JP4619362B2 - トランスフェリン不含・低鉄培地中での骨髄腫細胞培養 - Google Patents
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Description
1. トランスフェリンの非存在下では、ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞は高い鉄濃度(クエン酸第二鉄122.5mg/L)においては増殖するであろう(Kovar および Franek)。
2. 高い鉄濃度(例えばクエン酸第二鉄122.5mg/L)は沈殿を引き起こし、これが培養培地にダメージを与える(Bertheussen)。
3. トランスフェリンまたは親油性キレート剤の非存在下では、低い鉄濃度(それぞれ0.1〜10mg/Lおよび0.2mg/L)においては、振盪培養ではハイブリドーマ細胞は増殖せず、また骨髄腫細胞は全く増殖しないであろう(WO94/02592)。
4. 親油性キレート剤は、低い鉄濃度での振盪培養においてはハイブリドーマおよび骨髄腫細胞の増殖を可能にするために培地中に必要である(WO94/02592)。
5. 低い鉄濃度をある種の哺乳動物細胞の増殖のために用いることができるが、それはEDTAのような含窒素キレート剤の使用を伴う場合にのみ可能である(WO98/08934)。
(a) 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約0.03mg/L〜約3.2mg/Lで鉄を含有し、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである;および
(b) 適切な条件下で、振盪懸濁培養を用いて、接種された培養培地を増殖させるステップ、
を含む方法を提供する。
(a) 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度約0.2mg/L〜約20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含まないものである;および
(b) 適切な条件下で、振盪懸濁培養を用いて、接種された培養培地を増殖させるステップ、
を含む方法を提供する。
方法
グルタミン合成酵素(GS)発現システム(欧州特許明細書第2560550号)を用いてヒトIgG抗体を発現する組換えGS−NS0マウス骨髄腫細胞株(細胞株A)(キレート化鉄供給源を含む独自の無血清培地(GSF培地)中であらかじめ継代培養した)を遠心し、キレート剤不含培地中に再懸濁した。この培地に再懸濁した細胞をその後、接種密度2×105細胞/mlで実験用フラスコに接種するのに用いた。
図1aには、試験したFAC濃度範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度を示している。この図では、陰性対照培養は1回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことが明らかに示されている。0.2mg/LのFACを含有する培養では、最初の分裂後に増殖することが可能であったが、その後それ以上は増殖することができなかった。これらの培養物が当初の接種後に増殖することが可能であったという事実はおそらく、細胞分裂により枯渇することが避けられない鉄の細胞貯蔵の結果であろう。
方法
実施例2の方法はキレート化鉄の供給源のみを除いて実施例1のものと同一である。本実施例では、FACの代わりにクエン酸第二鉄(FC)を用いた。
図2aには、試験したFC濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。これは、陰性対照培養および0.2mg/LのFCを含有する培養では1回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことを示している。0.4、1および2mg/LのFCを含有する培養は、2回目の継代培養を越えて増殖することができなかった。したがって、試験した濃度では、数回の継代培養にわたる、および過剰増殖培養の間の継続的細胞増殖を支援するためには、10mg/Lかそれより高い濃度でFCが必要である。
方法
実施例3の方法は、以下の点を除いて実施例1のものと同一である:
抗Myc抗体産生マウスハイブリドーマ細胞株(9E10)(1mg/Lのヒトトランスフェリンおよび6mMのグルタミンを添加した改変CDSS中であらかじめ継代培養した)を、接種密度1×105細胞/mlで実験用フラスコに接種するのに用いた。
図3aには、試験したFAC濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。これは、陰性対照培養ならびに0.2および0.4mg/LのFACを含有する培養では1回目の継代培養を越えて増殖することができなかったことを示している。1、2および10mg/LのFACを含有する培養では2回目の継代培養を越えて増殖することができなかった。したがって、試験した濃度では、増殖を支援するためには50mg/Lまたはそれより高い濃度でFACが必要とされる。
実施例4では、鉄の供給源としてのFACの有用性についてさらに示す。本実施例では、第2の抗体産生組換えGS−NS0細胞株(細胞株B)を用いて、GSFとして知られる独自の無血清培地(唯一規定されていない成分としてウシ血清アルブミン[BSA]を含有する)中の唯一の鉄供給源としてFACを用いた。
