JP2023516458A - ヒト細胞由来細胞外小胞を含有する噴霧吸入製剤、その調製方法及び使用 - Google Patents

Abstract

ＡＲＤＳなどの炎症又は損傷に関連する疾患を治療するための医薬組成物であって、（ａ）ヒト体細胞由来の活性物質であって、活性成分はヒト体細胞によって産生された細胞外小胞である、活性物質と、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。体細胞は、ヒト組織、骨髄及び／又は血液由来幹細胞などから選択される。医薬組成物の剤形は、噴霧吸入剤、点眼薬及び点鼻薬から選択される。医薬組成物は、生細胞製剤のものよりも優れた貯蔵安定性及び高い分散性を有する。細胞外小胞を調製するための方法であって、ヒト体細胞を培養するステップ、培養系から細胞を除去するステップ、培養液をポリエチレングリコールと混合して、ＰＥＧによって修飾された細胞外小胞を形成するステップ、遠心分離するステップ、再懸濁するステップなどを含む、方法。細胞外小胞の製剤は、炎症又は損傷を予防及び／又は治療するための医薬を調製するために使用され得る。

Description

本発明は、生物医学の分野に関し、より特定すると、ヒト細胞由来細胞外小胞を含有する噴霧吸入製剤、並びにその調製方法及び使用に関する。

急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、重病患者における呼吸不全の一般的な原因であり、機械的人工呼吸を必要とする非心原性肺水腫及び低酸素血症の急性増悪と定義される。

ＡＲＤＳは、最も一般的には、肺炎、敗血症、胃内容物の吸引又は重篤な外傷に付随し、世界的に集中治療室中の患者のおよそ１０％において見出される。過去数十年でなされたいくらかの進歩にもかかわらず、死亡率は大部分の研究において３０～４０％と依然として高い。米国において毎年合計およそ２００，０００のＡＲＤＳ症例が存在し、院内死亡率は３８．５％と高く、これは、過去数十年にわたって顕著には改善されていない。

急性肺損傷（ＡＬＩ）及びＡＲＤＳは、同じ病理学的変化を共有し、最も一般的な変化は、びまん性肺胞損傷である。ＡＬＩ／ＡＲＤＳの病理学的基礎は、様々な炎症細胞（マクロファージ、好中球、リンパ球など）によって媒介される肺における局所性炎症及び制御不能な炎症によって引き起こされた肺胞上皮及び肺胞毛細血管内皮の損傷である。その主な病理学的特徴は、肺微小血管透過性の増加によって引き起こされる肺胞滲出液中のタンパク質リッチ肺水腫及び硝子膜（ｈｙａｌｉｎｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の形成であり、これは、肺間質性線維症を伴い得る。病態生理学的変化は、主に、肺コンプライアンスの減少、肺内シャントの増加及び血流に対する換気の比率の不均衡である。臨床徴候は、呼吸数及び呼吸窮迫、難治性低酸素血症、胸部Ｘ線によって示される両肺のびまん性浸潤、並びにより後期での合併症としての多臓器不全である。

専門家の総意に基づく臨床診断基準が、ＡＲＤＳの診断のために使用される。患者管理の焦点は、肺保護換気戦略を実行することである。特異的な薬物療法はまだ特定されていない。生存しているＡＲＤＳ患者の長期予後は、重要な研究目標としてますます認識されている。なぜなら、多くのＡＲＤＳ患者は、臓器機能並びに／又は認知及び精神状態における持続的な後遺症を有して生存するからである、将来の研究の方向には、ＡＲＤＳの早期特定を促進すること、治療から恩恵を受け得るサブグループを特定するための臨床研究における予後及び／又は予測機能を加えること、並びに肺損傷の根底にあるメカニズムを理解するための努力を継続することが含まれる。

急性呼吸窮迫症候群のための既存の治療は、炎症又は炎症カスケードを調節することを目的としており、ＡＲＤＳの研究において使用されている。しかし、コルチコステロイド、好中球エラスターゼ阻害剤、顆粒球コロニー刺激因子、スタチン及びω－３脂肪酸などの既存の抗炎症薬、並びに、例えば、吸入β受容体アゴニスト、一酸化窒素などの肺呼吸器を改善することを目的とした界面活性剤は、死亡率を低下させることにおける利益を示していない。神経筋遮断薬を用いた肺保護換気又は腹臥位換気などの、機械的人工呼吸の間の圧肺損傷（気圧性外傷）を低下させる支持療法のみが、死亡率の改善を示しており、したがって、これらの療法は、ＡＲＤＳ治療の主な手段のままである。これまでのところ、ＡＲＤＳのための既存の治療方法は、死亡率を低下させることも、生存者における肺線維症及び他の臓器損傷又は神経精神後遺症を低下させることもし得ない。

２０１９年の年末から２０２０年にかけて、新たなコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染性肺炎が、中国及び世界中で突発し、重症肺炎、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）などを引き起こしている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスによって引き起こされる重症肺炎及びＡＲＤＳのために、有効なワクチン又は抗ウイルス薬は現在存在しない。これらの感染性疾患は、人々の生命及び健康に深刻な影響を与えており、有効な治療薬を開発が切迫している。国内外の患者の臨床的な必要を満たすように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などのコロナウイルスによって引き起こされる肺炎及びＡＲＤＳの疾患のための低い毒性で高い有効性の薬物を開発することには、大きな社会的意義がある。

上記の観点から、ＡＲＤＳ及び他の疾患の治療のための、高い有効性、低い毒性、高い安全性及び大量生産の実現可能性を有する薬物を開発することの、この分野における緊急の必要が存在する。

本発明の目的は、ＡＲＤＳ及び他の疾患の治療のための、高い有効性、低い毒性、高い安全性及び大量生産の実現可能性を有する薬物を提供することである。

本発明の第１の態様では、（ａ）ヒト体細胞によって産生された細胞外小胞である、ヒト体細胞由来の活性成分と、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物が提供される。

別の好ましい例では、医薬組成物は、注射剤又は無細胞医薬組成物である。

別の好ましい例では、「無細胞」は、医薬組成物が、生細胞又は死細胞を含有しないことを意味する。

別の好ましい例では、体細胞は、ヒト組織、骨髄及び／若しくは血液由来の幹細胞、前駆細胞若しくは免疫細胞、又はそれらの組み合わせから選択される。

別の好ましい例では、医薬組成物の剤形は、液体剤形、及び固体剤形（凍結乾燥剤形などの）から選択される。

別の好ましい例では、医薬組成物の剤形は、噴霧吸入調製物、点眼薬、又は点鼻薬から選択される。

別の好ましい例では、医薬組成物は、以下の特徴、
（Ｐ１）生細胞製剤よりも良好な貯蔵安定性であって、好ましくは、貯蔵は、室温及び／又は低温（例えば、－１９６℃～２５℃、好ましくは、－１００℃～０℃）でのものであり、「生細胞製剤よりも良好な貯蔵安定性」は、医薬組成物の安定性が、同じ条件下の生細胞を含有する製剤のものよりも良好であることを意味する、良好な貯蔵安定性と
（Ｐ２）高い分散性であって、好ましくは、医薬組成物が水を含有する液体製剤（例えば、生理食塩水を用いて調製された溶液）であり、０～２５℃で６～２４時間置かれたときに、それは、無色であり、可視性の凝集物（ｆｌｏｃｃｕｌｅ）又は沈殿物なしで透明である、高い分散性と、を有する。

別の好ましい例では、医薬組成物は、皮膚以外の部位に投与される。

別の好ましい例では、医薬組成物は、眼球結膜、眼瞼結膜、網膜、口腔、鼻腔、上気道、下気道、胃腸管、肺、又はそれらの組み合わせから選択される部位に投与される。

別の好ましい例では、医薬組成物は、血管内皮細胞、１型肺胞上皮細胞、２型肺胞上皮細胞、単核マクロファージ、好中球、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔリンパ球、線維芽細胞、中枢神経細胞、末梢神経細胞及びそれらの終末の線維、又はそれらの組み合わせから選択される細胞に投与される。

別の好ましい例では、幹（前駆）細胞は、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞、ヒト肺組織由来の肺胞上皮前駆細胞、ヒト臍帯のホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞、ヒト子宮内膜組織由来の間葉系幹細胞、ヒト胎盤組織由来の幹細胞、ヒト胎盤羊膜由来の上皮細胞、ヒト血液中の単核細胞、ヒト骨髄組織中の造血幹細胞、ヒト骨髄組織中の間葉系幹細胞、ヒト骨膜由来の間葉系幹細胞、ヒト皮膚組織由来のケラチノサイト、ヒト血液組織由来の樹状細胞、ヒト血液組織由来のＣＤ４陽性Ｔリンパ球、ヒト血液組織由来の血小板、又はそれらの組み合わせから選択される。

別の好ましい例では、細胞外小胞は、脂質二重層膜構造中に被覆されたナノ小胞を含む。

別の好ましい例では、ナノ小胞の直径は、３０～１，０００ナノメートルの範囲である。

別の好ましい例では、ナノ小胞は、様々なタイプのマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子リボ核酸（ｓＲＮＡ）、非コードＤＮＡフラグメント、転移リボ核酸（ｔ－ＲＮＡ）、可溶性サイトカイン、増殖因子、及び特異的機能の他のタンパク質を含有する。

別の好ましい例では、可溶性サイトカインは、可溶性及び遊離リポタンパク質分子、糖タンパク質分子、バイオシグナル伝達分子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１β受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１βＡ）、又はそれらの組み合わせから選択される。

別の好ましい例では、可溶性サイトカインは、ヒト体細胞によって産生された可溶性サイトカインである。

別の好ましい例では、可溶性サイトカインは、天然状態で培養されたヒト体細胞からパラクリン的に産生されたサイトカイン、外来遺伝子で改変されたヒト体細胞から発現されたサイトカイン、又はそれらの組み合わせを含む。

別の好ましい例では、細胞外小胞は、以下のタンパク質、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＴＳＧ１０１を特異的に発現し、タンパク質ＣＡＮＸを発現しないか、又は本質的に発現しない。

別の好ましい例では、細胞外小胞の直径は、好ましくは、５０～５００ｎｍである。

別の好ましい例では、直径は、平均直径である。

別の好ましい例では、細胞外小胞を産生するために使用される細胞は、以下の供給源からの細胞を含む：
（ａ）ヒト組織からの直接分離及び精製によって取得された細胞、
（ｂ）ヒト組織からの直接分離及び精製後の細胞を増殖させるためのＧＭＰ実験室における最小の操作によって取得された細胞、
（ｃ）ＧＭＰ実験室における特異的遺伝子改変、特異的遺伝子編集、特異的遺伝子形質導入、特異的ｍｉＲＮＡ導入によって取得された細胞、及び
（ｄ）ＧＭＰ実験室における特別な培養条件下での前処理によって取得された細胞。

別の好ましい例では、細胞外小胞を産生するために使用される細胞は、初代細胞及び継代数１～１０の継代細胞を含む。

別の好ましい例では、細胞外小胞を産生するために使用される細胞は、遺伝子操作されていない細胞及び遺伝子操作されている細胞を含む。

別の好ましい例では、遺伝子操作は、遺伝子編集、遺伝子導入、遺伝子ノックダウン、遺伝子ノックアウト、又はそれらの組み合わせを含む。

別の好ましい例では、細胞外小胞を産生するために使用される細胞は、前処理された細胞を含む。

別の好ましい例では、体細胞は、脂肪由来間葉系幹（前駆）細胞、胎盤羊膜由来間葉系幹細胞、又はそれらの組み合わせである。

別の好ましい例では、脂肪由来間葉系幹（前駆）細胞は、以下の手段によって取得される：倫理審査に合格し、登録され、インフォームドコンセントに署名し、脂肪幹（前駆）細胞バンクのための基準を満たすと実験室によって厳密に検査された健常な男性又は女性のボランティアから、腹部脂肪吸引又は腹部皮膚脂肪切除（ｄｅｒｍｏｌｉｐｅｃｔｏｍｙ）によって脂肪を取ること、脂肪を細胞貯蔵溶液に入れること、適格とされたＧＭＰ実験室にそれを低温で輸送すること、並びに分離、精製及び増殖によって、脂肪間葉系前駆細胞、すなわちワーキングバンク細胞（中間産物）を取得すること。

