JPS5974982A - 細胞をインビトロで生長させるための細胞生長培地補足剤およびそのための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 動物血清及び特に胎児の子牛血清は普通の組織培地への
補足剤として知られている。たとえば、牛血清をハム（
Ｈａｍ）Ｆ１２、ダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）部分修
正イーグル培地等のような標準組織生長培地中で動物細
胞の組織、培養に２０容量％、しばしば１０容量％まで
添加することが知られている。

該血清は仮にも公知の補足剤では容易に与えられない、
組織培養のための数種類の必須物質を与えるように思わ
れる。生育培地への補足剤として動物血清を使用するこ
とは、細胞が分化機能を示し、所望の濃度まで増大し、
かつ長時間の生長及び生存力を維持するのをしばしば促
進するものである。

しかしながら、動物血清の使用には組織培養における若
干の問題点が存在し得る。それらの問題点の中の主なも
のは血清の組成における変動性である。例えば、血清の
個々のロットの生長促進能は非常に大きく変動し得るも
のである。動物血清の製造業者は、多数の動物からの血
清をプールすること及び公知数量の動物の供与獣群を維
持すること及び（又は）ホルモン、生育因子及び他の血
油成分のレベルをスクリーニング又は検定することによ
って、このような変動を最小限度に押えることを試みて
いる。しかしながら、このような試みは費用のかかるも
のであり、又変動性の問題を軽減するのに常に効果的で
あるとは限らない。これらの問題はユーザーによる使用
を制限し、かつ調査結果の変動をもたらす。しばしばユ
ーザーは時間と金のかかる使用に先立って血清の広範囲
にわたる試験を行わなければならない。牛血清の量的な
利用価値も牛肉産業の景気不景気に左右されるので問題
である。例えば、胎児の子牛血清及び他の牛血清は副製
品としての利用価値を有し、かつ周期的に変動する獣群
の大きさに関連している。

こうして、標準生長培地への補足剤としての動物血清の
使用が欠点を有するものであることが認識された。他方
、組織培養において使用される血清の量を減らすか又は
血清を全く使用しない試みもなされた。血清を含有しな
い生長培地が設計されたが、これは特定の型の細胞に特
有のものである。

同様に、特定の細胞系のために設計された他の補足剤に
おける生長因子の添加に伴って通常添加される血清の量
も減少ぜしめられた。こうして、過去、標準組織生長に
おいて血清量はカットされるか又は排除されたが、この
ようなことは特定の型の細胞に関連していた。すなわち
、先行技術は繊維芽細胞様及び上皮様起始の変換した及
び変換していない原始細胞、並びに変換した及び変換し
ていない継続細胞計を含有する広範囲に異なる型の細胞
と共に使用するために産業上受け入れられる、組織培養
のための実質上普遍的な補足剤を提供し得なかったので
ある。

（発明の概要） 本発明の目的は、動物血管を含有する死亡生長填地補足
剤、及び補足剤が培地中で細胞の生長を促進するのに有
効である動物血清成分のための基質の組合せを提供する
ことにある。

本発明の別の目的は、その細胞が非常に広範囲の型の細
胞から選択され得る種々の培地中でこ細胞生長と関連し
て所望の使用量における実質上不変の特性を有して製造
され得る、前記目的に従つた細胞生長倍地補足剤を提供
することにある。

本発明の他の目的は、細胞生長に使用するための通常の
培地と組み合わせて、前記目的に従った細胞生長倍地補
足剤を提供することにある。

本発明のほかの目的は、本発明の細胞生長倍地補足剤を
製造かつ使用する有利な方法を提供することにある。

本発明によれば、細胞生長培補足剤は、原始及び繊維細
胞培養系、すなわち繊維芽細胞様細胞及び上皮様細胞か
らの変換した及び変換していない細胞系において非常に
広範囲の細胞系の急速かつ豊かな生長を可能にする、水
性塩基中の、チロイド及びペプチドホルモン、コルチコ
イド、アンドロゲン、エストロゲン、生長因子、栄養及
び輸送因子、無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖から選択
される大量成分に加えて動物血清、好ましくは新生子牛
血清の少量成分、及び他の微量成分から成る。

好ましい態様において、用いられる血清は新生子牛血清
であり、ペプチドホルモンはインシュリンであり、輸送
因子はトランスフェリンであり、生便因子は表皮生得因
子及び内皮細胞生長補足剤であり、一方栄養因子はセレ
ン酸及びＯ−ホスホリル−エタノールアミンを含有し、
チロイド（甲状腺）ホルモンはトリヨードチロキシンで
あり、コルチコイドはヒドロコルデシンであり、エスト
ロゲンはエストラジオール１７、プロゲステロンであり
、アンドロゲンはテストステロンである。

好ましくは、本発明の補足剤は調合され、完全に混合さ
れ、濾過工程が該混合物を滅菌するために使用される。

濾過は好ましくは補足剤の調合の量後の工程として行わ
れる。補足剤がロットからロットへの血清組織の変動と
関連した問題を減少するか又は除去し得ることか本発明
の１つの特徴である。使用される少量の血清は実質的な
影響なしに変えることができる。というのは血清はわず
かな量、しばしば普通に用いられる量よりも１／４又は
それ以下の組織培養成分にすきないからである。

驚くべきことに、たとえわずかな量の血清が使用されろ
としても、血清は例えば細胞結合印し及び水不溶性物質
のための担体蛋白質のような普遍的な組織生長培地のた
めに必要な成分を与えるのである、少量の血清ベースの
添加は細胞増殖のための他の因子を与える。血清の量が
少ないために、血清中に通常含有されている有毒物質の
レベルは減少する。最終細胞培養中の蛋白質レベルは血
清単独の使用によって減少するので、最終産物からの蛋
白質の分離は容易になる。倍地中で生長した細胞産物の
濃度は、本発明の補足剤が生長を強化するために用いら
れたときに増大せしめることができる。同様に、細胞生
長倍地の前蛋白質含量の減少は所望の細胞産物の回収及
び精製の効率及び容易性を高めることができる。このこ
とは製薬及びワクチン工業において非常に重要である。

一定の産物の再現性は本発明の補足剤中で高められる。

このことは全動物血清の種々のロットにおいて通常観察
される生長促進の変動性を排除することができ、かつ望
ましいロットを見い出すために多数のロットの血清を試
験ずろ必要性を排除することができる。組織培養設備の
全般にわたる操作における費用と時間の減少を獲得する
ことができる。

（好ましい態様の説明） 本発明の細胞生長倍地促進剤は細胞及び組織培養におい
て動物血清の代りに用いられる。通常、動物血清は標準
組織培地の５〜２０容量％の量で細胞培養中に使用され
る、しかし本発明の細胞生長培地補足剤を標準組織培地
の１〜２５容量％の量で用いることが好ましい。限定さ
れた細胞系において、標準倍地に対する高割合又は低割
合の補足剤が例えは９９．９％〜６０％の標準培地に対
て０．１％〜４０％の補足剤のように使用することがで
きる。血清のみと一緒に先に使用された本発明の補足剤
と併用するのに適したそのような標準組織培地は限定さ
れる訳ではないが、次の成分を含有する。

