CN117050936A - 新亚群的人脐带间充质干细胞、其外泌体、制剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新亚群的人脐带间充质干细胞、其外泌体、制剂和应用，特别是涉及新亚群的人脐带间充质干细胞或者由该新亚群人脐带间充质干细胞所产生的上清纯化得到的外泌体，所述干细胞或外泌体可用于制备雾化治疗肺纤维化疾病的制剂。特别是，本发明包括：新亚群的人脐带间充质干细胞或者干细胞制剂；新亚群的人脐带间充质干细胞产生的上清或者上清纯化后的外泌体；新亚群的人脐带间充质干细胞产生的上清纯化后的外泌体制剂；利用新亚群间充质干细胞培养后得到的外泌体的制剂雾化治疗肺纤维化疾病。本发明对于肺纤维化及其相关疾病的治疗和预后具有重大的价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种新亚群的人脐带间充质干细胞、其外泌体、其制剂，以它们在雾化治疗肺纤维化产品中的应用，具体涉及新亚群的人脐带沃顿区间充质干细胞、其外泌体、其制剂，以它们在治疗肺纤维化产品中的应用。
背景技术
干细胞来源的外泌体是干细胞在静息或缺氧应激、辐照、氧化损伤等刺激下分泌产生的细胞外囊泡[1],可通过选择性的转运蛋白质、mRNA、microRNA来充当干细胞与已分化细胞的信号分子[2]。从2007-2017年，间充质干细胞外泌体领域开展的主要是外泌体机制方面的基础研究；2017-2018年，主要进行的是外泌体表达、分化、生长、再生等方面的研究，并初步开始了外泌体在疾病治疗中的探索和尝试；2018年至今，随着对间充质干细胞外泌体的了解和研究，开始了外泌体用于更多疾病治疗中的探索，逐步开始了外泌体在心脏疾病、肾脏疾病、骨科疾病、炎症等相关疾病治疗中的尝试。现有研究已证明间充质干细胞外泌体在减少心肌梗死面积[3]，减轻肢体缺血[4]，增进伤口愈合[5,6]，改善移植物抗宿主病(graftversus-host disease,GVHD)[6,7]，减少肾损伤[8]，促进肝再生[9]，减轻视网膜损伤[10]，以及最近改善软骨[11]和骨再生[12]等方面具有重要作用。
目前，间充质干细胞外泌体领域还存在一些瓶颈问题，如外泌体分离纯化的方法尚未形成适应于大规模药物制剂应用的规范方法，影响研究结果的可重复性。外泌体进入受体细胞后的转归、生物分布、药代动力学和靶向递送器官分布的特异性以及疾病的治疗机制尚未完全阐明。与单克隆抗体产品相比，其规模量产、成分异质性、保存需要冷链等因素均是产业化发展、用于临床标准化需要解决的问题。
CN112826833A没有提到针对肺纤维化的GP130阳性干细胞的外泌体。
CN114269358A公开了源自间充质干细胞(MSC)的外泌体对肺纤维化的治疗，但对GP130阳性的干细胞没有任何公开。
发明内容
本发明的目的是提供一种新亚群的人脐带间充质干细胞、其外泌体、其制剂，以它们在雾化治疗肺纤维化产品中的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种间充质干细胞的外泌体，所述间充质干细胞的GP130的阳性率在95％以上。
在本发明的一个实施方式中，所述间充质干细胞的外泌体的特征在于：所述间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞，
所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料，制备得到脐带间充质干细胞，制备过程中采用低血清培养基。
在本发明的一个实施方式中，所述间充质干细胞的外泌体特征在于：所述脐带间充质干细胞为原代脐带间充质干细胞或传代后的脐带间充质干细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)采用低血清培养基培养离体的脐带沃顿区组织块7-10天；
(2)完成步骤(1)后，弃除组织块，采用低血清培养基培养细胞至80％汇合度；
(3)完成步骤(2)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P0代脐带间充质细胞；
(4)完成步骤(3)后，将所述P0代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(5)完成步骤(4)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞；
