DE3333190C2

DE3333190C2 -

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Publication number: DE3333190C2
Application number: DE3333190A
Authority: DE
Inventors: Paul Russell Billerica Mass. Us Kelley; Camille Josette Chestnut Hill Mass. Us Gaudreau; Orrie Max Brookline Mass. Us Friedman; Gordon Hisashi Lake Placid N.Y. Us Sato
Original assignee: COLLABORATIVE RESEARCH Inc LEXINGTON MASS US
Current assignee: Discovery Labware Inc
Priority date: 1982-09-15
Filing date: 1983-09-14
Publication date: 1992-11-12
Also published as: FR2532948A1; JPH0728728B2; CH666048A5; SE8304795L; GB2127845B; SE8304795D0; IL69664A0; BE897760A; DE3333190A1; IT8322885A0; NL8303166A; GB2127845A; JPS5974982A; IT1217274B; AU1907783A; GB8324369D0; DK417483D0; DK417483A; CA1221651A; FR2532948B1

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 4 angegebene Supplement, ein Verfahren zu dessen Herstellung nach Anspruch 15 sowie dessen Verwendung für ein Zellwachstumsmedium nach den Ansprüchen 6 bis 14.

Tierserum und insbesondere Fetal-Kalbsserum ist als Supplement für übliche Gewebekulturmedien bekannt. Das heißt, daß es bekannt ist, bis zu 20 Vol.-% und häufig 10 Vol.-% Rinderserum zu Gewebekulturen und Tierzellen in Standardgewebewachstumsmedien, wie Ham's F12, Dulbecco's Modified Eagle's Media und zu anderen zuzugeben. Dieses Serum scheint einige essentielle Materialien für die Gewebekultur zur Verfügung zu stellen, die nicht leicht, wenn überhaupt, von bekannten Stoffen zur Verfügung gestellt werden. Die Verwendung von tierischem Serum als Supplement für Wachstumsmedien hilft häufig, daß die Zellen eine differenzierte Funktion ausdrücken, daß sie in den gewünschten Konzentrationen wachsen und daß das Wachstum und die Lebensfähigkeit über längere Zeiträume erhalten bleiben.

Die Verwendung von tierischem Serum kann bei Gewebekulturen jedoch gewisse Probleme beinhalten. Das Hauptproblem ist die Variabilität in der Zusammensetzung des Serums. So kann die Wachstumsbeschleunigungsbeeinflussung von individuellen Seren sehr stark variieren. Die Hersteller von tierischem Serum versuchen, diese Variationen dadurch zu vermeiden, daß sie das Serum von vielen Tieren zusammengeben und Spenderherden von Tieren bekannter Qualität unterhalten und/oder indem sie das Niveau an Hormonen, Wachstumsfaktoren und anderen Serumskomponenten überwachen oder analysieren. Diese Versuche sind jedoch kostspielig und nicht immer erfolgreich, um das Problem der Variabilität zu lösen. Diese Probleme können aber die Anwendbarkeit beim Verbraucher einschränken und können zu unterschiedlichen Untersuchungsergebnissen führen. Häufig müssen die Verbraucher ausführliche Versuche mit einem Serum vornehmen, bevor dieses verwendet werden kann, und dies ist zeit- und kostspielig. Die Verfügbarkeit von Rinderserum in größeren Mengen kann problematisch werden, weil sie von den Höhen und Tiefen der Rinderhaltung abhängt. Fetales Kalbsserum sowie auch anderes Rinderserum fällt als Nebenprodukt an und ist deshalb von der Größe der Herde abhängig, die zyklisch variieren.

Es wurde festgestellt, daß die Verwendung von Tierserum als Supplement zu normalen Wachstumsmedien Nachteile hat. Andere haben versucht, die Menge des für Gewebekulturen verwendeten Serums zu vermindern oder das Serum ganz fortzulassen. Es sind serumfreie Wachstumsmedien entwickelt worden, die spezifisch für spezielle Zellarten sind. In gleicher Weise hat man die Verringerung des normalerweise zugesetzten Serums mit der Zugabe von Wachstumsfaktoren und anderen Supplementen, die für spezifische Zellinien gedacht sind, kompensiert. Wenn man daher in der Vergangenheit in normalem Gewebewachstum die Mengen an Serum erniedrigt oder ganz fortgelassen hat, so geschah dies im Zusammenhang mit ganz speziellen Zellarten.

So beschreibt Cell. Phys., 110, 219-229 (1982), ein Wachstumsmedium mit einer definierten Zusammensetzung ohne natürliche Zusätze wie tierisches Serum. Das Medium ist speziell zur hochselektiven Züchtung von epidermalen Keratinocyten geeignet und hemmt das Wachstum von Fibroblasten.