ＭｃＧｏｙ’ｓ５ａ培地 ＭｃＣｏｙ’Ｔ．Ａ，Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｍ．及びＫｒｕ
ｓｅ，Ｐ．Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐｅｒ．Ｂｉ
ｏｌ．ａｎｄ　Ｍｅｄ．，１００，１１５−１１８（１
９５９）．最小必須培地−ＭＥＭ Ｅａｇｌｅ，ｈ，Ｓｅｉｅｎｃｅ　１３０，４３２（１
９５９）部分修正イーグル培地 Ｄａｎｉｅｌ，Ｍ，Ｄ．及びＭｅｌｅｎｄｅｚ，Ｌ．Ｖ
．、Ｐｒｏｃ。

ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃ．ｆｏｒ　Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ，ａ
ｎｄ　Ｍｅｄ．１２７，Ｎｏ３（１９６９） ダルベコ部分修正イーグル培地 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．及びＦｒｅｅｍａｎ，Ｇ．ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ８．３９６（１９５９） Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．，Ｖｏｇ
ｔ，Ｍ、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１２，１８５−１９６（１９６８） 組織培養基準委員会，Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　６，Ｎｏ２，
９３Ｌ−１５（ライボビツツ）培地 Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ａ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ７８．１
７３−１８０（１９６３） 栄養素混合物−Ｆ−１０及びＦ−１２培地Ｈａｍ，Ｒ．
Ｇ．，Ｅｘ．Ｃｅｌｌ　Ｒｓｅ．２９．５１５−５２６
（１９６３） Ｈａｍ，Ｒ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．５３，２８８−２９３（１９６５） ウェイマウス培地 Ｗａｙｍｏｕｔｈ，Ｃ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ　
Ｉｎｓｔ．２２，１００３−１０１７（１９５９） このような培地の水性調合物の例は次のとおりである。

ハムの栄養培地Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓから入手可能） 成　　　　分　　　　　　　　　ｍｇ／Ｌ　　　無機塩
： ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　４４．００ＣｕＳＯ４
・５Ｈ２Ｏ８　　　　　０．００２４９ＦｅＳＯ４・７
Ｈ２Ｏ　　　　　　０．８３４ＫＣｌ　　　　　　　　
　　　２２３．６０ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　１２
２．００ＮａＣｌ　　　　　　　　　７５９９．００Ｎ
Ａ２ＨＣＯ３　　　　　　１１７６．００Ｎａ２ＨＰＯ
４・７Ｈ２Ｏ　　２６８．００ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏｂ
　　　　　０．８６３他の成分： Ｄ−グルコース　　　　　　　　１８０２．００ヒポキ
サンチン　　　　　　　　　　　４．１０リーノール酸
　　　　　　　　　　　　０．０８４リポ酸　　　　　
　　　　　　　　　　０．２１フエノール赤　　　　　
　　　　　　　１．２０プトレッシン２ＨＣｌ　　　　
　　　　０．１６１ピルビン酸ナトリウム　　　　　　
１１０．００チミジン　　　　　　　　　　　　　　０
．７３アミノ酸： Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　　　８．９０Ｌ
−アルギニンＨＣｌ　　　　　　　　２１１．００Ｌ−
アスパラギン・Ｈ２Ｏｂ　　　　　　１５．０１Ｌ−ア
スパラギン酸　　　　　　　　　　１３．３０Ｌ−シス
ティン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ　　　　３５．１２Ｌ−グルタ
ミン酸　　　　　　　　　　　１４．７０Ｌ−グルタミ
ン　　　　　　　　　　　１４６．００グリシン　　　
　　　　　　　　　　　　　７．５０Ｌ−ヒスデシンＨ
Ｃｌ・Ｈ２Ｏ　　　　　２０．９６Ｌ−イソロイシン　
　　　　　　　　　　　３．９４Ｌ−ロイシン　　　　
　　　　　　　　　１３．１０Ｌ−リジンＨＣｌ　　　
　　　　　　　　３６．５０Ｌ−メチオニン　　　　　
　　　　　　　　４．４８Ｌ−フェニルアラニン　　　
　　　　　　　４．９６Ｌ−プロリン　　　　　　　　
　　　　　３４．５０Ｌ−セリン　　　　　　　　　　
　　　　１０．５０Ｌ−スレオニン　　　　　　　　　
　　　１１．９０Ｌ−トリプトファン　　　　　　　　
　　　２．０４Ｌ−チロシン　　　　　　　　　　　　
　　５．４０Ｌ−バリン　　　　　　　　　　　　　　
１１．７０ビタミン： ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
０７３Ｄ−パントテン酸カルシウムｂ　　　　　　　　
０．４８００塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　
　　１３．９６００葉酸　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１．３０００ｉ−イノシトール　　　　　
　　　　　　　　１８．０００ナイアミンアミド　　　
　　　　　　　　　　　０．０３７０ピリドキシンＨＣ
ｌ　　　　　　　　　　　　　０．０６２０リボフラビ
ン　　　　　　　　　　　　　　　　０．０３８０チア
ミンナＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　０．３４０
０ビタミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　　　１．
３６００ダルベコ部分修正イーグル培地（水中）成分　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍｇ／Ｌ無
機塩： ＣａＣｌ２（無水）　　　　　　　　　　　　　２００
．００Ｆｅ（Ｎｏ３）３・９Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　
　　０．１０ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４００．００ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　
　　　　　　２００．００ＮａＣｌ　　　　　　　　　
　　　　　　　　６４００．００ＮａＨＣＯ３　　　　
　　　　　　　　　　　３７００．００ＮＡ２ＨＰＯ４
・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　１２５．００ａ他の成
分： Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　　１０００．
００フエノール赤　　　　　　　　　　　　　　　　１
５．００ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　
１１０．００アミノ酸： Ｌ−アルギニンＨＣｌ　　　　　　　　　　　８４．０
０Ｌ−シスチン　　　　　　　　　　　　　　　４８．
００Ｌ−グルタミン　　　　　　　　　　　　　５８４
．００グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　３
０．００Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ　　　　　　　
４２．００Ｌ−イソロイシン　　　　　　　　　　　　
１０５．００Ｌ−ロイシン　　　　　　　　　　　　　
　１０５．００Ｌ−リジンＨＣｌ　　　　　　　　　　
　　１４６．００Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　　
　　　　３０．００Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　
　　　　　６６．００Ｌ−セリン　　　　　　　　　　
　　　　　　４２．００Ｌ−スレオニン　　　　　　　
　　　　　　９５．００Ｌ−トリプトファン　　　　　
　　　　　　１６．００Ｌ−チロシン　　　　　　　　
　　　　　　７２．００Ｌ−バリア　　　　　　　　　
　　　　　　９４．００ビタミン： Ｄ−パントテン酸カルシウム　　　　　　　　４．００
塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　　　４．００
葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．００
ミオ−イノシトール　　　　　　　　　　　　７．２０
ニコチンアミド　　　　　　　　　　　　　　４．００
ピリドキサールＨＣｌ　　　　　　　　　　　４．００
リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　０．４０
チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　４．００
ビタミンＢ１２ 上記の数値（ａ）は組織培養基準委員会、ＩｎＶｉｔｒ
ｏ，９，Ｎｏ６（１９７０）と一致している。

