CN116584479A - 一种细胞冷藏保护液及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞冷藏保护液及其制备方法和应用，属于细胞保存技术领域。本发明提供了一种细胞冷藏保护液，配方组成包括复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖。制备所述细胞冷藏保护液时，在室温无菌条件下混匀配制。利用本发明所述细胞冷藏保护液对干细胞制剂进行冷藏时，冷藏96h后干细胞活力依然为85％以上，且能够保持干细胞生长增殖能力和分化潜能。
Description
技术领域
本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种细胞冷藏保护液及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，细胞生物治疗技术逐渐代替传统药物治疗，在各大疾病领域上发挥重要作用。细胞治疗是指利用具有某些特定功能的细胞，采用生物工程方法通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。
MSCs或者成纤维细胞在临床使用过程中往往需要长途运输，细胞在运输过程中细胞活性会受到运输环境的影响而导致下降，如使用的细胞经历过冻存复苏，细胞的活率及活性比较低，在氯化钠注射液中的保存时间较短。而在临床应用的过程中往往需要10小时乃至2～3天的运输时间，不利于细胞的运输应用。
氯化钠注射液是最常用的细胞重悬液，也是常用的细胞运输保存液，本身属于临床用品，优势在于实验室制备好细胞重悬后不需要再次处理，可直接用于临床。氯化钠注射液在短期运输可以使用，其保证细胞的活性时间约10h，但在长期运输过程中细胞活性会随时间逐渐下滑，无法进行长途运输。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞冷藏保护液及其制备方法和应用，使得细胞制剂在冷链条件下长时间运输、长时间保存时，保持细胞生物活性稳定、可控。
本发明提供了一种细胞冷藏保护液，包括以下组分：复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖。
优选的，包括以下体积百分含量的组分：复方电解质溶液30～60％、红细胞保存液10～35％、肝素钠水溶液3～30％、人血白蛋白溶液10～30％、人血小板裂解物2～15％和葡萄糖水溶液5～20％。
优选的，所述肝素钠水溶液中肝素钠的浓度为100～500单位/mL；
优选的，所述人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量百分含量为20％。
优选的，所述葡萄糖水溶液中葡萄糖的质量浓度为20g/100mL。
本发明还提供了上述细胞冷藏保护液的制备方法，将复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖在无菌环境中混合，得所述细胞冷藏保护液。
本发明还提供了上述细胞冷藏保护液在细胞样品冷链保藏和/或冷链运输中的应用。
优选的，所述细胞样品包括干细胞样品。
优选的，所述细胞样品包括神经干细胞、间充质干细胞或脂肪基质细胞。
优选的，所述冷链保藏和/或冷链运输的温度均为2～8℃。
有益效果：本发明提供了一种细胞冷藏保护液，配方组成包括复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖。制备所述细胞冷藏保护液时，在室温无菌条件下混匀配制。利用本发明所述细胞冷藏保护液对干细胞制剂进行冷藏时，冷藏96h后干细胞活力依然为85％以上，且能够保持干细胞生长增殖能力和分化潜能。
附图说明
图1为细胞冷藏保护液实验组hUC-MSCs贴壁0h、24h、48h、72h、96h后细胞状态图；
图2为氯化钠注射液对照组hUC-MSCs贴壁0h、24h、48h、72h、96h后细胞状态图；
图3为细胞冷藏保护液实验组的hUC-MSCs分别保存0h、24h、48h、72h、96h后的分化结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞冷藏保护液，包括以下组分：复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖。
本发明所述细胞冷藏保护液的组分中包括复方电解质溶液，所述复方电解质溶液的体积优选为所述细胞冷藏保护液体积的30～60％，更优选为40％。本发明所述复方电解质溶液优选包含氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等多种物质，为细胞能量代谢及时补充营养物质，有利于更好地维持细胞生命活动。本发明所述复方电解质溶液优选为市售产品，商品名为勃脉力A。
本发明所述细胞冷藏保护液的组分中包括红细胞保存液，所述红细胞保存液的体积优选为所述细胞冷藏保护液体积的范围为10～35％，更优选为15～30％，最优选为20％。本发明所述红细胞保存液为商品化药品，说明书显示体外对红细胞的保存时间为35天。
