CN103582700B - 新的蛋白质纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除病毒颗粒的工艺中通过在过滤之前将表面活性剂或非表面活性剂加入到水溶液中来减少超滤膜的结垢的方法。本发明也提供了通过将表面活性剂或非表面活性剂加入到蛋白质溶液中，来分离蛋白质聚集物或减少蛋白质聚集物形成的方法。

Description

新的蛋白质纯化方法
相关申请的交互引用
本发明要求2011年3月25日提交的美国临时申请系列号61/467,897的优先权，将所述临时申请以其整体并入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及蛋白质纯化领域。更特别地，本发明提供了在生物药物生产工艺中，减少蛋白质诱导的超滤膜结垢的新方法。
发明背景
在生物药物生产工艺中，特别地在基于多肽的药物来源于哺乳动物细胞培养物或者来源于完整生物的情况下，病毒是潜在的污染物。在许多情况下，存在灭活病毒污染物的化学或物理方法，但这些方法并非适用于所有病毒，并且在一些情况下，所述方法可能影响生物药物的活性。基于细小病毒（Parvoviruse）对化学和物理灭活剂的一般抗性，给去除细小病毒提出了特别的挑战。
防止细小病毒污染生物药物的当前方法包括在生产工艺期间使用膜过滤生物制品的进料流。细小病毒颗粒很小；例如一些细胞病毒小至23nm。因此，细小病毒滤器通常具有20nm的平均孔径。由于孔径小，所以这些滤器对蛋白质污垢极其敏感，所述蛋白质污垢导致在生产工艺期间频繁更换滤器，这显著地提高了工艺成本。减少小孔滤器的蛋白质污垢的方法包括使用预过滤器，例如离子交换滤器（美国专利号7,118,675；Bolton，GR等人2010Biotechnol.Prog.）或者用非离子表面活性剂预处理膜滤器（Fane，AG等人1985Desalination53：37-55；Jonsson，AS和Jonsson，B，1991J.Membrane Sci.56：49-76；Chen，V.等人1992J.Membrane Sci.67：249-261）。然而，已经证明，用这些方法获得的结果是不一致的、不可预测的，并且可能是无效的和/或成本过高。
除去除病毒外，还可将膜滤器用于去除生物药物中的蛋白质聚集物。例如，抗体的水溶液可能含有在施用给患者之前应当去除的抗体的聚集物，以避免可能的毒性反应。这些蛋白质聚集物造成了膜滤器结垢，并且减少了生物药物的总产率。
因此，存在用于过滤生物溶液的更好、更经济的方法的持续需求，以去除可能的病毒污垢物并减少蛋白质聚集物。本发明处理了这些需求，并提供了其他的益处。
将在本文中引用的全部参考文献，包括专利申请和出版物都以其整体并入本文作为参考。
发明概述
本发明提供了在从蛋白质的水溶液中去除病毒颗粒的工艺中通过在超滤前将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂直接加入到含水蛋白质进料流中来减少超滤膜结垢的方法。本方法提供了增强超滤膜的质量处理量和增加超滤膜的寿命的优点。此外，本发明提供了减少或者防止在蛋白质的水溶液中形成聚集物的方法。
在一个方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，该方法包括步骤a)将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中，和b)通过所述超滤膜过滤包含所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液，其中所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
在另一方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除病毒颗粒的工艺中增加超滤膜的过滤处理效率的方法，该方法包括这样的步骤：在通过所述超滤膜过滤所述水溶液之前，将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中，其中与所述表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中不存在的情况下相比，所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在增加了所述超滤膜的过滤处理效率。
在一个方面，本发明提供了在超滤进料流中分离多肽聚集物或者减少多肽聚集物形成的方法，所述超滤进料流包含含有至少一种蛋白质的水溶液，该方法包括将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中。在一些实施方案中，该方法还包括超滤步骤。
在一个方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，该方法包括步骤a)通过选自一层或多层吸附性厚度过滤器和一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜的设备过滤所述水溶液；b)将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中；和c)通过所述超滤膜过滤包含所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液，其中所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
在另一方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，该方法包括步骤a)将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中，b)通过选自一层或多层吸附性厚度过滤器和一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜的设备过滤所述水溶液；和c)通过所述超滤膜过滤包含所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液，其中表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
在上述发明的任一方面的一些实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。非离子表面活性剂的实例包括但不限于，聚山梨醇20、X-100、X-405、聚桂醇（Lauromacrogol）和聚山梨醇酯80。在上述发明的任一方面的一些实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇20。
在上述发明的任一方面的一些实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以1-10,000PPM的浓度加入到水溶液中。在一些实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以10-200PPM的浓度加入到水溶液中。
在上述发明的任一方面的一些实施方案中，超滤膜是能截留细小病毒的膜。在一些实施方案中，超滤膜具有小于约100nm或更小的孔径。在一些实施方案中，超滤膜具有约20nm或更小的孔径。在一些实施方案中，通过常规流过滤（normal flow filtration）进行过滤水溶液的步骤。
在上述发明的任一方面的一些实施方案中，水溶液中的蛋白质是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体或者人源化抗体。
在上述发明的任一方面的一些实施方案中，将表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少10%。在一些实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少50%。
在上述发明的任一方面的一些实施方案中，病毒颗粒是细小病毒颗粒。
附图简述
图1显示聚山梨醇20对包含抗-PDL1抗体的水溶液的超滤的影响。以0ppm(1)、20ppm(2)、50ppm(3)、70ppm(4)、100ppm(5)和1000ppm(6)，将聚山梨醇20加入到含抗体的含水进料流中。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图2显示聚山梨醇20对包含抗-VEGF抗体的水溶液的超滤的影响。以0ppm(1)、20ppm(2)、100ppm(3)、1000ppm(4)和10,000ppm(5)，将聚山梨醇20加入到含抗体的含水进料流中。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图3显示聚山梨醇20对包含抗-MUC16抗体的水溶液的超滤的影响。以0ppm(1)、20ppm(2)、100ppm(3)和1000ppm(4)，将聚山梨醇20加入到含抗体的含水进料流中。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图4显示无添加剂(1)、1000ppm聚山梨醇20(2)或1000ppmX-100(3)对包含抗-DR5抗体的水溶液的超滤的影响。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图5显示X-100对包含抗-PDL1抗体的水溶液的超滤的影响。以0ppm(1)、20ppm(2)、200ppm(3)、300ppm(4)和1000ppm(5)，将X-100加入到含抗体的含水进料流中。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图6显示X-100对包含抗-VEGF抗体的水溶液的超滤的影响。以0ppm(1)、300ppm(2)和1000ppm(3)，将X-100加入到含抗体的含水进料流中。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图7显示X-100对包含抗-MUC16抗体的水溶液的超滤的影响。以0ppm(1)、150ppm(2)、1000ppm(3)和2000ppm(4)，将X-100加入到含抗体的含水进料流中。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图8显示不组合或组合先前的预过滤步骤，聚山梨醇20或X-100对包含抗PDL1抗体的水溶液的超滤的影响。研究了以下情况，无表面活性剂或预过滤步骤(1)、使用Mustang阳离子交换预过滤器进行的预过滤(2)、1000ppm聚山梨醇20(3)、用Mustang阳离子交换预过滤器加上1000ppm聚山梨醇20进行的预过滤(4)、1000ppmX-100(5)，以及用Mustang阳离子交换预过滤器加上1000ppmX-100进行的预过滤(6)。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图9显示不组合或组合先前的预过滤步骤，聚山梨醇20或X-100对包含抗-VEGF抗体的水溶液的超滤的影响。