他の標準組織培地が細胞を生長させる本発明の補足剤に
加えて一緒に使用することができる。そのような培地に
は非猟に多くの種類がある。唯１つの制約事項は動物血
清の存在丁に生長を促進させることの知られた培地と一
緒に該補足剤を使用することである。

本発明の補足剤の血清部分としては新生子牛血清が好ま
しい。なぜなら、それは他の動物血清と比べてより普遍
性を有するからである。′新生’子牛血清は牛後１０日
目又はそれ以前の子牛から得られる。ある場合には、新
生子牛血清は他の牛血清又は他の動物血清、例えば馬血
清、牛血清、鶏血清、うさぎ血清、豚血清、羊面濱、又
は山羊血清又はそれらの組合せ血清で置換することがで
きる。新生子牛血清よりも他の血清中で正常に生長する
細胞系を生長させる場合には、他の面情は本発明の細胞
生長補足材の血清部分として用いることができる。

すべての場合において、高度の万能性を有し、かつ細胞
系の大きな多様性に関して有効である該補足剤中の成分
の適当な組合せを得ることが好ましい。したがって、ホ
ルモン及び他の成分は、その中のいくつかはすべての細
胞系での使用を要しないかも知れないが、どれもすべて
の細胞系中の他の成分の作用を妨げないというような基
準で選択される。

本発明のペプチドホルモン成分はインシュリンを含むこ
とができる。輸送因子は同様にペプチドホルモンである
ところのトランスフェリンである。

甲状腺ホルモンはトリヨードチロキシン及びチロキシン
である。

使用される生長因子は好ましくは表皮生長因子であり、
これはＣＲ−ＥＧＦという商品名でマサチュセッツ州ウ
オルサムのコラボラテイブ　リサーチ社によって市販さ
れている。このようなＥＧＦはＳａｖａｇｅ，Ｃ．Ｒ．
及びＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４
７，７６０９−７６１１（１９７２）の文献に記載され
ている。内皮細胞生長因子を含有する、本発明において
有用な内皮細胞生長補足剤はＣＲ−ＥＣＧＳという商品
名で同じくコラポラティブリサーチ社から入手すること
ができる。この生長因子はさらにＭａｃｉａｇ，Ｔ．，
Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，Ｊ．，Ｉｌｓｌｅｙ，Ｓ．，Ｋｅ
ｌｌｅｙ，Ｐ．Ｒ．，及びＦｏｒａｎｄ，Ｒ．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６．５６７４
−５６７８（１９７９）の文献に記載されている。

使用されるアンドロゲンはテストステロン、ジヒドロテ
ストステロン、ナンドロロン及びオキシメトロンであり
、使用されるエストロゲンはプロゲステロン、１７（ベ
ータ）エストラジオール、エストロンである。

コルチコイドは好ましくはヒドロコルチゾンであるが、
しかし他の物質、例えばコルチゾン、デキサメタゾン、
プレドニゾロン及びコルチコステロンも使用することか
できる。栄養素は好ましくは亜セレン酸、Ｏ−ホスホリ
ル−エタノールアミン及び細胞内酵索作用に関与してい
る他の物質を包含する。

本発明に有用な無機塩は組織培地中に普通に用いられる
もの、例えば塩素、硫酸、リン酸等のカルシウム、銅、
鉄、マンガン、アンモニア、カリウム、マグネシウム、
ナトリウム、亜鉛基等であり、その中のいくつかは水和
されていてもよい。

組織培地に対する信用のアミノ酸添加剤、例えばＬ−ア
ラニン、Ｌ−アルギニンＨＣｌ、Ｌ−アスパラギン、Ｌ
−アスパラギン酸、Ｌ−システインＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、Ｌ
−イソロイシン、Ｌ−リジンＨＣｌ、Ｌ−メチオニン、
Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ
−バリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グリシン、Ｌ−グル
タミン、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−ロイシンも同様に有効
である。

必須ビタミンはｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸カルシ
ウム、塩化コリン、葉酸、ミオ−イノシトール、ニコチ
ンアミド、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミ
ンＨＣｌ及びビタミンＢ１２を包含する。他の種々雑多
な成分はグルコースのような糖、ヒボキサンチン、リノ
ール酸、フェノーノ赤、プトレッシン２ＨＣｌ、ピルビ
ン酸ナトリウム、チミジン、アスコルビン酸、カルシフ
ェロール、ナイアシン、パラ−アミノ安息香酸、ピリド
キサールＨＣｌ、ビタミンＡを包含する。好ましくは８
メガオームより大きい好ましい抵抗率を有する脱イオン
した蒸留水が使用される。しかし、組織培養中に普通に
用いられる水ならどのような水でも用いることができる
。

上記成分ばそれらの水溶性の形、例えばホルモン、アミ
ノ酸、ビタミン等の塩の形で使用することができること
を理開すべきである。

本発明の補足剤は好ましくは組織培養中に普通に用いら
れるような血清の代りに使用することができる。したが
って、好ましくは該補足剤は慣用の組織培地の全溶液の
１〜２５容量％の量で用いることができ、例えばハムＦ
１２又はイーグル培地中で例えば１：９９〜１：４の割
合で用いることができる。それ故、子牛血清のレベルは
、動物血清が子牛血清である場合には、好ましくは全組
絨培地の０．２５〜６．２５容量％のレベルである。

したがって、本発明におりる血清のこのようなレベルは
有毒な因子のいかなる実質的な添加をも避けるのに十分
な低さであり、何らかの影響力を有する血清コンシスチ
ンシーの変動を減少させ、かつ完全に蛋白質をベースと
した物質以外の、細胞生長に必要な物質を与えるもので
ある。

