CN103555651A - 细胞培养改良 - Google Patents

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J.麦因泰尔
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Abstract

本发明涉及细胞培养改良。本发明描述在哺乳动物细胞培养物中生产重组蛋白例如抗体的改进方法和组合物。此外，本发明提供改良细胞培养基，包括改良生产培养基、补料溶液和组合补料，其可用于提高哺乳动物细胞培养物中的蛋白生产率。

Description

细胞培养改良
本申请是国际申请日为2007年9月13日的国际申请PCT／US2007／020027进入中国、申请号为200780041909.X的题为“细胞培养改良”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2006年9月13日申请的美国临时申请60／845158、2006年12月21日申请的美国临时申请60／876374的优先权。上述各优先权文件的内容以参考形式并于本文。
技术领域和背景技术
重组DNA技术已提供了使得能够用于包括治疗、诊断、农业及研究目的各种应用的量的蛋白质生产方法。
重组蛋白生产的目标之一是优化细胞培养基和条件以获得最大量的蛋白及最有效的生产方式。任何改良(包括增量改良)均可具有庞大的经济效益。在医药工业中，优化用于疾病治疗的生物制品的蛋白质生产是有利的，因为在大规模生产生物制品时任何改良均可具有显著影响。因此，仍需要最大化来自表达医药用生物蛋白的细胞培养的蛋白质生产。
通常，哺乳动物细胞培养基基于市售培养基配方，包括，例如，DMEM或Ham氏F12。通常，培养基配方并未充分富集(enriched)以支持细胞生长及生物蛋白表达的增加。仍需要改良细胞培养基、添加剂及用于改良蛋白生产的细胞培养方法。
发明内容
本发明提供用于改良细胞培养尤其哺乳动物细胞培养中的蛋白表达的方法及组合物。本发明涉及改良细胞培养基，包括用于蛋白表达和细胞生长的培养基和经优化用于蛋白表达的细胞培养生产培养基。
本发明也包括用于在哺乳动物细胞培养中高蛋白表达的最佳化方法和培养基。具体而言，最优化细胞培养基用于在哺乳动物细胞培养物(例如CHO细胞)中表达抗体。也提供通过添加补充溶液(例如含有水解产物的溶液及浓缩基础培养基溶液)促进蛋白生产的改良补料分批方法及组合物。
本发明提供用于哺乳动物细胞培养中的不含盐的改良基础生长培养基。本发明包括包含A部分、B部分及C部分的无血清细胞培养基，其中A部分基本上由排除下列组份的经修饰基础培养基组成：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；B部分基本上由无机铁来源组成；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源及至少两种不同的非动物水解产物。
在一个实施方案中，A部分进一步包含非铁金属离子、维生素或二者组合。在一个实施方案中，B部分的无机铁来源为柠檬酸铁，例如约100-150mg／L或0.1-1mM终溶液浓度的柠檬酸铁。在另一个实施方案中，B部分的无机铁来源为柠檬酸铁，例如约122.5mg／L或0.5mM终溶液浓度的柠檬酸铁。
在一个实施方案中，C部分的重组生长因子选自胰岛素或重组类似物、IGF-1及胰岛素与IGF-1的组合，例如约4mg／L至13mg／L胰岛素或其重组类似物。
在一个实施方案中，排除于经修饰的基础培养基之外的缓冲剂为HEPES缓冲剂。
在一个实施方案中，C部分的缓冲剂包含磷酸盐缓冲剂、HEPES及碳酸氢钠，例如约0.1至3g／L碳酸氢钠、约0.1至3g/LHEPES。在一个实施方案中，C部分的缓冲剂包含1.6g／L碳酸氢钠和／或约1.8g／LHEPES。在一个实施方案中，磷酸盐缓冲剂包含约0.01至0.5g／L磷酸二氢钠和磷酸氢二钠。
在另一个实施方案中，C部分进一步包含天冬酰胺、谷氨酰胺或谷氨酰胺和天冬酰胺。
在一个实施方案中，C部分的渗透压调节剂为NaCl，例如约1.0至6.5g／LNaCl。
在一个实施方案中，C部分的能量来源为单糖，例如葡萄糖(如D-葡萄糖)、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一个实施方案中，本发明的细胞培养基包含至多约7.0g／L的葡萄糖。
在另一个实施方案中，本发明的细胞培养基包含C部分的至少两种不同的非动物源水解产物，该类水解产物为植物源水解产物和既非动物源也非植物源的水解产物。可用于本发明的植物源水解产物的实例为大豆源水解产物。既非动物源也非植物源的水解产物的实例为酵母源水解产物。
在一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包含甲氨喋呤。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含约100nM至5000nM的甲氨喋呤。
在另一个实施方案中，细胞培养基进一步包含细胞保护剂或表面活性剂。可用于本发明细胞培养基的表面活性剂的实例为甲基纤维素或pluronic多元醇，例如Pluronic F-68。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1-5g／LPluronicF-68。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1.0g／LPluronicF-68。
在本发明的另一个实施方案中，细胞培养基进一步包含L-谷氨酰胺。
在一个实施方案中，细胞培养基的pH值范围为7.1至7.3。
在另一个实施方案中，本发明的细胞培养基的渗透压在约320至450mOsm／kg范围内。
本发明包括无血清细胞培养基，该培养基包含下列各物质：基础培养基；约8-12ml／kg或116-126mg／L柠檬酸铁；约2-6mg／kg重组人胰岛素；约2-5g/kg无水葡萄糖；约0.1-0.5g／kgL-谷氨酰胺；约1-3g／kg碳酸氢钠；约0.01-0.05g／kgNaH2PO4·H2O；约0.4-0.5g／kgNa2HPO4·7H2O；及约1.0-3.0g／kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基包含：基础培养基；约10.0ml／kg或122mg／L柠檬酸铁；约4.0mg／kg重组人胰岛素；约3.5g／kg无水葡萄糖；约0.29g/kgL-谷氨酰胺；约1.6g/kg碳酸氢钠；约0.03g／kgNaH2PO4·H2O；约0.43-0.44g／kgNa2HPO4·7H2O；及约2.0g／kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本上由下列物质组成：基础培养基；约10.0ml／kg或122mg／L柠檬酸铁；约4.0mg／kg重组人胰岛素；约3.5g／kg无水葡萄糖；约0.29g／kgL-谷氨酰胺；约1.6g／kg碳酸氢钠；约0.03g/kgNaH2PO4·H2O；约0.43-0.44g/kgNa2HPO4·7H2O；及约2.0g／kg酵母源水解产物。
本发明进一步提供基本由下列各物质组成的无血清细胞培养基：基础培养基；约8-12ml／kg或116-126mg／L柠檬酸铁；约2-6mg／kg重组人胰岛素；约2-5g／kg无水葡萄糖；约0.1—0.5g／kgL-谷氨酰胺；约1—3g／kg碳酸氢钠；约0.01—0.05g／kgNaH2PO4·H2O；约0.4-0.5g／kgNa2HPO4·7H2O；及约1.0-3.0g／kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养物基本上由下列各物质组成：基础培养基；约8—12ml／kg或116—126mg／L柠檬酸铁；约2-6mg／kg重组人胰岛素；约2-5g／kg无水葡萄糖；约0.1—0.5g／kgL-谷氨酰胺；约1—3g／kg碳酸氢钠；约0.01—0.05g／kgNaH2PO4·H2O；约0.4-0.5g／kgNa2HPO4·7H2O；及约1.0-3.0g／kg酵母源水解产物。
在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含约2.50mL／kg的甲氨喋呤。
本发明也包括一种用于生产蛋白的方法，其包含在本发明的培养基中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；并且将培养物转移至细胞培养生产培养基中，这样可生产蛋白。
在一个实施方案中，该蛋白为抗体，包括(例如)D2E7(阿达木单抗)。
本发明进一步提供包含下列各物质的无血清细胞生产培养基：排除下列组份的经修饰的基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；约4至8mL／kg或10至14mg／kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.5至0.7g／kgL-谷氨酰胺；约1至2g／kg碳酸氢钠；约1至2g／kgHEPES；约2至3g／kgNaCl；约0.5至2g／kgPluronicF-68；约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；约0.4至0.5g/kgNa2HPO4·7H2O；约8至12g/kg酵母源水解产物；及约60至70g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基基本由排除下列组份的经修饰基础培养基组成：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；约8至12ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；约4至8mL／kg或10至14mg／kg重组人胰岛素；约5至9g／kg无水葡萄糖；约0.5至0.7g／kgL-谷氨酰胺；约1至2g／kg碳酸氢钠；约1至2g／kgHEPES；约2至3g／kgNaCl；约0.5至2g／kgPluronicF-68；约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；约0.4至0.5g／kgNa2HPO4·7H2O；约8至12g／kg酵母源水解产物；及约60至70g／kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含：基础培养基；约10.0ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；约6.0mL／kg或12mg／kg重组人胰岛素；约7.0g／kg无水葡萄糖；约0.58至0.59g／kgL-谷氨酰胺；约1.6g／kg碳酸氢钠；约1.8g／kgHEPES；约2.4至2.5g／kgNaCl；约1.0g／kgPluronicF-68；约0.03至0.04g／kgNaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g／kgNa2HPO4·7H2O；约10.7g／kg酵母源水解产物；及约6.9至7.0g／kg植物源水解产物。
本发明进一步提供包含下列各物质的无血清细胞生产培养基：排除下列组份的经修饰的基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；约3至5mL／kg或6至8mg／kg重组人胰岛素；约5至9g／kg无水葡萄糖；约0.1至2g／kgL-谷氨酰胺；约1至2g／kg碳酸氢钠；约1至2g／kgHEPES；约2至3g／kgNaCl；约0.1至2g／kgPluronicF-68；约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；约0.4至0.5g／kgNa2HPO4·7H2O；约0.4至0.5g／kgL-天冬酰胺一水合物；约2至6g/kg酵母源水解产物；及约2至4g／kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；约3至5mL／kg或6至8mg／kg重组人胰岛素；约5至9g／kg无水葡萄糖；约0.1至2g／kgL-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g／kgHEPES；约2至3g／kgNaCl；约0.1至2g／kgPluronicF-68；约0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；约0.4至0.5g／kgNa2HPO4·7H2O；约0.4至0.5g／kgL-天冬酰胺一水合物；约2至6g／kg酵母源水解产物；及约2至4g／kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基包含：经修饰的基础培养基；约10.0ml／kg或122.45mg／kg柠檬酸铁；约3.8至3.9mL／kg或7.8mg／kg重组人类胰岛素；约7.0g／kg无水葡萄糖；约0.8至0.9g／kgL-谷氨酰胺；约1.6g／kg碳酸氢钠；约1.8g／kgHEPES；约2.6至2.7g／kgNaCl；约1.0g／kgPluronicF-68；约0.03至0.04g/kgNaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g／kgNa2HPO4·7H2O；约0.45g／kgL-天冬酰胺一水合物；约4.0g/kg酵母源水解产物；及约2.6g／kg植物源水解产物。
本发明也包括包含下列各物质的无血清细胞培养基：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至10ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；约3至5mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；约5至9g／kg无水葡萄糖；约0.8至0.9g／kgL-谷氨酰胺；约0.3至0.5g／kgL-天冬酰胺一水合物；约1至2g／kg碳酸氢钠；约1至2g／kgHEPES；约2至3g／kgNaCl；约0.5至2g／kgPluronicF-68；约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；约0.1至1.0g／kgNa2HPO4·7H2O；约2至6g／kg酵母源水解产物；及约2至4g／kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至10ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；约3至5mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；约5至9g／kg无水葡萄糖；约0.8至0.9g／kgL-谷氨酰胺；约0.3至0.5g／kgL-天冬酰胺一水合物；约1至2g／kg碳酸氢钠；约1至2g／kgHEPES；约2至3g／kgNaCl；约0.5至2g/kgPluronicF-68；约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；约0.1至1.0g／kgNa2HPO4·7H2O；约2至6g／kg酵母源水解产物；及约2至4g／kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含：经修饰的基础培养基；约10ml／kg或122mg／L柠檬酸铁；约3.8至3.9mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；约7.0g／kg无水葡萄糖；约0.87至0.88g/kgL-谷氨酰胺；约0.45g/kgL-天冬酰胺一水合物；约1.6g／kg碳酸氢钠；约1.8g/kgHEPES；约2.67至2.68g／kgNaCl；约1.0g／kgPluronicF-68；约0.03至0.04g／kgNaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kgNa2HPO4·7H2O；约4.0g／kg酵母源水解产物；及约2.6g/kg植物源水解产物。
本发明包括包含下列各物质的无血清细胞培养基：基础细胞生长培养基；约8至12ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；约2至6mg／kg重组人胰岛素；约150至250g／kg无水葡萄糖；约0.1至0.5g／kgL-谷氨酰胺；约1至2g／kg碳酸氢钠；及约5至15g／kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成：基础细胞生长培养基；约8至12ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；约2至6mg／kg重组人胰岛素；约150至250g／kg无水葡萄糖；约0.1至0.5g／kgL-谷氨酰胺；约1至2g／kg碳酸氢钠；及约5至15g/kg酵母源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含：基础细胞生长培养基；约10ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；约4mg／kg重组人胰岛素；约200g／kg无水葡萄糖；约0.29至0.30g／kgL-谷氨酰胺；约1.6g／kg碳酸氢钠；及约11g／kg酵母源水解产物。在另一个实施方案中，蛋白为抗体，包括(例如)完全人抗体、抗IL-12抗体，例如ABT-874。
本发明也包括包含下列各物质的无血清细胞培养基：基础细胞生长培养基；约8至12ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；约2至6mg／kg重组人胰岛素；约1至3g／kg无水葡萄糖；约0.1至1g/kgL-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；及约1至4g／kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基基本由下列各物质组成：基础细胞生长培养基；约8至12ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；约2至6mg/kg重组人胰岛素；约1至3g／kg无水葡萄糖；约0.1至1g／kgL-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；及约1至4g/kg酵母源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含：基础细胞生长培养基；约10ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；约4mg／kg重组人胰岛素；约1.5g／kg无水葡萄糖；约0.29至0.30g／kgL-谷氨酰胺；约1.6g／kg碳酸氢钠；及约2g／kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养基的pH值为约7.10至7.30，渗透压在约300至340mOSm/kg的范围内。在另一个实施方案中，细胞培养基包含至少8g／kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，使用细胞培养在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中生产的蛋白为抗体，包括，例如，抗IL-12抗体或抗EPO-R抗体，例如ABT-874。
本发明进一步提供包含下列各物质的细胞培养基：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；约2.5至4.5mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；约5至9g／kg无水葡萄糖；约0.5至1g／kgL-谷氨酰胺；约0.1至1g／kgL-天冬酰胺一水合物；约1至2g／kg碳酸氢钠；约1至2g／kgHEPES；约1至4g／kgNaCl；约0.1至2g／kgPluronicF-68；约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；约0.1至1g／kgNa2HPO4·7H2O；约2至6g/kg酵母源水解产物；及约2至6g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，本发明细胞培养基基本由下列各物质组成：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约2.5至4.5mL/kg或7.8mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.5至1g/kgL-谷氨酰胺；约0.1至1g/kgL-天冬酰胺一水合物；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kgHEPES；约1至4g/kgNaCl；约0.1至2g/kgPluronicF-68；约0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；约0.1至1g/kgNa2HPO4·7H2O；约2至6g/kg酵母源水解产物；及约2至6g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养基包含：经修饰的基础培养基；约10ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；约3.8至3.9mL/kg或7.8mg/kg重组人胰岛素；约7.0g/kg无水葡萄糖；约0.87至0.88g/kgL-谷氨酰胺；约0.45g/kgL-天冬酰胺一水合物；约1.6g/kg碳酸氢钠；约1.8g/kgHEPES；约2.67g/kg NaCl；约1.0g/kg Pluronic F-68；约0.03至0.04g/kgNaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；约4.0g/kg酵母源水解产物；及约2.6g/kg植物源水解产物。
本发明也包括包含下列各物质的细胞培养生产培养基：经修饰以去除下列组份的经修饰基础培养基；碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或10至14mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.1至1g/kgL-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kgHEPES；约1至3g/kg NaCl；约0.5至2g/kg Pluronic F-68；约0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；约0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；约8至12g/kg酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，本发明细胞培养生产培养基基本由下列各物质组成：经修饰以去除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml/kg或120至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或10至14mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.1至1g/kgL-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES；约1至3g/kg NaCl；约0.5至2g/kg Pluronic F-68；约0.01至0.1g/kgNaH2PO4·H2O；约0.1至1g/kgNa2HPO4·7H2O；约8至12g/kg酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含经修饰的基础培养基；约10ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；约6.0mL/kg或12mg/kg重组人胰岛素；约7.0g/kg无水葡萄糖；约0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；约1.6g/kg碳酸氢钠；约1.8g/kg HEPES；约2.45g/kg NaCl；约1.0g/kg Pluronic F-68；约0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；约10.7g/kg酵母源水解产物；及约6.9至7.0g/kg植物源水解产物。
