JP2013230151A - 細胞培養の改善 - Google Patents

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Abstract

【課題】細胞培養、特にほ乳動物細胞培養におけるタンパク質発現を促進する改善された流加培養法及び組成物を提供する。
【解決手段】Ａ部、Ｂ部及びＣ部を含む無血清細胞培地を含み、本質的にＡ部は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地からなり、本質的にＢ部は無機鉄源からなり、Ｃ部は、組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、及び少なくとも２種類の非動物加水分解物を含むほ乳動物細胞培養用の改善された無塩基本増殖培地。ある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによって、細胞を培養する流加培養法。
【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２００６年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／８４５１５８号、及び２００６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８７６３７４号の優先権の利益を主張するものである。上記優先権文書の各々の内容を参照により本明細書に組み入れる。
組換えＤＮＡ技術は、治療、診断、農業及び研究目的を含めた多様な応用分野に使用することができる量でタンパク質を産生する手段を提供する。
組換えタンパク質産生の一目的は、最大量のタンパク質、及び最も効率的な生産（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）手段を得るために、細胞培地及び諸条件を最適化することである。漸進的な改善を含めて、あらゆる改善が、経済的に莫大な利点を有し得る。医薬産業においては、生物学的製剤を大規模に製造するときにあらゆる改善がかなりの影響を有し得るので、疾患治療のための療法に使用される生物学的製剤のためのタンパク質産生の最適化は有利である。したがって、依然として医薬品用生物タンパク質を発現する細胞培養物からのタンパク質産生を最大にする必要がある。
典型的には、ほ乳動物細胞培地は、例えば、ＤＭＥＭ又はＨａｍ’ｓ Ｆ１２を含めて、市販の培地処方に基づく。培地処方は、細胞増殖と生物タンパク質発現の両方の増加を支援するには、十分濃縮されていないことが多い。依然として改善されたタンパク質産生のための、改善された細胞培地、補助剤及び細胞培養方法が求められている。
本発明は、細胞培養、特にほ乳動物細胞培養におけるタンパク質発現を改善する方法及び組成物を提供する。本発明は、タンパク質発現用細胞を増殖させるための培地、及びタンパク質発現用に最適化された細胞培養産生培地を含めて、改善された細胞培地に関する。
本発明は、ほ乳動物細胞培養における高いタンパク質発現のための最適化された方法及び培地処方も提供する。特に、細胞培地は、ほ乳動物細胞培養、例えば、ＣＨＯ細胞における、抗体の発現用に最適化される。補充溶液、例えば、加水分解物含有溶液及び濃縮基本培地溶液を添加することによってタンパク質産生を促進する、改善された流加培養法及び組成物も提供する。
本発明は、ほ乳動物細胞培養用の改善された無塩基本増殖培地を提供する。本発明は、Ａ部、Ｂ部及びＣ部を含む無血清細胞培地を含み、本質的にＡ部は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地からなり、本質的にＢ部は無機鉄源からなり、Ｃ部は、組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、及び少なくとも２種類の非動物加水分解物を含む。
一実施形態においては、Ａ部は、非鉄（ＩＩ）金属イオン、ビタミン、又は両方の組合せを更に含む。一実施形態においては、Ｂ部の無機鉄源は、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、例えば、最終溶液濃度約１００−１５０ｍｇ／Ｌ又は０．１−１ｍＭのクエン酸鉄（ＩＩＩ）である。別の一実施形態においては、Ｂ部の無機鉄源は、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、例えば、最終溶液濃度約１２２．５ｍｇ／Ｌ又は０．５ｍＭのクエン酸鉄（ＩＩＩ）である。
一実施形態においては、Ｃ部の組換え増殖因子は、インスリン又は組換え類似体ＩＧＦ−１、及びインスリンとＩＧＦ−１の組合せ（例えば、約４ｍｇ／Ｌから１３ｍｇ／Ｌインスリン又はその組換え類似体）からなる群から選択される。
一実施形態においては、改変基本培地から除外される緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ緩衝剤である。
一実施形態においては、Ｃ部の緩衝剤は、リン酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウム、例えば、約０．１から３ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、約０．１から３ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳを含む。一実施形態においては、Ｃ部の緩衝剤は、１．６ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム及び／又は約１．８ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳを含む。一実施形態においては、リン酸緩衝剤は、約０．０１から０．５ｇ／Ｌのリン酸ナトリウム及びリン酸水素ナトリウムを含む。
更なる一実施形態においては、Ｃ部は、アスパラギン、グルタミン、又はグルタミンとアスパラギンを更に含む。
一実施形態においては、Ｃ部の重量オスモル濃度調節剤は、ＮａＣｌ、例えば、約１．０から６．５ｇ／ＬのＮａＣｌである。
一実施形態においては、Ｃ部のエネルギー源は、単糖、例えば、（Ｄ−グルコースなどの）グルコース、マルトース、マンノース、ガラクトース及びフルクトースである。一実施形態においては、本発明の細胞培地は、約７．０ｇ／Ｌ以下のグルコースを含む。
別の一実施形態においては、本発明の細胞培地は、Ｃ部の少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含み、植物系加水分解物、及び動物系でも植物系でもない加水分解物である。本発明に使用することができる植物系加水分解物の例は、ダイズ系加水分解物である。動物系でも植物系でもない加水分解物の例は、酵母系加水分解物である。
一実施形態においては、本発明の細胞培地は、メトトレキサートを更に含む。一実施形態においては、細胞培地は、約１００ｎＭから５０００ｎＭのメトトレキサートを更に含む。
更に別の一実施形態においては、細胞培地は、細胞保護剤又は界面活性剤を更に含む。本発明の細胞培地に使用することができる界面活性剤の例は、メチルセルロース又はＰｌｕｒｏｎｉｃポリオール、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８である。一実施形態においては、細胞培地は、約０．１−５ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を含む。一実施形態においては、細胞培地は、約１．０ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を含む。
本発明の更に別の一実施形態においては、細胞培地は、Ｌ−グルタミンを更に含む。
一実施形態においては、細胞培地のｐＨ範囲は７．１から７．３である。
別の一実施形態においては、本発明の細胞培地の重量オスモル濃度は、約３２０から４５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
本発明は、基本培地、約８−１２ｍｌ／ｋｇ又は１１６−１２６ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約２−６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約２−５ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．１−０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１−３ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約０．０１−０．０５ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ及び約１．０−３．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物を含む、無血清細胞培地を含む。一実施形態においては、細胞培地は、基本培地、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約４．０ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約３．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．２９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約０．０３ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ及び約２．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物を含む。一実施形態においては、細胞培地は、基本培地、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約４．０ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約３．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．２９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約０．０３ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ及び約２．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物から本質的になる。
本発明は、基本培地、約８−１２ｍｌ／ｋｇ又は１１６−１２６ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約２−６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約２−５ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．１−０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１−３ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約０．０１−０．０５ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ及び約１．０−３．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物から本質的になる、無血清細胞培地を更に提供する。一実施形態においては、細胞培養物は、基本培地、約８−１２ｍｌ／ｋｇ又は１１６−１２６ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約２−６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約２−５ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．１−０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１−３ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約０．０１−０．０５ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ及び約１．０−３．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物から本質的になる。
一実施形態においては、細胞培地は、約２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを更に含む。
本発明は、タンパク質が製造されるように、本発明の培地中でタンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び培養物を細胞培養産生培地に移送することを含む、タンパク質を製造する方法も含む。
一実施形態においては、タンパク質は、例えばＤ２Ｅ７（アダリムマブ）を含めて、抗体である。
本発明は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．５から０．７ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６０から７０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、無血清細胞培養産生培地を更に提供する。一実施形態においては、細胞培養産生培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．５から０．７ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６０から７０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物から本質的になる。別の一実施形態においては、細胞培養産生培地は、基本培地、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．４から２．５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
本発明は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約３から５ｍＬ／ｋｇ又は６から８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物；約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２から４ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、無血清細胞培地も提供する。一実施形態においては、細胞培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約３から５ｍＬ／ｋｇ又は６から８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物；約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２から４ｇ／ｋｇ植物系加水分解物から本質的になる。一実施形態においては、細胞培地は、改変基本培地、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．８から０．９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．６から２．７ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、約０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、約４．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２．６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
本発明は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１０ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約３から５ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．８から０．９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約０．３から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１．０ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２から４ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、無血清細胞培地も含む。一実施形態においては、細胞培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１０ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約３から５ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．８から０．９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約０．３から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１．０ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２から４ｇ／ｋｇ植物系加水分解物から本質的になる。別の一実施形態においては、細胞培地は、改変基本培地、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．８７から０．８８ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム 約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．６７から２．６８ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４４・７Ｈ２Ｏ、約４．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２．６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
本発明は、基本細胞増殖培地、約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約２から６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約１５０から２５０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．１から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム及び約５から１５ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物を含む、無血清細胞培地を含む。一実施形態においては、細胞培地は、基本細胞増殖培地、約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約２から６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約１５０から２５０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．１から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム及び約５から１５ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物から本質的になる。更なる一実施形態においては、細胞培地は、基本細胞増殖培地、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約２００ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．２９から０．３０ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム及び約１１ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物を含む。追加の一実施形態においては、タンパク質は、例えば、完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体、例えば、ＡＢＴ−８７４を含めて、抗体である。
本発明は、基本細胞増殖培地、約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約２から６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約１から３ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム及び約１から４ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物を含む、無血清細胞培地も含む。一実施形態においては、細胞培地は、基本細胞増殖培地、約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約２から６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約１から３ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム及び約１から４ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物から本質的になる。別の一実施形態においては、細胞培地は、基本細胞増殖培地、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約１．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．２９から０．３０ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム及び約２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物を含む。一実施形態においては、細胞培地のｐＨは約７．１０から７．３０であり、重量オスモル濃度は約３００から３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。更に別の一実施形態においては、細胞培地は、少なくとも８ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物を含む。一実施形態においては、細胞培地を用いて、ほ乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞中で製造されるタンパク質は、例えば、抗ＩＬ−１２抗体又は抗ＥＰＯ−Ｒ抗体、例えば、ＡＢＴ−８７４を含めて、抗体である。
本発明は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約２．５から４．５ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．５から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約１から４ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２から６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、細胞培地を更に提供する。一実施形態においては、本発明の細胞培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約２．５から４．５ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．５から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約１から４ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２から６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物から本質的になる。別の一実施形態においては、細胞培地は、改変基本培地、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．８７から０．８８ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．６７ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、約４．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約２．６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
本発明は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを除去するように改変された、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約１から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６から８ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、細胞培養産生培地も含む。一実施形態においては、本発明の細胞培養産生培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを除去するように改変された、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約１から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６から８ｇ／ｋｇ植物系加水分解物から本質的になる。別の一実施形態においては、細胞培養産生培地は、改変基本培地、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム 約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
本発明の別の一態様は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１１０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１１から１５ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム 約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約１から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約１２から１６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約８から１０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、細胞培養産生培地である。一実施形態においては、細胞培養産生培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１１０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１１から１５ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム 約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約１から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約１２から１６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約８から１０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物から本質的になる。別の一実施形態においては、本発明の細胞培養産生培地は、改変基本培地、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、約１４．２から１４．３ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約９．２から９．３ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
一実施形態においては、細胞培地のｐＨは約６から８である。別の一実施形態においては、細胞培地のｐＨは約７．１０から７．２０である。
一実施形態においては、細胞培地の重量オスモル濃度は約３５０から４５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。別の一実施形態においては、細胞培地の重量オスモル濃度は約３７３から４０３ｍＯｓｍ／ｋｇである。
本発明の細胞培地は、メトトレキサートを更に含み得る。一実施形態においては、細胞培地は、メトトレキサート、例えば約１−１０ｍＬ／ｋｇを更に含む。別の一実施形態においては、細胞培地は、メトトレキサート、例えば約２．５０ｍＬ／ｋｇを更に含む。
一実施形態においては、細胞培養物中で発現されるタンパク質は、抗体又はその抗原結合性フラグメントである。一実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、抗ＴＮＦα抗体又は抗ＥＰＯ−Ｒ抗体である。別の一実施形態においては、抗ＴＮＦα抗体又はその抗原結合性フラグメントは、例えば、完全ヒト抗ＴＮＦα抗体はＤ２Ｅ７（アダリムマブ）である事を含めて、完全ヒト抗ＴＮＦα抗体である。更に別の一実施形態においては、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、完全ヒト抗ＩＬ−１２又は抗ＩＬ−１８抗体を含めて、抗ＩＬ−１２又は抗ＩＬ−１８抗体である。
本発明は、本明細書に記載の細胞培地中で、タンパク質、例えば抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養することを含む、タンパク質、例えば抗体又はその抗原結合性部分を製造する方法も含む。一実施形態においては、細胞培地は細胞培養産生培地である。本発明の方法及び組成物を用いて製造することができる抗体又はその抗原結合性フラグメントの例としては、抗ＩＬ−１８抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体が挙げられる。
一実施形態においては、本発明は、本明細書に記載の細胞培地、例えば細胞培養産生培地からタンパク質を単離することを更に含む。
一実施形態においては、本発明の細胞培地及び方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含めて、ほ乳動物細胞を培養するためのものである。
本発明は、本明細書に記載の細胞培地のいずれかにおけるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞も含む。
本発明は、ほ乳動物細胞培養物、例えばＣＨＯ細胞中でタンパク質を製造するための、改善された流加培養法、及び関連する細胞培地も提供する。本発明の一態様は、タンパク質が製造されるように、細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、タンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、並びにある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによってほ乳動物細胞を培養することを含み、加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、タンパク質を製造する流加培養法である。
一実施形態においては、基本濃縮溶液は、高濃度基本培地を含む。別の一実施形態においては、基本濃縮溶液は、基本培地、アスパラギン及びグルコースを含む。更に別の一実施形態においては、基本培地はＰＦ ＣＨＯである。
一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液は、植物由来でも動物由来でもない第１の加水分解物と、第２の植物系加水分解物とを含む。一実施形態においては、植物由来でも動物由来でもない加水分解物、及び植物系加水分解物は、酵母系加水分解物である。一実施形態においては、植物系加水分解物はダイズ系加水分解物である。
一実施形態においては、製造されるタンパク質は、抗体又はその抗原結合性部分である。本発明の流加培養法に使用することができる抗体又はその抗原結合性部分の例としては、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体が挙げられる。
本発明は、抗ＴＮＦα抗体が製造されるように、細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、抗ＴＮＦα抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養すること、並びにある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによってＣＨＯ細胞を培養することを含み、基本濃縮溶液が基本培地、アスパラギン及びグルコースを含み、加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、例えばアダリムマブなどの完全ヒト抗ＴＮＦα抗体を含めて、抗ＴＮＦα抗体を製造する流加培養法を含む。
本発明は、抗ＴＮＦα抗体が製造されるように、少なくとも１−５ｇ／Ｌ、例えば２．０ｇ／Ｌのグルコースを含む細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、抗ＴＮＦα抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞を培養すること（グルコース濃度は、少なくとも１−５ｇ／Ｌ、例えば２．０ｇ／Ｌのグルコース濃度を維持するのに必要なグルコースを細胞培養産生培地に添加することによって、調節される。）、並びにある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによってＣＨＯ細胞を培養することを含み、基本濃縮溶液が基本培地、アスパラギン及びグルコースを含み、加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、抗ＴＮＦα抗体を製造する流加培養法も特徴とする。
一実施形態においては、本発明は、抗ＴＮＦα抗体を更に回収することを含む。
更に別の一実施形態においては、細胞培養物は、温度約３２から３８℃、例えば３５℃で培養される。
一実施形態においては、細胞培養産生培地は、溶存酸素２０から６５％、例えば溶存酸素約３０％で維持される。
一実施形態においては、細胞培養産生培地の重量オスモル濃度は、培養を通して５００ｍＯｓｍ以下に維持される。
一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液は、植物由来でも動物由来でもない第１の加水分解物と、第２の植物系加水分解物とを含む。更に別の一実施形態においては、植物由来でも動物由来でもない加水分解物、及び植物系加水分解物は、酵母系加水分解物である。更に別の一実施形態においては、植物系加水分解物はダイズ系加水分解物である。一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液は、約５０−２８０ｇ／ｋｇ、例えば２５０から２８０ｇ／ｋｇのダイズ系加水分解物と、約７５−３００ｇ／ｋｇ、例えば１５０から１８０ｇ／ｋｇの酵母系加水分解物とから本質的になる。一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液は、約５０−２８０ｇ／ｋｇ、例えば２５０から２８０ｇ／ｋｇのダイズ系加水分解物と、約７５−３００ｇ／ｋｇ、例えば１５０から１８０ｇ／ｋｇの酵母系加水分解物とを含む。
一実施形態においては、基本培地はＰＦ ＣＨＯである。
一実施形態においては、基本濃縮溶液のｐＨは約９．０から１０．５である。
更に別の一実施形態においては、流加培養法の期間は約９から１５日間又は約１２日間である。
更に別の一実施形態においては、基本濃縮溶液を期間の以下の日、すなわち４日目、６日目、９日目及び１１日目の少なくとも１日に細胞培養産生培地に添加する。一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液を期間の４日目、７日目、又は４日目と７日目に細胞培養産生培地に添加する。
更に別の一実施形態においては、流加培養法は、細胞培養産生培地のｐＨをｐＨ線形勾配に従って調節することを更に含み、ｐＨ線形勾配は約６．５−８、例えば７．１から７．２のｐＨから出発し、約６．５−７．０、例えば６．９の最終ｐＨである。一実施形態においては、ｐＨ線形勾配は、少なくとも約２４時間調節される。別の一実施形態においては、ｐＨ線形勾配は、少なくとも約４８時間調節される。更に別の一実施形態においては、ｐＨ線形勾配は、約７２時間調節される。
本発明は、流加培養法における本明細書に記載の細胞培地（例えば、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１０ｍｌ／ｋｇ又は１１０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から３ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約１から３ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から０．１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６から８ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、細胞培養産生培地）の使用も含む。一実施形態においては、細胞培養産生培地（ｃｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）は、改変基本培地、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
本発明は、抗ＩＬ１２抗体が製造されるように、細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞を培養すること、ある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによってＣＨＯ細胞を培養することを含み、基本濃縮溶液が基本培地、アスパラギン及びグルコースを含み、加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、例えば完全ヒト抗ＩＬ１２抗体（例えば、ＡＢＴ−８７４）などの抗ＩＬ１２抗体を製造する流加培養法も提供する。
一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液はグルコースを更に含む。
一実施形態においては、本発明は、抗ＩＬ１２抗体を回収することも含む。