本発明の好ましい調合物において、細胞生長培地補足剤
は以下のとおりに調合され、かつ本発明の好ましい普遍
的な血清置換物であると考えられる。

調合物１ 成分　　　　　　　　　　　　　濃度 新生子牛血清　　　　　　　補足剤の２５容量％　　　
　　　　　　　　　　　　ｍｇ／ｌインシュリン　　　
　　　　　　　　　　　２５トランスフエリン　　　　
　　　　　　　　　５０ＥＧＦ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５ＥＣＧＳ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　７７．５亜セレン酸　　　　　　　　　
　　　　　　　０．１６１２０−ホスホリル−エタノー
ルアミン　　　　５６４４Ｌ−３，４，３’トリヨード
チロキシン　　　１．６８３Ｘ１０−４ヒドロコルチゾ
ン　　　　　　　　　４．３３Ｘ１０−３エストラジオ
ール１７　　　　　　　３．４１Ｘ１０−３プロゲステ
ロン　　　　　　　　　　３．９３Ｘ１０−３テストス
テロン　　　　　　　　　　３．６１Ｘ１０−３無機塩
　　　　　　　　　　　　　ｍｇ／ｌＣａＣｌ２　　　
　　　　　　　　　　　　２３．２４ＣｕＳＯ４・５Ｈ
２Ｏ　　　　　　　　　　　０．００１７４ＦｅＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　０．５８ＫＣｌ　　
　　　　　　　　　　　　　　１５６．５６ＭｇＣｌ２
・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　８５．４０ＮａＣｌ　
　　　　　　　　　　　　５，３１９．３０Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４　　　　　　　　　　　　　９９．４０ＺｎＳＯ４
・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　０．６０アミノ酸 Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　　　　６．２４
Ｌ−アルニニンＨＣｌ　　　　　　　　　１５３．７３
Ｌ−アスパラギン　　　　　　　　　　　　１０．５０
Ｌ−アスパラギン酸　　　　　　　　　　　　９．３２
Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ２Ｏ　　　　　　１４．６７
Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　　　　　　１０．３０
グリシン　　　　　　　　　　　　　　　　　５．２６
Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ　　　　　　１４．６７
Ｌ−イソロイシン　　　　　　　　　　　　　２．７６
Ｌ−リジンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　２５．５６
Ｌ−メチメニン　　　　　　　　　　　　　　３．１３
Ｌ−フエニルアラニン　　　　　　　　　　　３．４７
Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　　　　　２４．１７
Ｌ−セリン　　　　　　　　　　　　　　　　７．３６
Ｌ−スレメニン　　　　　　　　　　　　　　８．３４
Ｌ−トリプトファン　　　　　　　　　　　　１．４３
Ｌ−チロシン　　　　　　　　　　　　　　　３．８１
Ｌ−バリン　　　　　　　　　　　　　　　　８．２０
ビタミン ｄ−ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　０．００
５１Ｄ−パントデン酔カルシウム　　　　　　　　０．
１８塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　　　９．
７７葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．
９３ミオ−イノシトール　　　　　　　　　　　１２．
６１ニコチンアミド　　　　　　　　　　　　　　０．
０２６ビリドギシンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　０
．０４３リボクラビン　　　　　　　　　　　　　　　
０．０２６チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　
　０．２４ビタミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　
　０．９５他の種々雑多な成分 グルコース　　　　　　　　　　　　１，２６１．１２
ヒポキサンチン　　　　　　　　　　　　　　２．８６
リノール酸　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５
９フエノール赤　　　　　　　　　　　　　　　０．８
７プトレツシン２ＨＣｌ　　　　　　　　　　　０．１
１ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　　７７．０
７チミジン　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５
１重炭酸ナトリウム　　　　　　　　　　１１７６１ｌ
の容量に対して８メガオームより大きい抵抗率を有する
脱イオンした蒸留水 好ましい調合物は大きなパッチ又は小さな量、例えば上
の調合物１中に記載した割合に維持されるように与えら
れた量を有する１リットルの容量に作ることができる。

このような特定の調合物が好ましいものであることが見
い出されたが、一方適当に変化させることも可能である
。上述したように、他の動物血清を新生子牛血清の代り
に使用することができる。

牛血清が上述したように補足材として細胞倍地に対して
使用される場合においても上記の特定の調合物な使用す
ることができる。例えば、上記調合物０．１〜４０容量
％を、さもなければ動物血清の等容量の添加で生長せし
められたであろう多趣類の細胞系に対する標準組織培地
に添加することができる。該細胞に対して使用される生
長条件は、動物血清単独が補足剤として用いられる場合
に使用される生長条件と実質的に同一である。

本発明の補足剤が組織培地と混合され、かつ組織培養中
で細胞を生長させるのに使用される場合は、慣用の組織
培養条件が用いられる。例えば、３０〜３８℃の慣用生
長温度を使用することができる。細胞生長の期間は通常
は６時間又はそれ以上に可成変動する。細胞培養の型は
、懸濁培養、基質付着細胞生長、ミクロキャリヤービー
ド付着細胞生長、軟質寒天中での生長、コラーゲン及び
他のバイオマトリックス支持体を用いる細胞生長を含有
するいずれかの標準量を使用することができる。ローラ
ー、シェーカー又は静止状態の懸濁培養技術を用いるこ
とができる。本発明の補足剤で補足される培地は好まし
くは最大細胞生長のために約６．５〜７．８のｐＨに維
持される。通常、Ｆ１２又は部分修正イーグル培地緩衝
液のような普通の倍地中の緩衝液は動物細胞組織生長培
地を生理学的範囲内のｐＨに維持せしめる。本発明の生
長混合物の上方の気体雰囲気は生長している特別の細胞
系に対して慣用的に使用されるものある。例えば０〜１
５％の二酸化炭素雰囲気を使用することができ、また酸
素、窒素、二酸化炭素及び空気の混合ガス雰囲気を使用
することもできる。

上記の好ましい補足剤調合物中に示された量は好ましく
は下表に示すとおり変動させることができる。

成　　　分　　　　　　　　　　　範囲新生子牛血清　
　　　　　　５〜２５容量％　　　　　　　　　　　　
　　　ｍｇ／ｌインシュリン　　　　　　　　　　　５
−１０トランスフエリン　　　　　　　　　２０−１０
０ＥＧＦ　　　　　　　　　　　　　２−１００ＥＣＧ
Ｓ　　　　　　　　　　　　２−１００亜セレン酸　　
　　　　　　　　０．０１３−０．１３Ｏ−ホスホリル
−エタノールアミン　１．４−１４０Ｌ−３，５，３’
トリヨードチロキシン　６．７３Ｘ１０−６．７３Ｘ１
０−４ヒドロコルチゾン　　　　　　　　　３．４６Ｘ
１０−４−３．４６Ｘ１０−２エストラジオール１７　
　　　　　　２．７２Ｘ１０−４−２．７２Ｘ１０−２
プロゲステロン　　　　　　　　　　３．１５Ｘ１０−
４−３．１５Ｘ１０−２テストステロン　　　　　　　
　　　２．８８Ｘ１０−４−２．８８Ｘ１０−２組織培
地への慣用添加剤である残りの成分の量は、上に表示し
た成分の場合と比べてより大きな程世まで変動させるこ
とができる。これらの残りの成分は調合物１において無
機塩、アミノ酸、ビタミン及び他の種々雑多な成分の下
方に追加的に表示されたものである。

該成分の各々の両派若干の細胞系に関しては好ましい範
囲を越えて変動することができる。

本発明による好ましい細胞生長培地補足剤の調合におい
て、原料は慣用の方法で混合される。しかし、目標の滅
菌を付与するために混合後に該原料を濾過することが好
ましい。