10μMトロポロン(親油性鉄キレート剤[WO94/02592参照])および0.4mg/LのFACを鉄供給源として含有する独自の無血清培地中であらかじめ培養した細胞を遠心し、トロポロンおよび鉄不含GSF無血清培地中に再懸濁した。この培地に再懸濁した細胞を、その後、接種密度2×105細胞/mlで実験用フラスコに接種するのに用いた。
図4には、試験したFAC濃度の範囲に対する継代培養および最終的な過剰増殖の間の細胞濃度が示されている。この図では、0.8mg/Lおよびそれより高い濃度でFACを含有する培地では、陽性対照培養で見られるのと同等の増殖を支援することができたことが示されている。図4ではまた、過剰増殖培養での抗体産生についても示されている。これは、0.8mg/Lおよびそれより多いFACでは、対照と少なくとも同等の抗体産生を支援することができることを示している。抗体産生での傾向は、実施例1および2で見られたものとも非常に似通っている。
方法
細胞株Bの発酵は、5μMトロポロンおよび0.4mg/LのFAC(対照)、または1.0mg/LのFACを含有するGSF無血清培地を用いて行った。発酵は、半球型底部を備える7L(使用容量4.5L)Applikon発酵器中で、海洋用インペラーを用いて150rpmで振盪して行った。発酵は36.5℃、pH7.1にて操作し、溶解酸素圧15%を維持するために大気/酸素を分散した。
図5には、攪拌・気体分散発酵容器中で、5μMトロポロン/0.4mg/LのFAC(対照)または1mg/LのFACのいずれかを添加した培地を用いた場合には、同様の細胞増殖および産生特性が見られたことが示されている。
方法
それぞれ1mg/LのFACを含有する無血清GSF(タンパク質[BSA]含有)および無タンパク質GSF培地との比較を、細胞株A(実施例1参照)の攪拌・気体分散・流加(fed batch)発酵を用いて行った。無タンパク質発酵には、2ml/Lのコレステロール脂質濃縮物(実施例1参照)を添加し、また無血清発酵には1ml/LのCLOC添加物(実施例4参照)を添加した。発酵条件は実施例5に記載したのと同様とした。これら発酵物に対する接種物は発酵で用いたのと同じ培地中の細胞の継代培養から提供した。
図6には、2種類の発酵物での増殖および抗体産生が示されている。この図では、FACが両方の培地での良好な増殖および抗体産生を支援することができることが明らかに示されている。
以下の実施例では、実施例6の無タンパク質培地中の唯一の鉄供給源としてFACを用いることができること、およびこのFAC添加培地が一定範囲のGS−NSO細胞株について、かつ工業生産規模での高細胞密度および高力価までの増殖を支援することができることを示す。
異なる抗体を発現する3種類のGS−NSO細胞株(細胞株C、DおよびE)を、液体窒素貯蔵から、実施例6の無タンパク質・FAC含有培地中に直接的に復活させた。培養を無タンパク質FAC含有培地中で複数回継代培養し、これらの培養を実験室規模(4.5L)または試験的規模の流加発酵に接種するのに用いた。これらの流加発酵に用いた培地および栄養分は、高抗体力価をもたらすように最適化した。
図8Aには、4.5L発酵での細胞株Cの増殖および抗体産生が示されている。図8Bには、100L発酵での細胞株Cの増殖および抗体産生が示されている。図9および図10には、4.5L発酵での細胞株Dおよび100L発酵での細胞株Eの増殖および抗体産生がそれぞれ示されている。
ヒト抗体を発現し、G418選択システムを用いて選択された組換えNS0マウス骨髄腫細胞株を、GS選択システムの代替物を用いて形質転換したNS0細胞の増殖を支援するFACの能力を評価するのに用いた。
1mg/Lのトランスフェリン、0.1mg/LのFACおよび6mMのグルタミンを含有するGSF無血清培地中で培養した細胞を、1mg/LのFAC、または1mg/Lのトランスフェリンおよび0.1mg/LのFACのいずれかを含有する新しいGSF無血清培地で2×105まで希釈することにより継代培養した。5日後、フラスコを継代培養し、そして完全な増殖サイクルを行わせた。実験は、密閉した蓋を取り付けた振盪用フラスコ中で、往復式振盪器中にて36.5℃、125rpmでインキュベートして行った。フラスコには、当初および2日おきに5%CO2/95%大気を通した。
両方の培地中で同等の増殖が見られ、このことは、FACが代替選択システムを用いて形質転換したNS0細胞の増殖を支援することが可能であることを示唆した。
改変CDSSは以下のように調製した:
マグネチック・スターラーを用いて振盪されているDMEM/F12(1:1)(Gibco BRL.、1×液体、カタログ番号21331)1Lに対して、以下の成分を順番に加え、それぞれが次のものを加える前に完全に溶解していることに注意した:
・1g プルロニックF−68(Sigma P−1300)
・50nM 亜セレン酸ナトリウム無水物(Sigma S−5261)(25μMストック溶液から)
・2μM 硫酸亜鉛7水和物(Sigma Z−0251)(2mMストック溶液から)
・0.5ml クリーブランド微量元素I(Cellgro 99−175)
・1ml クリーブランド微量元素II(Cellgro 99−176)
・20μM エタノールアミン(Sigma E−0135)