(6)完成步骤(5)后，将所述P1代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(7)完成步骤(6)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞；
(8)完成步骤(7)后，将所述P2代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(9)完成步骤(8)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为所述细胞制剂。
在本发明的一个实施方式中，所述间充质干细胞的外泌体特征在于：所述间充质干细胞的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上，并且CD31和CD34的阳性率低于5％
在本发明的一个实施方式中，所述间充质干细胞的外泌体的制备方法包括如下步骤：
(1)收集10代以内的所述脐带间充质干细胞的培养上清；
(2)第一次离心800g，5分钟，室温；
(3)收集上清第二次离心2000g，10分钟，室温；
(4)然后0.22μm的滤膜过滤；
(5)装入超速离心管离心11000g，1小时30min，4℃；
(6)弃上清，用1mlPBS重悬并测浓度。
在本发明的一个方面，涉及一种用于治疗肺纤维化的药物，其包含以上限定的间充质干细胞的外泌体。
在本发明的一个实施方式中，所述药物为雾化剂型。
在本发明的一个方面，涉及所述的间充质干细胞的外泌体在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述药物通过雾化施用于肺。
根据本发明的细胞外泌体通过直接抵达肺泡，影响患者肺部的免疫微环境，调节患者的免疫平衡，溶解细胞外基质，从而达到治疗肺纤维化的目的。本发明提供的细胞外泌体雾化制剂，适用于肺纤维化及其相关疾病的细胞治疗。所述肺纤维化的相关疾病包括肺纤维化的并发症及发病机理相似的疾病，如肺损伤、肺炎等。本发明对于肺纤维化及其相关疾病的治疗具有重大的应用价值。
附图说明
图1为间充质干细胞的标志物(CD29、CD44、CD90、CD105)的结果。
图2为间充质干细胞GP130亚群的典型基因表达量。
图3为肺纤维化小鼠表型观察的结果。
图4为小鼠肺病理检测的结果。
图5为小鼠肺MicroCT的检测结果。
具体实施方式
本发明首先保护这种新亚群的间充质干细胞及上清及纯化后得到的外泌体。
上述应用中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。所述以脐带沃顿区组织块为原料制备脐带间充质干细胞的过程中采用无血清培养基。所述脐带为离体脐带。所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。所述新亚群的间充质干细胞是利用细胞表面的标志物GP130通过流式细胞仪分选得到的这群细胞。所述传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的GP130阳性脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的GP130阳性脐带间充质干细胞，更具体为传代5代的GP130阳性脐带间充质干细胞。所述上清是间充质干细胞传代培养至90-95％汇合度的细胞培养基。所述新亚群间充质干细胞外泌体是GP130阳性间充质干细胞培养后所得上清，纯化后为外泌体。所述外泌体制剂为利用生理盐水稀释成一定颗粒数的外泌体。所述治疗肺纤维化的外泌体制剂是指浓度是每毫升生理盐水中外泌体颗粒数是2x109的溶液。
本发明还保护新亚群细胞或上清及外泌体制剂雾化治疗用于肺纤维化的应用。
上述应用中，所述细胞制剂的制备方法包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料，制备得到脐带间充质干细胞，制备过程中采用无血清培养基。
所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。
所述原代脐带间充质干细胞的制备方法依次包括如下步骤：
(1)采用低血清培养基培养脐带沃顿区组织块，直至有细胞爬出；
(2)采用低血清培养基培养细胞；
(3)收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为原代脐带间充质细胞。
