KR20110086184A - 면역글로불린 정제 - Google Patents

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immunoglobulin
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마르크 폼피아티
안드레아스 샤우브마르
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 단량체 형태의 면역글로불린 및 응집된 형태의 면역글로불린 및/또는 면역글로불린 단편을 포함하는 완충된 수용액을 상기 면역글로불린이 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합하지 않는 조건 하에 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 인가하는 단계로서, 이때 상기 완충된 수용액의 pH 값이 pH 7.8 내지 pH 8.8인, 단계, 및 단량체 형태의 면역글로불린이 유동 통과액으로부터 회수하는 단계를 포함하는, 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 막 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다.

Description

면역글로불린 정제{IMMUNOGLOBULIN PURIFICATION}
본 발명은 폴리펩티드의 정제 분야에 관한 것이다. 본 발명은 용액 중 면역글로불린을 불순물, 특히 응집된 형태의 면역글로불린 및 면역글로불린 단편으로부터 분리함으로써 단량체(monomeric) 형태의 면역글로불린을 제공하는 방법에 관한 것이다.
단백질 및 특히 면역글로불린은 오늘날 의료 포트폴리오에서 중요한 역할을 수행한다. 인간에 적용하기 위해, 치료 단백질마다 상이한 기준을 충족시켜야 한다. 인간을 위한 생물약제의 안정성을 보장하기 위해, 해로움을 야기할 수 있는 핵산, 바이러스 및 숙주 세포 단백질이 특히 제거되어야 한다. 규제 요건을 충족시키기 위해, 발효 공정 후에 하나 이상의 정제 단계가 수행되어야 한다. 특히, 순도, 처리량 및 수율은 적절한 정제 공정을 결정하는 데 있어서 중요한 역할을 수행한다.
다양한 단백질 정제 방법, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환(설포프로필 또는 카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합-모드 이온 교환), 친황성(thiophilic) 흡착(예를 들어, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용한 흡착), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성(aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용한 흡착 크로마토그래피), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들어, Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용한 친화성 크로마토그래피), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 확립되어 있고 널리 이용되고 있다(예를 들어, 문헌(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)) 참조).
문헌(Necina, R., et al., Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698)에는 높은 전하 밀도를 나타내는 이온 교환 매질을 이용하여 세포 배양 상청액으로부터 인간 단일클론 항체를 직접 포획하는 것이 기재되어 있다. 국제특허출원 공개 제WO89/05157호에는 세포 배양 배지를 양이온 교환으로 직접 처리하여 생성물인 면역글로불린을 정제하는 방법이 기재되어 있다. 마우스 복수로부터의 단일클론 IgG 항체의 1-단계 정제는 문헌(Danielsson, A., et al., J. Immunol. Meth. 115 (1988), 79-88)에 기재되어 있다.
문헌(Mhatre, R., et al., J. Chrom. A 707 (1995) 225-231)에는 양이온 교환 크로마토그래피 및 pH 구배 용출을 이용하여 항체 Fab 단편을 정제하는 것이 기재되어 있다. 국제특허출원 공개 제WO94/00561호에는 인간 단일클론 항-붉은털원숭이 및 이를 생성하는 세포주가 기재되어 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 폴리펩티드를 정제하는 방법은 국제특허출원 공개 제WO04/024866에 기재되어 있는데, 이 방법에서 1종 이상의 오염물질로부터 원하는 폴리펩티드를 분리하기 위해 구배 세척이 이용된다. 문헌(Schwarz, A., et al., Laborpraxis 21 (1997) 62-66)에는 CM-HyperD-컬럼을 이용하여 단일클론 항체를 정제하는 것이 기재되어 있다. 국제특허출원 공개 제WO04/076485호에는 단백질 A 및 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 항체를 정제하는 방법이 기재되어 있다. 유럽특허 제0 530 447호에는 3개의 크로마토그래피 단계의 조합을 이용하여 IgG 단일클론 항체를 정제하는 공정이 기재되어 있다. 항체 제제로부터 단백질 A를 제거하는 것은 미국특허 제4,983,722호에 기재되어 있다.
재조합 단일클론 항체 공정은 항체가 유동하여 통과하게 하면서 미량의 불순물 및 잠재적 오염물질, 예컨대, DNA, 숙주 세포 단백질 및 바이러스에 결합하는 음이온 교환 크로마토그래피를 종종 이용한다(Knudsen, H.L., et al., J. Chrom. A 907 (2001) 145-154).
국제특허출원 공개 제WO95/16037호에는 단백질 A 및 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 하이브리드 하이브리도마로부터 항-EGF-R/항-CD3 이중특이적 단일클론 항체를 정제하는 것이 기재되어 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 항체 다량체로부터 항체 단량체를 분리하는 것은 유럽특허 제1 084 136호에 기재되어 있다.
미국특허 제5,429,746호는 소수성 상호작용 크로마토그래피 조합 크로마토그래피를 항체 분자 단백질의 정제에 적용하는 것에 관한 것이다. 유체, 특히 하전된 미립자로 오염된 비경구 또는 생물학적 액체의 여과를 위해 사용되는 음이온성 변경된 미세다공성 막은 미국특허 제4,604,208호에 기재되어 있다. 국제특허출원 공개 제WO03/040166호에는 단백질 함유 스트림에서 미량의 불순물을 제거하도록 설계된 막 및 장치가 기재되어 있다.