好ましい調合物１を作る好ましい方法は下の例１で説明
される。

例１ 調合物１中に示された成分の量を有する本発明の細胞生
長培地補足剤は次の通り調合される。

１．凍結した新生子牛血清を解凍して３７℃に温め、そ
れによって冷却した不溶性グロブリンの溶解を保証する
。

２．無機塩、アミノ酸、ビタミン及び仙他の種々雑多な
成分を３１〜３５℃の範囲の温度で脱イオンした蒸留水
に溶かして溶液をつくる。

３．第２工程における溶液のアリコート（〜２５％）を
残余成分の溶解のために除去する。このアリコートに新
生子牛血清を２容量％の最終濃度になるまで流加する。

４　次の成分から成るストック的液を、脱イオンした蒸
留水中の牛インシュリン（２５ｇ／ｌ）、トランスフェ
リン（２５ｇ／ｌ）、ＢＧＦ、レセプタ　グレート（Ｒ
ｅｃｅｐｔｏｒ　Ｇｒａｄｅ）（１０ｍｇ／ｌ）、ＥＣ
ＧＳ（１．５ｇ／ｌ）、亜セレン酸（１６．１２ｍｇ／
ｌ）、Ｏ−ホスホリルエタノールアミン（５６．４４ｇ
／ｌ）（水酸化ナトリウム中）、トリヨードチロキシン
（１６８２５μｇ／ｌ）並びに無水エタノール中のヒド
ロコルチゾン（４．１２ｍｇ／ｌ）、エストラジオール
１７（３．４１ｍｇ／ｌ）、プロゲステロン（３．９３
ｍｇ／ｌ）、テストステロン（３．６１ｍｇ／ｌ）を用
いて作る。

５　適当量の各ストック溶液を攪拌しながら第２工程の
溶液に次の順序でゆっくりと添加する。

すなわち、インシュリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、
ＥＣＧＳ、亜セレン酸、Ｏ−ホスホリルエタノールアミ
ン、トリヨードチロキシンを最終調合物への添加前に第
２工程の少量の溶液中でまず最初に希釈する。同様にし
て、ヒドロコルチゾン、エストラジオール、プロゲステ
ロン及びテストステロンを最終調合物への添加前に第２
工程の溶液中で希釈する。

６　３７℃に加熱した新生子牛血清を攪拌しながらゆっ
くりとてんかする。

７　調合物の終了ｐＨは７．２〜８．０の範囲であり、
３３０〜６５０ミリオスモルの容量ホスモル濃度を有す
る。

８　最終溶液を０．２ミクロンのフィルターを通して２
回濾過して上記の調合物１の組成を有する滅菌した最終
製品を得る。

上記の第１調合物の好ましい普遍的結成補足剤を用いる
特定の例において、いくつかの細胞系が以下のとおり生
長した。

例２ ＢＨＫ−２１細胞アメリカ型培養コレクション、Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、ＭＤＡＴＣＣ　ＮｏＣＣＬ−１０（生ま
れたてのハムスターの腎臓細胞）の生長に関連して調合
物１の生長培地補足刑を使用する。６０ｍｍのペトリ皿
の第１群において各５ｍｌの容量中のダルベコ部分修正
イーグル培地（ＤＭＥＭ）を１０％子牛血清で補足する
。その細胞を湿った５％ＣＯ２−９５％空気環境中で３
７℃で６日間生長させる。

６０ｍｍのペトリ皿の第２群において、ＢＨＫ−２１細
胞を同じ条件下で、本発明の調合物１の生長補足剤１０
％で補足されたＤＭＥＭ中で生長させる。

第１及び第２群をいくつかのペトリ皿で構成し、それぞ
れ補足剤のロットＡ、Ｂ、Ｃ及び子牛血清部分修正培地
のロットＡ、Ｂ、Ｃとする。３日目及びほぼ５日目に、
調合物１補足剤−培地及び血清ー培地を各皿中のそれぞ
れの新鮮なストックと取り換える。

ＢＨＫ−２１細胞生長に対する本発明の補足剤の置換適
正を図面のグラフで示す。例えば、本発明の細胞生長培
地補足剤中のＢＨＫ−２１世代時間は、１０％子牛面清
血清足した培地中の１６．５時間と比較して１３．１時
間であることがわかる。

細胞世代時間又は細胞倍加時間は細胞集団の生長速度又
は倍加速度を測定するために用いられる。

例えば、細胞世代時間は細胞培地補足剤の生長促進能の
量的割合である。６日目の細胞密度はＤＭＥＭ中の調合
物１の１０％細胞生長補足剤において２．２３ｘ１０５
細胞／ｃｍ２であり、またＤＭＥＭ中の１０％子牛血清
においてに１．５９ｘ１０５細胞／ｃｍ２である。

したがって、調合物１は細胞培地への添加のための実質
上普遍的な細胞生長促進剤であることが示された。

本発明の促進剤として調合物１の処方箋を使用してプラ
ス効果を有しながら生長したほかの細胞は以下に示すと
おりのものである。

Ａ４３１−ヒト類表皮線癌 ＢＡＬＢ３Ｔ３−マウス胎芽繊維細胞 Ｃ６−ラット神経膝腫 ＣＶ−１−アフリカグリーン猿腎臓 内皮細胞（非変換）−マウス大動脈内皮細胞Ｆ９−マウ
ス胎芽癌 ＦＳ−１２３０−ヒト２倍体線維芽細胞ＨｅＬａ−ヒト
頸癌 ハイブリドーマ（融合細胞腫）Ｓｐ−２−マウス骨髄腫
親−抗体生産を続行 ハイプリド−マ−ＮＳ−１親マウス骨髄腫ＫＢ−ヒトロ
腔類表皮癌 Ｌ６−ラット骨格筋筋原細胞 ＭＣＦ−７−ヒト乳癌 マウス肉腫 類筋原細胞（非変換）−ネズミ ＳＶ４０３Ｔ３−ＳＶ−４０ウイルスを変換したＢＡＬ
ＢＣ３Ｔ３ ＴＲ−Ｍラット睾丸腫瘍 ＴＲ−ＳＴラット睾丸腫瘍 ＴＭ−４マウス　セルトリ細胞 ＴＲ−１ラット睾丸細胞（非変換） ＶＥＲＯ−アフリカグリーン猿腎臓 ＷＩ−３８−ヒト２倍体線維芽細胞 ＭＲＣ−５−ヒト２倍体線糺芽細胞 ＯＭＴＷ９ＰＬ−ラット乳房腫瘍−６個の独立したクロ
ーン ヒト線維芽細胞の一次培養物 ヒト腫瘍牛検標本からの一次培養物 ラット胎芽へ維芽細胞のようないくつかの細胞系は通常
本発明の細胞生長培地中で生長しないが、それでもなお
本発明の細胞生長培地は広範囲の種類の細胞培養中で生
長を促進するので普遍的な補足剤であると考えられる。