別の好ましい例では、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹（前駆）細胞は、ＧＭＰ産生実験室における中間産物のための産生プロセスに従って産生され、種々の病原体について陰性であると試験され、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性及びＣＤ１０５陽性細胞などの特異的表面マーカーのおよそ９８％のパーセンテージと、ＣＤ３４陽性／ＣＤ４５陽性及びＨＬＡ－ＤＲ陽性細胞の２％未満のパーセンテージとを有し、抗生物質残留物並びに血清及び血清代替物残留物についての検出基準を満たしている、Ｐ１～Ｐ６の脂肪間葉系幹（前駆）細胞である。

別の好ましい例では、脂肪間葉系幹（前駆）細胞は、Ｐ３～Ｐ４の脂肪間葉系幹（前駆）細胞である。

別の好ましい例では、体細胞は、－１９６℃～－８０℃（好ましくは、－１９６℃～－１３５℃）で０～３６ヶ月間（好ましくは、０～２４ヶ月間又は０．５～２４ヶ月間）、超低温条件下で貯蔵された脂肪組織由来間葉系幹（前駆）細胞である。

別の好ましい例では、ヒト体細胞由来細胞外小胞及び可溶性サイトカインのための産生プロセスは、以下のステップを含む：
（１）ヒト体細胞を５％ＥｌｉｔｅＧｒｏを含有するαＭＥＭ基本培養培地中に播種し、それをＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ培養フラスコ中で３７±１℃及び５±０．５％ＣＯ_２の培養条件下で細胞コンフルエンシーが８０±１０％に達するまで培養し、次いで、３７±１℃及び５±０．５％ＣＯ_２の培養条件下で３６～７２時間培養するために特定の前処理された培地を使用するステップ、並びに
（２）細胞培養上清を収集し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿と組み合わせた分画遠心分離による分離を行うステップ。

別の好ましい例では、ＰＥＧ沈殿と組み合わせた分画遠心分離は、以下のステップを含む：ＰＥＧ３０００～ＰＥＧ９０００のＰＥＧ（ＰＢＳで８％～３０％に設定されたＰＥＧ）を使用することによって濾過して（例えば、０．２２μｍフィルターを使用することによって）、細菌を除去するステップ、それを処理された馴化培地に特定の比率（例えば、１：１の体積比）で添加するステップ、それをインキュベーションのために４℃で一晩置くステップ、遠心分離を３，０００～５，０００ｇで４℃で３０～６０分間行うステップ、上清を除去するステップ、予冷したＰＢＳを添加して、沈殿物を再懸濁するステップ、超遠心分離を１００，０００～１２０，０００ｇで４℃で６０～１２０分間行うステップ、上清を除去するステップ、適量の等張塩化ナトリウム溶液を添加するステップ、沈殿物を再懸濁して、並びにヒト体細胞由来細胞外小胞及び可溶性サイトカインを取得するステップ。

別の好ましい例では、産生プロセスによって取得された細胞外小胞は、以下のバイオマーカー特徴、ＣＤ９陽性（すなわち、ＣＤ９^＋）、ＣＤ６３陽性、ＣＤ８１陽性、ＴＳＧ１０１陽性、及びＣＡＮＸ陰性、を有する。

別の好ましい例では、産生プロセスは、以下の特徴、ＧＭＰ実験室条件下での細胞産物のための臨床グレード産生スケール、を有する。

別の好ましい例では、臨床グレード産生スケールは、１つの産生操作ユニットが、２つの細胞工場からの８００～１，２００ｍｌの馴化培地を分離して、２～５×１０^１１個の細胞外小胞を取得し得ること、及び合計２～５×１０^９個の細胞外小胞が各患者のために局所的に使用される場合、１つの産生操作ユニットから産生された１つのバッチが、１００～２５０人の患者のための局所使用の必要を満たし得ることを意味する。又は、１００の産生操作ユニットから産生された１つのバッチは、１０，０００～２５，０００人のために５～６日間使用される細胞外小胞をもたらし得る。

別の好ましい例では、産生プロセスは、分離された細胞外小胞及び可溶性サイトカインが、特定の分子量のＰＥＧと架橋されて、特定のサイズ（例えば、３ミクロン未満）の親水性粒子を形成して、－１９６℃～－２０℃で凍結貯蔵されたときの高い安定性と、室温の水溶液中での高い分散性とをもたらすことを特徴とする。

別の好ましい例では、ＰＥＧによって架橋された細胞外小胞、可溶性サイトカイン及び親水性粒子は、等張塩化ナトリウム溶液、低分子ヒアルロン酸溶液、人工涙液又はゲル溶液中に分散され、それによって、噴霧吸入液、点眼薬、点鼻薬、又は局所用ゲル調製物を形成する。

別の好ましい例では、医薬組成物は、粘膜細胞に投与され、粘膜細胞は、細胞外小胞を取り込み得る。

別の好ましい例では、本発明の医薬組成物は、噴霧吸入調製物である。

別の好ましい例では、本発明の医薬組成物（特に、噴霧吸入調製物）は、感染性肺損傷、好ましくは、ウイルス性肺損傷、より好ましくは、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルス及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス）の感染によって引き起こされた肺損傷の治療のために使用される。

別の好ましい例では、医薬組成物は、脂肪組織由来前駆細胞及び胎盤羊膜由来間葉系幹細胞由来の細胞外小胞及び可溶性サイトカインから等張塩化ナトリウム溶液を用いて調製された噴霧吸入液である。

別の好ましい例では、医薬組成物は、ウイルスによって引き起こされた疾患を治療するために使用される。

別の好ましい例では、ウイルスは、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、及びＭＥＲＳコロナウイルスからなる群から選択される。

別の好ましい例では、医薬組成物（例えば、噴霧吸入液）は、ウイルス性急性肺損傷の治療のために使用され、噴霧吸入での治療は、急性肺損傷炎症因子の放出を防止し、肺胞における高タンパク質液体の浸潤及び肺胞上皮細胞損傷を低下させ、急性肺損傷患者の救助の成功率を顕著に増加させ、生存患者の肺機能及び生活の質を改善し得る。

本発明の第２の態様では、細胞外小胞を調製するための方法であって、
（Ｓ１）ヒト体細胞（例えば、脂肪間葉系幹（前駆）細胞）を所定のコンフルエンシー（例えば、７５～９０％）まで培養するステップと、
（Ｓ２）ＥＶ産生に適した条件下で、細胞の培養を、Ｔ１の期間継続するステップであって、Ｔ１は、通常、２４～７２時間、好ましくは、３０～６０時間である、継続するステップと、
（Ｓ３）培養系から細胞を除去して、細胞外小胞を含有する培養培地、すなわち「馴化培地」を分離及び取得するステップと、
（Ｓ４）馴化培地をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と混合して、第１の混合物を形成し、それをＴ２の期間置き、それによって、ＰＥＧ修飾細胞外小胞を形成するステップであって、Ｔ２は、通常、６～６０時間、好ましくは、１２～４８時間である、形成するステップと、
（Ｓ５）前のステップからの第１の混合物を遠心分離して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞を沈殿させ、上清を除去して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を取得するステップと、
（Ｓ６）前のステップから取得されたＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を再懸濁して、第１の再懸濁混合物を取得するステップと、
（Ｓ７）第１の再懸濁混合物を遠心分離して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞を沈殿させ、上清を除去して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を取得するステップと、
（Ｓ８）前のステップから取得されたＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を再懸濁して、医学的に許容される細胞外小胞製剤（すなわち、ＰＥＧ－ＥＶ－因子製剤）を取得するステップと、を含む方法が提供される。

別の好ましい例では、方法は、
（Ｓ９）医学的に許容される細胞外小胞製剤（又は活性成分）を薬学的に許容される担体と混合して、医薬組成物を形成することを更に含む。

別の好ましい例では、方法は、医薬組成物を、噴霧吸入調製物、注射剤、又は凍結乾燥調製物にすることを更に含む。

本発明の第３の態様では、本発明の第２の態様に記載の方法によって調製される、細胞外小胞製剤が提供される。

別の好ましい例では、細胞外小胞製剤は、脂質二重層膜構造中に被覆されたナノ小胞を含む。

別の好ましい例では、ナノ小胞の直径は、３０～１，０００ナノメートルの範囲である。

別の好ましい例では、ナノ小胞は、様々なタイプのマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子リボ核酸（ｓＲＮＡ）、非コードＤＮＡフラグメント、転移リボ核酸（ｔ－ＲＮＡ）、可溶性サイトカイン、増殖因子、及び特異的機能の他のタンパク質を含有する。

別の好ましい例では、可溶性サイトカインは、可溶性及び遊離リポタンパク質分子、糖タンパク質分子、バイオシグナル伝達分子、トランスフォーミング増殖β（ＴＧＦβ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１β受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１βＡ）、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例では、可溶性サイトカインは、ヒト体細胞によって産生された可溶性サイトカインである。

別の好ましい例では、可溶性サイトカインは、天然状態で培養されたヒト体細胞からパラクリン的に産生されたサイトカイン、外来遺伝子で改変されたヒト体細胞から発現されたサイトカイン、又はそれらの組み合わせを含む。

別の好ましい例では、細胞外小胞は、以下のタンパク質、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＴＳＧ１０１を特異的に発現し、タンパク質ＣＡＮＸを発現しないか、又は本質的に発現しない。

本発明の第４の態様では、本発明の第１の態様に記載の医薬組成物又は第３の態様に記載の細胞外小胞製剤の使用が提供され、それらは、炎症又は損傷を予防及び／又は治療するための薬物を調製するために使用される。

別の好ましい例では、炎症は、ウイルス感染性炎症、細菌感染性炎症、真菌感染性炎症、自己免疫応答炎症、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

損傷は、虚血性損傷、低酸素性損傷、化学的損傷、物理的損傷、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例では、薬物は、ウイルスによって引き起こされた疾患を治療するために使用される。

別の好ましい例では、ウイルスは、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、及びＭＥＲＳコロナウイルスからなる群から選択される。

本発明の第５の態様では、炎症又は損傷を予防及び／又は治療するための方法であって、本発明の第１の態様に記載の医薬組成物又は第３の態様に記載の細胞外小胞製剤を、必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。

別の好ましい例では、炎症は、ウイルス感染性炎症、細菌感染性炎症、真菌感染性炎症、自己免疫応答炎症、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例では、損傷は、虚血性損傷、低酸素性損傷、化学的損傷、物理的損傷、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。

別の好ましい例では、薬物は、急性呼吸窮迫症候群を治療するために使用される。

別の好ましい例では、薬物は、噴霧吸入液である。

別の好ましい例では、薬物は、ウイルス性急性肺損傷を治療するために使用される。

別の好ましい例では、薬物は、急性肺損傷炎症因子の放出を防止し、肺胞における高タンパク質液体の浸潤及び肺胞上皮細胞損傷を低下させるための噴霧吸入を通じた治療のために使用される。

別の好ましい例では、対象は、ヒトである。

本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴及び以下で詳細に説明する技術的特徴（例えば、実施形態）を組み合わせて、新たな又は好ましい技術的解決策を形成し得ることを理解されたい。スペースの制限により、ここでは詳述しない。