本发明另一方面为包含下列各物质的细胞培养生产培养基：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml/kg或110至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或11至15mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.1至1g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES；约1至3g/kg NaCl；约0.1至2g/kg Pluronic F-68；约0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；约0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；约12至16g/kg酵母源水解产物；及约8至10g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基基本由下列各物质组成：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml/kg或110至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或11至15mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.1至1g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES；约1至3g/kg NaCl；约0.1至2g/kg Pluronic F-68；约0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；约0.1至1g/kg Na2HPO4·7H2O；约12至16g/kg酵母源水解产物；及约8至10g/kg植物源水解产物。在另一个实施方案中，本发明细胞培养生产培养基包含：经修饰的基础培养基；约10ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；约6.5mL/kg或13mg/kg重组人胰岛素；约7.0g/kg无水葡萄糖；约0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；约1.6g/kg碳酸氢钠；约1.8g/kg HEPES；约2.45g/kg NaCl；约1.0g/kg Pluronic F-68；约0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；约14.2至14.3g/kg酵母源水解产物；及约9.2至9.3g/kg植物源水解产物。
在一个实施方案中，细胞培养基的pH为约6至8。在另一个实施方案中，细胞培养基的pH约7.10至7.20。
在一个实施方案中，细胞培养基的渗透压约350至450mOsm/kg。在另一个实施方案中，细胞培养基的渗透压约373至403mOsm/kg。
本发明的细胞培养基可进一步包含甲氨喋呤。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含例如约1-10mL/kg甲氨喋呤。在另一个实施方案中，细胞培养基进一步包含例如约2.50mL/kg甲氨喋呤。
在一个实施方案中，在细胞培养物中表达的蛋白为抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段为抗-TNFα抗体或抗-EPO-R抗体。在另一个实施方案中，抗-TNFα抗体或其抗原结合片段为完全人类抗TNFα抗体，包括，例如，完全人类抗-TNFα抗体D2E7(阿达木单抗)。在又另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段为抗-IL-12或抗-IL-18抗体，包括完全人类抗-IL-12或抗-IL-18抗体。
本发明也包括一种用于生产蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)的方法，其包含在本文所呈现的细胞培养基中培养包含编码蛋白(例如抗体)的核酸的哺乳动物细胞。在一个实施方案中，细胞培养基为细胞培养生产培养基。可使用本发明方法及组合物生产的抗体或其抗原结合片段的实例包括抗IL-18抗体、抗-TNFα抗体、抗-IL-12抗体及抗EPO受体(EPO-R)抗体。
在一个实施方案中，本发明进一步包含从本文所述细胞培养生产培养基中分离蛋白。
在一个实施方案中，本发明的细胞培养基及方法用于培养哺乳动物细胞，包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明也包括本文所述任何细胞培养基中的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明亦提供用于在哺乳动物细胞培养物(例如CHO细胞)中生产蛋白的改良补料分批方法和相关细胞培养基。本发明一方面为生产蛋白的补料分批方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；及通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集(enrichment)溶液和基础富集溶液而向哺乳动物细胞馈料，其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物；这样可生产蛋白。
在一个实施方案中，基础富集溶液包含浓缩基础培养基。在另一个实施方案中，基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖。在另一个实施方案中，基础培养基为PF CHO。
在一个实施方案中，水解产物富集溶液包含非衍生自植物或动物的第一水解产物和第二植物源水解产物。在一个实施方案中，非衍生自植物或动物和植物源的水解产物为酵母源水解产物。在一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。
在一个实施方案中，所生产的蛋白为抗体或其抗原结合部分。可用于本发明的分批补料方法的抗体或其抗原结合部分的实例包括抗-TNFα抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体及抗EPO受体(EPO-R)抗体。
本发明包括产生抗TNFα抗体(包括，例如完全人类抗TNFα抗体，如阿达木单抗)的分批补料方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码抗-TNFα抗体的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；并通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集溶液和基础富集溶液而向CHO细胞补料，其中基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物；这样可生产抗-TNFα抗体。
本发明包括生产抗-TNFα抗体的分批补料方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码抗-TNFα抗体的核酸的CHO细胞，该细胞培养生产培养基包含至少1-5g/L例如2.0g/L的葡萄糖，其中通过按需要向细胞培养生产培养基中添加葡萄糖以维持至少1-5g/L例如2.0g/L的葡萄糖浓度来控制葡萄糖浓度；并且通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集溶液和基础富集溶液而向CHO细胞补料，其中基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物；这样可生产抗-TNFα抗体。
在一个实施方案中，本发明包括进一步回收抗-TNFα抗体。
在又另一个实施方案中，在约32至38℃范围内(例如35℃)的温度下培养细胞培养物。
在一个实施方案中，使细胞培养生产培养基的溶氧维持在20-65％之间，例如约30％溶氧。
在一个实施方案中，在整个培养过程中维持细胞培养生产培养基的渗透压不超过500mOsm。
在一个实施方案中，水解产物富集溶液包含非衍生自植物或动物的第一水解产物及第二植物源水解产物。在另一个实施方案中，非衍生自植物或动物和植物源水解产物的水解产物为酵母源水解产物。在另一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。在一个实施方案中，水解产物富集溶液基本由下列各物质组成：约50至280g/kg，例如250至280g/kg大豆源水解产物及约75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解产物。在一个实施方案中，水解产物富集溶液包含约50至280g/kg，例如250至280g/kg大豆源水解产物及约75至300g/kg，例如150至180g/kg酵母源水解产物。
在一个实施方案中，基础培养基为PF CHO。
在一个实施方案中，基础富集溶液的pH值约9.0至10.5。
在另一个实施方案中，分批补料方法的时段在约9至15天之间或为约12天。
在另一个实施方案中，于该时段中以下各日中至少一日将基础富集溶液添加至细胞培养生产培养基中：第4日、第6日、第9日及第11日。在一个实施方案中，于该时段中第4日、第7日或第4日和第7日将水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。
在另一个实施方案中，分批补料方法进一步包含根据pH值线性斜坡(linear ramp)调节细胞培养生产培养基的pH值，其中该pH值线性斜坡包含自约6.5-8(例如，7.1至7.2之间)的pH值起始且产生约6.5-7.0(例如6.9)的最终pH值。在一个实施方案中，至少在约24小时的时间段内调节pH值线性斜坡。在另一个实施方案中，至少在约48小时的时间段内调节pH值线性斜坡。在另一个实施方案中，在约72小时的时间段内调节pH值线性斜坡。
本发明也包括在分批补料方法中使用本文所述的细胞培养基，例如包含下列各物质的细胞培养生产培养基：排除下列组份的经修饰基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至10ml/kg或110至130mg/L柠檬酸铁；约4至8mL/kg或10至14mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.1至1g/kg L-谷氨酰胺；约1至3g/kg碳酸氢钠；约1至3g/kg HEPES；约2至3g/kg NaCl；约0.1至2g/kgPluronic F-68；约0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；约0.1至0.1g/kgNa2HPO4·7H2O；约8至12g/kg酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含经修饰的基础培养基；约10.0ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；约6.0mL/kg或12mg/kg重组人胰岛素；约7.0g/kg无水葡萄糖；约0.58至0.59g/kgL-谷氨酰胺；约1.6g/kg碳酸氢钠；约1.8g/kg HEPES；约2.45g/kgNaCl；约1.0g/kg Pluronic F-68；约0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；约10.7g/kg酵母源水解产物；及约6.9至7.0g/kg植物源水解产物。
本发明也提供生产抗-IL12抗体(例如完全人类抗-IL12抗体(如ABT-874))的分批补料方法，其包含在包含细胞培养生产培养基的细胞培养物中培养包含编码抗体的核酸的CHO细胞；通过在一时段内向细胞培养物中添加水解产物富集溶液和基础富集溶液向CHO细胞补料，其中基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖，且其中水解产物富集溶液包含至少两种不同的非动物源水解产物；这样可产生抗-IL12抗体。
在一个实施方案中，水解产物富集溶液进一步包含葡萄糖。
在一个实施方案中，本发明也包括回收抗-IL12抗体。
在一个实施方案中，在约32至38℃范围内(例如约33℃)的温度下培养细胞培养物。
在本发明的一个实施方案中，将细胞培养生产培养基的溶氧维持在20-65％之间，例如约40％溶氧。
在另一个实施方案中，细胞培养生产培养基的pH值约6.7至7.2。
在本发明的另一个实施方案中，水解产物富集溶液包含非衍生自植物或动物的水解产物和植物源水解产物。在一个实施方案中，非衍生自植物或动物的水解产物为酵母源水解产物。在另一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。在另一个实施方案中，水解产物富集溶液基本由下列各物质组成：约50至225g/kg，例如150至180g/kg大豆源水解产物、约75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解产物及约1至5g/L，例如2至3g/L葡萄糖。在另一个实施方案中，水解产物富集溶液包含约50至225g/kg，例如150至180g/kg大豆源水解产物、约75至300g/kg，例如250至280g/kg酵母源水解产物及约1至5g/L，例如2至3g/L葡萄糖。在一个实施方案中，基础富集溶液包含基础培养基、天冬酰胺和葡萄糖。
在另一个实施方案中，基础富集溶液的pH值约9.7，渗透压约1400至1500mOsm。在另一个实施方案中，基础富集溶液中的基础培养基为PF CHO。
在一个实施方案中，分批补料方法的时段在14-15天之间。
在一个实施方案中，自该时段的第5日起，每隔一天将基础富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。
在本发明的一个实施方案中，自该时段的第6日起始，每天将基础富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。在另一个实施方案中，自该时段的第5日起始，每天将基础富集溶液及水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。
本发明也包括在分批补料方法中使用本文所述的细胞培养基，例如包含下列各物质的细胞培养生产培养基：排除下列组份的经修饰基础培养基；碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约8至12ml/kg或110至130mg/L柠檬酸铁；约5至8mL/kg或11至15mg/kg重组人胰岛素；约5至9g/kg无水葡萄糖；约0.1至1g/kg L-谷氨酰胺；约1至2g/kg碳酸氢钠；约1至2g/kg HEPES；约2至3g/kg NaCl；约0.1至2g/kgPluronic F-68；约0.01至0.1g/kg NaH2PO4·H2O；约0.1至1g/kgNa2HPO4·7H2O；约6至12g/kg酵母源水解产物；及约6至8g/kg植物源水解产物。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含：约10ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；约6.5mL/kg或13mg/kg重组人胰岛素；约7.0g/kg无水葡萄糖；约0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；约1.6g/kg碳酸氢钠；约1.8g/kg HEPES；约2.45g/kg NaCl；约1.0g/kgPluronic F-68；约0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kgNa2HPO4·7H2O；约10.7g/kg酵母源水解产物；及约6.9至7.0g/kg植物源水解产物。
在一个实施方案中，本发明以大规模培养细胞方法为特点。在一个实施方案中，大规模细胞培养大于约10L。在另一个实施方案中，大规模细胞培养为约13L。
本发明也提供组合补料溶液，因为这些溶液可在一种溶液中提供养分组合所以是有利的。本发明包括包含下列各物质的组合补料溶液：葡萄糖；基础培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。本发明也包括基本由下列各物质组成的组合补料溶液：葡萄糖；基础培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。
在一个实施方案中，补料溶液的pH值约6.0至8.0。
在一个实施方案中，组合补料溶液包含约100至250g/kg葡萄糖。在一个实施方案中，组合补料溶液包含氨基酸天冬酰胺，例如约1.0至15.0g天冬酰胺；或约3.0至5.0g/kg天冬酰胺。
在一个实施方案中，组合补料溶液中的至少两种不同的非动物源水解产物为植物源水解产物和既非动物源也非植物源的水解产物。在一个实施方案中，非动物源或植物源水解产物为酵母源水解产物。在一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。
在一个实施方案中，组合补料溶液包含为PF-CHO或DMEM/F12培养基的基础培养基。在一个实施方案中，基础细胞培养基为经修饰的基础培养基且排除以下组份：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂、谷氨酰胺和葡萄糖。
在另一个实施方案中，组合补料溶液进一步具有小于约15NTU的浊度。
本发明以维持细胞培养生产培养基的稳定葡萄糖含量的方法为特点，其包含添加本文所述的组合补料溶液。
本发明的另一方面为制造包含下列各物质的组合补料溶液的方法：基础培养基、葡萄糖及至少两种不同的非动物源水解产物，其包含将葡萄糖与基础细胞培养基组合至溶液中；将a)溶液的pH值调节至约9.5至10.5；将至少两种不同的非动物源水解产物添加至b)溶液中；并调节c)溶液的pH值，这样组合补料溶液的pH值约6.5至7.5。在一个实施方案中，步骤c)包含添加既非以动物源也非植物源的第一水解产物和第二植物源水解产物。在一个实施方案中，非动物源或植物源水解产物为酵母源水解产物。在另一个实施方案中，植物源水解产物为大豆源水解产物。
本发明进一步提供增加由哺乳动物细胞培养物生产的蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)的方法。本发明提供由哺乳动物细胞培养物生产至少约1.5g/L抗体的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及向细胞培养生产培养基中添加pH值约6.7至7.2的组合补料溶液，其中该组合补料溶液包含葡萄糖、基础细胞培养基、除谷氨酰胺以外的氨基酸及至少两种不同的非动物源水解产物，这样可生产至少约1.5g/L抗体。在一个实施方案中，生产至少2g/L抗体。在另一个实施方案中，生产至少4g/L抗体。在另一个实施方案中，生产至少5g/L抗体。在另一个实施方案中，本发明提供用于产生约6g/L抗体的方法。
在一个实施方案中，组合补料溶液包含约100至250g/kg葡萄糖。
本发明也提供用于增加哺乳动物细胞培养物所生产抗体的滴度的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及向细胞培养生产培养基中添加pH值约6.7至7.2的组合补料溶液，其中该组合补料溶液包含葡萄糖、基础细胞培养基、除谷氨酰胺以外的氨基酸及至少两种不同的非动物源水解产物；这样所产生抗体的滴度比根据步骤a)且排除步骤b)培养的对照哺乳动物细胞培养物高至少50％。在一个实施方案中，所生产的抗体滴度比对照物高至少100％。在另一个实施方案中，所生产的抗体滴度比对照物高至少150％。
在一个实施方案中，当细胞密度达到每毫升至少2.0×106个细胞时添加组合补料溶液。在一个实施方案中，当细胞密度达到每毫升约3.5×106个细胞时添加组合补料溶液。
本发明进一步提供在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；及使用反馈控制系统来监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂水平，藉此将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中，其中在该反馈控制系统所测定的时间点将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中，这样以生产抗体。在一个实施方案中，代谢指示剂为葡萄糖或谷氨酰胺。在另一个实施方案中，补料溶液为包含下列各物质的组合补料溶液：葡萄糖；基础细胞培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。在一个实施方案中，抗体为抗-TNFα抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体及抗-EPO受体(EPO-R)抗体。
在一个实施方案中，使用本发明方法生产至少1.5g/L滴度的抗体。在另一个实施方案中，生产至少2g/L的滴度。
在本发明的一个实施方案中，组合补料溶液包含约3.0至12.5g/kg天冬酰胺。
在本发明的一个实施方案中，组合补料溶液包含约100至200g/kg葡萄糖。
在另一个实施方案中，本发明进一步包含监控细胞培养基中的葡萄糖含量，使得葡萄糖水平维持于约0.25与20.0g/L之间。在一个实施方案中，使用自动取样装置监控葡萄糖水平。
在一个实施方案中，使用本文公开的方法和组合物生产的抗体或其抗原结合部分选自：抗-TNFα抗体、抗-IL-18抗体、抗-EPO-R抗体及抗IL-12抗体。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分为完全人类抗体。在一个实施方案中，抗-TNFα抗体为D2E7(阿达木单抗)。在一个实施方案中，抗IL-18抗体为ABT-325。在一个实施方案中，抗IL-12抗体为ABT-874。
本发明也提供测定在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白的补料曲线的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及使用反馈控制系统监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂，藉此将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中，其中将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中以达到目标代谢指示剂设定点；及测定每天添加至细胞培养生产培养基中的组合补料溶液的量，这样以测定补料曲线。
在一个实施方案中，代谢指示剂为葡萄糖或谷氨酰胺。
本发明也包括在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白的分批补料方法，其包含根据使用本发明方法测定的补料曲线将组合补料溶液添加至哺乳动物细胞培养物中。
本发明的另一方面为包括丁酸钠和/或N-乙酰半胱氨酸的改良细胞培养基。本发明以在哺乳动物细胞培养物中生产抗体使得抗体滴度为至少300mg/L的方法为特点，该方法包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；向细胞培养基中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合，其中添加丁酸钠至终浓度约0.1mM至10mM且添加N-半胱氨酸至终浓度约1mM至80mM；这样以生产至少300mg/L滴度的抗体。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约100mg/L。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约200mg/L。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约250mg/L。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约300mg/L。在一个实施方案中，抗体滴度至少为约400mg/L。
本发明也提供在哺乳动物细胞培养物中生产抗体，使得抗体滴度至少比对照哺乳动物细胞培养物高10％的方法，该方法包含a)在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及b)向细胞培养基中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合，其中添加丁酸钠至终浓度约0.1mM至10mM且添加N-乙酰半胱氨酸终浓度至约1mM至80mM，使得抗体滴度至少比对照物高10％，其中对照哺乳动物细胞培养包含步骤a)且排除步骤b)。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少29％。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少40％。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少70％。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物高至少90％。
在一个实施方案中，在哺乳动物细胞培养物的生长期向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。
在一个实施方案中，在培养时间的第4天与第7天之间向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。
在一个实施方案中，在培养时间的第0天向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。
在另一个实施方案中，丁酸钠的终浓度为约0.1mM至10mM。在一个实施方案中，丁酸钠的终浓度为约0.1mM至8.0mM。在一个实施方案中，丁酸钠的终浓度为约0.1mM至3.0mM丁酸钠。
在一个实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为约20mM至60mM。在一个实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为约10mM。在一个实施方案中，N-乙酰半胱氨酸的终浓度为约8mM。
本发明进一步提供与对照哺乳动物细胞培养物相比使哺乳动物细胞培养物的寿命延长至少35％的方法，该方法包含a)在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞；及b)将约1mM至80mM N-乙酰半胱氨酸添加至细胞培养基中，使得哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少35％，其中对照哺乳动物细胞培养包含步骤a)且排除步骤b)。
在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约45％。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约55％。