一実施形態においては、細胞培養物は、温度約３２から３８℃、例えば約３３℃で培養される。
本発明の一実施形態においては、細胞培養産生培地は、溶存酸素２０−６５％、例えば溶存酸素約４０％で維持される。
更に別の一実施形態においては、細胞培養産生培地のｐＨは約６．７から７．２である。
本発明の別の一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液は、植物由来でも動物由来でもない加水分解物と植物系加水分解物とを含む。一実施形態においては、植物由来でも動物由来でもない加水分解物は、酵母系加水分解物である。別の一実施形態においては、植物系加水分解物はダイズ系加水分解物である。更に別の一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液は、約５０−２２５ｇ／ｋｇ、例えば１５０から１８０ｇ／ｋｇのダイズ系加水分解物、約７５−３００、例えば２５０から２８０ｇ／ｋｇの酵母系加水分解物、及び約１−５ｇ／Ｌ、例えば２から３ｇ／Ｌのグルコースから本質的になる。更に別の一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液は、約５０−２２５ｇ／ｋｇ、例えば１５０から１８０ｇ／ｋｇのダイズ系加水分解物、約７５−３００、例えば２５０から２８０ｇ／ｋｇの酵母系加水分解物、及び約１−５ｇ／Ｌ、例えば２から３ｇ／Ｌのグルコースを含む。一実施形態においては、基本濃縮溶液は、基本培地、アスパラギン及びグルコースを含む。
更に別の一実施形態においては、基本濃縮溶液のｐＨは約９−１０、例えば約９．７であり、重量オスモル濃度は約１４００から１５００ｍＯｓｍである。更なる一実施形態においては、基本濃縮溶液中の基本培地はＰＦ ＣＨＯである。
一実施形態においては、流加培養法の期間は１４−１５日間である。
一実施形態においては、基本濃縮溶液を期間の５日目から１日おきに細胞培養産生培地に添加する。
本発明の一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液を期間の６日目から毎日、細胞培養産生培地に添加する。更に別の一実施形態においては、基本濃縮溶液及び加水分解物濃縮溶液を期間の５日目から毎日、細胞培養産生培地に添加する。
本発明は、流加培養法における本明細書に記載の細胞培地（例えば、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１１０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約５から８ｍＬ／ｋｇ又は１１から１５ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム 約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約６から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６から８ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、細胞培養産生培地）の使用も含む。一実施形態においては、細胞培養産生培地は、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む。
一実施形態においては、本発明は、細胞を大規模に培養する方法を特徴とする。一実施形態においては、大規模細胞培養は約１０Ｌを超える。別の一実施形態においては、大規模細胞培養は約１３Ｌを超える。
本発明は、栄養素の組合せを１種類の溶液で提供するので有利である、組合せ供給溶液も提供する。本発明は、グルコース、基本培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、組合せ供給溶液を含む。本発明は、グルコース、基本培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物から本質的になる、組合せ供給溶液も含む。
一実施形態においては、供給溶液のｐＨは約６．０から８．０である。
一実施形態においては、組合せ供給溶液は、約１００から２５０ｇ／ｋｇグルコースを含む。一実施形態においては、組合せ供給溶液は、アミノ酸アスパラギン、例えばアスパラギン約１．０から１５．０ｇ、又は約３．０から５．０ｇ／ｋｇアスパラギンを含む。
一実施形態においては、組合せ供給溶液中の少なくとも２種類の非動物系加水分解物は、植物系加水分解物、及び動物系でも植物系でもない加水分解物である。一実施形態においては、動物系でも植物系でもない加水分解物は、酵母系加水分解物である。一実施形態においては、植物系加水分解物はダイズ系加水分解物である。
一実施形態においては、組合せ供給溶液は、ＰＦ−ＣＨＯ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、基本培地を含む。一実施形態においては、基本細胞培地は、改変基本培地であり、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤、グルタミン及びグルコースを含まない。
更に別の一実施形態においては、組合せ供給溶液は、約１５ＮＴＵ未満の濁度を更に有する。
本発明は、本明細書に記載の組合せ供給溶液を添加することを含む、細胞培養産生培地の定常グルコースレベルを維持する方法を特徴とする。
本発明の別の一態様は、グルコースと基本細胞培地を組み合わせて溶液にすること、ａ）の溶液のｐＨを約９．５から１０．５に調節すること、少なくとも２種類の非動物系加水分解物をｂ）の溶液に添加すること、及び組合せ供給溶液が約６．５から７．５のｐＨを有するように、ｃ）の溶液のｐＨを調節することを含む、基本培地、グルコース及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む組合せ供給溶液を製造する方法である。一実施形態においては、段階ｃ）は、動物系でも植物系でもない第１の加水分解物と第２の植物系加水分解物とを添加することを含む。一実施形態においては、動物系でも植物系でもない加水分解物は、酵母系加水分解物である。更に別の一実施形態においては、植物系加水分解物はダイズ系加水分解物である。
本発明は、ほ乳動物細胞培養物からの増加したタンパク質、例えば抗体又はその抗原結合性部分の製造の方法を更に提供する。本発明は、少なくとも約１．５ｇ／Ｌの抗体が製造されるように、細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び約６．７から７．２のｐＨを有する組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、グルコース、基本細胞培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む。）を含む、ほ乳動物細胞培養物から少なくとも約１．５ｇ／Ｌの抗体を製造する方法を提供する。一実施形態においては、少なくとも２ｇ／Ｌの抗体が製造される。別の一実施形態においては、少なくとも４ｇ／Ｌの抗体が製造される。更に別の一実施形態においては、少なくとも５ｇ／Ｌの抗体が製造される。更なる一実施形態においては、本発明は、約６ｇ／Ｌの抗体を製造する方法を提供する。
一実施形態においては、組合せ供給溶液は、約１００から２５０ｇ／ｋｇグルコースを含む。
本発明は、製造される抗体の力価が、段階ｂ）を含まずに段階ａ）によって培養された対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも５０％高くなるように、細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び約６．７から７．２のｐＨを有する組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、グルコース、基本細胞培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む。）を含む、ほ乳動物細胞培養物から産生される抗体の力価を増加させる方法も提供する。一実施形態においては、製造される抗体の力価は、対照よりも少なくとも１００％高い。別の一実施形態においては、製造される抗体の力価は、対照よりも少なくとも１５０％高い。
一実施形態においては、細胞密度が少なくとも２．０×１０６細胞／ｍＬに到達したときに、組合せ供給溶液を添加する。一実施形態においては、細胞密度が少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌに到達したときに、組合せ供給溶液を添加する。
本発明は、抗体が製造されるように、細胞培養産生培地中で、タンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び細胞培養産生培地中の代謝指標レベルを監視するフィードバック制御系を用いて、組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、フィードバック制御系によって決定される時点で細胞培養産生培地に添加される。）を含む、ほ乳動物細胞培養物中でタンパク質、例えば抗体又はその抗原結合性部分を製造する方法を更に提供する。一実施形態においては、代謝指標はグルコース又はグルタミンである。別の一実施形態においては、供給溶液は、グルコース、基本細胞培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、組合せ供給溶液である。一実施形態においては、抗体は、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体である。
一実施形態においては、抗体の少なくとも１．５ｇ／Ｌの力価は、本発明の方法を用いて生成される。別の一実施形態においては、少なくとも２ｇ／Ｌの力価が生成される。
本発明の一実施形態においては、組合せ供給溶液は、約３．０から１２．５ｇ／ｋｇアスパラギンを含む。
本発明の一実施形態においては、組合せ供給溶液は、約１００から２００ｇ／ｋｇグルコースを含む。
更に別の一実施形態においては、本発明は、グルコースレベルが約０．２５から２０．０ｇ／Ｌに維持されるように、細胞培地中のグルコースレベルを監視することを更に含む。一実施形態においては、グルコースレベルは、自動試料採取装置を用いて監視される。
一実施形態においては、本明細書に開示する方法及び組成物を用いて製造される抗体又はその抗原結合性部分は、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１８抗体、抗ＥＰＯ−Ｒ抗体及び抗Ｉｌ−１２抗体からなる群から選択される。一実施形態においては、抗体又はその抗原結合性部分は完全ヒト抗体である。一実施形態においては、抗ＴＮＦα抗体はＤ２Ｅ７（アダリムマブ）である。一実施形態においては、抗ＩＬ−１８抗体はＡＢＴ−３２５である。一実施形態においては、抗ＩＬ−１２抗体はＡＢＴ−８７４である。
本発明は、供給プロファイルが決定されるように、細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び細胞培養産生培地中の代謝指標を監視するフィードバック制御系を用いて、組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、目標代謝指標設定値に適合するように細胞培養産生培地に添加される。）、及び１日当たりに細胞培養産生培地に添加される組合せ供給溶液の量を決定することを含む、ほ乳動物細胞培養物中でタンパク質を産生するための供給プロファイルを決定する方法も提供する。一実施形態においては、代謝指標はグルコース又はグルタミンである。
本発明は、本発明の方法によって決定される供給プロファイルに従って、組合せ供給溶液をほ乳動物細胞培養物に添加することを含む、ほ乳動物細胞培養物中でタンパク質を製造する流加培養法も含む。
本発明の別の一態様は、酪酸ナトリウム及び／又はＮ−アセチルシステインを含む、改善された細胞培地である。本発明は、抗体が少なくとも３００ｍｇ／Ｌの力価で製造されるように、細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを細胞培地に添加すること（酪酸ナトリウムを約０．１ｍＭから１０ｍＭの最終濃度まで添加し、Ｎ−アセチルシステインを約１ｍＭから８０ｍＭの最終濃度まで添加する。）を含む、抗体の力価が少なくとも３００ｍｇ／Ｌであるように、ほ乳動物細胞培養物中で抗体を製造する方法を特徴とする。一実施形態においては、抗体価は、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌである。一実施形態においては、抗体価は、少なくとも約２００ｍｇ／Ｌである。一実施形態においては、抗体価は、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌである。一実施形態においては、抗体価は、少なくとも約３００ｍｇ／Ｌである。一実施形態においては、抗体価は、少なくとも約４００ｍｇ／Ｌである。
本発明は、抗体の力価が対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも１０％高くなるように（対照ほ乳動物細胞培養は、段階ａ）を含むが、段階ｂ）を含まない。）、ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及びｂ）酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを細胞培地に添加すること（酪酸ナトリウムを約０．１ｍＭから１０ｍＭの最終濃度まで添加し、Ｎ−アセチルシステインを約１ｍＭから８０ｍＭの最終濃度まで添加する。）を含む、抗体の力価が対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも１０％高くなるように、ほ乳動物細胞培養物中で抗体を製造する方法も提供する。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の抗体価は、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも２９％改善される。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の抗体価は、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも４０％改善される。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の抗体価は、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも７０％改善される。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の抗体価は、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも９０％高い。
一実施形態においては、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを、ほ乳動物細胞培養物の増殖期中に、ほ乳動物細胞培養物に添加する。
一実施形態においては、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを、培養時間の４日目から７日目に、ほ乳動物細胞培養物に添加する。
一実施形態においては、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを、培養時間の０日目にほ乳動物細胞培養物に添加する。
別の一実施形態においては、酪酸ナトリウムの最終濃度は約０．１ｍＭから１０ｍＭである。一実施形態においては、酪酸ナトリウムの最終濃度は約０．１ｍＭから８．０ｍＭである。一実施形態においては、酪酸ナトリウムの最終濃度は、約０．１ｍＭから３．０ｍＭ酪酸ナトリウムである。
一実施形態においては、Ｎ−アセチルシステインの最終濃度は約２０ｍＭから６０ｍＭである。一実施形態においては、Ｎ−アセチルシステインの最終濃度は約１０ｍＭである。一実施形態においては、Ｎ−アセチルシステインの最終濃度は約８ｍＭである。
本発明は、ほ乳動物細胞培養物の寿命が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも３５％延長されるように（対照ほ乳動物細胞培養は、段階ａ）を含むが、段階ｂ）を含まない。）、ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及びｂ）約１ｍＭから８０ｍＭ Ｎ−アセチルシステインを細胞培地に添加することを含む、ほ乳動物細胞培養物の寿命を対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも３５％延長する方法を更に提供する。
一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の寿命が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも約４５％延長される。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の寿命が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも約５５％延長される。
一実施形態においては、本発明の方法は、最終濃度約８ｍＭのＮ−アセチルシステインを細胞培養産生培地に添加することを特徴とする。
一実施形態においては、抗体又はその抗原結合性部分は、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１８抗体（例えば、ＡＢＴ−３２５）及び抗Ｉｌ−１２抗体からなる群から選択される。
本発明は、Ａ部、Ｂ部及びＣ部を含む無血清細胞培地を提供する。Ａ部は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地から本質的になり、Ｂ部は無機鉄源から本質的になり、Ｃ部は、組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、及び少なくとも２種類の非動物加水分解物を含む。一実施形態においては、Ｃ部は、組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、及び少なくとも２種類の非動物加水分解物から本質的になる。
本発明は、ビタミン含量が低く、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム 約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、無血清細胞培養産生培地も提供する。
本発明は、ビタミン含量が低く、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約１５０ｇ／ｋｇ無水グルコース；約５．０ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物；約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム；約６５ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約４１ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、無血清細胞培地も提供する。
本発明は、ビタミン含量が低く、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）；約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン；約２００ｇ／ｋｇ無水グルコース；約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン；約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム 約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ；約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ；約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８；約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ；約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物及び約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物を含む、無血清細胞培地を更に提供する。
本発明は、改善された培地の以下の実施形態も提供する。本発明は、Ａ、Ｂ及びＣ部を含む組換え生物学的製剤を発現するＣＨＯ細胞を培養するための改善された培地を含み、Ａ部は水、アミノ酸、ビタミン及び別の補助因子を含み、Ｂ部は無機鉄源を含み、Ｃ部は組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、非鉄（ＩＩ）金属イオン、加水分解物及び追加の薬剤を含む。
一実施形態においては、Ｃ部は、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８及びグルコースを含む。別の一実施形態においては、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを添加する。更なる一実施形態においては、１．８ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳを添加する。更に別の一実施形態においては、０．１−０．５ｇ／Ｌリン酸ナトリウム及びリン酸水素ナトリウムを添加する。更に別の一実施形態においては、１ｇ／Ｌから６．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウムを添加する。更なる一実施形態においては、１．０ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を添加する。一実施形態においては、１ｇ／Ｌから７ｇ／Ｌグルコースを添加する。一実施形態においては、ビタミンは、ＰＡＢＡ（ｐ−アミノ安息香酸）、ビオチン、Ｄ−パントテン酸Ｃａ（ビタミンＢ５）、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン（Ｐｙｒｏｄｏｘｉｎｅ）（ビタミンＢ６）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、チアミン（ビタミンＢ１）及びシアノコバラミン（ビタミンＢ１２）からなる群から選択される。別の一実施形態においては、別の補助因子は、脂質因子、アルコールアミン、アミノ酸及びペプチドからなる群から選択される。更に別の一実施形態においては、脂質因子は、塩化コリン及びホスファチジルコリンからなる群から選択される。更に別の一実施形態においては、アルコールアミンはエタノールアミンである。一実施形態においては、アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン及びプトレシンからなる群から選択される。
一実施形態においては、ペプチドはグルタチオンである。一実施形態においては、０．４ｍｇ／Ｌから１．６５ｍｇ／Ｌグルタチオンを添加する。
更に別の一実施形態においては、Ｂ部の無機鉄源はクエン酸鉄（ＩＩＩ）である。一実施形態においては、１０ｍＬ／Ｌ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）を添加する。更に別の一実施形態においては、クエン酸鉄（ＩＩＩ）は、１２２ｍｇ／Ｌの濃度に保持される。一実施形態においては、組換え増殖因子は、インスリン、組換え類似体ＩＧＦ−１、又はインスリンとＩＧＦ−１の組合せである。一実施形態においては、４ｍｇ／Ｌから１３ｍｇ／Ｌのインスリン又は組換え類似体を添加する。別の一実施形態においては、２５ｎｇ／Ｌから１５０ｎｇ／Ｌ ＩＧＦ−１を添加する。更に別の一実施形態においては、５０ｎｇ／Ｌから１００ｎｇ／Ｌ ＩＧＦ−１を添加する。更に別の一実施形態においては、２５ｎｇ／Ｌから１５０ｎｇ／Ｌ ＩＧＦ−１をインスリンに補充する。一実施形態においては、５０ｎｇ／Ｌから１００ｎｇ／Ｌ ＩＧＦ−１をインスリンに補充する。
更に別の一実施形態においては、重量オスモル濃度調節剤は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＫＮＯ３からなる群から選択される。一実施形態においては、０ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌ重量オスモル濃度調節剤を添加する。別の一実施形態においては、０ｇ／Ｌから６．５ｇ／Ｌ重量オスモル濃度調節剤を添加する。
更に別の一実施形態においては、エネルギー源は、単糖、例えば、グルコース（例えば、Ｄ−グルコース）、マルトース、マンノース、ガラクトース及びフルクトースである。一実施形態においては、１．０から７．０ｇ／Ｌグルコースを添加する。別の一実施形態においては、１．５から５．０ｇ／Ｌグルコースを添加する。
更に別の一実施形態においては、非鉄（ＩＩ）金属イオンを塩化物及び硫酸塩の形で添加する。一実施形態においては、非鉄（ＩＩ）金属イオンは、カリウム、マグネシウム、銅（ＩＩ）、セレン、亜鉛、ニッケル、マンガン、スズ、カドミウム、モリブデン酸塩、バナジン酸塩及びケイ酸塩からなる群から選択される。一実施形態においては、緩衝剤は、炭酸塩、塩化物、硫酸塩及びリン酸塩からなる群から選択される。一実施形態においては、緩衝剤は、ＮａＨＣＯ３、ＣａＣｌ２、ＭＧＳＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｃ３Ｈ３Ｏ３Ｎａ、及びＨＥＰＥＳとして知られるＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］からなる群から選択される。
本発明の一実施形態においては、培地に添加される追加の薬剤の１つは、メトトレキサートである。一実施形態においては、メトトレキサートは、抗ＩＬ−１８、抗ＩＬ１２、抗ＴＮＦアルファ（例えば、完全ヒト抗ＴＮＦアルファ）又は抗ＥＰＯ−Ｒ抗体を発現するＣＨＯ細胞の増殖に使用される。一実施形態においては、１００ｎＭから５０００ｎＭを添加する。一実施形態においては、５００ｎＭメトトレキサートを培地に添加する。一実施形態においては、１００ｎＭメトトレキサートを添加する。一実施形態においては、５０００ｎＭメトトレキサートを添加する。
本発明の更に別の一実施形態においては、追加の薬剤の１つは、細胞保護剤（ｐｒｏｔｅｃｔｏｒａｎｔ）、例えば、メチルセルロース又はＰｌｕｒｏｎｉｃポリオール（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８）である。一実施形態においては、０．５ｇ／Ｌから１．０ｇ／Ｌメチルセルロースを添加する。一実施形態においては、０．５ｇ／Ｌから１．０ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を添加する。一実施形態においては、０．７ｇ／Ｌから１．２ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を添加する。
更に別の一実施形態においては、Ａ部のｐＨを最大ｐＨ１０に増加させる。一実施形態においては、次いで、加水分解物を添加しながら、Ａ部のｐＨを最小値７．０に低下させる。
本発明は、１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、２ｍＬ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、３．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．２９２ｇ／ｋ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．０ｇ／ｋｇ加水分解物及び２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、完全ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地も提供する。
本発明は、１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．５８４ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．７ｇ／ｋｇ加水分解物、６．９２ｇ／ｋｇフィトンペプトン及び２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、完全ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地も提供する。
１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、３．８８ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．８７６ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．６７ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．７ｇ／ｋｇ加水分解物、６．９２ｇ／ｋｇフィトンペプトン及び２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、完全ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地も本発明に包含される。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、３．８８ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．８７６ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．６７ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．０ｇ／ｋｇ加水分解物、２．６ｇ／ｋｇフィトンペプトン及び２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、完全ヒト抗ＴＮＦアルファ抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を更に提供する。
本発明の別の一態様は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、３．８８ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．８７６ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．６７５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．０ｇ／ｋｇ酵母源加水分解物、２．５７９ｇ／ｋｇフィトンペプトン及び２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地である。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．５８４ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．７ｇ／ｋｇ酵母加水分解物及び６．９２ｇ／ｋｇフィトンペプトンを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を提供する。
本発明は、１５０．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、５．０ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、６５．０ｇ／ｋｇ酵母加水分解物及び４１．０ｇ／ｋｇフィトンペプトンを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を提供する。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、２００．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．５８４ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム １．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｍｌ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．７ｇ／ｋｇ酵母加水分解物及び６．９２ｇ／ｋｇフィトンペプトンを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地も提供する。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、２ｍＬ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、３．５＋１．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．２９２ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、２ｇ／ｋｇ酵母加水分解物及び０．２５ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、２ｍＬ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、３．５＋１．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、０．２９２ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１１ｇ／ｋｇ酵母加水分解物及び０．２５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、２ｍＬ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、２００ｇ／ｌ無水グルコース、０．２９２ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、８ｇ／ｋｇ酵母加水分解物及び０．２５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、３．８８ｍＬ／ｋｇ又は７．７６ｍｇ／Ｌ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｌ無水デキストロース、０．８７６ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、２．６７ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、０．０３１ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、２．５７９ｇ／Ｌフィトンペプトン、０．０５ｍＬ／ｋｇメトトレキサート、３．５ｍＬ／Ｌ ２Ｎ ＮａＯＨ及び２．９１ｇ／Ｌ ２Ｎ ＨＣｌを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。この培地は、最終ｐＨが７．１０から７．２０であり、最終重量オスモル濃度が３７３から４０３ｍＯｓｍｏ／ｋｇである。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、１３ｍｇ／Ｌ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｌ無水デキストロース、０．５８４ｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳ、２．４５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、０．０３１ｇ／Ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、６．９２ｇ／Ｌフィトンペプトン、０．０５ｍＬ／ｋｇメトトレキサート、５．６７ｍＬ／Ｌ ２Ｎ ＮａＯＨ及び２．５ｇ／Ｌ ２Ｎ ＨＣｌを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。この培地は、最終ｐＨが７．１０から７．２０であり、最終重量オスモル濃度が３７３から４０３ｍＯｓｍｏ／ｋｇである。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、１．５ｇ／ｋｇ無水デキストロース、０．２９２ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、２．０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ及び０．２５ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。この培地は、最終ｐＨが７．１０から７．３０であり、最終重量オスモル濃度が３００から３４０ｍＯｓｍｏ／ｋｇである。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｋｇ無水デキストロース、０．５８４ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、６．９２ｇ／ｋｇフィトンペプトン、ｎ５．６７ｍＬ／ｋｇ ＮａＯＨ及び２．５ｍＬ／ｋｇ ＨＣｌを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。この培地は、最終ｐＨが７．１０から７．２０であり、最終重量オスモル濃度が３７３から４０３ｍＯｓｍｏ／ｋｇである。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、７．７６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｌ無水デキストロース、０．８７６ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．６７ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、４．０ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、２．５７９ｇ／Ｌフィトンペプトン、０．０５ｍＬ／Ｌメトトレキサート、３．５ｍＬ／ｋｇ ＮａＯＨ及び２．９１ｍＬ／ｋｇ ＨＣｌを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。この培地は、最終ｐＨが７．１０から７．２０であり、最終重量オスモル濃度が３７３から４０３ｍＯｓｍｏ／ｋｇである。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｌ無水デキストロース、０．５８４ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、６．９２ｇ／Ｌフィトンペプトン、０．０５ｍＬ／Ｌメトトレキサート、５．６７ｍＬ／ｋｇ ＮａＯＨ及び２．５ｍＬ／ｋｇ ＨＣｌを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。この培地は、最終ｐＨが７．１０から７．２０であり、最終重量オスモル濃度が３７３から４０３ｍＯｓｍｏ／ｋｇである。