ウェスタンブロット及びＮＴＡによって検出されたＰＥＧ沈殿及び超遠心分離によって収集された細胞外小胞の収量を示す。図中、図（１Ａ）：Ｍはマーカーであり、１～４は、それぞれ、８％ＰＥＧ６０００、１２％ＰＥＧ６０００、１６％ＰＥＧ６０００及び２０％ＰＥＧ６０００によって分離された細胞外小胞のＣＤ６３発現である（同じ量のタンパク質がロードされたサンプルでの）。図（１Ｂ）：Ｍはマーカーであり、１はｈａＭＳＣであり、２及び４は超遠心分離によって分離された細胞外小胞のタンパク質発現であり、３及び５は１２％ＰＥＧ６０００によって分離された細胞外小胞のタンパク質発現である。図（１Ｃ）：ＮＴＡによって検出されたＰＥＧ６０００及び超遠心分離によって分離された細胞外小胞粒子の濃度。図（１Ｄ）：ＮＴＡによって検出されたＰＥＧ６０００及び超遠心分離によって分離された細胞外小胞粒子の直径。＊ｐ＜０．０５。 線維芽細胞による細胞外小胞の取り込みを示す。図中、青：Ｈｏｅｃｈｓｔ染色されたた細胞核、緑：ＰＫＨ－６７によってマークされた細胞外小胞。スケール：１００μｍ。 ４℃、－２０℃及び－８０℃で９週間貯蔵された細胞外小胞の数を示す。 ４℃、－２０℃及び－８０℃で９週間貯蔵された細胞外小胞の特異的マーカーＣＤ８１の発現を示す。 ３０分間の室温での融解後の透過型電子顕微鏡下での細胞外小胞の状態を示す。図中、図５Ａは、－８０℃での１週間の貯蔵後の透過型電子顕微鏡下での細胞外小胞の状態であり、図５Ｂは、３０分間の室温での融解後の透過型電子顕微鏡下での細胞外小胞の状態である。 ３０分間の室温での融解後の細胞外小胞の粒子濃度及び粒子サイズを示す。 ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞によるＬＰＳ誘発性マクロファージ活性化の阻害を示す。図中、（Ａ）は、炎症誘発性マクロファージの形態的観察であり、（Ｂ）は、炎症誘発性マクロファージの形態的統計分析である。対照は対照群であり、ＬＰＳはリポ多糖単独で処理されたマクロファージ群であり、ＬＰＳ＋Ｄｅｘはリポ多糖及びデキサメタゾンで処理された群であり、ＬＰＳ＋ｈａＭＰＣｓ－Ｅｘｏはリポ多糖及び脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞で処理された群であり、赤色矢印は活性化マクロファージ（炎症誘発性マクロファージ）を示す。＊ｐ＜０．０５、スケールは５０μｍである。 ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞によるＬＰＳ誘発性マクロファージにおける炎症誘発性因子の遺伝子発現の阻害を示す。図中（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれ、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲによって検出されたマクロファージ炎症因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の遺伝子発現レベルを示す。対照は対照群であり、ＬＰＳはリポ多糖単独で処理されたマクロファージ群であり、ＬＰＳ＋Ｄｅｘはリポ多糖及びデキサメタゾンで処理された群であり、ＬＰＳ＋ｈａＭＰＣｓ－Ｅｘｏはリポ多糖及び脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞で処理された群である。＊＊＊ｐ＜０．００１。 ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞によるＬＰＳ誘発性マクロファージにおける炎症誘発性因子の放出の阻害を示す。図中、（Ａ）は、マクロファージのＬＰＳ誘発及びヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞での処理の模式的フローチャートであり、（Ｂ）は、マクロファージによって放出された炎症誘発性因子ＩＬ－６及びＥＬＩＳＡによって検出されたタンパク質ＴＮＦ－αのレベルである。対照は対照群であり、ＬＰＳはリポ多糖単独で処理されたマクロファージ群であり、ＬＰＳ＋Ｄｅｘはリポ多糖及びデキサメタゾンで処理された群であり、ＬＰＳ＋ｈａＭＰＣｓ－Ｅｘｏはリポ多糖及び脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞で処理された群である。＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。 親水性粒子を形成するための細胞外小胞、可溶性サイトカイン及びＰＥＧの架橋の模式図である。 本発明の模式的プロセス経路（ステップＳ４～ステップＳ８）を示す。

特定の実施形態
広範で綿密な研究並びに選択及び研究の繰り返しを通じて、本発明者らは、ＡＲＤＳを有効に治療し得る無細胞バイオ医薬製剤のタイプを予想外にも初めて発見した。バイオ医薬製剤は、特定の粒子サイズを有し、特定のＰＥＧで修飾されたヒト細胞由来の細胞外小胞を含有し、したがって、それは、長期間安定に貯蔵され得るだけでなく、医療用溶媒（例えば、生理食塩水など）中での優れた分散性もまた有しており、このことは、それを、肺炎、ＡＲＤＳ及び他の疾患の症状を迅速で効率的に治療又は緩和し、コロナウイルスなどによって引き起こされた感染症状のリスク及び死亡率を顕著に低下させるための、噴霧吸入による患者の肺（特に、下気道）及び他の部分へ直接投与に特に適したものにしている。よって本発明がある。

コロナウイルス
コロナウイルス（ＣｏＶ）は、ニドウイルス目のコロナウイルス科に属する。それらは、エンベロープを持つプラス鎖ＲＮＡウイルスである。亜科には、α、β、δ及びγの４つの属が含まれる。

現在知られているヒト感染コロナウイルスのうち、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＮＬ６３はα属に属し、一方、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は全てβ属に属する。

それぞれ、２００３年及び２０１２年に突発した、高病原性コロナウイルス「重症急性呼吸器症候群」又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ及び「中東呼吸器症候群」又はＭＥＲＳ－ＣｏＶの両方は、β属コロナウイルスである。２０１９年の年末に突発した新たなコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶにおよそ８０％類似し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに４０％類似しており、これもまたβ属コロナウイルスである。

細胞外小胞
１．間葉系幹細胞の細胞外小胞の生物学的特徴
３つの主要なタイプの細胞外小胞（ＥＶ）、すなわち、エキソソーム、微小胞、及びアポトーシス小体が存在する。３つの主要なタイプのＥＶの全ては、脂質二重層で境界決めされており、その直径は３０～２，０００ｎｍの範囲である。

エキソソームは、エンドソームに由来するＥＶのサブタイプであり、５０～１００ｎｍの直径を有する。それらは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む様々な細胞のパラクリン因子の主成分である。

ＭＳＣエキソソームは、ＭＳＣに由来するＥＶのタイプであり、直径は５０～１００ｎｍの範囲であり、完全な脂質二重層構造を有するＥＶである。

エキソソームは、様々なカーゴを運ぶベクターのタイプであり、その機能は主にｍｉＲＮＡ及びタンパク質を継続的に移行させることによって作用する。ＭＳＣ由来エキソソームにおいて、１５０個を超えるｍｉＲＮＡ及び８５０個の特有のタンパク質が、様々な経路を通じて標的細胞の種々の活性を変化させることが特定されている。ＭＳＣエキソソームは、例えば、身体発達、エピジェネティック調節、免疫調節（ｍｉＲ－１５５及びｍｉＲ－１４６）、腫瘍形成及び腫瘍進行（ｍｉＲ－２３ｂ、ｍｉＲ－４５１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－３１、ｍｉＲ－２１４、ｍｉＲ－１２２）などの生理学的及び病理学的プロセスに関与している。ＥｘｏＣａｒｔａデータによれば、９００を超えるタイプのタンパク質が、ＭＳＣエキソソームから収集されている。いくつかの研究は、ＭＳＣエキソソームが、例えば、ＴＧＦβ１、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１０、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などのいくつかのサイトカイン及び増殖因子を含有することを示しており、これらは、免疫調節において役立つことが確認されている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、細胞外マトリックスメタロプロテイナーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）及びＭＭＰ－９が、ＭＳＣエキソソームにおいて報告されている。これら３つのタンパク質は、血管新生の刺激における重要な役割を果たし、エキソソーム組織修復の基礎であり得る。

２．動物における間葉系幹細胞の細胞外小胞の体内分布
様々な動物モデルにおいて、いくつかのインビボ追跡戦略が、その全身投与後のＥＶ又はエキソソームの体内分布を決定するために用いられている。近赤外（ＮＩＲ）色素は、その高いシグナル対ノイズ比のおかげで、インビボ適用に理想的である。超常磁性酸化鉄ナノ粒子で標識されたＥＶは、高解像度及び高感度の磁気共鳴分析能を有しており、これは、深部臓器における正確な検出のための基礎を提供する。

脳内出血を有するラットモデルにおいて、ＤｉＩ標識ＭＳＣエキソソームは、静脈内注射後に脳、肝臓、肺、及び脾臓に達することが示された。急性腎障害（ＡＫＩ）を有するマウスモデルにおいて、ＤＩＤ標識ＥＶは、健常対照と比較して、ＡＫＩマウスの腎臓中に特異的に蓄積し、これは、エキソソームが損傷部位にホーミングすることができるようであることを示す。

鼻腔投与は、静脈内投与と比較して、損傷部位での脳エキソソームのより良好な蓄積を導いた。全身投与を介するＥＶの体内分布は、動的なプロセスであり、投与後およそ３０分以内に、ＥＶは、肝臓、脾臓、及び肺中に急速に分布し、次いで、肝臓及び腎臓の処理によって排除段階に入り、投与後１～６時間で除去される。

３．間葉系幹細胞の細胞外小胞の免疫調節及び抗炎症効果
研究は、エキソソームが、機能的ＭＨＣペプチド複合体を運び、提示することによって、腫瘍特異的Ｔ細胞活性化の調節において重要な役割を果たすことを示している。

骨髄由来ＭＳＣから放出されたエキソソームは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の活性化及び浸潤を阻害し、炎症誘発性サイトカインの産生を低下させ、ＩＬ－１０発現Ｔｒｅｇの生成を促進し、Ｔｈ１７細胞を阻害し、それによって、マウスにおける慢性移植片対宿主病（ｃＧＶＨＤ）を有効に改善し得る。

ヒト多能性間質細胞由来のＥＶは、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）及び実験的自己免疫ブドウ膜網膜炎（ＥＡＵ）のモデルにおいて自己免疫抑制を示した。ＥＶは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を阻害し、Ｔｈ１を阻害し、Ｔｈ１７細胞の発達を阻害し、免疫抑制因子ＩＬ－１０の発現を増加させ得る。

ヒト骨髄ＭＳＣのエキソソームは、制御性Ｔ細胞サブセットの増殖を促進し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるサイトカインＩＬ－１０及びＴＧＦ－β１の発現をアップレギュレートすることによって、喘息患者の免疫抑制能力を増強し得る。

ヒト臍帯ＭＣＳ由来のエキソソーム中のｍｉＲ－１８１ｃは、ＴＬＲ４シグナル伝達経路をダウンレギュレートすることによって、火傷からの炎症を有するラットモデルにおいて抗炎症効果を発揮した。

腎動脈狭窄症を有するブタモデルにおいて、ブタ自家脂肪ＭＳＣ－ＥＶの単回腎内注射は、腎静脈における種々の炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－１－β）のレベルを低下させ得、一方で、炎症因子ＩＬ－１０の増加を阻害し、これには、炎症誘発性細胞から修復マクロファージへのマクロファージの遊走が伴い、これは再び、ＥＶの免疫調節潜在力を実証する。

多くの研究は、肝線維症／硬変及び急性肝障害を有する動物モデルにおけるＭＳＣの適用を報告しており、これは、最終的に患者における疾患進行を改善し得る。脂肪ＭＳＣのエキソソームは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）誘発性肝炎モデルにおける血清アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベルの上昇を顕著に低下させ、肝臓炎症を軽減し、肝炎モデルにおける肝炎の重症度を低下させ得た。マウスの肝炎モデルの血清中の炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１８、及びＩＬ－１β）のレベルは低下し、マウスの肝炎モデルの肝臓におけるインフラマソームの活性化は阻害された。

敗血症は、微生物感染に対する身体の全身性炎症応答である。先進的な抗生物質の適用にもかかわらず、敗血症の死亡率は集中治療室において高いままであり、したがって、研究者はこの全身性炎症性疾患の治療においてＭＳＣを標的としている。近年、盲腸結紮誘発性敗血症の動物モデルにおけるＭＳＣ－ＥＶの有効性が広範に研究されている。脂肪ＭＳＣ－ＥＶでの静脈内治療は、敗血症のラットモデルにおいて全身性炎症、臓器損傷、及びその後の致死を緩和した。敗血症の治療の別の研究において、ＩＬ－１βで前処理されたＭＳＣ由来のＥＶは、前処理なしのＭＳＣ由来のＥＶよりも敗血症の治療において顕著に有効であった。