研究了以下情况，无表面活性剂或预过滤步骤(1)、1000ppm聚山梨醇20(2)、1000ppmX-100(3)、用Mustang阳离子交换预过滤器进行的预过滤(4)、用Mustang阳离子交换预过滤器加上1000ppm聚山梨醇20进行的预过滤(5)和用Mustang阳离子交换预过滤器加上1000ppmX-100进行的预过滤(6)。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图10显示多种表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂对包含抗-PDL1抗体的水溶液的超滤的影响。研究了以下情况，无添加剂(1)、1000ppm辛基β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、1000ppm PEG6000(3)、用Mustang阳离子交换预过滤器进行的预过滤(4)、200mM L-精氨酸HCl(5)、1000ppmX-405(6)、1000ppm聚桂醇(35)(7)、1000ppm聚山梨醇20(8)或1000ppmX-100(9)。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图11显示多种表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂对包含抗-VEGF抗体的水溶液的超滤的影响。研究了以下情况，无添加剂(1)、1000ppmPEG8硬脂酸酯(2)、1000ppm葡聚糖LMW PEG6000(3)、1000ppmPEG20山梨聚糖(4)、1000ppm PEG8月桂酸酯(5)、1000ppm聚山梨醇酯80(6)、1000ppm聚山梨醇20(7)、1000ppm聚桂醇(35)(8)、用Mustang阳离子交换预过滤器进行的预过滤(9)或者1000ppmX-100(10)。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
图12显示在超滤抗-VEGF抗体的水溶液之前，用聚山梨醇20预处理超滤膜的影响。在一个样品中，用聚山梨醇20预处理超滤膜，但不将表面活性剂直接加入到含水原料中(2)。在另一样品中，将1000ppm聚山梨醇20直接加入到含水原料中，但不用表面活性剂预处理超滤膜(3)。在对照样品中，既不将表面活性剂直接加入到进料流中，也不用表面活性剂预处理细小病毒滤器(1)。将以g/m2表示的超滤膜（VF）的处理量对以磅/每平方英寸表示的跨膜压作图。
发明详述
本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除病毒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，其通过在用超滤膜过滤水溶液之前，将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中进行。本发明还产生了意外的发现：与过滤前用表面活性剂预处理超滤膜相比，将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂直接加入到水溶液中极大程度地减少了超滤膜的结垢。可以通过多种表面活性剂（例如但不限于聚山梨醇20和X-100）或者非表面活性剂、非离子剂（例如但不限于聚乙二醇、葡萄糖、精氨酸或某些甲基-或乙基-纤维素）实现超滤膜结垢的减少。在一些实施方案中，本发明提供了在从含水进料流中去除病毒颗粒的工艺中通过将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂直接加入到进料流中来增加超滤膜的处理量的方法。在一些实施方案中，本发明提供了在从含水进料流中去除病毒颗粒的工艺中通过将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂直接加入到进料流中来增加超滤膜的寿命的方法。
在本发明的一些方面，将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到系统中包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中，其中水溶液在超滤之前通过预过滤器。在一些实施方案中，在通过预过滤器之前，将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。在一些实施方案中，在通过预过滤器之后且在超滤之前，将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。
在另一方面，本发明提供了通过在超滤步骤之前，将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中，来分离超滤进料流中的蛋白质或多肽聚集物的方法。在另一方面，本发明提供了通过在超滤步骤之前，将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中，来减少超滤进料流中蛋白质或多肽聚集物形成的方法。在一些实施方案中，水溶液在超滤之前通过预过滤器。
定义
除非另外指出，本文中所使用的全部技术和科学术语的含义是本发明所属领域技术人员通常理解的那些含义。Singleton，等人，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,3rd ed.,John Wiley and Sons,NewYork(2002)，和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary ofBiology,Harper Perennial,N.Y.(1991)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般字典。应当理解，本发明并不限于所述的特定方法、步骤和试剂，因为他们是可以变化的。本领域技术人员应当理解，也可将与本文中所述的那些方法和物质相似的或者等同的任何方法和物质用于实践或测试本发明。
“超滤”是膜过滤的一种形式，其中流体静压力迫使液体压紧半透膜。截留了悬浮物和高分子量溶质，而水和低分子量溶质通过膜。在一些实例中，超滤膜具有1-100nm的孔径。术语“超滤膜”和“超滤滤器”可以互换使用。
“病毒截留滤器”、“病毒滤器”、“病毒膜”或“病毒截留膜”是一种类型的超滤滤器/膜，其用于基于大小从含病毒颗粒的水溶液中去除病毒。特别地，病毒截留膜具有足以截留目的病毒，同时允许单体蛋白质通过的孔径。
“细小病毒截留滤器”、“细胞病毒滤器”、“细小病毒膜”或“细小病毒截留膜”是一种类型的超滤滤器/膜，其用于基于大小从含细小病毒颗粒的水溶液中去除细小病毒。特别地，细小病毒截留膜孔径很小；例如，在一些情况下，20nm，以去除小病毒颗粒如直径小至23nm的细小病毒颗粒。
“表面活性剂”是含有疏水和亲水基团的化合物，通常（但并非必须）是有机化合物，因此在有机和水溶液中是微溶的（semi-soluble）。表面活性剂可以是非离子型的、阳离子型的或阴离子型的。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，指任意长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性的或者分支的，可以包含经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还包括已经经天然修饰或者通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述修饰例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操作或修饰如与标记组分缀合。该定义还包括例如，含有一个或多个氨基酸（包括例如，非天然氨基酸等）的类似物的多肽，以及本领域已知的其他修饰。如本文中所用，术语“多肽”和“蛋白质”具体地包括抗体。
术语“抗体”以其广义使用并具体地涵盖例如，单一的单克隆抗体（包括激动剂、拮抗剂和中和抗体）、具有多表位特异性的抗体组合物、多克隆抗体、单链抗体、免疫粘附素和只要显示出期望的生物学或免疫学活性的抗体的片段。在本文中，术语“免疫球蛋白”（Ig）与抗体可互换使用。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”指从基本上为均质性抗体的群体获得的抗体，即除可能存在较少量的有可能天然发生的突变外，包含群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，其针对单一的抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每一单克隆抗体针对抗原上单一的决定簇。除单克隆抗体的特异性外，它们的优势还在于，可以以不被其他抗体污染的方式来合成它们。不应将修饰语“单克隆”理解为需要通过任何特定的方法产生的抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通过Kohler等人,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备（参见例如，美国专利号4,816,567）。还可以使用例如Clackson等人,Nature,352:624-628(1991)和Marks等人,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述的技术，从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，以及此类抗体的片段，只要它们显示出期望的生物学活性，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或者属于特定抗体种类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源，而剩余链与来源于另一物种或者属于另一抗体种类或亚类的抗体中相应的序列相同或同源（参见美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)）。在本文中，目的嵌合抗体包括“灵源化的”抗体，其包含来源于非人灵长类动物（例如，旧大陆猴、猿等）的可变域抗原结合序列，以及人恒定区序列。
“完整”抗体是这样的抗体，其包含抗原结合位点，CL和至少重链恒定域，CH1、CH2和CH3。恒定域可以是天然的序列恒定域（例如，人天然序列恒定域）或者其氨基酸变体。优选地，完整抗体具有一个或多个效应子功能。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体（参见美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等人,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995]）；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文中所用，术语“单体”指多肽或蛋白质的单个单位。例如，在抗体的情况下，单体由两条重链和两条轻链组成；在单臂抗体的情况下，单体由一条重链和一条轻链组成。