폴리펩티드를 회수하는 방법은 미국특허 제6,716,598호에 기재되어 있다. 미국특허출원 공개 제2006/0194953호에는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된 항체로부터 누출된 단백질 A를 선별적으로 제거하는 방법이 기재되어 있다. 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 응집체로부터 단백질 단량체를 분리하는 것은 국제특허출원 공개 제WO99/62936호에 기재되어 있다. 문헌(Lynch, P. and Londo, T., Gen. Eng. News 11 (1997) 17)에는 친화성-정제된 치료-등급 항체로부터 응집체를 제거하는 시스템이 기재되어 있다. 인간에서 치료제로 사용하기 위한 뮤린 단일클론 항체의 2-단계 정제는 문헌(Jiskoot, W., et al., J. Immunol. Meth. 124 (1989) 143-156)에 기재되어 있다.
본 발명은 면역글로불린 정제의 분야에 속하는 양태를 포함한다. 본 발명자들은 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 좁은 pH 값 범위, 예를 들어, pH 7.8 내지 pH 8.8에서 수행되어야 단량체 형태의 면역글로불린이 유동 통과 모드로 음이온 교환 물질로부터 수득될 수 있음을 발견하였다. 놀랍게도, 이 pH 값 범위로부터 약간만 벗어나도, 예를 들어, pH 7.0 또는 pH 9.0에서도 상기 효과가 사라진다. 본 발명에 따른 방법을 이용하는 경우 응집된 형태의 면역글로불린 및 면역글로불린 단편으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 단일 단계로 분리할 수 있다.
한 양태는 단량체 형태의 면역글로불린 및 응집된 형태의 면역글로불린 및/또는 면역글로불린 단편을 포함하는 완충 수용액을 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 인가하는 단계로서, 이때 상기 완충 수용액의 pH 값은 pH 7.8 내지 pH 8.8인 단계, 및 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 유동 통과액 또는 상청액으로부터 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 결여된 면역글로불린을 회수하여 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 단계를 포함하는, 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 방법이다. 한 실시양태에서, 상기 완충 수용액의 pH 값은 pH 8.0 내지 pH 8.5이다. 또 다른 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 막 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 추가 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 강음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 또 다른 실시양태에서, 강음이온 교환 크로마토그래피 물질은 Q-세파로스(등록상표), 즉 화학식 R-O-CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3의 4급 암모늄 기가 공유결합되어 있는 가교-결합된 아가로스 매트릭스(R)이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계, 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC) 단계 또는 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 제1 단계로서 추가로 포함한다.
도 1a: 항-CCR 항체를 함유하는 용액의 pH를 pH 7.0, 7.5 및 8.0으로 조절하고(pH x.x 적재로서 표시된 분획); 단백질 5 mg을 유동 통과 모드의 15 ㎠ 막 흡착기와 각각 접촉시켰다(pH x.x 유동 통과로서 표시된 분획). 결합된 물질을 염화나트륨으로 용출하였다(pH x.x 용출로서 표시된 분획). 분획을 코마시에 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
도 1b: 항-CCR 항체를 함유하는 용액의 pH를 pH 8.5 및 9.0으로 조절하고(pH x.x 적재로서 표시된 분획); 단백질 5 mg을 유동 통과 모드의 15 ㎠ 막 흡착기와 각각 접촉시켰다(pH x.x 유동 통과로서 표시된 분획). 결합된 물질을 염화나트륨으로 용출하였다(pH x.x 용출로서 표시된 분획). 분획을 코마시에 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) 염색을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
도 1c는 pH 7.5의 항-CCR5 함체 함유 용액의 적재 및 유동 통과 분획(A 및 B)과, pH 8.5의 항-CCR5 항체 함유 용액의 적재 및 유동 통과 분획을 분석 크기 배제 크로마토그래피로 비교한 것이다. 응집체 및 단편은 pH 7.5의 유동 통과 분획에서 검출될 수 있지만 pH 8.5의 유동 통과 분획에서는 검출될 수 없다.
도 2a는 pH 7.5의 CD19 항체의 적재 및 유동 통과 분획(A) 및 pH 8.5의 CD19 항체의 적재 및 유동 통과 분획(B)을 보여주는 오버레이이다. 응집체는 pH 7.5의 유동 통과 분획에서 검출될 수 있지만 pH 8.5의 유동 통과 분획에서는 검출될 수 없다.
도 2b는 항-CCR5 항체 및 항-CD19 항체 용액으로부터의 응집체의 제거를 보여주는 표이다. 유동 통과의 감소는 pH 7.5보다 높은 pH 값, 예컨대, pH 8.5에서 관찰된다.