本发明所述细胞冷藏保护液的组分中包括肝素钠，且所述肝素钠在使用时以溶液形式存在，所述肝素钠水溶液中肝素钠的浓度为100～500单位/mL，更优选为150～400单位/mL，最优选为200单位/mL。本发明所述肝素钠水溶液优选为所述细胞冷藏保护液体积的3～30％，更优选为3～15％，最优选为5％。本发明所述肝素钠可有效避免因加入血小板裂解物产生凝结现象。
本发明所述细胞冷藏保护液的组分中包括人血白蛋白，且所述人血白蛋白在使用时优选以溶液形式存在，所述人血白蛋白溶液的浓度优选为20％。本发明所述细胞冷藏保护液中所述人血白蛋白溶液的体积百分含量优选为10～30％，更优选为10～20％，最优选为20％。本发明所述人血白蛋白为临床静脉使用上市药品，因其蛋白含量较高，对细胞活性具有保护作用。
本发明所述细胞冷藏保护液的组分中包括人血小板裂解物，且所述人血小板裂解物以液体形式存在。本发明所述细胞冷藏保护液中所述人血小板裂解物的体积百分含量优选为2～15％，更优选为2～10％，最优选为5％。本发明所述人血小板裂解物为商品化人血小板提取物质，其含有血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等多种细胞因子。本发明实施例中所用人血小板裂解物优选为血小板裂解物为商品化试剂，品牌为helios。
本发明所述细胞冷藏保护液的组分中包括葡萄糖，所述葡萄糖以葡萄糖水溶液形式进行添加，所述葡萄糖水溶液中葡萄糖的浓度为20g/100mL。本发明所述细胞冷藏保护液中所述葡萄糖水溶液的体积百分含量优选为5～20％，更优选为5～10％，最优选为10％。本发明所述葡萄糖浓度为20％，为细胞提供能量，有助于维持细胞活性。
本发明还提供了上述细胞冷藏保护液的制备方法，将复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖在无菌环境中混合，得所述细胞冷藏保护液。
本发明所述细胞冷藏保护液优选在室温(18～25℃)无菌条件下进行混匀，即配制完成。
本发明还提供了上述细胞冷藏保护液在细胞样品冷链保藏和/或冷链运输中的应用。
本发明所述细胞冷藏保护液可应用于细胞样品的长时间冷藏，所述细胞样品优选包括干细胞样品，更优选包括神经干细胞、间充质干细胞或脂肪基质细胞。本发明所述冷链保藏和/或冷链运输的温度优选为2～8℃。利用本发明所述细胞冷藏保护液对干细胞制剂进行冷藏时，冷藏96h后干细胞活力依然为85％以上，且能够保持干细胞生长增殖能力和分化潜能。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种细胞冷藏保护液及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、人脐带间充质干细胞制备方法
在产妇知情同意的情况下，在无菌操作下，采集足月顺产/剖妇产婴儿脐带组织1根，采用组织块贴壁法进行原代细胞提取分离，采用10％FBS的α-MEM培养基进行体外扩增培养至第5代，消化、离心，收获人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)于离心管中。
2、人脂肪间充质干细胞制备方法
在供者知情同意的情况下，吸取腹部脂肪50ml，采用胶原酶消化法提取原代细胞，采用10％FBS的α-MEM培养基进行体外扩增培养至第5代，消化、离心，收获人脂肪间充质干细胞(hAD-MSCs)于离心管中。
3、保存方式
分别将上述人脐带间充质干细胞和人脂肪间充质干细胞分成2份，1份加入细胞冷藏保护液，另一份加入氯化钠注射液和人血白蛋白。
3.1、细胞冷藏保护液保存
按照以下方法配制细胞冷藏保护液，依次加入复方电解质溶液45ml，红细胞保存液20ml，200单位/ml肝素钠5ml，20％人血白蛋白15ml，人血小板裂解物5ml，20％葡萄糖溶液10ml，无菌条件下混匀，取适量该细胞冷藏保护液混悬上述细胞沉淀。
3.2、氯化钠注射液保存
取上述细胞沉淀适量，加入氯化钠注射液，无菌条件下混匀，再加入终浓度为5％人血白蛋白溶液，混匀。
4、细胞活率
按照上述方法制备hUC-MSCs和hAD-MSCs，将两种细胞分别于细胞冷藏保护液和氯化钠注射液对照组中，均调整细胞浓度为2×105个/ml，每种配方配制100ml，均于2～8℃条件下避光保存，于0h、24h、48h、72h分别取样，采用AO/PI染色法，利用细胞计数仪检测细胞活率，结果如表1所示。
表1冷藏保存不同时间细胞活率的变化
5、免疫表型
(1)主要设备：流式细胞仪(厂家：BD)、离心机(厂家：Thermo)。
(2)主要试剂：CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR单克隆抗体(厂家：BD；货号：550257、555596、560839、557153、555412、555821、555482、555560)。
(3)实验方法：
取hUC-MSCs，按细胞浓度5×105个活细胞/管分装，共分装12管。分别加入不同荧光素标记的CD73、CD90、CD105、CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR单克隆抗体及同型对照，混匀，4℃避光孵育30min。