本発明は、１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、７．０ｇ／ｌ無水デキストロース、０．５８４ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、０．０３１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．４３６ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．２７ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、９．２３ｇ／Ｌフィトンペプトン、０．０５ｍＬ／Ｌメトトレキサート、８．９５ｍＬ／ｋｇ ＮａＯＨ及び４．１ｍＬ／ｋｇ ＨＣｌを含む、抗ＩＬ−１８抗体を発現するＣＨＯ細胞用の改善された培地を含む。この培地は、最終ｐＨが７．１０から７．２０であり、最終重量オスモル濃度が３７３から４０３ｍＯｓｍｏ／ｋｇである。
本発明は、酪酸ナトリウムを添加すること、及びＮ−アセチルシステインを添加することを含む、最終力価を増加させることによって、ＩｇＧ１抗体を産生するＣＨＯ細胞系の生産性を増大させる方法も特徴とする。一実施形態においては、ＩｇＧ１抗体は抗ＩＬ−１８である。一実施形態においては、生産性の増大は、最終力価の増加によって評価される。一実施形態においては、最終力価の増加は、濃度０．１ｍＭから１０ｍＭの酪酸ナトリウムの添加によって成される。一実施形態においては、酪酸ナトリウムの濃度は０．１ｍＭから８．０ｍＭである。一実施形態においては、酪酸ナトリウムの濃度は０．１ｍＭから３．０ｍＭである。一実施形態においては、酪酸ナトリウムの濃度は０．１２５ｍＭから２．０ｍＭである。一実施形態においては、酪酸ナトリウムの濃度は０．１２５ｍＭである。一実施形態においては、最終力価の増加は１０−８０％である。一実施形態においては、最終力価の増加は２０−６０％である。一実施形態においては、最終力価の増加は３５−５５％である。一実施形態においては、最終力価の増加は４０％である。一実施形態においては、細胞培養物の寿命は、濃度０．１ｍＭから１０ｍＭのＮ−アセチルシステインの添加によって改善される。一実施形態においては、細胞培養物の寿命の増加は５−５０％である。
本発明は、ＳＲ−３７１及び酪酸ナトリウムを含む、最終力価を増加させることによって、ＩｇＧ１抗体を産生するＣＨＯ細胞系の生産性を増大させる細胞培地も提供する。一実施形態においては、ＩｇＧ１抗体は抗ＩＬ−１８である。一実施形態においては、生産性の増大は、最終抗ＩＬ−１８力価の１０−８０％の増加によって判定される。一実施形態においては、生産性の増大は、最終抗ＩＬ−１８力価の２０−６０％の増加によって判定される。一実施形態においては、生産性の増大は、最終抗ＩＬ−１８力価の３５−５５％の増加によって判定される。一実施形態においては、生産性の増大は、最終抗ＩＬ−１８力価の４０％の増加によって判定される。一実施形態においては、添加される酪酸ナトリウムの濃度は０．１２５ｍＭから８．０ｍＭである。一実施形態においては、添加される酪酸ナトリウムの濃度は０．２ｍＭから３．０ｍＭである。一実施形態においては、添加される酪酸ナトリウムの濃度は０．３ｍＭから２．０ｍＭである。一実施形態においては、添加される酪酸ナトリウムの濃度は０．１２５ｍＭである。一実施形態においては、添加されるＮ−アセチルシステインの濃度は１ｍＭから１０ｍＭである。一実施形態においては、添加されるＮ−アセチルシステインの濃度は５ｍＭから１０ｍＭである。一実施形態においては、平均最終力価は５−５０％増加する。一実施形態においては、平均最終力価は１５−３５％増加する。一実施形態においては、平均最終力価は２５−３５％増加する。
シードにおける生細胞密度の関数としてＡＢＴ−８７４増殖力価を示すグラフである。１５日目の力価の結果は、供給時の生細胞密度と強く相関する。上記データに多項式を適合させると、最適供給密度が約３．５・１０６細胞・ｍｌ−１であることが示唆される。プロセスパラメータは、ｐＨ＝６．９、Ｔ＝３５℃、ＤＯ＝４０％、４×培地への接種材料比１：５又は１：４であり、供給を指定密度で開始し、初期体積の１％で１０日間であった。
Ｉ． 定義
本願で用いる用語は当分野で標準のものであるが、ある用語の定義は、特許請求の範囲の意味に明瞭性及び明確性を確保するためのものである。
本明細書では「抗体」という用語は、４本のポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とからなる免疫グロブリン分子を指すものとする。各重鎖は、（ＨＣＶＲ又はＶＨと略記する）重鎖可変領域と重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３個のドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、（ＬＣＶＲ又はＶＬと略記する）軽鎖可変領域と軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣＬで構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的である領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域に更に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序、すなわちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で整列する３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成される。本発明の方法及び組成物を用いて製造することができる抗体の例としては、（抗ＴＮＦα抗体とも称する）腫よう壊死因子（ＴＮＦ）α抗体、（抗ＩＬ１２抗体とも称する）インターロイキン（ＩＬ）１２抗体、（抗ＩＬ１８抗体とも称する）インターロイキン（ＩＬ）１８抗体、及び（本明細書では抗ＥＰＯ／Ｒ抗体とも称する）ＥＰＯ／Ｒ抗体が挙げられる。本発明によって製造することができるＴＮＦα抗体は、その各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第６，０９０，３８２号、同６，２５８，５６２号及び同６，５０９，０１５号に更に詳細に記載されている。
本発明によって抗体断片を製造することもできる。本明細書では、抗体の「抗原結合性部分」又は「抗原結合性フラグメント」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ｈＴＮＦα）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１個以上の断片を指す。完全長抗体の断片は、抗体の抗原結合機能を果たし得ることが示された。抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬとＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１： ５４４−５４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び（ｖｉｉ）二重可変（ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ）ドメイン（ＤＶＤ）抗体が挙げられる。また、Ｆｖ断片の２個のドメインＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、ＶＬとＶＨは、ＶＬ領域とＶＨ領域が一対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２： ４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ５８７９−５８８３を参照されたい。）として生成させることができる合成リンカーを用いて、組換え方法によって連結することができる。かかる単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含される。二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）などの単鎖抗体の他の形態も包含される。二重特異性抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、短かすぎて同じ鎖上の２個のドメインの対形成が不可能であるリンカーを用いることによって、これらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を生成させた、二価の二重特異的な抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６４４４−６４４８； Ｐｏｌｊａｋ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２： １１２１−１１２３参照）。本発明の方法によって製造することができる抗体部分の例は、その各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国特許第６，０９０，３８２号、同６，２５８，５６２号及び同６，５０９，０１５号に更に詳細に記載されている。本発明の方法及び組成物を用いた抗体断片又は部分の製造も本発明の範囲内である。
本明細書では「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞に移入された組換え発現ベクターを用いて発現される抗体、（以下に更に記述する）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したトランスジェニック動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０： ６２８７参照）、別のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離されたすべてのヒト抗体を含むものとする。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかし、ある実施形態においては、かかる組換えヒト抗体は、インビトロでの変異誘発（又はヒトＩｇ配列を導入したトランスジェニック動物を使用するときには、インビボでの体細胞変異誘発）を受け、したがって組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、関係するものの、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリーに天然には存在し得ない配列である。
本明細書では「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する別の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする（例えば、ｈＴＮＦαに特異的に結合する単離抗体は、ｈＴＮＦα以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。）。しかし、ｈＴＮＦαに特異的に結合する単離抗体は、別の種由来のＴＮＦα分子などの他の抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない場合もある。
「基本培地」という用語は、細胞の増殖を支援することができる任意の培地を指す。基本培地は、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウムなどの標準無機塩、並びに微量元素、ビタミン、エネルギー源、緩衝系及び必須アミノ酸を補給する。基本培地の例としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ ＣＨＯ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びイスコフ改変ダルベッコ培地が挙げられるが、これらだけに限定されない。
本明細書では「改変基本培地」という用語は、少なくとも１種類の標準構成要素、成分又は栄養素（すなわち、当分野で公知の、古典的に処方された基本培地中に存在する少なくとも１個の構成要素、成分又は栄養素）が取り除かれ、減少し、又は増加した、基本培地を指す。「改変基本培地」において用いられる「改変」という用語は、基本培地内の個々の成分間の比率の変化も表し得る。本発明の好ましい一実施形態においては、改変基本培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム及び／又はリン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及びグルコース（例えば、単糖グルコース）の少なくとも１つを含まない。
本明細書では「細胞培地」、「培地」及び「培地処方」という用語は、多細胞生物又は組織の外部の人工的インビトロ環境における細胞の維持、増殖、成長又は拡大のための栄養溶液を指す。細胞培地は、例えば、細胞増殖を促進するように処方された細胞培養増殖培地、又は組換えタンパク質産生を促進するように処方された細胞培養産生培地を含めて、特定の細胞培養用途に対して最適化することができる。栄養素、構成要素及び成分という用語は、細胞培地を構成する要素を指すのに本明細書では区別なく使用される。
本明細書では「細胞培養産生培地」又は「産生培地」という用語は、細胞培養の産生期中に使用されるように設計された細胞培地を指す。好ましい一実施形態においては、産生培地は、産生期中の組換えタンパク質発現用に設計される。産生培地の例を、実施例の項の表２−７を含めて、本明細書に記載する。
本明細書では「流加細胞培養」及び「流加培養」という用語は、細胞（好ましくは、ほ乳動物細胞）及び培地を最初に培養容器に補給し、追加の培養栄養素を培養中に培養物に連続的に、又は不連続的な増分で供給し、培養終了前に細胞及び／又は産物を定期的に収集する、又は収集しない、細胞培養を指す。
「流加培養法」とは、流加細胞培養物に追加の栄養素を補給する方法を指す。例えば、流加培養法は、確定された供給スケジュールに従って所与の期間内に補充培地を添加することを含み得る。
本明細書では「供給」という用語は、接種後に培養物に対して成される任意の物質の任意の添加を指す。供給は、１回以上の添加であり得る。
本明細書では「供給溶液」、「供給培地」及び「供給用培地」という用語は、接種後のある時期に開始される、培養物に添加される１種類以上の栄養素を含む培地を指す。一実施形態においては、供給溶液は、基本培地と少なくとも１種類の加水分解物、例えば、ダイズ系加水分解物、酵母系加水分解物、又はこれら２タイプの加水分解物の組合せとを含む、組合せ供給液である。本発明の別の一実施形態においては、供給溶液は、高濃度基本培地などの基本培地のみを含み得、又は加水分解物若しくは高濃度加水分解物のみを含み得る。
本明細書では「フィードバック制御系」という用語は、所与のパラメータを監視するプロセスを指し、それによって所望のパラメータ設定値に適合するように、追加の薬剤が添加され、又は細胞培養の環境が変更される。一実施形態においては、所与のパラメータは、ほ乳動物細胞培養物のグルコースレベルであり、それによってグルコースレベルを使用して、供給溶液、例えば組合せ供給溶液を細胞培養物に添加すべき時期を決定する。フィードバック制御系を使用して、ほ乳動物細胞培養物におけるタンパク質産生を最適化するのに必要な栄養成分を維持することができる。
本明細書では「供給プロファイル」という用語は、ほ乳動物細胞培養物に供給溶液、例えば組合せ供給溶液を補充するスケジュールを指す。供給プロファイルは、フィードバック制御系を用いて好ましく作成される。
細胞は、ポリペプチドの発現を可能にする組換え核酸配列が、組換えウイルスによるウイルス感染、形質移入、形質転換、電気穿孔法などの「遺伝子操作」方法によって細胞に導入されたときに、特定のポリペプチド又はタンパク質を発現するように「遺伝子操作」することができる。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０）， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５： ４８７−５１１； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８、及び年４回の改訂）を参照されたい。目的タンパク質を発現するように細胞及び／又は細胞系を遺伝子操作するための方法及びベクターは、当業者に周知である。遺伝子操作技術としては、発現ベクター、標的相同組換え及び遺伝子活性化（例えば、Ｃｈａｐｐｅｌ、米国特許第５，２７２，０７１号参照）、並びに操作された転写因子によるトランス活性化（例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６（６）： ２７５８−６３参照）が挙げられるが、これらだけに限定されない。ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドの産生を本質的に誘導しないプロモーターなどの異種調節領域の制御下で発現されてもよい。例えば、プロモーターは、ほ乳動物ポリペプチドの発現を誘導する強力なウイルスプロモーター（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０）であり得る。宿主細胞は、通常、ポリペプチドを産生しても、しなくてもよい。例えば、宿主細胞は、ヒトポリペプチドを産生するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞であり得る（ヒトポリペプチドをコードする核酸がＣＨＯ細胞に導入されたことを意味する）。
或いは、宿主細胞は、（例えば、内在性プロモーターを強力なウイルスプロモーターで置換することによって）通常は極めて低レベルでしか存在しないヒトポリペプチドを高レベルで産生するように遺伝子操作されたヒト細胞であり得る。
本明細書では「増殖期」とは、培養細胞が急速に分裂し、数が増える期間を指す。増殖期中、細胞は、細胞成長を最大にするように設計された培地及び条件下で一般に培養することができる。
「加水分解物」という用語は、任意の酵素消化物、特に、抽出する物質（例えば、植物成分又は酵母細胞）を、物質の成分をより単純な形（例えば、単糖類若しくは二糖類及び／又はモノ、ジ若しくはトリペプチドを含む調製物）に分解することができる少なくとも１種類の酵素で処理することによって調製される、抽出物の特別なタイプを含む。「加水分解物」は、例えばパパインによって、更に酵素的に消化することができ、及び／又は自己分解、熱分解及び／又は原形質分離によって形成することができる。本発明の好ましい一実施形態においては、加水分解物は、動物源から調製されず、すなわち、非動物系である。好ましい非動物系加水分解物の例としては、植物系加水分解物、例えばダイズ系加水分解物、及び植物源にも動物源にも由来しない加水分解物、例えば酵母系加水分解物が挙げられる。
「加水分解物濃縮溶液」及び「加水分解物濃縮培地」という用語は、加水分解物、又は複数の加水分解物、すなわち異なる出所から抽出された加水分解物の組合せを、細胞培養物に添加される主構成要素として含む、培地を指す。加水分解物濃縮溶液は、例えば、細胞培養物に添加して、タンパク質産生を高めることができる。同様に、「基本濃縮溶液」及び「基本濃縮培地」という用語は、基本培地（又は基本培地の組合せ）を主構成要素として含む培地を指す。一実施形態においては、加水分解物濃縮溶液、基本濃縮溶液又はこれら２種類の濃縮溶液の組合せを細胞培養物に添加して、タンパク質産生における細胞培養物の生産性を増大させる。
追加の薬剤を含む培養物、又はタンパク質製造プロセスの変更パラメータを含む培養物において産生されるポリペプチド量が、追加の薬剤を含まないこと、又はタンパク質製造プロセスの変更パラメータを含まないこと以外は同一である培養物において産生されるポリペプチド量よりも多い場合に、追加の薬剤の添加、又はタンパク質製造プロセスのパラメータの変更によって、タンパク質産生が「増加」する。タンパク質製造プロセスの変更の例としては、培地補助剤の添加、補充培地量の増加、培養温度の変化、及び細胞が培養される酸素濃度が挙げられるが、これらだけに限定されない。追加の薬剤は、供給溶液などの補充溶液を用いた細胞培養に用意することができる。
「構成要素」という用語は、化学起源でも生物起源でも、細胞成長の増殖を維持又は促進するのに細胞培地中で使用することができる任意の化合物を指す。「成分」、「栄養素」及び構成要素」という用語は、区別なく使用され、すべてかかる化合物を指すものとする。細胞培地中で使用される典型的な構成要素としては、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などが挙げられる。細胞の培養を生体外で促進又は維持する別の構成要素は、本発明の範囲内で、特定の必要性に応じて、当業者が選択することができる。
本明細書では「接種」という用語は、培養を開始するために培地に細胞を添加することを指す。
「産生期」とは、細胞が組換えポリペプチド又はタンパク質の最大量を産生している期間を指す。産生期は、増殖期よりも細胞分裂が少ないという特徴があり、ポリペプチド産生を最大にするように設計された培地及び培養条件の使用も含み得る。
「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」は、遺伝子操作プロセスから生じるポリペプチド又はタンパク質である。好ましい一実施形態においては、組換えタンパク質は、前記タンパク質を細胞培養物中で発現する培養細胞から得られる。
「遷移期」とは、「増殖期」と「産生期」の間の細胞培養期間を意味する。遷移期中、培地及び環境条件は、増殖を最大にするように設計されたものから、ポリペプチド産生を最大にするように設計されたものに移行し得る。
本発明は、ほ乳動物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）の細胞培養によって、タンパク質、好ましくは組換えタンパク質、例えば抗体を製造するための新しい組成物及び方法を提供する。本明細書に記載の細胞培地及び方法は、組換えタンパク質産生、特に組換え（完全ヒト、ヒト化又はキメラ）モノクローナル抗体製造に使用されてきた。培地及び方法は、多数の抗体産物系にわたって、ほ乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞の増殖及び生産性を増大させる種々の改善及び進歩を取り込むように改変されてきた。本発明の改善された組成物及び方法の諸態様を以下に詳細に記述する。
ＩＩ． 目的タンパク質
一般に、本発明の方法及び組成物は、組換えタンパク質の製造に有用である。組換えタンパク質は、遺伝子操作プロセスによって製造されるタンパク質である。本発明の方法及び組成物による製造に特に好ましいタンパク質は、生物学的製剤としても知られる、タンパク質系治療用物質である。好ましくは、タンパク質は、細胞外産物として分泌される。
本発明の方法及び組成物によって製造することができるタンパク質としては、抗体又はその抗原結合性フラグメントが挙げられるが、これらだけに限定されない。抗体分子をコードするＤＮＡを操作して、単鎖抗体、高親和性抗体、抗体に基づく別のポリペプチドなどの組換えタンパク質をコードすることができるＤＮＡを生成することができる多数の技術が当分野で公知である（例えば、その各々を参照により本明細書に組み入れる、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４−９３８； Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７； Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１−７３４； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６； Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３９４−３９７参照）。（トランスジェニック動物を用いて調製され、インビトロで更に改変されていてもよいような）完全ヒト抗体及びヒト化抗体を産生する組換え細胞も、本発明に使用することができる。ヒト化抗体という用語は、単鎖抗体も包含する。例えば、その各々を参照により本明細書に組み入れる、Ｃａｂｉｌｌｙ他、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ他、欧州特許第０，１２５，０２３号Ｂ１；Ｂｏｓｓ他、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓ他、欧州特許第０，１２０，６９４号Ｂ１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他、国際公開第８６／０．１５３３号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｍ．Ｓ．他、欧州特許第０，１９４，２７６号Ｂ１；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００号Ｂ１；Ｑｕｅｅｎ他、欧州特許第０ ４５１ ２１６号Ｂ１及びＰａｄｌａｎ， Ｅ．Ａ．他、欧州特許第０ ５１９ ５９６号Ａ１を参照されたい。例えば、本発明は、特定の細胞標的、例えば、上記タンパク質、ヒトＥＧＦ受容体、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原、ＣＥＡ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＮＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、Ｅｐ−ｃａｍ、別の癌細胞表面分子、ＴＮＦアルファ、ＴＧＦ−ｂ１、ＶＥＧＦ、別のサイトカイン、アルファ４ベータ７インテグリン、ＩｇＥ、ウイルスタンパク質（例えば、サイトメガロウイルス）のいずれかを免疫特異的に認識するヒト及び／又はヒト化抗体の製造に使用することができる。本発明の組成物及び方法によって製造することができる抗体の例としては、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体が挙げられるが、これらだけに限定されない。一実施形態においては、抗ＴＮＦα抗体は、完全ヒト抗ＴＮＦα抗体、例えばアダリムマブ／Ｄ２Ｅ７である（参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，０９０，３８２号参照、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。一実施形態においては、抗ＩＬ−１２抗体は、完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体、例えばＡＢＴ−８７４である（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，９１４，１２８号参照）。一実施形態においては、抗ＩＬ−１８抗体は、完全ヒトＩＬ−１８抗体（例えば、ＡＢＴ−３２５）である。例えば、米国特許出願公開第２００５０１４７６１０号Ａ１に記載の抗体も参照されたい。一実施形態においては、（ＡＢＴ−００７とも称される）抗ＥＰＯ／Ｒ抗体は、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第２００６００１８９０２号Ａ１に記載の抗体のような完全ヒト抗体である。
本発明の方法及び組成物によって製造することができるタンパク質のタイプの別の例としては、融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質は、異種タンパク質又はペプチドに融合した、タンパク質又はドメイン若しくはタンパク質（例えば、可溶性細胞外ドメイン）である。かかる融合タンパク質の例としては、免疫グロブリン分子の一部との融合物として発現されるタンパク質、ジッパー部分との融合タンパク質として発現されるタンパク質、及びサイトカインと増殖因子の融合タンパク質（すなわち、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３、ＭＧＦとＩＬ−３）などの新規多機能タンパク質が挙げられる。国際公開第９３／０８２０７号及び同９６／４０９１８号は、それぞれ免疫グロブリン融合タンパク質及びジッパー融合タンパク質を含めて、ＣＤ４０Ｌと称する分子の種々の可溶性オリゴマー体の調製を記載する。そこで考察された技術は、別のタンパク質にも適用可能である。別の融合タンパク質は、エタネルセプトとしても知られる組換えＴＮＦＲ：Ｆｃである。エタネルセプト（又はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）；Ａｍｇｅｎ／Ｗｙｅｔｈ）は、ｐ７５ ＴＮＦアルファ受容体の細胞外部分の２分子の２量体であり、各分子は、ヒトＩｇＧ１の２３２アミノ酸Ｆｃ部分に融合した２３５アミノ酸のＴＮＦＲ由来のポリペプチドからなる。実際、細胞受容体分子の細胞外ドメイン、酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン分子の一部、ジッパードメイン及びエピトープを含めて、ただしこれらだけに限定されない任意の分子が、融合タンパク質として発現され得る。
ＩＩＩ． 本発明の細胞培地
本発明は、組換えタンパク質、例えば、抗体又はその抗原結合性部分の産生又は発現用のほ乳動物細胞培養物に使用される細胞培地を提供する。本明細書に記載の種々の細胞培地は、タンパク質産生の増加及び細胞寿命の延長を含めて、改善された細胞培養に、別々に、又は一括して、使用することができる。
好ましい一実施形態においては、本発明の細胞培地は、無血清であり、すなわち、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウマ血清、ヤギ血清、又は当業者に公知の任意の他の動物由来の血清）を含まない。
第１の態様においては、本発明は、改変基本培地を全体的又は部分的に含むほ乳動物細胞培地を提供する。改変基本細胞培地は、当分野で公知の標準基本細胞培地から誘導することができる。適切な基本培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥ／Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、α最小必須培地（α−ＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）、ＰＦ ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯタンパク質を含まない培地（Ｓｉｇｍａ）又はＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３２５ ＰＦ ＣＨＯ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ＣＨＯ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）参照、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が挙げられるが、これらだけに限定されない。本発明に使用することができる基本培地の別の例としては、ＢＭＥ基本培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅａｇｌｅ， Ｈ （１９６５） Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ８９， ３６参照）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、粉末）（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃３１６００）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ （１９５９） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８， ３９６； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９６０） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２， １８５． Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｃｏｍｍｉｔｅｅ， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ６： ２， ９３も参照されたい。）、ＣＭＲＬ １０６６培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（＃１１５３０）、Ｐａｒｋｅｒ Ｒ．Ｃ． ｅｔ ａｌ （１９５７） Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ５， ３０３も参照されたい。）が挙げられる。
基本培地は、種々の無機及び有機緩衝剤、界面活性剤、塩化ナトリウムなど、標準基本培地中に存在するある種の非栄養成分を除去するために、改変することができる。かかる成分を基本細胞培地から除去すると、残りの栄養成分の濃度が増加し、本明細書に記載するように、全体的な細胞増殖及びタンパク質発現が向上する。また、取り除いた成分は、細胞培養条件の要件に従って、改変基本細胞培地を含む細胞培地に戻すことができる。以下に示すように、ある種の構成要素を基本細胞培地から分離し、すなわち、改変基本細胞培地を細胞培地中の構成要素として添加し、続いて分離した構成要素として構成要素を細胞培地に戻すと、細胞培養物の増殖、及びタンパク質産生に有利である諸性質がもたらされることが見いだされた。
本発明の改変基本培地は、以下の構成要素、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースの全部ではないがいずれかを含まない。これらの構成要素は、一般に、市販基本細胞培地中に存在する。
成分、例えば、炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び／又は単糖グルコースは、商業的な培地サービス、例えばＳＡＦＣ Ｐｈａｒｍａ（商標）によって除外することができる。当業者は、改変基本培地を、一実施形態においては、商業的な細胞培地サービス、すなわち受注培地サービスによって得ることができることを理解されたい。受注培地サービスの例は、ＳＡＦＣ（以前のＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（登録商標）、Ｌｏｎｚａなどの会社によって提供される。
或いは、当業者は、本明細書に記載の特定の構成要素が取り除かれた、基本細胞培地を作製する標準方法に従って、本発明の改変基本細胞培地を調製することができる（例えば、その各々を参照により本明細書に組み入れる、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （２００５） Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ； ＢＤ Ｂｉｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ， （２００６）， Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ； Ｊｅｎｋｉｎｓ， ｅｄ． （１９９９）， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ； Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， ｅｄｓ．， （１９９７） Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ： Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｂｕｔｌｅｒ， ｅｄ． （１９９１） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｄａｒｌｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ （１９９４） Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｄｉａ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９９２）， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （２ｎｄ ｅｄ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｐｏｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ （１９９７）， Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （２ｎｄ Ｅｄ）， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， （Ｐａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ７５）を参照されたい。）。
一実施形態においては、本発明の細胞培地は、改変基本細胞培地、鉄源（好ましくは無機、例えば、クエン酸鉄（ＩＩＩ））、組換え増殖因子、緩衝剤、界面活性剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、及び少なくとも２種類の非動物加水分解物を含む。また、改変基本細胞培地は、アミノ酸、ビタミン、又はアミノ酸とビタミンの両方の組合せを含んでいてもよい。
本明細書では「鉄」という用語は、培地の補強に用いられる非動物由来の鉄源を意味する。細胞培地中の鉄源は、好ましくは無機である。鉄源は、好ましくは無機であり、例えば、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）などの鉄（ＩＩＩ）及び鉄（ＩＩ）塩である。クエン酸鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウムなどのキレート塩が好ましい。しかし、動物源から単離されていない別の鉄源、例えば、当量の鉄を与える化学鉄キレート剤又は組換えタンパク質鉄担体を使用することもできる。使用することができる鉄キレート化合物としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス（ベータ−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、デフェロキサミンメシラート、ジメルカプトプロパノール、ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）及びトランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）の鉄キレート、並びにクエン酸鉄（ＩＩＩ）キレート及び硫酸鉄（ＩＩ）キレートが挙げられるが、これらだけに限定されない。特に好ましい鉄源はクエン酸鉄（ＩＩＩ）であり、好ましくは、細胞培地の最終体積中に０．１−１ｍＭの濃度で存在する。一実施形態においては、クエン酸鉄（ＩＩＩ）の濃度は約０．５ｍＭである。別の一実施形態においては、クエン酸鉄（ＩＩＩ）の濃度は１００−１５０ｍｇ／Ｌ、例えば、１２２ｍｇ／Ｌである。上記ｍＭの中間の数、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９及び１．０ｍＭ、並びに上記ｍｇ／Ｌの中間の数、例えば、１００、１１０、１２０、１３０、１４０及び１５０も本発明の一部とする。
細胞培地に含めることができる増殖因子の非限定的例は、インスリン又はその組換え類似体ＩＧＦ−１、及びインスリンとＩＧＦ−１の組合せである。特に好ましい組換え増殖因子は、インスリン又はその組換え類似体であり、好ましくは細胞培地の最終体積中に約４ｍｇ／Ｌから１３ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。上記インスリン濃度の中間の数、例えば、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５及び１３も本発明の一部とする。