所述传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代5代的脐带间充质干细胞。所述传代的方法具体可为：将脐带间充质细胞1：3传代，采用无血清培养基培养细胞，收集细胞，酶消化，收集细胞。
进一步的，所述间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)采用无血清培养基培养离体的脐带沃顿区组织块7-10天；
(2)完成步骤(1)后，弃除组织块，采用无血清培养基培养细胞至80％汇合度；
(3)完成步骤(2)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P0代脐带间充质细胞；
(4)完成步骤(3)后，将所述P0代脐带间充质细胞1：2传代，采用无血清培养基培养至80％汇合度；
(5)完成步骤(4)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞；
(6)完成步骤(5)后，将所述P1代脐带间充质细胞1：3传代，采用无血清培养基培养至80％汇合度；
(7)完成步骤(6)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞；
(8)完成步骤(7)后，将所述P2代脐带间充质细胞1：3传代，采用无血清培养基培养至80％汇合度；
(9)完成步骤(8)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为所述细胞制剂。
以上任一所述细胞制剂为GP130阳性的细胞制剂，GP130的阳性率在95％以上，优选为99％以上。以上任一所述细胞制剂为CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上的细胞制剂，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率优选在95％以上，进一步优选在99％以上。以上任一所述细胞制剂的CD31和CD34的阳性率低于5％，优选低于3％。CD29、CD44、CD90和CD105均为鉴定间充质干细胞常用的表面标志物，CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率高说明细胞制剂是间充质干细胞且其纯度很高。CD31是内皮祖细胞的标志物、CD45是白细胞的标志物和CD34是造血干细胞的标志物，CD31、CD45以及CD34的三个指标的阳性率低，说明细胞制剂纯度很高。GP130是该发明鉴定间充质干细胞质量以及治疗有效性的表面标志物。图2为间充质干细胞GP130亚群的典型基因表达量。
上述应用中，所述上清制剂的制备方法包括如下步骤：
(1)采用无血清培养基培养所述10代以内脐带间充质干细胞，采用无血清培养基培养至90-95％汇合度；
(2)收集步骤(1)细胞的培养基上清，即为所述培养上清。
上述应用中，所述外泌体制备方法包括如下步骤：
(7)收集10代以内脐带间充质干细胞的培养上清；
(8)第一次离心800g，5分钟，室温；
(9)收集上清第二次离心2000g，10分钟，室温；
(10)然后0.22μm的滤膜过滤；
(11)装入超速离心管离心11000g，1小时30min，4℃；
(12)弃上清，用1mlPBS重悬并测浓度。
本发明还保护一种用于治疗肺纤维化的外泌体的雾化药物。
本发明保护的用于雾化治疗肺纤维化的药物的活性成分为GP130阳性的间充质干细胞培养得到的上清或者外泌体制剂。
上述药物中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。所述脐带间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞。以脐带沃顿区组织块为原料制备脐带间充质干细胞的过程中采用低血清培养基。所述脐带为离体脐带。所述脐带间充质干细胞可为原代脐带间充质干细胞也可为传代后的脐带间充质干细胞。传代后的脐带间充质干细胞可为传代20代以内的脐带间充质干细胞，具体为传代10代以内的脐带间充质干细胞，更具体为传代5代的脐带间充质干细胞。
以上任一所述无血清培养基为不含血清的细胞培养基。
以上任一所述无血清培养基的组成如下：人上皮生长因子10ng/mL、人碱性成纤维生长因子10ng/mL、重组人胰岛素样生长因子5μg/mL、血小板衍生因子10ng/mL、肝素5μg/mL、氢化可的松1μg/mL、抗坏血酸10μg/mL、非必需氨基酸溶液1％(体积百分比)、L-谷氨酰胺2mmol/L、余量为DMEM高糖培养基。