In Analytical Biochemistry, 102, 255-270 (1980), werden ebenfalls Verfahren zum Wachstum von Zellkulturen in serumfreien Medien vorgestellt.

Aus dem Stand der Technik ist kein im wesentlichen universelles Supplement für Gewebekulturen bekannt, welches von der Industrie für eine große Anzahl von unterschiedlichen Zellen akzeptiert wird, einschließlich transformierten und nicht-transformierten Primärzellen von sowohl fibroblastoidem als auch epithelioidem Ursprung und transformierten und nicht- transformierten kontinuierlichen Zellinien.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Supplement für ein Zellwachstumsmedium zur Verfügung zu stellen, welches tierisches Serum und eine Kombination von Ergänzungsstoffen für tierische Serumkomponenten enthält, wobei das Supplement der Erhöhung des Zellwachstums in der Kultur dient.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, in Übereinstimmung mit dem vorhergehenden Ziel ein Supplement für ein Zellwachstumsmedium zur Verfügung zu stellen, das mit im wesentlichen gleichen Eigenschaften im gewünschten Volumen hergestellt werden kann, und zwar für das Zellwachstum in einer Vielzahl von Medien, wobei die Zellen aus einer großen Anzahl von Zelltypen ausgewählt sein können.

Ein Ziel der Erfindung ist es auch, im Zusammenhang mit den vorhergehenden Zielen Supplemente für ein Zellwachstumsmedium in Kombination mit üblichen Gewebekulturmedien, wie sie zum Züchten von Zellen verwendet werden, zur Verfügung zu stellen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es schließlich auch, vorteilhafte Verfahren zur Herstellung und Verwendung des erfindungsgemäßen Supplements für ein Zellwachstumsmedium aufzuzeigen.

Erfindungsgemäß enthält das Supplement für ein Zellwachstumsmedium eine kleinere Menge tierisches Serum, vorzugsweise Serum eines neugeborenen Kalbes, zusammen mit einer größeren Menge von ausgewählten Schilddrüsen- und Peptidhormonen, Corticoiden, Androgenen, Östrogenen, Wachstumsfaktoren, Nährmitteln und Transportfaktoren, anorganischen Salzen, Aminosäuren, Vitaminen, Zucker und geringeren Mengen an anderen Komponenten in einer wäßrigen Base, um dadurch ein schnelles und produktives Wachstum einer Vielzahl von Zelltypen bei primären und kontinuierlichen Zellkulturlinien, transformierten und nicht-transformierten Zellinien aus Geweben, einschließlich fibroblastoiden und epitheloiden Zellen, zu ermöglichen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Serum ein Serum von neugeborenen Kälbern, das Peptidhormon ist Insulin, der Transportfaktor ist Transferrin, die Wachstumsfaktoren sind epidereme Wachstumsfaktoren und endotheliale Zellwachstumssupplemente, während die Nährmittel selenige Säure und o-Phosphoryl- ethanolamin einschließen und das Schilddrüsenhormon Trÿodothyroxin, das Corticoid Hydrocortison, das Östrogen Estradiol 17, Progesteron und das Androgen Testosteron sind.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Supplement durch gründliches Vermischen formuliert, und zum Sterilisieren der Mischung wird eine Filtrierstufe angewendet. Das Filtrieren wird vorzugsweise als letzte Stufe bei der Herstellung des Supplements durchgeführt.

Ein Merkmal der Erfindung ist es, daß das Supplement Probleme, wie sie durch die Variabilität bei Serumzusammensetzungen aus unterschiedlichen Ansätzen vorkommen, vermindern oder vermeiden kann. Die geringe Menge des zugegebenen Serums kann ohne wesentliche Auswirkungen variieren, da sie nur eine kleine Komponente in der Gewebekultur, häufig ein Viertel oder weniger, der Menge ausmacht, wie sie normalerweise verwendet wird. Überraschenderweise werden, obwohl nur eine geringe Menge des Serums verwendet wird, die notwendigen Komponenten für ein universelles Gewebewachstumsmedium, z. B. Zellbindungsfaktoren und Trägerproteine für wasserunlösliche Substanzen zur Verfügung gestellt. Die geringe Zugabe der Serumbase stellt weitere Faktoren für die Zellmultiplikation zur Verfügung. Da die Serummenge gering ist, enthält sie auch verminderte Mengen an toxischen Substanzen, die normalerweise in Serum vorkommen. Da das Proteinniveau in der fertigen Zellkultur gegenüber der alleinigen Verwendung von Serum verringert wird, ist die Abtrennung des Proteins aus dem Fertigprodukt einfacher. Die Konzentration des in dem Kulturmedium gewachsenen Zellproduktes kann erhöht werden, wenn man das erfindungsgemäße Supplement zur Erhöhung des Wachstums verwendet. Die Verringerung des Gesamtproteingehaltes des Zellwachstumsmediums ergibt auch eine erhöhte Effizienz und eine leichtere Gewinnung und Reinigung der gewünschten Zellprodukte. Dies kann außerordentlich wichtig für die pharmazeutische und Impfstoffindustrie sein. Durch das erfindungsgemäße Supplement wird die Reproduzierbarkeit eines konstanten Produktes verbessert. Dies kann die Variabilität der Wachstumsbeschleunigung, wie sie üblicherweise mit unterschiedlichen Ansätzen von Gesamt-Tierserum beobachtet wird, vermeiden und vermeidet auch die Notwendigkeit zahlreiche Ansätze eines Serums auszuprobieren, um den gewünschten Ansatz herauszufinden. Auf diese Weise kann man Kosten und Zeit bei der Gesamtherstellung von Gewebekulturen verringern.