도 3은 규모 확대 실험을 보여준다: 항-CCR5 항체를 함유하는 용액의 pH를 pH 8.5로 조절하고, 25 mg의 단백질을 75 ㎠ 막 흡착기를 통해 펌핑하였다(pH x.x 유동 통과로서 표시된 분획). 결합된 물질을 염화나트륨으로 용출하였다(pH x.x 용출로서 표시된 분획). 분획을 코마시에 브릴리언트 블루 염색을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
도 4: 항-CCR5 항체를 함유하는 용액의 pH를 pH 8.5로 조절하고(pH 8.5 적재로서 표시된 분획), 26 mg의 단백질을 1 ml Q-세파로스(등록상표) 급속 유동 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 통해 펌핑하였다(pH 8.5 유동 통과로서 표시된 분획). 컬럼을 염화나트륨으로 용출하였다(pH 8.5 용출로서 표시된 분획). 분획을 코마시에 브릴리언트 블루 염색을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다.
용어 "이온 교환 물질" 또는 이의 문법적 등가어는 공유결합된 하전된 치환기를 보유하는 부동 매트릭스를 의미한다. 총 전하 중성을 위해서는, 공유결합되지 않은 반대 이온이 음이온성 상호작용에 의해 하전된 치환기에 결합된다. "이온 교환 물질"은 그의 공유결합되지 않은 반대 이온을 주변 용액의 유사하게 하전된 결합 파트너 또는 이온으로 교환하는 능력을 갖는다. 그의 교환가능한 반대 이온의 전하에 따라, "이온 교환 물질"은 "양이온 교환 물질" 또는 "음이온 교환 물질"로서 지칭된다. 하전된 기(치환기)의 성질에 따라 "이온 교환 물질"은 예를 들어, 양이온 교환 물질의 경우 설폰산 또는 설포프로필 수지(S) 또는 카복시메틸 수지(CM)로서 지칭된다. 하전된 기/치환기의 화학적 성질에 따라 "이온 교환 물질"은 공유결합된 하전된 치환기의 강도에 따라 강이온 교환 물질 또는 약이온 교환 물질로서 더 분류될 수 있다. 예를 들어, 강양이온 교환 물질은 하전된 치환기로서 설폰산 기, 바람직하게는 설포프로필 기를 갖고, 약양이온 교환 물질은 하전된 치환기로서 카복실산 기, 바람직하게는 카복시메틸 기를 갖는다. 강음이온 교환 물질은 하전된 치환기로서 4급 암모늄 기를 갖고, 약음이온 교환 물질은 하전된 치환기로서 다이에틸아미노에틸 기를 갖는다.
용어 "막"은 미세다공성 막 또는 거대다공성 막 둘다를 지칭한다. 막 자체는 중합체 물질, 예컨대, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리카보네이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리아마이드(나일론, 예를 들어, 제타포어(Zetapore)(상표명), N66 포시다인(Posidyne)(상표명)), 폴리에스터, 셀룰로스 아세테이트, 재생된 셀룰로스, 셀룰로스 합성물, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아릴설폰, 폴리페닐설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 부직포 및 직포(예를 들어, 타이벡(Tyvek)(등록상표)), 섬유 물질로 구성되거나, 무기 물질, 예컨대, 제올라이트, SiO2, Al2O3, TiO2 또는 하이드록시아파타이트로 구성된다.
이온 교환 물질은 다양한 명칭 하에 다수의 회사로부터 입수될 수 있는데, 예를 들어, 양이온 교환 수지 바이오-렉스(Bio-Rex)(등록상표)(예를 들어, 타입 70), 켈렉스(Chelex)(등록상표)(예를 들어, 타입 100), 마크로-프렙(Macro-Prep)(등록상표)(예를 들어, 타입 CM, 하이 S, 25S) 및 AG(등록상표)(예를 들어, 타입 50W, MP)는 바이오라드 레이보레이토리스(BioRad Laboratories)로부터 입수될 수 있고, WCX 2는 시퍼겐(Ciphergen)으로부터 입수될 수 있고, 도웩스(등록상표) MAC-3은 다우 케미칼 컴파니로부터 입수될 수 있고, 셀룰로스 CM(예를 들어, 타입 23, 52), 하이퍼-D 및 파티스피어(partisphere)는 와트만 피아이씨(Whatman pic)로부터 입수될 수 있고, 앰버라이트(Amberlite)(등록상표) IRC(예를 들어, 타입 76, 747, 748), 앰버라이트(등록상표) GT 73 및 토요펄(Toyopearl)(등록상표)(예를 들어, 타입 SP, CM, 650M)은 토소 바이오사이언스 게엠베하(Tosoh Bioscience GmbH)로부터 입수될 수 있고, CM 1500 및 CM 3000은 바이오크롬 랩스(BioChrom Labs)로부터 입수될 수 있고, SP-세파로스(상표명) 및 CM-세파로스(상표명)는 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)로부터 입수될 수 있고, 포로스 수지는 퍼셉티브 바이오시스템스(PerSeptive Biosystems)로부터 입수될 수 있고, 아사히팍 ES(예를 들어, 타입 502C), CXpak P, IEC CM(예를 들어, 타입 825, 2825, 5025, LG), IEC SP(예를 들어, 타입 20N, 825) 및 IEC QA(예를 들어, 타입 LG, 825)는 쇼코 아메리카 인코포레이티드(Shoko America Inc.)로부터 입수될 수 있고, 50W 양이온 교환 수지는 에이크롬 테크놀로지스 인코포레이티드(Eichrom Technologies Inc.)