細胞培地は緩衝剤も含み得る。好ましい一実施形態においては、緩衝剤は、改変基本細胞培地から除外されるが、別個の成分として（改変基本細胞培地も添加される）細胞培地に添加される。細胞培地に使用される緩衝剤は、当分野で公知である。細胞培地に含めることができる緩衝剤の非限定的例は、リン酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウムである。一実施形態においては、炭酸水素ナトリウムを緩衝剤として細胞培地に約０．１−３ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。一実施形態においては、炭酸水素ナトリウムを緩衝剤として細胞培地に約１．６ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。一実施形態においては、ＨＥＰＥＳを緩衝剤として細胞培地に約０．１−３ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。別の一実施形態においては、ＨＥＰＥＳを緩衝剤として細胞培地に１．８ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。一実施形態においては、リン酸緩衝剤、例えば、リン酸ナトリウム及びリン酸水素ナトリウムを細胞培地に０．０１から０．５ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。上記濃度の中間の数、例えば、炭酸水素ナトリウム又はＨＥＰＥＳの濃度０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９及び３．０、又はリン酸緩衝剤の濃度０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８及び０．５ｇ／Ｌも本発明の一部とする。
緩衝剤を含有すると、細胞培地を所望のｐＨに維持するのに役立つ。一実施形態においては、細胞培地のｐＨは、６．０から８．０、６．５から７．５、又は７．１から７．２の範囲である。これらのｐＨ値の中間の数、例えば、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９及び８．０、並びに本明細書に列挙する他のすべての数も本発明の一部とする。上記値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として用いた値の範囲も本発明の範囲に包含されるものとする。
細胞培地は、ＮａＣｌなどの重量オスモル濃度調節剤も含み得る。一実施形態においては、ＮａＣｌを細胞培地に約１．０から６．５ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。一実施形態においては、細胞培地の重量オスモル濃度は約２６０から４５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。一実施形態においては、細胞培地の重量オスモル濃度は約３２０から４５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。上記ＮａＣｌ濃度及びｍＯｓｍ／ｋｇ値の中間の数、例えば、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６及び６．５のＮａＣｌ濃度、又は２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０のｍＯｓｍ／ｋｇ範囲、並びにその中間の数も本発明の一部とする。上記値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として用いた値の範囲も本発明の範囲に包含されるものとする。
エネルギー源を本発明の細胞培地に添加することもできる。好ましくは、エネルギー源は単糖である。細胞培地中で使用することができる単糖の例としては、グルコース（例えば、Ｄ−グルコース）、マルトース、マンノース、ガラクトース及びフルクトースが挙げられる。一実施形態においては、グルコースを細胞培地に３．５−７．０ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。一実施形態においては、グルコースを細胞培地に７．０ｇ／Ｌ以下の最終濃度で添加する。一実施形態においては、グルコースを細胞培地に約７．０ｇ／Ｌの最終濃度で添加する。上記グルコース濃度の中間の数、例えば、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．２、４．４、４．６、４．８、５、５．２、５．４、５．６、５．８、６、６．２、６．４、６．６、６．８及び７、並びにその中間の数も本発明の一部とする。上記値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として用いた値の範囲も本発明の範囲に包含されるものとする。
本発明の細胞培地中の重要な構成要素は、加水分解物の添加である。本発明の細胞培地は、単一の出所、例えば、酵母若しくはダイズに由来する加水分解物を含み得、又は加水分解物の組合せ、例えば、酵母系加水分解物とダイズ系加水分解物を含み得る。好ましくは、本発明の細胞培地中で使用される加水分解物は非動物系である。非動物系加水分解物の例としては、植物系加水分解物及び非植物系加水分解物、例えば、酵母系加水分解物、Ｔｒｙｐｒｏｎｅ、カゼイン加水分解物、酵母エキス、又はパパインによって消化されたダイズペプトンが挙げられる。本発明の培地中で使用される加水分解物は、例えば、Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎｏｒｗｉｃｈ， Ｎ．Ｙ．、ＯｒｇａｎｏＴｅｃｈｎｉｅ， Ｓ．Ａ． Ｆｒａｎｃｅ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｈｅｆｅｗｅｒｋｅ ＧｍｂＨ， Ｇｅｒｍａｎｙ、又はＤＭＶ Ｉｎｔｌ． Ｄｅｌｈｉ， Ｎ．Ｙ．などの供給源からのＨｙＰｅｐ １５１０（登録商標）、Ｈｙ−Ｓｏｙ（登録商標）、Ｈｙ−Ｙｅａｓｔ ４１２（登録商標）及びＨｉ−Ｙｅａｓｔ ４４４（登録商標）を含めて、市販されている。酵母エキス源及びダイズ加水分解物源は、国際公開第９８／１５６１４号、同００／０３０００号、同０１／２３５２７号及び米国特許第５，７４１，７０５号にも開示されている。やはり本発明に使用することができる酵母系加水分解物の例としては、ＴＣ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）及びＹｅａｓｔｏｌａｔｅ ＵＦ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられ、植物系加水分解物の例としては、Ｓｏｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ＵＦ（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＨｙＱ（登録商標）Ｓｏｙ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ Ｍｅｄｉａ）が挙げられる。
一実施形態においては、本発明の細胞培地は、グルタミン、例えば、Ｌ−グルタミンを更に含む。適切なＬ−グルタミン源は、Ｇｉｂｃｏ（Ｃａｔ． Ｎｏ． ２５０３０−０８１）などの種々の商業供給源から利用可能である。
実施例の項に記載の細胞培地を含めて、本発明の細胞培地は、メトトレキサートを含んでいてもよい。ＣＨＯ細胞を培養するための細胞培地中で使用されるメトトレキサートの量の例としては、約１００ｎＭから５０００ｎＭのメトトレキサートが挙げられる。上記メトトレキサートモル濃度の中間の数、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００及び５０００ｎＭ、並びにその中間の数も本発明の一部とする。上記値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として用いた値の範囲も本発明の範囲に包含されるものとする。
大規模バイオリアクターでは、ＣＨＯ細胞は、気体を用いた容器のスパージング、及び撹拌羽根による混合から生じる完全な力（ｓｈｅｅｒ ｆｏｒｃｅ）の影響を特に受けやすい。したがって、本発明の細胞培地は、細胞保護剤を含んでいてもよい。本明細書では「細胞保護剤」という用語は、真核細胞を損傷から保護する物質を意味する。かかる損傷は、例えば、せん断力、又はバイオリアクター容器に注入される気泡の作用によって生じ得る。細胞の損傷の発生を最少にするために、培地は、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオールなどの細胞保護剤を含むことが有利である。これらのうち、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ポリオール、ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ．）ポリオールＦ６８は、ポリビニルアルコールとは異なり、無毒物質であり、ポリエチレングリコールとは異なり、下流の精製を妨害しないので、好ましい。
本発明の細胞培地は、非鉄（ＩＩ）金属イオンも含み得る。非鉄（ＩＩ）金属イオンの例としては、塩化物及び硫酸塩、カリウム、マグネシウム、銅（ＩＩ）、セレン、亜鉛、ニッケル、マンガン、スズ、カドミウム、モリブデン酸塩、バナジン酸塩及びケイ酸塩が挙げられるが、これらだけに限定されない。
本発明の細胞培地は、ビタミン及び酵素補助因子も含み得る。かかるビタミン及び酵素補因子の例としては、ＰＡＢＡ（ｐ−アミノ安息香酸）、ビタミンＫ（ビオチン）、ビタミンＢ５（Ｄ−パントテン酸カルシウム）、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド（ニコチン酸アミド）、ビタミンＢ６（ピリドキシン（Ｐｙｒｄｏｘｉｎｅ）ＨＣｌ）（及びピリドキサール（Ｐｙｒｏｄｏｘａｌ）ＨＣｌ）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ１（チアミン）及びビタミンＢ１２（シアノコバラミン）が挙げられるが、これらだけに限定されない。或いは、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸）を培地に添加することができる。塩化コリンを添加することもできる。塩化コリンは、通常、ビタミンとみなされるが、脂質因子とみなすこともできる。
さらに、本発明の細胞培地は脂質様因子も含み得る。脂質因子の例としては、塩化コリン及びホスファチジルコリンが挙げられる。脂質産生の助剤、例えば、エタノールアミンのようなアルコールアミンも含まれ得る。
本発明の方法及び組成物においては、細胞は、好ましくは、無血清培地中で培養される。培地に適用される「無血清」という用語は、ウシ胎児血清などの血清を含まない任意のほ乳動物細胞培地を包含する。
本明細書に記載の改善された細胞培地のいずれかの培地中のほ乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞も本発明の範囲に包含される。
本発明の一態様においては、ある種の抗体の産生に最適化された細胞培地の処方を提供する。最適化された処方の例としては、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体を発現するＣＨＯ細胞の増殖又はタンパク質産生用の細胞培地が挙げられる。
完全ヒト抗ＴＮＦα抗体を含めて、抗ＴＮＦα抗体を発現するほ乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞用の細胞培地は、本発明に包含される。好ましい一実施形態においては、完全ヒト抗ＴＮＦα抗体はアダリムマブ（Ｄ２Ｅ７及びＨｕｍｉｒａ（登録商標）とも称される。Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。核酸及びアミノ酸配列を含めて、アダリムマブの諸特性は、参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，０９０，３８２号に記載されている。アダリムマブは、タンパク質、例えばアダリムマブをコードする核酸を含むほ乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞を細胞培養増殖培地中で培養し、細胞培養物を細胞培養産生培地に移送し、タンパク質を細胞培養産生培地から単離することによって製造することができる。
一実施形態においては、本発明は、アダリムマブをコードする核酸を含むＣＨＯ細胞に対して最適化された細胞培養増殖培地を提供する。アダリムマブを発現するＣＨＯ細胞に対して最適化された無血清細胞培養増殖培地の処方は、基本培地、クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約８−１２ｍｌ／ｋｇ、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌ）、組換えヒトインスリン（例えば、約２−６ｍｇ／ｋｇ又は４．０ｍｇ／ｋｇ）、無水グルコース（例えば、２−５ｇ／ｋｇ、約３．５ｇ／ｋｇ）、Ｌ−グルタミン（例えば、約０．２９ｇ／ｋｇ）、炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３ｇ／ｋｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）及び酵母系加水分解物（例えば、約２．０ｇ／ｋｇ）を含む。アダリムマブを発現するＣＨＯ細胞に対して最適化された無血清細胞培養増殖培地の別の例は、以下の構成要素を含む：以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／ｋｇ）；組換えヒトインスリン（例えば、約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ）；無水グルコース（例えば、約７．０ｇ／ｋｇ）；Ｌ−グルタミン（例えば、約０．８から０．９ｇ／ｋｇ）；炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）；ＨＥＰＥＳ（例えば、約１．８ｇ／ｋｇ）；ＮａＣｌ（例えば、約２．６から２．７ｇ／ｋｇ）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（例えば、約１．０ｇ／ｋｇ）；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ）；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）；Ｌ−アスパラギン一水和物（例えば、約０．４５ｇ／ｋｇ）；酵母系加水分解物（例えば、約４．０ｇ／ｋｇ）及び植物系加水分解物（例えば、約２．６ｇ／ｋｇ）。アダリムマブ発現用細胞培養増殖培地は、メトトレキサート、例えば、約１−５ｍＬ／ｋｇ又は約２．５０ｍＬ／ｋｇを更に含み得る。
一実施形態においては、本発明は、例えば、ヒト抗ＴＮＦα抗体（例えば、アダリムマブ）又はエリスロポイエチン受容体（ＥＰＯ／Ｒ）抗体を含めて、抗体を発現するＣＨＯ細胞に対して最適化された細胞培養産生培地を提供する。抗ＥＰＯ／Ｒ抗体の例は、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願公開第２００４００７１６９４号に記載されている。アダリムマブ、抗ＥＰＯ／Ｒ抗体などの抗体を発現するＣＨＯ細胞に対して最適化された無血清細胞培養産生培地の処方は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない改変基本培地；クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌ）；組換えヒトインスリン（例えば、約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ）；無水グルコース（例えば、約７．０ｇ／ｋｇ）；Ｌ−グルタミン（例えば、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ）；炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）；ＨＥＰＥＳ（例えば、約１．８ｇ／ｋｇ）；ＮａＣｌ（例えば、約２．４から２．５ｇ／ｋｇ）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（例えば、約１．０ｇ／ｋｇ）；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ）；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）；酵母系加水分解物（例えば、ｂｏｕｔ １０．７ｇ／ｋｇ）及び植物系加水分解物（例えば、約６．９から７．０ｇ／ｋｇ）を含む。一実施形態においては、細胞培養産生培地は、約７．１から７．２の範囲のｐＨを有し、３７３から４０３ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有する。上記値、例えば、列挙したインスリン、ｐＨ又は重量オスモル濃度値の中間の数も本発明の一部とする。
本発明の別の一態様は、ＣＨＯ細胞によって産生される抗インターロイキン１２（ＩＬ−１２）抗体、例えば完全ヒトＩＬ−１２抗体の産生に対して最適化された細胞培地に関する。好ましい一実施形態においては、完全ヒト抗ＩＬ１２抗体はＡＢＴ−８７４である。核酸及びアミノ酸配列を含めて、ＡＢＴ−８７４の諸特性は、参照により本明細書に組み入れる米国特許第６，９１４，１２８号に記載されている。
一実施形態においては、ＡＢＴ−８７４を発現するＣＨＯ細胞の増殖に対して最適化された無血清細胞培養増殖培地は、以下を含む：以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌ）；組換えヒトインスリン（例えば、約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ）；無水グルコース（例えば、約７．０ｇ／ｋｇ）；Ｌ−グルタミン（例えば、約０．８７から０．８８ｇ／ｋｇ）；Ｌ−アスパラギン一水和物（例えば、約０．４５ｇ／ｋｇ）；炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）；ＨＥＰＥＳ（例えば、約１．８ｇ／ｋｇ）；ＮａＣｌ（例えば、約２．６７から２．６８ｇ／ｋｇ）；約Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（例えば、１．０ｇ／ｋｇ）；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ）；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）；酵母系加水分解物（例えば、約４．０ｇ／ｋｇ）及び植物系加水分解物（例えば、約２．６ｇ／ｋｇ）。
一実施形態においては、ＡＢＴ−８７４発現用無血清細胞培養産生培地は、以下を含む：ビタミン含量が低く、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌ）；組換えヒトインスリン（例えば、約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ）；無水グルコース（例えば、約７．０ｇ／ｋｇ）；Ｌ−グルタミン（例えば、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ）；炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）；ＨＥＰＥＳ（例えば、約１．８ｇ／ｋｇ）；ＮａＣｌ（例えば、約２．４５ｇ／ｋｇ）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（例えば、約１．０ｇ／ｋｇ）；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ）；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）；酵母系加水分解物（例えば、約１０．７ｇ／ｋｇ）及び植物系加水分解物（例えば、約６．９から７．０ｇ／ｋｇ）。
一実施形態においては、本発明は、以下を含む、抗体、例えば抗ＩＬ１２及び抗ＥＰＯ／Ｒ抗体を発現するＣＨＯ細胞用無血清細胞培養増殖培地を提供する：基本培地、クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌ）、組換えヒトインスリン（例えば、約４ｍｇ／ｋｇ）、無水グルコース（例えば、約１．５ｇ／ｋｇ）、Ｌ−グルタミン（例えば、約０．２９から０．３０ｇ／ｋｇ）、炭酸水素ナトリウム（（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）及び酵母系加水分解物（例えば、少なくとも約２ｇ／ｋｇ）。一実施形態においては、抗体、例えば抗ＩＬ１２及び抗ＥＰＯ／Ｒ抗体を発現するＣＨＯ細胞用細胞培養増殖培地は、約７．１０から７．３０のｐＨを有し、約３００から３４０ｍＯｓｍｏ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する。細胞培地は、酵母系加水分解物（例えば、少なくとも約８ｇ／ｋｇ）も含み得る。
本発明の別の一態様は、ＣＨＯ細胞によって産生される抗インターロイキン１８（ＩＬ−１８）抗体、例えば完全ヒトＩＬ−１８抗体の産生に対して最適化された細胞培地に関する。本発明の方法及び組成物によって製造することができる完全ヒトＩＬ−１８抗体の例は、参照により本明細書に組み入れる国際公開第０１／０５８９５６号に記載されている。
一実施形態においては、ＣＨＯ細胞中でのＩＬ−１８抗体産生に対して最適化された細胞培養増殖培地は、以下の構成要素を含む：以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌ）；組換えヒトインスリン（例えば、約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ）；無水グルコース（例えば、約７．０ｇ／ｋｇ）；Ｌ−グルタミン（例えば、約０．８７から０．８８ｇ／ｋｇ）；Ｌ−アスパラギン一水和物（例えば、約０．４５ｇ／ｋｇ）；炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）；ＨＥＰＥＳ（例えば、約１．８ｇ／ｋｇ）；ＮａＣｌ（例えば、約２．６７ｇ／ｋｇ）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（例えば、約１．０ｇ／ｋｇ）；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ）；Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２０（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）；酵母系加水分解物（例えば、約４．０ｇ／ｋｇ）及び植物系加水分解物（例えば、約２．６ｇ／ｋｇ）。完全ヒトＩＬ−１８抗体を発現する細胞の増殖用細胞培地は、７．１０から７．２０のｐＨ、及び３７３から４０３ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し得る。上記値、例えば、列挙したインスリン、ｐＨ又は重量オスモル濃度値の中間の数も本発明の一部とする。
ＣＨＯ細胞中でのＩＬ−１８抗体産生に対して最適化された細胞培養産生培地の例は、以下の構成要素を含む：以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを除去するように改変された、改変基本培地；クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌ）；組換えヒトインスリン（例えば、約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ）；無水グルコース（例えば、約７．０ｇ／ｋｇ）；Ｌ−グルタミン（例えば、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ）；炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）；ＨＥＰＥＳ（例えば、約１．８ｇ／ｋｇ）；ＮａＣｌ（例えば、約２．４５ｇ／ｋｇ）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（例えば、約１．０ｇ／ｋｇ）；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ）；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）；酵母系加水分解物（例えば、約１０．７ｇ／ｋｇ）及び植物系加水分解物（例えば、約６．９から７．０ｇ／ｋｇ）。完全ヒト抗ＩＬ−１８抗体を産生するための細胞培養産生培地の別の例は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地；クエン酸鉄（ＩＩＩ）（例えば、約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌ）；組換えヒトインスリン（例えば、約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ）；無水グルコース（例えば、約７．０ｇ／ｋｇ）；Ｌ−グルタミン（例えば、約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ）；炭酸水素ナトリウム（例えば、約１．６ｇ／ｋｇ）；ＨＥＰＥＳ（例えば、約１．８ｇ／ｋｇ）；ＮａＣｌ（例えば、約２．４５ｇ／ｋｇ）；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８（例えば、約１．０ｇ／ｋｇ）；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ（例えば、約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ）；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（例えば、約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ）；酵母系加水分解物（例えば、約１４．２から１４．３ｇ／ｋｇ）及び植物系加水分解物（例えば、約９．２から９．３ｇ／ｋｇ）を含む。完全ヒトＩＬ−１８抗体を産生するＣＨＯ細胞用の細胞培地は、７．１０から７．２０のｐＨ、及び３７３から４０３ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し得る。上記値、例えば、列挙したインスリン、ｐＨ又は重量オスモル濃度値の中間の数も本発明の一部とする。
実施例の項に記載の例示的培地に加えて、本発明の範囲内の培地の別の例を、抗体産生を改善する流加培養法及び補充培地に関係して記述する。
本発明の培地を使用して、培地又はその成分を細胞集団の全部又は一部と接触させることによって、細胞を適切に培養することができる。１個以上の細胞を１種類以上の化合物、溶液、培地などと混合、添加、併用、播種又は撹拌することによって、培地を細胞と接触させることができる。より詳細に後述するように、培地を細胞と、例えば、細胞を培養する培地を置換又は補充する「供給」によって、すべて一緒に、漸増的に、又は段階的に接触させることもできる。
ＩＶ． 改善されたタンパク質産生のための方法及び組成物
本発明の組成物の方法は、ほ乳動物細胞培養物を対象とする。一実施形態においては、使用するほ乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。
ＤＮＡをほ乳動物細胞に導入する確立された方法が記述されている。Ｋａｕｆｍａｎ， Ｒ．Ｊ．， Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９９０， ｐｐ．１５−６９。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入することができる）陽イオン性脂質試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）−２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）−ｐｌｕｓなどの市販試薬を用いた追加のプロトコルを使用して、細胞に移入することができる。Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８７）．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７。また、電気穿孔法、又は核酸で被覆された微粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）の打ち込みを使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｖｏｌ． １−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）、及びＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ−ＭｃＥｌｌｉｇｏｔｔ （１９９２）， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １０（９）： １０３６−４０に記載の手順などの手順によって、ほ乳動物細胞に移入することができる。安定な形質転換体の選択は、例えば細胞毒に対する耐性など、当分野で公知の方法を用いて、実施することができる。Ｋａｕｆｍａｎ等（（１９９０）， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：４８７−５１１）は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）耐性などの幾つかの選択スキームを記載している。ＤＨＦＲ選択に適切な宿主系統は、ＤＨＦＲが欠乏しているＣＨＯ系統ＤＸ−Ｂ１１であり得る。Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ （１９８０）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現するプラスミドを系統ＤＸ−Ｂ１１に導入することができ、プラスミドを含む細胞のみを適切な選択培地中で増殖させることができる。発現ベクターに導入することができる選択マーカーの別の例としては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢなどの抗生物質に対する耐性を与えるｃＤＮＡが挙げられる。ベクターを収容する細胞は、これらの化合物に対する耐性に基づいて選択することができる。
ほ乳動物発現ベクターからの異種遺伝子の発現を改善することが判明した別の制御配列としては、ＣＨＯ細胞由来の発現増強配列要素（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＥＡＳＥ）（Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐｐ． ５２９−５３４ （１９９７）、米国特許第６，３１２，９５１号Ｂ１、同６，０２７，９１５号及び同６，３０９，８４１号Ｂ１）、アデノウイルス２由来のトリパルタイト（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）及びＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Ｇｉｎｇｅｒａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８２）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１３４７５−１３４９１）などの要素が挙げられる。ウイルス起源の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列によって、２シストロン性ｍＲＮＡを効率的に翻訳することができる（Ｏｈ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ （１９９３）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：２９５−３００； Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：２６９７−２７００）。２シストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡと、それに続く選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲ）遺伝子の発現は、宿主の移入可能性（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）、及び異種ｃＤＮＡの発現を改善することが判明した（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５：４８７−５１１）。２シストロン性ｍＲＮＡを用いる例示的な発現ベクターは、Ｍｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２２：１５０−１６１（１９９７）によって記述されたｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰ、及びＭｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｐｐ．５２９−５３４（１９９７）によって記述されたｐ２Ａ５Ｉである。
有用な高発現ベクターｐＣＡＶＮＯＴは、Ｍｏｓｌｅｙ等（（１９８９）， Ｃｅｌｌ ５９：３３５−３４８）によって記述された。ほ乳動物宿主細胞用の別の発現ベクターを、Ｏｋａｙａｍａ及びＢｅｒｇ（（１９８３）， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０）によって開示されたように構築することができる。Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞中のほ乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現のための有用な系を、Ｃｏｓｍａｎ等（（１９８６）， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：９３５）によって記述されたように実質的に構築することができる。Ｃｏｓｍａｎ等（（１９８４）， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８）によって記述された有用な高発現ベクターＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託された。別の有用なほ乳動物発現ベクターは、ＥＰ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．−Ａ−０ ３６７ ５６６及び国際公開第０１／２７２９９号Ａ１に記載されている。このベクターは、レトロウイルスから誘導され得る。未変性シグナル配列の代わりに、以下の配列の１つなどの異種シグナル配列を付加することができる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載のＩＬ−７用シグナル配列、Ｃｏｓｍａｎ等（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８（１９８４））に記載のＩＬ−２受容体用シグナル配列、欧州特許第０ ３６７ ５６６号に記載のＩＬ−４シグナルペプチド、米国特許第４，９６８，６０７号に記載の類別された（ｔｙｐｅｄ）ＩＬ−１受容体シグナルペプチド、及び欧州特許第０ ４６０ ８４６号に記載のＩＩ型ＩＬ−Ｉ受容体シグナルペプチド。
ポリペプチドは、真核細胞中で組換え産生することができ、好ましくは、細胞培養で増殖するようになされた宿主細胞によって分泌される。本発明に使用される宿主細胞は、好ましくはほ乳動物細胞である。細胞は、目的遺伝子を発現するように遺伝子操作することもでき、細胞培養で増殖するようになされたほ乳動物産生細胞であり得、及び／又は同種細胞系であり得る。当業界で一般に使用されるかかる細胞の例は、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、（Ｃｏｓを含めた）ＣＶ１、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫細胞系（例えば、ＮＳ０、ＮＳ１）、ＰＣ１２、ＷＩ３８細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、これらは幾つかの複雑な組換えポリペプチド、例えば、サイトカイン、凝固因子及び抗体の産生に広く用いられる（Ｂｒａｓｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９６）， Ｂｌｏｏｄ ８８：２００４−２０１２； Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８）， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：６３５２−６３６２； ＭｃＫｉｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１）， Ｊ Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ６：２３１−２３９； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ． （１９９０）， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５：３０１１−３０１６）。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）が欠乏した変異体細胞系（参照により本明細書に組み入れる、Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ． （１９８０）， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０）ＤＸＢ１１及びＤＧ−４４は、望ましいＣＨＯ宿主細胞系である。というのは、これらの細胞において、効率的ＤＨＦＲ選択可能・増幅可能遺伝子発現系によって、高レベル組換えポリペプチド発現が可能だからである（参照により本明細書に組み入れる、Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ． （１９９０）， Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８５：５３７−５６６）。また、これらの細胞は、接着培養物又は懸濁培養物として操作が容易であり、比較的良好な遺伝的安定性を示す。ＣＨＯ細胞、及びその中で発現される組換えポリペプチドは、広範に特徴づけられ、規制行政機関によって臨床的な商業生産への使用が認可された。本発明の方法は、抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を用いて実施することもできる。ハイブリドーマ細胞系を作製する方法は、当分野で周知である。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｐａｕｌ， ｅｄ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ．３１５−３５６， ａｔ ３４７−３５０， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照されたい。上記系統由来の細胞系も、本発明の実施に適切である。