Das Supplement für ein Zellwachstumsmedium gemäß der Erfindung wird anstelle von Tierserum in Zell- und Gewebekulturen verwendet. Gewöhnlich wurde Tierserum in Zellkulturen in Mengen von 5 bis 20 Vol.-% eines normalen Gewebekulturmediums verwendet, es ist jedoch bevorzugt, das Supplement für das Zellwachstumsmedium gemäß der Erfindung in Mengen von 1 bis 25 Vol.-% des üblichen Gewebekulturmediums zu verwenden. Bei limitierten Zellinien kann man höhere oder niedrigere Anteile an Supplement gegenüber üblichem Medium verwenden, z. B. 0,1 bis 40% Supplement und 99,9 bis 60% übliches Medium. Solche normalen Gewebekulturmedien, die mit dem erfindungsgemäßen Supplement verwendet werden können und die bisher mit Serum allein verwendet wurden, schließen die folgenden Medien ein, ohne daß dadurch eine Beschränkung ausgesprochen werden soll:
McCoy's 5a Medium
McCoy, T. A., Maxwell, M., und Kruse, P. F., Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., 100, 115-118 (1959);
Minimum Essential Medium - MEM
Eagle, H., Science, 130, 432 (1959);
Modified Eagle Medium
Daniel, M. D., und Melendez, L. V., Proc. of the Soc. for Exp. Biol. and Med., 127, Nr. 3 (März 1969);
Dulbecco's Modified Eagle Medium
Dulbecco, R., und Freeman, G., Virology, 8, 396 (1959);
Smith, J. D., Freeman, G., Vogt, M., und Dulbecco, R., Virology, 12, 185-196 (1960), Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6, Nr. 3, 93;
L-15 (Leibovitz) Medium
Leibovitz, A., Am. J. Hyg., 78, 173-180 (1963):
Nutrient Mixtures - F-10 und F-12 Media
Ham, R. G., Exp. Cell Res., 29, 515-526 (1963);
Ham, R. G., Proc. Nat. Acad. Sci., 53, 288-293 (1965);
Waymouth's Medium
Waymouth, C., J. Nat. Cancer Inst., 22, 1003-1017 (1959).

Beispiele für wäßrige Formulierungen solcher Medien sind:

Ham's Nutrient Medium F-12 (erhältlich von Gibco Laboratories)

Dulbecco's Modified Eagle Medium (in H₂O)

Man kann auch andere Standardgewebekulturmedien zusammen mit dem erfindungsgemäßen Supplement für das Zellwachstum verwenden. Die Variationen bei solchen Medien sind zahlreich. Die einzige Begrenzung besteht darin, daß man das Supplement mit einem Medium verwendet, von dem bekannt ist, daß es in Gegenwart von tierischem Serum das Wachstum beschleunigt.

Das Serum von neugeborenen Kälbern wird als Serumanteil des erfindungsgemäßen Supplements bevorzugt, weil es universeller ist als andere Tierseren. Serum von "neugeborenen" Kälbern wird von 10 Tage alten oder jüngeren Kälbern entnommen. In einigen Fällen kann das Serum von neugeborenen Kälbern durch anderes Rinderserum oder Seren von anderen Tieren, wie Pferdeserum, Rinderserum, Hühnerserum, Kaninchenserum, Schweineserum, Schafsserum oder Ziegenserum oder eine Kombination davon, ersetzt werden. Beim Wachstum von Zellinien, die normalerweise in anderen Seren als dem von neugeborenen Kälbern wachsen, kann man das andere Serum als den Serumanteil des Supplements für das Zellwachstum gemäß der Erfindung verwenden.