로부터 입수될 수 있고, 예를 들어, 도웩스(등록상표) 1과 같은 음이온 교환 수지는 다우 케미칼 컴파니로부터 입수될 수 있고, AG(등록상표)(예를 들어, 타입 1, 2, 4), 바이오-렉스(등록상표) 5, DEAE 바이오-겔 1 및 마크로-프렙(등록상표) DEAE는 바이오라드 레이보레이토리스로부터 입수될 수 있고, 음이온 교환 수지 타입 1은 에이크롬 테크놀로지스 인코포레이티드로부터 입수될 수 있고, 소스 Q, ANX 세파로스(등록상표) 4, DEAE 세파로스(등록상표)(예를 들어, 타입 CL-6B, FF), Q 세파로스(등록상표), 캡토 Q(등록상표) 및 캡토 S(등록상표)는 지이 헬쓰케어로부터 입수될 수 있고, AX-300은 퍼킨엘머로부터 입수될 수 있고, 아사히팍 ES-502C, AXpak WA(예를 들어, 타입 624, G) 및 IEC DEAE는 쇼코 어메리카 인코포레이티드로부터 입수될 수 있고, 앰버라이트(등록상표) IRA-96, 토요펄(등록상표) DEAE 및 TSKgel DEAE는 독일에 소재하는 모두 토쇼 바이오사이언스 게엠베하로부터 입수될 수 있다. 막 이온 교환 물질은 다양한 회사로부터 입수될 수 있고, 예를 들어, 막 양이온 교환 물질 무스탕(Mustang)(상표명) C 및 무스탕(상표명) S는 폴 코포레이션(Pall Corporation)으로부터 입수될 수 있고, 사토바인드(Sartobind)(상표명) CM 및 사토바인드(상표명) S는 사토리우스(Sartorius)로부터 입수될 수 있고, 음이온 교환 막, 예컨대, 무스탕(상표명) Q는 폴 코포레이션으로부터 입수될 수 있고, 사토바인드(상표명) Q는 사토리우스로부터 입수될 수 있다. 막 이온 교환 물질에서, 결합 부위는 유동 통과 공극 벽에서 발견될 수 있고 분산 공극 내에 감추어져 있지 않아 확산보다는 대류를 통해 물질 전달을 가능하게 한다. 한 실시양태에서, 추가 크로마토그래피 단계는 사토바인드(상표명) CM, 사토바인드(상표명) S, 무스탕(상표명) S 및 무스탕(상표명) C로부터 선택된 막 양이온 교환 물질을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피 단계이다. 또 다른 실시양태에서, 음이온 교환 물질은 Q-타입 막 음이온 교환 물질 또는 Q-타입 음이온 교환 컬럼이다.
"폴리펩티드"는 천연적으로 생성되든 아니면 합성적으로 생성되든 관계없이 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기들로 구성된 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드는 "펩티드"로서 지칭된다.
"단백질"은 100개 초과의 아미노산 잔기들로 구성된 1개 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 거대분자이다. 단백질은 비-펩티드 성분, 예컨대, 탄수화물 기도 포함할 수 있다. 탄수화물 및 다른 비-펩티드 치환기는 단백질이 생성되는 세포에 의해 단백질에 부가될 수 있고 세포의 종류에 따라 달라질 것이다. 단백질은 본 명세서에서 그의 아미노산 골격 구조 면에서 정의되고, 치환기, 예컨대, 탄수화물 기는 일반적으로 특정되지 않지만 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
용어 "면역글로불린" 및 이의 문법적 등가어는 2개의 경쇄 폴리펩티드 및 2개의 중쇄 폴리펩티드로 구성된 분자를 의미한다. 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드는 항원과의 상호작용을 위한 결합 도메인을 함유하는 가변 영역(일반적으로 폴리펩티드 쇄의 아미노 말단 부분)을 각각 포함한다. 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드는 면역 시스템의 다양한 세포, 일부 식균세포 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자와 항체의 결합을 매개할 수 있는 불변 영역(일반적으로 폴리펩티드 쇄의 카복실 말단 부분)도 각각 포함한다. 한 실시양태에서, 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드는 가변 영역, 즉 VL 또는 VH, 및 불변 영역, 즉 CL(경쇄 폴리펩티드의 경우) 또는 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 경우에 따라 CH4(중쇄 폴리펩티드의 경우)로 구성된 쇄이다. 또한, 용어 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드로 구성된 단백질을 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 다양한 불변 영역 유전자뿐만 아니라 다수의 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 다양한 형태로 존재할 수 있다. 면역글로불린 단편은 예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일쇄이다(예를 들어, 문헌(Huston, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird et al., Science 242 (1988) 423-426; Hood et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition (1984); and Hunkapiller and Hood, Nature 323 (1986) 15-16) 참조). 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 면역글로불린은 단일클론 면역글로불린이다.