本明細書中で用いられろ「生長」とう用語は、固体の支
持体上で又は自由に懸濁液中で生長した場合の培地中の
高密年度に刻する細胞増殖を意味する。本発明の補足剤
が上記の慣用培地と一緒に、本発明の細胞生長培地補足
剤０．１〜４０容量％対慣用培地９９．９〜６０容量％
、好ましくは本発明の補足剤１〜２５容量％対慣用培地
９９〜７５容量％という広範囲の割合で使用される場合
、広範囲の種類の細胞系の細胞生長が促進される、本発
明の補足剤は活性の著しい損失なしに長時間保存するこ
とができす。例えば、該補足剤は−２０℃に凍結させる
ことができる。該補足剤は４℃の温度で少なくとも４週
間は安定であることがわかった。慣用培地と混合した後
でさえ、該促進剤は長期間にわたって活性を促進してい
るその細胞生長を維持する。該補足剤は別の独立した溶
液として慣用倍地に添加されるものとして説明したが、
しかし補足剤調合物自体は慣用倍地中でそこに所要量を
添加することによって直接作ることができる。

すべての場合において、使用される血清に最終工程とし
て最初の溶解後に無機塩、アミノ酸、ビタミン及び種々
雑多な成分から成る混合物のアリコート中の血清の少な
くとも一部分を添加することが好ましい。