如本文中所用，术语“聚合物”指多肽或多肽片段的任一种多聚体。例如，聚集物可以是二聚体、三聚体、四聚体或四聚体以上的多聚体。
如本文中所用，术语“病毒滤器污垢物”指具有与超滤膜相似的或者更大的孔径分布的任何大分子量颗粒或者高分子量物种（HMWS）。病毒滤器污垢物包括但不限于，可溶性高分子量多肽或蛋白质聚集物，以及可溶的和/或不溶的宿主细胞杂质聚集物（例如，CHOP）。
术语“跨膜压”指通过TMP[bar]=PF–Pf计算的从膜的进料侧至滤出液侧有差异的外加压力，其中是PF进料压，Pf是截留压，并且Pf是过滤压。
当用于超滤膜时，术语“增加的过滤处理效率”等指在用超滤膜过滤该水溶液之前，由于将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到含蛋白质的水溶液中，引起通过超滤膜的体积处理量增加的有益作用。
对于在本文中使用，除非另外明确指出，术语“一个”等的使用指一个或多个。
本文中，涉及“约”的数值或参数包括（并且描述）涉及该数值或参数自身的实施方案。例如，涉及“约X”包括“X”的描述。数值范围包括限定范围的数字。
应当理解，在本文中所述的方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”和“基本上由……组成”的方面或实施方案。
超滤膜
本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除病毒颗粒的工艺中减少超滤膜污垢的方法。在超滤之前，将一种或多种表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。然后，使水溶液通过超滤膜，以使病毒颗粒被超滤膜截留，并且使一种或多种蛋白质通过膜。例如，可以将该方法用于蛋白质和多肽治疗剂的工业规模生产。在去除蛋白质进料流中可能存在的任何病毒颗粒的工艺中，在超滤进料流之前，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到蛋白质进料流中，以减少滤器结垢。
可以由再生纤维素、聚醚砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺、聚偏氟乙烯（PVDF）等形成超滤膜。代表性超滤膜包括但不限于，膜、Pro膜、180膜、70膜、NFP膜、NFR膜、RetroporeTM膜、Virosart CPV膜、Planova75膜、Planova35膜、Planova20膜、Planova15N膜、VAG300膜、UltiporDVD膜、Ultipor DV50膜、Ultipor DV20膜和DVD Zeta Plus VRTM滤器。在一些实施方案中，超滤膜能去除细小病毒颗粒。在一些实施方案中，超滤膜是细小病毒截留膜。
超滤膜的孔径应当足够地小，以截留不期望的病毒颗粒，同时允许水溶液中一种或多种蛋白质通过膜。在本发明的一些实施方案中，超滤膜的孔径为10nm、10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm或200nm。在一些实施方案中，超滤膜的孔径为20nm或者少于20nm。
以截留分子量表征超滤膜，所述截留分子量表示超滤膜截留的最小蛋白质的平均分子量。例如，具有1000kD的截留分子量的超滤膜可以以80-90%的比率截留具有大于1000kD的分子量的大多数球形蛋白质，而具有小于1000kD的分子量的大多数球形蛋白质会通过超滤膜。在本发明的一些实施方案中，超滤膜的截留分子量在200kD至1000kD之间。在本发明的一些实施方案中，超滤膜具有200kD、300kD、400kD、500kD、600kD、700kD、900kD或1000kD的截留分子量。
可以用一种或多种超滤膜，通过死端（常规）流过滤（dead end(normal)flow filtration）（NFF）或者通过切向流过滤（TFF）实现过滤。在NFF中，进料流通过膜，并且大分子量物质被捕获在滤器中，而在另一端释放滤出液。在TFF中，大多数进料流切向通过滤器的表面，而不是进入滤器中。因此，在过滤工艺中，基本上洗去了滤饼，增加了过滤装置可以使用的时间。可以以筒（NFF）形式例如NFP病毒过滤器，或者以盒形式（对于TFF）例如盒提供任何过滤模式的超滤膜。在优选的实施方案中，过滤是常规流过滤。
在本发明方法中，可以使用一个以上的超滤膜。在一些实施方案中，将一个以上的超滤膜平行地与水溶液接触。
用于本发明方法的超滤膜的特征在于，病毒颗粒和其他颗粒的对数截留值（LRV；筛漏系数（sieving coefficient）的负对数）随颗粒直径单调递增；病毒的目的大小范围为直径约1nm至约100nm。在经验上，LRV随着颗粒投影面积（颗粒直径的平方）的大小持续增加。当涉及从蛋白质溶液中去除小型病毒颗粒时；例如细小病毒，获得了至少约3的良好LRV。然而，减小截留分子量导致减少了蛋白质回收。本领域技术人员可以选择能产生良好LRV和蛋白质回收的膜。病毒颗粒（溶液中的单一溶质；不存在蛋白质）的对数下降值取决于病毒颗粒大小。例如，大于约3的LRV可以用小型病毒如细小病毒和肝炎病毒获得，并且大于6的LRV可以用较大型病毒如AIDS病毒获得。
表面活性剂
用于本发明的表面活性剂可以是非离子的、阴离子的或阳离子的。用于本发明的合适的非离子表面活性剂包括例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酯如聚山梨醇20、聚山梨醇40、聚山梨醇60、聚山梨醇65、聚山梨醇酯80等聚氧乙烯叔辛基酚如X-100、X-220、X-405和X-460、聚氧乙烯壬基酚聚氧乙烯十二烷基醚（35、十二烷基聚乙二醇（laurylmacrogol））、聚氧乙烯单己基癸醚（polyoxyethylene monohexyldecyl ether）（Cetomacrogol）、聚氧丙烯-聚氧乙烯醚（包括polyoxamers F38、68、127、108、L62、184、188、Poloxamer124、188、237、338、407等）、多元醇、硬脂酸40或50硬脂酸酯polyoxyl ester laurate、硬脂酸35、硬脂酸40、聚乙二醇10油基醚、聚氧乙烯(20)十六烷基-十八烷基醚、PEG4-8月桂酸、PEG4-8硬脂酸酯、氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酰酯、辛基葡糖苷、山梨糖醇酐酯失水山梨糖醇单月桂酸酯、单棕榈酸、单油酸酯、单硬脂酸酯、倍半油酸酯、三油酸酯、蔗糖脂肪酸酯、辛基葡糖苷、甘油酯等。用于本发明的阴离子表面活性剂包括例如，十二烷基硫酸钠、脂肪磺基琥珀酸纳（sodium fatty sulfosuccinate）二辛基琥珀酸磺酸钠己二基磺基琥珀酸酯（Aerosol）、脱氧胆酸钠、胆酸钠、甘胆酸钠、辛酸钠、己基磺酸钠等。用于本发明的阳离子表面活性剂包括例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、西吡氯铵、十六烷基三甲基溴化铵等。在一些实施方案中，通过在过滤前将聚山梨醇20直接加入到含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中来减少超滤膜结垢。在一些实施方案中，通过在过滤前将X-100直接加入到含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中来减少超滤膜结垢。
用于本发明的非表面活性剂、非离子剂
用于本发明的非表面活性剂、非离子剂包括例如，聚乙二醇（PEG），优选地具有约400-约6000g/mol分子量的聚乙二醇，纤维素衍生物（例如，甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素）、精氨酸（包括L-精氨酸、精氨酸-HCl等）、二氢黄酮甙、柚皮苷、芦丁（槲皮素芸香糖苷）和葡聚糖，优选地具有约2,000-20,000Da分子量的葡聚糖等。在一些实施方案中，非表面活性剂、非离子剂不是精氨酸。
在本发明的一些实施方案中，在超滤之前将一种以上的非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中，以减少超滤膜的结垢。在其他实施方案中，可以使用表面活性剂和非表面活性剂、非离子剂的组合。
在本发明的一些实施方案中，在超滤之前将一种以上的表面活性剂加入到水溶液中，以减少超滤膜的结垢。在一些实施方案中，将一种以上的非离子表面活性剂加入到水溶液中。在其他实施方案中，将一种以上的阴离子表面活性剂加入到水溶液中。在其他实施方案中，将一种以上的阳离子表面活性剂加入到水溶液中。在其他实施方案中，将选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的表面活性剂任意组合；例如，非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂组合、非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂组合或者阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂组合。
原料
在一些方面，本发明提供了通过在超滤之前将表面活性剂或非表面活性剂、非离子加入到原料中，来减少超滤膜结垢的方法，所述超滤膜用于从生产生物药物期间产生的原料中去除病毒颗粒。在一些实施方案中，本发明提供了通过在超滤之前将表面活性剂或非表面活性剂、非离子加入到原料中，增加超滤膜的处理量的方法，所述超滤膜用于从生产生物药物期间产生的原料中去除病毒颗粒。在一些实施方案中，本发明提供了通过在超滤之前将表面活性剂或非表面活性剂、非离子加入到原料中，增加超滤膜的寿命的方法，所述超滤膜用于从生产生物药物期间产生的原料中去除病毒颗粒。在一些实施方案中，生物药物是多肽或蛋白质。在一些实施方案中，生物药物是免疫球蛋白；例如免疫粘附素或抗体。
本发明所考虑的原料可以是包含至少一种蛋白质的水溶液。将原料通过超滤膜，以去除原料中可能存在的病毒颗粒。可以从任何来源产生原料。例如，可以从用于重组产生目的蛋白质的真核细胞培养系统产生原料。在本发明的一些实施方案中，真核细胞培养是哺乳动物细胞培养；例如，仓鼠细胞培养、人类细胞培养、小鼠细胞培养等。在本发明的一些实施方案中，从体内来源产生原料。
在本发明的一些实施方案中，包含目的蛋白质的原料在超滤步骤之前已经进行了分离处理。例如，可以将原料进行层析分离处理、离心处理、凝胶过滤处理和/或沉淀处理。在本发明的一些实施方案中，原料包含基本纯的蛋白质。
包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液可以包括适合于目的蛋白质的以下任意一种：缓冲液、盐、螯合剂、抗氧化剂、蛋白酶抑制剂、防腐剂等。水溶液的pH应当适合于目的蛋白质。在一些实施方案中，水溶液的pH为约3.4-约9.0，优选地约5.0至8.0，更优选地约6.0-8.0。进料流的温度应当适合于目的蛋白质。在一些实施方案中，水溶液的温度为约2℃-约30℃，优选地约10℃-25℃。水溶液中蛋白质的浓度为约1g/mL-约200g/L，优选地约1g/mL-约50g/L。本领域技术人员可以确定特定蛋白质的合适浓度。
在超滤之前，原料含有至少一种类型的病毒颗粒。在某些实施方案中，病毒颗粒可以是细小病毒、圆环病毒或内源性逆转录病毒。