・40ml GS添加物(JRH Biosciences 58672)
・1.3g 炭酸水素ナトリウム((BDH 102475W)
・3.6ml 2M塩酸(BDH 190675T)
グルタミン依存性細胞株のみに対して:
・0.88g グルタミン(Sigma G−5763)
トランスフェリン含有対照培地のみに対して:
・0.1mg クエン酸第二鉄アンモニウム(BDH 271634K)(1mg/ml ストックから)
・1mg ヒトトランスフェリン(Serologicals Proteins 82−349)
Claims (50)
- 骨髄腫細胞株のin vitro培養の方法であって、以下のステップ:
(a) 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度0.03mg/L〜3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない;および
(b) 適切な条件下において、振盪懸濁培養を用いて、培養培地に接種した骨髄腫細胞株を増殖させるステップ、
を含む、上記方法。 - 培地中の鉄濃度が0.03mg/L〜2.4mg/Lである、請求項1記載の方法。
- 培地中の鉄濃度が0.064mg/L〜1.6mg/Lである、請求項1記載の方法。
- 培地中の鉄濃度が0.16mg/L〜0.32mg/Lである、請求項1記載の方法。
- 鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項1記載の方法。
- 可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート(simple chelate)からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
- 可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
- 第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項7記載の方法。
- 第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項7記載の方法。
- 骨髄腫細胞株のin vitro培養の方法であって、以下のステップ:
(a) 培養培地に骨髄腫細胞株を接種するステップ、ここで前記培地は前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能なものであり、かつ培地中濃度0.2mg/L〜20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない;および
(b) 適切な条件下において、振盪懸濁培養を用いて、培養培地に接種した骨髄腫細胞株を増殖させるステップ、
を含む、上記方法。 - クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に0.2mg/L〜15mg/Lの濃度で存在する、請求項10記載の方法。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に0.4mg/L〜10mg/Lの濃度で存在する、請求項10記載の方法。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に1mg/L〜2mg/Lの濃度で存在する、請求項10記載の方法。
- 培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含であるか、または化学的組成が明らかなものである、請求項1または10記載の方法。
- 骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項1または10記載の方法。
- 骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項1または10記載の方法。
- 振盪懸濁培養条件下での骨髄腫細胞株のin vitro増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地が培地中濃度0.03mg/L〜3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない、上記使用。
- 培地中の鉄濃度が0.03mg/L〜2.4mg/Lである、請求項17記載の使用。
- 培地中の鉄濃度が0.064mg/L〜1.6mg/Lである、請求項17記載の使用。
- 培地中の鉄濃度が0.16mg/L〜0.32mg/Lである、請求項17記載の使用。
- 鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項17記載の使用。
- 可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート(simple chelate)からなる群より選択される、請求項21記載の使用。
- 可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項21記載の使用。
- 第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項21記載の使用。