【図面の簡単な説明】

添伺の図面はＢＨＬ−２１細胞生長に対する本発明の補
足剤の置換適性を示したグラフである。 代理人　弁理士（８１０７）　佐々木　清隆（ほか３名
）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）細胞をインビトロで生長させるための細胞生長培
   地補足剤において、該補足剤が少量の動物血清と、ペプ
   チドホルモン、甲状腺ホルモン、エストロゲン、アンド
   ロゲン、コルチコイド、栄養素、生長因子、輸送因子、
   無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖から成る大量の混合物
   と、他の微量成分とから本質的に成ることを特徴とする
   前記補足剤。 （２）前記の動物血清、ホルモン、エストロゲン、アン
   ドロゲン、コルチコイド、生長因子、栄養素及び輸送因
   子が呻乳動物の血清、インシュリン、トランスフェリン
   、ＥＧＦ、ＥＣＧＳ、亜セレン酸、０−ホスホリル−エ
   タノールアミン、トリヨードチロキシン、ヒドロコルチ
   ゾン、エストラジオール１７、プロゲステロン及びテス
   トステロンから本質的に成ることを特徴とする前項（１
   ）記載の細胞生長培地補足剤。 （３）前記の血清が牛血清であることを特徴とする特許
   請求の範囲第２項に記載の細胞生長培地補足剤。 （４）前記の成分が以下のとおりの該補足剤の量で用い
   られることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の
   細胞生長培地補足剤。 成分　　　　　　　　　　　　範囲 牛血清　　　　　　　　　　　５〜２５容量％　　　　
   　　　　　　　　　　ｍｇ／ｌインシュリン　　　　　
   　　　５−１０トランスフェリンン　　　　２０−１０
   ０ＥＧＦ　　　　　　　　　　　２−１００ＥＣＧＳ　
   　　　　　　　　　２−１００亜セレン酸　　　　　　
   　　　０．０１３−０．１３Ｏ−ホスホリル−エタノー
   ルアミン　　１．４−１４０Ｌ−３，５，３’トリヨー
   ドチロキシン　６．７３Ｘ１０−７−６．７３Ｘ１０−
   ４ヒドロコルチゾン　　　　　　　３．４６Ｘ１０−４
   −３．４６Ｘ１０−２エストラジオール１７　　　　　
   ２．７２×１０−４−２．７２ｘ１０−２プロゲスゾロ
   ン　　　　　　　　３．１５Ｘ１０−４−３．１５Ｘ１
   ０−２テストステロン　　　　　　　　２．８８Ｘ１０
   −４−２．８８Ｘ１０−２（５）少量の牛血清と、ペプ
   チドホルモン、甲状腺ホルモン、エストロゲン、アンド
   ロゲン、コルチコイド、栄養素、生長因子、輸送因子、
   無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖から成る大量の混合物
   と、他の微量成分とから本質的に成る細胞生長培地補足
   剤において、前記補足剤が線維芽細胞様及び上皮起始の
   変換した及び変換していない原子細胞、並びに変換した
   及び変換していない継続細胞系を包含する広範囲に異な
   る型の細胞の生長を促進するのに有効であることを特徴
   とする前記補足剤。 （６）前記の牛血清、ホルモン、エストロゲン、アンド
   ロゲン、コルチコイド、生長因子、栄養素及び輸送因子
   が牛血清、インシュリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、
   ＥＣＧＳ、亜セレン酸、Ｏ−ホスホリル−エタノールア
   ミン、トリョードチロキシン、ヒドロコルチゾン、エス
   トラジオール１７、プロゲステロン及びテストステロン
   から本質的に成ることをを特徴とする前項（５）記載の
   細胞生長培地補足剤。 （７）前記の血清が新生子牛血清であることを特徴とす
   る特許請求第６項に記載の細胞生長培地補足剤。 （８）下記の成分： 成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃　　　
   度動物血清　　　　　　　　　　　　　０．１〜４０容
   量％　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｍｇ／ｌイ
   ンシュリン　　　　　　　　　　　　２５トランスフエ
   リン　　　　　　　　　　５０ＥＧＦ　　　　　　　　
   　　　　　　　　５ＥＣＧＳ　　　　　　　　　　　　
   　　７７．５亜セレン酸　　　　　　　　　　　　０．
   １６１２０−ホスホリル−エタノールアミン　　５６．
   ４４Ｌ−３，５，３′トリヨードチロキシン　　１．６
   ８３ｘ１０−４ヒドロコルチゾンン　　　　　　　　　
   　４．３３Ｘ１０−３エストラジオール１７　　　　　
   　　　　３．４１Ｘ１０−３プロゲステロン　　　　　
   　　　　　　３．９３Ｘ１０−３テストステロン　　　
   　　　　　　　　３．６１Ｘ１０−３無機塩　　　　　
   　　　　　　　　　　ｍｇ／ｌＣａＣＬ２　　　　　　
   　　　　　　　　２３．２４ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　
   　　　　　　　０．００１７４ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
   　　　　　　　　０．５８ＫＣｌ　　　　　　　　　　
   　　　　　　１５６．５６ＭｇＧｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　
   　　　　　　　８５．４０ＮａＣｌ　　　　　　　　　
   　　　　　　　５３１９．３０Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　
   　　　　　　　　　９９．４０ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　
   　　　　　　　　　０．６０アミノ酸 Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　　６．２４Ｌ−
   アルギニンＨＣｌ　　　　　　　　　１５３．７３Ｌ−
   アスパラギン　　　　　　　　　　　１０．５０Ｌ−ア
   スパラギン酸　　　　　　　　　　　９．３２Ｌ−シス
   ティンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ　　　　　　２４．５８Ｌ−グル
   タミン酸　　　　　　　　　　　　１０．３０グリシン
   　　　　　　　　　　　　　　　　５．２６Ｌ−ヒスチ
   ジンＨＣＬ・Ｈ２Ｏ　　　　　１４．６７Ｌ−イソロイ
   ジン　　　　　　　　　　　　２．７６Ｌ−リジンＨＣ
   ｌ　　　　　　　　　　　　２５．５６Ｌ−メチオニン
   　　　　　　　　　　　　　３．１３Ｌ−フェニルアラ
   ニン　　　　　　　　　　３．４７Ｌ−プロリン　　　
   　　　　　　　　　　　２４．１７Ｌ−セリン　　　　
   　　　　　　　　　　　７．３６Ｌ−スレオニン　　　
   　　　　　　　　　　８．３４Ｌ−トリプトファン　　
   　　　　　　　　　１．４３Ｌ−チロシン　　　　　　
   　　　　　　　　３．８１Ｌ−バリン　　　　　　　　
   　　　　　　　８．２０ビタミン ｄ−ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　０．００
   ５１Ｄ−パントテン酸カルシウム　　　　　　　　０．
   １８塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　９．７７
   葉酸　　　　　　　　　　　　　　　　０．９３ミオ−
   イノシトール　　　　　　　　１２．６１ニコチンアミ
   ド　　　　　　　　　　０．０２６ピリドキシンＨＣｌ
   　　　　　　　　　　　０．０４３リボフラビン　　　
   　　　　　　　　　　　０．０２６チアミンＨＣｌ　　
   　　　　　　　　　　　　　０．２４ビタミンＢ１２　
   　　　　　　　　　　　　　　０．９５他の種々雑多な
   成分 グルコース　　　　　　　　　　　　１，２６１．１２
   ヒポキサンチン　　　　　　　　　　　　２．８６リノ
   ール酸　　　　　　　　　　　　　　　０．０５９フエ
   ノール赤　　　　　　　　　　　　　　０．８７プトレ
   ツシン２ＨＣｌ　　　　　　　　　　０．１１ピルビン
   酸ナトリウム　　　　　　　　　　７７．０７チミジン
   　　　　　　　　　　　　　　０．５１重炭酸ナトリウ
   ム　　　　　　　　　　１１７６蒸留水で１ｌの容積に
   する。 から本質的に成る細胞生長培地補足剤。 （９）前記の動物血清が５〜２５容量％の量の新生子牛
   血清であることを特徴とする特許請求の範囲囲第８項に
   記載の細胞生長培地補足剤。 （１０）前記の新生子牛血清が２５％の絹で使用される
   ことを特徴とする前項（９）記載の細胞生長培地補足剤
   。 （１１）（α）動物血清と組み合わせたときに動物細胞
   の生長に必要なすべての生長成分を有する細胞培地９９
   ．９〜６０容量％と、 （ｂ）　少華の動物血清と、ペプチドホルモン、甲状腺
   ホルモン、エストロゲン、アンドロゲン、コルチコイド
   、栄養素、生長因子、輸送因子、舞機塩、アミノ酸、ビ
   タミン、糖から成る大量の混合物と、他の微量成分とか
   ら本質的に成る細胞生長培地補足剤０．１〜４０容呈％
   とから成る組合せ物。 （１２）前記の動物血清、ホルモン、エストロゲン、ア
   ンドロゲン、コルチコイド、生長因子、栄養素及び輸送
   因子が哺乳動物の血清、インシュリン、トランスフェリ
   ン、ＥＧＦ、ＥＣＧＳ、亜セレン酸、Ｏ−ホスホリル−
   エタノールアミン、トリヨードチロキシン、ヒドロコル
   チゾン、エストラジオール１７、プロゲステロン及びテ
   ストステロンから本質的に成ることを特徴とする前項（
   １１）記載の組合せ物。 （１３）前記の血清が新生子牛血清であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１１項に記載の組合せ物物。 （１４）前記の補足剤が次の処方箋： 　　成　　　分　　　　　　　　　　　濃　　　度動物
   血清　　　　　　　　　０．１〜４０容量％　　　　　
   　　　　　　　　　　ｍｇ／ｌインシュリン　　　　　
   　　　　　２５トランスフエリン　　　　　　　　　５
   ０ＥＧＦ　　　　　　　　　　　　　　　５ＥＣＧＳ　
   　　　　　　　　　　　　７７．５亜セレン酸　　　　
   　　　　　　　　０．１６１２Ｏ−ホスホリル−エタノ
   ールアミン　　５６．４４Ｌ−３，５．３′トリヨード
   チロキシン　１．６８３Ｘ１０−４ヒドロコルチゾン　
   　　　　　　　４．３３Ｘ１０−３エストラジメール１
   ７　　　　　　３．１４Ｘ１０−３プロゲステロン　　