在一个实施方案中，本发明方法包含将终浓度为约8mM的N-乙酰半胱氨酸添加至细胞培养生产培养基中。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分选自抗-TNFα抗体、抗-IL-18抗体(例如ABT-325)及抗IL-12抗体。
本发明提供包含A部分、B部分及C部分的无血清细胞培养基，其中A部分基本由排除下列组份的经修饰基础培养基组成：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；B部分基本由无机铁来源组成；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源及至少两种不同的非动物水解产物。在一个实施方案中，C部分基本由下列各物质组成：重组生长因子；缓冲剂；渗透压调节剂；能量来源；及至少两种不同的非动物水解产物。
本发明也提供包含下列各物质的无血清细胞培养生产培养基：维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约10ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；约6.5mL/kg或13mg/kg重组人胰岛素；约7.0g/kg无水葡萄糖；约0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；约1.6g/kg碳酸氢钠；约1.8g/kg HEPES；约2.45g/kg NaCl；约1.0g/kg Pluronic F-68；约0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kg Na2HPO4·7H2O；约10.7g/kg酵母源水解产物；及约6.9至7.0g/kg植物源水解产物。
本发明也提供包含下列各物质的无血清细胞培养基：维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约150g/kg无水葡萄糖；约5.0g/kg L-天冬酰胺一水合物；约1.6g/kg碳酸氢钠；约65g/kg酵母源水解产物；及约41g/kg植物源水解产物。
本发明进一步提供包含下列各物质的无血清细胞培养基：维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；约10ml/kg或122.45mg/L柠檬酸铁；约6.5mL/kg或13mg/kg重组人胰岛素；约200g/kg无水葡萄糖；约0.58至0.59g/kg L-谷氨酰胺；约1.6g/kg碳酸氢钠；约1.8g/kg HEPES；约2.45g/kg NaCl；约1.0g/kgPluronic F-68；约0.03至0.04g/kg NaH2PO4·H2O；约0.43至0.44g/kgNa2HPO4·7H2O；约10.7g/kg酵母源水解产物；及约6.9至7.0g/kg植物源水解产物。
本发明也提供改良培养基的以下实施方案。本发明包括用于培养CHO细胞以表达重组生物制品的改良培养基，其包含A、B和C部分，其中：A部分包含水、氨基酸、维生素及其他辅因子；B部分包含无机铁来源；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源、非铁金属离子、水解产物及附加试剂。
在一个实施方案中，C部分包含碳酸氢钠、HEPES、磷酸二氢钠及磷酸氢二钠、氯化钠、Pluronic F-68及葡萄糖。在另一个实施方案中，添加1.5g/L碳酸氢钠。在另一个实施方案中，添加1.8g/L HEPES。在另一个实施方案中，添加0.1-0.5g/L磷酸二氢钠及磷酸氢二钠。在另一个实施方案中，添加1g/L至6.5g/L氯化钠。在另一个实施方案中，添加1.0g/L Pluronic F-68。在一个实施方案中，添加1g/L至7g/L葡萄糖。在一个实施方案中，维生素选自PABA(对氨基苯甲酸)、生物素、D-Ca泛酸盐(维生素B5)、叶酸、内消旋肌醇、烟酰胺、Pyrodoxine(维生素B6)、核黄素(维生素B2)、硫胺素(维生素B1)和氰钴胺(Cyanocobalamin)(维生素B12)。在另一个实施方案中，其他辅因子选自脂因子、醇胺、氨基酸和肽。在另一个实施方案中，脂因子选自氯化胆碱及磷脂酰胆碱。在另一个实施方案中，醇胺为乙醇胺。在一个实施方案中，氨基酸选自天冬酰胺、谷氨酰胺及腐胺。
在一个实施方案中，肽为谷胱甘肽。在一个实施方案中，添加0.4mg/L至1.65mg/L谷胱甘肽。
在另一个实施方案中，B部分的无机铁来源为柠檬酸铁。在一个实施方案中，添加10mL/L或122mg/L柠檬酸铁。在另一个实施方案中，使柠檬酸铁保持122mg/L的浓度。在一个实施方案中，重组生长因子为胰岛素或重组类似物、IGF-1或胰岛素与IGF-1的组合。在一个实施方案中，添加4mg/L至13mg/L胰岛素或重组类似物。在另一个实施方案中，添加25ng/L至150ng/L IGF-1。在另一个实施方案中，添加50ng/L至100ng/L IGF-1。在另一个实施方案中，将25ng/L至150ng/L IGF-1添加至胰岛素中。在一个实施方案中，将50ng/L至100ng/L IGF-1添加至胰岛素中。
在另一个实施方案中，渗透压调节剂选自NaCl、KCl、KNO3。在一个实施方案中，添加0g/L至10g/L渗透压调节剂。在另一个实施方案中，添加0g/L至6.5g/L渗透压调节剂。
在另一个实施方案中，能量来源为单糖，例如葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麦芽糖、甘露糖、半乳糖及果糖。在一个实施方案中，添加1.0g/L至7.0g/L葡萄糖。在另一个实施方案中，添加1.5g/L至5.0g/L葡萄糖。
在另一个实施方案中，以氯化物和硫酸盐的形式添加非铁金属离子。在一个实施方案中，非铁金属离子选自钾、镁、铜、硒、锌、镍、锰、锡、镉、钼酸盐、钒酸盐及硅酸盐。在一个实施方案中，缓冲剂选自碳酸盐、氯化物、硫酸盐和磷酸盐。在一个实施方案中，缓冲剂选自NaHCO3、CaCl2、MGSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、C3H3O3Na和称作HEPES的N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸]。
在本发明的一个实施方案中，添加至培养基中的附加试剂之一为甲氨喋呤。在一个实施方案中，甲氨喋呤用于使表达抗-IL-18、抗-IL-12、抗-TNFα(例如完全人类抗-TNFα)或抗EPO-R抗体的CHO细胞的生长。在一个实施方案中，添加100mM至5000nM。在一个实施方案中，向培养基中添加500nM甲氨喋呤。在一个实施方案中，添加100nM甲氨喋呤。在一个实施方案中，添加5000nM甲氨喋呤。
在本发明的另一个实施方案中，附加试剂之一为细胞保护剂，例如甲基纤维素或pluronic多元醇(例如Pluronic F-68)。在一个实施方案中，添加0.5g/L至1.0g/L甲基纤维素。在一个实施方案中，添加0.5g／L至1.0g／L Pluronic F-68。在一个实施方案中，添加0.7g／L至1.2g／L Pluronic F-68。
在另一个实施方案中，将A部分的pH增加至最大pH值10。在一个实施方案中，在添加水解产物之后将A部分的pH降低至最小值7.0。
本发明也提供用于表达完全人类抗-TNFα抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10.0ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；2mL／kg或4.0mg／kg重组人胰岛素；3.5g／kg无水葡萄糖；0.292g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；0.031g／kg NaH2PO4·H2O；0.436g／kgNa2HPO4·7H2O；2.0g／kg水解产物；及2.50mL／kg甲氨喋呤。
本发明也提供用于表达完全人类抗-TNF-α抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10.0ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；6.0mL／kg或12mg／kg重组人胰岛素；7.0g／kg无水葡萄糖；0.584g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kg HEPES；2.45g／kg NaCl；1.0g／kg PluronicF-68；0.031g／kg NaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；10.7g／kg水解产物；6.92g／kg植物蛋白胨(Phytone peptone)；及2.50mL／kg甲氨喋呤。
本发明也包括用于表达完全人类抗-TNF-α抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／L柠檬酸铁；3.88mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；7.0g／kg无水葡萄糖；0.876g／kg L-谷氨酰胺；0.45g／kg L-天冬酰胺一水合物；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kgHEPES；2.67g／kg NaCl；1.0g／kg Pluronic F-68；0.031g／kgNaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；10.7g／kg水解产物；6.92g／kg植物蛋白胨；及2.50mL／kg甲氨喋呤。
本发明进一步提供用于表达完全人类抗-TNF-α抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／L柠檬酸铁；3.88mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；7.0g／kg无水葡萄糖；0.876g／kg L-谷氨酰胺；0.45g／kg L-天冬酰胺一水合物；1.6g／kg碳酸氢钠；1g／kgHEPES；2.67g／kg NaCl；1.0g／kg Pluronic F-68；0.031g／kgNaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；4.0g／kg水解产物；2.6g／kg植物蛋白胨；及2.50mL／kg甲氨喋呤。
本发明的另一方面为用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／L柠檬酸铁；3.88mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；7.0g/kg无水葡萄糖；0.876g／kg L-谷氨酰胺；0.45g／kg L-天冬酰胺一水合物；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kg HEPES；2.675g/kg NaCl；1.0g/kg Pluronic F-68；0.031g/kg NaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；4.0g／kg酵母源水解产物；2.579g／kg植物蛋白胨；及2.50mL／kg甲氨喋呤。
本发明提供用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／L柠檬酸铁；6.5mL／kg或13mg／kg重组人胰岛素；7.0g／kg无水葡萄糖；0.584g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kg HEPES；2.45g／kg NaCl；1.0g／kg Pluronic F-68；0.031g／kg NaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；10.7g／kg酵母水解产物；及6.92g／kg植物蛋白胨。
本发明提供用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：150.0g／kg无水葡萄糖；5.0g／kg L-天冬酰胺一水合物；65.0g／kg酵母水解产物；及41.0g／kg植物蛋白胨。
本发明也提供用于表达抗-IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；6.5mL／kg或13mg／kg重组人胰岛素；200.0g／kg无水葡萄糖；0.584g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kg HEPES；2.45g／kg NaCl；1.0ml／kg Pluronic F-68；0.031g／kg NaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；10.7g／kg酵母水解产物；及6.92g／kg植物蛋白胨。
本发明包括用于表达抗-IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；2mL／kg或4mg／kg重组人胰岛素；3.5+1.5g／kg无水葡萄糖；0.292g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；2g／kg酵母水解产物；及0.25mL／kg甲氨喋呤。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；2mL／kg或4mg／kg重组人胰岛素；3.5+1.5g／kg无水葡萄糖；0.292g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；11g／kg酵母水解产物；及0.250mL／kg甲氨喋呤。
本发明包括用于表达抗-IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；2mL／kg或4mg／kg重组人胰岛素；200g／l无水葡萄糖；0.292g/kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；8g／kg酵母水解产物；及0.250mL／kg甲氨喋呤。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；3.88mL／kg或7.76mg／L重组人胰岛素；7.0g／l无水右旋糖；0.876g／L L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／L HEPES；2.67g／L NaCl；1.0g／L Pluronic；0.031g/LNaH2PO4·H2O；0.436g/L Na2HPO4·7H2O；4.0g／L酵母粉(yeastolate)；2.579g／L植物蛋白胨；0.05mL／kg甲氨喋呤；3.5mL／L2N NaOH；及2.91g／L2N HCl；其产生7.10至7.20的终pH值及373至403mOsmo／kg的终渗透压。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；13mg／L重组人胰岛素；7.0g／l无水右旋糖；0.584g/L L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／LHEPES；2.45g／L NaCl；1.0g／L Pluronic；0.031g／L NaH2PO4·H2O；0.436g／L Na2HPO4·7H2O；10.7g／L酵母粉；6.92g／L植物蛋白腖；0.05mL／kg甲氨喋呤；5.67mL／L2N NaOH；及2.5g／L2N HCl；其产生7.10至7.20的终pH值和373至403mOsmo／kg的终渗透压。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；4mg／kg重组人胰岛素；1.5g／kg无水右旋糖；0.292g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；2.0g／L酵母粉；及0.25mL／kg甲氨喋呤；其产生7.10至7.30的终pH值和300至340mOsmo／kg的终渗透压。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；13mg／kg重组人胰岛素；7.0g／kg无水右旋糖；0.584g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kg HEPES；2.45g／kg NaCl；1.0g／kg Pluronic F-68；0.031g／kgNaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；10.7g／L酵母粉；及6.92g／kg植物蛋白胨；5.67mL／kg NaOH；及2.5mL／kg HCl；其产生7.10至7.20的终pH值和373至403mOsmo／kg的终渗透压。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；7.76mg／kg重组人胰岛素；7.0g／l无水右旋糖；0.876g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kgHEPES；2.67g／kg NaCl；1.0g／kg Pluronic F-68；0.031g／kgNaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；4.0g/L酵母粉；及2.579g／L植物蛋白胨；0.05mL／L甲氨喋呤；3.5mL／kg NaOH；及2.91mL／kgHCl；其产生7.10至7.20的终pH值和373至403mOsmo／kg的终渗透压。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；13mg／kg重组人胰岛素；7.0g／l无水右旋糖；0.584g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kgHEPES；2.45g／kg NaCl；1.0g／kg Pluronic F-68；0.031g／kgNaH2PO4·H2O；0.436g／kg Na2HPO4·7H2O；10.7g／L酵母粉；及6.92g/L植物蛋白胨；0.05mL／L甲氨喋呤；5.67mL／kg NaOH；及2.5mL／kgHCl；其产生7.10至7.20的终pH值和373至403mOsmo／kg的终渗透压。
本发明包括用于表达抗IL-18抗体的CHO细胞的改良培养基，其包含：10ml／kg或122mg／kg柠檬酸铁；13mg／kg重组人胰岛素；7.0g／l无水右旋糖；0.584g／kg L-谷氨酰胺；1.6g／kg碳酸氢钠；1.8g／kgHEPES；1.0g／kg Pluronic F-68；0.031g／kg NaH2PO4·H2O；0.436g／kgNa2HPO4·7H2O；14.27g／L酵母粉；9.23g／L植物蛋白胨；0.05mL／L甲氨喋呤；8.95mL／kg NaOH；及4.1mL／kg HCl；其产生7.10至7.20的终pH值及373至403mOsmo／kg的终渗透压。
本发明也提供通过增加终滴度增加CHO细胞系生产IgG1抗体的生产率的方法，其包含：添加丁酸钠；及添加N-乙酰半胱氨酸。在一个实施方案中，IgG1抗体为抗-IL-18。在一个实施方案中，通过终滴度的增加测量生产率的增加。在一个实施方案中，通过添加0.1mM至10mM浓度的丁酸钠达到终滴度的增加。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0.1mM至8.0mM。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0.1mM至3.0mM。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0.125mM至2.0mM。在一个实施方案中，丁酸钠的浓度为0.125mM。在一个实施方案中，终滴度增加10-80％。在一个实施方案中，终滴度增加20-60％。在一个实施方案中，终滴度增加35-55％。在一个实施方案中，终滴度增加40％。在一个实施方案中，通过添加0.1mM至10mM浓度的N-乙酰半胱氨酸达到改良的细胞培养物寿命。在一个实施方案中，细胞培养物寿命增加5-50％。
本发明也提供通过增加终滴度增加CHO细胞系生产IgG1抗体的生产率的细胞培养基，其包含：SR-371；和丁酸钠。在一个实施方案中，IgG1抗体为抗-IL-18。在一个实施方案中，通过增加10-80％的终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，通过增加20-60％的终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，通过增加35-55％的终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，通过增加40％的最终抗-IL-18滴度测量生产率增加。在一个实施方案中，所添加的丁酸钠浓度为0.125mM至8.0mM。在一个实施方案中，所添加丁酸钠的浓度为0.2mM至3.0mM。在一个实施方案中，所添加丁酸钠的浓度为0.3mM至2.0mM。在一个实施方案中，所添加丁酸钠的浓度为0.125mM。在一个实施方案中，所添加N-乙酰半胱氨酸的浓度为0mM至10mM。在一个实施方案中，所添加N-乙酰半胱氨酸的浓度为5mM至10mM。在一个实施方案中，平均终滴度增加5-50％。在一个实施方案中，平均终滴度增加15-35％。在一个实施方案中，平均终滴度增加25-35％。
附图说明
图1图解描述了作为接种活细胞密度的函数的ABT-874生长滴度。第15日的滴度结果与补料活细胞密度强烈相关。对以上数据的多项式拟合(polynominal fit)表明最佳补料密度约为每毫升3.5×106个细胞。过程参数为pH=6.9；T=35℃；DO=40％；4X培养基中的接种比率为1：5或1：4；在特定密度下以初始体积1％开始补料历时10天。
具体实施方式
I.定义
尽管本申请案中所使用的术语为本领域的标准术语，但本文中提供某些术语的定义以确保申请专利范围含义的清晰性和确定性。
如本文所使用，术语″抗体″意指包含由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中两条重(H)链和两条轻(L)链以双硫键互联。各重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域组成，CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。可将VH及VL区进一步细分为高变区(称作互补决定区(CDR))，其与称作骨架区(FR)的更保守区域散布。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其按照以下次序自氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可使用本发明方法及组合物生产的抗体实例包括肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(也称作抗-TNFα抗体)、白介素(IL)-12抗体(也称作抗-IL-12抗体)、白介素(IL)-18抗体(也称作抗-IL18抗体)和EPO／R抗体(本文中一称作抗-EPO／R抗体)。可使用本发明生产TNFα抗体更详细地描述于美国专利第6090382号、第6258562号和第6509015号中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
本发明也可用于生产抗体片段。如本文所用，术语抗体的″抗原结合部分″或“抗原结合片段”(或简单地″抗体部分″)指保留了与抗原(例如hTNFα)结合的能力和特异性的抗体的一个或多个片段。已显示全长抗体片段可执行抗体的抗原结合功能。术语抗体的″抗原结合部分″涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在铰链区由双硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341：544-546)，其由VH或VL结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR)；及(vii)双重可变结构域(DVD)抗体。此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)由分离基因编码，但可使用重组方法通过合成接头使它们接合，该合成接头使其能够成为单一蛋白链，其中VL与VH区配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等，(1988)Science242：423-426；及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)。该等单链抗体也涵盖于术语抗体的″抗原结合部分″中。也涵盖其他形式的单链抗体，例如双功能抗体。双功能抗体为二价双特异性抗体，其中VH及VL结构域表达于单一多肽链上，但使用因过短而不允许两个结构域在同一个链上配对的接头，藉此迫使该等结构域与另一条链的互补结构域配对且产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448；Poljak等，(1994)Structure2：1121-1123)。可通过本发明方法生产的抗体部分的实例更详细地描述于美国专利第6090382号、第6258562号、第6509015号，其各自以全文引用的方式并入本文。使用本发明方法及组合物生产的抗体片段或部分也包括于本发明范畴内。