原料含有至少一种蛋白质，其在一个实施方案中是抗体。基本的4-链抗体单位是由两个相同的轻链（L）和两个相同的重链（H）组成的异四聚体糖蛋白（IgM抗体包括5个基本的异四聚体单位和称为J链的额外多肽，因此含有10个抗原结合位点，而分泌型IgA抗体可以多聚化，以形成包含2-5个基本的4-链单位和J链的多价聚集体）。在IgG的情况下，4-链单位通常为约150,000道尔顿。每一L链通过一个共价二硫键与H链连接，而取决于H链同种型，两个H链通过一个或多个二硫键相互连接。每一H和L链还具有调节空间的链内二硫键。每一H链在N端具有可变域（VH），然后是三个恒定域（CH）（每一个都具有α和γ链）和4个CH域（具有μ和ε同种型）。每一L链在N端具有可变域（VL），之后是在其另一端的恒定域（CL）。VL与VH连接，并且CL与重链的第一个恒定域（CH1）连接。认为特定的氨基酸残基形成了轻链和重链可变域之间的界面。VH和VL对一起形成了单个抗原结合位点。对于不同种类的抗体的结构和特性，参见例如Basic and Clinical Immunology,8th edition,Daniel P.Stites,Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(eds.),Appleton&Lange,Norwalk,CT,1994,page71and Chapter6。
基于L链恒定域的氨基酸序列，可以将来自任一脊椎动物物种的L链分类为两种明显不同的类型之一，所称作的κ和λ。取决于免疫球蛋白重链（CH）恒定域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分类为不同的种类或同种型。存在5种类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，所述重链免疫球蛋白的重链分别命名为α、δ、ε、γ和μ。基于CH序列和功能的相对较小差异，将γ和α类型进一步划分成亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段（称为“Fab”片段）以及剩余的“Fc”片段，命名反映了容易结晶的能力。Fab片段由完整的L链，以及H链的可变区（VH）和一个重链的第一恒定域（CH1）组成。对于抗原结合，每一Fab片段均是单价的，即具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生了单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于两个二硫键连接的Fab片段且具有二价抗原结合活性，并且仍能交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同在于Fab’片段在CH1结构域的羧基端具有额外的几个残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。在本文中，将Fab’-SH命名为Fab’，其中恒定域的半胱氨酸残基具有自由的硫醇基。F(ab’)2抗体片段最初产生为Fab’片段对，在所述Fab’片段对之间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
Fc片段包含通过二硫键连接在一起的两个H链的羧基端部分。Fc区的序列确定抗体的效应子功能，所述区域也是在某些类型的细胞上发现的Fc受体（FcR）识别的部分。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密的、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区结构域组成。从这两个结构域的折叠中发出了6个高变环（分别从H和L链中发出3个环），其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基，并赋予了针对抗体的抗原结合特异性。然而，尽管以比完整结合位点低的亲和力，单可变域（或者Fv的一半，其仅包含对抗原特异的三个CDR）仍具有识别并结合抗原的能力。
“单链Fv”也简称为“sFv”或“scFv”，其是包含VH和VL抗体结构域且连接成单个多肽链的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv形成用于抗原结合的期望结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Antibody Engineering,2nd edition(C.Borrebaeck,ed.,Oxford University Press,1995。
术语“双抗体”指通过用VH和VL结构域之间的短接头（约5-10个残基）构建sFv片段制备的小的抗体片段（参见前面段落），以实现V结构域的链间而不是链内配对，产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是具有两个“交换型”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域在不同的多肽链上存在。双抗体更全面地描述于例如，EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
非人（例如，啮齿类动物）抗体的“人源化”形式是含有来源于非人抗体的最小序列的嵌合抗体。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中用来自非人物种（供体抗体）如小鼠、大鼠、兔或具有期望的抗体特异性、亲和力和能力的非人灵长类动物的超变区替换来自受体的超变区的残基。在一些实例中，用相应的非人残基替换人免疫球蛋白的构架区（FR）。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰，以进一步优化抗体的性能。总之，人源化抗体基本上包含至少一个，并且通常两个可变域的全部，其中全部或者基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，而全部或者基本上全部FR都是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体任选地还包含免疫球蛋白（通常为人免疫球蛋白）恒定区（Fc）的至少一部分。对于其他细节，参见Jones等人,Nature321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
预过滤器
在一些方面，本发明提供了在工艺中减少超滤膜结垢的方法，在所述工艺中，在超滤之前将包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液进行预过滤步骤。美国专利号7,118,675提供了在超滤之前将原料进行预过滤步骤的系统的实例。本发明提供了在包括预过滤的工艺中进一步减少超滤膜结垢的方法，其通过在超滤之前将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中进行。在一些实施方案中，在预过滤步骤之前加入表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂。在其他实施方案中，在预过滤步骤之后，且在超滤之前加入表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂。在本发明的一些实施方案中，使用一种以上的预过滤或预过滤步骤。在本发明的一些实施方案中，在第一预过滤步骤之前，第二预过滤步骤之前或者一个或多个预过滤之后，且在超滤之前加入表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂。
在本发明的一些实施方案中，预过滤器包含一层或多层吸附性厚度过滤器。在本发明的一些实施方案中，预过滤器包含一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜。合适的预过滤器的代表包括由纤维素纤维、合成的纤维或其混合物形成的纤维介质，例如+填塞形成的那些预过滤器；由选自再生纤维素、聚醚砜、聚芳砜、聚砜、聚酰亚胺、聚酰胺或聚偏氟乙烯（PVDF），例如带电荷的膜、疏水性膜、疏水性膜和InterceptTM Q四电荷膜和层析介质制备的带电荷的或者具有表面化学（如由美国专利号5,629,084和4,618,533教导的亲水性或疏水性或者带正电荷或负电荷）的微孔膜，所述层析介质包括大小排阻介质、离子交换介质、疏水性介质等如疏水性介质、PEIL-1000介质、离子交换和层析介质。在一些实施方案中，预过滤器是S滤器。在一些实施方案中，预过滤器是A1HC滤器。在一些实施方案中，预过滤器是X0HC滤器。用于本发明的其他滤器包括例如，MilliporePro+、Shield、Intercept Q、ChromaSorbTM、PallS、E、Q、SartoriusStedimS、C、Q、D、STIC、HIC、Natrix Q、S、C膜吸附器、PallSTAXTM、SUPRAcapTM、SUPRAdisc1和SUPRAdisc2EKSP、EK1、EK、KS50、KS80、K100、K150、K200、K250、K300、K700、K900、K100IR、K250IR、K800IR、K900IR、T950、T1000、T2100、T2600、T3500、T5500、Sartorius StedimP厚度过滤筒和厚度过滤垫C4、CH8、F4H、F7H、S5、S9、Begerow BECODISC、Begerow BECOPAD、Begerow BECODISC BS、CUNO厚度过滤器ZETA PlusTMEXT ZA、EXTSP、ZA、LP、LA、AP、SP和VR。
减少膜污垢的方法
本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，其包括步骤a)将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中，和b)通过一种或多种超滤膜过滤包含所述表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液。本发明人发现，将表面活性剂直接加入到水溶液中，减少了超滤膜的结垢。
在本发明中，在超滤之前将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到含蛋白质的进料流中将以可定量地测量的量增加超滤膜的过滤处理效率。如上所述，当用于指超滤膜时，“增加过滤处理效率”等指在用超滤膜过滤该水溶液之前，由于将表面活性剂或某些非表面活性剂、非离子剂加入到含蛋白质的水溶液中而引起的通过超滤膜的体积处理量增加的有益作用。为了定量测定由于超滤之前将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到进料流中而产生的超滤处理效率的增加程度，通过用超滤膜以恒定的跨膜压过滤水溶液（在加入和不加入表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的情况下）进行了定量比较，并测量了随时间的处理体积。在更特定的情况下，例如超滤膜的过滤处理效率增加至少10%意为在表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂存在的情况下，每单位时间并且在恒定的压力下，膜的体积处理量比在表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂不存在的情况下，在相同的单位时间和相同的恒压下膜的体积处理量至少高10%。