용어 "단량체 형태의 면역글로불린" 및 이의 문법적 등가어는 제2 면역글로불린 분자와 결합되지 않은, 즉 또 다른 면역글로불린 분자에 공유결합 또는 비공유결합되지 않은 면역글로불린 분자를 의미한다. 용어 "응집된 형태의 면역글로불린" 및 이의 문법적 등가어는 하나 이상의 추가적 면역글로불린 분자 또는 이의 단편과 공유결합되거나 비공유결합되어 단량체 형태의 면역글로불린보다 먼저 크기 배제 크로마토그래피 컬럼을 사용한 크로마토그래피에서 용출되는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "단량체 형태의" 및 이의 문법적 등가어는 반드시 100%의 면역글로불린 분자가 단량체 형태로 존재함을 의미하는 것은 아니다. 상기 용어는 면역글로불린의 크기 배제 크로마토그램의 피크 면적으로서 측정된 경우 면역글로불린이 본질적으로 단량체 형태로 존재함, 즉 90% 이상의 면역글로불린이 단량체 형태로 존재함, 한 실시양태에서 95% 이상의 면역글로불린이 단량체 형태로 존재함, 또 다른 실시양태에서 98% 이상의 면역글로불린이 단량체 형태로 존재함, 추가 실시양태에서, 99% 이상의 면역글로불린이 단량체 형태로 존재함, 또 다른 실시양태에서 99% 초과의 면역글로불린이 단량체 형태로 존재함을 의미한다. 용어 "단량체 형태 및 응집된/단편화된 형태"는 적어도 다른 면역글로불린 분자와 결합되지 않은 면역글로불린 분자, 다른 면역글로불린 분자와 결합된 면역글로불린 분자 및/또는 다른 면역글로불린 분자의 부분을 포함하는 혼합물을 의미한다. 이 혼합물에서 단량체 형태, 응집된 형태 및 단편화된 형태 중 어느 것도 배타적으로 존재하지 않는다.
용어 "100%"는 특정된 성분 이외의 성분들의 양이 특정된 조건 하에 언급된 분석 방법의 검출 한계 미만임을 의미한다.
용어 "90%", "95%", "98%" 및 "99%"는 정확한 값을 의미하는 것이 아니라 특정된 조건 하에 언급된 분석 방법의 정확도 이내의 값을 의미한다. 용어 "면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 결여된 단량체 형태의 면역글로불린"은 일부 실시양태에서 단량체 형태의 면역글로불린이 90중량% 이상, 95중량% 이상, 98중량% 이상 또는 99중량% 이상을 차지함을 의미한다. 일부 실시양태에서 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편은 제제의 중량을 기준으로 10중량% 이하, 5중량% 이하, 2중량% 이하 또는 1중량% 이하를 차지한다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 이의 이용은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York)을 참조한다.
재조합 제조된 면역글로불린의 정제를 위해, 종종 다양한 크로마토그래피 단계가 병용된다. 일반적으로, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 다음에 1 또는 2종의 추가적인 분리 단계를 수행한다.
최종 정제 단계는 미량의 불순물 및 오염물질, 예컨대, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소의 제거를 위한 소위 "연마(polishing) 단계"이다. 이 연마 단계만을 위해, 종종 음이온 교환 물질이 유동 통과 모드로 사용된다.
용어 "유동 통과 모드" 및 이의 문법적 등가어는 정제할 원하는 물질, 예를 들어, 단량체 형태의 면역글로불린을 함유하는 용액을 고정상, 한 실시양태에서 고체상과 접촉시키고, 이때 상기 원하는 물질이 상기 고정상에 결합하지 않는 정제 방법의 작동 모드를 의미한다. 결과적으로, 원하는 물질은 유동 통과액(정제 방법이 크로마토그래피 방법인 경우) 또는 상청액(정제 방법이 회분식 방법인 경우)으로 수득된다. 정지상과 접촉하기 전에 용액에 존재하는 원하지 않는 물질, 예를 들어, 응집된 형태의 면역글로불린 및/또는 면역글로불린 단편은 정지상에 결합하여 용액으로부터 제거된다. 이것은 100%의 원하지 않는 물질이 용액으로부터 제거되는 것을 의미하는 것이 아니라, 크기 배제 크로마토그래피의 피크 면적에 의해 측정된 경우 본질적으로 100%의 원하지 않는 물질이 제거되거나, 특정 실시양태에서 50% 이상의 원하지 않는 물질이 용액으로부터 제거되거나, 75% 이상의 원하지 않는 물질이 용액으로부터 제거되거나, 90% 이상의 원하지 않는 물질이 용액으로부터 제거되거나, 95% 초과의 원하지 않는 물질이 용액으로부터 제거됨을 의미한다.