Es ist auf jeden Fall bevorzugt, eine Kombination von Bestandteilen in dem Supplement zu erhalten, das eine große Vielseitigkeit aufweist und für eine große Anzahl von Zellinien geeignet ist. Die Hormone und anderen Bestandteile werden daher so ausgewählt, daß, obwohl einige von ihnen nicht in allen Zellinien erforderlich sind, keines mit der Wirkung des anderen in einer anderen Zellinie interferiert.

Die Peptidhormonkomponenten bei der vorliegenden Erfindung schließen Insulin ein. Der Transportfaktor ist Transferrin, welches auch ein Peptidhormon darstellt. Die Schilddrüsenhormone sind Trÿodothyroxin und Thyroxin.

Als Wachstumsfaktoren werden vorzugsweise epidermale Wachstumsfaktoren verwendet, wie sie von der Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts, unter der Bezeichnung CR-EGF vertrieben werden. EGF wird beschrieben von Savage, C. R., und Cohen, S., J. Biol. Chem., 247, 7609-7611 (1972). Endotheliales Zellwachstumssupplement, das bei der vorliegenden Erfindung geeignet ist und endothelialen Zellwachstumsfaktor enthält, ist von Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts, unter der Bezeichnung CR-ECGS erhältlich. Dieser Wachstumsfaktor wird auch von Maciag, T., Cerundolo, J., Ilsley, S., Kelley, P. R., und Forand, R., in Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 76, 5674-5678 (1979), beschrieben.

Als Androgen kann man Testosteron, Dihydrotestosteron, Nandrolon und Oxymetholon verwenden, und das verwendete Östrogen kann Progesteron, 17-(beta)Estradiol oder Estron sein.

Das Corticoid ist vorzugsweise Hydrocortison, aber andere Materialien, wie Cortison, Dexamethason, Prednisolon und Corticosteron können gleichfalls verwendet werden. Die bevorzugten Nährmittel schließen selenige Säure, o-Phosphoryl-ethanolamid und andere Materialien, die an zellularen enzymatischen Funktionen teilnehmen, ein.

Die für die vorliegende Erfindung geeigneten anorganischen Salze umfasen all diejenigen, wie sie üblicherweise bei Gewebekulturmedien verwendet werden, z. B. Salze von Kalzium, Kupfer, Eisen, Mangan, Ammonium, Kalium, Magnesium, Natrium und Zink, in Form von Chloriden, Sulfaten oder Phosphaten, wobei diese gegebenenfalls auch hydratisiert sein können.

Übliche Aminosäureadditive zu Gewebekulturmedien, wie L-Alanin, L-Arginin HCl, L-Asparagin, L-Asparaginsäure, L-Cystein HCl · H₂O, L-Isoleuzin, L-Lysin HCl, L-Methionin, L-Phenylalanin, L-Pyrolin, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Valin, L- Glutaminsäure, L-Glyzinsäure, L-Glutamin, L-Histidin und L-Leuzin sind gleichfalls geeignet.

Zu den essentiellen Vitaminen gehören d-Biotin, D-Ca-Pantothenat, Cholinchlorid, Folsäure, Myo-inosit, Nikotinamid, Pyridoxin HCl, Riboflavin, Thiamin HCl und Vitamin B₁₂. Andere verschiedene Komponenten schließen Zucker, wie Glukose, Hypoxanthin, Linolsäure, Phenolrot, Putrescin 2 HCl, Natriumpyruvat, Thymidin, Ascorbinsäure, Calciferol, Niacin, p-Aminobenzoesäure, Pyridoxal HCl, Vitamin A, ein. Vorzugsweise verwendet man entionisiertes Wasser mit einem Widerstand von vorzugsweise mehr als 8 Mega-Ohm. Jedoch kann man jedes Wasser, wie es üblicherweise für Gewebekulturen verwendet wird, einsetzen.

Dabei bleibt festzuhalten, daß man die Komponenten in ihrer wasserlöslichen Form, z. B. in Form von Salzen, bei den Hormonen, Aminosäuren, Vitaminen und dergleichen verwenden kann.