尽管可以以任何有用的量将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中，以减少超滤膜的结垢，但在一些实施方案中，以约1PPM-约10,000PPM的浓度将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约10PPM-约1000PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约100PPM-约1000PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约10PPM-约200PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约10PPM-约100PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约20PPM-约200PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约20PPM-约100PPM。在一些实施方案中，以低于约1PPM、5PPM、10PPM、20PPM、30PPM、40PPM、50PPM、60PPM、70PPM、80PPM、90PPM、100PPM、110PPM、120PPM、130PPM、140PPM、150PPM、160PPM、170PPM、180PPM、190PPM、200PPM、225PPM、250PPM、275PPM、300PPM、350PPM、400PPM、450PPM、500PPM、600PPM、700PPM、800PPM、900PPM、1000PPM、1250PPM、1500PPM、1750PPM、2000PPM、3000PPM、4000PPM、5000PPM、6000PPM、7000PPM、8000PPM、9000PPM、10,000PPM中的任意一种浓度或者高于约10,000PPM的浓度将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。
在本发明的一些实施方案中，在超滤之前将一种或多种表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液的进料流中。在一些实施方案中，在超滤之前将一种或多种表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到病毒颗粒和至少一种蛋白质的大量水溶液中。
在一些方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除病毒颗粒并且在超滤之前，使水溶液通过预过滤器的工艺中减少超滤膜结垢的方法。在本发明的一些实施方案中，该方法包括步骤a)用预过滤器过滤水溶液；b)将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中；和c)用一种或多种超滤膜，过滤包含表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的水溶液，其中表面活性剂在水溶液中的存在减少了超滤膜的结垢。在本发明的其他实施方案中，该方法包括步骤a)将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中；b)用预过滤器过滤水溶液；和c)用一种或多种超滤膜过滤包含表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的水溶液，其中表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂在水溶液中的存在减少了超滤膜的结垢。在一些实施方案中，预过滤器是一层或多层吸附性厚度过滤器或者一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜。可以通过测量膜的质量处理量来测定超滤膜的结垢程度。
在一个方面，可以通过在恒定的跨膜压下，用超滤膜过滤含蛋白质的水溶液（在加入和不加入表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的情况下），然后按时间测量通过膜的处理体积，来进行定量比较。通常，可以通过在预设的时间段中维持恒定的跨膜压来进行此类定量比较，其中该恒定的跨膜压通常在约5psi-约45psi之间，优选地为40psi。此外，对于此类定量比较，实际上可以使用任意的预设时间段，并且用于检测处理体积的可测量差异所需的时间基于某些水溶液变量，例如水溶液中蛋白质浓度、污垢物的水平等而改变，然而，优选的时间段在约5分钟至360分钟之间，优选地在约10分钟至240分钟之间，更优选地为60分钟。
在更特定的情况下，例如超滤膜的过量处理效率增加了至少10%意为，在表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂存在（和或实施至少一个预过滤步骤）的情况下，在预设的时间段（如上所述，优选地约5分钟-约360分钟之间的任一时间段）且在恒定的跨膜压（优选地40psi）下，膜的体积处理量比在表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂不存在的情况下，在相同的单位时间和相同的恒压下膜的体积处理量高至少10%。
还可以通过测量流量的改变，来测定膜污垢。在一些实施方案中，将流量测量为（L/m2/小时），其表示在1小时内，通过特定面积的膜的水溶液的升数。随着膜结垢，流量减小。
还可以在预设的端点跨膜压（endpoint transmembrane pressure）下，通过测量水溶液中蛋白质的处理量，来测定膜污垢。由于膜结垢，跨膜压增加。在一些情况下，压力的增加超过了膜的承受能力，需要终止过滤。本领域技术人员知道给定超滤膜的合适的端点跨膜压。因此，膜污垢的指示表现为在预设的跨膜端点，例如对于VPro超滤膜40psi时的低处理量。具有很少或者没有污垢的膜可以导致高处理量；例如在低于或等于40psi时，6000g/m2以上的处理量。在一些情况下，当很少的膜结垢发生时，可能不会达到端点压。在这些情况下，可以通过在最大蛋白质处理量时观察到的跨膜压表示膜结垢的程度。在本发明的一些实施方案中，可以通过将跨膜压（例如以磅/每平方英寸表示）对质量处理量（例如g/m2，其中m2是膜的横切面面积）作图，来评估滤器性能。在本发明的一些实施方案中，可以通过将跨膜压（例如以磅/每平方寸差异）对质量处理量（例如g/m2）作图，来评估滤器性能。
本发明提供了测量超滤膜截留病毒的方法。测量病毒颗粒的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于免疫测定法、病毒核酸杂交、PCR、病毒滴度测定法等。可以通过将超滤前水溶液原料中病毒的量与超滤渗透中病毒的量比较，来测量对数截留值（LRV）。在一些实施方案中，本发明提供了通过将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到病毒和至少一种蛋白质的水溶液中，来减少超滤膜结垢的方法，其中超滤膜截留了水溶液中至少3个对数的病毒。在本发明的一些实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到包含病毒和至少一种蛋白质的水溶液中，其中减少了超滤膜的结垢，并且由超滤膜截留的病毒基本上没有改变。
分离蛋白质聚集物或者减少蛋白质聚集物形成的方法
在一些方面，本发明提供了在超滤进料流中分离蛋白质聚集物和/或减少蛋白质聚集的方法，所述超滤进料流包含含有至少一种蛋白质的水溶液。该方法包括将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。在一些实施方案中，蛋白质聚集物的分离或蛋白质聚集物形成的减少可以减少超滤膜的结垢。聚集物指多肽或多肽片段的任意多聚体（例如，二聚体、三聚体、四聚体或四聚体以上的多聚体）。
在本发明的一些实施方案中，当与在缺少表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的相同水溶液中存在的蛋白质聚集物的量相比，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的添加能使含蛋白质水溶液中的蛋白质聚集物减少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。使用本领域已知的技术，可以进行缺少与含有表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的水溶液中蛋白质聚集物的量的定量测定和比较。
在本发明的一些实施方案中，当与在缺少表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的相同水溶液中存在的蛋白质聚集物的平均数量相比，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的添加能使水溶液中蛋白质聚集物的平均数量减少至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之一。使用本领域已知的技术，可以进行缺少与含有表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的水溶液中蛋白质聚集物的平均数量的定量测定和比较。
在本发明的一些实施方案中，当与在缺少表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的相同水溶液中存在的蛋白质聚集物的平均数量相比，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的添加能使水溶液中平均蛋白质聚集物的大小减少了约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%中的一个。使用本领域已知的技术，可以进行缺少与含有表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的水溶液中平均蛋白质聚集物大小的定量测定和比较。在一些实施方案中，平均蛋白质聚集物大小减少了至少约上述量中的一个。