용어 "에 인가하는" 및 이의 문법적 등가어는 정제할 원하는 물질을 함유하는 용액을 정지상과 접촉시키는 정제 방법의 부분적 단계를 의미한다. 이것은 a) 상기 용액이, 상기 정지상이 위치한 크로마토그래피 장치에 첨가되거나, b) 상기 정지상이 상기 용액에 첨가됨을 의미하고, a)의 경우 정제할 원하는 물질을 함유하는 용액은 정지상과 용액 중 상기 물질 사이의 상호작용을 허용하는 정지상을 통과한다. 조건, 예를 들어, pH, 전도성, 염 농도, 온도 및/또는 유속에 따라, 용액의 일부 물질들은 정지상에 결합되어 용액으로부터 제거된다. 다른 물질들은 용액에 잔존한다. 용액에 잔존하는 물질들은 유동 통과액 중에서 발견될 수 있다. "유동 통과액"은 크로마토그래피 장치의 통과 후 수득된 용액을 의미한다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 장치는 크로마토그래피 물질을 가진 컬럼이거나, 또 다른 실시양태에서 막 크로마토그래피 물질을 가진 카세트이다. 정지상에 결합되지 않은 원하는 물질은 당업자에게 잘 알려진 방법, 예컨대, 침전, 염석, 한외여과, 정용여과, 동결건조, 친화성 크로마토그래피 또는 농축된 용액을 수득하기 위한 용매 부피 감축에 의해 유동 통과액으로부터 회수될 수 있다. b)의 경우, 정지상은 정제할 원하는 물질을 함유하는 용액에 예를 들어, 분말로서 첨가되어 상기 정지상과 용액 중 상기 물질 사이의 상호작용을 허용한다. 상호작용 후, 상기 정지상은 예를 들어, 여과에 의해 제거되고, 정지상에 결합되지 않은 원하는 물질은 상청액 중에 수득된다.
용어 "에 결합하지 않는" 및 이의 문법적 등가어는 원하는 물질, 예를 들어, 면역글로불린이 정지상, 예컨대, 막 이온 교환 물질과 접촉할 때 용액에 잔존함을 의미한다. 이것은 100%의 원하는 물질이 용액에 잔존함을 의미하는 것이 아니라, 크기 배제 크로마토그래피의 피크 면적에 의해 측정된 경우 본질적으로 100%의 원하는 물질이 용액에 잔존하거나, 특정 실시양태에서 50% 이상의 원하는 물질이 용액에 잔존하거나, 65% 이상의 원하는 물질이 용액에 잔존하거나, 80% 이상의 원하는 물질이 용액에 잔존하거나, 90% 이상의 원하는 물질이 용액에 잔존하거나, 95% 초과의 원하는 물질이 용액에 잔존함을 의미한다.
용어 "완충된"은 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH의 변화가 완충제 물질에 의해 수평화된 용액을 의미한다. 이러한 효과를 발생시키는 임의의 완충제 물질이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충제 물질, 예를 들어, 인산 및 이의 염, 시트르산 및 이의 염, 모르폴린, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 및 이의 염, 히스티딘 및 이의 염, 글리신 및 이의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 및 이의 염이 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 완충제 물질은 인산 및 이의 염, 시트르산 및 이의 염, 및 히스티딘 및 이의 염으로부터 선택된다. 경우에 따라, 완충된 용액은 추가적 염, 예컨대, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨을 포함할 수 있다.
용어 "결합-및-용출 모드" 및 이의 문법적 등가어는 정제할 원하는 물질을 함유하는 용액을 정지상, 한 실시양태에서, 고체상과 접촉시키고, 이때 상기 원하는 물질이 상기 정지상에 결합하는 정제 방법의 작동 모드를 의미한다. 그 결과, 원하는 물질은 정지상에 보유되는 반면, 원하지 않는 물질은 유동 통과액 또는 상청액과 함께 제거된다. 그 후, 원하는 물질은 제2 단계에서 정지상으로부터 용출되고, 이에 따라 용출 용액과 함께 정지상으로부터 회수된다.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 방법에 관한 것이다: 단량체 형태의 면역글로불린 및 응집된 형태의 면역글로불린 및/또는 면역글로불린 단편을 포함하는 완충된 수용액을 상기 면역글로불린이 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합하지 않는 조건 하에 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 인가하는 단계로서, 이때 상기 완충된 수용액의 pH 값이 pH 7.8 내지 pH 8.8인, 단계, 및 단량체 형태의 면역글로불린을 유동 통과액으로부터 회수하는 단계.
용어 "단량체 형태의 면역글로불린이 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합하지 않는 조건" 및 이의 문법적 등가어는 단량체 형태의 면역글로불린이 음이온 교환 크로마토그래피 물질과 접촉하였을 때 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 결합되지 않는 조건을 의미한다. 이것은 100%의 단량체 형태의 면역글로불린이 결합되지 않음을 의미하는 것이 아니라, 크기 배제 크로마토그래피의 피크 면적에 의해 측정된 경우 본질적으로 100%의 단량체 형태의 면역글로불린이 결합되지 않거나, 특정 실시양태에서 50% 이상의 단량체 형태의 면역글로불린이 결합되지 않거나, 65% 이상의 단량체 형태의 면역글로불린이 결합되지 않거나, 80% 이상의 단량체 형태의 면역글로불린이 결합되지 않거나, 90% 이상의 단량체 형태의 면역글로불린이 결합되지 않거나, 95% 초과의 단량체 형태의 면역글로불린이 결합되지 않음을 의미한다. 한 실시양태에서, 완충된 수용액의 pH 값은 pH 7.8 내지 pH 8.8이다. 추가 실시양태에서, 이러한 조건은 pH 8.0 내지 pH 8.5의 완충된 수용액의 pH 값이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 단량체 형태의 면역글로불린이 유동 통과 모드로 음이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 수득될 수 있는 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 pH 7.8 내지 pH 8.8, 한 실시양태에서 pH 8.0 내지 pH 8.5의 좁은 pH 값 범위 내에서 수행될 수 있음을 발견하였다.