非必需氨基酸溶液中含有Glycine 10mM、L-Alanine 10mM、L-Asparagine 10mM、L-Aspartic acid 10mM、L-Glutamic Acid 10mM、L-Proline 10mM、L-Serine 10mM。
本发明中采用无血清培养基来进行培养。在间充质干细胞培养方面，通常使用10％(体积百分数)的胎牛血清，有的血清浓度高达20％(体积百分比)。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、碳水化合物、生长因子、激素等。血清成分复杂，每批血清之间都有差别，不能保证其成分一致。另外，虽然血清内含有很多利于细胞生长的成分，但不可避免的含有一些对细胞有伤害的成分，如补体、抗体、内毒素等。因此，高浓度血清培养出的细胞不适合于临床应用，会增加了临床过敏的风险。本发明的发明人发现，无血清培养基对于细胞生长、增殖、形态及功能无不良影响。
免疫治疗常用的间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等。与常用的骨髓间充质干细胞(MSCs)相比，脐带沃顿区间充质干细胞具有来源丰富、对供体无影响、易于采集和运输、致癌性可能性小、病毒污染概率低、无社会、伦理和法律方面争议等诸多优点。更重要的是从脐带沃顿区分离的间充质干细胞含量高，产生的外泌体具有免疫原性低，稳定性和均一性高，易存储的特点。
细胞外泌体是通过直接抵达肺泡，影响患者肺部的免疫微环境，调节患者的免疫平衡，溶解细胞外基质，从而达到治疗肺纤维化的目的。本发明提供的细胞外泌体雾化制剂，适用于肺纤维化及其相关疾病的细胞治疗。所述肺纤维化的相关疾病包括肺纤维化的并发症及发病机理相似的疾病，如肺损伤、肺炎等。
本发明对于肺纤维化及其相关疾病的治疗具有重大的应用价值。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所使用的各试剂的配方或来源：
无血清培养基：人上皮生长因子10ng/mL、人碱性成纤维生长因子10ng/mL、重组人胰岛素样生长因子5μg/mL、血小板衍生因子10ng/mL、肝素5μg/mL、氢化可的松1μg/mL、抗坏血酸10μg/mL、非必需氨基酸溶液1％(体积百分比)、L-谷氨酰胺2mmol/L，余量为DMEM高糖培养基。
人上皮生长因子(hEGF)：GenScript公司，产品全称为EGF Recombinant HumanProtein，货号为Z00333。
人碱性成纤维生长因子(b-FGF)：GenScript公司，货号为Z03116。
重组人胰岛素样生长因子(IGF)：GenScript公司，货号为Z03017。
血小板衍生因子(PDGF)：GenScript公司，货号为Z02529。
弗氏完全佐剂：Chondrex公司，货号为7001。
弗氏不完全佐剂：Chondrex公司，货号为7002。
肝素：迈晨公司。
氢化可的松：迈晨公司。
抗坏血酸：迈晨公司。
非必需氨基酸溶液为GibcoTMMEM Non-Essential Amino Acids Solution，(100X)，货号为11140050。网址如下：https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/technical-resources/media-formulation.165.html。该产品中具有七种氨基酸，组成如下：Glycine 10.0mM、L-Alanine 10.0mM、L-Asparagine 10.0mM、L-Aspartic acid10.0mM、L-Glutamic Acid 10.0mM、L-Proline 10.0mM、L-Serine 10.0mM。
C57小鼠：北京维通利华有限公司。
实施例1、脐带沃顿区间充质干细胞制剂的制备
一、胎儿脐带的获取
取足月、无先天性疾病的新生儿的离体脐带；该产妇无肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病，产妇及家属对脐带用于试验研究均知情同意。
二、脐带沃顿区间充质细胞的获取
1、脐带的预处理
在无菌实验台内，将脐带用生理盐水反复冲洗，洗去残余血液。用无菌手术器械将脐带剪成2-3cm的小段，将脐带纵向剖开，去除脐动脉、脐静脉和羊膜，取沃顿区，剪成0.5-1mm3左右的小块。
2、原代脐带间充质细胞的获得
采用组织块培养法获得原代脐带间充质细胞，具体步骤如下：