如本文所用，术语″重组人抗体″意欲包括通过重组方式制备、表达、生产或分离的所有人抗体，例如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；自重组、组合人类抗体库(下文进一步描述)分离的抗体；自转移了人类免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor等，(1992)Nucl.Acids Res.20：6287)；或通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、生产或分离的抗体。该等重组人类抗体具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，体外诱变该等重组人类抗体(或当使用转移了人类Ig序列的动物时，体内体细胞诱变)且因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列为尽管衍生自人类生殖系VH和VL序列且与其相关，但可能并非天然存在于体内人类抗体生殖系谱系中的序列。
如本文所用，″经分离抗体″意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合至hTNFα的经分离抗体基本上不含特异性结合除hTNFα以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hTNFα的经分离抗体可与其他抗原(例如来自其他物种的TNFα分子)具有交叉反应性。此外，经分离抗体可基本上不含其他细胞材料和／或化学物质。
术语″基础培养基″指能够支撑细胞生长的任何培养基。基础培养基供应标准无机盐，例如锌、铁、镁、钙和钾，以及痕量元素、维生素、能量来源、缓冲剂系统和必需氨基酸。基础培养基的实例包括但不限于达氏经修饰伊氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)(DMEM)、DME／F12、极限必需培养基(MEM)、基础培养基Eagle(BME)、RPMI1640、F-10、F-12、α-极限必需培养基(α-MEM)、Glasgow氏极限必需培养基(G-MEM)、PF CHO(SAFC Biosciences)和Iscove氏经修饰杜氏培养基。
如本文所使用，术语″经修饰基础培养基″指排除、减低或增加至少一种标准成份、组份或养分(即本领域已知的经典配方基础培养基中发现的至少一种成份、组份或养分)的基础培养基。如″经修饰基础培养基″的上下文中所用的术语″经修饰″也可指基础培养基内个别组份之间比例的变化。在本发明的优选实施方案中，经修饰基础培养基排除至少一种以下组份：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸钠(磷酸二氢钠及／或磷酸氢二钠)、渗透压调节剂、表面活性剂和葡萄糖，例如单糖葡萄糖。
如本文所使用，术语″细胞培养基″、″培养基″和″培养基配方″指使细胞在多细胞生物体或组织外部的人造体外环境中维持、生长、繁殖或扩增的营养溶液。可优化细胞培养基以用于特定细胞培养用途，该细胞培养基包括，例如，经配制以促进细胞生长的细胞培养生长培养基或经配制以促进重组蛋白生产的细胞培养生产培养基。术语养分、成份和组份可于本文中互换使用，指构成细胞培养基的组成成分。
如本文所使用，术语″细胞培养生产培养基″或″生产培养基″指经设计用于细胞培养物生产期的细胞培养基。在优选的实施方案中，生产培养基经设计用于生产期中的重组蛋白表达。本文(包括实施例部分的表2-7)提供生产培养基的实例。
如本文所使用，术语″分批补料细胞培养″和″分批补料培养″指起初向培养容器中供应细胞(优选哺乳动物动物)和培养基并在培养期间连续或以离散增量向培养物中补入附加培养养分，在培养终止前具有或不具有周期细胞和／或产物收集的细胞培养。
″分批补料方法″指向分批补料细胞培养物中供应附加养分的方法。举例而言，分批补料方法可包含根据预定补料程序在给定时段内添加补充培养基。
如本文所使用，术语″补料″指接种后向培养物中进行的任何物质的任何添加。补料可为一或多次添加。
如本文所使用，术语″补料溶液″、″补料培养基″和″补入培养基″指含有在接种后某时起始向培养物中添加的一种或多种养分的培养基。在一个实施方案中，补料溶液为包含下列各物质的组合补料：基础培养基和至少一种水解产物，例如大豆源水解产物、酵母源水解产物或两种类型水解产物的组合。在本发明的另一个实施方案中，补料溶液可仅包括基础培养基，例如浓缩基础培养基，或可仅包括水解产物或浓缩水解产物。
如本文所使用，术语″反馈控制系统″指监控给定参数的方法，藉此添加附加试剂或进行细胞培养物的环境修饰以满足所需参数设定点。在一个实施方案中，所给定参数为哺乳动物细胞培养物的葡萄糖含量，藉此使用葡萄糖含量来确定应于何时将补料溶液(例如组合补料溶液)添加至细胞培养物中。可使用反馈控制系统维持使哺乳动物细胞培养物中蛋白生产最佳化所需要的营养组份。
如本文所使用，术语″补料曲线″指以补料溶液(例如组合补料溶液)补充哺乳动物细胞培养物的时间表。优选使用反馈控制系统产生补料曲线。
可使用″基因工程″方法(例如用重组病毒进行病毒感染、转染、转化或电穿孔)使细胞经″基因工程设计″以在将允许表达多肽的重组核酸序列导入细胞时表达特定多肽或蛋白。参见，例如Kaufman等，(1990)，Meth.Enzymol.185：487-511；Current Protocols in MolecularBiology,Ausubel等编辑(Wiley&Sons，New York，1988，且每季更新)。用于表达相关蛋白的基因工程细胞和／或细胞系的方法和载体为本领域技术人员熟知。基因工程技术包括但不限于表达载体、靶向同源重组和基因活化(参见，例如Chappel，美国专利第5272071号)以及通过基因工程转录因子进行的转录活化(参见，例如Segal等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96(6)：2758-63)。多肽任选在异源控制元件(例如天然状态不引导该多肽生产的启动子)控制下表达。举例而言，启动子可为引导哺乳动物多肽表达的强病毒启动子(例如CMV，SV40)。宿主细胞可或不可正常生产该多肽。举例而言，宿主细胞可为经基因工程设计以生产人类多肽的CHO细胞，意指已将编码人类多肽的核酸导入CHO细胞中。
或者，宿主细胞可为经基因工程设计以生产水平增加的通常仅以极低含量存在的人类多肽(例如通过用强病毒启动子替代内源性启动子)的人类细胞。
如本文所使用，″生长期″指经培养细胞快速分裂并且数量增加的时段。在生长期中，一般可在培养基中和经设计以使细胞增殖最大化的条件下培养细胞。
术语″水解产物″包括任何酶消化物，尤其是通过用至少一种能够使物质组份分解为简单形式(例如分解为包含单糖或双糖和／或单肽、二肽或三肽的制剂)的酶处理待萃取物质(例如植物组份或酵母细胞)而制备的特定类型的萃取物。″水解产物″可进一步被酶消化，例如木瓜酶，和／或由自体分解、热解和／或胞浆溶解形成。在本发明的优选实施方案中，水解产物并非由动物来源制备，即非动物源。优选的非动物源水解产物实例包括植物源水解产物，例如大豆源水解产物，及既非衍生自植物也非衍生自动物来源的水解产物，例如酵母源水解产物。
术语″水解产物富集溶液″和″水解产物富集培养基″指含有水解产物或水解产物组合(即自不同来源萃取的水解产物)作为添加至细胞培养物中的主要成份的培养基。例如，可将水解产物富集溶液添加至细胞培养物中以增强蛋白生产。类似地，术语″基础富集溶液″和″基础富集培养基″指含有基础培养基(或基础培养基组合)作为主要成份的培养基。在一个实施方案中，将水解产物富集溶液或基础富集溶液或两种富集溶液的组合添加至细胞培养物中以增加细胞培养物在蛋白生产中的生产率。
如果在含有附加试剂或改变的蛋白生产工艺参数的培养物中生产的多肽量超过在不含有附加试剂或改变的蛋白生产工艺参数的相同培养物中生产的多肽量，则通过添加附加试剂或改变蛋白生产工艺的参数″增加″了蛋白生产。改变蛋白生产工艺的实例包括但不限于添加培养基添加剂，增加补充培养基的量，变化培养温度及细胞培养的氧浓度。可使用补充溶液(例如补料溶液)向细胞培养物提供附加试剂。
术语″成份″指任何可用于细胞培养基中以维持或促进细胞增殖增长的化合物(无论其为化学来源或生物来源)。术语″组份″、″养分″及″成份″可交替使用且均意指该类化合物。用于细胞培养基的典型成份包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白及其类似物。促进或维持细胞离体培养的其他成份可由本领域技术人员在本发明范畴内根据特定需要加以选择。
如本文所使用，术语″接种″指向培养基中添加细胞以起始培养。
″生产期″指细胞生产最大量的重组多肽或蛋白的时段。生产期的特征在于细胞分裂少于生长期中的细胞分裂，且也包括使用经设计以使多肽生产最大化的培养基和培养条件。
″重组多肽″或″重组蛋白″为由基因工程方法生产的多肽或蛋白。在优选的实施方案中，通过在细胞培养物中培养表达该类蛋白的细胞获得重组蛋白。
″过渡期″意指″生长期″与″生产期″之间的细胞培养时段。在过渡期中，可将培养基和环境条件由经设计以使增殖最大化的培养基和条件转变为经设计以使多肽生产最大化的培养基和条件。
本发明提供通过哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢(CHO))细胞培养物生产蛋白(优选重组蛋白，例如抗体)的新颖组合物和方法。本文所述的细胞培养基及方法已用于重组蛋白生产，尤其是重组(完全人类、人源化或嵌合)单克隆抗体的生产。培养基和方法已经多种抗体产品修饰以并入可增加哺乳动物(例如CHO)细胞的生长和生产率的各种改良和进步。下文详细提供本发明的改良组合物和方法的各方面。
II.所关注蛋白
一般而言，本发明方法和组合物适用于生产重组蛋白。重组蛋白为通过基因工程方法生产的蛋白。根据本发明方法和组合物生产的尤其优选蛋白为以蛋白为主的治疗剂，也称作生物制品。优选地，该蛋白作为细胞外产物分泌。
可使用本发明方法和组合物生产的蛋白包括但不限于抗体或其片段。可通过本领域中已知的许多技术来操做编码免疫球蛋白分子的DNA以产生能够编码重组蛋白(例如单链抗体、亲和力增强的抗体或其他以抗体为主的多肽)的DNA(参见，例如Larrick等，1989，Biotechnology7：934-938；Reichmann等，1988，Nature332：323-327；Roberts等，1987，Nature328：731-734；Verhoeyen等，1988，Science239：1534-1536；Chaudhary等，1989，Nature339：394-397，均以参考形式并于本文)。生产完全人类抗体(例如使用转殖基因动物制备，且任选在活体外进一步修饰者)以及人源化抗体的重组细胞也可用于本发明。术语人源化抗体也涵盖单链抗体。参见，例如Cabilly等，美国专利第4816567号；Cabilly等，欧洲专利第0125023 B1号；Boss等，美国专利第4816397号；Boss等，欧洲专利第0120694 B1号；Neuberger,M.S.等，WO86／01533；Neuberger,M.S.等，欧洲专利第0194276 B1号；Winter，美国专利第5225539号；Winter，欧洲专利第0239400B1号；Queen等，欧洲专利第0451216B1号；及Padlan，E.A.等，EP 0 519 596 A1，均以参考形式并于本文。举例而言，本发明可用于生产免疫特异性辨识特异细胞靶标的人类和／或人源化抗体，该类特异细胞靶标例如任一上述蛋白、人类EGF受体、her-2／neu抗原、CEA抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD5、CD11a、CD18、NGF、CD20、CD45、CD52、Ep-cam、其他癌细胞表面分子、TNFα、TGF-b1、VEGF、其他细胞因子、α4β7整合素(integrin)、IgE、病毒蛋白(例如巨细胞病毒)。可使用本发明组合物和方法生产的抗体的实例包括但不限于抗-TNFα抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体和抗-EPO受体(EPO-R)抗体。在一个实施方案中，抗-TNFα抗体为完全人类抗-TNFα抗体，例如阿达木单抗／D2E7(参见美国专利第6090382号，其以参考的方式并于本文；
Figure BDA0000381087840000371
Abbott Laboratories)。在一个实施方案中，抗-IL-12抗体为完全人类抗-IL-12抗体，例如ABT-874(Abbott Laboratories；参见美国专利第6914128号，其以参考方式并于本文)。在一个实施方案中，抗-IL-18抗体为完全人类-IL-18抗体(例如ABT-325)，例如也可参见US20050147610A1中描述的抗体。在一个实施方案中，抗-EPO／R(亦称作ABT-007)抗体为完全人类抗体，如以引用的方式并入本文的美国专利公开案第US20060018902A1号中所描述者。
可使用本发明方法和组合物生产的蛋白类型的另一实例包括融合蛋白。融合蛋白为融合至异源蛋白或肽的蛋白或结构域或蛋白(例如可溶性胞外结构域)。该类融合蛋白的实例包括以含有免疫球蛋白分子部分的融合物表达的蛋白；以含有拉链部分的融合蛋白表达的蛋白；及新颖多功能蛋白，例如细胞因子和生长因子融合蛋白(即GM-CSF及IL-3、MGF及IL-3)。WO93／08207及WO96／40918描述了被称作CD40L的分子各种可溶性寡聚物形式的制备，分别包括免疫球蛋白融合蛋白和拉链融合蛋白；其中所论述的技术可应用于其他蛋白。另一种融合蛋白为重组TNFR：Fc，也称作依那西普(entanercept)。依那西普(或
Figure BDA0000381087840000381
Amgen／Wyeth)为p75TNFα受体胞外部分的两个分子的二聚体，各分子由融合至人类IgG1的232氨基酸Fc部分的235氨基酸TNFR衍生的多肽组成。实际上，任何分子均可表现为融合蛋白，包括但不限于细胞受体分子的胞外结构域、酶、激素、细胞激素、免疫球蛋白分子部分、拉链结构域和表位。
III.本发明的细胞培养基
本发明提供用于生产或表达重组蛋白(例如抗体)的哺乳动物细胞培养的细胞培养基。本文所述各种细胞培养基可独立或共同地用于改良细胞培养，包括增加蛋白生产和延长细胞寿命。
在优选的实施方案中，本发明的细胞培养基为无血清的，意指培养基不含血清(例如胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清或本领域技术人员已知的其它衍生自动物的血清)。
在第一方面，本发明提供包括全部或部分经修饰基础培养基的哺乳动物细胞培养基。经修饰基本细胞培养基可衍生自本领域已知的标准基础细胞培养基。适当的基础培养基包括但不限于杜氏经修饰伊氏培养基(DMEM)、DME／F12、极限必需培养基(MEM)、基础培养基Eagle(BME)、RPMI1640、F-10、F-12、α-极限必需培养基(α-MEM)、Glasgow氏极限必需培养基(G-MEM)、PF CHO及Iscove氏经修饰杜氏培养基。可用于本发明的基础培养基的其他实例包括BME基础培养基(Gibco-Invitrogen；也可参见Eagle，H(1965)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.89，36)；杜氏经修饰Eagle培养基(DMEM，粉末)(Gibco-Invitrogen(#31600)；也可参见Dulbecco and Freeman(1959)Virology8，396；Smith等(1960)Virology12，185.Tissue CultureStandards Commitee，In Vitro6：2，93)；CMRL1066培养基(Gibco-Invitrogen(#11530)；也可参见Parker R.C.等(1957)SpecialPublications，N.Y.Academy of Sciences，5，303)。
可修饰基础培养基以移除存在于标准基础培养基中的特定非营养组份，例如各种无机和有机缓冲剂、表面活性剂和氯化钠。如本文所述，从基础细胞培养基移除该类组份可使剩余营养组份的浓度增加并改良总细胞生长和蛋白表达。此外，根据细胞培养条件的要求可将省略的组份添加回含有经修饰基础细胞培养基的细胞培养基中。如下所述，已发现从基础细胞培养基分离特定成份(即添加经修饰基础细胞培养基作为细胞培养基中的成份)，且随后将成份添加回细胞培养基中作为分离成份会提供对细胞培养物生长和蛋白生产有利的特性。
本发明的经修饰基础培养基排除任何(或所有)以下成份：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖。这些成份常见于市售基础细胞培养基中。
可通过市售培养基服务(例如SAFC PharmaTM)完成组份(例如碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和／或单糖葡萄糖)的排除。本领域技术人员将了解在一个实施方案中可使用市售细胞培养基服务(即定制培养基服务)获得经修饰基础培养基。定制培养基服务的实例可由以下公司提供：例如，SAFC(原JRH Bioscience)、
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Atlanta
Figure BDA0000381087840000392
及Lonza。
或者，本领域普通技术人员可根据制造基础细胞培养基的标准方法制备本发明经修饰基础细胞培养基，其中省略了本文所述的特定成份(参见例如Freshney(2005)Culture of Animal Cells：A Manual ofBasic Technique；BD Bionutrients Technical Manual，(2006)，第三版；Jenkins编辑(1999)，Animal Cell Biotechnology,Methods and Protocols，Humana Press；Doyle and Griffiths编辑，(1997)Essential Techniques：Mammalian Cell Culture，John Wiley and Sons；Butler编辑(1991)Mammalian Cell Biotechnology：A Practical ApproachOxford UniversityPress；Darling及Morgan(1994)Animal Cells：Culture and Media，JohnWiley and Sons；Freshney编辑(1992)，Animal Cell Culture：A PracticalApproach(第2版)，Oxford University Press；Pollard及Walker(1997)，Basic Cell Culture Protocols(第2版)，Humana Press，(Part of theMethods in Molecular Biology series，第75卷)，其各以参考形式并于本文)。
在一个实施方案中，本发明的细胞培养基含有经修饰的基础细胞培养基；铁来源(优选为无机的，例如柠檬酸铁)；重组生长因子；缓冲剂；表面活性剂；渗透压调节剂；能量来源；及至少两种不同的非动物水解产物。此外，经修饰的基础细胞培养基任选可含有氨基酸、维生素或氨基酸与维生素的组合。
如本文所使用，术语″铁″意指用以补充培养基的衍生自非动物的铁来源。细胞培养基中的铁来源优选为无机的。铁来源优选为无机的且包括(例如)铁盐和亚铁盐，例如柠檬酸铁或硫酸亚铁。优选螯合盐，例如柠檬酸铁和柠檬酸铁铵。然而，也可使用并非自动物来源分离的其他铁来源，例如提供等量铁的化学铁螯合剂或重组蛋白铁载剂。可使用的铁螯合化合物包括但不限于铁螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(β-胺基乙醚)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、甲磺酸去铁胺、二巯基丙醇、二乙撑三胺五乙酸(DPTA)和反-1，2-二胺基环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸(CDTA)以及柠檬酸铁螯合剂和硫酸亚铁螯合剂。尤其优选的铁来源为柠檬酸铁，其优选以0.1-1mM浓度存在于终体积细胞培养基中。在另一个实施方案中，柠檬酸铁的浓度为100-150mg／L，例如122mg／L。上述mM(例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0)和mg／L(例如100、110、120、130、140和150)的中间数也可为本发明的一部分。
可包括于细胞培养基中的生长因子的非限制性实例为胰岛素或其重组类似物、IGF-1及胰岛素与IGF-1的组合。尤其优选的重组生长因子为胰岛素或其重组类似物，其优选以约4mg／L至13mg／L的浓度存在于终体积细胞培养基中。上述胰岛素浓度的中间数也可为本发明的一部分，例如4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5和13。
细胞培养基也可包括缓冲剂。在一个优选的实施方案中，缓冲剂自经修饰的基本细胞培养基中排除而作为分离组份添加至细胞培养基中(也向其中添加经修饰的基础细胞培养基)。用于细胞培养基中的缓冲剂为本领域已知。细胞培养基中可包括的缓冲剂的非限制性实例为磷酸盐缓冲剂、HEPES和碳酸氢钠。在一个实施方案中，碳酸氢钠作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度约0.1-3g／L。在一个实施方案中，碳酸氢钠作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度约1.6g／L。在一个实施方案中，HEPES作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度0.1-3g／L。在另一个实施方案中，HEPES作为缓冲剂添加至细胞培养基中，终浓度1.8g／L。在一个实施方案中，将磷酸盐缓冲剂(例如磷酸二氢钠及磷酸氢二钠)添加至细胞培养基中，其终浓度介于0.01与0.5g／L之间。上述浓度的中间数也为本发明的一部分，例如碳酸氢钠或HEPES的浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、2.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0或磷酸盐缓冲剂的浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.36、0.38、0.4、0.42、0.44、0.46、0.48和0.5g／L。
包括缓冲剂以帮助将细胞培养基维持在期望的pH。在一个实施方案中，细胞培养基的pH在6.0至8.0、6.5至7.5、及7.1至7.2之范围内。这些pH值中间数(例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9及8.0)以及本文所述的所有其他数值也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和／或下限值的范围也包括于本发明范畴内。
细胞培养基也可包括渗透压调节剂，例如NaCl。在一个实施方案中，将NaCl添加至细胞培养基中，终浓度在约1.0至6.5g／L之间。在一个实施方案中，细胞培养基的渗透压在260至450mOsmo／kg的范围内。在一个实施方案中，细胞培养基的渗透压在320至450mOsmo／kg的范围内。所述NaCl浓度和mOsmo／kg值的中间数(例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6和6.5的NaCl浓度和260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450的mOsmo／kg范围)以及本文所述所有其他数值也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和／或下限值的范围也包括于本发明范畴内。
本发明的细胞培养基中也可添加能量来源。优选地，能量来源为单糖。可用于细胞培养基中的单糖实例包括葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一个实施方案中，将葡萄糖添加至细胞培养基中，最终浓度约3.5-7.0g／L。在一个实施方案中，将葡萄糖添加至细胞培养基中，终浓度不大于7.0g／L。在一个实施方案中，将葡萄糖添加至细胞培养基中，终浓度约7.0g／L。上述葡萄糖浓度的中间数(例如3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.2、5.8、6、6.2、6.4、6.6、6.8和7)以及本文所述所有其他数值也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和／或下限值的范围也包括于本发明范畴内。
本发明细胞培养基的一个重要成份为添加的水解产物。本发明的细胞培养基可包括源自单一来源(例如酵母或大豆)的水解产物，或可包括水解产物的组合(例如酵母与和豆源水解产物)。优选地，用于本发明细胞培养基的水解产物为非动物源的。非动物源水解产物的实例包括植物源水解产物和非植物源水解产物，例如酵母源水解产物、Tryprone、酪蛋白水解产物、酵母萃取物、或经木瓜酶消化的大豆蛋白胨。用于本发明培养基的水解产物可商业购买，包括例如来自例如Quest International，Norwich，N.Y.，OrganoTechnie，S.A.France，Deutsche Hefewerke GmbH，Germany,或DMV Intl.Delhi，N.Y.来源的HyPep1510.RTM.、Hy-Soy.RTM.、Hy-Yeast412.RTM.和Hi-Yeast444.RTM.。酵母萃取物和大豆水解产物的来源公开于WO98／15614、WO00／03000、WO01／23527和美国专利第5741705号中。也可用于本发明的酵母源水解产物的实例包括TC酵母粉(BD Diagnostic)和酵母粉UF(SAFC Biosciences)，而植物源水解产物的实例包括大豆水解产物UF(SAFC Biosciences)和
Figure BDA0000381087840000431
大豆水解产物(HyClone Media)。
在一个实施方案中，本发明的细胞培养基进一步包括谷氨酰胺，例如L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的适当来源可为各种商业来源，例如Gibco(目录号25030-081)。
