CN114306621B - 一种携带核酸药物的细胞外泌体及其制备方法与在免疫治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种携带核酸药物的细胞外泌体及其制备方法与在免疫治疗中的应用，所述外泌体是巨噬细胞来源的外泌体（Macrophage‑derived Extracellular Vesicles，Mac‑EVs）,所携带的核酸药物siRNA为siCCR2，该Mac‑EVssiCCR2经静脉注射可有效降低脓毒血症患者体内的炎症风暴水平。

Description

一种携带核酸药物的细胞外泌体及其制备方法与在免疫治疗 中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术，涉及一种携带核酸药物的细胞外泌体及其制备方法与在免疫治疗中的应用，具体涉及一种携带siCCR2的细胞外泌体及其制备方法与在脓毒血症治疗中的应用。
背景技术
外泌体（Extracellular Vesicles，EVs）是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡（30-150nm），多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。有关外泌体分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究。外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。
小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA），有时称为短干扰RNA（shortinterfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），为一种长20～25个核苷酸的小分子RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。不过这些复杂机制的反应途径目前尚未明了。
发明内容
针对脓毒血症存在治疗效果还需改善、治疗花费高的问题，本发明公开了一种携带核酸药物的细胞外泌体及其制备方法与在脓毒血症治疗中的应用。
本发明采用如下技术方案：
一种携带核酸药物的细胞外泌体，由巨噬细胞外泌体与核酸药物组成；所述核酸药物为siCCR2。
发明公开了上述携带核酸药物的细胞外泌体的制备方法为，采用电转程序，将核酸药物电转至巨噬细胞外泌体内，得到携带核酸药物的细胞外泌体。
本发明公开了上述携带核酸药物的细胞外泌体在脓毒血症治疗中的应用；或者在制备脓毒血症治疗药物中的应用。
本发明中，将巨噬细胞离心去除细胞沉淀，收集上清，再经超高速离心收集巨噬细胞外泌体，然后进行核酸药物电转程序，将核酸药物电转至巨噬细胞外泌体内，得到携带核酸药物的细胞外泌体。优选的，超高速离心为80000～120000g离心50～100分钟；优选的，上清过滤后经过8000～12000g离心去除细胞碎片后，再次获得的上清再经超高速离心，收集沉淀为细胞外泌体。
脓毒血症是机体感染后引起的一种全身性免疫反应，研究表明脓毒症引起细胞因子风暴特别是TNF、IL-1、IL-6等因子大量释放从而加重炎症反应，抑制天然免疫系统被激活不利于清除入侵细菌；本发明首次以巨噬细胞高亲和性的外泌体为载体，装载siCCR2，改善脓毒血症。实验结果表明Mac-EVssiCCR2提高脓毒症小鼠的存活率，减轻肺水肿和肺部炎症情况，降低脓毒症小鼠肺部的炎症反应；尤其与干细胞外泌体相比，巨噬细胞外泌体做载体低脓毒症小鼠体内的炎症风暴效果明显优于干细胞外泌体做载体。
附图说明
图1为鼠的存活率；
图2为减轻肺水肿；
图3为肺部炎症情况；
图4为肺的流式图。
具体实施方式
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用Mac-EVssiCCR2治疗脓毒血症的新用途，具体的是Mac-EVssiCCR2可用于制备治疗脓毒血症药物；具体的给药方式可采取静脉注射等。
本发明涉及的原料都为现有产品，具体制备方法与实验操作都为现有技术。以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例 Mac-EVssiCCR2治疗脓毒血症
所使用的主要材料和来源分别如下：
C57BL/6J小鼠（昭衍（苏州）新药研究中心提供，此实验由苏州大学伦理委员会批准）；手术器械（六六视觉公司，苏州）；缝合针线（上海浦东金环医疗用品有限公司，上海）；小鼠巨噬细胞（mMac）；小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSC）；siNC（吉玛基因）；siCCR2（吉玛基因，mus, 5’-uGcuAAAcGucucuGcAAAdTsdT-3’）；电转仪；流式细胞仪。