組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列で、適切なほ乳動物宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞を形質転換した後、組換えタンパク質を安定に発現する細胞を特定し、単離する。組換えタンパク質の安定な発現は、当分野で公知の方法に従って、適切なＤＮＡベクターをジヒドロ葉酸還元酵素欠乏（ＤＨＦＲ−）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ ＡＭ−１／Ｄ、米国特許第６，２１０，９２４号）に移入し、続いて単離し、組換えタンパク質の最大発現を示す個々のクローンを試験することによって、実施することができる。小規模スピナー及びより大規模なバイオリアクターでの増殖及び産生に基づいて、特定の細胞系を組換えタンパク質製造用細胞系として選択する。
最高レベルの組換えタンパク質を産生する細胞は、当分野で周知の方法によって、例えば、９６及び／又は２４ウェルプレート中で無血清条件下で本発明の細胞培地を用いた複数回の限界希釈によって、クローン化することができる。クローンは、種々の懸濁容器中で産生及び増殖特性に基づいて選択される。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を実施して、最高レベルの組換えタンパク質を産生するクローンを選択することができる。倍加時間及び密度を含めて、増殖特性は、１００ｍｌから３Ｌの種々の振とうフラスコ又はスピナーフラスコ及びバイオリアクター中でクローンを増殖させることによって測定することができる。最適クローン、例えば、培養において最高密度に達する最速倍加時間を有するクローンを選択し、組換えタンパク質産生用細胞系として選択する。一実施形態においては、組換えタンパク質産生は、商業目的であり、大規模バイオリアクターを用いて実施される。
典型的には、細胞培養は、無菌の制御された温度及び雰囲気条件下で、組織培養プレート（例えば、１０ｃｍプレート、９６ウェルプレートなど）中で実施され、又は別の（例えば、マイクロキャリアビーズ上の）接着培養、若しくはローラーボトル中などの懸濁培養で実施される。培養物は、振とうフラスコ、小規模バイオリアクター、及び／又は大規模バイオリアクター中で増殖させることができる。バイオリアクターは、細胞の培養に使用される装置であり、温度、雰囲気、撹拌及び／又はｐＨなどの環境条件を監視、調節及び制御することができる。本発明の流加培養法を含めた方法及び組成物は、大規模ほ乳動物細胞培養、例えば、１０Ｌ、１１Ｌ、１２Ｌ、１３Ｌ、１４Ｌなどに使用することができる。一実施形態においては、本発明の大規模細胞培養方法及び組成物は、ＣＨＯ細胞培養及び抗体産生に適切である。
本発明によれば、ほ乳動物の宿主細胞は、抗体又は組換えポリペプチドであり得る目的ポリペプチドの産生を促進する条件下で培養される。当業者は、特定の培養宿主細胞中で細胞増殖、細胞生存及び／又は組換えポリペプチド産生を最大にするように開発された本明細書に記載の細胞培地の１つ以上を使用するように選択することができる。或いは、本発明の方法及び組成物を市販細胞培地と併用することができる。
ほ乳動物細胞に適切な培養条件は、当分野で公知であり（例えば、Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｄ． Ｒｉｃｋｗｏｏｄ， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）参照）、本発明の改善された方法と組み合わせることができる。ほ乳動物細胞は、懸濁液中で、又は固体基板に付着した状態で、培養することができる。また、ほ乳動物細胞は、例えば、流動層バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル、振とうフラスコ又は撹拌槽バイオリアクター中で、マイクロキャリアと一緒に、又はマイクロキャリアなしで培養することができ、バッチ、流加培養、連続、半連続又は潅流様式で運転することができる。
本発明による方法を使用して、単一期と複数期の両方の培養プロセスにおける組換えポリペプチドの産生を改善することができる。単一期プロセスでは、細胞を培養環境に接種し、開示した方法を単一産生期中に使用する。複数段階プロセスでは、細胞を２つ以上の異なる時期に培養する。例えば、細胞をまず増殖期に、細胞増殖及び生存度を最大にする環境条件下で培養し、次いでポリペプチド産生を最大にする条件下の産生期に移すことができる。増殖及び産生期は、１つ以上の遷移期が先行又は介在し得る。複数期プロセスでは、本発明の方法を少なくとも産生期中に使用する。
限定するものではなく、理解のため、タンパク質産生のための細胞培養及び培養運転（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｒｕｎ）としては、３つの一般的タイプ、すなわち、連続培養、バッチ培養及び流加培養が挙げられることを実務家は認識されたい。連続培養では、例えば、新しい補充培地（すなわち、供給用培地）を培養期間中に細胞に与え、古い培地を毎日除去し、産物を、例えば毎日又は連続的に収集する。連続培養では、供給用培地を毎日添加することができ、連続的に、すなわち点滴又は注入として、添加することができる。連続培養の場合、細胞が生存し、環境及び培養条件が維持される限り、細胞を所望の期間培養し続けることができる。
バッチ培養では、細胞を最初に培地で培養し、培養運転中、又は培養運転を終了するまで、この培地を除去せず、置換せず、補充せず、すなわち、細胞に新しい培地を「供給」しない。培養運転の最後に、所望の産物を収集する。
流加培養の場合、運転中に培地に毎日１回以上（又は連続的に）栄養液を補充することによって、すなわち、培養期間中に細胞に供給用培地を「供給」することによって、培養運転時間が増加する。流加培養は、種々の下記供給計画及び回数、例えば、毎日、１日おき、２日おきなど、１日１回を超えて、又は１日１回未満などを含み得る。また、流加培養物に供給用培地を連続的に供給することができる。次いで、培養／産生運転の最後に、所望の産物を収集する。本発明は、好ましくは、タンパク質産生を増加させ、タンパク質産生期を延長することができる最適化された供給溶液を供給する、流加細胞培養を包含する。
改善された流加培養：加水分解物及び基本濃縮溶液
本発明の一態様は、改善された流加培養法を補充基本溶液及び加水分解物溶液と組み合わせて用いる、タンパク質産生を増加させる方法及び組成物を特徴とする。改善された流加培養法は、タンパク質産生期間中に細胞培地に添加される２種類の濃縮溶液、すなわち加水分解物濃縮溶液と基本濃縮溶液の添加に一部基づく。本発明の流加方法に用いられる加水分解物濃縮溶液は、植物由来でも動物由来でもない第１の加水分解物と第２の植物系加水分解物とを含む。植物由来でも動物由来でもない加水分解物、及び植物系加水分解物の例は、酵母系加水分解物である。加水分解物濃縮溶液に使用することができる植物系加水分解物の例は、ダイズ系加水分解物である。基本濃縮溶液は、基本培地、例えばＰＦ ＣＨＯ、アスパラギン及びグルコースを含み、加水分解物濃縮溶液は、少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む。加水分解物及び基本濃縮溶液を細胞培養物に期間中時折、例えば１１−１５日間毎日添加し、同じ日又は異なる日に添加することができる。
本発明は、抗ＴＮＦα抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を細胞培養物中で３２から３８℃の培養温度で培養することを含む、抗ＴＮＦα抗体、例えばアダリムマブ／Ｄ２Ｅ７を産生する流加培養法を特徴とする。一実施形態においては、培養温度は３５℃である。栄養欠乏に対処して、例えば、栄養欠乏を解消又は矯正して、生産性を最大にするために、ＣＨＯ細胞に加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を供給する。加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液は、細胞培養物に添加される。一実施形態においては、溶存酸素２０から６５％、例えば溶存酸素約３０％を含む細胞培養産生培地。一実施形態においては、細胞培養産生培地は、タンパク質産生に必要なグルコースレベル、例えば、少なくとも約１−５ｇ／Ｌグルコースを含む。一実施形態においては、細胞培養産生培地は、約１．５−２．５ｇ／Ｌグルコースを含む。更なる一実施形態においては、細胞培養産生培地は、約２．０ｇ／Ｌグルコースを含む。グルコース濃度は、所与の濃度、例えば少なくとも２．０ｇ／Ｌグルコースを維持するのに必要なグルコースを細胞培養産生培地に添加することによって、タンパク質産生培養プロセスを通して制御することができる。一実施形態においては、抗ＴＮＦα抗体の流加培養法に用いられる加水分解物濃縮溶液は、約５０−２８０ｇ／Ｌダイズ系加水分解物（その中の範囲及び数、例えば、１００−２２５、５０−２２５、２５５−２７５及び２６５ｇ／Ｌを含む。）、及び約７５−３００ｇ／Ｌ酵母系加水分解物（その中の範囲及び数、例えば、１００−２５０、１５０−２００、１４５−１７５及び１６５ｇ／Ｌを含む。）で構成される。
ＣＨＯ細胞中の抗ＴＮＦα抗体、例えばアダリムマブ／Ｄ２Ｅ７の産生のための流加培養法用に最適化された基本濃縮溶液のｐＨは、約９．０から１０．５（その中の範囲及び数、例えば、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５を含む。）である。加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を添加する期間は、９から１５日間、例えば１２日間である。一実施形態においては、基本濃縮溶液を期間の以下の日、すなわち４日目、６日目、９日目及び１１日目の少なくとも１日に細胞培地に添加し、加水分解物濃縮溶液を期間の４日目、７日目、又は４日目と７日目に細胞培地に添加する。上記値の中間の数も本発明の一部とする。
或いは、抗ＴＮＦα抗体、例えばアダリムマブ／Ｄ２Ｅ７の産生のための流加培養法は、約６．５−８、例えば約７．１から７．２のｐＨから出発し、約６．９の最終ｐＨであるｐＨ線形勾配に従って、細胞培地のｐＨを調節することを含み得る。一実施形態においては、ｐＨ線形勾配を少なくとも約２４時間、４８時間又は７２時間の期間にわたって調節する。
本発明は、抗ＩＬ１２抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を細胞培養物中で３２から３８℃、例えば３３℃の培養温度で培養することを含む、抗ＩＬ１２抗体、例えばＡＢＴ−８７４を産生する流加培養法も特徴とする。ＩＬ−１２抗体産生に用いられる加水分解物濃縮溶液は、グルコースも含み得る。一実施形態においては、ＣＨＯ細胞をｐＨ約６．９で培養する。栄養欠乏を維持して、生産性を最大にするために、ＣＨＯ細胞に加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を供給する。加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液は、細胞培養物に添加される。一実施形態においては、溶存酸素２０から６５％、例えば溶存酸素約４０％を含む細胞培養産生培地。一実施形態においては、抗ＩＬ１２抗体の流加培養法に用いられる加水分解物濃縮溶液は、約５０−２８０ｇ／Ｌダイズ系加水分解物（その中の範囲及び数、例えば、１００−２２５、５０−２２５、２５５−２７５及び２６５ｇ／Ｌを含む。）、約７５−３００ｇ／Ｌ酵母系加水分解物（その中の範囲及び数、例えば、１００−２５０、１５０−２００、１４５−１７５及び１６５ｇ／Ｌを含む。）、及び約２−３ｇ／Ｌグルコース、例えば２．４ｇ／Ｌグルコースを含む。ＣＨＯ細胞中の抗ＩＬ１２抗体、例えばＡＢＴ−８７４の発現のための流加培養法用に最適化された基本濃縮溶液は、ｐＨが約９．７であり、重量オスモル濃度が約１４８０ｍＯｓｍである。加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を添加する期間は、１４から１５日間、例えば１２日間である。一実施形態においては、基本濃縮溶液を期間の５日目から１日おきに細胞培養産生培地に添加し、加水分解物濃縮溶液を期間の６日目から毎日、細胞培養産生培地に添加する。或いは、基本濃縮溶液及び加水分解物濃縮溶液を期間の５日目から毎日、細胞培養産生培地に添加することができる。上記範囲値の中間の数も本発明の一部とする。
安定高濃度供給溶液
本発明の一態様は、タンパク質生産性を改善するための改善された安定高濃度供給溶液に関する方法及び組成物を特徴にする。改善された供給溶液を使用して、抗体産生時に細胞培養産生培地に補充することができる。供給溶液は、グルコース（例えば、１００から２５０ｇ／ｋｇ）、基本培地、グルタミン以外のアミノ酸、例えばアスパラギン（例えば、１．０から１５．０ｇ／ｋｇ、３−１２．５ｇ／ｋｇ、又は３−５ｇ／ｋｇ）、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む。また、供給溶液のｐＨは約６．０から７．５である。２種類の非動物系加水分解物は、植物系加水分解物、例えばダイズ系加水分解物と、動物系でも植物系でもない加水分解物、例えば酵母系加水分解物とを含み得る。ＰＦ ＣＨＯ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含めて、ただしこれらだけに限定されない当分野で公知の任意の基本培地を、改善された供給溶液に使用することができる。改変基本培地を使用することもできる。一実施形態においては、基本細胞培地は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤、グルタミン及びグルコースを含まない。改善された供給溶液は、安定であり、約１５ＮＴＵ未満の濁度を有する。本発明は、供給溶液を添加することによって、細胞培養産生培地の定常グルコースレベルを維持することも含む。上記範囲値の中間の数、例えば、３．０、３．１、３．２、３．３、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８及び５ｇ／ｋｇアスパラギンも本発明の一部とする。
グルコース及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む供給溶液を製造する方法も本発明に包含される。供給溶液を製造する方法は、グルコースと基本細胞培地を混合して組合せ溶液にし、組合せ溶液のｐＨを約９．５から１０．５に調節することを含む。次いで、少なくとも２種類の非動物系加水分解物を溶液に添加し、生成する供給溶液のｐＨが約６．５から７．５になるようにｐＨを再度調節する。上記範囲値の中間の数、例えば、ｐＨ６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５も本発明の一部とする。
本発明の供給溶液を使用して、ほ乳動物細胞培養物から高レベルの組換えタンパク質産生、例えば抗体産生を実施することができる。一実施形態においては、本発明は、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を細胞培養産生培地中で培養することを含む、ほ乳動物細胞培養物から少なくとも１．５ｇ／Ｌ抗体を製造する方法を特徴とする。次いで、ｐＨ約６．７から７．０の供給溶液を細胞培養産生培地に添加する。供給溶液は、グルコース（例えば、約１００から２５０ｇ／ｋｇ）、基本細胞培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む。一実施形態においては、かかるプロセスによって、少なくとも２ｇ／Ｌの抗体を産生し、少なくとも４ｇ／Ｌの抗体を産生し、少なくとも約５ｇ／Ｌの抗体を産生し、少なくとも６ｇ／Ｌの抗体を産生する。上記範囲値の中間の数、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５ｇ／Ｌ抗体も本発明の一部とする。
ｐＨ約６．７から７．２の供給溶液を使用し、以下の成分、すなわちグルコース、基本細胞培地、約グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含めることによって、ほ乳動物細胞培養物から産生される抗体の力価を増加させることができる。一実施形態においては、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞用の細胞培養産生培地に供給溶液を添加すると、供給溶液を添加せずに培養した対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも５０％増加する。一実施形態においては、供給溶液を添加すると、対照よりも少なくとも１００％力価が増加する。一実施形態においては、供給溶液を添加すると、対照よりも少なくとも１５０％力価が増加する。補充供給溶液は、細胞密度が少なくとも２．０×１０６細胞／ｍＬに達したとき、又は細胞密度が少なくとも３．５×１０６細胞／ｍｌに達したときなど、ある細胞密度で細胞培養物に添加することができる。上記範囲値の中間の数も本発明の一部とする。上記値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として用いた値の範囲も本発明の範囲に包含されるものとする。
本発明の流加培養法は、タンパク質、例えば抗体の製造に対する細胞培養の栄養上のある要件に対処、例えば、解決又は矯正するのに役立つので、ある種の構成要素を監視することは有利であり得る。監視し得る構成要素としては、任意の代謝指標、すなわち、細胞代謝の指標が挙げられる。一実施形態においては、本発明の流加方法は、グルコースレベルが０．２５−２０ｇ／Ｌで維持されるようにグルコースレベルを監視することを含めて、細胞培地中のグルコースレベルを監視することを含む。一実施形態においては、グルコースレベルを０．５から５．５ｇ／Ｌ又は４．０−５．５ｇ／Ｌに維持する。グルコースレベルを監視することによって、細胞代謝を間接的に監視することができる。下記実施例３に記載のように、グルコースを代謝指標として使用することができる。一実施形態においては、グルコースレベルに基づいて、細胞培養物に栄養成分、例えば加水分解物を補充することができる。グルコースレベルを監視する方法は、当分野で公知であり、自動試料採取装置を用いた監視などが挙げられる。使用することができる代謝指標の別の例はグルタミンである。上記範囲の中間の数、及び本明細書に列挙する他のすべての数も本発明の一部とする。上記値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として用いた値の範囲も本発明の範囲に包含されるものとする。
フィードバック制御系を使用して、細胞培養産生培地中の代謝指標レベルを監視することができる。一実施形態においては、所望のパラメータ設定値、例えば所定のグルコースレベルに適合させるために、フィードバック制御系によって決定されたとおりに、組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加する。
フィードバック制御系を使用して、所与のほ乳動物細胞培養物、及び目的タンパク質の産生に対する供給プロファイルを決定することもできる。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物中でタンパク質を産生するための供給プロファイルを決定する方法は、タンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び代謝指標を監視するフィードバック制御系を用いて、供給溶液、例えば組合せ供給溶液を細胞培地に添加することを含む。供給溶液を細胞培養産生培地に添加して、目標代謝指標設定値、例えば、グルコースレベルに適合させる。細胞培養の終結後、細胞培養産生培地に添加する供給溶液の１日当たりの量を決定し、供給溶液を細胞培養物に添加すべきときの供給プロファイルを用意する。供給プロファイルを確定後、目的タンパク質を産生する所与のほ乳動物細胞培養物に対する代謝指標の監視はもはや不要である。供給プロファイルは、頻繁な試料採取がもはや不要であるので、汚染のリスク低減を含めて、多数の利点を与える。
Ｎ−アセチルシステイン及び酪酸ナトリウム方法及び組成物
上述したように、本発明の細胞培養プロセスは、有利には抗体価を増加させる。ほ乳動物細胞培養におけるタンパク質生産性を達成するための本発明の別の一態様は、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを細胞培地に添加することによるものである。一実施形態においては、本発明は、酪酸ナトリウム（例えば、０．１ｍＭから１０ｍＭ）、Ｎ−アセチルシステイン（例えば、１ｍＭから８０ｍＭ）、又はこれらの組合せを細胞培地に添加することによって抗体を製造する方法を特徴とする。一実施形態においては、抗体価は、少なくとも約１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３００ｍｇ／Ｌ、少なくとも約３５０ｍｇ／Ｌ、又は少なくとも約４００ｍｇ／Ｌである。
本発明は、酪酸ナトリウム（例えば、最終濃度０．１ｍＭから１０ｍＭ）、Ｎ−アセチルシステイン（例えば、最終濃度１ｍＭから８０ｍＭ）、又はこれらの組合せを細胞培地（対照。したがって、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン、又はこれらの組合せを含まない。）に添加することによって、抗体の力価が対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも１０％改善されるように、ほ乳動物細胞培養物中で抗体を製造する方法も特徴とする。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の抗体価は、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも２９％、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも４０％、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも７０％、又は対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも９０％改善される。酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せは、ほ乳動物細胞培養物の増殖期中にほ乳動物細胞培養物に添加することができる。一実施形態においては、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを、培養時間の４日目から７日目にほ乳動物細胞培養物に添加する。一実施形態においては、Ｎ−アセチルシステインを単独で、又は酪酸ナトリウムと組み合わせて、最終濃度５ｍＭから８０ｍＭ、例えば、２０−６０ｍＭ、又は約１０ｍＭの量で添加する。
本発明は、約０．１ｍＭから１０ｍＭ Ｎ−アセチルシステインを細胞培地に添加することによって（対照は、この添加がない。）、ほ乳動物細胞培養物の寿命を対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも約４５％延長する方法も特徴とする。一実施形態においては、ほ乳動物細胞培養物の寿命を対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも約３５％、又は対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも約５５％延長する。
本明細書に記載の細胞培地と改善された培養方法は、別々に、又は互いに組み合わせて、使用することができることに留意されたい。
本発明の方法及び組成物を用いて培養後、生成した発現タンパク質を回収又は収集することができる。また、タンパク質は、かかる培養物又は成分から（例えば、培地、細胞抽出物又は体液から）、公知のプロセスによって精製又はある程度精製することができる。分画手順としては、ろ過、遠心分離、沈殿、相分離、親和性精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、（フェニルエーテル、ブチルエーテル、プロピルエーテルなどの樹脂を用いた）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ＨＰＬＣ、又はこれらのある組合せのうちの１つ以上の段階が挙げられるが、これらだけに限定されない。
例えば、ポリペプチドの精製としては、ポリペプチドに結合する薬剤を含むアフィニティーカラム、コンカナバリンＡ−アガロース、ＨＥＰＡＲＩＮ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（クロマトグラフィー培地）、Ｃｉｂａｃｒｏｍ ｂｌｕｅ ３ＧＡ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（アガロースビーズ）などの親和性樹脂上の１つ以上のカラム段階、溶出を含む１つ以上の段階、及び／又はイムノアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。ポリペプチドは、精製を容易にする形態で発現され得る。例えば、ポリペプチドは、マルトース結合ポリペプチド（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）の融合ポリペプチドなどの融合ポリペプチドとして発現され得る。かかる融合ポリペプチドの発現及び精製用キットが、それぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓｓ．）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）及びＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。ポリペプチドは、エピトープタグを付け、続いてかかるエピトープに対する特異抗体を用いて精製することができる。かかる１つのエピトープＦＬＡＧ（エピトープタグ）は、Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、Ｃｏｎｎ．）から市販されている。組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体などのポリペプチド結合性ポリペプチドを含むアフィニティーカラムを利用して、発現されたポリペプチドを親和性精製することもできる。別のタイプの親和性精製段階は、親和性薬剤が、Ｆｃドメインを含むタンパク質に結合する、プロテインＡ又はプロテインＧカラムであり得る。ポリペプチドは、例えば高塩濃度溶出緩衝剤中で、従来の技術を用いてアフィニティーカラムから除去することができ、次いで低塩濃度緩衝剤で透析することができ、又は利用する親和性マトリックスに応じてｐＨ若しくは別の成分を変えて除去することができ、又は親和性部分の天然基質を用いて競合的に除去することができる。一実施形態においては、本発明の方法及び組成物を用いて製造される抗体は、参照により本明細書に組み入れる米国特許出願第１１／７３２９１８号に記載の方法に従って精製される。
所望の最終純度は、ポリペプチドの意図する用途に応じて決まる。本発明の方法及び組成物は、目的タンパク質の治療上の使用に適切である。したがって、ポリペプチドを生体内投与しようとするときには、比較的高い純度が望ましい。こうした場合には、ポリペプチドは、他のポリペプチドに対応するポリペプチドバンドがＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析によって検出されないように精製される。ポリペプチドに対応する複数のバンドは、グリコシル化の違い、翻訳後プロセシングの違いなどのために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化できることを当業者は認識されたい。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による単一のポリペプチドバンドによって示されるように、実質的に均一になるまで精製される。ポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色、又は（ポリペプチドが放射性標識の場合）オートラジオグラフィーによって可視化することができる。
本発明は、タンパク質を更に処方することを包含してもよい。「処方する」という用語は、タンパク質を緩衝剤置換、滅菌、バルク包装、及び／又は最終使用者用に包装し得ることを意味する。かかる組成物は、生理的に許容される希釈剤、担体、賦形剤などの別の成分と組み合わせて、タンパク質の有効量を含むことができる。「生理的に許容される」という用語は、活性構成要素の生物活性の有効性を妨害しない無毒の材料を意味する。
本明細書に列挙する数に関して、上記範囲の中間の数、及び本明細書に列挙する他のすべての数も本発明の一部であることに留意されたい。上記値のいずれかの組合せを上限及び／又は下限として用いた値の範囲も本発明の範囲に包含されるものとする。
実施例
以下の実施例では、ほ乳動物細胞中で生物学的製剤を発現するための改善された方法及び組成物を含めて、ほ乳動物細胞を培養するための改善された方法及び組成物を例示する。種々の組換え生物学的製剤の発現に用いられるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養するための改善された、生化学的に規定された培地を以下に開示する。また、同じ成分を含むが、残りの成分が異なり、細胞増殖の増大及び産物発現の増加を可能にするように濃縮された、種々の構成及び規模のバイオリアクター運転における細胞の大規模培養用培地も例示する。
（実施例１）
ほ乳動物細胞を培養するための改善された培地
典型的には、ほ乳動物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培地は、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２、これらの培地タイプの組合せなどの市販培地処方に基づく。ほ乳動物細胞におけるタンパク質産生の場合、細胞増殖と生物学的製剤産物発現の両方の増加を支援するために細胞培地を十分に濃縮しなければならない。以下の実施例では、抗体を含めて、種々の組換え生物学的製剤を発現するほ乳動物細胞、すなわち、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養するための改善された、生化学的に規定された培地を記述する。
ジヒドロ葉酸還元酵素の欠乏した［ｄｈｆｒ（−）］チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、動物源に由来する血清又は任意の他の材料の非存在下で懸濁増殖するように手直しした。商業供給源から得られた規定の細胞培地ＪＲＨ ＰＦ−ＣＨＯ（カタログ＃６７１４７）中でヒポキサンチン及びチミジンの非存在下で細胞を増殖させた。細胞系はグルタミンシンターゼが欠乏していないが、追加のグルタミンを培地に添加した。
所与の標的に対する抗体などの生物学的製剤を発現するＣＨＯ細胞系を、当分野で周知の分子生物学的技術を用いて作製した。手短に述べると、目的抗体を発現する能力及びｄｈｆｒ酵素遺伝子を発現する能力のある発現ベクターを、当分野で周知の方法によってＣＨＯ細胞に導入した。ヒポキサンチン及びチミジンの存在下で細胞を選択することによって、移入された目的細胞を得た。選択された形質転換体を高濃度メトトレキサート中で更に培養して、移入された遺伝子を増幅し、発現されるタンパク質の収率を増加させた。ＣＨＯ細胞の培養に用いられる改善された細胞培地を以下に記述する。
（実施例１．１）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養用培地
一般に、ＣＨＯ細胞を培養するための培地処方は、Ａ、Ｂ及びＣ部と命名された３つの部分で構成された。Ａ部は、基本培地であり、水、アミノ酸、ビタミン、無機金属塩、微量元素、エタノールアミン、プトレシン、界面活性剤、ピルビン酸ナトリウム、グルタチオン、及び２−メルカプトエタノールを含んだ。Ｂ部は、無機鉄源を含み、Ｃ部は、組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、種々の非鉄（ＩＩ）金属イオン、界面活性剤及び加水分解物を含んだ。培地成分は、大部分は無機であり、又は組換え原料に由来し、高度に精製された。培地は、動物源由来のタンパク質、脂質及び炭水化物を含まなかった。複合加水分解物は、高度に加工された酵母と植物源から得られた。
培地のＡ部は、無タンパク質ＣＨＯ（ＰＦ ＣＨＯ）培地（ＪＲＨ − ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＪＲＨ Ｃａｔ ＃ ６７１４７ − 原Ａ部（Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｐａｒｔ Ａ）とも称する。）を含んだ。したがって、Ａ部は、水、アミノ酸及びビタミンを含めて、基本培地を含んだ。基本培地（ＰＦ ＣＨＯ）は、細胞増殖及び発現タンパク質生産性の更なる増加を支持する改変及び再処方のために選択された。ＰＦ ＣＨＯを改変して、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含めて、ある種の成分を除去した（改変ＰＦ ＣＨＯを本明細書では（ＪＲＨカタログ＃６７４１１とも称される）改変Ａ部と称する。）。これらの改変は、大規模バイオリアクターにおける細胞培養プロセス条件の改善を容易にするためにもなされた。
Ｂ部成分（ＪＲＨ）は、別個に添加された高濃度クエン酸鉄（ＩＩＩ）溶液からなった。Ｂ部成分の濃度を全ＣＨＯ細胞培養プロジェクトにおいて一定に維持した。
Ｃ部成分は、増殖因子、例えば、インスリン、アミノ酸グルタミン、ＴＣ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ及びダイズ加水分解物フィトン、選択圧の維持に必要なメトトレキサート、並びに調製中に培地が水和した後のｐＨを調節するための塩基ＮａＯＨと酸ＨＣｌを含んだ。
改善された細胞培地処方を以下のように作製した。まず、ＣＨＯ細胞を、ＪＲＨから得られたＰＦ−ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣ−ＪＲＨカタログＮｏ．６７１４７）中で最初に増殖させた。以下に示すように、ＰＦ−ＣＨＯ培地（カタログ＃６７１４７）を、ＣＨＯ細胞系を用いた用途用に更に改変した。この改変培地は、ＪＲＨによって新しいカタログ＃６７４１１が付けられた。この改変の目的は、重量オスモル濃度及びｐＨが影響を受けないように、細胞培地のＡ部の濃度を増加させることであった。原Ａ部（Ｃａｔ ＃ ６７１４７）は、炭酸水素ナトリウム、グルタミン及び無タンパク質を含まないことも製造者（ＪＲＨ）によって公表された（インスリン若しくは別のタンパク質又はペプチド増殖因子が添加されない。）。次いで、これらの除去成分は、効果的であると判明したときには、特にＣＨＯ細胞系用に、６７１４７と６７４１１の両方のＡ部処方に独立に添加された。これらは、Ｃ部として以下により詳細に記述する成分の一部になった。
Figure 2013230151
ＣＨＯ細胞培養用細胞培地のＡ部
上述したように、改善された細胞培地のＡ部は、改変型の基本培地、すなわち、ＰＦ−ＣＨＯ培地を含んだ。緩衝剤の炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、リン酸ナトリウム及びリン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤の塩化ナトリウム、界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、並びに単糖グルコースをＡ部から除去することによって、ＪＲＨから得られたＰＦ−ＣＨＯ培地（カタログＮｏ．６７１４７）を改変した。これらの成分を、具体的細胞培養プロジェクトの要求に応じて、種々の濃度でＡ部に戻した。これによって、緩衝剤濃度を定常に維持し、界面活性剤濃度を細胞に有毒なレベルよりも下に維持し、重量オスモル濃度及び炭素基質レベルを、細胞の増殖が増加し、抗体産生が増加するように操作することができた。これらの成分を原ＪＲＨ Ａ部処方から分離すると、改変細胞培地（改変ＰＦ ＣＨＯ − 表１で＃６７４１１と称する。）において見られるように、ＪＲＨ Ａ部中の残りの成分の濃度の増加が促進され、したがって細胞増殖が増加し、抗体価で測定して抗体発現が増加した。アミノ酸、ビタミン、微量元素及び別の種々の成分画分を含めて、改変Ａ部粉末（６７４１１）処方の個々の成分は、培地の体積を変化させる必要なしに、原処方の濃度の４倍まで増加した。６７１４７を用いた原Ａ部処方と６７４１１を用いた改変処方の比較を上記表１に示す。
定義上、原ＪＲＨ ＰＦ ＣＨＯ基本培地（カタログ＃６７１４７）は、グルタミン及び炭酸水素ナトリウムを含まないＰＦ ＣＨＯ基本培地であった。パート１中の初期グルコース濃度は１．５ｍｇ／Ｌであった。
ＣＨＯ細胞培養用細胞培地のＢ部
細胞培地のＢ部成分は、ＪＲＨから得られたＰＦ−ＣＨＯ培地（カタログＮｏ．６７１４７）中のＢ部成分と同じ高濃度クエン酸鉄（ＩＩＩ）溶液を含み、別個に添加された。
鉄（ＩＩＩ）塩、鉄（ＩＩ）塩、特にクエン酸鉄（ＩＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ）などの無機鉄源を基本培地、すなわち、Ａ部又は改変Ａ部に添加した。少量の硫酸鉄（ＩＩ）（０．２−０．８ｍｇ／Ｌ）及び硝酸鉄（ＩＩＩ）非水和物（０．０２５−０．１１ｍｇ／Ｌ）を添加したが、クエン酸鉄（ＩＩＩ）などのキレート塩が好ましかった。クエン酸鉄（ＩＩＩ）を補充液としてより高濃度で添加し、ＰＦ−ＣＨＯ Ｂ部として細胞培地に含めた。他の培地成分の濃度は、変化し、より大きな濃度範囲を有し得たが、クエン酸鉄（ＩＩＩ）は、１２２ｍｇ／Ｌの単一濃度に維持された。これは、基本培地中で細胞損傷及び望ましくない化合物の形成を引き起こすスーパーオキシド及びフリーラジカルが形成されるためである。
ＣＨＯ細胞培養用細胞培地のＣ部
細胞培地のＣ部は、組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源及び加水分解物で主に構成された。開発の過程でアミノ酸、ビタミン及び補助因子、無機塩及び緩衝剤、微量元素又は鉱物の通常の分類には含まれない、細胞培地に添加される追加の化合物を上記表１に「Ｃ部」として記載する。下記表１中のＣ部に関して、Ｃ部中に確認される構成要素は、別々に、又は組み合わせて、添加し得ることに留意されたい。
組換え増殖因子
ペプチドホルモンのインスリン又は組換え類似体を４−１３ｍｇ／Ｌの範囲の濃度で細胞培地に添加した。ＩＧＦ−１は、細胞培地に添加されたインスリンに５０−１００ｎｇ／Ｌの濃度で置換又は補充することもできる。
モル浸透圧濃度制御因子
種々の細胞培地におけるモル浸透圧濃度は、２６０ｍＯｓｍから４６０ｍＯｓｍの範囲であった。モル浸透圧濃度は、塩、特にＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＫＮＯ３によって調節されたが、アミノ酸及び加水分解物のすべてがモル浸透圧濃度の変化の大きな一因である。
エネルギー源
培地中の最も豊富な単糖は、グルコース（Ｄ−グルコース）であり、必要に応じて補充された。細胞培地の出発濃度は、３．５から７．０ｇ／Ｌの範囲であった。別の糖は、代謝産物又はせん断保護剤（ｓｈｅａｒ ｐｒｏｔｅｃｔｏｒａｎｔ）として補充することもでき、マルトース、マンノース、ガラクトース、フルクトースなどが挙げられる。
加水分解物
加水分解物は、ジ及びトリペプチドと一緒に、別の遊離アミノ酸源と考えられる。
ｐＨ維持（緩衝剤）
種々の緩衝剤を使用して、細胞培地中のｐＨを６．５から７．５の範囲に維持した。培地に用いられる無機緩衝剤（又は緩衝系）としては、炭酸塩（ＮａＨＣＯ３）、塩化物（ＣａＣｌ２）、硫酸塩（ＭｇＳＯ４）、リン酸塩（ＮａＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４）などが挙げられた。有機緩衝剤としては、ピルビン酸ナトリウム（Ｃ３Ｈ３Ｏ３Ｎａ）、ＨＥＰＥＳとしても知られるＮ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］なども挙げられる。
グルタミン
グルタミンもＣ部に含まれ、原Ａ部と改変Ａ部の両方からは除去された。グルタミンは、Ｃ部に含まれ、例えば、原Ａ部を含む細胞培地中に０．２から０．４（０．２９）ｇ／Ｌ含まれ、改変Ａ部を含む細胞培地中に０．３から０．７、例えば０．５８含まれた（上記表１参照）。
ＣＨＯ細胞培養用細胞培地の他の成分
以下は、細胞培地に添加することができる追加の成分である。添加することができる追加の成分は、下記例に限定されないことに留意されたい。
追加のペプチド