(1)将步骤1得到的沃顿区组织块均匀的铺在直径为10cm的无菌培养皿内，覆盖60-70％皿底面积，倒置放入37℃培养箱15min；翻转培养皿，轻轻加入10mL低血清培养基，在37℃，5％CO2的培养箱内培养7-10天，此时组织块下均匀爬出细胞。
(2)完成步骤(1)后，取培养皿，用PBS缓冲液清洗2次，弃除组织块(此时细胞已贴壁生长)，每皿加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(3)完成步骤(2)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为原代脐带间充质细胞，又称P0代脐带间充质细胞。
3、P3代脐带间充质细胞的获得
(1)将步骤2获得的P0代脐带间充质细胞平均分到两个直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(2)完成步骤(1)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞。
(3)完成步骤(2)后，将P1代脐带间充质细胞平均分到直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(4)完成步骤(3)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化细胞1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞。
(5)完成步骤(4)后，将P2代脐带间充质细胞平均分到直径为10cm的无菌培养皿内(1：2传代)，每个培养皿内分别加入10mL新鲜的低血清培养基(3-4天换液一次)，培养至细胞铺满培养皿底80％左右。
(6)完成步骤(5)后，收集细胞，用0.25％的胰酶消化细胞1-2min，1000rpm离心3min，收集细胞，即为P3代脐带间充质细胞(又称P3细胞制剂)。
实施例2、P3细胞外泌体雾化的制备
供试品为实施例1制备的P3细胞制剂。
用流式细胞术检测供试品中CD29、CD44、CD90、CD105、CD126、CD31、CD45、CD34及HLA-DR的表达，具体步骤如下：将细胞(供试品)分别与相应抗体共同孵育后，洗去多余的抗体，用PBS缓冲液重悬细胞，利用BD公司的LSR Fortessa仪器检测各指标的阳性率。
间充质干细胞的标志物(CD29、CD44、CD90、CD105和CD126)的检测结果见图1。结果表明，供试品高表达间充质干细胞的标志物(阳性率均在97％以上)。
用流式细胞术分选供试品中GP130阳性的细胞。具体步骤如下：将细胞(供试品)分别与相应抗体共同孵育后，洗去多余的抗体，用PBS缓冲液重悬细胞，利用BD公司的LSRFortessa仪器分选得到GP130阳性的细胞。
无血清培养基培养所述分选获得的GP130阳性的细胞脐带间充质干细胞，培养至90-95％汇合度；收集细胞的培养基上清，即为所述培养上清。第一次离心800g，5分钟，室温；收集上清第二次离心2000g，10分钟，室温；然后0.22μmum的滤膜过滤，装入超速离心管离心11000g，1小时30min，4℃,弃上清，用1mlPBS重悬并测浓度。
实施例3、GP130亚群细胞外泌体对肺纤维化的治疗效果
一、制备模型和给药
供试小鼠：6-8周，C57BL/6小鼠，进行适应饲养一周(清洁级动物饲养房，自由摄取食水)。采用博来霉素对小鼠进行肺炎模型诱导。根据是否给药及给药的不同分为如下各组：
正常对照组(5只)：用0.05ml生理盐水对每只小鼠进行气管滴注。从气管滴注第二天开始，每天生理盐水雾化30min,连续14天。
细胞外泌体治疗组(8只)：用0.05ml博来霉素(2mg/ml)对每只小鼠进行气管滴注。从气管滴注第二天开始，。每天GP130亚群细胞外泌体或脐带间充质干细胞外泌体雾化30min,连续14天。
模型组(8只)：用0.05ml博来霉素(2mg/ml)对每只小鼠进行气管滴注。从气管滴注第二天开始，。每天生理盐水雾化30min,连续14天。
从气管滴注当天开始算起，处死小鼠，第18天收集样本。
二、表型观察
图3为肺纤维化小鼠表型观察的结果。
试验第17天，对各组小鼠进行MicroCT拍照，评估小鼠的肺部纤维化情况。
结果见图5(Ctrl为正常对照组，盐水为模型组，GP130-EXO为GP130亚群细胞外泌体雾化治疗组，UCMSC-EXO为脐带间充质干细胞外泌体雾化治疗组)。与模型组相比，细胞外泌体雾化治疗组小鼠的肺部阴影面积大幅度减少，即细胞外泌体雾化对于肺纤维化具有显著的治疗作用。
三、小鼠肺部病理检测