小鼠脓毒血症模型的建立：选用25g左右的C57BL/6J雄性小鼠为实验对象，采用CLP手术创建脓毒症小鼠模型。腹腔注射麻醉后，腹中部纵切口切开外层皮肤及腹部薄膜，取出盲肠，在盲肠的50%处使用4-0线结扎，使用22G针头穿过盲肠两侧，挤出粪便，将盲肠放入腹部，缝合关腹腔；皮下注射1ml的生理盐水，完成手术。
Mac-EVs提取及siRNA电转至Mac-EVs：市购小鼠巨噬细胞常规培养（所使用的培养基和血清为RPMI1640和无外泌体血清）后，2000g离心去细胞沉淀，收集mMac的细胞上清，上清用0.22μm滤器过滤后再次10000g离心去除细胞碎片，最后以110000g离心70min收集外泌体，并重悬沉淀，BCA测外泌体浓度；采用MSC Human 电转程序，将100μg siCCR2电转至100μg Mac-EVs，得到Mac-EVssiCCR2。
根据上述方法，将siCCR2替换为siNC，得到Mac-EVssiNC，作为空白对照。
BMSC-EVs提取及siRNA电转至BMSC-EVs：市购小鼠骨髓间充质干细胞常规培养（所使用的培养基和血清为小鼠骨髓间充质干细胞专用培养基和无外泌体血清）后，2000g离心去细胞沉淀，收集mBMSC的细胞上清，上清用0.22μm滤器过滤后再次10000g离心去除细胞碎片，最后以110000g离心70min收集外泌体，并重悬沉淀，BCA测外泌体浓度；采用MSC Human电转程序，将100μg siCCR2电转至100μg BMSC-EVs，得到BMSC-EVssiCCR2，作为对比。
小鼠生存曲线统计：术后4h尾静脉注射Mac-EVssiNC和Mac-EVssiCCR2；每隔12h统计小鼠的生存状况，采用GraphPad软件分析小鼠生存曲线。
HE染色：术后4h尾静脉注射Mac-EVssiNC和Mac-EVssiCCR2，术后24h处死小鼠，取小鼠右肺组织进行组织染色，观察治疗效果。按常规HE染色步骤进行，在普通光学显微镜下观察并拍照。
肺干湿比：术后4h尾静脉注射Mac-EVssiNC、BMSC-EVssiCCR2和Mac-EVssiCCR2；术后24h处死小鼠，取小鼠左肺组织进行称重，烘干后再进行称重，进行干湿比统计，观察治疗效果。
实验结果：Mac-EVssiCCR2提高脓毒症小鼠的存活率（图1），减轻肺水肿和肺部炎症情况（图2和3），图4为肺的流式图；*P < 0.05，***P < 0.001。另外，BMSC-EVssiCCR2改善肺部炎症的效果不如Mac-EVssiCCR2，统计学具有差异（*）。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【结论】本发明公开了一种用于治疗脓毒血症的载药外泌体—Mac-EVssiCCR2，涉及一种携带siCCR2的细胞外泌体及其制备方法与在脓毒血症治疗中的应用。上述实验结果综合证明：Mac-EVs装载siCCR2，降低脓毒症小鼠体内的炎症风暴，提高脓毒症小鼠的存活率。
脓毒血症是指由感染引起的全身炎症反应综合征，临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶，虽然脓毒血症是由感染引起，但是一旦发生后，其发生发展遵循其自身的病理过程和规律。脓毒症的病情凶险，病死率高，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒血症的病死率仍然高，并且脓毒血症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。本发明的目的在于提供一种利用Mac-EVssiCCR2治疗脓毒血症的新用途，具体的是Mac-EVssiCCR2可用于制备治疗脓毒血症药物；具体的给药方式可采取静脉注射等，经Mac-EVssiCCR2治疗，提高了CLP术后小鼠的存活率。

Claims (7)

1.一种携带核酸药物的细胞外泌体，其特征在于，由细胞外泌体与核酸药物组成；所述核酸药物为siCCR2；所述细胞外泌体为巨噬细胞外泌体。
2.权利要求1所述携带核酸药物的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，采用电转程序，将核酸药物电转至细胞外泌体内，得到携带核酸药物的细胞外泌体。
3.根据权利要求2所述携带核酸药物的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，将细胞离心去除细胞沉淀，收集上清，再经超高速离心收集细胞外泌体。
4.根据权利要求3所述携带核酸药物的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，超高速离心为80000～120000g离心50～100分钟。
5.根据权利要求3所述携带核酸药物的细胞外泌体的制备方法，其特征在于，上清过滤后经过8000～12000g离心去除细胞碎片后，再次获得的上清再经超高速离心，收集沉淀为细胞外泌体。
6.权利要求1所述携带核酸药物的细胞外泌体在制备脓毒血症治疗药物中的应用。
7.权利要求1所述携带核酸药物的细胞外泌体在制备免疫治疗药物中的应用。
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