本发明的细胞培养基(包括下文实例部分描述的细胞培养基)可任选包括甲氨喋呤。在用于培养CHO细胞的细胞培养基中，甲氨喋呤用量的实例包括约100nM至5000nM甲氨喋呤。上述甲氨喋呤摩尔浓度的中间数(例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800和500nM)以及其他中间数也为本发明的一部分。使用任何上述值的组合作为上限和／或下限值的范围也包括于本发明范畴内。
在大规模生物反应器中，CHO细胞特别易受容器内气体喷射和叶轮混合所产生的剪切力的影响。因此，本发明的细胞培养基也可任选包括细胞保护剂。如本文所使用，术语″细胞保护剂″意指保护真核细胞免受损害的物质。例如，该损害可由剪切力或生物反应容器中的气泡喷射效应引起。为使细胞损害的发生降至最低，培养基最好含有细胞保护剂，例如甲基纤维素、聚乙二醇、聚乙烯醇或pluronic多元醇。其中，优选Pluronic.RTM.(多元醇，BASF Wyandotte Corp.)多元醇F68，因为其不像聚乙烯醇，其为无毒物质且不像聚乙二醇，其并不干扰下游纯化。
本发明的细胞培养基也可包括非铁金属离子。非铁金属离子的实例包括但不限于氯化物和硫酸盐、钾、镁、铜、硒、锌、镍、锰、锡、镉、钼酸盐、钒酸盐和硅酸盐。
本发明的细胞培养基也可包括维生素和酶辅因子。该类维生素和酶辅因子的实例包括但不限于PABA(对氨基苯甲酸)、维生素K(生物素)、维生素B5(D-泛酸钙)、叶酸、内消旋肌醇、烟酰胺(菸酸酰胺)、维生素B6(盐酸吡多辛(PyrdoxineHCl))(及盐酸吡哆醛(PyrodoxalHCl))、维生素B2(核黄素)、维生素B1(硫胺素)和维生素B12(氰钴胺素(cyanocobalamin))。或者，可向培养基中添加维生素C(L-抗坏血酸)。也可添加氯化胆碱，通常认为其为维生素但也可作为脂质因子。
此外，本发明的细胞培养基也可包括脂质样因子。脂质因子的实例包括氯化胆碱和磷脂酰胆碱。也可包括脂质生产助剂，例如醇胺(例如乙醇胺)。
在本发明的方法和组合物中，优选在无血清培养基中培养细胞。应用于培养基的术语″无血清″包括不含有血清(例如胎牛血清)的任何哺乳动物细胞培养基。
本发明范畴内也包括本文所述的任何改良细胞培养基中的哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在本发明的一方面提供为生产特定抗体而优化的细胞培养基配方。优选配方的实例包括用于表达下列抗体的CHO细胞生长或蛋白生产的细胞培养基：抗-TNFα抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体和抗-EPO受体(EPO-R)抗体。
本发明中包括表达抗-TNFα抗体(包括完全人类抗-TNFα抗体)的哺乳动物细胞(例如CHO细胞)的细胞培养基。在优选的实施方案中，完全人类抗-TNFα抗体为阿达木单抗(也称作D2E7及
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Abbott Laboratories)。阿达木单抗(包括核酸和氨基酸序列)的特征描述于美国专利第6090382中，其以参考形式并于本文。可通过在细胞培养生长培养基中培养包含编码蛋白(例如阿达木单抗)的核酸的哺乳动物细胞(例如CHO细胞)，将细胞培养物转移至细胞培养生产培养基中且将蛋白从细胞培养生产培养基中分离生产阿达木单抗。
在一个实施方案中，本发明提供为包含编码阿达木单抗的核酸的CHO细胞而优化的细胞培养生长培养基。为表达阿达木单抗的CHO细胞而优化的无血清细胞培养生长培养基的配方包括：基础培养基；柠檬酸铁(例如约8-12ml／kg，约10.0ml／kg或122mg／L)；重组人胰岛素(例如约2-6mg／kg，约4.0mg／kg)；无水葡萄糖(例如约2-5mg／kg，约3.5g/kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.29g／kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g／kg)；及酵母源水解产物(例如约2.0g／kg)。为表达阿达木单抗的CHO细胞而优化的无血清细胞培养生长培养基的另一实例包括以下成份：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10.0ml／kg或122.45mg／kg)；重组人胰岛素(例如约3.8至3.9mL／kg或7.8mg／kg)；无水葡萄糖(例如约7.0g/kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.8至0.9g／kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；HEPES(例如约1.8g／kg)；NaCl(例如约2.6至2.7g／kg)；Pluronic F-68(例如约1.0g／kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03至0.04g／kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g／kg)；L-天冬酰胺一水合物(例如约0.45g／kg)；酵母源水解产物(例如约4.0g/kg)；及植物源水解产物(例如约2.6g／kg)。表达阿达木单抗的细胞培养生长培养基可进一步包括甲氨喋呤，例如约2.50mL／kg。
在一个实施方案中，本发明提供为表达抗体(包括，例如，人类抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗)或红细胞生成素受体(EPO／R)抗体)的CHO细胞而优化的细胞培养生产培养基。抗-EPO/R抗体的实例描述于美国专利公开案第20040071694号中，其以参考形式并于本文。为表达抗体(例如阿达木单抗或抗-EPO／R抗体)的CHO细胞而优化的无血清细胞培养生产培养基配方包括：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10.0ml／kg或122.45mg／L)；重组人胰岛素(例如约6.0mL／kg或12mg／kg)；无水葡萄糖(例如约7.0g／kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.58至0.59g/kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；HEPES(例如约1.8g／kg)；NaCl(例如约2.4至2.5g／kg)；Pluronic F-68(例如约1.0g／kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03至0.04g／kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g／kg)；酵母源水解产物(例如约10.7g／kg)；及植物源水解产物(例如约6.9至7.0g/kg)。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基具有介于约7.1至7.2范围内的pH值及介于373至403mOSm／kg范围内的渗透压。
本发明的另一方面涉及使由CHO细胞生产的抗-白介素-12(IL-12)抗体(例如完全人类IL-12抗体)的生产最优化的细胞培养基。在优选的实施方案中，完全人类抗-IL12抗体为ABT-874。ABT-874(包括核酸和氨基酸序列)的特点描述于美国专利第6914128号中，其以参考文献的形式并于本文。
在一个实施方案中，为表达ABT-874的CHO细胞生长而优化的无血清细胞培养生长培养基包括下列各物质：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml／kg或122.45mg／L)；重组人胰岛素(例如约3.8至3.9mL／kg或7.8mg／kg)；无水葡萄糖(例如约7.0g／kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.87至0.88g／kg)；L-天冬酰胺一水合物(例如约0.45g／kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；HEPES(例如约1.8g/kg)；NaCl(例如约2.67至2.68g／kg)；约PluronicF-68(例如1.0g／kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03至0.04g／kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g／kg)；酵母源水解产物(例如约4.0g／kg)；及植物源水解产物(例如约2.6g/kg)。
在一个实施方案中，用于表达ABT-874的无血清细胞培养生产培养基包括下列各物：维生素含量降低且排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml／kg或122.45mg／L)；重组人胰岛素(例如约6.5mL／kg或13mg／kg)；无水葡萄糖(例如约7.0g／kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.58至0.59g/kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；HEPES(例如约1.8g/kg)；NaCl(例如约2.45g／kg)；PluronicF-68(例如约1.0g／kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g／kg)；酵母源水解产物(例如约10.7g／kg)；及植物源水解产物(例如约6.9至7.0g／kg)。
在一个实施方案中，本发明提供表达抗体(例如抗-IL12及抗-EPO／R抗体)的CHO细胞的无血清细胞培养生长培养基，其包含下列各物质：基础培养基；柠檬酸铁(例如约10ml／kg或122.45mg／L)；重组人胰岛素(例如约4mg／kg)；无水葡萄糖(例如约1.5g/kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.29至0.30g／kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g/kg)；及酵母源水解产物(例如至少约2g／kg)。在一个实施方案中，表达抗体(例如抗-IL-12及抗-EPO/R抗体)的CHO细胞的细胞培养生长培养基具有约7.10至7.30的pH值及约300至340mOsmo／kg的渗透压。细胞培养基也可含有酵母源水解产物(例如至少约8g／kg)。
本发明的另一方面涉及为由CHO细胞生产抗白介素18(IL-18)抗体(例如完全人类IL-18抗体)的生产而优化的细胞培养基。可使用本发明方法和组合物生产的完全人类IL-18抗体的实例描述于PCT公开案WO01／058956中，其以参考形式并于本文。
在一个实施方案中，为CHO细胞中IL-18抗体生产而优化的细胞培养生长培养基包括下列成份：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂的单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml／kg或122.45mg／L)；重组人胰岛素(例如约3.8至3.9mL／kg或7.8mg／kg)；无水葡萄糖(例如约7.0g／kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.87至0.88g／kg)；L-天冬酰胺一水合物(例如约0.45g/kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；HEPES(例如约1.8g/kg)；NaCl(例如约2.67g／kg)；Pluronic F-68(例如约1.0g／kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03至0.04g／kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g／kg)；酵母源水解产物(例如约4.0g／kg)；及植物源水解产物(例如约2.6g／kg)。用于表达完全人类IL-18抗体的细胞生长的细胞培养基可具有7.10至7.20的pH值及373至403mOsmo／kg的渗透压。上述数值(例如所述胰岛素、pH或渗透压值)的中间数也为本发明的一部分。
为CHO细胞中IL-18抗体生产而优化的细胞培养生产培养基实例包括下列成份：经修饰的基础培养基，其经修饰以去除下列组份：碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml／kg或122.45mg／L)；重组人胰岛素(例如约6.0mL／kg或12mg／kg)；无水葡萄糖(例如约7.0g／kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.58至0.59g/kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；HEPES(例如约1.8g／kg)；NaCl(例如约2.45g／kg)；PluronicF-68(例如约1.0g／kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g／kg)；酵母源水解产物(例如约10.7g／kg)；及植物源水解产物(例如约6.9至7.0g／kg)。用于生产完全人类抗-IL-18抗体的细胞培养生产培养基的另一实例包括：排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；柠檬酸铁(例如约10ml／kg或122.45mg／L)；重组人胰岛素(例如约6.5mL／kg或13mg／kg)；无水葡萄糖(例如约7.0g／kg)；L-谷氨酰胺(例如约0.58至0.59g／kg)；碳酸氢钠(例如约1.6g／kg)；HEPES(例如约1.8g／kg)；NaCl(例如约2.45g/kg)；Pluronic F-68(例如约1.0g/kg)；NaH2PO4·H2O(例如约0.03至0.04g/kg)；Na2HPO4·7H2O(例如约0.43至0.44g/kg)；酵母源水解产物(例如约14.2至14.3g/kg)；及植物源水解产物(例如约9.2至9.3g/kg)。生产完全人类IL-18抗体的CHO细胞的细胞培养基可具有7.10至7.20的pH值及373至403mOsmo/kg的渗透压。上述数值(例如所述胰岛素、pH或渗透压值)的中间数也为本发明的一部分。
除实施例部分所述的示例性培养基以外，下文也描述了与改良抗体生产分批补料方法和补充培养基相关的本发明范畴内的培养基的其它实例。
本发明培养基可用于通过使培养基或其组份与所有或部分细胞群接触来实现适当细胞培养。可通过混合、添加、组合、接种或搅拌一或多种细胞与一或多种化合物、溶液、培养基等而使培养基与细胞接触。亦可通过(例如)″补料″以替代或补充下文更详细描述的培养细胞的培养基而使培养基与细胞一次性、以增量形式或以逐步方式接触。
IV.用于改良蛋白生产的方法和组合物
本发明方法或组合物涉及哺乳动物细胞培养。在一个实施方案中，所使用的哺乳动物细胞为CHO细胞。
已描述将DNA导入哺乳动物细胞中的既定方法。Kaufman，R.J.，Large Scale Mammalian Cell Culture，1990，第15-69页。使用市售试剂(例如阳离子脂质试剂LipofectamineTM、lipofectamineTM-2000或lipofectamineTM-plus(可购自Invitrogen))的附加方案可用以转染细胞。Feigner等人(1987).，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413-7417。此外，用涂渍了核酸的颗粒进行电穿孔或轰击可用以使用程序转染哺乳动物细胞，例如下列文献中的程序：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)和Fitzpatrick-McElligott(1992)，Biotechnology(NY)10(9)：1036-40。可使用本领域已知方法(例如对细胞毒性药物的抗性)进行稳定转化子的选择。Kaufman等人((1990)，Meth.Enzymology185：487-511)描述了若干选择机制，例如二氢叶酸还原酶(DHFR)抗性。DHFR选择的适当宿主菌株可为缺失DHFR的CHO菌株DX-B11。Urlaub及Chasin(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220。可将表达DHFR cDNA的质粒导入菌株DX-B11中且只有含有质粒的细胞可于适当选择培养基中生长。可并入表达载体中的可选择标记的其他实例包括赋予抗生素(例如G418及匀霉素B)抗性的cDNA。可基于对这些化合物的抗性选择含有载体的细胞。
已显示可改良哺乳动物表达载体的异源基因表达的附加控制序列包括下列元件：衍生自CHO细胞的表达加强序列元件(EASE)(Morris等，Animal Cell Technology，第529-534页(1997)；美国专利第6312951 B1号、第6027915号和第6309841 B1号)及来自腺病毒2的三联前导序列(TPL)和VA基因RNA(Gingeras等(1982)，J.Biol.Chem.257：13475-13491)。病毒来源的内部核糖体进入位点(IRES)序列使得双顺反子mRNA有效翻译(Oh和Sarnow(1993)，CurrentOpinion in Genetics and Development3：295-300；Ramesh等人(1996)，Nucleic Acids Research24：2697-2700)。异源cDNA以双顺反子mRNA部分(后面为筛选标记的基因(例如DHFR))表达的部分已显示可改良宿主的转染能力和异种cDNA的表达(Kaufman等人(1990)，Methods in Enzymol.185：487-511)。采用双顺反子mRNA的示例性表达载体为Mosser等，Biotechniques22：150-161(1997)描述的pTR-DC/GFP及Morris等，Animal Cell Technology，第529-534页(1997)描述的p2A5I。
Mosley等人已描述了一种可用的高表达载体pCAVNOT((1989)，Cell59：335-348)。可如Okayama及Berg所公开经((1983)，Mol.Cell.Biol.3：280)构建用于哺乳动物宿主细胞中的其他表达载体。适用在C127鼠类乳腺上皮细胞中哺乳动物cDNA的稳定高水平表达的系统可大体上如Cosman等人所述构建((1986)，Mol.Immunol.23：935)。Cosman等人描述的可用高表达载体PMLSV N1/N4((1984)，Nature312：768)已保藏为ATCC39890。其它可用的哺乳动物表达载体描述于EP专利第-A-0 367 566号和WO01/27299A1。载体可衍生自反转录病毒。可添加异源信号序列替代天然信号序列，该类异源信号序列例如以下序列之一：美国专利第4965195号中描述的IL-7信号序列；Cosman等人描述的IL-2受体信号序列(Nature312：768(1984))；EP专利第0 367 566号描述的IL-4信号肽序列；美国专利第4968607号中描述的IL-1受体型信号肽；及EP专利第0 460 846号中描述的II型IL-1受体信号肽。
可在真核细胞中重组生产多肽且优选由适合于细胞培养物中生长的宿主细胞分泌。用于本发明的宿主细胞优选为哺乳动物细胞。该类细胞也可经基因工程改造表达所关注基因，可为适合于细胞培养物中生长的哺乳动物生产细胞和/或可为同源细胞株。常用于工业中的该类细胞的实例为VERO、BHK、HeLa、CV1(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞株(例如NSO、NS1)、PC12、WI38细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，该类细胞广泛地用于生产数种复合重组多肽，例如细胞激素、凝血因子和抗体(Brasel等(1996)，Blood88：2004-2012；Kaufman等(1988)，J.Biol Chem263：6352-6362；McKinnon等(1991)，J Mol Endocrinol6：231-239；Wood等(1990)，J.Immunol.145：3011-3016)。缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变细胞株(Urlaub等(1980)，Proc Natl Acad Sci USA77：4216-4220，其以参考形式并于本文)DXB11和DG-44为合乎需要的CHO宿主细胞株，因为有效DHFR可选择和可扩增基因表达系统使得该类细胞中高水平表达重组多肽(Kaufman R.J.(1990)，Meth Enzymol 185：537-566，其以参考形式并于本文)。此外，这些细胞易于作为粘附或混悬培养物操纵且显示相对优良的遗传稳定性。CHO细胞和其中表达的重组多肽已被广泛地特性研究且已经管理机构许可用于临床商业制造。也可使用生产抗体的杂交瘤细胞株实践本发明方法。制造杂交瘤的方法为本领域熟知。参见例如Berzofsky等，Paul编辑，Fundamental Immunology，第2版，第315-356页，347-350，Raven Press Ltd.，New York(1989)。衍生自上述细胞系的细胞株也适用于实践本发明。
用编码重组蛋白的多聚核苷酸序列转化适当的哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞)后，鉴定并分离显示稳定表达重组蛋白的细胞。可根据本领域的已知方法，通过将适当DNA载体转染至二氢叶酸还原酶缺乏(DHFR-)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO AM-1/D，美国专利第6210924号)中，随后分离且检测显示最高重组蛋白表达的个别纯系而完成重组蛋白的稳定表达。基于小规模旋转器和较大规模生物反应器中的生长和生产，选择特定细胞株作为生产重组蛋白的细胞株。
可通过本领域熟知的方法(例如，通过在不含血清的条件下于96和/或24孔板中进行多轮限制性稀释)，使用本发明细胞培养基克隆生产最高含量重组蛋白的细胞。基于各种悬浮容器中的生产和生长特征来选择克隆。可进行酶免疫测定法(EIA)选择生产最高水平重组蛋白的克隆。可通过使克隆在介于100ml至高达3L范围内的各种振荡器或旋转烧瓶及生物反应器中的生长来测量生长特征(包括倍增时间和密度)。选择最佳克隆(例如可在培养物中达到最高密度的最快倍增时间的克隆)且选择其作为用于重组蛋白生产的细胞系。在一个实施方案中，重组蛋白生产用于商业目的且使用大规模生物反应器进行。
通常，在组织培养板(例如10cm培养板、96孔培养板等)或其他粘附培养(例如微载体珠)和悬浮培养(例如滚瓶中)，在无菌、温度受控和大气条件下进行细胞培养。培养物可在摇瓶、小规模生物反应器和/或大规模生物反应器中生长。生物反应器为用以培养细胞的装置，在生物反应器中可监测、调节并控制环境条件，例如温度、空气、搅拌和/或pH值。本发明方法(包括分批补料方法)和组合物可用于大规模哺乳动物细胞培养，例如10L、11L、12L、13L、14L等。在一个实施方案中，本发明的大规模细胞培养方法和组合物适用于CHO细胞培养和抗体生产。
根据本发明，在促进所关注多肽(可为抗体或重组多肽)生产的条件下培养哺乳动物宿主细胞。本领域技术人员可选择使用本文所述的一或多种经研发以使特定培养宿主细胞中的细胞生长、细胞活力和/或重组多肽生产最大化的细胞培养基。或者，本发明方法和组合物可与市售细胞培养基组合使用。
哺乳动物细胞的适当培养条件为本领域已知(参见例如Animalcell culture：A Practical Approach，D.Rickwood编，Oxford universitypress，New York(1992))且可与的本发明的改良方法组合。可以悬浮状态或附著至固体基质上培养哺乳动物细胞。此外，也可(例如)在具有或不具有微载体的流体化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌槽生物反应器中培养哺乳动物细胞且以分批、分批补料、连续、半连续或灌注模式进行。
根据本发明的方法可用以改良单一阶段和多阶段培养过程中的重组多肽生产。在单一阶段过程中，将细胞接种至培养环境中且在单一生产期间采用所公开的方法。在多阶段过程中，在两个或两个以上不同阶段中培养细胞。举例而言，首先可在生长期，在使细胞增殖和活力最大化的环境条件下培养细胞，接着在使多肽生产最大化的条件下将其转移至生产期。生长期和生产期可在一或多个过渡期之后或被一或多个过渡期所分离。在多阶段过程中，至少可在生产期中采用本发明方法。
为达成理解而非限制目的，本领域技术人员应理解蛋白生产的细胞培养和培养周期可包括三种通用类型：即，连续培养、分批培养和分批补料培养。在连续培养中，例如，在培养期间向细胞提供新鲜培养基补充物(即补入培养基)，同时每日移除旧培养基且(例如)每日或连续收集产物。在连续培养中，可每日添加并可连续(即点滴或灌注)添加补入培养基。对于连续培养而言，可如需要将细胞保持于培养物，只要细胞保持存活并且维持环境和培养条件即可。
在分批培养中，最初在培养基中培养细胞且在培养周期中或在培养周期结束前不移除、替代也不补充该培养基，即不用新鲜培养基向细胞″补料″。在培养周期结束时，收集所需产物。
对于分批补料培养而言，通过在培养周期中每日(或连续地)一或多次用营养溶液补充培养基，即在培养期间用补入培养基对细胞″补料″，延长培养周期时间。分批补料培养可包括如下所述的各种补料方案和次数，例如每日、每隔一日、每两日等、每日一次以上或每日少于一次等。此外，可用补入培养基对分批补料培养物连续补料。接着，在培养/生产周期结束时收集所需产物。本发明优选涵盖分批补料细胞培养物，其中使用可增加蛋白生产并可延长蛋白生产期的优化补料溶液进行补料。
改良分批补料培养物：水解产物和基础富集溶液