试验第18天，取小鼠的肺部，制作石蜡切片(切片厚度为4μm)，然后进行H&E和马松染色。
结果见图4(Ctrl为正常对照组，盐水为模型组，GP130-EXO为GP130亚群细胞外泌体雾化治疗组，UCMSC-EXO为脐带间充质干细胞外泌体雾化治疗组)。正常对照组小鼠的肺部正常小鼠的肺部通常呈粉红色或淡红色。在H&E染色下，正常小鼠肺泡壁薄，上皮细胞排列整齐，间质内有一些浅色细线状结构，为血管和支气管等组织间隔。马松染色可以更清晰地显示出肺组织中的弹性纤维和胶原纤维等成分，呈淡蓝色。模型组小鼠的肺部呈暗红色，质地较硬。在H&E染色下，小鼠肺组织切片纤维化区域通常出现肺泡减少，染色区域呈现出粉红色或玫瑰红色，与周围正常肺组织形成明显的对比。此外，纤维化区域中也可能出现炎症细胞浸润、血管增生等病理改变的表现。马松染色则更清晰的显示出纤维化的程度和范围，纤维化区域中呈现出深蓝色或紫色的颜色，在严重肺纤维化的情况下，还可能出现大量胶原沉积和肺泡结构破坏的表现。
以上结果表明GP130阳性的间充质干细胞外泌体比脐带间充质干细胞外泌体对肺纤维化有更好的治疗效果。
引用文献列表
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Claims (10)
1.一种间充质干细胞的外泌体，所述间充质干细胞的GP130的阳性率在95％以上。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞的外泌体，其特征在于：所述间充质干细胞是以脐带沃顿区组织块为原料制备得到的脐带间充质干细胞，
所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：以脐带沃顿区组织块为原料，制备得到脐带间充质干细胞，制备过程中采用低血清培养基。
3.如权利要求2所述的间充质干细胞的外泌体，其特征在于：所述脐带间充质干细胞为原代脐带间充质干细胞或传代后的脐带间充质干细胞。
4.如权利要求2所述的间充质干细胞的外泌体，其特征在于：所述脐带间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
(1)采用低血清培养基培养离体的脐带沃顿区组织块7-10天；
(2)完成步骤(1)后，弃除组织块，采用低血清培养基培养细胞至80％汇合度；
(3)完成步骤(2)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P0代脐带间充质细胞；
(4)完成步骤(3)后，将所述P0代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(5)完成步骤(4)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P1代脐带间充质细胞；
(6)完成步骤(5)后，将所述P1代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(7)完成步骤(6)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为P2代脐带间充质细胞；
(8)完成步骤(7)后，将所述P2代脐带间充质细胞1：2传代，采用低血清培养基培养至80％汇合度；
(9)完成步骤(8)后，收集细胞，胰酶消化，收集细胞，即为所述脐带间充质干细胞。
5.如权利要求1所述的间充质干细胞的外泌体，所述间充质干细胞的CD29、CD44、CD90和CD105的阳性率均在90％以上，并且CD31和CD34的阳性率低于5％。
6.如权利要求1所述的间充质干细胞的外泌体，所述外泌体制备方法包括如下步骤：
(1)收集10代以内的所述间充质干细胞的培养上清；
(2)第一次离心800g，5分钟，室温；
(3)收集上清第二次离心2000g，10分钟，室温；
(4)然后0.22μm的滤膜过滤；
(5)装入超速离心管离心11000g，1小时30min，4℃；
(6)弃上清，用1mlPBS重悬并测浓度。
7.一种用于治疗肺纤维化的药物，其包含权利要求1-6中任一项所述的间充质干细胞的外泌体。
8.如权利要求7所述的药物，所述药物为雾化剂型。
9.权利要求1-6中任一项所述的间充质干细胞的外泌体在制备治疗肺纤维化的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，所述药物通过雾化施用于肺。
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