研究はまた、誘発されたＭＳＣ由来のＥＶが、マクロファージを効率的に極性化して、マクロファージの抗炎症性表現型であるＭ２型に分化させ得ることを示した。抗炎症性ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲ－１４６ａは、ＩＬ－１β前処理されたＭＳＣ及びＥＶの両方において顕著に増加した。ＥＶ中にパッケージングされたｍｉＲ－１４６ａのマクロファージ中への移行は、それをＭ２型に極性化し得た［Ｃａｓａｄｏ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７；４：３９］。

４．遺伝子改変されたＭＳＣは、その細胞外小胞の有効性を増加させ得る
ヒト骨髄ＭＳＣの肺への遊走を改善し、ＭＳＣの治療潜在力を増強するために、骨髄ＭＳＣにおける高く安定な長期発現を有するＡＴ２Ｒ ＤＮＡ含有構築物が、レンチウイルス媒介性遺伝子トランスフェクションによって取得された。ＡＴ２Ｒ－ＭＳＣの遊走が、インビトロで検出された。その後、ＡＴ２Ｒ－ＭＳＣの潜在的な治療有効性が、リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性急性肺損傷のインビボモデルにおいて調査され、ＭＳＣの損傷肺組織への遊走が評価された。同時に、ＡＴ２ＲノックアウトＭＳＣ（ＭＳＣ－ＳｈＡＴ２Ｒ）が、インビボでのＭＳＣの遊走能力におけるＡＴ２Ｒの役割と、ＡＲＤＳに対する治療効果とを決定するために使用された。

ＭＳＣエキソソームは、抗アポトーシスｍｉＲ－２１－５ｐを輸送することによって、マウスにおける肺虚血／再灌流損傷を軽減した。エキソソーム中のｍｉＲ－２１－５ｐは、肺組織におけるＰＴＥＮ及びＰＤＣＤ４を標的とすることによって、酸化ストレス誘発性アポトーシスを低下させた。

最近の研究により、ｍｉＲ－３０ｂ－３ｐを過剰発現するＭＳＣ由来のエキソソームが、血清アミロイドＡ３（ＳＡＡ３）を阻害し得ることが見出された。

盲腸結紮及び穿孔誘発性敗血症のモデルにおいて、エキソソームｍｉＲ－１４６ａは、ＩＬ－１β前処理されたＭＳＣの治療効果を増強し、ＭＳＣのＩＬ－１β刺激が、ＭＳＣにおけるｍｉＲ－１４６ａ（これは、エキソソーム中にパッケージングされ得る）の発現をアップレギュレートし得ることが更に見出された。次いで、このエキソソームｍｉＲ－１４６ａはマクロファージに移行され、Ｍ２極性化及び最終的に敗血症マウスにおける生存率の増加を導いた。したがって、特異的ｍｉＲＮＡの過剰発現によってＭＳＣのエキソソームを改変することは、ＡＲＤＳ療法を開発するための有望で新たな方向である。

急性呼吸窮迫症候群
ＡＲＤＳは、例えば、喫煙、溺水、誤嚥、敗血症、外傷、虚血、毒素への曝露などの要因に起因する直接的又は間接的な肺損傷に対する急性全身性炎症応答である。重篤な炎症応答は、血管透過性の変化を引き起こし、急性肺水腫を導く。

ＡＲＤＳの病理学的プロセスは、主に、滲出段階、増殖段階及び線維増殖段階の３つの段階を有する。

滲出段階の間に、肺損傷及び肺胞毛細血管関門の機能不全によって引き起こされた炎症カスケードは、肺胞上皮及び肺毛細血管内皮細胞の透過性の増加をもたらし、これは、滲出段階に特徴的である。肺組織の病理学的徴候には、浸出を伴うびまん性肺胞損傷、二次性肺水腫を伴う微小血管損傷、肺胞１型（ＡＴ１）上皮細胞の壊死、炎症細胞の凝集、及び活性メディエーターの放出が含まれる。肺胞炎症は、主に、多形核好中球、単球、及びマクロファージによって引き起こされる。他の炎症誘発性メカニズム、例えば、肺細胞、炎症細胞及び線維芽細胞からの大量の炎症誘発性サイトカインの放出もまた関与する。

増殖段階の間に、Ｔリンパ球、好中球、及びマクロファージを含む、炎症細胞の浸潤を伴って、肺胞内に硝子膜が形成される。炎症及び酸化ストレスからの重篤な損傷に続いて、細胞外マトリックスが肺胞中に沈着し、持続的慢性炎症を伴う。炎症カスケードは、アポトーシス、増殖、遊走及びＡＲＤＳに密接に関連する他のプロセスにおいて重要な役割を果たす。持続的であり、間に合うように修復され得ない損傷は、線維増殖段階におけるＡＲＤＳの主な病理学的徴候である。

この線維増殖段階の間に、線維芽細胞増殖、ＡＴ２細胞増殖及び肺組織修復が行われる。損傷した肺胞上皮の修復メカニズムは完全には理解されていないが、それにはＡＴ２細胞の増殖が関与しており、このＡＴ２細胞は、基底膜に沿って遊走して、新たな上皮性関門を形成し、細胞外マトリックス及び肺胞マクロファージを含む他の細胞との複雑な相互作用を有し、その結果、いくつかの場合に肺の構造及び機能の顕著な変化をもたらす。肺のコンピューター断層撮影（ＣＴ）は、ＡＲＤＳの線維増殖段階の間に、密な線維症及び蜂巣構造を検出し得る。

ＡＲＤＳに関連する重篤な疾患は、人工呼吸器獲得性肺炎、急性心筋梗塞、及び急性肺塞栓症の高いリスクをもたらす。

細胞外小胞
本発明は、間葉系幹細胞（脂肪間葉系幹（前駆）細胞、臍帯間葉系幹細胞及び胎盤羊膜間葉系幹細胞を含む）由来の細胞外小胞を提供する。

本発明では、本発明の特定の最適化されたプロセスによって調製された細胞外小胞は、特定の粒子サイズ分布を有し、ＰＫＧと架橋されて、親水性粒子を形成し、これは、肺（特に、下気道）における噴霧吸入調製物の形態での投与及び作用に極めて適しているだけでなく、水溶液中での長期間の高い安定性及び優れた分散性（その両方は元の細胞より優れている）もまた特徴付ける。

理解の容易のために、出願人は図１０に模式図を提供する。図１０に示すように、細胞外小胞、可溶性サイトカイン及びＰＥＧは架橋して、親水性粒子を形成する。

別の好ましい例では、本発明に記載の分離方法及びプロセスによって取得される細胞外小胞の粒子サイズは、好ましくは、５０～５００ｎｍである。細胞外小胞、可溶性サイトカイン及びＰＥＧは架橋して、３ミクロン未満（例えば、およそ１～３ミクロン又は０．５～３ミクロン）の粒子サイズを有する親水性粒子を形成し、これは、細胞自体よりも良好な安定性及び水溶液中での分散性を有する。細胞外小胞、可溶性サイトカイン及びＰＥＧの架橋によって形成された親水性粒子は、生理食塩水、人工涙液、及びヒアルロン酸などの溶液と混合されて、それぞれ、噴霧吸入液、点眼薬、点鼻薬及び外用製剤を形成し、これらは、局所粘膜細胞がこれらの細胞外小胞及び可溶性活性サイトカインを吸収及び利用するために有益である。インビボでのそれらの体内分布は、純粋な細胞外小胞のものと一致している。

本発明では、間葉系幹細胞を使用して、細胞外小胞の細胞を調製することが得策である。間葉系幹細胞の代表例としては、脂肪間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、胎盤羊水間葉系幹細胞、又はそれらの組み合わせが挙げられる（がこれらに限定されない）。

医薬組成物及び噴霧吸入製剤
本発明はまた、（ａ）ヒト体細胞によって産生された細胞外小胞である、ヒト体細胞由来の活性成分と、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含有する、医薬組成物を提供する。

別の好ましい例では、医薬組成物は、注射剤又は無細胞医薬組成物である。

本発明では、好ましくは、活性成分は、可溶性活性サイトカインを更に含み、この可溶性サイトカインは、主に細胞外小胞中に存在する。更に、いくつかの可溶性サイトカインは、細胞外小胞の外側に存在し得る。いくつかの可溶性サイトカインはまた、ＰＥＧによって修飾され得る。

本発明では、特に好ましい医薬製剤は、噴霧吸入製剤である。

調製方法
本発明はまた、細胞外小胞を調製するための方法を提供する。

典型的な方法は、原材料として、間葉系幹細胞（脂肪間葉系幹（前駆）細胞、臍帯間葉系幹細胞、及び胎盤羊膜間葉系幹細胞を含む）の使用によって細胞外小胞を調製することである。

脂肪間葉系幹（前駆）細胞を例にとると、典型的な調製方法は、
（Ｓ１）細胞（例えば、脂肪間葉系幹（前駆）細胞）を所定のコンフルエンシー（例えば、７５～９０％）まで培養するステップと、
（Ｓ２）ＥＶ産生に適した条件下で、細胞の培養を、Ｔ１の期間継続するステップであって、Ｔ１は、通常、２４～７２時間、好ましくは、３０～６０時間である、継続するステップと、
（Ｓ３）培養系から細胞を除去して、細胞外小胞を含有する培養培地、すなわち「馴化培地」を分離及び取得するステップと、
（Ｓ４）馴化培地をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と混合して、第１の混合物を形成し、それをＴ２の期間置き、それによって、ＰＥＧ修飾細胞外小胞を形成するステップであって、Ｔ２は、通常、６～６０時間、好ましくは、１２～４８時間である、形成するステップと、
（Ｓ５）前のステップからの第１の混合物を遠心分離して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞を沈殿させ、上清を除去して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を取得するステップと、
（Ｓ６）前のステップから取得されたＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を再懸濁して、第１の再懸濁混合物を取得するステップと、
（Ｓ７）第１の再懸濁混合物を遠心分離して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞を沈殿させ、上清を除去して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を取得するステップと、
（Ｓ８）前のステップから取得されたＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を再懸濁して、医学的に許容される細胞外小胞製剤（すなわち、ＰＥＧ－ＥＶ－因子製剤）を取得するステップと、を含む。

ステップＳ４～Ｓ８の模式的プロセス経路を図１１に示す。

ＧＭＰ条件下での細胞外小胞のための産生プロセスのスケール
１つのＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ細胞工場は、５００ｍｌの馴化培地中の細胞外小胞を産生し得、合計５×１０^１０～１０×１０^１０個の細胞外小胞が分離によって取得され得ることが推定される。

現在の実験室能力で、１つの産生操作ユニットは、２つの細胞工場からの合計８００～１２００ｍｌの馴化培地を分離して、推定合計２～５×１０^１１個の細胞外小胞を取得し得、合計２～５×１０^９個の細胞外小胞が各患者のために局所的に使用される場合、１つの産生操作ユニットから産生された１つのバッチは、１００～２５０人の患者のための局所使用の必要を満たし得る。

本発明の主な利点は以下を含む。
（ａ）本発明は、スケール産生、特に、臨床工業スケール産生に適している。１つのＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ細胞工場は、５００～６００ｍｌの馴化培地中の細胞外小胞を産生し得、合計２～５×１０^１１個の細胞外小胞が分離によって取得され得ることが推定される。ＧＭＰ実験室能力で、１つの産生操作ユニットは、２つの細胞工場からの８００～１，２００ｍｌの馴化培地を分離して、推定合計２～５×１０^１１個の分離及び精製された細胞外小胞を取得し得る。合計２～５×１０^９個の細胞外小胞が各患者のために局所使用される場合、１つの産生操作ユニットから産生された１つのバッチは、１００～２５０人の患者の必要を満たし得る。
（ｂ）良好な安定性：ヒト身体に有害である、ＤＭＳＯなどの凍結防止液の必要は存在しない。それは、低温（－２０℃）及び超低温（－８０℃～－１９６℃）で３６ヶ月以上貯蔵され得、その膜構造及び内容物は安定である。
（ｃ）高い分散性：薬学的に許容される担体、特に、等張塩化ナトリウム水溶液中での良好な分散性。凍結及び融解の後、それが４℃で２４時間以上置かれたときに結晶化又は沈殿は存在せず、これは、細胞ベースの製剤よりも顕著に良好である。
（ｃ）本発明の医薬組成物は、３ミクロン未満の親水性粒子を有し、水溶液中に均一に分散され、これは、噴霧及び吸入によって投与されたときに、気道、特に、下気道に非常に高い効率で入り得る。