本发明的一方面为使用改良分批补料方法和补充基础溶液及水解产物溶液组合增加蛋白生产的方法和组合物。改良分批补料方法部分基于添加两种富集溶液(即水解产物富集溶液和基础富集溶液)，该类富集溶液在蛋白生产时段中添加至细胞培养基中。用于本发明的分批补料方法的水解产物富集溶液包含并非衍生自植物或动物的第一水解产物和第二植物源水解产物。并非衍生自植物或动物且并为植物源水解产物的水解产物的实例为酵母源水解产物。可用于水解产物富集溶液中的植物源水解产物的实例为大豆源水解产物。基础富集溶液包括基础培养基，例如PF CHO、天冬酰胺和葡萄糖，且水解产物富集溶液包括至少两个不同的非动物源水解产物。在一定时段中以一定时间间隔(例如在11-15天的时段中以每日时间间隔)将水解产物和基础富集溶液添加至细胞培养物中，且可于同一日或不同日添加。
本发明表征了一种生产抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗/D2E7)的分批补料方法，其包含在介于32至38℃范围内的培养温度下在细胞培养物中培养包含编码抗-TNFα抗体的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，培养温度为35℃。向CHO细胞补入水解产物富集溶液和基础富集溶液以处理(例如解决或校正)营养缺乏以使生产率最大化。将水解产物和基础富集溶液添加至细胞培养物中。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含介于20与65％之间的溶氧，例如约30％溶氧。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基含有蛋白生产所需的葡萄糖含量，例如至少约1-5g/L葡萄糖。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含约1.5-2.5g/L葡萄糖。在另一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含约2g/L葡萄糖。在整个蛋白生产培养过程中，可通过按需要向细胞培养生产培养基中添加葡萄糖以维持所给定浓度(例如至少约2.0g/L葡萄糖)来控制葡萄糖浓度。在一个实施方案中，用于抗-TNFα抗体的分批补料方法的水解产物富集溶液基本由下列各物组成：约50-280g/L大豆源水解产物(包括其间的范围和数值，例如，100-225，50-225，225-275和265g/L)和约75-300g/L酵母源水解产物(包括其间的范围和数值，例如，100-250，150-200，145-175和165g/L)。
为用于在CHO细胞中生产抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗/D2E7)的分批补料方法而优化的基础富集溶液具有约9.0至10.5的pH值(包括其间的范围和数值，例如，9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5)。添加水解产物富集溶液和基础富集溶液的时段在9至15天之间，例如12天。在一个实施方案中，在该时段以下各日的至少一日将基础富集溶液添加至细胞培养基中：第4日、第6日、第9日和第11日，且在该时段的第4日、第7日或第4日和第7日将水解产物富集溶液添加至细胞培养基中。
在另一备选实施例中，用于生产抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗/D2E7)的分批补料方法可包括根据pH值线性斜坡(包含自约6.5-8(例如，7.1至7.2)的pH值起始且产生最终约6.9的pH值)调节细胞培养基的pH值。在一个实施方案中，在至少约24小时、48小时或72小时的时段内调节pH值线性斜坡。
本发明也涉及生产抗-IL12抗体(例如ABT-874)的分批补料方法，其包含在介于32至38℃(例如33℃)范围内的培养温度下在细胞培养物中培养包含编码抗-IL12抗体的核酸的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用于IL-12抗体生产的水解产物富集溶液也可含有葡萄糖。在一个实施方案中，在约6.9的pH值下培养CHO细胞。向CHO细胞补入水解产物富集溶液和基础富集溶液以维持营养缺乏，以使生产率最大化。将水解产物和基础富集溶液添加至细胞培养物中。在一个实施方案中，细胞培养生产培养基包含介于20与65％之间的溶氧，例如约40％溶氧。在一个实施方案中，用于抗-IL12抗体的分批补料方法的水解产物富集溶液基本由下列各物组成：约50-280g/L大豆源水解产物(包括其间的范围和数值，例如，100-225、50-225、255-275和165g/L)、约75-300g/L酵母源水解产物(包括其间的范围和数值，例如，100-250、150-200、145-175和165g/L)和约2.4g/L葡萄糖。为用于在CHO细胞中表达抗-IL12抗体(例如ABT-874)的分批补料方法而优化的基础富集溶液具有约9.7的pH值及约1480mOsm的渗透压。添加水解产物富集溶液和基础富集溶液的时段在14至15天之间，例如12天。在一个实施方案中，在该时段的第5日起每隔一天将基础富集溶液添加至细胞培养生产培养基中，且在该时段的第6日起每天将水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。或者，可在该时段的第5日起始每天将基础富集溶液和水解产物富集溶液添加至细胞培养生产培养基中。
稳定、高浓度补料溶液
本发明一方面涉及与用于改良蛋白生产率的改良、稳定高浓度补料溶液相关的方法和组合物。改良补料溶液可用于在抗体生产中补充细胞培养生产培养基。补料溶液包括葡萄糖(例如100至250g/kg)；基础培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸，例如天冬酰胺(例如1.0至15.0g/kg；3-12.5g/kghuo3-5g/kg)；以及至少两种不同的非动物源水解产物。此外，补料溶液具有约6.0至7.5的pH值。两种不同的非动物源水解产物可包括植物源水解产物，例如大豆源水解产物，和并非动物源或植物源的水解产物，例如酵母源水解产物。本领域中已知的任何基础培养基均可用于改良补料溶液，包括但不限于PF CHO或DMEM/F12培养基。也可使用经修饰的基础培养基。在一个实施方案中，基础细胞培养基排除以下组份：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂、谷氨酰胺和葡萄糖。改良补料溶液为稳定的，具有小于约15NTU的浊度。本发明也包括通过添加补料溶液维持细胞培养生产培养基的稳定葡萄糖含量。上述范围值的中间数也为本发明的一部分，例如，3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8和5g/kg天冬酰胺。
本发明也包括一种用于制造包含葡萄糖和至少两种不同非动物源水解产物的补料溶液的方法。制造补料溶液的方法包括将葡萄糖与基础细胞培养基组合为组合溶液并将组合溶液的pH值调节至约9.5至10.5。接着，将至少两种不同的非动物源水解产物添加至溶液中并再次调节pH值，使得所得补料溶液具有约6.5至7.5的pH值。上述范围值的中间数也为本发明的一部分，例如，6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5的pH。
本发明的补料溶液可用以完成自哺乳动物细胞培养物生产高含量重组蛋白，例如生产抗体。在一个实施方案中，本发明涉及由哺乳动物细胞培养物生产至少约4g/L抗体的方法，其包含在细胞培养生产培养基中培养包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞。接着，将pH值约6.7至7.0的补料溶液添加至细胞培养生产培养基中。补料溶液包括葡萄糖(例如约100至200g/kg)；基础细胞培养基；除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物。在一个实施方案中，该方法可生产至少约4g/L抗体，至少约5g/L抗体；至少约6g/L抗体。上述范围值的中间数也为本发明的一部分，例如，1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.55g/L抗体。
通过使用pH值约6.7至7.0并包括下列组份的补料溶液：葡萄糖；基础细胞培养基；约除谷氨酰胺以外的氨基酸；及至少两种不同的非动物源水解产物，可增加自哺乳动物细胞培养物生产的抗体滴度。在一个实施方案中，将补料溶液添加至包含编码抗体的核酸的哺乳动物细胞的细胞培养生产培养基中，致使比不添加补料溶液培养的对照哺乳动物细胞培养物增加至少50％。在一个实施方案中，添加补料溶液会生产比对照物增加至少100％的滴度。在一个实施方案中，添加补料溶液会产生比对照物增加至少150％的滴度。可将补充补料溶液在特定细胞浓度下添加至细胞培养物中，例如当细胞密度达到每毫升2.0×106个细胞或当细胞密度达到每毫升约3.5×106个细胞时。以上范围的中间数以及本文中所引用的所有其他数均为本发明的一部分。使用上述值的任何组合作为上限和/或下限的数值范围包括于本发明范畴内。
由于本发明的分批补料方法用以处理(例如解决或校正)生产蛋白(例如抗体)的特定细胞培养物的营养要求，因此监控特定成份是有利的。可监控的成份包括任何代谢指示剂，即细胞代谢指示剂。在一个实施方案中，本发明的分批补料方法包含监控细胞培养基中的葡萄糖水平，包括监控葡萄糖水平以使其维持于0.25-20g/L之间。在一个实施方案中，葡萄糖水平维持在0.5至5.5g/L之间，或4.0-5.5g/L。通过监控葡萄糖水平，可间接监控细胞代谢。如以下实例3中所述，可将葡萄糖用作代谢指示剂。在一个实施方案中，可基于葡萄糖水平以营养组份(例如水解产物)补充细胞培养物。监控葡萄糖含量的方法为本领域已知并可包括使用自动取样装置进行监控。可使用的代谢指示剂的另一实例为谷氨酰胺。以上范围的中间数以及本文中所引用的所有其他数均为本发明的一部分。使用上述值的任何组合作为上限和/或下限的数值范围包括于本发明范畴内。
反馈控制系统可用以监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂水平。在一个实施方案中，为了满足所需参数设定点(例如预定葡萄糖水平)，如反馈控制系统所测定将组合补料溶液添加至细胞培养生产培养基中。
反馈控制系统也可用以测定给定哺乳动物细胞培养物和所关注蛋白生产的补入曲线。在一个实施方案中，确定用于在哺乳动物细胞培养物中生产蛋白的补入曲线的方法包含：在细胞培养生产培养基中培养包含编码蛋白的核酸的哺乳动物细胞；使用反馈控制系统监控细胞培养生产培养基中的代谢指示剂，藉此将补料溶液(例如组合补料溶液)添加至细胞培养生产培养基中。将补料溶液添加至细胞培养生产培养基中以达到目标代谢指示剂设定点，例如葡萄糖水平。根据细胞培养结论，测定每天添加至细胞培养生产培养基中的补料溶液的量并提供应于何时将补料溶液添加至细胞培养物中的补入曲线。一旦确立补入曲线，则不再需要监控生产所关注蛋白的给定哺乳动物细胞培养物的代谢指示剂。
N-乙酰半胱氨酸和丁酸钠方法及组合物
如上所述，本发明的细胞培养方法可有利达到增加抗体滴度。用于达到在哺乳动物细胞培养物中的蛋白生产率的本发明另一方面为通过向细胞培养基中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，本发明涉及通过向细胞培养基中添加丁酸钠(例如0.1mM至10mM)、N-乙酰半胱氨酸(例如1mM至80mM)或其组合而生产抗体的方法。在一个实施方案中，抗体滴度至少约100mg/L；至少约150mg/L；或至少约200mg/L；至少约250mg/L；至少约300mg/L；至少约350mg/L；或至少约400mg/L。
本发明也涉及通过向细胞培养基中添加丁酸钠(例如终浓度0.1mM至10mM)、N-乙酰半胱氨酸(例如终浓度1mM至80mM)或其组合(对照物相应地缺乏丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合)而在哺乳动物细胞培养物中生产抗体，从而使得抗体滴度比对照哺乳动细胞培养物改良至少10％的方法。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物改良至少29％；比对照哺乳动物细胞培养物改良至少40％；比对照哺乳动物细胞培养物改良至少70％；或比对照哺乳动物细胞培养物高至少90％。可在哺乳动物细胞培养物的生长期中向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，在培养时间的第4日与第7日之间向哺乳动物细胞培养物中添加丁酸钠、N-乙酰半胱氨酸或其组合。在一个实施方案中，以介于5mM至80mM的终浓度(例如20-60mM或约10mM)单独添加N-乙酰半胱氨酸或与丁酸钠组合。
本发明也涉及通过向细胞培养基中添加约0.1mM至10mM N-乙酰半胱氨酸(对照物缺少此添加)使得哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约45％的方法。在一个实施方案中，哺乳动物细胞培养物的寿命与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约35％；或与对照哺乳动物细胞培养物相比延长至少约55％。
应注意，本文所描述的细胞培养基和改良培养方法可独立或彼此组合使用。
在使用本发明方法和组合物进行培养后，接着可回收或收集所得表达蛋白。此外，可使用已知方法将自该培养物或组份(例如自培养基或细胞萃取物或体液)纯化或部分纯化蛋白。分级分离程序包括但不限于过滤、离心、沉淀、相分离、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用层析(HIC，使用例如苯基醚、丁醚或丙醚的树脂)、HPLC或上述步骤的一些组合。
举例而言，多肽纯化可包括含有将结合至多肽的试剂的亲柱；在该类亲和树脂(例如刀豆球蛋白A琼脂糖、HEPARIN-TOYOPEARL(层析介质)或Cibacrom blue3GA SEPHAROSE(琼脂糖颗粒))上进行的一个或多个柱层析步骤；包括洗脱的一个或多个步骤；和/或免疫亲和层析。可以促进纯化的形式表达多肽。举例而言，其可表达为融合多肽，例如麦芽糖结合多肽(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或硫氧还蛋白(TRX)的融合多肽。表达且纯化该类融合多肽的试剂盒可分别购自New England BioLab(Beverly,Mass.)、Pharmacia(Piscataway,N.J.)和In Vitrogen。可用表位标记多肽且随后使用针对该表位的特定抗体纯化。一种该表位FLAG(表位标记)购自Kodak(New Haven，Conn.)。也可能将包含多肽结合多肽(例如结合至重组蛋白的单克隆抗体)的亲和柱用于亲和力纯化所表达多肽。其他类型的亲和纯化步骤可为蛋白A或蛋白G柱，其中亲和试剂结合至含有Fc结构域的蛋白。可使用常规技术将多肽自亲和柱移除，例如在高盐洗脱缓冲剂中并接着在低盐缓冲剂中透析以供使用或根据所使用的亲和基质改变pH值或其他组份；或可使用亲和部分的天然底物竞争性移除。在一个实施方案中，根据US申请案第11/732918号(以参考形式并于本文)所述方法纯化使用本发明方法和组合物生产的抗体。
所需的最终纯度取决于多肽的预期用途。本发明方法和组合物适用于所关注蛋白的治疗用途。因此，当预期在活体内给予多肽时，需要相对较高的纯度。在该情况下，将多肽纯化，使得在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析时不能检测到对应于其他多肽的多肽条带。相关领域技术人员应理解，由于差异糖基化、差异翻译后加工及其类似技术，通过SDS-PAGE可观测到多个对应于多肽的条带。最优选地，将本发明多肽纯化至大体均质，如通过SDS-PAGE进行分析时的单一多肽条带所指示。可通过银染、考马斯蓝染色或(如果多肽经放射性标记)通过放射自显影目测多肽条带。
本发明也任选涵盖进一步配制蛋白。术语″配制″意指蛋白可经缓冲液交换、杀菌、大体积包装和/或包装以用于最后使用者。该类组合物可包含与其他组份(例如生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂)组合的有效量蛋白。术语″生理学上可接受″意指不干扰活性成份的生物活性有效性的无毒材料。
应注意，关于本文所引用的数值，以上范围的中间数以及本文所引用的所有其他数值为本发明的一部分。使用上述数值的任何组合作为上限和/或下限的数值范围包括于本发明范畴内。
实施例
以下实施例举例说明用于培养哺乳动物细胞的改良方法和组合物，包括用于在哺乳动物细胞中表达生物制品的改良方法和组合物。下文揭示用以培养中国仓鼠卵巢(CHO)细胞以表达各种重组生物制品的改良生化成分确定的培养基。此外，也举例说明在以各种形式和规模运作的生物反应器中，含有相同组份但具有不同组份平衡且经富集以使更多细胞生长和产物表达增加的大规模培养细胞的培养基。
实施例1：培养哺乳动物细胞的改良培养基
通常，哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢(CHO))细胞培养基基于市售培养基配方，例如DMEM、Ham氏F12或这些类型培养基的组合。为了在哺乳动物细胞中生产蛋白，细胞培养基必须充分富集以支持细胞生长和生物制品产品表达的增加。以下实施例描述用于培养哺乳动物细胞(即中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)以表达包括抗体的各种重组生物制品的改良生化成分确定的培养基。
缺乏二氢叶酸还原酶[dhfr(-)]的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞适合在不存在血清或任何其他衍生自动物来源的材料下以悬浮状态生长。细胞在不存在次黄嘌呤和胸苷下，在从商业来源JRH PF-CHO(目录号67147)获得的成分确定细胞培养基中生长。尽管细胞系并不缺乏谷氨酰胺合酶，但仍向培养基中添加额外的谷氨酰胺。
使用本领域熟知的分子生物技术生成表达生物制品(例如给定标靶的抗体)的CHO细胞系。简而言之，使用本领域熟知的方法将能够表达所关注抗体并能够表达dhfr酶基因的表达载体导入CHO细胞中。通过在次黄嘌呤和胸苷存在下筛选细胞获得所关注的经转染细胞。在浓度不断增加的甲氨喋呤中进一步培养所筛选的转化子以扩增经转染基因并增加所表达蛋白的产率。下文描述用以培养CHO细胞的改良细胞培养基。
实施例1.1：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养的培养基
一般而言，用于培养CHO细胞的培养基配方由命名为A部分、B部分及C部分的三个部分组成。A部分为基础培养基并包含水、氨基酸、维生素、无机金属盐、微量元素、乙醇胺、腐胺、表面活性剂、丙酮酸钠、谷胱甘肽和2-巯基乙醇。B部分包含无机铁来源；且C部分包含重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源、各种非铁金属离子、表面活性剂和水解产物。培养基组份大部分为无机的或来自重组来源并且经高度纯化。培养基不含有来自动物来源的蛋白、脂质和碳水化合物。复合水解产物从经高度加工的酵母和植物来源获得。
培养基的A部分包括不含蛋白的CHO(PF CHO)培养基(JRH-SAFC Biosciences；JRH目录号67147-也称作原始A部分)。因此，A部分包括基础培养基，该基础培养基包括水、氨基酸和维生素。选择基础培养基(PF CHO)将其修饰并再调配以支持细胞生长和所表达蛋白生产率的进一步增加。修饰PF CHO以去除特定组份，包括碳酸氢钠、HEPES缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖(经修饰PF CHO在本文中称作经修饰A部分(也称作JRH目录号67411))。也进行这些修饰以促进大规模生物反应器中细胞培养过程条件的改良。
B部分组份(JRH)由独立添加的浓缩柠檬酸铁溶液组成。B部分组份的浓度在所有CHO细胞培养方案中均保持恒定。
C部分组份包括生长因子(例如胰岛素)、氨基酸谷氨酰胺、TC酵母粉和大豆水解产物植物蛋白胨、保持选择压力必需的甲氨喋呤及在制备期间用于在培养基水合后调节pH值的碱NaOH和酸HCl。
改良细胞培养基配方由如下制成。首先，最初使CHO细胞在从JRH获得的PF-CHO培养基(SAFC-JRH目录号67147)中生长。如下所述，将PF-CHO培养基(目录号67147)进一步修饰以与CHO细胞株一起使用。该经修饰培养基由JRH以新目录号67411命名。修饰的目标是使细胞培养基的A部分浓度增加，以致渗透压和pH值不受影响。制造商(JRH)也声明原始A部分(目录号67147)不具有碳酸氢钠、谷氨酰胺并不含蛋白质(不添加胰岛素或其他蛋白或肽生长因子)。当证明有效时，将这些省略的组份独立添加至67147和67411A部分配方中，特别用于CHO细胞系。这些成为下文如C部分更详细描述的组份中的一些。
表1：原始细胞培养基配方(A部分67147)和经修饰细胞培养基配方 (经修饰的A部分67411)的比较
Figure BDA0000381087840000641
Figure BDA0000381087840000651
Figure BDA0000381087840000661
CHO细胞培养的细胞培养基A部分
如上所述，改良细胞培养基的A部分含有修饰型基础培养基，即PF-CHO培养基。获自JRH的PF-CHO培养基(目录号67147)为通过从A部分去除缓冲剂碳酸氢钠、HEPES及磷酸二氢钠和磷酸氢二钠、渗透压调节剂氯化钠、表面活性剂Pluronic F-68以及单糖葡萄糖而加以修饰。取决于特定细胞培养方案的需要，将这些组份以各种浓度添加回A部分中。这使得缓冲剂浓度保持稳定，并使表面活性剂浓度保持低于对细胞造成毒性的水平，同时使得可操纵渗透压和碳底物水平用于增加细胞生长和增加的抗体生产。一旦将这些组份从原始JRHA部分配方分离，则如经修饰细胞培养基(经修饰PF CHO-在表1中称作#67411)所示，可促进JRH A部分中剩余组份浓度的增加，从而使细胞生长和由抗体滴度所测定的抗体表达有所增加。不需改变培养基体积，即可使经修饰A部分粉末(67411)配方的单个组份(包括氨基酸、维生素、微量元素和其他各种组份)比例增加至原始调配方浓度的四倍。上文表1描述了使用67147的原始A部分配方与使用67411的修饰配方的比较。
就定义而言，原始JRH PF CHO基础培养基(目录号67147)为不含有谷氨酰胺且不含有碳酸氢钠的PF CHO基础培养基。1部分中葡萄糖的原始浓度为1.5mg/L。
CHO细胞培养的细胞培养基的B部分
细胞培养基的B部分组份包含浓缩柠檬酸铁溶液，其与获自JRH的PF-CHO培养基的B部分相同(目录号67147)并独立添加。
将无机铁来源(例如铁盐和亚铁盐，尤其是柠檬酸铁和硫酸亚铁)添加至基础培养基(即A部分或经修饰A部分)中。尽管添加了少量硫酸亚铁(0.2-0.8mg/L)和无水硝酸铁(0.025-0.11mg/L)，但优选螯合盐(例如柠檬酸铁)。柠檬酸铁作为液体补充物以较大浓度添加并作为PF-CHO B部分包括于细胞培养基中。尽管可改变其他培养基组份的浓度并具有更大的浓度范围，但保持122mg/L单一浓度的柠檬酸铁。这是由于引起细胞损害的超氧化物和自由基的形成以及基础培养基中不期望化合物的形成。
CHO细胞培养的细胞培养基的C部分
细胞培养基C部分主要由下列各物质组成：重组生长因子、缓冲剂、渗透压调节剂、能量来源和水解产物。在研发过程中添加至细胞培养基中且不包括于氨基酸、维生素和辅因子、无机盐及缓冲剂、微量元素或矿物质的通常分组中的额外化合物在上表1中描述为″C部分″。关于下表1中所提及的C部分，应注意可独立或组合添加C部分中所鉴别的成份。
重组生长因子
以介于4-13mg/L浓度范围内的肽激素胰岛素或重组类似物添加至细胞培养基中。IGF-1也可以50-100ng/L的浓度替代或补充添加至细胞培养基中的胰岛素。
渗透压调节剂
各种细胞培养基的渗透压在260mOsm至460mOsm的范围内。使用盐尤其是NaCl、KCl和KNO3调节渗透压；尽管所有氨基酸和水解产物有助于大幅改变渗透压。
能量来源
培养基中最多的单糖为葡萄糖(D-葡萄糖)并按需要补充。细胞培养基中的起始浓度在3.5至7.0g/L的范围内。亦可补充其他糖作为代谢物或作为剪切力保护剂，其可包括麦芽糖、甘露糖、半乳糖或果糖。
水解产物
认为水解产物为游离氨基酸以及二肽和三肽的额外来源。
pH值维持(缓冲剂)
使用各种缓冲剂将细胞培养基的pH值维持于6.5至7.5的范围内。用于培养基中的无机缓冲剂(或缓冲系统)包括碳酸盐(NaHCO3)、氯化物(CaCl2)、硫酸盐(MgSO4)和磷酸盐(NaH2PO4及Na2HPO4)。有机缓冲剂也包括丙酮酸钠(C3H3O3Na)和也称作HEPES的N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙烷磺酸]。
谷氨酰胺
谷氨酰胺也包括于C部分中，因为原始A部分和经修饰A部分均将其省略。谷氨酰胺包括于C部分中，例如在含有原始A部分的细胞培养基中为0.2至0.4(0.29)g/L；在含有经修饰A部分的细胞培养基中为0.3至0.7，例如0.58(参见上表1)。
CHO细胞培养的细胞培养基的其他组份
以下提供可添加至细胞培养基中的额外组份。应注意，可添加的额外组份不限于以下提供的实施例。
额外肽
将0.4至1.65mg/L有助于维持内质网结构和CHO细胞系特异性生长的腐胺HCl盐添加至基础培养基中。
以0.5至2.0mg/L添加谷胱甘肽(三肽)。添加2-巯基乙醇至3.6mg/L，作为维持巯基的还原剂并结合、传送各种金属如铜。其还原脱氢抗坏血酸和胱氨酸并再生抗坏血酸和半胱氨酸。
甲氨喋呤：
产品线之间的甲氨喋呤浓度有所不同，取决于预期达到的最终扩增水平。使用2mM浓度的储备溶液，添加体积和终浓度为：对于抗-IL-12和抗-EPO-R，0.250mL/kg导致最终为500nM；对于抗-IL-18，0.5mL/kg导致最终为100nM，最后对于抗-TNFα，2.5mL/kg导致最终为5000nM。
细胞保护剂/表面活性剂
该实施例中描述的培养基用于在所有规模的反应器、烧瓶和旋转烧瓶中，在产生较大剪切力的搅拌及喷射下使CHO细胞以悬浮状态生长。为使细胞损害降至最低，添加浓度为每升培养基大约1g的细胞保护剂(如pluronic多元醇，尤其为Pluronic F-68)。也使用小于和等于1g/L的其他剪切力缓和剂(包括甲基纤维素)和高达每升克量的不同浓度的特定水解产物和植物萃取物。
氨基酸