尽管可以以任意有用的量将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中，以分离存在的蛋白质聚集物和/或防止新的蛋白质聚集物形成，但在一些实施方案中，以约1PPM-约10,000PPM的浓度将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约10PPM-约1000PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约100PPM-约1000PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约10PPM-约200PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约10PPM-约100PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约20PPM-约200PPM。在本发明的一些实施方案中，表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的浓度为约20PPM-约100PPM。在一些实施方案中，以低于1PPM、5PPM、10PPM、20PPM、30PPM、40PPM、50PPM、60PPM、70PPM、80PPM、90PPM、100PPM、110PPM、120PPM、130PPM、140PPM、150PPM、160PPM、170PPM、180PPM、190PPM、200PPM、225PPM、250PPM、275PPM、300PPM、350PPM、400PPM、450PPM、500PPM、600PPM、700PPM、800PPM、900PPM、1000PPM、1250PPM、1500PPM、1750PPM、2000PPM、3000PPM、4000PPM、5000PPM、6000PPM、7000PPM、8000PPM、9000PPM、10,000PPM或者高于10,000PPM的浓度，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。
在本发明的一些实施方案中，用于含蛋白质的水溶液中分离存在的蛋白质聚集物和/或防止蛋白质聚集物形成的表面活性剂可以是非离子的、阴离子的或者阳离子的。用于本发明的合适的非离子表面活性剂包括例如，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酯如聚山梨醇20、聚山梨醇40、聚山梨醇60、聚山梨醇65、聚山梨醇酯80等聚氧乙烯叔辛基酚如X-100、X-220、X-405和X-460、聚氧乙烯壬基酚聚氧乙烯十二烷基醚（35、十二烷基聚乙二醇）、聚氧乙烯单己基癸醚（Cetomacrogol）、聚氧丙烯-聚氧乙烯醚（包括polyoxamers F38、68、127、108、L62、184、188、Poloxamer124、188、237、338、407等）、多元醇、硬脂酸40或50硬脂酸酯polyoxyl ester laurate、硬脂酸35、硬脂酸40、聚乙二醇10油基醚、聚氧乙烯(20)十六烷基-十八烷基醚、PEG4-8月桂酸、PEG4-8硬脂酸酯、氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、甘油单硬脂酰酯、辛基葡糖苷、山梨糖醇酐酯失水山梨糖醇单月桂酸酯、单棕榈酸、单油酸酯、单硬脂酸酯、倍半油酸酯、三油酸酯、蔗糖脂肪酸酯、辛基葡糖苷、甘油酯等。用于本发明的阴离子表面活性剂包括例如，十二烷基硫酸钠、脂肪磺基琥珀酸纳二辛基琥珀酸磺酸钠己二基磺基琥珀酸酯（Aerosol）、脱氧胆酸钠、胆酸钠、甘胆酸钠、辛酸钠、己基磺酸钠等。用于本发明的阳离子表面活性剂包括例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、西吡氯铵、十六烷基三甲基溴化铵等。在本发明的一些实施方案中，将一种以上的表面活性剂加入到水溶液中，以在含蛋白质的溶液中分离先前存在的蛋白质聚集物和/或防止蛋白质聚集物的形成。在一些实施方案中，将一种以上的非离子表面活性剂加入到水溶液中。在其他实施方案中，将一种以上的阴离子表面活性剂加入到水溶液中。在其他实施方案中，将一种以上的阳离子表面活性剂加入到水溶液中。在其他实施方案中，任意组合选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂的表面活性剂；例如，非离子表面活性剂和阴离子表面活性剂组合、非离子表面活性剂和阳离子表面活性剂组合或者阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂组合。
用于在含蛋白质的水溶液中分离预先存在的蛋白质聚集物和/或防止新的蛋白质聚集物形成的非表面活性剂、非离子剂包括例如，聚乙二醇（PEG），优选地具有约400-约6000g/mol分子量的聚乙二醇、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、精氨酸（包括L-精氨酸、精氨酸-HCl等）、二氢黄酮甙、柚皮苷、芦丁（槲皮素芸香糖苷）和葡聚糖，优选地具有约2,000-20,000Da分子量的葡聚糖等。
在本发明的一些实施方案中，将一种以上的非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中。在其他实施方案中，可以使用表面活性剂和非表面活性剂、非离子剂的任意组合。
在一些实施方案中，减少蛋白质聚集物或减少蛋白质聚集物形成的方法进一步包括用超滤膜过滤包含蛋白质和表面活性剂和非表面活性剂、非离子剂的水溶液的步骤。在一些实施方案中，超滤膜是细小病毒截留膜或者能去除细小病毒的膜。在一些实施方案中，通过常规流过滤进行过滤。在其他实施方案中，通过切向流过滤进行过滤。在本发明的一些实施方案中，通过超滤从水溶液中去除剩余的聚集物。
在一些实施方案中，减少蛋白质聚集物或减少蛋白质聚集物形成的方法进一步包括预过滤步骤和超滤步骤。在一些实施方案中，该方法包括步骤a)用预过滤器过滤水溶液；b)将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中，以分离蛋白质聚集物或防止蛋白质聚集物形成；和c)用一种或多种超滤膜过滤包含表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的水溶液。在本发明的其他实施方案中，该方法包括步骤a)将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到水溶液中，以分离蛋白质聚集物或防止蛋白质聚集物形成；b)用预过滤器过滤水溶液；和c)用一种或多种超滤膜过滤包含表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的水溶液。在一些实施方案中，预过滤器是一层或多层吸附性厚度过滤器或者一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜。
本领域已知测量蛋白质聚集的方法。例如，可以将使用光阻分析（lightobscuration analysis）的液体颗粒计数系统用于确定特定大小范围的颗粒的数量。在本发明的一些实施方案中，可以通过将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂存在情况下蛋白质的水溶液中颗粒的总数与表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂不存在情况下蛋白质的水溶液中颗粒的总数相比较，来测定蛋白质聚集的减少。在本发明的一些实施方案中，可以通过将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂存在情况下蛋白质的水溶液中颗粒的平均大小与表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂不存在情况下蛋白质的水溶液中颗粒的平均大小相比较，来测定蛋白质聚集的减少。
示例性实施方案
在一个方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，该方法包括步骤a)将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中，和b)用所述超滤膜过滤包含所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液，其中所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
在上述方法的一个实施方案中，表面活性剂是非离子表面活性剂。在任意上述方法的一个实施方案中，非离子表面活性剂选自聚山梨醇20、X-100、X-405、聚桂醇和聚山梨醇酯80。在上述方法中的任一个的实施方案中，非离子表面活性剂是聚山梨醇20。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以1-10,000PPM的浓度加入到所述水溶液中。在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以10-200PPM的浓度加入到所述水溶液中。
在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜是细小病毒截留膜。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有小于约100nm或更小的孔径。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有约20nm或更小的孔径。
在上述方法中的任一个的实施方案中，通过常规流过滤进行过滤所述水溶液的步骤。
在上述方法中的任一个的实施方案中，蛋白质是抗体。在上述方法中的任一个的实施方案中，抗体是单克隆抗体或人源化抗体。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少10%。在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少50%。
在上述方法中的任一个的实施方案中，病毒颗粒是细小病毒颗粒。
在上述方法中的任一个的实施方案中，所述方法进一步包括在用所述超滤膜过滤所述水溶液之前，通过一层或多层吸附性厚度过滤器或一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜过滤所述水溶液的步骤。
在另一方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中增加超滤膜的过滤处理效率的方法，其包括在用所述超滤膜过滤所述水溶液之前，将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中，其中与所述表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中不存在的情况下相比，所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在增加了所述超滤膜的过滤处理效率。
在上述方法中的任一个的实施方案中，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。在上述方法中的任一个的实施方案中，非离子表面活性剂选自聚山梨醇20、X-100、X-405、聚桂醇和聚山梨醇酯80。在上述方法中的任一个的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇20。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以1-10,000PPM的浓度加入到所述水溶液中。在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以10-200PPM的浓度加入到所述水溶液中。