Das erfindungsgemäße Supplement wird vorzugsweise anstelle des üblicherweise für Gewebekulturen verwendeten Serums verwendet. Vorzugsweise wird dieses Supplement in Mengen von etwa 1 bis 25 Vol.-% der Gesamtlösung eines üblichen Gewebekulturmediums, wie beispielsweise Ham's F12 oder Eagle's Medium, verwendet, und zwar beispielsweise in einem Anteil von 1 : 99 bis 1 : 4. Wenn darum das Tierserum Kalbsserum ist, dann beträgt das Niveau an Kalbsserum vorzugsweise 0,25 bis 6,25 Vol.-%, bezogen auf das gesamte Gewebekulturmedium. Damit ist das Niveau des erfindungsgemäßen Serums niedrig genug, um jede merkliche Zugabe von toxischen Faktoren zu vermeiden, es verhindert, daß durch Veränderung der Serumkonsistenz irgendeine Wirkung erfolgt und stellt die gewünschten Materialien für das Zellwachstum zur Verfügung, ohne daß man das vollständig auf Protein aufgebaute Material verwenden muß.

Bei einer bevorzugten Formulierung gemäß der Erfindung wird das Zellwachstumsmediumsupplement in der nachfolgenden Weise formuliert, wobei diese Ausführungsform das bevorzugte Universalserum-Ersatzmittel gemäß der Erfindung darstellt.

Formulierung 1

Die bevorzugte Formulierung kann man in einem Ansatz oder in kleineren Mengen, z. B. in einer Menge von 1 l, herstellen, wobei man die Mengenangaben gemäß der vorliegenden Formulierung 1 dann in den entsprechenden Anteilen anwendet.

Obwohl die vorgenannte spezielle Formulierung bevorzugt wird, sind Veränderungen möglich. Wie schon dargelegt, kann man andere Tierseren anstelle des Serums eines neugeborenen Kalbes verwenden. Die obige Formulierung kann überall dort verwendet werden, wo man bisher Rinderserum als Supplement für übliche Gewebekulturmedien verwendet hat. Man kann 0,1 bis 40 Vol.-% der obigen Formulierung zu einem normalen Gewebekulturmedium für eine große Anzahl von Zellinien zugeben, die sonst mit einer gleichvolumigen Zugabe eines tierischen Serums gezüchtet worden wären. Die Wachstumsbedingungen für diese Zellen sind im wesentlichen die gleichen wie die, die man anwendet, wenn tierisches Serum allein als Supplement verwendet wird.

Man wendet übliche Gewebekulturbedingungen an, wenn man das erfindungsgemäße Supplement mit Gewebekulturmedium vermischt und die Mischung dann zum Wachstum von Zellen in Gewebekulturen verwendet. Beispielsweise kann man übliche Wachstumstemperaturen zwischen 30 und 38°C anwenden. Die Zeiträume für das Zellwachstum können erheblich variieren und liegen im allgemeinen bei 6 Stunden oder darüber. Die Art der Zellkultur kann irgendeine der normalen Typen sein, einschließlich einer Suspensionskultur, einem Zellwachstum an einem befestigten Substrat, einem Zellwachstum an Mikroträgerkügelchen, einem Wachstum in Weichagar, einem Zellwachstum mit Kollagen oder mit anderen Biomatrixträgern.

Roll-, Schüttel- oder stationäre Suspensionskulturmethoden können angewendet werden. Das mit dem erfindungsgemäßen Supplement ergänzte Medium wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,8 für ein maximales Zellwachstum gehalten. Normalerweise puffern in üblichen Medien, wie F12, oder modifiziertem Eagle's Medium tierisches Zellgewebewachstumsmedium auf einen pH im physiologischen Bereich. Die Gasatmosphäre oberhalb des Wachstumsgemisches gemäß der Erfindung kann die übliche sein, wie sie für die jeweils zu kultivierende Zellinie verwendet wird. So kann man eine Kohlendioxidatmosphäre von 0 bis 15% oder eine Mischgasatmosphäre aus Sauerstoff, Stickstoff, Kohlendioxid und Luft verwenden.

Bevorzugte Veränderungen in der vorher angegebenen bevorzugten Supplementformulierung sind möglich und werden nachfolgend aufgelistet:

Die übrigen Komponenten, welches die üblichen Additive für Gewebekulturmedien sind, können in einem größeren Maße ergänzt oder ersetzt werden als die oben aufgelisteten Komponenten. Diese üblichen Komponenten sind diejenigen, wie sie in der Formulierung 1 unter anorganischen Salzen, Aminosäuren, Vitaminen und den übrigen Komponenten aufgelistet wurden.

Die Menge jeder dieser Komponenten kann außerhalb der bevorzugten Bereiche unter Berücksichtigung von gewissen Zellinien variiert werden.

Beim Formulieren des erfindungsgemäßen bevorzugten Supplements für ein Zellwachstumsmedium werden die Materialien in üblicher Weise vermischt. Es wird jedoch bevorzugt, daß man die Materialien nach dem Vermischen filtriert, um dadurch eine Endsterilisation zu bewirken.