놀랍게도, 이 pH 값 범위를 약간 벗어난 pH, 예를 들어, pH 7.0 또는 pH 9.0에서 이 효과는 감소된다. 본 발명에 따른 방법을 이용하는 경우, 응집된 형태의 면역글로불린 및 면역글로불린 단편으로부터 단량체 형태의 면역글로불린을 단일 단계에서 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 단일 단계 방법으로서 이용될 수 있거나, 또는 다른 단계, 예컨대, 한 실시양태에서 단백질 A 크로마토그래피 단계 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피 단계와 함께 병용될 수 있다.
한 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질은 막 음이온 교환 크로마토그래피 물질이다. 또한, 친화성 크로마토그래피를 이용하는 제1 정제 단계에서 용적이 큰 숙주 세포 단백질 및 배양 부산물을 제거하는 것이 유리하다. 친화성 크로마토그래피는 예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 단백질 G 친화성 크로마토그래피, HCIC 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC, 예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용하는 HIC)일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 단백질 A 크로마토그래피 단계 또는 HCIC 크로마토그래피 단계를 포함한다.
1개 초과의 크로마토그래피 단계를 포함하는 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 정제 방법의 한 단계(또는 후속 단계)에 용액을 인가하기 전에 파라미터, 예컨대, 용액의 pH 값 또는 전도성을 조절해야 한다. 한 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 인가된 완충된 수용액의 pH 값은 pH 7.8 내지 pH 8.8, 또 다른 실시양태에서 pH 8.0 내지 pH 8.5이다.
하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않으면서 기재된 절차에 대한 변경을 가할 수 있음을 이해해야 한다.
[실시예]
재료 및 방법
컨디셔닝된 단백질 A 용출액
항-CCR5 항체(이하, "mAb CCR5"로 지칭됨, 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 2006/103100호 참조) 및 항-CD19 항체(이하, "mAb CD19"로 지칭됨)를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 제1 단계에서 정제하였다.
산성 조건 하에 단백질 A 컬럼으로부터 mAb CCR5를 용출하였다. 추가 처리 전에, 완충된 용액(예를 들어, 트라이스(하이드록시메틸)아미놀-메탄(TRIS) 또는 포스페이트 완충제)에 대한 투석을 수행하여 면역글로불린을 함유하는 분획의 pH 값을 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 9.0의 pH 값으로 조절하였다. 이 물질은 이하에서 mAb CCR5의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액으로서 지칭된다.
산성 조건 하에 단백질 A 컬럼으로부터 mAb CD19를 용출하였다. 추가 처리 전에, 완충된 용액(예를 들어, 트라이스(하이드록시메틸)아미놀-메탄(TRIS) 또는 포스페이트 완충제)에 대한 투석을 수행하여 면역글로불린을 함유하는 분획의 pH 값을 8.5의 pH 값으로 조절하였다. 이 물질은 이하에서 mAb CD19의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액으로서 지칭된다.
분석 방법
크기 배제 크로마토그래피:
수지: TSK 3000(토소하아스)
컬럼: 300 x 7.8 mm
유속: 0.5 ml/분
완충제: pH 7.0으로 조절된, 250 mM 염화칼륨을 함유하는 200 mM 인산칼륨 완충제
파장: 280 nm
SDS-PAGE:
LDS 샘플 완충제(4배 농축액)(4x): 4 g 글리세롤, 0.682 g TRIS-베이스, 0.666 g TRIS-하이드로클로라이드, 0.8 g LDS(리튬 도데실 설페이트), 0.006 g EDTA(에틸렌 다이아민 테트라 아세트산), 1 중량%(w/w)의 물 중 서바 블루(Serva Blue) G250 용액 0.75 ml 및 중량%(w/w)의 페놀 레드 용액에 물을 첨가하여 총 부피가 10 ml가 되게 한다.
면역글로불린을 함유하는 용액을 원심분리하여 데브리스를 제거하였다. 정화된 상청액의 분취액을 1/4 부피(v/v)의 4x LDS 샘플 완충제 및 1/10 부피(v/v)의 0.5 M 1,4-다이티오트레이톨(DTT)와 혼합하였다. 이어서, 샘플을 70℃에서 10분 동안 항온처리하고, 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였다. NuP AGE(등록상표) 프리-캐스트 겔 시스템(인비트로겐 코포레이션)을 제조자의 지시에 따라 사용하였다. 구체적으로, 10% NuP AGE(등록상표) 노벡스(등록상표) 바이스-TRIS 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 NuP AGE(등록상표) MOPS 런닝 완충제를 사용하였다.