本発明は、いくつかの実施形態を参照することによって更に説明される。実施形態は、本発明を例証するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施形態では、実験方法について条件が特定されていない場合、従来の条件、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の条件が一般に使用される。別段の特定がない限り、パーセンテージ及び部は重量パーセンテージ及び重量部である。

材料
脂肪間葉系幹（前駆）細胞：倫理審査に合格し、登録され、インフォームドコンセントに署名し、脂肪幹（前駆）細胞バンクへの基準組み入れを満たすと実験室によって厳密に検査された健常な男性又は女性のボランティアから、腹部脂肪吸引又は腹部皮膚脂肪切除によって脂肪を取り、脂肪を細胞貯蔵溶液に入れ、適格とされたＧＭＰ実験室にそれを低温で輸送し、分離、精製及び増殖によって、脂肪間葉系前駆細胞、すなわちワーキングバンク細胞（中間産物）を取得する。

一般方法
１．培地前処理
５％ＥｌｉｔｅＧｒｏを含有するαＭＥＭ培地を、１２０，０００ｇで４℃で６時間遠心分離した。

２．ＰＥＧ沈殿による細胞外小胞の取得
１２％ＰＥＧ６０００をＰＢＳを用いて調製し、０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、処理した馴化培地に１：１の体積比で添加し、４℃で一晩インキュベートし、３，０００ｇで４℃で１時間遠心分離し、上清を除去した。予冷したＰＢＳを添加して、沈殿物を再懸濁し、超遠心分離を１２，００００ｇで４℃で７０分間行い、上清を吸引除去し、適量の等張塩化ナトリウム溶液を添加して、沈殿物を再懸濁して、細胞外小胞を取得した。

３．粒径分布及び粒子濃度の測定
適量のサンプルを取り、３００倍希釈し、ＺｅｔａＶｉｅｗを使用して、サンプルの粒径分布及び粒子濃度を測定した。

４．タンパク質濃度の測定
適量のサンプルを取り、タンパク質濃度をＢＣＡによって測定した。５×ＳＤＳローディングバッファーを添加し、サンプルを１００℃で５分間加熱し同じ量のタンパク質を含むサンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を、色素がゲル底に移動するまで１００Ｖで行った。２５０ｍＡで、サンプルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし９０分後にＴＢＳＴバッファーをブロッキングバッファーとしての５％スキムミルク並びに一次及び二次抗体希釈バッファーと混合した。ＰＶＤＦをブロックした。サンプルを、それぞれ、一次抗体希釈バッファー、すなわち陽性タンパク質ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、及び陰性タンパク質ＣＡＮＸとともにインキュベートし、対応する二次抗体希釈バッファーとともにインキュベートした。次いで、発色溶液を添加し、タンパク質バンドを観察した。

実施例１
細胞外小胞を含有する培地（馴化培地）の調製
２×１０^７個の脂肪間葉系幹細胞（継代Ｐ４）を取り、５％ＥｌｉｔｅＧｒｏを含有する基本培地αＭＥＭ中に播種し、ＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ培養フラスコ中で３７℃及び５％ＣＯ_２の培養条件下で培養した。

細胞コンフルエンシーがおよそ８０％に達したときに、３７℃及び５％ＣＯ_２の培養条件下で４８時間培養するために、培地を前処理した培地に交換した。

上清を収集し、３，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を取り、１０，０００ｇで３０分間４℃で遠心分離した。上清を、細胞外小胞を含有する培地（以下、「馴化培地」）として取った。

実施例２
細胞外小胞の調製
本実施例では、細胞外小胞を、それぞれ、ＰＥＧ沈殿及び超遠心分離によって調製した。

超遠心分離：
馴化培地（実施例１から）を取り、１２０，０００ｇで４℃で７０分間超遠心分離した。予冷したＰＢＳを用いて再懸濁した後、それを再度１２０，０００ｇで７０分間超遠心分離した。細胞外小胞を取得するために適量の等張塩化ナトリウム溶液を用いて再懸濁した、沈殿物。

ＰＥＧ沈殿：
ＰＢＳを使用して、８％、１２％、１６％又は２０％の濃度のＰＥＧ６０００を調製し、これを、０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、処理した馴化培地（実施例１から）に１：１の体積比で添加し、４℃で一晩インキュベートした。

遠心分離を３，０００ｇで４℃で１時間行い、上清を除去した。予冷したＰＢＳを添加して、沈殿物を再懸濁し、超遠心分離を１２０，０００ｇで４℃で７０分間行い、上清を除去し、適量の等張塩化ナトリウム溶液を添加して、沈殿物を再懸濁して、細胞外小胞を取得した。

性能測定：
８％ＰＥＧ６０００、１２％ＰＥＧ６０００、１６％ＰＥＧ６０００、及び２０％ＰＥＧ６０００を含有する分離した細胞外膜小胞を、同じ総タンパク質量にロードし、ＣＤ６３の決定を行った。

結果を図１Ａに示す。１２％ＰＥＧ６０００及び１６％ＰＥＧ６０００を含有する細胞外膜小胞のＣＤ６３発現レベルが最も高かった。したがって、１２％ＰＥＧ６０００をその後の実験において使用した。

更に、１２％ＰＥＧ６０００を含む２００ｍｌの培地を分離することによって取得した細胞外小胞と、超遠心分離によって３５０ｍｌの培地を分離することによって取得した細胞外小胞とを、ＣＡＮＸ、ＴＳＧ１０１及びＣＤ８１の決定のため並びにＮＴＡ検出のために、同じ体積及び同じ量のタンパク質にロードした。

結果を図１Ｂ～１Ｄに示す。結果は、同じ体積又は同じタンパク質量でのウェスタンブロットによって検出したときに、ＰＥＧ６０００によって分離した細胞外小胞の標的タンパク質の量が、超遠心分離によって分離した細胞外小胞のものよりもはるかに高いことを示した。

ＮＴＡの結果は、ＰＥＧ６０００によって分離した細胞外小胞の濃度は１．３５×１０^８細胞外小胞／ｍｌ培地であり、超遠心分離によって分離した細胞外小胞の濃度は６．８×１０^７細胞外小胞／ｍｌ培地であることを示した。

ＰＥＧ６０００によって分離した細胞外小胞の粒子サイズは１２６．６±２．０９ｎｍであり、超遠心分離によって分離した細胞外小胞のそれは１３７．８±３．８ｎｍであった。

これらの実験結果は、１２％ＰＥＧ６０００によって分離した細胞外小胞の収量が、超遠心分離によるものよりもはるかに高く、ＰＥＧが、細胞外小胞の粒子サイズに影響を与えなかったことを確証する。

実施例３
線維芽細胞による細胞外小胞の取り込み
ＰＫＨ－６７を使用して、ＰＥＧ６０００によって分離した細胞外小胞を標識した。

図２は、ＰＥＧ６０００によって分離した細胞外小胞が、線維芽細胞による細胞外小胞の取り込みに影響を与えなかったことを示す。

実施例４
細胞外小胞の安定性及び性能の決定
分離によって調製した細胞外小胞を生理食塩水と混合して、水溶液を調製し、これを、それぞれ４℃、－２０℃及び－８０℃で９週間貯蔵した。９週間後に、３つの温度の細胞外小胞をＮＴＡによって試験し、それらの性能を決定した。

ＮＴＡ検出の結果を図３及び表１に示す。

結果は、３つの異なる温度で９週間貯蔵した細胞外小胞の数が、一次分離後０日目のものと比較して顕著には粒子数の減少をしないことを示した（図３）。

ウエスタンタンパク質電気泳動の結果は、－２０℃及び－８０℃で９週間貯蔵した細胞外小胞の特異的マーカーＣＤ８１及びＴＳＧ１０１が安定に発現されることを示した。４℃で、３週間貯蔵した細胞外小胞の特異的マーカーＴＳＧ１０１は、安定に発現され得たが、このマーカーの発現は第５週から減少し始めた（図４）。

－８０℃で１週間貯蔵した細胞外小胞は、透過型電子顕微鏡下で「ソーサー様」であった（図５Ａ）。室温で３０分の融解後、細胞外小胞は透過型電子顕微鏡下で依然として「ソーサー様」であり（図５Ｂ）、顕著な変化は存在しなかった。

－８０℃で１週間貯蔵した細胞外小胞と、室温で３０分間融解した細胞外小胞とをＮＴＡによって検出し、粒子濃度（図６Ａ）及びサイズ（図６Ｂ）の顕著な差異が存在しないことが見出された。

実施例５
細胞外小胞及びサイトカインを含有する凍結乾燥製剤における複数のサイトカインの検出
本実施例では、サイトカインを、本発明の方法によって調製した細胞外小胞について検出した。試験したサンプルは以下を含んだ。
サンプル１：基本培地の凍結乾燥粉末（陰性対照）、４℃で４週間貯蔵、
サンプル２：幹細胞培地の凍結乾燥粉末（陽性対照）、４℃で４週間貯蔵、
サンプル３：細胞外小胞の凍結乾燥粉末、室温で４週間貯蔵、
サンプル４：細胞外小胞の凍結乾燥粉末、４℃で４週間貯蔵、及び
サンプル５：細胞外小胞の凍結乾燥粉末、－２０℃で４週間貯蔵。

複数のサイトカインの検出結果を表２に示す。

結果は、本発明に記載の分離及び精製方法によって調製した細胞外小胞が、サイトカインに富むことを示した。サンプルを－２０℃及び４℃で４週間貯蔵したときに、サイトカインは安定なままであった。

実施例６
ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞によるＬＰＳ誘発性マクロファージ活性化の阻害
ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞が、マウスＲａｗ２６４．７マクロファージにおけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘発性炎症に対して抗炎症効果を有することを検証するために、本実施例では、マクロファージにおけるＬＰＳ誘発性炎症を、ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞の、インビボでのその活性化レベルに対する効果を研究するためのモデルとして使用した。具体的な方法は以下のとおりである。

最初に、４つの実験群、具体的には、いかなる薬物処理もなしの対照群、０．１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ単独で処理する群、０．１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ及び５μｇ／ｍｌデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で処理する群、並びに０．１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ及び適切な濃度のヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞（ｈａＭＰＣｓ－Ｅｘｏ）で処理する群を設定した。

１ｍｌのＲａｗ２６４．７マクロファージ懸濁液を１２ウェル培養プレートの各ウェルに添加し（１×１０^４細胞／ウェル）、これを、ＣＯ_２恒温インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）に１時間入れた。次いで、サンプルを、上記の群を形成するように処理し、ＣＯ_２恒温インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）中で４時間培養した。最後に、培養したプレートを取り出し、活性化されたマウスＲａｗ２６４．７マクロファージの形態的変化を倒立顕微鏡下で観察し、２０×対物レンズ下の視野を、撮影、記録及び統計分析のために無作為に選択した。

結果を図７に示す。対照群と比較して、活性化マクロファージ（炎症誘発性マクロファージ）は、ＬＰＳ単独での４時間の誘発後に枝状になり（図７Ａ）、統計分析により、活性化量もまた有意に増加したことが見出され（図７Ｂ）、これは、インビトロＬＰＳ誘発性マクロファージ炎症モデルの確立が成功したことを示す。

ＬＰＳ単独で処理した群と比較して、ＬＰＳ及びデキサメタゾンで４時間処理した群において、枝状になったマクロファージの数は顕著に低下し（図７Ａ）、活性化されたマクロファージの数は、統計分析において有意により低かった（図７Ｂ）。