Eine bevorzugte Methode zur Herstellung der bevorzugten Formulierung 1 wird im nachfolgenden Beispiel 1 gezeigt.

Beispiel 1

Ein erfindungsgemäßes Supplement für ein Zellwachstumsmedium wird in den in der Formulierung 1 angegebenen Mengen aus den dort angegebenen Komponenten wie folgt formuliert:

(1) Gefrorenes Serum von einem neugeborenen Kalb wird aufgetaut und auf 37°C erwärmt, um die Löslichkeit des in der Kälte unlöslichen Globulins sicherzustellen.
(2) Anorganische Salze, Aminosäuren, Vitamine und die übrigen Komponenten werden in entionisiertem destilliertem Wasser bei einer Temperatur im Bereich von 31 bis 35°C unter Ausbildung einer Lösung aufgelöst.
(3) Ein aliquoter Teil (ungefähr 25%) der Lösung von Stufe (2) wird zum Solubilisieren der übrigen Komponente abgezogen. Zu diesem Aliquot wird das Serum eines neugeborenen Kalbes bis zu einer Endkonzentration von 2 Vol.-% gegeben.

(4) Vorratslösungen der folgenden Komponenten werden unter Verwendung von destilliertem, entionisiertem Wasser hergestellt:

Rinderinsulin\|25 g/l
Transferrin	25 g/l
EGF, Rezeptorgrad	10 mg/l
ECGS	1,5 g/l
Selenige Säure	16,12 mg/l
o-Phosphoryl-ethanolamin in Natriumhydroxid	56,44 g/l
(Trÿodothyroxin	168,25 µg/l
und in absolutem Ethanol: @	Hydrocortison	4,12 mg/l
Estradiol 17	3,41 mg/l
Progesteron	3,93 mg/l
Testosteron	3,61 mg/l

(5) Die richtige Volumenmenge der jeweiligen Vorratslösung wird langsam unter konstantem Rühren zu der Lösung von Stufe (2) in der folgenden Reihenfolge gegeben: Insulin, Transferrin, EGF, ECGS, selenige Säure, o-Phosphoryl-ethanolamin, Trÿodothyroxin werden zunächst mit einem geringen Volumen der Lösung von Stufe (2) verdünnt, bevor man sie zu der Endformulierung gibt. In gleicher Weise werden Hydrocortison, Estradiol, Progesteron und Testosteron in der Lösung von Stufe (2) verdünnt, bevor man sie zur Endformulierung gibt.
(6) Das auf 37°C erwärmte Serum eines neugeborenen Kalbs wird langsam unter Rühren zugegeben.
(7) Der End-pH der Formulierung liegt im Bereich von 7,2 bis 8,0 und hat eine Osmolarität von 330 bis 350 Milliosmolen.
(8) Die fertige Lösung wird zweifach filtriert durch ein 0,2-µm-Filter, wodurch man ein steriles Endprodukt erhält mit der Zusammensetzung der Formulierung 1.

In den speziellen Beispielen, in welchen die Verwendung des bevorzugten Universalserumsupplements der ersten Formulierung gezeigt wird, wurden die verschiedenen Zellinien wie folgt kultiviert.

Beispiel 2

Das Wachstumsmediumsupplement von Formulierung 1 wird zum Wachstum von BHK-21-Zellen American Type Culture Collection, Rockville, MD ATCC Nr. CCL-10 (Babyhamster-Nierenzellen), verwendet. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) in einem Volumen von jeweils 5 ml, wird in einem ersten Satz von 60-mm- Petrischalen mit 10%igem Kalbsserum ergänzt. Die Zellen läßt man während 6 Tagen bei 37°C in einer angefeuchteten 5% CO₂-95% Luft-Umgebung wachsen.

In einem zweiten Satz von 60-mm-Petrischalen läßt man BHK-21-Zellen unter den gleichen Bedingungen in DMEM, ergänzt mit 10% des Wachstumssupplements der Formulierung 1 gemäß der Erfindung, wachsen.

Die ersten und zweiten Ansätze bestehen aus mehreren Petrischalen, in denen sich jeweils Lots A, B und C des Supplements und Lots A, B und C des Kalbsserum- modifizierten Mediums befinden. Nach 3 Tagen und nach etwa 5 Tagen werden die mit Supplement versehenen Medien (Formulierung 1) und die Medien mit den Seren in den einzelnen Petrischalen jeweils mit frischen Vorratslösungen versehen.