- 第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項24記載の使用。
- 振盪懸濁培養条件下での骨髄腫細胞株のin vitro増殖を支援するための培養培地の使用であって、該培養培地が培地中濃度0.2mg/L〜20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有しない、上記使用。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に0.2mg/L〜15mg/Lの濃度で存在する、請求項26記載の方法。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に0.4mg/L〜10mg/Lの濃度で存在する、請求項26記載の方法。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に1mg/L〜2mg/Lの濃度で存在する、請求項26記載の方法。
- 培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものである、請求項17または26記載の方法。
- 骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項17または26記載の方法。
- 骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項17または26記載の方法。
- 哺乳動物細胞産物を取得する方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を振盪懸濁培養下および前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培地が培地中濃度0.03mg/L〜3.2mg/Lで鉄を含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有せず;および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む、上記方法。
- 培地中の鉄濃度が0.03mg/L〜2.4mg/Lである、請求項33記載の方法。
- 培地中の鉄濃度が0.064mg/L〜1.6mg/Lである、請求項33記載の方法。
- 培地中の鉄濃度が0.16mg/L〜0.32mg/Lである、請求項33記載の方法。
- 鉄の供給源が可溶性鉄化合物である、請求項33記載の方法。
- 可溶性鉄化合物が、第一鉄塩もしくは第二鉄塩またはそれらの簡単なキレート(simple chelate)からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
- 可溶性鉄化合物が、硫酸第一鉄、クエン酸第一鉄、クエン酸第二鉄および第二鉄アンモニウム化合物からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
- 第二鉄アンモニウム化合物が、クエン酸第二鉄アンモニウム、シュウ酸第二鉄アンモニウム、フマル酸第二鉄アンモニウム、リンゴ酸第二鉄アンモニウムおよびコハク酸第二鉄アンモニウムからなる群より選択される、請求項39記載の方法。
- 第二鉄アンモニウム化合物がクエン酸第二鉄アンモニウムである、請求項40記載の方法。
- 哺乳動物細胞産物を取得する方法であって、前記産物を産生することが可能な骨髄腫細胞を振盪懸濁培養下および前記骨髄腫細胞株の増殖を支援することが可能な培養培地中で培養すること、ここで前記培地が培地中濃度0.2mg/L〜20mg/Lでクエン酸第二鉄アンモニウムを含み、前記培地はトランスフェリン、親油性キレート剤、合成含窒素キレート剤または親油性合成含窒素キレート剤を含有せず;および前記哺乳動物細胞産物を回収すること、を含む、上記方法。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に0.2mg/L〜15mg/Lの濃度で存在する、請求項42記載の方法。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に0.4mg/L〜10mg/Lの濃度で存在する、請求項42記載の方法。
- クエン酸第二鉄アンモニウムが、培地中に1mg/L〜2mg/Lの濃度で存在する、請求項42記載の方法。
- 培地が、無血清、無タンパク質、動物由来成分不含、または化学的組成が明らかなものである、請求項33または42記載の方法。
- 骨髄腫細胞株が、NSOシリーズ、P3シリーズ、MOPCシリーズ、MPC-11、J558L、K6H6/B5、45.6.TG1.7、Y0、Y3HTK、RPMI 8226およびU266B1からなる群より選択される、請求項33または42記載の方法。
- 骨髄腫細胞株がNSO細胞株である、請求項33または42記載の方法。
- 細胞産物が、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン、リンホカイン、インターロイキンおよび工業上かつ治療上有用な酵素からなる群より選択される、請求項33または42記載の方法。
- 細胞産物が抗体またはその断片である、請求項49記載の方法。
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