プトレシンＨＣｌ塩は、ＣＨＯ細胞系に特異的である小胞体構造及び増殖を維持するのを助け、基本培地に０．４から１．６５ｍｇ／Ｌ添加された。
グルタチオン（トリペプチド）は０．５から２．０ｍｇ／Ｌの範囲の量で添加された。２−メルカプトエタノールも３．６ｍｇ／Ｌまで添加され、スルフヒドリルを維持する還元剤として作用し、銅のような種々の金属に結合し、輸送する。２−メルカプトエタノールは、デヒドロアスコルビン酸塩及びシスチンを還元し、アスコルビン酸塩及びシステインを再生する。
メトトレキサート：
メトトレキサート濃度は、得られる最終増幅レベルに応じて、産物系間で異なった。２ｍＭ濃度の原液を用いて、添加体積及び最終濃度は以下のとおりである。すなわち、０．２５０ｍＬ／ｋｇは、抗ＩＬ−１２と抗ＥＰＯ−Ｒの両方で最終５００ｎＭであり、０．５ｍＬ／ｋｇは抗ＩＬ−１８では最終１００ｎＭであり、最後に２．５ｍＬ／ｋｇは抗ＴＮＦアルファでは最終５０００ｎＭである。
細胞保護剤／界面活性剤
この実施例に記載の培地を用いて、より大きいせん断力を生じる撹拌とスパージングの両方の下で、すべての規模の反応器、フラスコ及びスピナーフラスコ中で、ＣＨＯ細胞を懸濁増殖させた。細胞の損傷を最小化するために、Ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオールのような細胞保護剤、特に培地の約１ｇ／Ｌの濃度のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を添加した。１ｇ／Ｌ以下のメチルセルロースを含めた別のせん断軽減剤（ｍｉｔｉｇａｔｏｒ）、並びにグラム当量／リットルまでの様々な濃度のある種の加水分解物及び植物抽出物も使用した。
アミノ酸
細胞培地は、本明細書に記載の量範囲のアミノ酸を含んだ。２種類のアミノ酸、アスパラギン及びグルタミンを、それ以外のアミノ酸よりも高い出発濃度で添加すると、これらは、ＣＨＯ細胞培養の過程で急速に制限栄養素（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｎｕｔｒｉｅｎｔ）になる。特にアスパラギンは、基本培地中約０．４から０．５ｇ／ｋｇである。
アスパラギンは、（原ＰＦ ＣＨＯと改変ＰＦ ＣＨＯの両方を含めて）Ａ部の成分であったが、アスパラギン濃度は、細胞培地にアスパラギンを補充することによって増加した。
細胞培地は、極めて低い初期密度から１．０×１０７細胞／ｍＬを超える密度まで、成分濃度に応じて数日間、所望の培地の目的及び細胞効果でＣＨＯ増殖を支援することができた。ＣＨＯプロセスは、下記セクションに記載のように増殖期及び産生期を更に含み、異なる成分範囲を必要とした。しかし、細胞培地処方の比率及びアイデンティティは、同じままであった。
ＣＨＯ細胞培地の最終調製
改善された細胞培地の調製は、種々の成分を特定の順序で添加し、塩基又は酸を用いて特定の時間にｐＨを調節する必要があった。Ａ部基礎濃度（ｂａｓａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の増加につれて、ＮａＯＨの形の塩基を添加して、処方中のアミノ酸の溶解を最大ｐＨ１０まで助けた。加水分解物の添加につれて、ＨＣｌの形の酸を用いてｐＨを最小７．０に低下させた。特定のｐＨに応じた更なる調節は、必要に応じてＮａＯＨ又はＨＣｌ溶液を用いて実施された。
以下の実施例では、上記の種々の特異抗体の発現に基づいて、細胞培地を記述する。
（実施例１．２）
抗ＴＮＦアルファ抗体を発現するＣＨＯ細胞を培養するための細胞培地
ＴＮＦαに対する完全ヒト抗体（すなわち、アダリムマブ；Ｄ２Ｅ７）を発現するＣＨＯ細胞系を表２に記載の細胞培地中で培養した。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
（実施例１．３）
ＩＬ−１２抗体を発現するＣＨＯ細胞を培養するための培地組成物
完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体を発現するＣＨＯ細胞系を、表３に記載の増殖培地中で培養した。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
上で参照した、無塩であり、ビタミンの少ない改変基本培地に関して、ビタミン量は、ＲＭ−００３として上記した非改変基本培地、又はＲＭ−２３０として上記した改変無塩基本培地の１／３に低下する。したがって、上述したように、低ビタミン基本培地は、ＲＭ−００３及びＲＭ−２３０の１／３のビタミン量である。上記表に示した量で使用すると、培地中のビタミンの最終濃度は、ＲＭ−００３又はＲＭ−２３０を使用したのとは対照的に１／３に低下する。しかし、必要に応じて、ＲＭ−２３０を用いた産生及び供給培地も使用できることに留意されたい。
（実施例１．４）
ＩＬ−１８及びＥＰＯ／Ｒ抗体を発現するＣＨＯ細胞を培養するための培地組成物
表４は、抗ＩＬ１８及び抗ＥＰＯ／Ｒ抗体の発現に用いられる増殖及び産生培地の要約である。これらの抗体を発現するための培地に関する更なる詳細を表５（抗ＩＬ−１８）及び表６（抗ＥＰＯ／Ｒ）に示す。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
ＩＬ−１８を発現するＣＨＯ細胞系を増殖培地２ｘＰ（ＳＲ−３７１）中で培養し、その後、約１ｇ／Ｌの最終力価のための産生培地３ｘＰ（ＳＲ−３７２）中で抗体を産生した。高力価プロセスは、約２ｇ／Ｌの最終力価に到達するための産生培地として４ｘＰ（ＳＲ−３８２）を使用した。抗ＥＰＯ／Ｒ産生用の産生培地は、ＳＲ−２８６と同一であったが、１ｘＰ培地（ＳＲ−２７４）を細胞増殖用に用いた。すべての培地を表４及び５に示す。
（実施例１．５）
ほ乳動物細胞中で抗体を産生するための細胞培養プロセス
上で開示した培地を、ほ乳動物細胞、すなわちＣＨＯ細胞を培養するための２つのプロジェクトに用いられる２つの産生プラットホームにも展開した。第１のプラットホームを、上表２−４に記載の改変産生培地において記載されたものと類似の培地組成物を用いて開発した。唯一の相違は、細胞培養に用いられる温度であった。このプラットホームを抗ＩＬ１８抗体の産生、及び抗エリスロポイエチン受容体（抗ＥＰＯ／Ｒ）の産生に用いた。栄養成分を更に強化する第２の培地プラットホームを、高力価抗ＩＬ１８産生に用いて、より高体積の抗体生産性を得た。
抗ＩＬ−１２、抗ＩＬ−１８及び抗ＥＰＯ／Ｒ抗体を含めて、全抗体が、上記移入ｄｈｆｒ（−）ＣＨＯ細胞系によって発現される完全ヒトＩｇＧ１抗体であった。これらの細胞系を、ウシ由来の血清や他の動物源材料の助けを借りずに、懸濁培養した。
抗ＩＬ１８抗体を産生するために、抗ＩＬ１８を発現するＣＨＯ細胞系を、本明細書ではＳＲ−３７１と称する増殖培地中で培養した。培地ＳＲ−３７１を用いて、より高い細胞生産性と適度の細胞増殖を支援した。細胞密度が移行基準に達した後、細胞を産生培地（ＳＲ−３７２）に移送して、産生段階を開始した。
表５：抗ＩＬ１８プロセスＡにおける培地組成
増殖培地ＳＲ−３７１をシートレイン（ｓｅｅ ｔｒａｉｎ）及びシード反応器中で使用した。産生培地ＳＲ−３７２を３０００リットル製造バイオリアクター中で使用した。
Figure 2013230151
培養を通して温度を３５℃に維持した。細胞培養グルコースレベルが２ｇ／Ｌ未満のときには、追加の４ｇ／Ｌグルコースを添加した。
類似プロセスを抗ＥＰＯ／Ｒ抗体産生にも使用した。しかし、より低栄養の培地（ＳＲ−２７４）をシードトレインにおける細胞増殖に使用した。Ｈｕｍｉｒａ製造に用いたのと同じ培地である培地ＳＲ−２８６を、抗ＥＰＯ／Ｒ抗体の産生段階に使用した（表６）。増殖培地ＳＲ−２７４をシードトレイン及びシード反応器に使用した。産生培地ＳＲ−２８６を３０００リットル製造バイオリアクター中で使用した。
Figure 2013230151
増殖培地ＳＲ−２７４を、スピナーフラスコ、Ｗａｖｅバッグ、１００ＬシードバイオリアクターＺ−４６０５、及び３０００Ｌ製造バイオリアクターＺ−３６００中の５７５Ｌ培養の初期段階に使用した。産生培地ＳＲ−２８６を３０００Ｌ製造バイオリアクターＺ−３６００中でのみ使用した。
産生培地ＳＲ−２８６及びＳＲ−３７２は、表５及び６に記載のものと類似の培地成分からなるが、ＭＴＸレベルが異なった（ＳＲ−２８６では０ｎＭ、及びＳＲ−３７２では１００ｎＭ）。
より高い生産性を得るために、改善されたプロセスを抗ＩＬ１８産生用に開発した。この新しいプロセスであるプロセスＢは、細胞培養物の寿命を延長し、抗体の体積測定の生産性を増大させるために、新しい培地を導入した。産生培地（ＳＲ−３８２）は、産生段階に使用される栄養素の量に関して、以前の産生培地とは異なった。ＳＲ−３８２の完全な組成を表７に示す。新しい抗ＩＬ１８産生プロセスにおいては、シードトレイン中では依然として培地ＳＲ−３７１中で細胞を培養したが、産生段階の１工程前のシードバイオリアクター中では培地ＳＲ−３７２を使用した。次いで、産生段階において、細胞を培地ＳＲ−３８２中で培養し、温度を３５℃から３３℃に変更して、細胞培養物の寿命を延長し、したがって細胞への培地ＳＲ−３８２の効果を延長した。
増殖培地ＳＲ−３７１をスピナーフラスコ、Ｗａｖｅバッグ及び１００リットルシードバイオリアクターに使用した。充填が不十分な（Ｓｈｏｒｔ−ｆｉｌｌ）培地ＳＲ−３７２を３０００リットル製造バイオリアクター中の５７５リットル培養の初期段階に使用した。産生培地ＳＲ−３８２を３０００リットル製造バイオリアクター中のみに使用した。
Figure 2013230151
栄養素をこの培地中で濃縮して、ＣＨＯ細胞増殖及び抗体産生のエネルギー源及び構成成分を更に提供した。プロセスＢでは、シードトレイン中では依然として培地ＳＲ−３７１中で細胞を培養したが、産生段階の１工程前のシードバイオリアクター中では培地ＳＲ−３７２を使用した。次いで、産生段階において、細胞を培地ＳＲ−３８２中で培養し、温度を３５℃から３２℃に変更して、細胞培養物の寿命を延長し、したがって細胞への培地ＳＲ−３８２の効果を延長した。
プロセスＡ：培地ＳＲ−３７２及び培地ＳＲ−２８６中の抗ＩＬ１８細胞及び抗ＥＰＯ／Ｒ細胞の性能
抗ＩＬ１８を発現する細胞を、１００ｎＭ ＭＴＸを含む培地ＳＲ−３７１中で培養して、産生段階のために細胞集団を蓄積した。培地ＳＲ−３７１を用いて、より高い細胞生産性と適度の細胞増殖を支援した。表８に、３０００Ｌ製造バイオリアクターにおける抗ＩＬ１８産生ＣＨＯ細胞の代表的な産生増殖プロファイルを示す。培地ＳＲ−３７２を用いたこのプロセス（プロセスＡ）によって、最高１ｇ／Ｌの最終力価を得ることができる。
Figure 2013230151
ＭＴＸレベル以外は培地３７２と同じ処方を有する培地２８６を、抗ＥＰＯ／Ｒ産生に使用した。通常、産生段階ではより低い細胞密度が得られるが、培地ＳＲ−２８６を産生培地として使用することによって、細胞が３０００Ｌ規模で最高１．８ｇ／Ｌの抗体を産生することができる、より高い生産性を達成した。表９に要約するように、妥当な細胞増殖が観察された。ベンチスケールの結果、及び３０００Ｌ運転の結果によれば、この培地は、細胞特異的な生産性を増大させ、最高１．９ｇ／Ｌの最終力価が観察された。これらの結果は、類似処方の培地（表１及び２のＳＲ−３７２とＳＲ−２８６）が、大規模ＣＨＯ細胞培養において、良好な細胞増殖及び高い抗体産生率を支持することを示す。
Figure 2013230151
プロセスＢ：培地ＳＲ−３８２を用いたプロセスＢにおける抗ＩＬ１８細胞の性能
培地ＳＲ−３８２は、抗ＩＬ−１８抗体産生の長時間バッチプロセスに用いられる最も濃縮された培地であった。プロセスＢでは、シードトレインにおいては培地ＳＲ−３７１を使用し、産生段階又は充填が不十分な段階の前のシードバイオリアクターにおいてはＳＲ−３７２を使用する。細胞増殖は、産生段階における培地ＳＲ−３７２中の細胞増殖と比較して中程度であった。しかし、温度を変更すると、培地ＳＲ−３８２を用いて、最高２．５ｇ／Ｌの最終力価が得られた。
培地ＳＲ−３８２は、抗ＩＬ１８を発現する細胞の細胞特異的生産性が産生培地中の栄養素の増加に比例して増加することを示した研究に基づいて開発された。培地ＳＲ−３８２は、細胞増殖と最終力価の増加が均衡した最適な培地であった。最大細胞密度は５．９×１０６細胞／ｍＬにすぎなかったが、細胞特異的生産性は２倍に増加した。細胞培養期間を延長する温度変更と組み合わせて、表１０に示すように、最高２．２ｇ／Ｌの最終力価を得た。
Figure 2013230151
（実施例２）
抗体を発現するための改善された流加プロセス及び供給溶液
バッチ式のバイオリアクター運転の使用済み培地の分析によれば、ある種のアミノ酸が欠乏した。この結果は、測定されなくても、別の培地成分の欠乏も示唆しており、更なる栄養欠乏をもたらし得る。これらの潜在的欠乏を補うために、栄養素の溶液を添加した。工学分野では、この手法を一般に流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）と称する。
操作の点では、高濃度供給溶液を使用することが好都合である。以下の実施例では、化学的に規定された基本培地（ＰＦＣＨＯ、カタログ＃６７４１１−５０Ｌ）の高濃度溶液、及び複合加水分解物、例えばＹｅａｓｔｏｌａｔｅとフィトンの高濃度溶液の添加を記述する。この加水分解物の対は、濃度比に関係した生産性増大の相乗効果を示すことが確認された。
（実施例２．１）
アダリムマブ流加プロセス
初期のアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ／Ｄ２Ｅ７）プロセスは、８回連続して培地を除去し、補充する３日間のプロセスからなった。改善された流加プロセスは、培地中で加水分解物Ｐｒｉｍａｔｏｎｅを加水分解物Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅで置換し、新しい反応器パラメータを用いることによって、開発された。改善された流加プロセスは、約１２日間持続した。
初期バッチプロセスの生産性は、基本培地ＰＦＣＨＯを再処方し、新しい加水分解物、すなわちフィトンを添加することによって、更に改善された。この加水分解物を含む培地処方を、上記でＳＲ−２８６と称するプロセスに使用した（表２参照）。反応器操作パラメータも検討して、アダリムマブ産生プロセス全体を運転する最適温度を確認した。
反応器実験から毎日採取した試料の分析によって、幾つかの潜在的栄養欠乏が強調された。アダリムマブバッチプロセスの場合、２５倍濃度ＰＦＣＨＯ溶液、及び加水分解物Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅとフィトンの３３倍溶液を供給することによって、潜在的栄養欠乏に対処した。加水分解物は、その濃度比に関係した相乗効果を示す複合成分である。高濃度３３倍溶液ではこの比を維持した。
実験計画
実験目的は、新しい流加プロセスを２つのバッチ制御プロセスと比較することであった（温度変化３７→３３℃に対して恒温３５℃）。流加改変点は、以下のとおりであった。
１． アミノ酸欠乏に基づいて供給される２５倍基本培地濃縮（ＰＦＣＨＯ溶液）。
２． 培地の重量オスモル濃度が４４０ｍＯｓｍを超えないような間隔で供給される３３倍加水分解物濃縮溶液（細胞増殖及び生存度が低下する条件）。
３． 全体を通した反応器温度設定値３５℃。
この実験の対照は、以下のとおりであった。
ａ）現行培地（ＳＲ−２８６）を用いて、制御バッチプロセスパラメータ下で操作される同一反応器（制御条件は、温度を変更して、線形ｐＨ勾配でＳＲ−２８６培地を運転する反応器を含んだ。）（対照１と称する。）。
ｂ）現行培地（ＳＲ−２８６）を用いて、全体を通した操作温度が３５℃である以外はすべて現行バッチプロセスパラメータ下で操作される、同一反応器（対照２と称する。）。
材料
有効体積１３ＬのＢｒａｕｎ ＥＤ反応器
ワーキングセルバンクＷＣＢ９７０５１３−６を用いたパイロットプラント接種材料ＡＦＩ９１５Ａ
３ＸＰ１１Ｙ７Ｐ基本培地溶液（ＳＲ−２８６）
基本培地濃縮溶液（２５倍）（ＰＦ ＣＨＯ溶液）
加水分解物濃縮溶液（３３倍）
グルコース供給ショット（Ｆｅｅｄ Ｓｈｏｔ）（２００ｇ／Ｌ）（グルコース溶液）
ｐＨ制御用０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液
溶液調製：
１． 産生培地（上記表２のＳＲ−２８６溶液の記述を参照されたい。）
２． ＰＦＣＨＯ濃縮溶液（２５倍）（基本濃縮溶液）２ｋｇ：
一定撹拌下、各添加工程後１０分間混合して、以下の順で調製した。
Figure 2013230151
３． 加水分解物濃縮溶液（３３倍）１Ｋｇ：
一定撹拌下、各添加工程後１０分間混合して、以下の順で調製した。
Figure 2013230151
方法：
反応器操作：
反応器に接種するために、バイアルを解凍し、Ｈｕｍｉｒａシードトレインプロセスの記述に従って拡大させた。反応器中で増殖後、反応器を３．６２Ｌまで排出させて、充填が不十分な段階をシミュレートした。次いで、反応器に産生培地（ＳＲ−２８６）を１３Ｌレベルまで充填した。
反応器を以下のパラメータで操作した。
ａ）撹拌７０ＲＰＭ
ｂ）温度３５℃
ｃ）７２時間にわたるｐＨ７．１６からｐＨ６．９０までのｐＨ線形勾配
ｄ）溶存酸素３０％
ｅ）グルコースレベルが２．０ｇ・Ｌ−１未満であるときには、反応器に２００ｇ／Ｌグルコース溶液１９５ｇを供給した。
供給スケジュール：
以下は、追加の栄養素、すなわち、補充基本培地及び加水分解物をアダリムマブバッチに添加する供給スケジュールである。
Figure 2013230151
結果：
対照プロセス１及び２を、改善された流加プロセスと比較した結果（及び算定される改善）を、表１２及び１３に記載する。表１２に示すように、アダリムマブ生産性は、恒温下で、改善された流加プロセスを用いた高度濃縮基本培地及び加水分解物濃縮溶液の添加に伴って増加した。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
（実施例２．２）
ＡＢＴ−８７４流加プロセス
上記アダリムマブの改善された流加プロセスに関して、ＡＢＴ−８７４をバッチ式で運転する反応器から毎日採取した試料の分析によって、アミノ酸の欠乏が強調された。やはり、２５倍ＰＦＣＨＯ溶液及び高濃度３３倍加水分解物溶液を用いて、この欠乏に対処した。
ＡＢＴ−８７４のバッチプロセスは、培地中の加水分解物を置換し、新しい反応器パラメータを導入することによって、Ｄ２Ｅ７（アダリムマブ）用に最初に開発された。また、Ｄ２Ｅ７（アダリムマブ）の場合と同様に、基本培地を再処方し、新しい加水分解物を添加した。この培地処方を現行Ｄ２Ｅ７プロセスにＳＲ−２８６として使用した（上記表２参照）。
実験計画：
実験の目的は、どちらもアミノ酸欠乏が以前に確認された時間に開始された以下の流加条件と対照バッチプロセスを比較することであった。
ａ）基本培地濃縮２５倍ＰＦＣＨＯと３３倍加水分解物濃縮溶液を二者択一的に供給
ｂ）基本培地濃縮２５倍ＰＦＣＨＯと３３倍加水分解物濃縮溶液を毎日供給
この実験の対照は、現行培地（ＳＲ−２８６）を用いて、対照バッチプロセスパラメータ下で操作される同一反応器を含んだ（温度変更及び線形ｐＨ勾配を有するＳＲ−２８６培地）。
材料：
有効体積１３ＬのＢｒａｕｎ ＥＤ反応器
ワーキングセルバンクＷ９９０１０７−Ｊ６９５
３ＸＰ１１Ｙ７Ｐ基本培地溶液（ＳＲ−２８６−１１１８９９−１）
ＰＦＣＨＯ−０−５００−ＨＧ２Ｙ増殖培地
基本培地濃縮溶液（２５倍）
加水分解物濃縮溶液（３３倍）
０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液
溶液調製：
１． 産生培地（ＳＲ−２８６溶液の記述を参照されたい。）
２． ２５倍ＰＦＣＨＯ溶液（基本濃縮溶液：グルコース溶液４６２ｇをグルコース粉末の代わりに用い、したがって最終重量が２１７０ｇであったこと以外、前の実施例に記載。）。
注：上記溶液の初期体積の１％の添加ごとに、
ａ）最初の３倍濃度よりもＰＦＣＨＯ濃度が０．２５倍増加する。
ｂ）アスパラギンが７５ｍｇ・Ｌ−１増加する。
ｃ）グルコース濃度が２．１ｇ・Ｌ−１増加する。
・ｐＨ約０．１０ｐＨ単位増加
３． ３３倍加水分解物溶液（前の実施例に記載。２．４０ｇ・Ｌ−１グルコースを追加）
注：上記溶液の初期体積の１％の添加によって、
ａ）最初のバッチ濃度に比較して、ＴＣ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ濃度が２．６５ｇ／Ｌ（０．３３倍）増加する。
ｂ）最初のバッチ濃度に比較して、フィトンペプトン濃度が１．６５ｇ／Ｌ（０．３３倍）増加する。
方法：
反応器に接種するために、バイアルを解凍し、ＡＢＴ−８７４シードトレインプロセスの記述に従って拡大させた。反応器中で増殖後、反応器を４．０６リットルまで排出させて（表１３に記載のように、運転名Ｂ９０１３−ＥＤ２及びＢ９０１４−ＥＤ３）、充填が不十分な段階をシミュレートした。次いで、反応器に通常の産生培地（ＳＲ−２８６）を１３Ｌレベルまで充填した。
反応器を以下のパラメータで操作した。
ａ）撹拌７０ＲＰＭ
ｂ）温度３３℃
ｃ）ｐＨ６．９０
ｄ）溶存酸素４０％
Figure 2013230151
結果
改善された流加プロセスを比較した結果を下記表１４及び１５に示す。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
（実施例３）
流加培養の体積測定の生産性を増大させるための安定な組合せ供給溶液
以下の実施例では、２種類の加水分解物、グルタミン以外の少なくとも１種類のアミノ酸、糖、及び化学的に規定された培地基剤を含む、安定高濃度供給溶液を処方する新規手法を記述する。生成する供給溶液は、組換えタンパク質を産生するほ乳動物細胞系の体積測定の産生を増加させる能力がある。最後に、グルコース濃度のフィードバック制御に基づく流加プロセス開発の促進的方法を提案する。
材料及び方法
組合せ供給液は、加水分解物Ｂａｃｔｏ ＴＣ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、（ＲＭ−２１６）（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ ２５５７７１）及びフィトンペプトン、（ＢＤ Ｄｉｆｃｏ ２９２２４５０）＋グルコース、Ｌ−アスパラギン一水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ） ＤＭＥＭ／Ｆ１２の還元バージョン（ＮａＣｌ、リン酸塩、ｐＨ指示薬、及び他の非必須成分を除去した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５００）又はグルタミンを含まない、ＮａＨＣＯを含まない、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ ＰＦＣＨＯ（Ａ）−Ｓ１（改変欠乏）（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ６７４１１−５００Ｌ３５４７０）を含んだ。
溶液調製の場合、ＰＭＱ００４Ｄ２ろ過パックを用いたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ ＰＦによって水をろ過した。ベンチトップ型マグネチックスターラを用いて、指定量の水に材料を溶解させた。各成分を添加後、次の成分を導入する前に、完全溶解を視覚的に確認した。
適用可能であれば、ＨＡＣＨ ２１００Ｐ携帯濁度計（Ｈａｃｈ Ｃｏ． Ｌｏｖｅｌａｎｄ、ＣＯ）を用いて濁度を定量した。人間の目が濁度を検出するしきい値は、約１５ＮＴＵ（比濁計濁度単位）である。
バイオリアクター実験を、３Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中で、操作体積１．５Ｌで、空気及び酸素流のカスケードによってｐＨ、温度、撹拌及び酸素を制御して、実施した。細胞数をＣｅｄｅｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ ＡＧ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって数えた。グルコース、乳酸塩をＹＳＩ ２７００（ＹＳＩ Ｉｎｃ．、Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＯＨ）によって測定した。追加の代謝産物をＮｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）によって測定する場合もあった。酸素（ｐＯ２）、二酸化炭素（ｐＣＯ２）の平衡分圧、及びｐＨをＡＢＬ ５ Ｂｌｏｏｄ Ｇａｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ Ａ／Ｓ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｂｒｏｎｓｈｏｊ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって確認した。
（実施例３．１）
ＰＦＣＨＯを基本培地として用いた安定な組合せ供給液の調製
単一の高濃度供給液は、必要な添加体積及び添加数を減少させるので、細胞培養流加製造を容易にする。しかし、ＰＦＣＨＯ粉末を９．００を超えるｐＨ値で溶解させなければならないため、単一の高濃度供給液は複雑である。また、加水分解物は、中性ｐＨ条件下では可溶性である。したがって、両方の成分を中性又は高ｐＨ値で単純に混合しようとすると、（非溶解）粉末懸濁液が生成する。文献に報告されているように、「十分最適化された供給液は、（例えば、溶解性の理由で）１つを超える導入速度及び供給ｐＨを支持する２つ以上の別々の溶液として存在することが多い」［１］。
組合せ供給液安定性実験
以下の表に記載のように、加水分解物の添加によって、ＰＦＣＨＯ濃度が長期間安定であることが確認された。最後に水約７００ｇ及び水を添加して最終重量１Ｋｇとするために、２０ｇ Ｋｇ−１ ＰＦＣＨＯ、７．５ｇ Ｋｇ−１アスパラギン、２１ｇ Ｋｇ−１グルコース、２２ｇ Ｋｇ−１ Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ及び１４ｇ Ｋｇ−１フィトンの成分量を添加した。溶液を混合し、次いで２．０Ｎ ＨＣＬを用いて標的ｐＨまで低下させた。以下の表においては、濁度を裸眼による視覚的観察によって測定した。
Figure 2013230151
表１６に示すように、最小濁度（ｔｕｒｂｉｄ）は、２）及び３）ｐＨ６．７５及び７．２５であった。２）と３）の両方は、ほぼ２４時間後でも混濁しなかったことが注目される。これらの結果に基づいて、加水分解物が溶液中のＰＦＣＨＯを安定化し、低濁度が得られることが明白である。
加水分解物が生成混合物を安定化することから、フィトン及びＹｅａｓｔｏｌａｔｅをＰＦＣＨＯ溶液にｐＨ１０．０で添加し、次いで混合物全体を標的ｐＨに低下させることができる。この添加順序は、特により大きい体積を混合するときに脆弱である８．０未満のｐＨ値にＰＦＣＨＯ溶液を保持する不安定な段階を取り除く。
先の仮説を検定するために、本発明者らは、それぞれ２０及び７．５ｇ・Ｋｇ−１のＰＦＣＨＯ及びアスパラギンを含む処方でこの新しい添加順序を試験した。生成した溶液Ｘ−１を分割し、ｐＨ７．０、６．７５、６．５及び６．２５に低下させた。これらの溶液は、以下のグラフで認められるように、安定であることが証明された。
Figure 2013230151
３時間後、最小濁度溶液はｐＨ６．５０であった。特にｐＨ７．０の場合の、濁度の見かけの減少は、幾つかの微粒子の沈降によるものであった。
安定剤としてのグルコース
２００ｇ Ｋｇ−１グルコースを安定剤として添加した処方（表１８参照）を試験した。
Figure 2013230151
各成分を計量し、順次添加した。水の初期質量は、最終質量が１Ｋｇになるように削減すべきである。
この溶液は、以下の表で認められるように、ある範囲のｐＨ値で数時間安定であることが証明された。
Figure 2013230151
グルコースを含む改変組合せ供給溶液を使用して、２種類の抗体、すなわちアダリムマブ（Ｄ２Ｅ７）及び抗ＩＬ−１８抗体ＡＢＴ−３２５を発現させた。
安定なＤ２Ｅ７製造のための組合せ供給溶液
バイオリアクターに添加する処方の体積が最低高濃度成分（すなわちＰＦＣＨＯ）に基づく場合、個々に評価されたものに対応させるために、極めて多量の供給液を添加する必要がある。したがって、より高い濃度は、有効な供給処方の開発における次の段階であった。この溶液をＤ２Ｅ７組合せ供給溶液と称し、以下の表に示す。
Figure 2013230151
各成分を計量し、順次添加した。水の初期質量は、最終質量が１Ｋｇになるように削減すべきである。
２００、１５０及び１００ｇ Ｋｇ−１グルコースを含む処方を試験した。以下の表に示すように、これらの溶液も数時間安定な濁度を有した。表２１は、グルコースの添加によって溶液の濁度が減少したことを示している。
Figure 2013230151
 表２１に示すように、グルコースレベルが増加すると、溶液の濁度が減少した。その濁度レベルに基づくこれらの異なる処方は、ろ過実験に許容されると考えられた。
安定なＡＢＴ−３２５製造のための組合せ供給溶液
安定なＡＢＴ−３２５組合せ供給液を得るために、表２２に示すように、Ｄ２Ｅ７組合せ供給液に用いた方法に従って現行処方５０Ｌを調製した。
Figure 2013230151
各成分を計量し、順次添加した。水の初期質量は、最終質量が１Ｋｇになるように削減すべきである。
以下の表で認められるように、調製時に、溶液は約２０−３０ＮＴＵの濁度レベルを維持した。
Figure 2013230151
ＡＢＴ−３２５処方組合せ供給溶液５０ＬをＤ２Ｅ７の方法に従って調製して、調製方法の拡張性と適用性の両方を試験した。上で示したように、溶液は４時間安定であった。
上記実施例で言及したＰＦ ＣＨＯ培地は、実施例１の細胞培地で言及した改変ＰＦ ＣＨＯ（改変Ａ部）に対応することに留意されたい。
（実施例３．２）
ＤＭＥＭ−Ｆ１２を基本培地として用いた安定な組合せ供給液の調製
前の実施例に記載したように、ＰＦＣＨＯ及び２種類の加水分解物並びにグルコースを含む安定な組合せ供給溶液を製造することができた。以下の実施例では、この方法論が任意の基本供給処方に適用可能であり、安定な組合せ供給溶液をもたらすことを実証する。
公的に利用可能な培地処方であるＤＭＥＭ−Ｆ１２を、本明細書ではＤＭＥＭ−Ｆ１２ｍと称する組合せ供給調製物に適合するように改変した。以下の成分を除去した：ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｄ−グルコース、ＨＥＰＥＳ、ヒポキサンチンＮａ、フェノールレッド、Ｌ−グルタミン及びチミジン。Ｄ２Ｅ７及びＡＢＴ−３２５供給処方に対応した組合せ供給液を、実施例３．０及び３．１に記載の方法論に従って調製した。最終成分及び処方配列を以下の表に示す。
Figure 2013230151
各成分を計量し、最終質量１Ｋｇになるように添加した。
調製時、供給液ＩとＩＩの両方は、１２ＮＴＵ以下の濁度を４時間を超えて維持した。
（実施例３．３）
組合せ供給液の添加による細胞増殖及び生産性増強
上記組合せ供給液の増殖及び力価促進特性を評価するために、（抗ＩＬ−１２完全ヒトＩｇＧ１抗体を発現する）ＡＢＴ−８７４細胞を使用した。このＣＨＯ細胞系は、細胞培地ＳＲ−３８３（５００ｎＭ ｍｔｘを含む２Ｘ）中で正常に培養される。
これらの実験では、適応が一定の増殖速度で認められるまで、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２中に少なくとも５世代継代した。撹拌培養物を３５℃及び５％ＣＯ２の恒温器中のＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ撹拌プレート上で７０ｒｐｍで撹拌した。接種直前に、細胞懸濁液の必要量を維持培養物（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）から採取した。細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを新しい予熱された培地に再懸濁させて、４×１０５／ｍＬのシード密度を得た。
バイオリアクター接種に十分な体積が生成して、１．５Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中で１：５の分割比が得られるまで、細胞培養物をスピナー中で拡大した。反応器運転条件は、ｐＨ６．９、３５℃、１５０ｒｐｍ、及び飽和の４０％の溶存酸素レベルであった。すべてのバイオリアクター実験を２回実施した。運転中に、組合せ供給液の初期反応器体積ボーラスショットの１％を３回１日おきに細胞に与えた。
両方の組合せ供給液の使用は、細胞培養増殖を大きく促進する。ＣＦ Ｉの場合、最高細胞密度が２倍になったが、培養は対照の１３日に比べて１０日間しか持続しなかった。ＣＦ ＩＩの場合、最高細胞密度は、対照のほぼ３倍であり、培養はほぼ同じ時間持続した。最終力価の点では、より劇的な効果が認められた。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地の力価は約４１ｍｇ／Ｌであったのに対して、ＣＦ Ｉでは１８８、ＣＦ ＩＩでは４３４であった。最大細胞密度、培養長さ、力価及び特異的生産性に対する異なる供給溶液の効果を以下の表に要約する。
Figure 2013230151
（実施例３．４）
組合せ供給液の添加による高力価細胞培養プロセス
力価が高いほど、所与の全収率を満足させるのに必要な製造運転回数は減少する。以下の実施例では、流加プロセス中に約４ｇ／Ｌの平均力価を与えるＡＢＴ−８７４の流加大規模プロセスを記述する。さらに、培地及び組合せ供給液を更に改善すると、６ｇ／Ｌを超える力価レベルが得られた。
材料及び方法
モデル系として、ＡＢＴ−８７４抗体産物系を使用した。
供給溶液調製
供給溶液を上記手順に従って調製した。２つのアスパラギン濃度、すなわち５．０又は７．５ｇ・Ｋｇ−１を使用した。調製方法を以下の表に示す。
Figure 2013230151
各成分を計量し、最終質量１Ｋｇになるように添加した。
ベンチトップ型マグネチックスターラを用いて強度のボルテックス撹拌下で、指定量の水に材料を溶解させた。段階５まで、各成分を添加後、次の成分を導入する前に、完全溶解を視覚的に確認した。しかし、これは段階６及び７では不可能であった。これら２つの段階では、粉末を溶液に混合することが、最終ＨＣｌ添加に進むのに十分と考えられた。
プロセス培地スクリーニング
ベースライン性能データを得るために、対照としての３Ｘ流加（ＦＢ）３０００Ｌ、原型４Ｘ ＦＢプロセス並びに非供給（ｎｏｎ−ｆｅｄ）（長時間バッチ：ＥＢ）３Ｘ及び４Ｘ条件を特徴とする実験を実施した。特に、より高い培地濃度は、培養増殖プロファイルにおいて初期の遅れを生じることが示唆された。しかし、長時間バッチ（ＥＢ）３Ｘ又は４Ｘプロセスでは、大きな遅れは認められなかった。
予想どおりに、供給液補充は、３Ｘと４Ｘの両方のプロセスで力価を増加させた。それにもかかわらず、供給（すなわち流加）した場合には、４Ｘプロセスではかなりの増殖抑制が認められた。小規模実験のアミノ酸分析によれば、供給後でも、アミノ酸アスパラギン及びグルタミンの完全な欠乏が依然として存在した。そのため、組合せ供給液中のアスパラギンの総供給時間と量のどちらも増加させた。要するに、４Ｘ ＦＢプロセスは、ＥＢプロセス又は３Ｘ ＦＢ対照よりも高い最終力価に達する可能性があることが確認された。したがって、４Ｘ ＦＢプロセスを更なる開発の出発点として選択した。
３Ｘ流加プロセス（対照）と４Ｘ流加プロセスの相違を表２７に示し、以下に更に詳細に記述する。
供給開始時の生細胞密度
極めて低い細胞密度で供給を開始すると、細胞増殖、最終的に最終力価が抑制される傾向にあることが認められた。したがって、供給が過度に遅れると、細胞の飢餓のために、体積測定の生産性が低下すると予想された。
上記仮説を検討するために、幾つかの実験を実施して、異なる生細胞密度における供給の有意性を判定した。実験を総合した結果を図１のグラフにプロットする。図１に見られるように、１５日目の力価は、供給開始日における生細胞密度に大きく依存する。データポイントに一致させた３次多項式によれば、１５日目の最大力価は、３．５・１０６細胞ｍｌ−１の供給密度において予想することができる。
再現性
６ｇ・Ｌ−１プロセスのプロセス条件を下記表２７に示す。このプロセス条件は、５．０・１０６生細胞／ｍｌの細胞密度まで、ＳＲ−３８３における充填が不十分な運転からの１：４分割としての接種、ｐＨ７．０、ＤＯ＝３０％、３７℃として定義された。反応器運転条件はｐＨ６．９、Ｔ＝３５℃、ＤＯ＝４０％であった。細胞が３．５・１０６細胞／ｍｌの生存可能密度に達し、１０日間持続したときに、初期反応器重量の１％からなる組合せ供給液の毎日のボーラス添加によって、供給を開始した。
４ｇ・Ｌ−１プロセスのプロセス条件を下記表２７に示す。
Figure 2013230151
（実施例３．５）
グルコースフィードバック制御による組合せ供給液を用いた流加
フィードバック制御は、系固有の挙動の理解が極めて限定された所与のパラメータの設定値を標的にすることができる。このようにして、標的設定値を、系が起こし得る撹乱又は変化とは無関係に維持することができる。ほ乳動物細胞培養物の代謝は複雑なため、培養物の経路（ｃｕｌｔｕｒｅ ｇｉｖｅｎ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）を予測することができる包括的なモデルを引き出すことは労力を要する。それでも、標的グルコースレベルを維持するためにグルコースを補給することができる、例えば自動試料採取による、試料採取方法を開発することが望ましい。それによって、所与のグルコース濃度（又は別の代謝産物）の効果を切り離すことができ、組合せ供給物中のグルコースの異なる比率が異なる培養物に対して有する効果を試験する手段も提供される。効果の切離しとは、組合せ供給物中のグルコースの異なる量を用いることの効果に対して、所与のグルコースレベルを維持する効果を指す。
材料及び方法
モデル系として、２種類の抗ＩＬ−１２抗体、すなわちＡＢＴ−８７４及び１Ｄ４．７の産物系を使用した。
自動試料採取、すなわちＹＳＩ ２７００ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ａｎａｌｙｚｅｒを、細胞培地中のグルコースレベルを監視する手段として選択した。ＹＳＩ ２７３０ Ｍｏｎｉｔｏｒ及びＣｏｎｔｒｏｌ ＡｃｃｅｓｓｏｒｙをＹＳＩ ２７００ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ａｎａｌｙｚｅｒに取り付けることによって、オンライン自動試料採取装置を設置した（ＹＳＩ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ、ＯＨ参照）。この試料採取装置は、２本の管を保持するポンプからなった。第１の管は２本の枝分かれを有し、一方は試料をバイオリアクターから収集し、他方は防腐剤を注入して無菌を維持した。試料を採取後、試料を外部チャンバーに送り、そこでストロー（ｓｉｐｐｅｒ）によって試料を実際の分析用に採取した。ポンプを通る第２の管は、排出物を廃棄物容器に収集するのに用いた。試料採取間隔、ＴＰＵ（料金ポンプ（ｆｅｅ ｐｕｍｐ）が設定値からの実測オフセットに基づいて運転する時間に相当する、単位エラー当たりの時間（Ｔｉｍｅ ｐｅｒ Ｕｎｉｔ Ｅｒｒｏｒ））など、オンライン試料採取附属品の幾つかのパラメータを制御した。
１５ピンコネクタを用いて、ポンプをＹＳＩに接続した。ＹＳＩのグルコースプローブに対応するピン（白色−７、黒色−１１）をポンプのＴＴＬオン／オフピン（８）に接続し、ＹＳＩ（１−５）のグランドピンの１個をポンプの１５ピンコネクタのシャシーに接続した。ＹＳＩ Ｓｅｔｕｐ Ｍｅｎｕからポンプをオン・オフして、接続を試験した。使用したポンプ配管は、Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ ＣＦＬＥＸ ０８２であった。
Figure 2013230151
ＹＳＩ１−Ａ２５反応器を４．９ｇ／Ｌグルコースに制御した。４．９ｇ／Ｌのグルコース制御を約２日目に４時間の試料採取間隔で８日目まで開始した。８日目に、試料採取間隔を２時間に短縮し、ＹＳＩ自動装置の設定値を再設定して、ＰＩＤメモリーを消去した。オーバーシュートによる設定値からの変動は、８日目後にはかなり減少した。したがって、２時間の試料採取間隔がこれらの条件に最適であることが確認された。２から８日目までの平均オーバーシュートは０．４３ｇ／Ｌであり、平均アンダーシュートは０．３１ｇ／Ｌであり、設定値からの変動誤差は約８％であった。一方、８から１３日目までの平均オーバーシュートは０．０８ｇ／Ｌであり、平均アンダーシュートは０．０９ｇ／Ｌであり、変動誤差は約２％であった。