Die Eignungsfähigkeit, daß das erfindungsgemäße Supplement bei BHK-21-Zellenwachstum verwendbar ist, wird in der grafischen Darstellung der Fig. 1 gezeigt. Die BHK-21-Erzeugungszeit in dem Zellwachstumsmediumsupplement gemäß der Erfindung beträgt 13,1 Stunden im Vergleich zu 16,5 Stunden bei einem Medium, das mit 10%igem Kalbsserum supplementiert ist. Die Zellerzeugungszeit oder die Zellverdopplungszeit verwendet man, um die Wachstumsrate oder die Verdoppelungsrate der Zellpopulation zu messen. Die Zellerzeugungszeit ist somit eine quantitative Messung der Wachstumsbeschleunigungsfähigkeit des Gewebekulturmediumsupplements. Die Zelldichte beträgt am sechsten Tag 2,23×10⁵ Zellen pro cm² in dem 10%igen Zellwachstumssupplement der Formulierung 1 in DMEM und 1,59×15⁵ Zellen pro cm² in 10%igem Kalbsserum in DMEM.

Dies zeigt, daß die Formulierung 1 ein im wesentlichen universelles Zellwachstumssupplement für die Zugabe zu einem Gewebekulturmedium darstellt.

Andere Zellen, die mit positivem Ergebnissen unter Verwendung der Formulierung 1 als Supplement gemäß der Erfindung gezüchtet wurden, sind die folgenden:

A431 - humans epidermoides Adenocarcinom
BALB 3T3 - Mäuseembryofibroblast
C6 - Rattenglioma
CV-1 - afrikanische Grünaffen-Niere
entothelial (nicht-transformiert) - Mäuse-aortisch endothelial
F9 - Mäuseembryocarcinom
FS-1230 - humane diploide Fibroblasten
HeLa - humanes Cervicalcarcinom
Hybridoma Sp-2 - Mäuse-Myeloma Parent - fortgesetzte Antikörper-Produktion
Hybridoma - NS-1 Parent Mäuse-Myeloma
KB - humanes orales epidermoides Carcinom
L6 - Rattenskelett-Muskelmyoblast
MCF-7 - humanes Brustcarcinom
Mäusesarcom
Myoblastoid (nicht-transformiert) - Murine
SV403T3 - SV40 Virus-transformiertes BALB C 3T3
TR-M Ratten-testikularer Tumor
TR-ST Ratten-testikularer Tumor
TM-4 Mäuse Sertoli
TR-1 Ratten-testikulare Zellen (nicht-transformiert)
VERO - afrikanische Grünaffen-Niere
WI-38 - humanes diploides Fibroblast
MRC-5 - humanes diploides Fibroblast
OMTW9PL - Ratten-Mammatumor - 6 unabhängige Clone
Primärkulturen von Human-Fibroblasten
Primärkulturen von Human-Tumor-Biopsie-Proben

Obwohl einige Zellinien, wie Rattenembryo-Fibroblast- Zellen, gewöhnlich nicht in dem Zellwachstumsmedium der Erfindung wachsen, stellt dies dennoch ein universelles Supplement dar, das das Wachstum einer großen Vielzahl von Kulturzellen beschleunigt.

"Wachsen" bedeutet gemäß der vorliegenden Anmeldung die Proliferation einer Zellmultiplikation zu höheren Dichten in einem Medium, wobei das Wachstum auf einem festen Träger oder frei in einer Suspension abläuft. Verwendet man das erfindungsgemäße Supplement in einem üblichen Medium der oben beschriebenen Art, wobei der Anteil ganz breite 0,1 bis 40% Zellwachstumsmediumsupplement gemäß der Erfindung zu 99,9 bis 60% Medium und vorzugsweise 1 bis 25 Vol-.% des erfindungsgemäßen Supplements zu 99 bis 75 Vol.-% des üblichen Mediums beträgt, so wird das Zellwachstum einer Vielzahl von Zellinien beschleunigt. Das erfindungsgemäße Supplement kann während langer Zeiträume ohne wesentlichen Aktivitätsverlust gelagert werden. Beispielsweise kann man das Supplement bei -20°C einfrieren. Das Supplement ist bei einer Temperatur von 4°C wenigstens 4 Wochen stabil. Selbst nach dem Vermischen mit üblichen Medien behält das Supplement die zellwachstumsbeschleunigende Aktivität während langer Zeiträume bei. Obwohl das Supplement als eine getrennte Lösung, die man zu einem üblichen Medium hinzugibt, beschrieben wurde, sollte doch klar sein, daß die Supplementformulierung selbst direkt in einem üblichen Medium durch Zugabe von Anteilen dazu formuliert werden kann. In allen Fällen wird es bevorzugt, das verwendete Serum in einer letzten Stufe zuzugeben, nachdem man wenigstens einen Teil des Serums in einem Aliquot einer Mischung aus anorganischen Salzen, Aminosäuren, Vitaminen und verschiedenen anderen Verbindungen solubilisiert hat.