同様に、ＬＰＳ及びヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞での４時間の処理の後、枝状になったマクロファージの数はまた顕著に低下し（図７Ａ）、活性化されたマクロファージの数はまた統計分析において有意により低かった（図７Ｂ）。

したがって、これらの結果は、ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞が、ＬＰＳ誘発性マクロファージ活性化を阻害し得、これが今度は、炎症誘発性マクロファージの形成を損なったことを示唆する。

実施例７
ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞によるＬＰＳ誘発性マクロファージにおける炎症誘発性因子の遺伝子発現の阻害
本実施例では、ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞が、ＬＰＳ誘発性マウスＲａｗ２６４．７マクロファージの炎症応答に対する阻害効果を有することを検証するために、リアルタイム定量的ＰＣＲを使用して、主な炎症因子の遺伝子発現を検出した。具体的な操作方法は、薬物処理を２４時間行ったことを除いて、実施例１に記載のものと本質的に同じである。全ＲＮＡ抽出を、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔの説明書に従って行い、一方、リアルタイム蛍光定量的ＰＣＲ検出を、標的遺伝子及び内部参照遺伝子の同時検出のためのＴａｑＭａｎプローブを用いて行い、相対的定量分析を２^{－ΔΔＣＴ}方法によって実施した。

結果を図８に示す。対照群と比較して、マウスＲａｗ２６４．７マクロファージにおける炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現レベルは、ＬＰＳ単独での２４時間の処理後に有意に増加した。しかし、ＬＰＳ及びデキサメタゾンでの２４時間の処理後に、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の発現レベルは大いに減少した（図８Ａ、Ｂ及びＣ）。

同様に、ＬＰＳ及びヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞での２４時間の処理後に、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の発現レベルは全て有意に低下し、本質的にデキサメタゾンで処理した群のレベルに達した（図８Ａ、Ｂ及びＣ）。

したがって、これらの結果は、ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞が、ＬＰＳ誘発性マクロファージにおける炎症誘発性サイトカインの遺伝子発現レベルを顕著に阻害し、それによって、それらの炎症応答を阻害し得ることを示唆する。

実施例８
ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞によるＬＰＳ誘発性マクロファージにおける炎症誘発性因子の放出の阻害
本実施例では、ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞が、ＬＰＳ誘発性マウスＲａｗ２６４．７マクロファージの炎症応答を阻害し得ることを更に検証するために、ＥＬＩＳＡ方法を使用して、それらが放出した炎症因子のレベルを検出した。具体的な操作方法は、薬物処理を２４時間行ったことを除いて、実施例２に記載のものと同じである。実験スキームについては図９Ａを参照されたい。マクロファージにおける炎症因子を検出するためのＥＬＩＳＡの操作を、Ｂｅｙｏｔｉｍｅ ＴＮＦ－α及びＩＬ－６キットの説明書に従って行い、次いで、統計分析を行った。

結果は、対照群と比較して、マウスＲａｗ２６４．７マクロファージによって放出された炎症誘発性サイトカインＴＮＦ－α及びＩＬ－６の両方が、ＬＰＳ単独での２４時間の処理後に有意に増加したことを示す（図９Ｂ）。しかし、ＬＰＳ及びデキサメタゾンでの２４時間の処理後に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルは大いに減少した（図９Ｂ）。

同様に、ＬＰＳ及びヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞での２４時間の処理後に、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６のレベルは両方とも大いに低下し、デキサメタゾンで処理した群のレベルに達した（図９Ｂ）。それらの中で、細胞外小胞は、ＩＬ－６に対するより良好な阻害効果を有しており、これは、それらが、新型コロナウイルス肺炎におけるサイトカインストームを阻害する介入療法におけるより良好な適用の見込みを有したことを示唆する。

したがって、上記のデータは、ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞の細胞外小胞が、ＬＰＳ誘発性マクロファージにおける炎症誘発性サイトカインの放出を顕著に阻害し、それによって、それらの炎症誘発性応答を阻害し得ることを示唆する。

実施例９
噴霧吸入によるヌードマウスにおける蛍光標識ＥＶの体内分布を研究するためのスキーム
本実施例では、噴霧吸入後のマウスの肺組織におけるヒト由来脂肪間葉系前駆細胞のエキソソームの分布及び持続期間を研究した。蛍光標識エキソソーム追跡方法を研究において使用した。

ヒト由来脂肪間葉系前駆細胞のＰＫＨ６７標識エキソソーム（１×１０^６細胞外小胞／ｇ）を３０分間噴霧し、ヌードマウス（Ｎ＝３）の肺中に吸入し、ヌードマウスの肺組織におけるＰＫＨ６７標識エキソソームの分布を、吸入後２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間及び２４時間でのインビボ蛍光イメージングによって観察し、ヌードマウスの肺におけるその保持の時間を分析した。

実施例１０
動物モデルにおける感染性肺損傷の治療におけるＥＶの噴霧吸入の有効性を研究するためのスキーム
本実施例では、吸入後のマウスモデルにおける多剤耐性緑膿菌（ＰＡ）誘発性肺炎の治療のためのヒト由来脂肪間葉系前駆細胞のエキソソームの有効性を研究した。ＰＢＳ誘発性マウスのブランク対照群、ＰＡ誘発性マウス肺炎の群、噴霧吸入を通じたヒト由来脂肪間葉系前駆細胞のエキソソームによって治療するＰＡ誘発性マウス肺炎の群、及びマウス線維芽細胞エキソソームによって治療するマウス肺炎の群をそれぞれ設定した。各群は６匹の８～１０週齢のＣ５７ＢＬ／６野生型雄性マウスからなり、治療群中の各マウスにおけるエキソソームの量は、１×１０^６細胞外小胞／ｇであると計算された。４時間の多剤耐性緑膿菌誘発の後に、エキソソーム吸入を１日１回、５日間行った。次いで、血液サンプルを、末梢血白血球数及び好中球数並びに細菌負荷測定のために収集した。気管支肺胞洗浄液を、好中球数、細菌負荷測定及び関連する炎症誘発性因子レベルの決定のために収集した。更に、肺組織における細菌負荷を測定し、肺組織の形態的観察をＨＥ染色によって行った。

実施例１１
新型コロナウイルス肺炎からの急性肺損傷の治療のためのＥＶの噴霧吸入の臨床治験のプロトコル
本実施例では、噴霧吸入による新型コロナウイルス肺炎（ＮＣＰ）を有する重症及び重病患者の治療のための同種脂肪由来間葉系幹細胞のエキソソームの安全性及び有効性を予備的に研究した。

３０人の重症及び重病ＮＣＰ対象者を含めることを計画し、これらを３つの投与量群、すなわち、低、中及び高投与量に分けた。ＩＣＵにおけるルーチンの治療に加えて、全ての対象に２～８×１０^８細胞外小胞／３ｍｌの併用療法としての同種脂肪ＭＳＣ－Ｅｘｏの噴霧吸入を与え、これを、１日１回、連続５日間投与した。有害反応の発生率及び２８日以内の臨床的改善時間、並びに引き離された患者の数、ＩＣＵ看護日数、生存者の機械的人工呼吸の持続期間及び死亡率などを記録及び分析した。更に、治療後の患者における症状の改善を、毎日のＳＯＦＡスコア、関連する生化学的指標の検出及び肺イメージング観察、並びに患者の呼吸器検体においてコロナウイルスが陰性になった時間によって評価した。本研究のための組み入れ基準には、主に１）男性又は女性であって、１８～７５歳であり、本人又はその家族が自発的に研究に参加し、インフォームドコンセントに署名した者、２）ＲＴ－ＰＣＲ試験において陽性と試験されたか、又は新型コロナウイルス肺炎と診断された者、及び３）重症及び重病患者のための診断基準を満たした者が含まれた。除外基準には、主に１）関連ウイルス保有者又は重篤なアレルギーを有した患者、及びその肺炎が他のウイルスによって引き起こされた患者、２）肺がん又は免疫抑制剤の長期使用を有する患者、３）血液透析又は腹膜透析を受けているか、又は異常肝機能を有する患者、４）ＥＣＭＯ又は高頻度振動換気を使用していた患者、５）妊娠中であるか、授乳中であるか、又は６ヶ月以内に妊娠を計画している患者、６）研究者によって研究に参加することができないと評価されたか、又はプロトコルを理解及び実施できなかった患者が含まれた。

考察
急性呼吸窮迫症候群の治療のための、いくつかの代替細胞療法には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）療法、インビトロ誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）療法、間葉系／間質幹細胞（ＭＳＣ）療法、肺上皮前駆細胞（ＥｐＰＣ）療法、内皮前駆細胞（ＥｎＰＣ）療法などが含まれる。

ＭＳＣ療法は、最も研究されている幹細胞療法である。ＭＳＣは、インビトロで免疫応答を抑制し得、肺胞２型細胞（ＡＴ２細胞）に分化する潜在力を有する、自己再生及び増殖性多能性幹細胞である。ＭＳＣ媒介性炎症抑制並びにＭＳＣ関連肺修復及び再生は、例えば、ＡＲＤＳ、肺炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、間質性肺線維症（ＩＰＦ）などの肺疾患の治療のその潜在力の主なメカニズムである。

前述のように、ＡＲＤＳは、進行性急性呼吸不全を導く間質性水腫及び炎症細胞浸潤を伴う、肺胞上皮関門の破壊から生じる重篤な臨床症候群である。合成コルチコステロイド、界面活性剤、吸入一酸化窒素、抗酸化剤、プロテアーゼ阻害剤、及び種々の他の抗炎症治療、例えば、シンバスタチン及びイブプロフェンがＡＲＤＳを治療するために使用されているが、これらの薬物はいずれもＡＲＤＳの死亡率を顕著には低下させず、それは、３４％～４４％のままであった。

いくつかの最近の前臨床研究は、ＭＳＣが、そのパラクリンサイトカイン及び細胞外微小胞とともに、ＡＲＤＳのための新規で有効な治療とみなされ得ることを実証している。ＡＲＤＳはしばしば、重篤な敗血症（特に、グラム陰性菌感染後）の合併症である。ＭＳＣでの治療は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来リポ多糖（ＬＰＳ）誘発性敗血症の動物モデルにおいてＡＲＤＳを予防した［Ｃｕｒｌｅｙ ＧＦ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１７，４５（２）：ｅ２０２－ｅ２１２］［Ｌｅｅ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１１，２９（６）：９１３－９１９］。

ＭＳＣの静脈内注射は、リポ多糖誘発性ＡＲＤＳマウスモデルにおいて肺胞損傷及び炎症応答を顕著に改善し得た。ＭＳＣは、パラクリン及びインターロイキン１０（ＩＬ－１０）依存的に、肺における好中球の浸潤及び肺に浸潤する免疫細胞による炎症因子ＴＮＦ－αの産生を低下させた［Ｇｕｐｔａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７，１７９，（３）：１８５５－１８６３］［Ｍｅｉ ＳＨＪ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，４（９）：ｅ２６９］。

更に、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の産生を通じて、ＭＳＣは、ＡＴ２型細胞再生を促進し、内皮細胞アポトーシスを防止し、ＡＲＤＳ損傷における肺上皮関門の修復を促進した［Ｌｅｅ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ２００９，１０６（３８）：１６３５７－１６３６２］［Ｈｕ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１６，７（１）：６６］。炎症性損傷の低下、水腫の低下、酸素負荷の改善、及び生存の延長が、ＭＳＣで治療された動物モデルにおいて観察された。ＭＳＣは、マクロファージにおける抗炎症因子ＩＬ－１０の産生を増加させることによってＰＧＥ－２依存的にそれ自体を敗血症関連ＡＲＤＳから保護する。