실시예 1
pH 7.0의 mAb CCR5의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액, pH 7.5의 mAb CCR5의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액, pH 8.0의 mAb CCR5의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액, pH 8.5의 mAb CCR5의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액 및 pH 9.0의 mAb CCR5의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액을 각각 1 mg/ml의 농도로 조절하였다. 5 ml의 용액 각각을 크로마토그래피 시스템을 이용하여 유동 통과 모드의 재생되고 (상기 pH 각각으로) 평형화된 Q-막 흡착기(막 음이온 교환 크로마토그래피 물질, 막 면적: 15 ㎠)에 개별적으로 인가하였다. 이어서, 상기 막을 상응하는 pH의 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질을 상응하는 pH 값에서 염 구배로 용출하였다.
mAb CCR5는 pH 7.0 및 pH 7.5에서 막 흡착기에 결합하지 않음을 발견하였다. pH 8.0 내지 pH 8.5에서 약한 결합이 달성되었다. pH 9.0에서 항체의 강한 결합이 보였다. 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의한 유동 통과 분획 및 용출 분획의 분석은 pH 8.0 및 pH 8.5에서 유동 통과 분획으로부터 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 상당히 제거됨을 보였다. pH 7.0 및 7.5에서는 이러한 제거가 관찰되지 않았고, pH 9.0에서는 매트릭스 결합으로 인한 높은 생성물 손실이 일어났다. pH 8.0 및 pH 8.5에서 전도성에 의해 유발되는 용출을 이용하여 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 풍부한 분획을 수득하였다.
실시예 2
H 7.0의 mAb CD19의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액, pH 7.5의 mAb CD19의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액, pH 8.0의 mAb CD19의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액, pH 8.5의 mAb CD19의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액 및 pH 9.0의 mAb CD19의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액을 각각 1 mg/ml의 농도로 조절하였다. 5 ml의 용액 각각을 크로마토그래피 시스템을 이용하여 유동 통과 모드의 재생되고 (상기 pH 각각으로) 평형화된 Q-막 흡착기(막 면적: 15 ㎠)에 개별적으로 인가하였다. 이어서, 상기 막을 상응하는 pH의 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질을 상응하는 pH 값에서 염 구배로 용출하였다.
mAb CD19는 pH 7.0 및 pH 7.5에서 막 흡착기에 결합하지 않음을 발견하였다. pH 8.0 내지 pH 8.5에서 약한 결합이 달성되었다. pH 9.0에서 항체의 강한 결합이 보였다. 크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의한 유동 통과 분획 및 용출 분획의 분석은 pH 8.0 및 pH 8.5에서 생성물로부터 면역글로불린의 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 상당히 제거됨을 보였다. pH 7.0 및 7.5에서는 이러한 제거가 관찰되지 않았고, pH 9.0에서는 매트릭스 결합으로 인한 높은 생성물 손실이 일어났다. pH 8.0 및 pH 8.5에서 전도성에 의해 유발되는 용출을 이용하여 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 풍부한 분획을 수득하였다.
실시예 3
mAb CCR5의 단백질 A 용출액을 pH 8.5로 컨디셔닝하고 1 mg/ml의 농도로 조절하였다.
25 ml의 용액을 크로마토그래피 시스템을 이용하여 유동 통과 모드의 재생되고 (pH 8.5로) 평형화된 Q-막 흡착기(막 면적: 75 ㎠)에 인가하였다. 이어서, 상기 막을 pH 8.5의 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질을 상응하는 pH 값에서 염 구배로 용출하였다.
실시예 1의 결과는 5배 더 높은 수준으로 재수득될 수 있었다. 유동 통과액은 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편을 결여하였다. 상기 두 불순물을 염 구배를 이용하여 막 흡착기로부터 용출할 수 있었다.
실시예 4
pH 8.5에서 mAb CCR5의 컨디셔닝된 단백질 A 용출액을 1 mg/ml의 농도로 조절하였다.
6 ml의 용액을 크로마토그래피 시스템을 이용하여 유동 통과 모드의 재생되고 (pH 8.5로) 평형화된 Q-세파로스(등록상표) FF에 인가하였다. 이어서, 상기 세파로스를 상응하는 pH의 완충제로 세척하였다. 결합된 단백질을 상응하는 pH 값에서 염 구배로 용출하였다.
크기 배제 크로마토그래피 및 SDS-PAGE에 의한 유동 통과 분획 및 용출 분획의 분석은 pH 8.5에서 생성물로부터 면역글로불린의 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 상당히 제거됨을 보였다. pH 8.0 및 pH 8.5에서 전도성에 의해 유발되는 용출을 이용하여 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 풍부한 분획을 수득하였다.

Claims (4)

  1. 하기 단계 a) 및 b)를 포함하는, 단량체(monomeric) 형태의 면역글로불린을 수득하는 방법:
    a) 단량체 형태의 면역글로불린 및 응집된 형태의 면역글로불린 및/또는 면역글로불린 단편을 포함하는 완충된 수용액을 음이온 교환 크로마토그래피 물질에 인가하는 단계로서, 이때 상기 완충된 수용액의 pH 값이 pH 8.0 내지 pH 8.5인, 단계; 및
    b) 상기 음이온 교환 크로마토그래피 물질의 유동 통과액으로부터 면역글로불린 응집체 및 면역글로불린 단편이 결여된 면역글로불린을 회수하여 단량체 형태의 면역글로불린을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    음이온 교환 크로마토그래피 물질이 막 음이온 교환 크로마토그래피 물질임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    음이온 교환 크로마토그래피 물질이 강음이온 교환 크로마토그래피 물질임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 a) 전에 단백질 A 크로마토그래피 단계 또는 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC) 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
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