孵育完成后，分别加入氯化钠注射液，1ml/管，混匀，1800rpm离心7min，弃上清，重复洗涤1次，再分别加入氯化钠注射液，0.5ml/管，混匀，利用BD Calibur流式细胞仪上机检测，采用Flowjo.7.6软件进行数据分析。
(4)免疫表型标准：
CD73、CD90、CD105阳性率均≥95％
CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阳性率均≤2％
(5)检测结果
结果如表2所示，细胞冷藏保护液实验组0h、24h、48h、72h、96h免疫表型均符合标准；氯化钠注射液实验组0h、24h、48h免疫表型均符合标准，但72h、96h免疫表型存在差异显著，不符合标准。
表2冷藏保存不同时间细胞免疫表型的变化
6、细胞形态
将hUC-MSCs分别利用细胞冷藏保护液和氯化钠注射液进行稀释，稀释至细胞浓度5×105个活细胞/管进行扩增培养，分别统计扩增培养0h、24h、48h、72h、96h后细胞生长增殖情况。结果如图1和图2所示，氯化钠注射液对照组培养过程仅有很少量细胞贴壁，细胞冷藏保护液实验组细胞逐渐增殖，培养至96h，汇合度90％以上。
7、诱导分化成骨细胞
(1)主要设备：生物安全柜(厂家：北京东联哈尔仪器制造有限公司；型号：BSC-1100-LⅡA2)、CO2培养箱(厂家：Thermo；型号：371)、倒置显微镜(厂家OlympusCorporation；型号：CKX41)
(2)主要试剂：成骨分化诱导培养基(厂家：Stemcell；货号：05465)、0.2％茜素红染色液(厂家：北京索莱宝科技有限公司；货号：G1450)、高糖培养基(厂家：Gibco；货号：12800017)、胎牛血清(厂家：BI；货号：04-001-1ACS)
(3)实验方法：从氯化钠注射液对照组和细胞冷藏保护液实验组分别取冷藏条件下保存0h、24h、48h、72h、96h的hUC-MSCs适量，首先进行扩增培养至细胞汇合度约80％，扩增培养成功后，再按照2×105个活细胞/孔接种至6孔细胞培养板中，补加体积百分含量为10％胎牛血清的高糖培养基至2ml/孔，于37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞汇合度约80％时，更换成骨分化诱导培养基，2ml/孔，将第一次换液时间记为诱导分化的第1天，此后每3天换液1次，诱导分化培养21天。
诱导分化完成后，弃上清，加入氯化钠注射液洗涤1次，3ml/次；加4％组织细胞固定液，2ml/孔，固定30min，加入氯化钠注射液洗2次，3ml/次；加0.2％茜素红染色液，2ml/孔，染色30min，加入氯化钠注射液洗2次，3ml/次；在显微镜下扩大40倍用数码相机拍照。
实验结果如图3所示，氯化钠注射液对照组，取冷藏条件下保存0h、24h、48h、72h、96h的hUC-MSCs再进行扩增培养至24h、48h，细胞贴壁均很少，未见细胞增殖现象，故未进行诱导分化成骨实验；细胞冷藏保护液实验组，取冷藏条件下保存0h、24h、48h、72h、96h的hUC-MSCs再进行扩增培养后，各时间点取出的样品均能够生长增殖，培养至48h细胞汇合度约80％，各时间点的样品均进行诱导分化成骨实验，结果显示均能够分化成骨细胞，细胞冷藏保护液实验组各时间点样品分化成骨能力未见明显差异，说明保存至96h仍能够保持细胞的活性不变、细胞的生物学功能不变。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种细胞冷藏保护液，其特征在于，包括以下组分：复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖。
2.根据权利要求1所述细胞冷藏保护液，其特征在于，包括以下体积百分含量的组分：复方电解质溶液30～60％、红细胞保存液10～35％、肝素钠水溶液3～30％、人血白蛋白溶液10～30％、人血小板裂解物2～15％和葡萄糖水溶液5～20％。
3.根据权利要求2所述细胞冷藏保护液，其特征在于，所述肝素钠水溶液中肝素钠的浓度为100～500单位/mL。
4.根据权利要求2所述细胞冷藏保护液，其特征在于，所述人血白蛋白溶液中人血白蛋白的质量百分含量为20％。
5.根据权利要求2所述细胞冷藏保护液，其特征在于，所述葡萄糖水溶液中葡萄糖的质量浓度为20g/100mL。
6.权利要求1～5任一项所述细胞冷藏保护液的制备方法，其特征在于，将复方电解质溶液、红细胞保存液、肝素钠、人血白蛋白、人血小板裂解物和葡萄糖在无菌环境中混合，得所述细胞冷藏保护液。
7.权利要求1～5任一项所述细胞冷藏保护液在细胞样品冷链保藏和/或冷链运输中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述细胞样品包括干细胞样品。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于，所述细胞样品包括神经干细胞、间充质干细胞或脂肪基质细胞。
10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述冷链保藏和/或冷链运输的温度均为2～8℃。
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