ＡＲＤＳのための骨髄ＭＳＣの静脈内注入の初期臨床治験が完了している。［Ｊ．Ｇ．Ｗｉｌｓｏｎ ＪＧ，ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｒｅｓｐｉｒ．Ｍｅｄ．２０１５，３（１）：２４－３２］［Ｚｈｅｎｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．２０１４，１５（１）：３９］。Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．は、中等度から重度のＡＲＤＳを有する９人の患者において、同種骨髄ＭＳＣ（１００万、５００万、及び１０００万細胞／ｋｇ）の単回静脈内注入の良好な耐性が臨床研究において観察されたことを報告した（ＮＣＴ０１７７５７７４）。有害反応及び用量制限毒性は、同種骨髄ＭＳＣで治療された９人の患者において観察されなかった。この第Ｉ相臨床研究の結論に従って、無作為化多施設第ＩＩ相臨床研究が米国において２０１４年から２０１８年まで実施された（ＸＣＴ０２０９７６４１）。研究には、同種骨髄ＭＳＣ（１０００万細胞／ｋｇ）又はプラセボの単回用量で治療された６０人の成人ＡＲＤＳ患者が登録された。結果はまだ報告されていない。

ＡＲＤＳ治療のための同種脂肪組織由来ＭＳＣの静脈内注射の別の第Ｉ相臨床治験（ＮＣＴ０１９０２０８２）において、１２人の成人ＡＲＤＳ患者は、同種脂肪ＭＳＣ（１００万細胞／ｋｇ）の単回静脈内注射を投与されたが、ＡＴ－ＭＳＣ治療は、ＡＲＤＳ患者における血清炎症性サイトカイン（ＩＬ－６及びＩＬ－８）のレベルを顕著には低下させず、ＡＲＤＳ患者における肺機能の改善もしなかった。このことは、これが安全ではあるが有効でない治療であったことを示す。

最近の研究により、ＭＳＣによって産生された細胞外小胞（ＥＶ）が、肺胞マクロファージの貪食活性を促進し、それによって、グラム陰性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉによって誘発された細菌性肺炎を低下させたことが見出された［ＭｏｎｓｃｌＡ，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１５，１９２（３）：３２４－３３６］。更に、ＭＳＣは、炎症肺における細菌増殖を直接阻害する抗菌タンパク質を産生する。

ＭＳＣの気管内注射は、リポカルシン（ｌｉｐｏｃａｌｃｉｎ）－２依存的に細菌クリアランスを促進することによって、細菌性肺炎を有する実験動物において、肺損傷及び炎症応答を顕著に減弱し、生存を改善した。ＭＳＣにおけるＴＬＲ－４のＬＰＳ誘発性活性化は、リポカルシン－２の分泌を増強し、これは、細菌シデロフォアに結合し、鉄吸収を低下させ、細菌増殖を阻害し得る。これらの知見と一致するのは、最近報告された知見であり、細菌性肺炎の実験モデルにおいて、Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．［Ｇｕｐｔａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｏｒａｘ ２０１２，６７（６）：５３３－５３９］は、ＭＳＣにおけるＴＬＲ－４の変異が、その治療効果を顕著に減少させることを見出した。したがって、肺から抗生物質耐性グラム陰性株を潜在的に排除し得る潜在的な新たな細胞ベースの療法が期待される。

本発明の研究は、間葉系幹細胞の細胞外小胞の顕著な利点を実証する。幹細胞は、種々の疾患の治療のための大きな潜在力を有する。幹細胞の治療効果は、そのパラクリンサイトカインに大きく依存し、細胞外小胞（ＥＶ）又はエキソソームによって媒介される。

ＥＶは、細胞間コミュニケーションを媒介するナノサイズの膜構造小胞である。ＭＳＣ由来ＥＶは、サイトカイン、増殖因子、シグナル伝達脂質、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ及び他の物質を含有する。

ますます多くの研究証拠が、ＭＳＣ－ＥＶが既存のＭＳＣ療法を上回る特有の利点を有する新たな無細胞治療アプローチを表し得ることを示唆する。１）インビボでの腫瘍形成のリスクなし。２）より低い免疫原性。３）分離及び精製を通じた同種ヒトＭＳＣの培養の間の内因性ＭＳＣから及び上清（馴化培地の）からＥＶを誘導する可能性。これは、バッチにおける高い収量及び簡便なバッチ品質管理で、臨床スケールの産生及び精製の必要を満たすことを可能にする。４）様々な治療目的により特異的なＥＶを濃縮するための、ＥＶを産生する特定の増殖継代のシード幹細胞のインビトロ改変の可能性。５）単一の懸濁されたＭＳＣの直径（１８～４０μｍ）は、赤血球の直径（６μｍ）よりも３～７倍大きいことから、ＭＳＣは容易に沈着及び接着して、微小血塊を形成し、静脈内注射後の毛細血管の閉塞のリスクを導く一方で、ＥＶは、５０～５００ｎｍの直径を有するナノ膜構造小胞であり、これは、水溶液中での良好な分散性を有し、注射剤への調製が容易である。６）ＥＶは、良好な膜構造安定性、並びに凍結保存及び凍結融解プロセスの強い耐性を有する。７）膜構造及びナノ粒子特徴に起因して、ＥＶは、活発に貪食され、標的組織細胞によって取り込まれ、それによって、ＥＶによって運ばれる生物学的情報及び／又は活性成分を取得して、細胞へのＥＶの直接的なシグナル伝達及び標的化薬物送達を発揮し得る。８）ＥＶは、特定の活性成分が負荷され得、天然の薬物送達システムになり得る。９）複数の研究グループが、ＭＳＣ由来ＥＶの治療潜在力を報告している。ＭＳＣ－ＥＶは、ＡＲＤＳのための将来のバイオマーカー及び治療薬としての潜在力を有する。ＭＳＣ－ＥＶはまた、ＡＲＤＳ回復における重要な役割を果たすようである。

複数の研究により、気道又は静脈内経路を介した ＭＳＣ由来微小胞（ＭＶ）の治療上の利点が見出された。Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．の研究は、ＭＳＣ由来ＭＶの気管内注入が、肺組織における細胞外含水量を低下させ、肺水腫を低下させ、Ｅ．ｃｏｌｉエンドトキシン誘発性肺損傷におけるタンパク質に対する肺胞膜透過性を低下させ得ることを示した。ＭＳＣ－ＭＶはまた、好中球流入を低下させ、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）におけるマクロファージ炎症性タンパク質２のレベルを低下させた。

ＭＳＣは、ＥＶ媒介性ミトコンドリア移行を通じてＡＬＩにおけるマクロファージを調節する。アンジオポエチン－１は、ＭＳＣ－ＭＶにおいて豊富であり、マクロファージに対するＭＳＣの免疫調節特性は、アンジオポエチン－１ ｍＲＮＡのマクロファージへの移行によって部分的に媒介される。ＭＳＣエキソソームは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を通じて内皮細胞のアポトーシスを低下させ、ＩＬ－１０産生を増加させ、ＩＬ－６産生を低下させることによって、マウスのＬＰＳ誘発性急性肺損傷モデルにおける肺微小血管透過性を部分的に改善した。

ＭＳＣ－ＭＶは、肺胞膜のタイトジャンクションの完全性を回復させ得、また、ヒト肺微小血管内皮細胞に対するＩＬ－１β、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γの透過性増強効果を低下させ得る。抗ＣＤ４４及びアンジオポエチン－１ ｓｉＲＮＡでの前処理は、ＭＳＣ－ＭＶのこの治療効果を消失させ、これは、ＣＤ－４４及びアンジオポエチン－１ ｍＲＮＡの移行が、ＭＳＣ－ＭＶの修復及び治療メカニズムに関与することを示唆する。ＭＶサブセットの発現は、ＭＳＣを前処理し、それによってその治療潜在力を増加させることによって増強され得る。