在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜是细小病毒截留膜。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有小于约100nm或更小的孔径。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有约20nm或更小的孔径。
在上述方法中的任一个的实施方案中，通过常规流过滤进行过滤所述水溶液的步骤。
在上述方法中的任一个的实施方案中，蛋白质是抗体。在上述方法中的任一个的实施方案中，抗体是单克隆抗体或人源化抗体。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少10%。在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少50%。
在上述方法中的任一个的实施方案中，病毒颗粒是细小病毒颗粒。
在上述方法中的任一个的实施方案中，所述方法进一步包括在用所述超滤膜过滤所述水溶液之前，通过一层或多层吸附性厚度过滤器或一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜过滤所述水溶液的步骤。
在另一方面，本发明提供了在超滤进料流中分离多肽聚集物或者减少多肽聚集物形成的方法，所述超滤进料流包含含有至少一种蛋白质的水溶液，该方法包括将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中。
在上述方法中的任一个的实施方案中，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。在上述方法中的任一个的实施方案中，非离子表面活性剂选自聚山梨醇20、X-100、X-405、聚桂醇和聚山梨醇酯80。在上述方法中的任一个的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇20。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以1-10,000PPM的浓度加入到所述水溶液中。在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以10-200PPM的浓度加入到所述水溶液中。
在上述方法中的任一个的实施方案中，所述方法进一步包括用超滤膜过滤包含所述表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜是细小病毒截留膜。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有小于约100nm或更小的孔径。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有约20nm或更小的孔径。在上述方法中的任一个的实施方案中，通过常规流过滤进行过滤所述水溶液的步骤。
在上述方法中的任一个的实施方案中，蛋白质是抗体。在上述方法中的任一个的实施方案中，抗体是单克隆抗体或人源化抗体。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少10%。在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少50%。
在上述方法中的任一个的实施方案中，所述方法进一步包括在用所述超滤膜过滤所述水溶液之前，通过一层或多层吸附性厚度过滤器或一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜过滤所述水溶液的步骤。
在另一方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，该方法包括步骤a)通过以下设备过滤所述水溶液，所述设备选自一层或多层吸附性厚度过滤器和一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜；b)将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中；和c)用所述超滤膜过滤包含所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液，其中所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
在上述方法中的任一个的实施方案中，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。在上述方法中的任一个的实施方案中，非离子表面活性剂选自聚山梨醇20、X-100、X-405、聚桂醇和聚山梨醇酯80。在上述方法中的任一个的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇20。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以1-10,000PPM的浓度加入到所述水溶液中。在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以10-200PPM的浓度加入到所述水溶液中。
在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜是细小病毒截留膜。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有小于约100nm或更小的孔径。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有约20nm或更小的孔径。
在上述方法中的任一个的实施方案中，通过常规流过滤进行过滤所述水溶液的步骤。
在上述方法中的任一个的实施方案中，蛋白质是抗体。在上述方法中的任一个的实施方案中，抗体是单克隆抗体或人源化抗体。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少10%。在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少50%。
在上述方法中的任一个的实施方案中，病毒颗粒是细小病毒颗粒。
在另一方面，本发明提供了在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，该方法包括步骤a)将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中，b)通过以下设备过滤所述水溶液，所述设备选自一层或多层吸附性厚度过滤器和一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜；和c)用所述超滤膜过滤包含所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂的所述水溶液，其中表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
在上述方法中的任一个的实施方案中，其中所述表面活性剂是非离子表面活性剂。在上述方法中的任一个的实施方案中，非离子表面活性剂选自聚山梨醇20、X-100、X-405、聚桂醇和聚山梨醇酯80。在上述方法中的任一个的实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇20。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以1-10,000PPM的浓度加入到所述水溶液中。在上述方法中的任一个的实施方案中，将表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂以10-200PPM的浓度加入到所述水溶液中。
在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜是细小病毒截留膜。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有小于约100nm或更小的孔径。在上述方法中的任一个的实施方案中，超滤膜具有约20nm或更小的孔径。
在上述方法中的任一个的实施方案中，通过常规流过滤进行过滤所述水溶液的步骤。
在上述方法中的任一个的实施方案中，蛋白质是抗体。在上述方法中的任一个的实施方案中，抗体是单克隆抗体或人源化抗体。
在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少10%。在上述方法中的任一个的实施方案中，将所述表面活性剂或所述非表面活性剂、非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少50%。
在上述方法中的任一个的实施方案中，病毒颗粒是细小病毒颗粒。
在本说明书中公开的全部特征可以以任何组合方式进行组合。可以用适用于相同、等同或者相似目的的备选特征替换本说明书中公开的每一特征。因此，除非另外明确指明，公开的每一特征仅是一系列等同或相似特征的实例。
实施例
实施例仅意在示例本发明，且不应认为所述实施例以任何方式限制本发明，所述实施例还描述了以上讨论的本发明的详细方面和实施方案。除非另外指明，温度为℃，压力为大气压或者接近大气压。以说明的方式，而不以限制的方式提供前述实例和详细描述。将在本说明书中引用的全部公开、专利申请和专利并入本文作为参考，如同明确地且单独地说明将每种单独的公开、专利申请或专利并入本文作为参考一样。特别地，为描述和公开可能与本发明有关的组合物和方法的目的，将本文中引用的全部文献明确并入本文作为参考。尽管出于清楚地理解的目的，已经通过说明和实施例的方式详细地描述了前述发明，但在本发明的教导下，对本领域技术人员而言，显而易见的是，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对本发明进行某些改变和修改。
实施例1：聚山梨醇20对超滤膜性能的影响
为了测定某些表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂添加剂对含多种抗体的水溶液的超滤的效率的可能影响，在下述实验中制备并使用了下表1中所示的进料水溶液。
表1
为了测量加入的表面活性剂对超滤膜的结垢速率的影响，通过Pro超滤膜（Millipore Corporation）过滤表1（添加或者不添加表面活性剂）中所述的含蛋白质的进料水溶液。在约10psi的起始跨膜压下，用超滤膜进行含多种蛋白质的溶液的过滤，并允许产生跨膜压（归因于超滤膜的结垢），直到达到约50psi的跨膜压，此时终止超滤进程。如果超滤的结垢基本上没有发生，那么在达到约50psi的跨膜压之前终止超滤进程。然后测定抗体处理量（测量为g/m2膜表面积），并将其对跨膜压作图。除非说明，过滤的端点压力为40psi。