Claims

1. Supplement, dadurch gekennzeichnet, daß das Supplement im wesentlichen aus einer geringeren Menge eines Tierserums und einer größeren Menge einer Mischung von Peptid- und Schilddrüsenhormonen, Östrogenen, Androgenen, Corticoiden, Nährmitteln, Wachstumsfaktoren, Transportfaktoren, anorganischen Salzen, Aminosäuren, Vitaminen, Zucker und geringeren Mengen an anderen Bestandteilen besteht.

2. Supplement gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Tierseren, Hormone, Östrogene, Androgene, Corticoide, Wachstumsfaktoren, Nährmittel und Transportfaktoren im wesentlichen aus Säugetierseren, Insulin, Transferrin, EGF, ECGS, seleniger Säure, o-Phosphoryl-ethanolamin, Trÿodothyroxin, Hydrocortison, Estradiol 17, Progesteron und Testosteron bestehen.

3. Supplement gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum Rinderserum ist.

4. Supplement gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten in dem Supplement in den folgenden Mengen angewendet werden:

5. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 1, bestehend im wesentlichen aus: einer kleineren Menge Tierserum und einer größeren Menge einer Mischung aus Peptid- und Schilddrüsenhormonen, Östrogenen, Androgenen, Corticoiden, Nährmitteln, Wachstumsfaktoren, Transportfaktoren, anorganischen Salzen, Aminosäuren, Vitaminen, Zucker und geringeren Mengen an anderen Komponenten, für ein Zellwachstumsmedium zur Unterstützung des Wachstums einer großen Anzahl unterschiedlicher Zelltypen einschließlich transformierter und nicht-transformierter Primärzellen von sowohl fibroblastoidem und epithelioidem Ursprung und transformierter und nicht-transformierter kontinuierlicher Zellinien.

6. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Tierserum, die Hormone, Östrogene, Androgene, Corticoide, der Wachstumsfaktor, die Nährmittel und der Transportfaktor im wesentlichen aus Rinderserum, Insulin, Transferrin, EGF, ECGS, seleniger Säure, o-Phosphoryl-ethanolamin, Trÿodothyroxin, Hydrocortison, Estradiol 17, Progesteron und Testosteron bestehen.

7. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Tierserum das Serum eines neugeborenen Kalbes ist.

8. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 5 bestehend im wesentlichen aus:

9. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Tierserum das Serum eines neugeborenen Kalbes in einer Menge von 5 bis 25 Vol.-% ist.

10. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum des neugeborenen Kalbes in einer Menge von 25% verwendet wird.

11. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung, enthaltend 99,9 bis 60 Vol.-%

(a) Zellkulturmedium mit allen für das Wachstum von tierischen Zellen in Kombination mit einem Tierserum erforderlichen Wachstumskomponenten, und
(b) 0,1 bis 40 Vol.-% des Supplements, bestehend im wesentlichen aus einer geringeren Menge eines Tierserums und einer größeren Menge einer Mischung von Peptid- und Thyroidhormonen, Östrogenen, Androgenen, Corticoiden, Nährmitteln, Wachstumsfaktoren, Transportfaktoren, anorganischen Salzen, Aminosäuren, Vitaminen, Zucker und geringen Mengen an anderen Komponenten.

12. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 11 zur Herstellung einer Zusammensetzung, worin das Tierserum, die Hormone, Östrogene, Androgene, Corticoide, Wachstumsfaktoren und der Transportfaktor im wesentlichen aus Säugetierserum, Insulin, Transferrin, EGF, ECGS, seleniger Säure, o-Phosphoryl-ethanolamin, Trÿodothyroxin, Hydrocortison, Estradiol 17, Progesteron und Testosteron bestehen.

13. Verwendung des Supplements gemäß Anspruch 11 zur Herstellung einer Zusammensetzung, worin das Serum das Serum eines neugeborenen Kalbes ist.

14. Verwendung des Suplements gemäß Anspruch 11 zur Herstellung einer Zusammensetzung, worin das Supplement die folgende Formulierung hat:

15. Verfahren zur Herstellung eines Supplements gemäß Anspruch 1, bei dem ein Teil aus Tierserum besteht, gekennzeichnet durch folgende Stufen:
Solubilisieren eines Teils des Tierserums in einem Teil des Supplements, weiterem Vermischen der Komponenten des Supplements und als im wesentlichen letzte Stufe Zugabe des Restes zu dem Tierserum, und
Filtrieren des Supplements unter Ausbildung eines sterilisierten Supplements.