细胞培养基具有如本文所述的氨基酸含量范围。以高于其他氨基酸的起始浓度添加两种氨基酸(天冬酰胺和谷氨酰胺)，因为它们在CHO细胞培养过程中快速变为限制养分。具体而言，天冬酰胺在基础培养基中约0.4-0.5g/kg。
尽管天冬酰胺为A部分的组份(包括原始和经修饰PF CHO)，但通过将其补充至细胞培养基中增加天冬酰胺的浓度。
细胞培养基能够支持极低初始密度的CHO历时数天生长至超过每毫升1.0×107个细胞，取决于目标组份浓度及所需培养基的细胞效应。CHO过程额外包括稍后部分所述的生长期和生产期，以及所需不同范围的组份。然而，细胞培养基配方比例和一致性保持相同。
CHO细胞培养基的最终制备
制备改良细胞培养基需要以特定次序添加各种组份，同时在特定时间使用碱或酸调节pH值。随着A部分基本浓度的增加，添加NaOH形式的碱以辅助配方中氨基酸溶解至最大pH值10。随着水解产物的添加，使用HCl形式的酸使pH值下降至最小值7.0。若需要，使用NaOH或HCl溶液完成至特定pH值的进一步调节。
以下实施例描述了基于上文用于各种特定抗体表达的细胞培养基。
实施例1.2：用于培养表达抗-TNFα抗体的CHO细胞的细胞培养基
在表2所述的细胞培养基中培养表达抗TNFα的完全人类抗体(即阿达木单抗；D2E7)的CHO细胞株。
表2：用于培养表达完全人抗-TNFα抗体的CHO细胞的细胞培养基
Figure BDA0000381087840000701
实施例1.3：用于培养表达IL-12抗体的CHO细胞的培养基组合物
在表3所述的生长培养基中培养表达完全人类抗-IL-12抗体的CHO细胞系。
表3：用于培养表达完全人类抗-IL12抗体(ABT-874)的CHO细胞培 养基
Figure BDA0000381087840000711
参考上文，关于不含盐并维生素减少的经修饰基础培养基，维生素量相对于以上描述为RM-003的未经修饰基础培养基，或相对于以上描述为RM-230的经修饰不含盐基础培养基减少了三分之一。因此，如上所述，维生素减少的基础培养基具有RM-003和RM-230的三分之一的维生素量。当使用上表中所给出量时，培养基中维生素的终浓度与使用RM-003或RM-230相比降低至三分之一。然而，应注意如果需要的话则使用了RM-230的生产和补料培养基也可使用。
实施例1.4：用于培养表达IL-18和EPO/R抗体的CHO细胞培养基组合物
表4提供了用以表达抗-LI-18和抗-EPO/R抗体的生长和生产培养基的概述。关于表达该类抗体的培养基的额外详述可见于表5(抗-IL-18)和表6(抗-EPO/R)。
表4：用于培养表达完全人类抗-IL-18和抗-EPO/R抗体的CHO细 胞培养基
Figure BDA0000381087840000721
Figure BDA0000381087840000731
在生长培养基2xP(SR-371)中培养表达IL-18的CHO细胞系，且稍后在生产培养基3xP(SR-372)中生产抗体，最终滴度为大约1g／L。高滴度过程使用4xP(SR-382)作为生产培养基以达到约2g／L的终滴度。用于抗-EPO／R生产的生产培养基与SR-286相同，但将1xP培养基(SR-274)用于细胞生长。所有培养基均描述于表4和5中。
实施例1.5：用于在哺乳动物细胞中生产抗体的细胞培养过程
将以上公开的培养基开发为两个用于两个培养哺乳动物(即CHO)细胞计划的生产平台。使用与如上表2-4中所述经修饰的生产培养基相似的(仅用于细胞培养的温度有所不同)培养基组合物开发第一平台。此平台用于生产抗-IL-18抗体以及生产抗红细胞生成素受体(抗EPO／R)。进一步强化营养组份的第二培养基平台用于生产高滴度抗-IL-18，以达到更高的体积抗体生产率。
如先前所述，所有抗体(包括抗-IL-12、抗-IL-18和抗-EPO／R抗体)均为由经转染dhfr(-)CHO细胞系表达的完全人类IgG1抗体。这些细胞系以悬浮状态培养且不需牛来源血清或其他动物来源材料的帮助。
为生产抗-IL-18抗体，在生长培养基(本文中称作SR-371)中培养表达抗-IL-18的CHO细胞系。培养基SR-371用于支持具有中等细胞生长的较高细胞生产率。一旦细胞密度达到转移标准，则将细胞转移至生产培养基(SR-372)中以起始生产阶段。
表5：抗-IL18过程A中培养基组成
生长培养基SR-371用于种子驯养(seed train)和种子反应器中。生产培养基SR-372用于3000升的生产生物反应器中。
组份 生长培养基SR-371 生产培养基SR-372
PFCHO A部分，特定无盐配方 5.26g／L 7.89g／L
PFCHO B部分(柠檬酸铁储备溶液) 10mL／L 10mL／L
重组人类胰岛素 7.76mg／L 13mg／L
右旋糖，无水 7.0g／L 7.0g／L
L-谷氨酰胺 0.876g／L 0.584g／L
碳酸氢钠 1.6g／L 1.6g／L
HEPES 1.8g／L 1.8g／L
NaCl 2.67g/L 2.45g／L
Pluronic F-68(泊洛沙姆188，NF) 1.0g／L 1.0g／L
NaH2PO4·H2O 0.031g／L 0.031g/L
Na2HPO4·7H2O 0.436g／L 0.436g／L
细菌培养用TC酵母粉 4.0g／L 10.7g／L
植物蛋白胨 2.579g／L 6.92g／L
甲氨喋呤，2mM 0.05mL／L 0.05mL／L
NaOH，2N 3.5mL／L 5.67mL／L
HCl，2N 2.91g／L 2.5mL／L
终pH值 7.10-7.20 7.10-7.20
终渗透压(mOsmo／kg) 373-403 373-403
在整个培养中将温度维持在35℃。当细胞培养物葡萄糖水平低于2g／L时，添加额外4g／L的葡萄糖。
将类似过程用于抗-EPO／R抗体生产。然而，将贫养培养基(leanermedium)(SR-274)用于种子驯养中的细胞生长。将培养基SR-286(用于Humira生产的相同培养基)用于抗-EPO／R抗体的生产阶段(表6)。生长培养基SR-274用于种子驯养和种子反应器中。生产培养基SR-286用于3000升的生产生物反应器中。
表6：抗-EPO／R过程中培养基的组成
Figure BDA0000381087840000741
生长培养基SR-274用于旋转烧瓶、Wave袋、100L种子生物反应器Z-4605和在3000L生产生物反应器Z-3600中初始阶段的575L培养中。生产培养基SR-286仅用于3000L生产生物反应器Z-3600中。
生产培养基SR-286和SR-372由表5和6所列出的类似培养基组份组成，但含有不同水平的MTX(SR-286为0nM且SR-372为100nM)。
研发抗-IL18生产的改良过程以获得较高生产率。这一新过程(过程B)引入延长细胞培养寿命并增加抗体体积生产率的新培养基。生产培养基(SR-382)在生产阶段中使用的养分量不同于先前的生产培养基。SR-382的完全组成描述于表7中。在抗-IL18生产的新过程中，尽管在种子驯养期间仍在培养基SR-371中培养细胞，但培养基SR-372用于生产阶段前一个步骤的种子生物反应器中。接着，在生产阶段在培养基SR-382中培养细胞，将温度从35℃转变至33℃以延长细胞培养寿命，从而延长培养基SR-382对细胞的作用。
生长培养基SR-371用于旋转烧瓶、Wave袋好100升种子生物反应器中。短程填充培养基(Short-fill medium)SR-372用于3000升生产生物反应器中的初始阶段的575升培养中。生产培养基SR-382仅用于3000升生产生物反应器中。
表7：抗-IL18过程B的培养基组成
Figure BDA0000381087840000761
富集该培养基中的养分以进一步提供CHO细胞生长和抗体生产的能量来源及构建组份。在过程B中，尽管在种子驯养期间仍在培养基SR-371中培养细胞，但培养基SR-372用于在生产阶段前一个步骤的种子生物反应器中。接着，在生产阶段于培养基SR-382中培养细胞，将温度从35℃转变至32℃以延长细胞培养寿命，从而延长培养基SR-382对细胞的作用。
过程A：抗-IL18细胞和抗-EPO／R细胞在培养基SR-372和培养基SR-286中的性能
在培养基SR-371中培养表达抗-IL18的细胞，该培养基具有100nM MTX以累积用于生产阶段的细胞质量。培养基SR-371用于支持具有中等细胞生长的较高细胞生产率。表8展示生产抗-IL18的CHO细胞在3000L生产生物反应器中的代表性生产生长概况。以培养基SR-372使用此过程(过程A)，可获得高达1g／L的终滴度。
表8：在培养基372中生产抗-IL18抗体(过程A)
Figure BDA0000381087840000762
Figure BDA0000381087840000771
将除MTX水平以外与培养基372共有相同配方的培养基286用于抗-EPO／R生产。尽管较低细胞密度通常在生产阶段获得，但通过使用培养基SR-286作为生产培养基来达到较高生产率使得细胞能够以3000L规模生产高达1.8g／L的抗体。如表9所概述，观测到合理细胞生长。实验室规模结果和3000L运行结果证实该培养基可增加细胞单位生产率并观测到高达1.9g／L的终滴度。这些结果表明具有类似配方的培养基(表1和2中的SR-372和SR-286)支持大规模CHO细胞培养中的优良细胞生长和高抗体生产率。
表9：于培养基286中产生抗EPO／R抗体
Figure BDA0000381087840000772
过程B：用培养基SR-382的过程B中抗-IL18细胞的性能
培养基SR-382是用于抗-IL-18抗体生产的延长分批过程中的最富集培养基。过程B包括在生产阶段或短程填充阶段之前在种子驯养中使用培养基SR-371并在种子生物反应器中使用SR-372。细胞生长与生产阶段培养基SR-372中的细胞生长相比为中等的。然而，由于温度转变，使用培养基SR-382获得高达2.5g／L的终滴度。
基于表明表达抗-IL18细胞的细胞单位生产率随着生产培养基中养分增加而成比例增加的研究来研发培养基SR-382。培养基SR-382为提供细胞生长与终滴度增加之间平衡的最佳培养基。尽管最大细胞密度仅达到每毫升5.9×106个细胞，但细胞单位生产率增加两倍。与温度转变组合来延长细胞培养持续时间，如表10所示达到高达2.2g／L的终滴度。
表10：在培养基SR-382中生产抗-IL18抗体(过程B)
Figure BDA0000381087840000781
实施例2：用于表达抗体的改良分批补料方法和补料溶液
以分批模式运行的生物反应器的废培养基分析表明特定氨基酸的耗竭。即使未经量测，但此发现也暗示其他培养基组份的耗竭，其可导致额外营养缺乏。为补偿这些可能的缺乏，添加养分溶液。在工程设计领域中，该方法一般称作分批补料。
就操作观点而言，使用浓缩补料溶液是便利的。以下实施例描述添加化学成分确定的基础培养基(PF CHO，目录号67411-50L)和复合水解产物(例如酵母粉和植物蛋白胨)的高度浓缩溶液。经测定该对水解产物展现与其浓度比率相关的生产率增加协同效应。
实施例2.1：阿达木单抗分批补料方法
初始阿达木单抗(Humira／D2E7)过程由3天过程组成，其中去除培养基并连续补充八次。通过用水解产物酵母粉替代培养基中的水解产物Primatone并通过使用新反应器参数来研发改良分批补料方法。改良分批补料方法持续大约12天。
通过再调配基础培养基(PFCHO)并添加新水解产物(即植物蛋白胨)进一步改良初始分批过程的生产率。将含有培养基调配物的该水解产物用于以上称作SR-286的方法中(参见表2)。也研究反应器操作参数，使可以鉴别运行整个阿达木单抗生产过程的最佳温度。
每日从反应器实验获得的样本分析突显一些潜在的营养缺乏。对于阿达木单抗分批过程的情况而言，通过补入25x浓缩PFCHO溶液和水解产物酵母粉(yeastolate)及植物蛋白胨的33x溶液处理潜在的营养缺乏。水解产物为复合组份，其表现出与浓度比率相关的协同效应。将该比率维持在高度浓缩33x型中。
实验计划
实验目标为比较新分批补料方法与两种分批对照方法(温度转变37→33℃相对于恒定温度35℃)。
分批补料修饰为：
1.基于氨基酸缺乏补入25x基础培养基富集(PFCHO溶液)。
2.以一定时间间隔补入33x水解产物富集溶液使得培养基渗透压决不超过440mOsm(可引起细胞生长和生存力降低的条件)。
3.反应器温度设定点始终为35℃。
此实验的对照为：
a)相同反应器以当前培养基(SR-286)并在对照分批方法参数(对照条件包括反应器以温度转变和线性pH斜坡运行SR-286培养基)下操作，命名为对照#1；及
b)相同反应器以当前培养基(SR-286)并在除操作温度始终为35℃以外的所有当前分批方法参数下操作，命名为对照#2。
材料
工作体积为13L的Braun ED反应器；
使用Working Cell Bank WCB970513-6的中试工厂接种物(Pilot PlantInoculum)AFI915A；
3XP11Y7P基础培养基溶液(SR-286)；
基础培养基富集溶液(25x)(PF CHO溶液)；
水解产物富集溶液(33x)；
葡萄糖补料注射(feed shot)(200g／L)(葡萄糖溶液)；
用于控制pH的0.5N氢氧化钠溶液。
溶液制备：
1.生产培养基(参见上文表2中所述的SR-286溶液记录)
2.2kgPFCHO富集溶液(25x)(基本富集溶液)：
按照以下次序在恒定搅拌下并在各添加步骤后混合10分钟制备：
Figure BDA0000381087840000801
3.1Kg水解产物富集溶液(33x)：
按照以下次序在恒定搅拌下并在各添加步骤后混合10分钟制备：
Figure BDA0000381087840000812
方法：
反应器操作：
为接种反应器，根据Humira种子驯养方法的描述使小瓶解冻并扩增。在反应器中生长后，抽排反应器至3.62L以刺激短程填充阶段。接着，用生产培养基(SR-286)将反应器注满至13L水平。
以下列参数操作反应器：
a)搅拌70RPM；
b)温度35℃；
c)pH值线性斜坡自pH7.16起始，经72小时至pH6.90；
d)溶氧30％；
e)当葡萄糖含量低于2.0g·L-1时，向反应器中补入195g200g／L的葡萄糖溶液。
补入时间表
以下描述表示用于向阿达木单抗批料中添加额外养分(即补充基础培养基)和水解产物的补入时间表
表11：阿达木单抗分批补料方法的补入时间表
Figure BDA0000381087840000821
结果：
比较对照方法#1和#2与改良分批补料方法的结果(以及预期改良)描述于表12和13中。如表12所示，在恒定温度下使用改良分批补料方法，添加增强的富集基础培养基和水解产物富集溶液增加阿达木单抗生产率。
表12：比较阿达木单抗分批补料方法
Figure BDA0000381087840000831
表13：使用阿达木单抗分批补料方法预期结果的比较
Figure BDA0000381087840000832
实施例2.2：ABT-874分批补料方法
关于以上提及的阿达木单抗改良分批补料方法，每日从以分批模式运行ABT-874的反应器获得的样本的分析突出了氨基酸耗竭。同样，通过使用25x PFCHO溶液和浓缩33x水解产物溶液解决该缺乏。
最初通过替代培养基中的水解产物并导入新的反应器参数为D2E7(阿达木单抗)研发ABT-874分批过程。此外，如D2E7(阿达木单抗)的情况，再调配基础培养基并添加新的水解产物。将该培养基配方作为SR-286用于当前的D2E7方法中(参见上表2)。
实验计划：
实验目标为比较对照分批过程和以下分批补料条件，二者均从先前鉴别出氨基酸耗竭时起始：
a)交替补入基础培养基富集25x PFCHO和33x水解产物富集溶液；
b)每日补入基础培养基富集25x PFCHO和33x水解产物富集溶液。
该实验的对照包括以当前培养基(SR-286)并在对照分批过程参数(SR-286培养基，具有温度转变和线性pH值斜坡)下操作的相同反应器。
材料：
工作体积为13L的Braun ED反应器；
Working Cell Bank W990107-J695；
3XP11Y7P基础培养基溶液(SR-286-111899-1)；
PFCHO-0-500-HG2Y生长培养基；
基础培养基富集溶液(25x)；
水解产物富集溶液(33x)；
0.5N氢氧化钠溶液。
溶液制备：
1.生产培养基(参见SR-286溶液记录)
2.25x PFCHO溶液(基础富集溶液：描述于先前实施例中；但使用462g葡萄糖溶液替代葡萄糖粉末，因此最终重量为2170g)。
注意：每次添加1％初始体积的以上溶液将增加：
a)与原始3x浓度相比，PFCHO浓度增加0.25x；
b)天冬酰胺增加75mg·L-1；
c)葡萄糖浓度增加2.1g·L-1；
·pH值增加约0.10个pH单位。
3.33x水解产物溶液(描述于先前实施例中，添加2.40g·L-1葡萄糖)
注意：添加1％初始体积的以上溶液将增加：
a)与原始分批浓度相比，TC酵母粉浓度增加2.65g／L(0.33x)。
b)与原始分批浓度相比，植物蛋白胨浓度增加1.65g／L(0.33x)。
方法：
为接种反应器，根据ABT-874种子驯养方法的描述使小瓶解冻并扩增。在反应器中生长后，将反应器抽排至4.06升(如表13所述，运行名称为B9013-ED2和B9014-ED3)以刺激短程填充。接着，用常规生产培养基(SR-286)将反应器注满至13L水平。
根据以下参数操作反应器：
a)搅拌70RPM；
b)温度33℃；
c)pH6.90；
d)溶氧40％。
表13：ABT-874的补入时间表
结果
比较改良分批补料方法的结果描述于下文表14和15中。
表14：分批补料方法结果
表15：分批补料方法结果
Figure BDA0000381087840000863
Figure BDA0000381087840000871
实施例3：用于增加分批补料培养物的体积生产率的稳定组合补料溶液
以下实施例描述调配稳定高浓度补料溶液的新颖方法，该补料溶液包括两种水解产物、至少一种除谷氨酰胺以外的氨基酸、糖和化学成分确定的培养基。所得补料溶液能够增加生产重组蛋白的哺乳动物细胞系的体积生产。最后，提出基于葡萄糖浓度的反馈控制而研发的分批补料方法的加速方法。
材料和方法
组合补料含有水解产物细菌培养用TC酵母粉(RM-216)(BDDifco255771)和植物蛋白胨(BD Difco2922450)加葡萄糖、L-天冬酰胺一水合物(Sigma-Aldrich)、还原形式的DMEM／F12(去除NaCl、磷酸盐、pH值指示剂和其他非必需组份；Invitrogen12500)或Ex-CellPFCHO(A)-S1(经修饰的缺乏)w／o谷氨酰胺、w／o NaHCO(JRHBiosciences67411-500L35470)。
为制备溶液，使用具有PMQ004D2过滤包的Millipore Milli-Q过滤水。使用实验室电磁搅拌器将材料溶解在特定质量的水中。在添加各组份后，在并入下一组份前视觉验证完全溶解。
当适用时，则使用HACH 2100P携带型浊度计(Hach Co.Loveland，CO)定量浊度。人眼侦测浊度的阈值约为15NTU(散射浊度单位)。
在1.5L的操作体积于3L Applikon生物反应器中进行生物反应器实验，通过经由级联空气和氧气流控制pH值、温度、搅拌和氧。用Cedex(Innovatis AG，Bielefeld，Germany)进行细胞计数。使用YSI2700(YSI Inc.，Yellow Springs，OH)测定葡萄糖、乳酸盐并在一些情况下也用Nova Bioprofile400(Nova Biomedical Corp.，Waltham，MA)测定额外代谢物。使用ABL5血液气体分析仪(Radiometer A／S，Copenhagen，
Figure BDA0000381087840000881
Denmark)验证氧(pO2)、二氧化碳(pCO2)的平衡分压及pH值。
实施例3.1：使用PFCHO作为基础培养基制备稳定组合补料
单一高浓度补料可促进细胞培养分批补料生产，因为其降低所需添加物的体积和数量。然而，这是比较复杂的，因为PFCHO粉末必须在pH值大于9.00时溶解。此外，水解产物在中性pH值条件下为可溶的。因此，尝试将两种组份在中性或高pH值下简单混合将会导致(非溶解)粉末混悬液。如文献中所报导，″完全优化的补料通常以支持一种以上导入速率和补料pH值(例如由于溶解度的原因)的两种或两种以上分离溶液存在″[1]。
组合补料稳定性实验
如下表所述，已确定添加水解产物可使PFCHO浓度在较长时间段保持稳定。依次向约700g水中添加组份，量为20g Kg-1PFCHO、7.5g Kg-1天冬酰胺、21g Kg-1葡萄糖、22g Kg-1酵母粉和14g Kg-1植物蛋白胨，且最后添加水以达到1Kg的最终重量。将溶液混合并接着用HCl2.0N将其pH值降至目标pH值。在下表中，通过肉眼视觉观测来测定浊度。
表16：终pH值对不同组合补料配方的
Figure BDA0000381087840000882
Figure BDA0000381087840000891
由表16可知，最小浊度为2)和3)pH6.75和7.25。注意，2)及3)即使在接近24小时后也不变混浊。基于这些结果，显然由于达到低浊度，水解产物使溶液中的PFCHO稳定。
只要水解产物使所得混合物稳定，则可将植物蛋白胨和酵母粉于pH值10.0添加至PFCHO溶液中；接着使整个混合物降至目标pH值。此添加次序将去除尤其在混合较大体积时不稳定的使PFCHO溶液保持pH值8.0下的不稳定步骤。
为测试先前假设，我们用分别含有20和7.5g·Kg-1PFCHO和天冬酰胺配方测试该新的添加次序。将所得溶液X-1分开，且使其降至pH7.0、6.75、6.5和6.25。如可从下图中观测，证明这些溶液是稳定的：
表17.不同pH值时配方X-1的浊度概况(NTU)
Figure BDA0000381087840000892
三小时后，最少混浊溶液pH值为6.5。浊度明显减少(尤其对于pH值7.0而言)是由于一些微粒沉降。
葡萄糖作为稳定剂
测试添加200g Kg-1葡萄糖作为稳定剂的配方(参见表18)。
表18.经稀释的D2E7补料溶液
Figure BDA0000381087840000901
依次称重并添加组份。应降低水的初始质量以达到1Kg最终质量。
如可从下表中观测，证明该溶液在一定pH值范围内稳定数小时：
表19.组合补料浊度读数(NTU)对时间和pH值的函数
使用包含葡萄糖的经修饰组合补料溶液表达两种不同抗体，即阿达木单抗(D2E7)和抗-IL-18抗体ABT-325。
稳定D2E7产生的组合补料溶液
如果添加至生物反应器中的调配物体积是以最低浓度组份(即PFCHO)计算，则需要添加极大量补料来匹配已个别评估的量。因此，较高浓度为研发有效补料配方的下一步骤。该溶液称作D2E7组合补料溶液并描述于下表中。
表20.D2E7组合补料溶液
Figure BDA0000381087840000911
依次称重并添加组份。应降低水的初始质量以达到1Kg最终质量。
测试含有200、150和100g Kg-1葡萄糖的配方。如下表可见，这些溶液也具有数个小时内的稳定浊度。表21显示添加葡萄糖会降低溶液浊度。
表21.作为葡萄糖浓度函数的D2E7组合补料溶液浊度时间曲线
如表21所示，提高葡萄糖水平会减低溶液浊度。基于浊度水平认为这些不同配方可为过滤实验所接受。
稳定ABT-325生产的组合补料溶液
为获得稳定ABT-325组合补料，根据用于D2E7组合补料的方法制备50L当前配方，如表22所示。
表22.ABT-325组合补料溶液
Figure BDA0000381087840000921
依次称重并添加组份。应降低水的初始质量以达到1Kg最终质量。
如可从下表中观测，在制备时，溶液维持大约20-30NTU的浊度水平：
表23.ABT-325组合补料的浊度
Figure BDA0000381087840000922
根据D2E7方法制备50L ABT-325配方组合补料溶液以测试制备方法的可扩缩性和适用性。如上所示，溶液保持稳定四小时。
应注意，以上实施例中所提及的PF CHO培养基对应于实施例1的细胞培养基中所提及的经修饰PF CHO(经修饰A部分)。
实施例3.2：使用DMEM-F12作为基础培养基制备稳定组合补料
如先前实施例中所描述，可制造含有PFCHO和两种水解产物以及葡萄糖的稳定组合补料溶液。以下实施例证实此方法可应用于任何基础补料配方并产生稳定的组合补料溶液。
修饰DMEM-F12(一种可公开获得的培养基配方)使其与组合补料制剂相容，此处命名为DMEM-F12m。去除以下组份：NaCl、NaHCO3、NaH2PO4·H2O、Na2HPO4、D-葡萄糖、HEPES、Na·次黄嘌呤、酚红、L-谷氨酰胺和胸苷。根据实施例3.0和3.1中所述方法制备与D2E7和ABT-325补料配方匹配的组合补料。最终组份和配方次序见下表：
表24.DMEM-F12组合补料
Figure BDA0000381087840000931
依次称重并添加组份以达到1Kg最终质量。
补料I及II在制备后可维持12NTU或更小的浊度4小时以上。
实施例3.3：归因于组合补料添加的细胞生长和生产率增强
为评估以上组合补料的生长和滴度促进特征，使用ABT-874细胞(表达抗-IL-12完全人类IgG1抗体)。该CHO细胞系通常在细胞培养基SR-383(2X，具有500nM mtx)中培养。
对于这些实验而言，将细胞传代至DMEM／F12至少5代，直至经恒定生长速率观测到适应。在35℃和5％CO2的恒温箱中，在Thermolyne搅拌盘上以70rpm搅拌旋转培养物。在接种之前即刻从维持培养物中获取所需量的细胞悬浮液。将细胞离心，丢弃上清液并将沉淀重悬于新鲜、预温的培养基中以获得4×105／mL的接种密度。
将细胞培养物于旋转器中扩增直至生成足以用于生物反应器接种的体积，以在1.5L Applikon生物反应器中达到1：5的分流比。反应器运行条件为pH6.9、35℃、150rpm且溶氧水平为40％饱和。所有生物反应器实验均一式两份。在运行过程中，每隔一天给予细胞三次初始反应器体积1％的组合补料快速注射。
使用两种组合补料可极大地增强细胞培养物的生长。在CF I情况下，与对照物的13天相比，尽管培养仅持续10天，但达到双倍峰值细胞密度。对于CF II情况，与对照物相比，峰值细胞密度几乎为三倍，而培养的持续时间类似。就终滴度而言，观测到更显著的效应。DMEM／F12培养基的滴度大约为41mg／L，相比之下，CF I的为188，CF II的为434。不同补料溶液对最大细胞密度、培养时间、滴度和单位生产率的影响概述于下表中：
表25.DMEM-F12m组合补料的性能
Figure BDA0000381087840000951
实施例3.4：经由添加组合补料的高滴度细胞培养过程
较高滴度使得需要较少生产运行即可满足给定总产量。以下实施例描述在分批补料方法中生产平均约4g／L滴度的ABT-874分批补料大规模过程。此外，培养基和组合补料的进一步改良使可达到超过6g／L的滴度水平。