图1-4中显示了从测量多种浓度的聚山梨醇20在含不同抗体分子的多种不同水溶液导致超滤膜结垢中的影响的实验获得的数据。如图1-4中所示，在超滤工艺期间将少至20PPM的聚山梨醇20加入到含抗体的水溶液中对防止超滤膜结垢具有有益的和可再生的作用。使用包含完全不同的抗体的水溶液，以及在宽范围的聚山梨醇20的测试浓度下，显示了聚山梨醇20有益的抗结垢作用。这些数据明确表明，可以将非离子表面活性剂如聚山梨醇20用作含蛋白质的进料流的添加剂，以减少或防止超滤工艺期间超滤膜的结垢。
实施例2：X-100对超滤膜性能的影响
在第二组实验中，如上文实施例1中所述，测定了加入的X-100对超滤膜的结垢速率的影响。图4-7中显示了从测量多种浓度的X-100在含不同抗体分子的多种不同水溶液导致超滤膜结垢中的影响的实验获得的数据。如图4-7中所示，在超滤工艺期间将少至20PPM的X-100加入到含抗体的水溶液中对防止超滤膜结垢具有有益的和可再生的作用。使用包含完全不同的抗体的水溶液，以及在宽范围的聚山梨醇20的测试浓度下，显示了X-100有益的抗结垢作用。这些数据明确表明，可以将非离子表面活性剂如X-100用作含蛋白质的进料流的添加剂，以减少或防止超滤工艺期间超滤膜的结垢。
实施例3：预过滤与添加表面活性剂的组合对超滤膜性能的影响
在另一组实验中，研究了预过滤与添加表面活性剂的组合对超滤膜的结垢速率的影响。具体地，用表面活性剂任选地处理上文表1中所述的含抗-PDL1和抗-VEGF抗体的水溶液，然后用Mustang阳离子交换膜（Pall Corporation）进行预过滤。通过Mustang阳离子交换膜预过滤后，将滤出液/表面活性剂溶液进行如上所述的超滤。将从这些实验获得的数据显示于图8和9中。
如图8和9所示，通过Mustang的简单过滤对防止或减少下游超滤膜的结垢具有很小的或者没有有益的作用。然而，相反，当将含抗体的水溶液的预过滤与非离子表面活性剂的添加组合时，观察到了下游超滤膜结垢的显著减少。这些数据明确显示，在含蛋白质的水溶液的超滤工艺中，上游预过滤步骤与表面活性剂添加的组合使用为减少或防止下游超滤膜的结垢提供了显著的、可再生的和有益的作用。
实施例4：其他表面活性剂和某些非表面活性剂、非离子剂对超滤膜性能的影响
在另一组实验中，研究了多种不同的表面活性剂或非表面活性剂、非离子添加剂对下游超滤膜的结垢速率的影响。更具体地，将多种不同的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂加入到含不同抗体的水溶液（如表1中所述）中，如上文实施例1中所述用Pro超滤膜进行超滤。来自这些实验的数据显示于图10和11中。
如图10和11中所示，使用多种不同的表面活性剂或非表面活性剂、非离子剂，观察到了下游超滤膜结垢的显著减少。表2中提供了与多种抗体溶液、添加剂、预过滤器组合产生的其他数据。
表2
这些数据表明，为减少和/或防止超滤工艺期间超滤膜的结垢，可以将多种表面活性剂和某些非表面活性剂、非离子剂用作含蛋白质的水溶液的添加剂。在后续超滤步骤之前，在组合或者不组合预过滤步骤的情况下，这些表面活性剂和非表面活性剂、非离子剂都是有用的。
实施例5：聚山梨醇酯20对病毒清除没有负面影响
进行的研究显示直接将表面活性剂加入到蛋白质进料流中不会负面地影响超滤膜细小病毒滤器清除病毒。研究进行如下。
病毒原种
鼠细小病毒（Murine Minute Virus）（MMV）是无包膜的且具有单链DNA基因组的细小病毒，大小大约18-24nm，MMV对化学灭活具有高度抗性。MMV原种购自BioReliance（Rockville，MD）。
病毒过滤
将MMV原种按体积以1/100掺入到（spike）具有和不具有表面活性剂的添加剂的原料中。用0.22μm滤器和Viresolve Pro过滤掺入了MMV原种的原料。在0.22μm滤器和Viresolve Pro过滤后，通过Q-PCR测定病毒滴度。
病毒定量
以前Strauss等人，(2008)Biotechnology and Bioengineering,102:168-175和Zhan等人，(2002)Biologicals,30:259-70描述了Q-PCR测定法。对核酸酶消化步骤进行改良，以优化残余的游离DNA的去除。将样品调整至pH8-9，在37℃，用microccocal核酸酶消化30分钟。然后使用EZ1Advanced XL和EZ1virus mini kit v2.0（Qiagen Inc.，Valencia，CA）进行病毒基因组DNA的提取。如上所述进行Q-PCR反应。
病毒清除
病毒清除表示为对数下降值（LRV）。根据LRV=log10×(总病毒载量/滤出液中的总病毒)计算LRV。
结果显示于下表3中。
表3
抗体 表面活性剂 LRV
抗-VEGF 0ppm聚山梨醇20 4.05
抗-VEGF 100ppm聚山梨醇20 4.55
抗-VEGF 1000ppm聚山梨醇20 4.37
抗-PDL1 0ppm聚山梨醇20 4.30
抗-PDL1 100ppm聚山梨醇20 4.59
抗-PDL1 1000ppm聚山梨醇20 4.67
这些分析的结果显示，将聚山梨醇20表面活性剂加入到含蛋白质的进料流中不会不利地影响超滤膜从进料流中去除病毒的能力。
实施例6：用表面活性剂预处理超滤膜的作用
进行研究，以比较超滤之前将表面活性剂直接加入到进料流中的作用与超滤之前用表面活性剂预处理膜的作用。如表1中所示制备抗-VEGF抗体的水溶液的蛋白质进料流。超滤膜为Pro膜。在一些情况下，在超滤步骤之前，通过过滤1000ppm聚山梨醇20（溶解于水中）且用聚山梨醇20预处理膜来制备Pro膜。在其他情况下，在超滤之前，将聚山梨醇20直接加入到进料流中，使用未用表面活性剂预处理的膜。作为对照，没有将表面活性剂直接加入到第三进料流中或者没有预处理膜。图12显示了该分析的结果。图12中的数据显示，在将聚山梨醇20直接加入到抗-VEGF抗体的进料流的情况下观察到了最大的处理量。相反，用聚山梨醇20预处理超滤膜导致处理量低于从对照样品获得的处理量。这些数据表明，与用表面活性剂或其他非离子剂、非表面活性剂预处理超滤膜相比，将相同的表面活性剂或其他非离子剂、非表面活性剂直接加入到含蛋白质的含水进料流中对减少或防止超滤膜的结垢具有显著有益的作用。
实施例7：在水溶液中使用表面活性剂来分离蛋白质聚集物
进行研究，以评价表面活性剂的使用对蛋白质聚集物的分离作用。通过将聚山梨醇20或X-100的10%原液加入到表1中所述的抗-PDL1水溶液中来制备样品，以达到1000ppm的最终赋形剂浓度。分析之前，室温温育含赋形剂的水溶液30分钟。使用HIAC（液体颗粒计数系统，型号9703）测量水溶液中≥1.6μm的聚集物颗粒。使用已知大小为1.5μm-100μm的PSL颗粒分散标准校准仪器通过旋涡容器轻轻混合样品，以均匀分散颗粒，之后立即进行分析。单独测试了含水样品的4次试验（每次试验1mL），并计数指定大小的颗粒数。记录最后三次试验的颗粒计数数据，且舍去第一次试验的结果。来自该分析的结果显示于下表4中，其中数值表示每ml水溶液所参照大小的颗粒的数量。
表4
如表4中所示，HIAC数据显示，在含抗体的含水进料溶液中加入表面活性剂可以分离预先存在的聚集物颗粒，因此可以通过减少或防止超滤膜的结垢而具有改进超滤膜性能的作用。

Claims (17)

1.在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，其包括步骤
a)在超滤前，将非表面活性剂或非离子剂直接加入到所述水溶液中，所述非表面活性剂和非离子剂选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖，和
b)用所述超滤膜过滤包含所述非表面活性剂或非离子剂的所述水溶液，其中所述非表面活性剂或非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
2.权利要求1的方法，其中将所述非表面活性剂或非离子剂以1-10,000PPM的浓度加入到所述水溶液中。
3.权利要求1的方法，其中将所述非表面活性剂或非离子剂以10-200PPM的浓度加入到所述水溶液中。
4.权利要求1的方法，其中所述超滤膜是细小病毒截留膜。
5.权利要求1的方法，其中所述超滤膜具有小于约100nm的孔径。
6.权利要求1的方法，其中所述超滤膜具有约20nm或更小的孔径。
7.权利要求1的方法，其中所述过滤水溶液的步骤通过常规流过滤进行。
8.权利要求1的方法，其中所述蛋白质是抗体。
9.权利要求8的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或人源化抗体。
10.权利要求1的方法，其中将所述非表面活性剂或非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少10％。
11.权利要求1的方法，其中将所述非表面活性剂或非离子剂加入到所述水溶液中使所述超滤膜的过滤处理效率增加至少50％。
12.权利要求1的方法，其中所述病毒颗粒是细小病毒颗粒。
13.权利要求1的方法，其进一步包括这样的步骤：在用所述超滤膜过滤所述水溶液之前，通过一层或多层吸附性厚度过滤器或一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜过滤所述水溶液。
14.在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中增加超滤膜的过滤处理效率的方法，其包括以下步骤：在用所述超滤膜过滤所述水溶液之前，将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的非表面活性剂或非离子剂直接加入到所述水溶液中，其中与所述非表面活性剂或非离子剂在所述水溶液中不存在的情况相比，所述非表面活性剂或非离子剂在所述水溶液中的存在增加了所述超滤膜的过滤处理效率。
15.在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜结垢的方法，其包括步骤
a)通过以下设备过滤所述水溶液，所述设备选自一层或多层吸附性厚度过滤器和一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜；
b)在超滤前，将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的非表面活性剂或非离子剂直接加入到所述水溶液中，和
c)用所述超滤膜过滤包含所述所述非表面活性剂或非离子剂的所述水溶液，其中所述非表面活性剂或非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
16.在从包含病毒颗粒和至少一种蛋白质的水溶液中去除所述病毒颗粒的工艺中减少超滤膜的结垢的方法，其包括步骤
a)在超滤前，将选自聚乙二醇、纤维素衍生物、精氨酸和葡聚糖的非表面活性剂或非离子剂直接加入到所述水溶液中，
b)通过以下设备过滤所述水溶液，所述设备选自一层或多层吸附性厚度过滤器和一层或多层带电荷的或者表面经修饰的微孔膜；和
c)用所述超滤膜过滤包含所述非表面活性剂或非离子剂的所述水溶液，其中所述非表面活性剂或非离子剂在所述水溶液中的存在减少了所述超滤膜的结垢。
17.权利要求9的方法，其中所述单克隆抗体或人源化抗体是抗-PDL1抗体、抗-DR5抗体、抗-VEGF抗体、抗-HER2抗体或抗-MUC16抗体。
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