組合せ供給液を用いたグルコース濃度の制御
組合せ供給溶液をバイオリアクター中の培養物に供給するスケジュールは、経験的手法によって規定された。実行可能な流加スキームが見いだされるまで、異なる供給量を試験し、異なる供給時間を試験した。理想的には、組合せ供給液の供給スケジュールは、所与の培養物の具体的要件に合致すべきである。
上記検討事項を考慮して、例えばグルコースを栄養要件の指標として用いることによって、細胞培養の要求に基づく組合せ供給液を提供することが有利であった。このようにして、フィードバック制御系を使用して、１）様々なグルコース濃度の異なる供給物を試験し、２）生じた供給プロファイルをより大規模な培養における手動供給に使用することができる。
以下の表に、１Ｄ４．７ ｍＡｂを産生する細胞系を用いた２つの反応器操作様式を要約する。（表２９にベースラインとして示した）基準実験は、１．５Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中でｐＨ６．９、Ｔ＝３５℃、ＤＯ＝４０％で運転される、ＳＲ−３７２培地における長時間バッチプロセスの典型的な力価性能を説明するものである。ＹＳＩ実験は、同じ条件＋フィードバック制御下で運転され、１００、１５０又は２００ｇ・Ｌ−１グルコースを含む組合せ供給液を補給した。
Figure 2013230151
表２９からわかるように、種々の組合せ供給液を用いたフィードバック系は、抗体の最終力価を大きく改善した。
１日当たりに補給される組合せ供給液を計量することによって、上記実験のような実験から供給プロファイルを得た。典型的な供給プロファイルを以下の表に示す。
Figure 2013230151
フィードバック制御系なしでも、上記スキームを実行して、反応器に手動で供給することもできる。このようにして、供給スケジュールをスケールアップすることができる。
結果の要約
加水分解物混合物と化学的に規定された基本培地の両方を利用した流加プロセスは、ほ乳動物細胞培養物中で分泌されたｍＡｂの最終力価を増加させることが判明した。
また、以下の安定な組合せ供給液を生成可能な方法を実証した。
Figure 2013230151
表３１に記載の組合せ供給液は、ＭｉｌｌｉＱＨ２Ｏ（最高７５０ｇ）から出発して作製された。上述したように、構成要素を最終重量（組合せ供給液の総重量）１０００ｇまで水に添加した。さらに、組合せ供給溶液は、細胞培養物寿命、最高生細胞密度及び特異的生産性を増大させることが判明した。分泌されたモノクローナル抗体の力価レベルを６ｇ・Ｌ−１まで増加させる能力のある組合せ供給液を用いた細胞培養流加プロセスを実証した。上記組合せ供給液は、細胞培養物の細胞密度を増加させることも判明した。
最後に、フィードバック制御系及び異なる組合せ供給液を使用する方法は、力価レベルを増加させる能力のあることも判明した。この手法を用いて、供給スケジュールを素早く作成することによって細胞培養プロセスの開発を加速することができる。
参考文献
１． Ｗｈｉｔｆｏｒｄ， Ｗ．Ｇ．， Ｆｅｄ−Ｂａｔｃｈ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ２００６． ３０−４０．
２． ＹＳＩ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ． （１９９８） ＹＳＩ ２７００ Ｓｅｌｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ．
３． ＹＳＩ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ． （１９９８） ＹＳＩ ２７３０ Ｍｏｎｉｔｏｒ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ．
４． Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ Ｐｕｍｐｓ． １０１Ｆ， １０１Ｕ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ．
（実施例４）
抗ＩＬ−１８産生ＣＨＯ細胞系の生産性を増大させる酪酸ナトリウム及びＮ−アセチルシステインの適用
本発明は、抗体、例えば、抗ＩＬ−１８産生ＣＨＯ細胞系の生産性を増大させる新規手法を包含する。より具体的には、以下の実施例は、細胞培地に化学物質を添加することによる、最終抗体（例えば、抗ＩＬ−１８）力価の増加に関する。細胞生存及び抗体価の改善を、例示的な抗体、すなわちＩＬ−１８抗体を用いて、以下に記述する。
細胞系及び培地
以下の実施例に用いる抗ＩＬ−１８抗体は、ＩＬ−１８に対する完全ヒトＩｇＧ１抗体（Ａｂ）である。抗ＩＬ−１８を発現するＣＨＯ細胞系を、実施例１の表４の上記増殖培地ＳＲ−３７１中で培養する。細胞系用産生培地も、実施例１で上述した（スピナーフラスコ培養用）ＳＲ−３７２及び（バイオリアクター培養用）ＳＲ−３８２である。
スピナーフラスコ中で実施した実験の培養条件
すべてのスピナーフラスコ実験を２回実施した。撹拌培養物を３５℃及び５％ＣＯ２の恒温器中のＴｈｅｒｍｏｌｙｎｅ撹拌プレート上で８０ｒｐｍで撹拌した。接種直前に、細胞懸濁液の必要量を維持培養物から採取した。細胞を遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを新しい予熱された培地に再懸濁させて、４×１０５／ｍＬのシード密度を得た。
（実施例４．１）
増殖培地中で培養した抗ＩＬ−１８産生ＣＨＯ細胞系の増殖及び生産性に対する酪酸ナトリウムの効果
酪酸ナトリウムの濃度範囲を決定するために、第１の実験を種々の濃度の酪酸ナトリウムを含むＳＲ−３７１中で実施した。実験を有効体積７０ｍＬの１００ｍＬスピナーフラスコ中で実施した。酪酸ナトリウム１．１０１ｇをＭｉｌｌｉＱ水１０ｍＬに溶解して調製し、０．２μｍフィルターに通してろ過滅菌した１Ｍ原液から酪酸ナトリウムを添加した。溶液を−２０℃で保存した。
酪酸ナトリウムを培養開始時（０日目）に濃度０ｍＭ、０．１２５ｍＭ、０．５ｍＭ及び１ｍＭで添加した。本実施例及び以下のすべての実施例において、細胞密度及び生存度を自動細胞カウンター（Ｃｅｄｅｘ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。表３２は培養時間にわたる生細胞密度であり、表３３は培養時間にわたる生存度である。実験を１２日間実施した。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
酪酸ナトリウムが細胞増殖及び生存度に影響を及ぼしたことは明らかである。酪酸塩濃度０．１２５ｍＭでは細胞増殖及び生存度に対する明白な効果はなかったが、０．５ｍＭ酪酸塩では細胞増殖に明らかな影響を及ぼし、最大細胞密度が低下した。０．５ｍＭでは、酪酸ナトリウムは、培養時間５日後に生存度に影響を及ぼした。酪酸ナトリウムは、濃度１ｍＭで細胞増殖を完全に阻害し、生存度は０日目から連続的に減少した。
表３４は、培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価を示す。本実施例及び以下のすべての実施例において、抗ＩＬ−１８濃度をＰｏｒｏｓ Ａ ＨＰＬＣアッセイによって求めた。
Figure 2013230151
表３４（上）：培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価
０．１２５ｍＭ酪酸塩を含む培養物の平均最終力価は３５２ｍｇ／Ｌであり、未処理対照の平均最終力価は２５７ｍｇ／Ｌであった。この濃度において、酪酸塩処理は、最終力価を４０％増加させた。
（実施例４．２）
ＳＲ−３７２中で培養した抗ＩＬ−１８産生ＣＨＯ細胞系の増殖及び生産性に対する酪酸ナトリウムの効果
ＳＲ−３７１からＳＲ−３７２への培養物分割により起こり得る効果を排除するために、抗ＩＬ−１８を発現するＣＨＯ細胞系をＳＲ−３７２中での増殖に適合させた。ＳＲ−３７２中での増殖に適合させた細胞を用いたすべての実験を、有効体積１８０ｍＬの２５０ｍＬスピナーフラスコ中で実施した。「スピナーフラスコ中で実施した実験の培養条件」の項で概説した条件を適用して、培養を実施した。
細胞が中間及び後期指数増殖期にあるときに酪酸塩を添加するように実験を設計した。酪酸塩の添加が遅いほど、細胞１個当たりの酪酸塩濃度が低下するので、０日目に添加するよりも細胞に対するストレスが低下する可能性があり、細胞増殖が改善され、ＩＶＣが増加する可能性がある（ＩＶＣ（生細胞の積分）は、培養時間に対する生細胞密度の積分として定義される。）。酪酸塩を４及び５日目に濃度０．５ｍＭ及び２ｍＭで添加した。実験を１２日間実施した。表４は培養時間にわたる生細胞密度であり、表５は培養時間にわたる生存度である。４日目に添加したわずか２ｍＭの酪酸ナトリウムによって、対照よりも生存度が低下した。他の条件は、生存度に影響を及ぼさなかった。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
表３７は、培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価を示す。５日目に添加した２ｍＭ酪酸ナトリウムによって、対照よりも２９％増加した（それぞれ３１７ｍｇ／Ｌ対２４５ｍｇ／Ｌ）。これらの条件下では、細胞増殖はさほど阻害されなかった（表３５参照）。
Figure 2013230151
表３７（上）：培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価
（実施例４．３）
３ＬバイオリアクターにおけるＳＲ−３８２中で培養した抗ＩＬ−１８産生ＣＨＯ細胞系の増殖及び生産性に対する酪酸ナトリウムの効果
以下の実施例では、大規模、すなわち３Ｌバイオリアクターにおける抗ＩＬ−１８プロセスＢ（セクション１．５参照）に酪酸ナトリウムを適用することによって最終抗ＩＬ−１８力価が増加することを示す。このプロセスは、３Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクターにおいて開発された。充填が不十分な段階（ＳＲ−３７２）まで、シードトレインをＳＲ−３７１中で実施した。充填が不十分な段階を有効体積１０Ｌの２０Ｌ Ｂｉｏｗａｖｅ Ｂａｇ中でシミュレートした。抗ＩＬ−１８プロセスＢの増殖及び生産性に対する酪酸ナトリウムの効果を検討する実験を有効体積１．５Ｌの３Ｌ Ａｐｐｌｉｋｏｎバイオリアクター中で実施した。各バイオリアクターにＳＲ−３８２ １１２５ｍＬを充填し、ＳＲ−３７２中に抗ＩＬ−１８細胞を含むＢｉｏｗａｖｅ Ｂａｇから細胞懸濁液３７５ｍＬを添加することによって接種した。
実施例４．２において、細胞が中間から後期対数期にあるときに（スピナーフラスコにおいて５日目であった。）酪酸塩を添加することによって力価を増加させた。時間的に、３Ｌバイオリアクターにおける抗ＩＬ−１８産生プロセスの中間から後期対数期は、培養時間の７日目である。この実施例では、中間から後期対数期に酪酸塩を確実に添加するように、培養物への酪酸ナトリウムの添加を７日目にした。
濃度２００ｍＭの酪酸ナトリウム原液を、酪酸ナトリウム４．４０４ｇをＭｉｌｌｉＱ水２００ｍＬに溶解させることによって、培養に添加する直前の７日目に調製した。この溶液を０．２２μｍフィルターに通してろ過滅菌した。
実験を５個のバイオリアクターを用いて実施した。各バイオリアクターの運転は、それぞれの生存度が５０％未満になったときに終了した。２個のバイオリアクターを対照とした（抗ＩＬ−１８プロセスＢ）。培養時間７日目に、酪酸ナトリウムを別の３個のバイオリアクターにそれぞれ濃度０．３ｍＭ、１ｍＭ及び３ｍＭで添加した。表３８は培養時間にわたる生細胞濃度であり、表３９は培養時間にわたる生存度である。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
表３９（上）：培養時間にわたる生存度
対照培養物は、反応器５の初期ＣＯ２濃度が高いため、繰り返し実験（反応器２）におけるよりも反応器５において増殖が遅かった。反応器２は（抗ＩＬ−１８産生プロセスにおいて時間的に観察して）培養時間１６日目に終了し、反応器５は１７日目に終了した。濃度３ｍＭの酪酸ナトリウム（反応器４）は、細胞増殖及び生存度に影響を及ぼした。酪酸塩添加から２日後に細胞が死滅し始めた。１ｍＭ酪酸塩は細胞増殖及び生存度に影響を及ぼさず（反応器１）、反応器運転は１６日目に終了した。細胞増殖は、反応器２の対照と極めて類似した。０．３ｍＭ酪酸塩は、培養時間を２日間延長した（反応器３）。表４０は、培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価を示す。
Figure 2013230151
表４０（上）：培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価
反応器２（抗ＩＬ−１８プロセスＢ）における培養の最終力価（１６日目）は２３２５ｇ／Ｌであった。反応器５の最終力価は１５８９ｇ／Ｌであった。この力価の低下は、培地における高い初期ＣＯ２濃度によって引き起こされた細胞増殖の悪化による可能性がある。７日目に添加した１ｍＭ及び３ｍＭの酪酸塩は、最終力価を対照（反応器２）よりも低下させた。７日目に添加した０．３ｍＭの酪酸塩によって、１７日目の力価は２５６１ｇ／Ｌとなり、対照よりも１０％増加した。この力価は、抗ＩＬ−１８プロセスにおいて達成された最高力価であった。
（実施例４．４）
ＳＲ−３７２中で培養した抗ＩＬ−１８産生ＣＨＯ細胞系の増殖及び生産性に対するＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、８０ｍＭ）の効果
Ｎ−アセチルシステインは、ほ乳動物細胞を細胞死から保護することができる。Ｎ−アセチルシステインは、抗酸化剤として、活性酸素種を直接減少させることができる。Ｎ−アセチルシステインは、脱アセチルによって、システインに転化され、細胞内グルタチオンレベルを増加させ得る。グルタチオンは、活性酸素種を捕捉することができ、過酸化水素から水への還元における基質として役立つ。
この実施例では、抗ＩＬ−１８の力価を増加させるＮ−アセチルシステインの効果を実証する。実験を有効体積１８０ｍＬの２５０ｍＬスピナーフラスコ中で実施した。培地はＳＲ−３７２であった。実施例４．２に記載のように、実験前に細胞をＳＲ−３７２における増殖に前適応させた。撹拌培養条件を「スピナーフラスコ中で実施した実験の培養条件」で上述したように適用した。
加熱撹拌プレート上でＮ−アセチルシステイン１６．３２ｇをＭｉｌｌｉＱ水１００ｍＬに溶解させることによって、１Ｍ Ｎ−アセチルシステイン原液を調製した。原液を０．２２μｍフィルターに通してろ過滅菌した。実験開始の１日前に、Ｎ−アセチルシステインをＳＲ−３７２に添加して、濃度０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ及び８０ｍＭとした。「スピナーフラスコ中で実施した実験の培養条件」で上述したように、ＣＨＯ抗ＩＬ−１８維持培養から得られた細胞の遠心分離によって実験を開始した。各撹拌培養を、それぞれの生存度が５０％未満になったときに終了した。
細胞増殖は、Ｎ−アセチルシステイン濃度２０ｍＭ、４０ｍＭ及び８０ｍＭでは不可能であった。表４１及び表４２は、０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン及び１０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン中で増殖した細胞を用いた、培養時間にわたるそれぞれ生細胞密度及び生存度の比較である。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
表４１（上）：培養時間にわたる生細胞密度
表４２（上）：培養時間にわたる生存度
対照培養（Ｎ−アセチルシステインなし）は培養時間１１日目で終了したのに対して、１０ｍＭ Ｎ−アセチルシステインを用いた培養は１６日目まで延長することができた。初期に、１０ｍＭ Ｎ−アセチルシステインは細胞増殖及び生存度に影響を及ぼし、３日目まで生存度を減少させた。次いで、生存度は増加し始めた。１０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン中で増殖した培養物の最大細胞密度は、対照よりも低かった。表４３は、Ｎ−アセチルシステインによる最終抗ＩＬ−１８力価の増加を示す。
Figure 2013230151
表４３（上）：培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価
対照培養物の平均最終力価は２４３．２ｍｇ／Ｌであり、１０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン中で増殖した培養物の平均最終力価は４１８ｍｇ／Ｌであった。これは、対照に比較して７２％の増加であった。
（実施例４．５）
ＳＲ−３７２中で培養した抗ＩＬ−１８産生ＣＨＯ細胞系の増殖及び生産性に対するＮ−アセチルシステイン（１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭ）の効果
実施例４．４に記載のように、０日目に添加した濃度１０ｍＭのＮ−アセチルシステインは、培養時間を延長し、最終力価を増加させ得る。しかし、この濃度において、細胞生存度は最初減少した。実施例４．４の結果に基づいて、実施例４．４で試験したＮ−アセチルシステイン濃度の１／１０で実験を設計した。このスピナーフラスコ実験条件は、実施例４．４と同じであった。Ｎ−アセチルシステインを濃度０ｍＭ（対照）、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ及び８ｍＭで添加した。
表４４は培養時間にわたる生細胞密度であり、表４５は培養時間にわたる生存度である。
Figure 2013230151
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表４４（上）：培養時間にわたる生細胞密度
Figure 2013230151
Figure 2013230151
表４５（上）：培養時間にわたる生存度
対照培養物（０ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン）は、培養時間１０日後に終了した。Ｎ−アセチルシステインは、培養寿命を延長することができた。８ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン中で増殖した培養物は、培養１４日後に終了した。Ｎ−アセチルシステイン中で増殖した培養物は、最大細胞密度が対照よりも低かった。
表４６は、最終抗ＩＬ−１８力価に対するＮ−アセチルシステインの効果である。
Figure 2013230151
Figure 2013230151
表４６（上）：培養時間にわたる抗ＩＬ−１８力価
対照培養物の平均最終抗ＩＬ−１８力価は２４５ｍｇ／Ｌであった（実施例４．４の２４３ｍｇ／Ｌに極めて類似）。８ｍＭ Ｎ−アセチルシステイン中で増殖した培養物の最終抗ＩＬ−１８力価は４８１ｍｇ／Ｌであった。これは、対照に比較して９６％の増加である。
均等物
当業者は、本明細書に記載した本発明の具体的実施形態の多数の均等形態を、せいぜい定常的な実験法によって、認識し、又は確認することができる。かかる均等形態も、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。本願を通して引用するすべての参考文献、特許及び特許出願公報の内容を参照により本明細書に組み入れる。

Claims (233)

  1. Ａ部、Ｂ部及びＣ部を含み、
    ａ）Ａ部は、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地から本質的になり、
    ｂ）Ｂ部は無機鉄源から本質的になり、
    ｃ）Ｃ部は、組換え増殖因子、緩衝剤、重量オスモル濃度調節剤、エネルギー源、及び少なくとも２種類の非動物加水分解物を含む、
    無血清細胞培地。
  2. Ａ部が、非鉄（ＩＩ）金属イオン、ビタミン、又は両方の組合せを更に含む、請求項１に記載の細胞培地。
  3. Ｂ部の無機鉄源がクエン酸鉄（ＩＩＩ）である、請求項１に記載の細胞培地。
  4. 最終溶液濃度約１２２．５ｍｇ／Ｌ又は０．５ｍＭのクエン酸鉄（ＩＩＩ）を含む、請求項３に記載の細胞培地。
  5. Ｃ部の組換え増殖因子が、インスリン又は組換え類似体ＩＧＦ−１、及びインスリンとＩＧＦ−１の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の細胞培地。
  6. 約４ｍｇ／Ｌから１３ｍｇ／Ｌのインスリン又はその組換え類似体を含む、請求項５に記載の細胞培地。
  7. 改変基本培地から除外される緩衝剤がＨＥＰＥＳ緩衝剤である、請求項１に記載の細胞培地。
  8. Ｃ部の緩衝剤が、リン酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ及び炭酸水素ナトリウムを含む、請求項１に記載の細胞培地。
  9. 約１．６ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを含む、請求項８に記載の細胞培地。
  10. 約１．８ｇ／Ｌ ＨＥＰＥＳを含む、請求項８に記載の細胞培地。
  11. リン酸緩衝剤が、約０．０１から０．５ｇ／Ｌのリン酸ナトリウム及びリン酸水素ナトリウムを含む、請求項８に記載の細胞培地。
  12. Ｃ部が、アスパラギン、グルタミン、又はグルタミンとアスパラギンを更に含む、請求項１に記載の細胞培地。
  13. Ｃ部の重量オスモル濃度調節剤がＮａＣｌである、請求項１に記載の細胞培地。
  14. 約１．０から６．５ｇ／ＬのＮａＣｌを含む、請求項１３に記載の細胞培地。
  15. Ｃ部のエネルギー源が単糖である、請求項１に記載の細胞培地。
  16. 単糖が、グルコース、マルトース、マンノース、ガラクトース及びフルクトースからなる群から選択される、請求項１５に記載の細胞培地。
  17. グルコースがＤ−グルコースである、請求項１６に記載の細胞培地。
  18. 約７．０ｇ／Ｌ以下のグルコースを含む、請求項１７に記載の細胞培地。
  19. Ｃ部の少なくとも２種類の非動物系加水分解物が、植物系加水分解物、及び動物系でも植物系でもない加水分解物である、請求項１に記載の細胞培地。
  20. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項１９に記載の細胞培地。
  21. 動物系でも植物系でもない加水分解物が酵母系加水分解物である、請求項１９に記載の細胞培地。
  22. メトトレキサートを更に含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞培地。
  23. 約１００ｎＭから５０００ｎＭのメトトレキサートを含む、請求項２２に記載の細胞培地。
  24. 細胞保護剤又は界面活性剤を更に含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞培地。
  25. 界面活性剤がメチルセルロース又はＰｌｕｒｏｎｉｃポリオールである、請求項２４に記載の細胞培地。
  26. ＰｌｕｒｏｎｉｃポリオールがＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８である、請求項２５に記載の細胞培地。
  27. 約１．０ｇ／Ｌ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８を含む、請求項２６に記載の細胞培地。
  28. Ｌ−グルタミンを更に含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞培地。
  29. ｐＨが７．１から７．３の範囲である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞培地。
  30. 重量オスモル濃度が３２０から４５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞培地。
  31. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞培地中でほ乳動物細胞を培養することを含む、タンパク質を製造する方法。
  32. ほ乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. タンパク質が抗体である、請求項３１又は３２に記載の方法。
  34. 抗体が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. ａ）基本培地、
    ｂ）約８−１２ｍｌ／ｋｇ又は１１６−１２６ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約２−６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約２−５ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１−０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１−３ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約０．０１−０．０５ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｈ）約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び
    ｉ）約１．０−３．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物
    を含む、無血清細胞培地。
  36. ａ）基本培地、
    ｂ）約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約４．０ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約３．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．２９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約０．０３ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｈ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び
    ｉ）約２．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物
    を含む、請求項３５に記載の細胞培地。
  37. 約２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを更に含む、請求項３５又は３６に記載の細胞培地。
  38. ａ）請求項３５又は３６に記載の培地中で、タンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）タンパク質が製造されるように、（ａ）の培養物を細胞培養産生培地に移送すること
    を含む、タンパク質を製造する方法。
  39. タンパク質を細胞培養産生培地から単離することを更に含む、請求項３８に記載の方法。
  40. タンパク質が抗体である、請求項３８に記載の方法。
  41. 抗体がＤ２Ｅ７（アダリムマブ）である、請求項４０に記載の方法。
  42. ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．５から０．７ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約６０から７０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、無血清細胞培養産生培地。
  43. 細胞培地が、
    ａ）約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｆ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｇ）約２．４から２．５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｈ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｉ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｊ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｌ）約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項４２に記載の細胞培養産生培地。
  44. 約７．１０から７．２０のｐＨを有する、請求項４２又は４３に記載の細胞培養産生培地。
  45. 約３７３から４０３ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項４２又は４３に記載の細胞培養産生培地。
  46. ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約３から５ｍＬ／ｋｇ又は６から８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約０．４から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、
    ｍ）約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｎ）約２から４ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、無血清細胞培地。
  47. 細胞培地が、
    ａ）約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／ｋｇクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．８から０．９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｆ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｇ）約２．６から２．７ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｈ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｉ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｊ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、
    ｌ）約４．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約２．６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項４６に記載の細胞培地。
  48. 約２．５０ｍＬ／ｋｇメトトレキサートを更に含む、請求項４２から２７のいずれか一項に記載の細胞培地。
  49. 請求項４２から４７のいずれか一項に記載の細胞培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養することを含む、タンパク質を製造する方法。
  50. ほ乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項４９に記載の方法。
  51. タンパク質が抗体である、請求項４９に記載の方法。
  52. 抗体が抗ＴＮＦα抗体又は抗ＥＰＯ−Ｒ抗体である、請求項５１に記載の方法。
  53. 抗ＴＮＦα抗体が完全ヒト抗ＴＮＦα抗体である、請求項５２に記載の方法。
  54. 完全ヒト抗ＴＮＦα抗体がＤ２Ｅ７（アダリムマブ）である、請求項５３に記載の方法。
  55. ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地、
    ｂ）約８から１０ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約３から５ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．８から０．９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約０．３から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、
    ｇ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｈ）約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｉ）約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｊ）約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｋ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約０．１から１．０ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｍ）約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｎ）約２から４ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、無血清細胞培地。
  56. ａ）約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．８７から０．８８ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、
    ｆ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約２．６７から２．６８ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４４・７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約４．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約２．６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項５５に記載の細胞培地。
  57. メトトレキサートを更に含む、請求項５５又は５６に記載の細胞培地。
  58. ａ）基本細胞増殖培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約２から６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約１５０から２５０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１から０．５ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、及び
    ｇ）約５から１５ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物
    を含む、無血清細胞培地。
  59. ａ）約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約２００ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．２９から０．３０ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、及び
    ｆ）約１１ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物
    を含む、請求項５８に記載の細胞培地。
  60. メトトレキサートを更に含む、請求項５８又は５９に記載の細胞培地。
  61. 請求項５５から６０のいずれか一項に記載の細胞培地中で、タンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養することを含む、タンパク質を製造する方法。
  62. タンパク質が抗体である、請求項６１に記載の方法。
  63. ほ乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６２に記載の方法。
  64. 核酸が完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体をコードする、請求項６３に記載の方法。
  65. 完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体がＡＢＴ−８７４である、請求項６４に記載の方法。
  66. ａ）基本細胞増殖培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約２から６ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約１から３ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、及び
    ｇ）約１から４ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物
    を含む、無血清細胞培地。
  67. ａ）約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約１．５ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．２９から０．３０ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、及び
    ｆ）約２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物
    を含む、請求項６６に記載の細胞培地。
  68. メトトレキサートを更に含む、請求項６６又は６７に記載の細胞培地。
  69. 約７．１０から７．３０のｐＨを有する、請求項６６又は６７に記載の細胞培地。
  70. 約３００から３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項６６又は６７に記載の細胞培地。
  71. 少なくとも８ｇ／ｋｇの酵母系加水分解物を含む、請求項６６又は６７に記載の細胞培地。
  72. 請求項６２から６５のいずれか一項に記載の細胞培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養することを含む、タンパク質を製造する方法。
  73. タンパク質が抗体である、請求項７２に記載の方法。
  74. ほ乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項７２に記載の方法。
  75. 核酸が抗ＩＬ−１２抗体又は抗ＥＰＯ−Ｒ抗体をコードする、請求項７２に記載の方法。
  76. 完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体がＡＢＴ−８７４である、請求項７５に記載の方法。
  77. ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約２．５から４．５ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．５から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、