材料和方法
使用ABT-874抗体产品线作为模型系统。
补料溶液制备
根据先前所述方法制备补料溶液。使用两种天冬酰胺浓度，即5.0或7.5g·Kg-1。制备方法见下表：
表26.ABT-874组合补料制备
Figure BDA0000381087840000952
称重并添加组份以达到1Kg最终质量。
使用实验室电磁搅拌器在强烈涡旋下将材料溶解于特定质量的水中。在添加各组份后，在并入下一组份之前视觉验证完全溶解直至步骤5。然而，这对于步骤6和7是不可能的。对于这两个步骤，认为将粉末并入溶液中足以进行至最终HCl添加。
过程培养基筛检
为获得基线性能资料，进行以3X分批补料(FB)3000L作为对照物，以原型4X FB方法和非补入(扩展分批：EB)3X和4X条件为特征的实验。具体而言，已提出较高培养基浓度会在培养物生长过程中产生初始停滞；然而，扩展分批(EB)3X或4X方法未观测到显著停滞。
如预期，对于3X及4X方法而言，补料补充可产生较高滴度。然而，如果补料(即分批补料)，则观测到4X方法的显著生长抑制。小规模实验的氨基酸分析显示，即使在补料后仍存在氨基酸天冬酰胺和谷氨酰胺的完全耗竭。为此，增加总补料时间和组合补料中的天冬酰胺的量。总之，确定4X FB方法可能达到比EB方法或3X FB对照物更高的终滴度。因此，将其选为起始点以供进一步研发。
3X分批补料方法(对照物)与4X分批补料方法之间的差异描述于表27中并在下文中更详细描述。
补入起始时的活细胞密度
已观测到在极低细胞密度下起始补料倾向于抑制细胞生长并最终抑制终滴度。因此，预期由于细胞饥饿，过度延迟补料将引起体积生产率的损失。
为研究以上假设，进行若干实验以确定于不同活细胞密度下补料的重要性。将这些实验的组合结果绘于图1描述的图中。如图1所见，第15日的滴度显示出对补料起始日活细胞密度的强依赖性。对数据点的三级多项式拟合显示在3.5×106个细胞·ml-1的补入密度下可预期第15日达到最大滴度。
重现性
6g·L-1方法的过程条件描述于下表27中并定义为从SR-383短程填充运行(pH7.0，DO=30％，37℃)1：4分流直至5.0×106个活细胞／ml细胞密度的接种。反应器运行条件为pH6.9、T=35℃、DO=40％。当细胞达到3.5×106个细胞／ml的活细胞密度时起始补料，持续10天，每天快速推注添加由初始反应器重量1％组成的组合补料，。
4g·L-1方法的过程条件描述于下表27中。
表27.4和6gL-1ABT-874细胞培养方法的要点
Figure BDA0000381087840000971
实施例3.5：经由葡萄糖反馈控制使用组合补料的分批补料
反馈控制允许在对系统本质行为的理解非常有限的情况下靶向给定参数的设定点。以此方式，可维持标靶的设定点与系统可能经受的任何干扰或改变均无关。由于哺乳动物细胞培养物代谢的复杂性，产生可允许预测培养给定轨迹的综合模型需要大量工作。然而，需要研发能够供应葡萄糖以维持目标葡萄糖水平的取样方法(例如通过使用自动取样)。这使得可以去偶化给定葡萄糖浓度(或其他代谢物)的效应并提供研究组合补料中不同比率葡萄糖对不同培养物的影响的方式。效应去偶化指维持所给定葡萄糖水平的效应，与之相对的是在组合补料中使用不同量葡萄糖的效应。
材料和方法
使用两种不同抗IL-12抗体(ABT-874和1D4.7)的产品线作为模型系统。
选择自动取样(即YSI2700Bioprocess Analyzer)作为监控细胞培养基中葡萄糖含量的方式。通过将YSI2730监控器和控制附件附连接至YSI2700Bioprocess Analyzer(参见YSI Life Sciences；YellowSprings，OH)上建立在线自动取样装置。该取样装置由固持两个管的泵组成。第一个管具有两条分支，一条收集来自生物反应器的样本且第二条泵出消毒剂以维持无菌。样本一经获得，则将其泵入外室中，吸管(sipper)自外室中获取样本以供实际分析。使用纵穿泵的第二个管来收集进入废料容器中的排出物。控制在线取样附件的若干参数，例如取样时间间隔和TPU(每单位误差的时间，其对应于基于所测量的相对于设定点偏移的补入泵运行时间)。
使用15针连接器将泵连接至YSI。将对应于YSI中的葡萄糖探针(白色-7，黑色-11)的针连接至泵中的TTL开／关针(8)，并将来自YSI(1-5)之一接地针之一连接至泵的15针连接器的底盘。通过由YSI设定菜单将泵打开和关闭来测试连接。所使用的泵管为MasterflexCFLEX082。
表28：反馈初始实验设定
细胞 ABT-874
培养基 3XPFCHO(SR-286)
葡萄糖补料 400g／L
YSI TPU 16
所测试的反应器体积 1.5L
YSI净化时间 60秒
泵速度 50(一半，约16RPM)
YSI取样时间间隔 4小时／2小时(下文中解释)
YSI输出信号 X2(对YSI1-A25而言)
消毒剂 0.1N NaOH
将YSI1-A25反应器控制于4.9g／L葡萄糖。4.9g／L的葡萄糖控制起始于第2日，使用4小时的取样时间间隔直至第8日。在第8日，将取样时间间隔降低至2小时，并再次设置YSI自动装置设定点以抹去PID记忆。由相对于设定点的突增引起的波动在第8日显著降低。因此，确定2小时的取样时间间隔对于这些条件而言为最佳的。第2日至第8日的平均突增为0.43g／L且平均负向尖峰为0.31g／L，其中相对于设定点的波动误差为约8％。另一方面，第8日至第13日的平均突增为0.08g／L且平均负向尖峰为0.09g/L，其中波动误差为约2％。
使用组合补料控制葡萄糖浓度
经由经验方法定义向生物反应器中的培养物中补入组合补料溶液的时间表。测试不同补入量以及不同补入时间，直至发现可行的分批补料方案。理想地，组合补料的补入时间表应满足给定培养物的特定要求。
鉴于以上考虑，基于细胞培养物需要，例如通过使用葡萄糖作为营养要求指示剂来提供组合补料是有利的。以此方式，反馈控制系统可用以1)测试具不同葡萄糖浓度的不同补料；和2)使用所生成的补料概况在较大规模培养中进行人工补料。
下表概述了使用生产1D4.7mAb的细胞系的两种不同的反应器操作模式。参考实验(表29中称作基线)说明在1.5LApplikon生物反应器中在pH6.9、T=35℃、DO=40％下运行的SR-372培养基中的扩展分批过程的典型滴度性能。在相同条件加上反馈控制下运行YSI实验以供应含有100、150或200g·L-1葡萄糖的组合补料。
表29.使用组合补料的反馈控制性能
实验 最终滴度[mg／L]
基线(n=2) 1312+／-33
YSI100(n=1) 1974
YSI150(n=2) 2044+／-164
YSI200(n=2) 1837+／-163
表29中可见，使用各种组合补料的反馈系统极大地改良了抗体的终滴度。
通过称重每天供应的组合补料的量获得来自实验(如先前实验)的补料概况。典型补料概况见下表：
表30.由反馈控制生成的典型补料曲线(1D4.7抗体的曲线)
天 补料[％]
1 0.00
2 0.00
3 0.00
4 0.00
5 1.12
6 1.56
7 1.79
8 1.23
9 0.89
10 0.75
11 0.46
12 0.32
即使在无反馈控制系统的情况下也可手动进行以上流程以向反应器补料。通过这一方式可成比例增加补料时程。
结果概述
已显示利用水解产物和化学成分确定的基础培养基的混合物的分批补料方法可增加哺乳动物细胞培养物中所分泌的mAb的最终滴度。
此外，也证实了能够生产以下稳定组合补料的方法：
表31.稳定组合补料
Figure BDA0000381087840001011
描述于表31中的组合补料用MilliQH2O起始(高达750g)制成。如上所述，将成份添加至水中至1000g的最终重量(组合补料的总重量)。此外，也显示组合补料溶液可增加细胞培养物寿命、活细胞密度峰值和单位生产率。证实使用组合补料的细胞培养物分批补料方法能够达到所分泌单克隆抗体的高达6g·L-1的滴度水平。也显示以上组合补料可增加细胞培养物的细胞密度。
最后，也显示了采用反馈控制系统和不同组合补料的方法能够增加滴度水平。该方法可用以通过快速生成补料时间表而加速细胞培养方法的进展。
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实施例4：应用丁酸钠和N-乙酰半胱氨酸以增加生产抗IL-18的CHO细胞系的生产率
本发明涵盖一种增加生产抗体(例如抗IL-18)的CHO细胞系的生产率的新颖方法。更具体而言，以下实施例涉及通过向细胞培养基中添加化学物质来增加最终抗体(例如抗IL-18)滴度。下文使用示例性抗体即IL-18抗体描述细胞活力和抗体滴度的改良。
细胞系和培养基
用于以下实施例的抗IL-18抗体为IL-18的完全人类IgG1抗体(Ab)。在以上实施例1的表4中所述的生长培养基SR-371中培养表达抗IL-18的CHO细胞系。细胞系的生产培养基也描述于以上实施例1中，即SR-372(用于旋转烧瓶中的培养)和SR-382(用于生物反应器中的培养)。
在旋转烧瓶中进行的实验的培养条件
所有旋转烧瓶实验均执行一式两份。在35℃和5％CO2的恒温箱中，在Thermolyne搅拌盘上以80rpm搅拌旋转培养物。在接种之前即刻从维持培养物中获取所需量的细胞混悬液。将细胞离心，丢弃上清液并将沉淀重悬于新鲜、预温的培养基中以获得4×105／mL的接种密度。
实施例4.1：丁酸钠对在生长培养基中培养的生产抗IL-18的CHO细胞系的生长和生产率的影响
为测定丁酸钠的浓度范围，在含有各种浓度丁酸钠的SR-371中进行第一实验。实验在具有70mL工作体积的100mL旋转烧瓶中进行。从通过将1.101g丁酸钠溶解于10mL MilliQ水中并经0.2μm过滤器过滤灭菌而制备的1M储备溶液添加丁酸钠。将溶液储存在-20℃下。
在培养开始时(第0天)，以0mM、0.125mM、0.5mM和1mM的浓度添加丁酸钠。在该实施例及以下所有实施例中，用自动细胞计数器(Cedex，Innovatis，Germany)测定细胞密度和活力。表32显示了培养期间的活细胞密度，表33描述了培养期间的活力。实验进行12天。
表32：培养期间的活细胞密度
活细胞密度[105／ml]
Figure BDA0000381087840001031
表33：培养期间的活力
活力[％]
Figure BDA0000381087840001032
显而易见，丁酸钠影响细胞生长和活力。尽管在0.125mM的丁酸盐浓度时对细胞生长和生存力并无明显影响，但0.5mM丁酸盐对细胞生长存在明显影响，导致较低的最大细胞密度。0.5mM丁酸钠在5天培养时间后影响活力。1mM浓度的丁酸钠完全抑制细胞生长，且活力自第0天起持续降低。
表34显示了培养期间的抗IL-18滴度。在该实施例及以下所有实施例中，通过PorosAHPLC测定法来测定抗IL-18浓度。
滴度[mg／L]
Figure BDA0000381087840001042
表34(上表)：培养期间的抗IL-18滴度
含有0.125mM丁酸盐的培养物的平均最终滴度为352mg／L，未经处理对照物的平均最终滴度为257mg／L。在该浓度经丁酸盐处理可使最终滴度增加40％。
实施例4.2：丁酸钠对在SR-372中培养的生产抗IL-18的CHO细胞系的生长和生产率的影响
表达抗IL-18的CHO细胞系适合在SR-372中生长以排除培养物从SR-371分流至SR-372的任何可能效应。用适合在SR-372中生长的细胞进行的所有实验均在具有180mL工作体积的250mL旋转烧瓶中进行。应用上述在标题为″在旋转烧瓶中进行的实验的培养条件″的章节列出的条件进行培养。
设计实验以在细胞处于对数生长期的中期和后期添加丁酸盐。因为每个细胞的丁酸盐浓度较低，所以稍后添加丁酸盐与在第0日添加相比可能引起对细胞的较低应力并产生改良的细胞生长和较高的IVC(IVC(活细胞积分)定义为相对于培养时间的活细胞密度的积分)。在第4日和第5日添加0.5mM和2mM浓度的丁酸盐。将实验进行12天。表4显示了培养期间的活细胞密度，表5为培养期间的活力。第4日仅添加2mM丁酸钠会导致活力与对照物相比有所降低，其他条件不影响活力。
表35：培养期间的活细胞密度
活细胞密度[105/mL]
Figure BDA0000381087840001051
表36：培养期间的活力
活力[％]
Figure BDA0000381087840001061
表37揭示了培养期间的抗IL-18滴度。在第5日添加2mM丁酸钠导致与对照相比增加29％(分别为317mg/L对245mg/L)。细胞生长在这些条件下并未受到显著抑制(参见表35)。
滴度[mg/L]
Figure BDA0000381087840001062
表37(上表)：培养期间的抗IL-18滴度
实施例4.3：丁酸钠对在3L生物反应器中的SR-382中培养的生产抗IL-18的CHO细胞系的生长和生产率的影响
以下实施例证实通过将丁酸钠应用于大规模(即3L生物反应器)抗IL-18过程B(参见章节1.5)会导致最终抗-IL-18滴度增加。此过程在3L Applikon生物反应器中进行。种子驯养在SR-371中进行直至短程填充阶段(SR-372)。在具有10L工作体积的20L Biowave袋中刺激短程填充阶段。研究丁酸钠对抗IL-18过程B的生长和生产率的影响的实验在具有1.5L工作体积的3L Applikon生物反应器中进行。以1125mL SR-382填充各生物反应器并通过添加375mL来自含有SR-372中的抗IL-18细胞的Biowave袋的细胞悬浮液而接种。
在实施例4.2中，通过在细胞处于中间至后对数生长期时(其为旋转烧瓶中的第5日)添加丁酸盐来达到滴度增加。之前，3L生物反应器中抗IL-18产生过程的中间至后对数生长期为培养时间的第7日。在该实施例中，选择第7日向培养物中添加丁酸钠，以确保在中间至后对数生长期中添加丁酸盐。
在第7日在添加至培养物中之前即刻通过将4.404g丁酸钠溶解于200mL MilliQ水中而制备200mM浓度的丁酸钠储备溶液。经由0.22μm过滤器过滤对该溶液进行灭菌。
用5个生物反应器进行实验。在各自活力低于50％时终止各生物反应器运行。将两个生物反应器用作对照(抗IL-18过程B)。在培养时间的第7日将浓度分别为0.3mM、1mM和3mM的丁酸钠添加至其他3个生物反应器中。表38显示了培养期间的活细胞浓度，表39显示了培养期间的活力。
活细胞密度[105/ml]
天 反应器1： 反应器2： 反应器3： 反应器4： 反应器5：
1mM丁酸盐 无丁酸盐 0.3mM丁酸盐 3mM丁酸盐 无丁酸盐
0 5.53 5.22 4.89 5.28 5.41
1 8.21 7.68 7.66 9.66 6.81
2 11.35 13.53 10.39 11.12 10.07
3 15.62 17.37 12.58 14.3 13.07
4 20.69 22.4 18.39 22.46 16.49
5 29.58 31.55 31.15 34.03 23.43
6 41.27 44.42 43.32 46.81 32.3
7 59.07 62.09 56.91 60.46 33.95
8 67.07 76.26 51.82 76.4 45.43
9 68.68 73.23 63.11 61.52 57.6
10 65.55 70.17 64.53 55.52 62.45
11 66.55 72.98 66.23 47.27 63.42
12 60.98 56.33 45.87 30.99 44.65
13 49.67 52.03 40.39 21.34 39.1
14 38.46 30.51 21.93 18.38
15 33.23 38.37 41.34 35.97
16 27.97 29.31 33.89 24.58
17 30.13 17.51
18 20.98
表38(上表)：培养期间的活细胞密度
活力[％]
Figure BDA0000381087840001081
Figure BDA0000381087840001091
表39(上表)：培养期间的活力
由于反应器5中的高初始CO2浓度，对照培养物在反应器5中的生长慢于复制物(反应器2)中的生长。在培养时间的第16日终止反应器2(先前在抗IL-18生产过程中所观测)，在第17日终止反应器5。3mM浓度的丁酸钠(反应器4)影响细胞生长和活力。丁酸盐添加后两天细胞开始死亡。1mM丁酸盐不影响细胞生长和活力(反应器1)，第16日终止反应器运行。细胞生长与反应器2中的对照物相比非常类似。0.3mM的丁酸盐使培养时间延长2天(反应器3)。表40显示了培养期间的抗IL-18滴度。
滴度[mg/L]
Figure BDA0000381087840001101
表40(上表)：培养期间的抗IL-18滴度
反应器2(代表抗IL-18过程B)中培养物的最终滴度(第16日)为2325g/L。反应器5中的最终滴度为1589g/L。该较低的滴度可能是由于由培养基中的高初始CO2浓度引起的较差细胞生长。在第7日添加1mM和3mM丁酸盐产生比对照物(反应器2)低的最终滴度。在第7日添加0.3mM丁酸盐会在第17日产生2561g/L的滴度，其与对照物相比增加10％。该滴度为在抗IL-18过程中达到的最高滴度。
实施例4.4：N-乙酰半胱氨酸(10mM、20mM、40mM、80mM)对在SR-372中培养的生产抗IL-18的CHO细胞系的生长和生产率的影响
N-乙酰半胱氨酸可保护哺乳动物细胞免于细胞死亡。作为抗氧化剂，其可直接还原活性氧中间体。通过去乙酰基作用，可将其转化为半胱氨酸并增加细胞内谷胱甘肽水平。谷胱甘肽可清除活性氧中间体并在将过氧化氢还原为水时充当底物。
该实施例证实N-乙酰半胱氨酸的抗IL-18滴度增加效应。实验在具有180mL工作体积的250mL旋转烧瓶中进行。培养基为SR-372。在实验之前，如实施例4.2中所述使细胞预适应在SR-372中生长。如以上″在旋转烧瓶中进行的实验的培养条件″中所述应用旋转培养条件。
通过在加热搅拌盘上将16.32g N-乙酰半胱氨酸溶解于100mLMilliQ水中来制备1M N-乙酰半胱氨酸储备溶液。藉由经0.22μm过滤器过滤对储备溶液进行灭菌。在实验开始前一天，将N-乙酰半胱氨酸添加至SR-372中以获得0mM、10mM、20mM、40mM及80mM的浓度。如以上″在旋转烧瓶中进行的实验的培养条件″所述，通过将细胞自CHO抗IL-18维持培养物中离心起始实验。当各自活力低于50％时终止各旋转培养。
N-乙酰半胱氨酸浓度为20mM、40mM和80mM时细胞不可能生长。表41和表42分别显示了在0mM N-乙酰半胱氨酸及10mM N-半胱氨酸中细胞生长的培养期间活细胞密度和活力的比较。
活细胞密度[105/mL]
Figure BDA0000381087840001111
Figure BDA0000381087840001121
表41(上表)：培养期间的活细胞密度
活力[％]
Figure BDA0000381087840001122
表42(上表)：培养期间的活力
在培养时间的第11日终止对照培养(无N-乙酰半胱氨酸)，而以10 mM N-乙酰半胱氨酸进行的培养可延长直至第16日。最初，10 mMN-乙酰半胱氨酸会影响细胞生长和活力并且导致活力降低直至第3日。接着，活力开始增加。在10 mM N-乙酰半胱氨酸中生长的培养物的最大细胞密度与对照物相比较低。表43证实最终抗-IL-18滴度藉由N-乙酰半胱氨酸而增加。
滴度[mg／L]
Figure BDA0000381087840001132
表43(上表)：培养期间的抗IL-18滴度
对照培养物的平均最终滴度为243.2mg/L，在10mM N-乙酰半胱氨酸中生长的培养物的平均最终滴度为418mg/L。其与对照物相比增加72％。
实施例4.5：N-乙酰半胱氨酸(1mM、2mM、4mM、8mM)对在SR-372中培养的生产抗-IL-18的CHO细胞系的生长和生产率的影响
如实施例4.4中所述，在第0日添加浓度为10mM的N-乙酰半胱氨酸可延长培养时间并使最滴度增加。然而，在该浓度下，细胞活力最初会降低。基于实施例4.4的结果，使用实施例4.4中所测试的N-乙酰半胱氨酸浓度的十分之一设计实验。该旋转烧瓶实验的条件与实施例4.4中相同。添加0mM(对照物)、1mM、2mM、4mM和8mM浓度的N-乙酰半胱氨酸。
表44显示培养期间的活细胞密度，表45显示培养期间的活力。
Figure BDA0000381087840001142
Figure BDA0000381087840001151
Figure BDA0000381087840001152
表44(上表)：培养期间的活细胞密度
Figure BDA0000381087840001153
Figure BDA0000381087840001162
Figure BDA0000381087840001171
表45(上表)：培养期间的活力
在10天培养时间后终止对照培养(0mM N-乙酰半胱氨酸)。N-乙酰半胱氨酸可延长培养物的寿命。在14天培养后终止在8mM N-乙酰半胱氨酸中生长的培养物。在N-乙酰半胱氨酸中生长的培养物与对照物相比具有较低的最大细胞密度。
表46显示N-乙酰半胱氨酸对最终抗-IL-18滴度的影响。
滴度[mg/L]
Figure BDA0000381087840001172
Figure BDA0000381087840001173
Figure BDA0000381087840001181
表46(上表)：培养期间的抗-IL-18滴度
对照培养物的平均最终抗-IL-18滴度为245mg/L(与实施例4.4中的243mg/L非常类似)。在8mM N-乙酰半胱氨酸中生长的培养物的最终抗-IL-18滴度为481mg/L。其与对照物相比增加了96％。
等效物
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来辨识本文所述本发明特定实施方案的许多等效物。该类等效物意欲涵盖于以下权利要求中。本申请案全文中所引用的所有参考文献、专利和公开专利申请案的内容以引用的方式并于本文。

Claims (10)

1.包含A部分、B部分和C部分的无血清细胞培养基，其中：
a)A部分基本由排除下列组份的经修饰基础培养基组成：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；
b)B部分基本由无机铁来源组成；及
c)C部分包含重组生长因子；缓冲剂；渗透压调节剂；能量来源；及至少两种不同的非动物源水解产物。
2.一种用于生产蛋白的方法，其包含在权利要求1的细胞培养基中培养哺乳动物细胞。
3.一种无血清细胞培养基，其包含：
a)基础培养基；
b)约8-12ml／kg或116-126mg／L柠檬酸铁；
c)约2-6mg／kg重组人胰岛素；
d)约2-5g／kg无水葡萄糖；
e)约0.1-0.5g/kg L-谷氨酰胺；
f)约1-3g／kg碳酸氢钠；
g)约0.01-0.05g／kg NaH2PO4·H2O；
h)约0.4-0.5g/kg Na2HPO4·7H2O；及
i)约1.0-3.0g/kg酵母源水解产物。
4.一种用于产生蛋白的方法，其包含：
a)在权利要求3的培养基中培养包含编码该蛋白的核酸的哺乳动物细胞；及
b)将(a)的培养物转移至细胞培养生产培养基中，
以生产所述蛋白。
5.一种无血清细胞培养生产培养基，其包含：
a)排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；
b)约8至12ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；
c)约4至8mL／kg或10至14mg／kg重组人胰岛素；
d)约5至9g／kg无水葡萄糖；
e)约0.5至0.7g/kgL-谷氨酰胺；
f)约1至2g／kg碳酸氢钠；
g)约1至2g／kgHEPES；
h)约2至3g／kgNaCl；
i)约0.5至2g／kgPluronicF-68；
j)约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；
k)约0.4至0.5g/kgNa2HPO4·7H2O；
l)约8至12g／kg酵母源水解产物；及
m)约60至70g／kg植物源水解产物。
6.一种无血清细胞培养基，其包含：
a)排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖；
b)约8至12ml／kg或122.45mg／L柠檬酸铁；
c)约3至5mL／kg或6至8mg／kg重组人胰岛素；
d)约5至9g／kg无水葡萄糖；
e)约0.1至2g／kgL-谷氨酰胺；
f)约1至2g／kg碳酸氢钠；
g)约1至2g／kgHEPES；
h)约2至3g／kgNaCl；
i)约0.1至2g／kgPluronicF-68；
j)约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；
k)约0.4至0.5g／kgNa2HPO4·7H2O；
l)约0.4至0.5g／kgL-天冬酰胺一水合物；
m)约2至6g／kg酵母源水解产物；及
n)约2至4g／kg植物源水解产物。
7.一种用于生产蛋白的方法，其包含在权利要求6的细胞培养基中培养包含编码该抗体的核酸的哺乳动物细胞。
8.一种无血清细胞培养基，其包含：
a)排除下列组份的经修饰基础培养基：碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂及单糖葡萄糖；
b)约8至10ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；
c)约3至5mL／kg或7.8mg／kg重组人胰岛素；
d)约5至9g／kg无水葡萄糖；
e)约0.8至0.9g／kgL-谷氨酰胺；
f)约0.3至0.5g/kgL-天冬酰胺一水合物；
g)约1至2g／kg碳酸氢钠；
h)约1至2g／kgHEPES；
i)约2至3g／kgNaCl；
j)约0.5至2g／kgPluronicF-68；
k)约0.01至0.1g／kgNaH2PO4·H2O；
l)约0.1至1.0g/kgNa2HPO4·7H2O；
m)约2至6g/kg酵母源水解产物；及
n)约2至4g／kg植物源水解产物。
9.一种无血清细胞培养基，其包含：
a)基础细胞生长培养基；
b)约8至12ml／kg或120至130mg／L柠檬酸铁；
c)约2至6mg／kg重组人胰岛素；
d)约150至250g／kg无水葡萄糖；
e)约0.1至0.5g／kgL-谷氨酰胺；
f)约1至2g／kg碳酸氢钠；及
g)约5至15g／kg酵母源水解产物。
10.一种用于产生蛋白的方法，其包含在权利要求8-9中任一项的细胞培养基中培养包含编码所述蛋白的核酸的哺乳动物细胞。
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