   　　　　　　　３．９３Ｘ１０−３テストステロン　　
   　　　　　　　３．６１Ｘ１０−３無機塩　　　　　　
   　　　　　　　　　ｍｇ／ｌＣａＣｌ２　　　　　　　
   　　　　　　２３．２４ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　　　
   　　　　　０．００１７４ＦｌＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　
   　　　　　　０．５８ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　
   　　１５６．５６ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　
   　８５．４０ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　５
   ，３１９．３０Ｎａ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　
   　９９．４０ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｑ　　　　　　　　　
   　０．６０アミノ酸 Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　　６．２４Ｌ−
   アルギニンＨＣｌ　　　　　　　　１５３．７３Ｌ−ア
   スパラキン　　　　　　　　　　　１０．５０Ｌ−アス
   パラギン酸　　　　　　　　　　９．３２Ｌ−システイ
   ンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ　　　　　２４．５８Ｌ−グルタミン
   酸　　　　　　　　　　　１０．３０グリシン　　　　
   　　　　　　　　　　　５．２６Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ
   ・Ｈ２Ｏ　　　　　１４．６７Ｌ−イソロイシン　　　
   　　　　　　　　２．７６Ｌ−リジンＨＣｌ　　　　　
   　　　　　　２５．５６Ｌ−メチオニン　　　　　　　
   　　　　　３．１３Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　
   　　３．４７Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　　　２
   ４．１７Ｌ−セリン　　　　　　　　　　　　　７．３
   ６Ｌ−スレオニン　　　　　　　　　　　８．３４Ｌ−
   トリプトファン　　　　　　　　　１．４３Ｌ−チロシ
   ン　　　　　　　　　　　　３．８１Ｌ−バリン　　　
   　　　　　　　　　　８．２０ビタミン ｄ−ビオチン　　　　　　　　　　　０．００５１Ｄ−
   パントテン酸カルシウム　　　　　　　０．１８塩化コ
   リア　　　　　　　　　　　　　　　９．７７葉酸　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　０．９３ミオ−イノ
   シトール　　　　　　　　　　１２．６１ニコチンアミ
   ド　　　　　　　　　　　　　０．０２６ビリドキシン
   ＨＣｌ　　　　　　　　　　０．０４３リボフラビン　
   　　　　　　　　　　　　０．０２６チアミンＨＣｌ　
   　　　　　　　　　　　０．２４ビタミンＢ１２　　　
   　　　　　　　　　０．９５他の種々雑多な成分 グルコース　　　　　　　　　　　１，２６１．１２ヒ
   ポキサンチン　　　　　　　　　　　　２．８６リノー
   ル酸　　　　　　　　　　　　　　　０．０５９フエノ
   ール赤　　　　　　　　　　　　　０．８７ブトレツシ
   ン２ＨＣｌ　　　　　　　　　０．１１ピルビン酔ナト
   リウム　　　　　　　　７７．０７チミジン　　　　　
   　　　　　　　　　０．５１重炭酸ナトリウム　　　　
   　　　　１１７６．蒸留水で１６の容積にする を有することを特徴とする前項（１１）記載の組合せ物
   。 （１５）細胞をインヒドロで生長させろ方法において、
   該方法が細胞を、混合物の０．１〜４０容量％の量で細
   胞生長培地補足剤と混合された細胞培地の存在下で生長
   させること、及び該補足剤が細胞の急速かつ豊かな生長
   を促進させることを可能にする、少量の動物血清と、ペ
   プチドホルモン、甲状腺ホルモン、エストロゲン、アン
   ドロゲン、コルチコイド、栄養素、生長因子、輸送因子
   、無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖から成る大量の混合
   物と、他の微量成分とから本質的に成ることを特徴とす
   る前記方法。 （１６）動物血清、ホルモン、エストロゲン、アンドロ
   ゲン、コルチコイド、生長因子、栄養素及び輸送因子か
   ら成る本質的に成る前記補足剤が哺乳動物の血清、イン
   シュリン、トランスフェリン、ＥＧＦ、ＥＣＧＳ、亜セ
   レン酸、Ｏ−ホスホリル−エタノ−ルアミン、トリヨー
   ドチロキシン、ヒドロコルチゾン、エストラジオール１
   ７プロゲステロン及びテストステロンから本質的に成る
   ことを特徴とする前項（１５）記載の方法。 （１７）前記の動物血清が新生子牛血清であることを特
   徴とする前項（１６）記載の方法。 （１８）前記の補足剤が混合物の５〜２５容量％の量で
   存在することを特徴とする前項（１６）記載の方法。 （１９）前記の細胞生長培地補足剤が 成分　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度新生
   子牛血清　　　　　　　　　　補足剤の２５容量％　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　ｍｇ／ｌインシュリ
   ン　　　　　　　　　　　　２５トランスフエリン　　
   　　　　　　　　５０ＥＧＦ　　　　　　　　　　　　
   　　　　５ＥＣＧＳ　　　　　　　　　　　　　　　７
   ７．５亜セレン酸　　　　　　　　　　　　０．１６１
   ２Ｏ−ホスホリル−エタノールアミン　　５６．４４Ｌ
   −３，５，３′トリヨードチロキシン　　１．６８３×
   １０−４ヒドロコルチゾン　　　　　　　　　　４．３
   ３Ｘ１０−３エストラジオール１７　　　　　　　　３
   ．４１Ｘ１０−３プロゲステロン　　　　　　　　　　
   ３．９３Ｘ１０−３テストステロン　　　　　　　　　
   　３．６１Ｘ１０−３無機塩　　　　　　　　　　　　
   　　ｍｇ／ｌＣａＣｌ２　　　　　　　　　　２３．２
   ４ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　　　　　０．００１７４Ｆｌ
   ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　０．５８ＫＣｌ　　　
   　　　　　　　　　　１５６．５６ＭｇＣｌ２・６Ｈ２
   Ｏ　　　　　　　　８５．４ＯＮａＣｌ　　　　　　　
   　　　　　　　５，３１９．３０Ｎａ２ＨＰＯ４　　　
   　　　　　　　　　９９．４０ＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ　
   　　　　　　　　０．６０アミノ酸 Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　　　６．２４Ｌ−ア
   ルギニンＨＣｌ　　　　　　　　１５３．７３Ｌ−アス
   パラギン　　　　　　　　　１０．５０Ｌ−アスパラギ
   ン酸　　　　　　　　　９．３２Ｌ−システインＨＣｌ
   ・Ｈ２Ｏ　　　　　２４．５８Ｌ−グルタミン酸　　　
   　　　　　　　１０．３０グリシン　　　　　　　　　
   　　　　　５．２６Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ・Ｈ２Ｏ　　
   　　１４．６７Ｌ−イソロイシン　　　　　　　　　　
   ２．７６Ｌ−リジンＨＣｌ　　　　　　　　　　　２５
   ．５６Ｌ−メチオニン　　　　　　　　　　　　　３．
   １３Ｌ−フェニルアラニン　　　　　　　　　　３．４
   ７Ｌ−プロリン　　　　　　　　　　　　　　　２４．
   １７Ｌ−セリン　　　　　　　　　　　　７．３６Ｌ−
   スレオニン　　　　　　　　　　　　８３４Ｌ−トリプ
   トファン　　　　　　　　　１．４３Ｌ−チロシン　　
   　　　　　　　　　　３．８１Ｌ−バリン　　　　　　
   　　　　　　８．２０ビタミン ｄ−ビオチン　　　　　　　　　　　　０．００５１Ｄ
   −パントテン酸カルシウム　　　　　０．１８塩化コリ
   ン　　　　　　　　　　　　　９．７７葉酸　　　　　
   　　　　　　　　　　　０９３ミオ−イノシトール　　
   　　　　　　１２．６１ニコチンアミド　　　　　　　
   　　　　１２．６１ピリドキシンＨＣｌ　　　　　　　
   　　　０．０４３リボフラビン　　　　　　　　　　　
   　０．０２６チアミンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　
   　０．２４ビタミンＢ１２　　　　　　　　　　　　　
   ０．９５他の押々雑多な成分 クルコース　　　　　　　　　　　１，２６１．１２ヒ
   ポキサンチン　　　　　　　　　　　２．８６リノール
   酸　　　　　　　　　　　　　　０．０５９フエノーノ
   赤　　　　　　　　　　　　　０．８７プトレツシン２
   ＨＣｌ　　　　　　　　　０．１１ピルビン酸ナトリウ
   ム　　　　　　　　７７．０７チミジン　　　　　　　
   　　　　　　　０．５１重炭酸ナトリウム　　　　　　
   　　１１７６蒸貿水で１ｌの容積にする から本質的に成ることを特徴とする前項（１６）記載の
   方法。 （２０）　細胞をインヒドロで生長させる方法において
   、該方法が、細胞を、組織培地と、後記混合物が線維芽
   細胞様及び上皮梯起始の変換及び非変換の原始細胞、並
   びに変換及び非変換の繊維細胞系を包含する細胞の生長
   を促進することができる、全動物血清の代りに有効な細
   胞生長培地促進剤とから本質的に成る混合物中で生長さ
   せること、及び該補足剤がさもなければ全動物血清によ
   って与えられる、細胞生長に必要な必須成分を与え、か
   つ動物血清の少なくとも少量部分を含有することを特徴
   とする前記方法。 （２１）その一部分として動物血清を有する細胞長生培
   地を製造する方法において、その工程が該動物血清の一
   部分を前記補足剤の一部分中に溶解すること、該補足剤
   の成分の混合を完了させること及び実質上の最終工程と
   して該動物血清の残りを添加すること、並びに該補足剤
   を滅閉するために必補足剤を濾過することから成ること
   を特徴とする前記方法。