    ｇ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｈ）約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｉ）約１から４ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｊ）約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｋ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約０．１から１．０ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｍ）約２から６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｎ）約２から６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、細胞培地。
  78. ａ）約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約３．８から３．９ｍＬ／ｋｇ又は７．８ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．８７から０．８８ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約０．４５ｇ／ｋｇ Ｌ−アスパラギン一水和物、
    ｆ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約２．６７ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約４．０ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約２．６ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項７７に記載の細胞培地。
  79. 約７．１０から７．２０のｐＨを有する、請求項７７又は７８に記載の細胞培地。
  80. 約３７３から４０３ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項７７又は７８に記載の細胞培地。
  81. ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを除去するように改変された、改変基本培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１２０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約１から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約０．５から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約６から８ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、細胞培養産生培地。
  82. ａ）約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｆ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｇ）約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｈ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｉ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｊ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｌ）約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項８１に記載の細胞培養産生培地。
  83. 約７．１０から７．２０のｐＨを有する、請求項８０又は８１に記載の細胞培養産生培地。
  84. 約３７３から４０３ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項８０又は８１に記載の細胞培養産生培地。
  85. ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１１０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１１から１５ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約１から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約１２から１６ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約８から１０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、細胞培養産生培地。
  86. ａ）約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｆ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｇ）約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｈ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｉ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、
    ｊ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約１４．２から１４．３ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｌ）約９．２から９．３ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項８５に記載の細胞培養産生培地。
  87. メトトレキサートを更に含む、請求項８１から８６のいずれか一項に記載の細胞培養産生培地。
  88. 請求項８１から８６のいずれか一項に記載の細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養することを含む、抗体を製造する方法。
  89. ほ乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８８に記載の方法。
  90. 核酸が抗ＩＬ−１８抗体をコードする、請求項８８に記載の方法。
  91. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項３５、３６、４２、４３、４６、４７、５５、５６、７７、７８、８１、８２、８５又は８６のいずれか一項に記載の細胞培地。
  92. 請求項１から３０、３５から３７、４２から４８、５５から６０、６６から７１、及び８１から８７のいずれか一項に記載の細胞培地中のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
  93. タンパク質が製造されるように、
    ａ）細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、タンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）ある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによって、ほ乳動物細胞を培養すること
    を含み、
    加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、
    タンパク質を製造する流加培養法。
  94. 基本濃縮溶液が高濃度基本培地を含む、請求項９３に記載の方法。
  95. 基本濃縮溶液が、基本培地、アスパラギン及びグルコースを含む、請求項９３に記載の方法。
  96. 基本培地がＰＦ ＣＨＯである、請求項９４又は９５に記載の方法。
  97. ほ乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項９３から９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. タンパク質が抗体である、請求項９３から９６のいずれか一項に記載の方法。
  99. 抗体が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法。
  100. 加水分解物濃縮溶液が、植物由来でも動物由来でもない第１の加水分解物と、第２の植物系加水分解物とを含む、請求項９３から９６のいずれか一項に記載の方法。
  101. 植物由来でも動物由来でもない加水分解物、及び植物系加水分解物が、酵母系加水分解物である、請求項１００に記載の方法。
  102. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項１０１に記載の方法。
  103. 抗ＴＮＦα抗体が製造されるように、
    ａ）細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、抗ＴＮＦα抗体をコードする核酸を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養すること、及び
    ｂ）ある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによって、ＣＨＯ細胞を培養すること
    を含み、
    基本濃縮溶液が基本培地、アスパラギン及びグルコースを含み、
    加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、
    抗ＴＮＦα抗体を製造する流加培養法。
  104. 抗ＴＮＦα抗体が製造されるように、
    ａ）少なくとも２．０ｇ／Ｌのグルコースを含む細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、抗ＴＮＦα抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞を培養すること（グルコース濃度は、少なくとも２．０ｇ／Ｌのグルコース濃度を維持するのに必要なグルコースを細胞培養産生培地に添加することによって調節される。）、及び
    ｂ）ある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによって、ＣＨＯ細胞を培養すること
    を含み、
    基本濃縮溶液が基本培地、アスパラギン及びグルコースを含み、
    加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、
    抗ＴＮＦα抗体を製造する流加培養法。
  105. 抗ＴＮＦα抗体を回収することを更に含む、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  106. 細胞培養物が約３２から３８℃の温度で培養される、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  107. 培養温度が約３５℃である、請求項１０６に記載の方法。
  108. 細胞培養産生培地が溶存酸素２０から６５％で維持される、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  109. 細胞培養産生培地が溶存酸素約３０％で維持される、請求項１０８に記載の方法。
  110. 細胞培養産生培地の重量オスモル濃度が、培養を通して５００ｍＯｓｍ以下に維持される、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  111. 加水分解物濃縮溶液が、植物由来でも動物由来でもない第１の加水分解物と、第２の植物系加水分解物とを含む、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  112. 植物由来でも動物由来でもない加水分解物、及び植物系加水分解物が、酵母系加水分解物である、請求項１１１に記載の方法。
  113. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項１１２に記載の方法。
  114. 加水分解物濃縮溶液が、約５０−２８０ｇ／ｋｇのダイズ系加水分解物と、約７５−３００ｇ／ｋｇの酵母系加水分解物とから本質的になる、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  115. 基本培地がＰＦ ＣＨＯである、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  116. 基本濃縮溶液が約９．０から１０．５のｐＨを有する、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  117. 期間が約９から１５日間である、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. 期間が約１２日間である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 基本濃縮溶液が、期間の以下の日、すなわち４日目、６日目、９日目及び１１日目の少なくとも１日に細胞培養産生培地に添加される、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載の方法。
  120. 加水分解物濃縮溶液が、期間の４日目、７日目、又は４日目と７日目に細胞培養産生培地に添加される、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載の方法。
  121. 細胞培養産生培地のｐＨをｐＨ線形勾配に従って調節することを更に含み、ｐＨ線形勾配が約７．１から７．２のｐＨから出発し、約６．９の最終ｐＨである、請求項１０３から１１６のいずれか一項に記載の方法。
  122. ｐＨ線形勾配が少なくとも約２４時間調節される、請求項１２１に記載の方法。
  123. ｐＨ線形勾配が少なくとも約４８時間調節される、請求項１２１に記載の方法。
  124. ｐＨ線形勾配が約７２時間調節される、請求項１２１に記載の方法。
  125. 細胞培養産生培地が、
    ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地、
    ｂ）約８から１０ｍｌ／ｋｇ又は１１０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約４から８ｍＬ／ｋｇ又は１０から１４ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から３ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１から３ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．１から０．１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約８から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約６から８ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項１０３又は１０４に記載の方法。
  126. 細胞培養産生培地が、
    ａ）約１０．０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約６．０ｍＬ／ｋｇ又は１２ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｆ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｇ）約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｈ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｉ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、
    ｊ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｌ）約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項１２５に記載の方法。
  127. ほ乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１０３から１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 細胞培養物が大規模細胞培養物である、請求項１０３から１２６のいずれか一項に記載の方法。
  129. 大規模細胞培養物が約１０Ｌを超える、請求項１２８に記載の方法。
  130. 大規模細胞培養物が１３Ｌである、請求項１２８に記載の方法。
  131. 抗ＴＮＦα抗体が完全ヒト抗ＴＮＦα抗体である、請求項１０３から１２６のいずれか一項に記載の方法。
  132. 抗ＴＮＦα抗体がアダリムマブである、請求項１３１に記載の方法。
  133. 抗ＩＬ１２抗体が製造されるように、
    ａ）細胞培養産生培地を含む細胞培養物中で、抗体をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞を培養すること、
    ｂ）ある期間中、加水分解物濃縮溶液及び基本濃縮溶液を細胞培養物に添加することによって、ＣＨＯ細胞を培養すること
    を含み、
    基本濃縮溶液が基本培地、アスパラギン及びグルコースを含み、
    加水分解物濃縮溶液が少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む、
    抗ＩＬ１２抗体を製造する流加培養法。
  134. 加水分解物濃縮溶液がグルコースを更に含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. 抗ＩＬ１２抗体を回収することを更に含む、請求項１３３に記載の方法。
  136. 細胞培養物が約３２から３８℃の温度で培養される、請求項１３３に記載の方法。
  137. 培養温度が約３３℃である、請求項１３３に記載の方法。
  138. 細胞培養産生培地が溶存酸素約２０−６５％で維持される、請求項１３３に記載の方法。
  139. 細胞培養産生培地が溶存酸素約４０％で維持される、請求項１３８に記載の方法。
  140. 細胞培養産生培地が約６．７から７．２のｐＨを有する、請求項１３３に記載の方法。
  141. 加水分解物濃縮溶液が、植物由来でも動物由来でもない加水分解物と植物系加水分解物とを含む、請求項１３３に記載の方法。
  142. 植物由来でも動物由来でもない加水分解物が酵母系加水分解物である、請求項１４１に記載の方法。
  143. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項１４２に記載の方法。
  144. 加水分解物濃縮溶液が、約５０−２２５ｇ／ｋｇのダイズ系加水分解物、約７５−３００ｇ／ｋｇの酵母系加水分解物、及び約２から３ｇ／Ｌグルコースから本質的になる、請求項１３３に記載の方法。
  145. 基本濃縮溶液が、基本培地、アスパラギン及びグルコースを含む、請求項１３３に記載の方法。
  146. 基本濃縮溶液が、約９．７のｐＨを有し、約１４００から１５００ｍＯｓｍの重量オスモル濃度を有する、請求項１４５に記載の方法。
  147. 基本濃縮溶液中の基本培地がＰＦ ＣＨＯである、請求項１４５に記載の方法。
  148. 期間が１４−１５日間である、請求項１３３から１４７のいずれか一項に記載の方法。
  149. 基本濃縮溶液が、期間の５日目から１日おきに細胞培養産生培地に添加される、請求項１３３から１４７のいずれか一項に記載の方法。
  150. 加水分解物濃縮溶液が、期間の６日目から毎日、細胞培養産生培地に添加される、請求項１３３から１４７のいずれか一項に記載の方法。
  151. 基本濃縮溶液及び加水分解物濃縮溶液が、期間の５日目から毎日、細胞培養産生培地に添加される、請求項１３３から１４７のいずれか一項に記載の方法。
  152. 細胞培養産生培地が、
    ａ）以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤及び単糖グルコースを含まない、改変基本培地、
    ｂ）約８から１２ｍｌ／ｋｇ又は１１０から１３０ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｃ）約５から８ｍＬ／ｋｇ又は１１から１５ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｄ）約５から９ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｅ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｆ）約１から２ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｇ）約１から２ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｈ）約２から３ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｉ）約０．１から２ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｊ）約０．０１から０．１ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約０．１から１ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、
    ｌ）約６から１２ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｍ）約６から８ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項１３３から１４７のいずれか一項に記載の方法。
  153. 細胞培養産生培地が、
    ａ）約１０ｍｌ／ｋｇ又は１２２．４５ｍｇ／Ｌクエン酸鉄（ＩＩＩ）、
    ｂ）約６．５ｍＬ／ｋｇ又は１３ｍｇ／ｋｇ組換えヒトインスリン、
    ｃ）約７．０ｇ／ｋｇ無水グルコース、
    ｄ）約０．５８から０．５９ｇ／ｋｇ Ｌ−グルタミン、
    ｅ）約１．６ｇ／ｋｇ炭酸水素ナトリウム、
    ｆ）約１．８ｇ／ｋｇ ＨＥＰＥＳ、
    ｇ）約２．４５ｇ／ｋｇ ＮａＣｌ、
    ｈ）約１．０ｇ／ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８、
    ｉ）約０．０３から０．０４ｇ／ｋｇ ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ、
    ｊ）約０．４３から０．４４ｇ／ｋｇ Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、
    ｋ）約１０．７ｇ／ｋｇ酵母系加水分解物、及び
    ｌ）約６．９から７．０ｇ／ｋｇ植物系加水分解物
    を含む、請求項１５２に記載の方法。
  154. 細胞培養物が大規模細胞培養物である、請求項１３３から１５３のいずれか一項に記載の方法。
  155. 大規模細胞培養物が１０Ｌを超える、請求項１５４に記載の方法。
  156. 大規模細胞培養物が約１３Ｌである、請求項１５４に記載の方法。
  157. 抗ＩＬ１２抗体が完全ヒト抗ＩＬ１２抗体である、請求項１３３から１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体がＡＢＴ−８７４である、請求項１５７に記載の方法。
  159. ａ）グルコース、
    ｂ）基本培地、
    ｃ）グルタミン以外のアミノ酸、及び
    ｄ）少なくとも２種類の非動物系加水分解物
    を含み、
    供給溶液が約６．０から８．０のｐＨを有する、
    組合せ供給溶液。
  160. 約１００から２５０ｇ／ｋｇグルコースを含む、請求項１５９に記載の組合せ供給溶液。
  161. アミノ酸がアスパラギンである、請求項１５９に記載の組合せ供給溶液。
  162. アスパラギン約１．０から１５．０ｇを含む、請求項１６０に記載の組合せ供給溶液。
  163. 約３．０から５．０ｇ／ｋｇアスパラギンを含む、請求項１６１に記載の組合せ供給溶液。
  164. 少なくとも２種類の非動物系加水分解物が、植物系加水分解物、及び動物系でも植物系でもない加水分解物である、請求項１５９に記載の組合せ供給溶液。
  165. 動物系でも植物系でもない加水分解物が酵母系加水分解物である、請求項１６４に記載の組合せ供給溶液。
  166. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項１６４に記載の組合せ供給溶液。
  167. 基本培地がＰＦ−ＣＨＯ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地である、請求項１５９に記載の組合せ供給溶液。
  168. 基本細胞培地が、改変基本培地であり、以下の成分、すなわち炭酸水素ナトリウム、緩衝剤、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、重量オスモル濃度調節剤、界面活性剤、グルタミン及びグルコースを含まない、請求項１５９に記載の組合せ供給溶液。
  169. 約１５ＮＴＵ未満の濁度を更に有する、請求項１５９から１６８のいずれか一項に記載の組合せ供給溶液。
  170. 請求項１５９から１６８のいずれか一項に記載の組合せ供給溶液を添加することを含む、細胞培養産生培地の定常グルコースレベルを維持する方法。
  171. ａ）グルコースと基本細胞培地を組み合わせて溶液にすること、
    ｂ）ａ）の溶液のｐＨを約９．５から１０．５に調節すること、
    ｃ）少なくとも２種類の非動物系加水分解物をｂ）の溶液に添加すること、及び
    ｄ）組合せ供給溶液が約６．５から７．５のｐＨを有するように、ｃ）の溶液のｐＨを調節すること
    を含む、基本培地、グルコース及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む組合せ供給溶液を製造する方法。
  172. 段階ｃ）が、動物系でも植物系でもない第１の加水分解物と、第２の植物系加水分解物とを添加することを含む、請求項１７１に記載の方法。
  173. 動物系でも植物系でもない加水分解物が酵母系加水分解物である、請求項１７２に記載の方法。
  174. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項１７２に記載の方法。
  175. 少なくとも約１．５ｇ／Ｌの抗体が製造されるように、
    ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）約６．７から７．２のｐＨを有する組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、グルコース、基本細胞培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む。）
    を含む、ほ乳動物細胞培養物から少なくとも約１．５ｇ／Ｌの抗体を製造する方法。
  176. 組合せ供給溶液が約１００から２５０ｇ／ｋｇグルコースを含む、請求項１７５に記載の方法。
  177. 少なくとも２ｇ／Ｌの抗体が製造される、請求項１７５に記載の方法。
  178. 少なくとも４ｇ／Ｌの抗体が製造される、請求項１７５に記載の方法。
  179. 少なくとも５ｇ／Ｌの抗体が製造される、請求項１７５に記載の方法。
  180. 約６ｇ／Ｌの抗体が製造される、請求項１７５に記載の方法。
  181. 製造される抗体の力価が、段階ｂ）を含まずに段階ａ）によって培養された対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも５０％高くなるように、
    ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）約６．７から７．２のｐＨを有する組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、グルコース、基本細胞培地、グルタミン以外のアミノ酸、及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む。）
    を含む、ほ乳動物細胞培養物から産生される抗体の力価を増加させる方法。
  182. 製造される抗体の力価が対照よりも少なくとも１００％高い、請求項１８１に記載の方法。
  183. 製造される抗体の力価が対照よりも少なくとも１５０％高い、請求項１８１に記載の方法。
  184. 細胞密度が少なくとも２．０×１０６細胞／ｍＬに到達したときに、組合せ供給溶液が添加される、請求項１７５から１８３のいずれか一項に記載の方法。
  185. 細胞密度が約３．５×１０６細胞／ｍＬに到達したときに、組合せ供給溶液が添加される、請求項１７５から１８３のいずれか一項に記載の方法。
  186. 抗体が製造されるように、
    ａ）細胞培養産生培地中で、タンパク質をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）細胞培養産生培地中の代謝指標レベルを監視するフィードバック制御系を用いて、組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、フィードバック制御系によって決定される時点で細胞培養産生培地に添加される。）
    を含む、ほ乳動物細胞培養物中でタンパク質を製造する方法。
  187. ほ乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１８６に記載の方法。
  188. 代謝指標がグルコース又はグルタミンである、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
  189. 供給溶液が、グルコース、基本細胞培地、グルタミン以外のアミノ酸及び少なくとも２種類の非動物系加水分解物を含む組合せ供給溶液である、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
  190. タンパク質が抗体である、請求項１８６又は１８７に記載の方法。
  191. 抗体が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体からなる群から選択される、請求項１９０に記載の方法。
  192. 抗体が少なくとも１．５ｇ／Ｌの力価で製造される、請求項１９０又は１９１に記載の方法。
  193. 抗体が少なくとも２ｇ／Ｌの力価で製造される、請求項１９０又は１９１に記載の方法。
  194. 組合せ供給溶液が約３．０から１２．５ｇ／ｋｇアスパラギンを含む、請求項１７５から１８５及び１８９のいずれか一項に記載の方法。
  195. 少なくとも２種類の非動物系加水分解物が、植物系加水分解物、及び動物系でも植物系でもない加水分解物を含む、請求項１７５から１８５及び１８９のいずれか一項に記載の方法。
  196. 動物系でも植物系でもない加水分解物が酵母系加水分解物である、請求項１９５に記載の方法。
  197. 植物系加水分解物がダイズ系加水分解物である、請求項１９５に記載の方法。
  198. 組合せ供給溶液が約１００から２００ｇ／ｋｇグルコースを含む、請求項１７５から１８５及び１８９のいずれか一項に記載の方法。
  199. グルコースレベルが約０．２５から２０．０ｇ／Ｌに維持されるように、細胞培地中のグルコースレベルを監視することを更に含む、請求項１７５から１８５及び１８９のいずれか一項に記載の方法。
  200. グルコースレベルが自動試料採取装置を用いて監視される、請求項１９９に記載の方法。
  201. 製造される抗体が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗Ｉｌ−１２抗体からなる群から選択される、請求項１７５から１８５のいずれか一項に記載の方法。
  202. 抗ＴＮＦα抗体がＤ２Ｅ７（アダリムマブ）である、請求項１９１又は２０１に記載の方法。
  203. 抗ＩＬ−１８抗体がＡＢＴ−３２５である、請求項１９１又は２０１に記載の方法。
  204. 抗ＩＬ−１２抗体がＡＢＴ−８７４である、請求項１９１又は２０１に記載の方法。
  205. 供給プロファイルが決定されるように、
    ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）細胞培養産生培地中の代謝指標を監視するフィードバック制御系を用いて、組合せ供給溶液を細胞培養産生培地に添加すること（組合せ供給溶液は、目標代謝指標設定値に適合するように細胞培養産生培地に添加される。）、及び
    ｃ）１日当たりに細胞培養産生培地に添加される組合せ供給溶液の量を決定すること
    を含む、ほ乳動物細胞培養物中でタンパク質を産生するための供給プロファイルを決定する方法。
  206. 代謝指標がグルコース又はグルタミンである、請求項２０５に記載の方法。
  207. 請求項２０５に記載の供給プロファイルに従って、組合せ供給溶液をほ乳動物細胞培養物に添加することを含む、ほ乳動物細胞培養物中でタンパク質を製造する流加培養法。
  208. 抗体が少なくとも１００ｍｇ／Ｌの力価で製造されるように、
    ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、
    ｂ）酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを細胞培地に添加すること（酪酸ナトリウムを約０．１ｍＭから１０ｍＭの最終濃度まで添加し、Ｎ−アセチルシステインを約１ｍＭから８０ｍＭの最終濃度まで添加する。）
    を含む、抗体の力価が少なくとも１００ｍｇ／Ｌであるように、ほ乳動物細胞培養物中で抗体を製造する方法。
  209. 抗体価が少なくとも１５０ｍｇ／Ｌである、請求項２０８に記載の方法。
  210. 抗体価が少なくとも２００ｍｇ／Ｌである、請求項２０８に記載の方法。
  211. 抗体価が少なくとも２５０ｍｇ／Ｌである、請求項２０８に記載の方法。
  212. 抗体価が少なくとも３００ｍｇ／Ｌである、請求項２０８に記載の方法。
  213. 抗体価が少なくとも４００ｍｇ／Ｌである、請求項２０８に記載の方法。
  214. 抗体の力価が対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも１０％高くなるように（対照ほ乳動物細胞培養は、段階ａ）を含むが、段階ｂ）を含まない。）、
    ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せを細胞培地に添加すること（酪酸ナトリウムを約０．１ｍＭから１０ｍＭの最終濃度まで添加し、Ｎ−アセチルシステインを約１ｍＭから８０ｍＭの最終濃度まで添加する。）
    を含む、抗体の力価が対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも１０％高くなるように、ほ乳動物細胞培養物中で抗体を製造する方法。
  215. ほ乳動物細胞培養物の抗体価が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも２９％改善される、請求項２１４に記載の方法。
  216. ほ乳動物細胞培養物の抗体価が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも４０％改善される、請求項２１４に記載の方法。
  217. ほ乳動物細胞培養物の抗体価が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも７０％改善される、請求項２１４に記載の方法。
  218. ほ乳動物細胞培養物の抗体価が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも９０％高い、請求項２１４に記載の方法。
  219. 酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せが、ほ乳動物細胞培養物の増殖期中に、ほ乳動物細胞培養物に添加される、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  220. 酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せが、培養時間の４日目から７日目にほ乳動物細胞培養物に添加される、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  221. 酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルシステイン又はこれらの組合せが、培養時間の０日目にほ乳動物細胞培養物に添加される、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  222. 酪酸ナトリウムの最終濃度が約０．１ｍＭから１０ｍＭである、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  223. 酪酸ナトリウムの最終濃度が約０．１ｍＭから８．０ｍＭである、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  224. 酪酸ナトリウムの最終濃度が、酪酸ナトリウムの約０．１ｍＭから３．０ｍＭである、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  225. Ｎ−アセチルシステインの最終濃度が約２０ｍＭから６０ｍＭである、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  226. Ｎ−アセチルシステインの最終濃度が約１０ｍＭである、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  227. Ｎ−アセチルシステインの最終濃度が約８ｍＭである、請求項２０８から２１８のいずれか一項に記載の方法。
  228. ほ乳動物細胞培養物の寿命が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも３５％延長されるように（対照ほ乳動物細胞培養は、段階ａ）を含むが、段階ｂ）を含まない。）、
    ａ）細胞培養産生培地中で、抗体をコードする核酸を含むほ乳動物細胞を培養すること、及び
    ｂ）約１ｍＭから８０ｍＭ Ｎ−アセチルシステインを細胞培地に添加すること
    を含む、ほ乳動物細胞培養物の寿命を対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも３５％延長する方法。
  229. ほ乳動物細胞培養物の寿命が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも約４５％延長される、請求項２２８に記載の方法。
  230. ほ乳動物細胞培養物の寿命が、対照ほ乳動物細胞培養物よりも少なくとも約５５％延長される、請求項２２８に記載の方法。
  231. 最終濃度約８ｍＭのＮ−アセチルシステインを細胞培養産生培地に添加することを含む、請求項２２８から２３０のいずれか一項に記載の方法。
  232. 抗体が、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗Ｉｌ−１２抗体からなる群から選択される、請求項２０８から２３１のいずれか一項に記載の方法。
  233. 抗ＩＬ−１８抗体がＡＢＴ−３２５である、請求項２３２に記載の方法。
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