本発明者らの研究に基づいて、以下の発明が提供される。
発明１：ヒト細胞由来の活性成分を含有する医薬製剤であり、成分は、良好な安定性及び高い分散性を有し、皮膚以外のヒト身体によって容易に吸収され、種々の理由によって引き起こされた炎症及び損傷を予防及び治療するのに適している。
本発明２：発明１に記載のヒト細胞由来の活性成分であって、それらは、ヒト組織、骨髄及び血液由来の幹細胞、前駆細胞及び免疫細胞によって産生された細胞外小胞及び可溶性サイトカインを含むがこれらに限定されない、活性成分。
発明３：噴霧吸入液、点眼薬、及び点鼻薬を含むがこれらに限定されない、発明１に記載の医薬製剤。
発明４：発明１に記載の医薬製剤は、良好な安定性を有しており、活性成分の安定性は、同じ貯蔵条件下、例えば、限定されないが、室温での貯蔵、－２０℃より低温での貯蔵、－７０℃より低温での貯蔵、－１３５℃より低温での貯蔵、及び－１９６℃の低温での貯蔵での生細胞を含有する調製物よりも顕著に良好である。
発明５：発明１に記載の医薬製剤は、高い分散性を有しており、それは、０～２５℃で６～２４時間置かれたときに、無色であり、可視性の凝集物及び沈殿物なしで透明である。
発明６：発明１に記載の医薬製剤は、皮膚以外のヒト身体の部位への投与が容易であり、これらの部位には、眼球結膜、眼瞼結膜、網膜、口腔、鼻腔、上気道、下気道、胃腸管、血管内皮細胞、１型肺胞上皮細胞、２型肺胞上皮細胞、単核マクロファージ、好中球、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔリンパ球、線維芽細胞、中枢神経細胞、及び末梢神経細胞並びにそれらの終末の線維が含まれるがこれらに限定されない。
発明７：発明１に記載の医薬製剤は、ウイルス感染性炎症、細菌感染性炎症、真菌感染性炎症、自己免疫反応性炎症、虚血性損傷、化学的損傷、及び物理的損傷を含むがこれらに限定されない種々の要因によって引き起こされた炎症及び損傷を予防及び治療するのに適している。
発明８：発明２に記載のヒト組織、骨髄及び血液由来の幹細胞、前駆細胞及び免疫細胞であって、ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞、ヒト肺組織由来の肺胞上皮前駆細胞、ヒト臍帯のホウォートンゼリー由来の間葉系幹細胞、ヒト子宮内膜組織由来の間葉系幹細胞、ヒト胎盤組織由来の幹細胞、ヒト胎盤羊膜由来の上皮細胞、ヒト血液中の単核細胞、ヒト骨髄組織中の造血幹細胞、ヒト骨髄組織中の間葉系幹細胞、ヒト骨膜由来の間葉系幹細胞、ヒト皮膚組織由来のケラチノサイト、ヒト血液組織由来の樹状細胞、ヒト血液組織由来のＣＤ４陽性Ｔリンパ球、及びヒト血液組織由来の血小板を含むがこれらに限定されない、幹細胞、前駆細胞及び免疫細胞。
発明９：発明２に記載のヒト細胞由来の細胞外小胞であって、脂質二重層膜構造中に被覆された、直径３０～１，０００ｎｍの、様々なタイプのマイクロリボ核酸（ｍｉＲＮＡ）、核内低分子リボ核酸（ｓＲＮＡ）、非コードＤＮＡフラグメント、転移リボ核酸（ｔ－ＲＮＡ）、可溶性サイトカイン、増殖因子、及び特異的機能の他のタンパク質を含有するナノ小胞を含むがこれらに限定されない、細胞外小胞。
発明１０：発明２に記載のヒト細胞由来の可溶性サイトカインであって、可溶性及び遊離リポタンパク質分子、糖タンパク質分子、バイオシグナル伝達分子、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、及びインターロイキン１β受容体アンタゴニスト（ＩＬ－１βＡ）を含むがこれらに限定されない、可溶性サイトカイン。
発明１１：発明２及び発明１０に記載のヒト細胞由来の可溶性サイトカインであって、天然状態で培養されたヒト体細胞からパラクリン的に、及び特定の遺伝子で改変されたヒト体細胞の過剰発現から産生されたサイトカインを含むがこれらに限定されない、可溶性サイトカイン。
発明１２：発明２及び発明９に記載の細胞外小胞であって、膜タンパク質マーカーＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＴＳＧ１０１を特異的に発現し、ＣＡＮＸを発現しない、細胞外小胞。細胞外小胞の直径は、好ましくは、５０～５００ｎｍである。
発明１３：発明２及び発明８に記載のヒト組織、骨髄及び血液由来の幹細胞、前駆細胞、及び免疫細胞であって、これらの細胞は、ヒト組織からの直接分離及び精製によって、又はヒト組織からの直接分離及び精製後の細胞を増殖させるためのＧＭＰ実験室における最小の操作によって、又はＧＭＰ実験室における特異的遺伝子改変、特異的遺伝子編集、特異的遺伝子形質導入、特異的ｍｉＲＮＡ導入によって、又はＧＭＰ実験室における特別な培養条件下での前処理によって取得され得る、幹細胞、前駆細胞、及び免疫細胞。
発明１４：発明２及び発明８に記載のヒト組織、骨髄及び血液由来の幹細胞、前駆細胞、及び免疫細胞であって、これらの細胞は、好ましくは、脂肪由来間葉系幹細胞及び胎盤羊膜由来間葉系幹細胞である、幹細胞、前駆細胞及び免疫細胞。
発明１５：発明２、発明８、発明１３及び発明１４に記載のヒト組織、骨髄及び血液由来の幹細胞、前駆細胞、及び免疫細胞は、より好ましくは、脂肪由来間葉系幹（前駆）細胞及び胎盤羊膜由来間葉系幹細胞である。
発明１６：発明１５に記載のより好ましくは脂肪由来間葉系幹（前駆）細胞であって、脂肪は、倫理審査に合格し、登録され、インフォームドコンセントに署名し、脂肪幹（前駆）細胞バンクのための基準を満たすと実験室によって厳密に検査された健常な男性又は女性のボランティアから、腹部脂肪吸引又は腹部皮膚脂肪切除によって取られ、特許付与された細胞貯蔵溶液に入れられ、適格とされたＧＭＰ実験室に低温で輸送され、ワーキングバンク細胞（中間産物）としての脂肪間葉系前駆細胞は、特許付与された分離、精製及び増殖プロセスによって取得される、脂肪由来間葉系幹（前駆）細胞。
発明１７：発明１５及び発明１６に記載のより好ましくはヒト脂肪組織由来間葉系前駆細胞であって、この特定の型のヒト脂肪組織由来間葉系幹（前駆）細胞は、ＧＭＰ産生実験室における中間産物のための産生プロセスに従って産生され、種々の病原体について陰性であると試験され、ＣＤ７３陽性、ＣＤ９０陽性及びＣＤ１０５陽性細胞などの特異的表面マーカーのおよそ９８％のパーセンテージと、ＣＤ３４陽性／ＣＤ４５陽性及びＨＬＡ－ＤＲ陽性細胞の２％未満のパーセンテージとを有し、抗生物質残留物並びに血清及び血清代替物残留物についての検出基準を満たしている、Ｐ１～Ｐ６の脂肪間葉系幹（前駆）細胞、より好ましくは、継代Ｐ３～Ｐ４の脂肪間葉系幹（前駆）細胞である、ヒト脂肪組織由来間葉系前駆細胞。
発明１８：発明１５～１７に記載のより好ましくは脂肪組織由来間葉系幹（前駆）細胞は、－１９６℃～－８０℃で０～３６ヶ月間、好ましくは、１９６℃～－１３５℃で０～２４ヶ月間、超低温条件下で貯蔵される。
発明１９：その産生プロセスが以下である、発明２及び発明９～１２に記載のヒト体細胞由来細胞外小胞及び可溶性サイトカイン：
（１）これらの型のヒト体細胞を５％ＥｌｉｔｅＧｒｏを含有するαＭＥＭ基本培養培地中に播種し、それをＨｙｐｅｒＦｌａｓｋ培養フラスコ中で３７℃及び５％ＣＯ_２の培養条件下で細胞コンフルエンシーが８０％に達するまで培養し、次いで、３７℃及び５％ＣＯ_２の培養条件で４８時間培養するために特定の前処理された培地を使用すること。
（２）細胞培養上清を収集し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿と組み合わせた分画遠心分離による分離を行うこと。
発明２０：発明１９に記載の産生プロセスの（２）におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿と組み合わせた分画遠心分離であって、ＰＢＳで８％～３０％に設定されたＰＥＧ３０００～ＰＥＧ９０００のＰＥＧを、０．２２μｍフィルターを用いて濾過し、処理された馴化培地に１：１の体積比で添加し、インキュベーションのために４℃で一晩置き、３，０００～５，０００ｇで４℃で４５～６０分間遠心分離し、上清を除去する。予冷したＰＢＳを添加して、沈殿物を再懸濁し、超遠心分離を１００，０００～１２０，０００ｇで４℃で６０～１２０分間行い、上清を除去し、適量の等張塩化ナトリウム溶液を添加し、沈殿物を再懸濁して、ヒト体細胞由来細胞外小胞及び可溶性サイトカインを取得する。
発明２１：発明１９及び発明２０に記載の産生プロセスによって取得された細胞外小胞であって、それらが、バイオマーカーＣＤ９陽性、ＣＤ６３陽性、ＣＤ８１陽性、ＴＳＧ１０１陽性、及びＣＡＮＸ陰性を有することを特徴とする、細胞外小胞。
発明２２：発明１９～２１に記載の産生であって、ＧＭＰ実験室条件下で、それは、細胞産物のための臨床産生スケールまでスケールアップされ得、以下の利点を有する、産生：１つの産生操作ユニットは、２つの細胞工場からの８００～１，２００ｍｌの馴化培地を分離して、２～５×１０^１１個の細胞外小胞を取得し得る。合計２～５×１０^９個の細胞外小胞が各患者のために局所的に使用される場合、１つの産生操作ユニットから産生された１つのバッチは、１００～２５０人の患者の必要を満たし得る。１００の産生操作ユニットから産生された１つのバッチは、１０，０００～２５，０００人による５～６日間の使用のための細胞外小胞をもたらし得る。
発明２３：発明１９～２２に記載の産生であって、分離された細胞外小胞及び可溶性サイトカインは、特定の分子量のＰＥＧと架橋されて、－１９６℃～－２０℃で凍結貯蔵されたときに低温で高い安定性を有し、室温の水溶液中での高い分散性を有する（その両方は従来技術より優れている）３ミクロン未満の親水性粒子を形成する、産生。
発明２４：発明２３に記載のＰＥＧによって架橋された細胞外小胞、可溶性サイトカイン及び親水性粒子であって、これらは、等張塩化ナトリウム溶液、低分子ヒアルロン酸溶液、人工涙液又はゲル溶液を含むがこれらに限定されない、溶液中にそれらを分散させることによって、噴霧吸入液、点眼薬、点鼻薬、又は局所用ゲル調製物に調製され得る、細胞外小胞、可溶性サイトカイン及び親水性粒子。局所粘膜細胞による、本発明のプロセスによって取得された細胞外小胞の取り込みは、ＰＥＧによって影響を与えられない。
発明２５：発明１並びに発明２３及び２４に記載のヒト体細胞由来細胞外小胞及び可溶性サイトカインを含有する医薬製剤は、好ましくは、感染性肺損傷の治療に適した噴霧吸入製剤にされる。
発明２６：発明１及び発明２５に記載の医薬製剤であって、それは、好ましくは、脂肪組織由来間葉系幹（前駆）細胞及び胎盤羊膜由来間葉系幹細胞の細胞外小胞及び可溶性サイトカインと、等張塩化ナトリウム水溶液とを用いて調製された噴霧吸入液であり、急性肺損傷炎症因子の放出を防止し、肺胞における高タンパク質液体の浸潤及び肺胞上皮細胞損傷を低下させ、急性肺損傷患者の救助の成功率を顕著に増加させ、生存患者の肺機能及び生活の質を改善するための、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２、及びＭＥＲＳコロナウイルスを含むがこれらに限定されないウイルスの感染によって引き起こされた急性肺損傷の噴霧吸入治療に適している、医薬製剤。

本発明において言及される全ての文献は、あたかも各文献が個別に引用されているかのように、本出願において参考として引用される。更に、本発明の上記の教示を読んだ後に、当業者は、本発明に対して種々の変更又は改変をなし得、これらの等価な形態もまた、本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内に入ることを理解されたい。

Claims (14)

1. （ａ）ヒト体細胞によって産生された細胞外小胞である、ヒト体細胞由来の活性成分と、（ｂ）薬学的に許容される担体と、を含有することを特徴とする、医薬組成物。
2. 前記体細胞が、ヒト組織、骨髄及び／若しくは血液由来の幹細胞、前駆細胞若しくは免疫細胞、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記医薬組成物の剤形が、噴霧吸入調製物、点眼薬、又は点鼻薬からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
4. 前記医薬組成物が、以下の特徴、
   （Ｐ１）生細胞製剤よりも良好な貯蔵安定性であって、好ましくは、前記貯蔵は、室温及び／又は低温でのものであり、「生細胞製剤よりも良好な貯蔵安定性」は、前記医薬組成物の前記安定性が、同じ条件下の生細胞を含有する製剤のものよりも良好であることを意味する、良好な貯蔵安定性と、
   （Ｐ２）高い分散性であって、好ましくは、前記医薬組成物が、水を含有する液体製剤（例えば、生理食塩水を用いて調製された溶液）であり、０～２５℃で６～２４時間置かれたときに、それは、無色であり、可視性の凝集物（ｆｌｏｃｃｕｌｅ）又は沈殿物なしで透明である、高い分散性と、を有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 前記医薬組成物が、眼球結膜、眼瞼結膜、網膜、口腔、鼻腔、上気道、下気道、胃腸管、肺、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される部位に投与されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記細胞外小胞の直径が、好ましくは、５０～５００ｎｍであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. 細胞外小胞を調製するための方法であって、
   （Ｓ１）ヒト体細胞を、所定のコンフルエンシー（例えば、７５～９０％）まで培養するステップと、
   （Ｓ２）ＥＶ産生に適した条件下で、前記細胞の前記培養を、Ｔ１の期間継続するステップと、
   （Ｓ３）前記培養系から前記細胞を除去して、細胞外小胞を含有する培養培地、すなわち「馴化培地」を分離及び取得するステップと、
   （Ｓ４）前記馴化培地をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と混合して、第１の混合物を形成し、それをＴ２の期間置き、それによって、ＰＥＧ修飾細胞外小胞を形成するステップであって、Ｔ２は、通常、６～６０時間、好ましくは、１２～４８時間である、形成するステップと、
   （Ｓ５）前のステップからの前記第１の混合物を遠心分離して、前記ＰＥＧ修飾細胞外小胞を沈殿させ、上清を除去して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を取得するステップと、
   （Ｓ６）前記前のステップから取得された前記ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を再懸濁して、第１の再懸濁混合物を取得するステップと、
   （Ｓ７）前記第１の再懸濁混合物を遠心分離して、前記ＰＥＧ修飾細胞外小胞を沈殿させ、上清を除去して、ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を取得するステップと、
   （Ｓ８）前記前のステップから取得された前記ＰＥＧ修飾細胞外小胞沈殿物を再懸濁して、医学的に許容される細胞外小胞製剤を取得するステップと、を含むことを特徴とする、方法。
8. 前記細胞外小胞製剤が、請求項７に記載の方法によって調製されることを特徴とする、細胞外小胞製剤。
9. 請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項８に記載の細胞外小胞製剤の使用であって、それらが、炎症又は損傷を予防及び／又は治療するための薬物を調製するために使用されることを特徴とする、使用。
10. 前記炎症が、ウイルス感染性炎症、細菌感染性炎症、真菌感染性炎症、自己免疫応答炎症、又はそれらの組み合わせからなる群から選択され、
    前記損傷が、虚血性損傷、低酸素性損傷、化学的損傷、物理的損傷、又はそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
11. 前記薬物が、急性呼吸窮迫症候群を治療するために使用されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
12. 前記薬物が、噴霧吸入液であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
13. 前記薬物が、ウイルス性急性肺損傷を治療するために使用されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
14. 前記薬物が、急性肺損傷炎症因子の放出を防止し、肺胞における高タンパク質液体の浸潤及び肺胞上皮細胞損傷を軽減するための噴霧吸入を通じた治療のために使用されることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。

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