JPH03266981A

JPH03266981A - 動物細胞用合成培地

Info

Publication number: JPH03266981A
Application number: JP2064057A
Authority: JP
Inventors: Takeyoshi Tamura; 田村　武佳; Takeshi Matsumoto; 健松本; Soji Yokoshima; 横島　聡二; Junichiro Hata; 淳一郎秦; Masako Kabeno; 可部野　昌子; Shinya Yamashita; 伸也山下
Original assignee: NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd; Nippon Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: NITSUSUI SEIYAKU KK; Nissui Pharmacetuical Co Ltd; Nissui Corp
Priority date: 1990-03-16
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1991-11-27
Anticipated expiration: 2015-05-29
Also published as: JP3046606B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、動物細胞を用いた生理活性物質の生産に使用
される動物細胞用合成培地に関するものであり、詳しく
は基礎培地としてのアルファＭＥＭ培地に培養添加物を
加えることにより、動物血清の添加量を少なくし血清濃
度を低減することができる動物細胞用合成培地に関する
ものである。

（従来の技術）近年、遺伝子工学の急速な進歩と普及により、種々の生
理活性物質を動物細胞を用いて生体外で大量に生産する
ことが可能となった。動物細胞を用いた生理活性物質の
生産を目的とする場合には、目的とする遺伝子を動物細
胞に導入し、増殖細胞として株化させるのが一般的であ
る。そしてこの細胞を用いて、経験上から適当な濃度の
血清、−般には成牛、牛新生児または牛胎児血清（ＦＣ
３：通常５〜１０％濃度）を添加した合成培地１例えば
アルファＭＥＭ培地、ダルベツコ変法イーグルＭＥＭ培
地、ハムピー１２培地、或はこれらの混合物を基本とし
たものなどが用いられる。そして既知の動物細胞として
は、ＣＨ〇−Ｋｌ（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、ＢＨＫ２１
（ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２
）、ＣＯ３−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）　、Ｖｅｒ
ｏ（ＡＴＣＣＣＣＬ８１）などがある。

（発明が解決しようとする課題）上記のような血清添加培地を用いて培養液を調製し、こ
の培地を用いて生理活性物質産生細胞を１− − 増殖させようとする場合には、細胞の増殖はもっばら血
清に依存している。そして血清を添加し培養して得られ
た培養液から、産生された生理活性物質を分離、精製す
る工程が繁雑となり、多くの労力と経費が必要とされる
。また血清は、ロットごとに品質が異なり、メーカーに
よっても品質にばらつきがある。そして高価でもあり、
さらに目的とする生理活性物質産生細胞に適したものを
選択する必要がある。

本発明は上記の問題に鑑みてなされたものであり、その
目的は１％前後の低濃度の血清添加でも、従来は５〜１
０％の血清濃度を添加しなければならなかった培地と比
較したとき、細胞の増殖や細胞の産生ずる生理活性物質
量が、同等かそれ以上の成績をあげることができる合成
培地を提供することである。

（課題を解決するための手段および作用）本発明者らが
種々研究した結果、従来から使用されているアルファＭ
ＥＭ培地に種々の物質を添加したり強化することにより
、上記の課題を達成することができた。

すなわち本発明の要旨は「アルファＭ、ＥＭ培地を基礎
培地とし、これに培養添加物を加えることを特徴とする
動物細胞用合成培地」である。

そして本発明において、基礎培地であるアルファＭＥＭ
培地に添加する培養添加物としては、種々のビタミン、
微量元素、核酸、その他の化学合成物質を用いることが
できるが、特に第１表に示す物質と濃度範囲での添加が
本発明の目的の達成に効果的である。

第１表さらに、アルファＭＥＭ培地組成のうち、ビタミン類で
ある塩化コリン１．０■／Ｑを、１〜２０■／Ω４− の範囲で、ｉ−イノシトール濃度２．０■／Ｑを２〜４
０ＫＩＱの範囲で増強し、一方アスコルビン酸濃度５０
■／Ｑは、０■／Ｑに近づけるほどより効果的である。

また、アルファＭＥＭ培地組成に含まれない核酸物質で
あるヒボキサンチン濃度は０．１〜２０■／Ωの範囲で
、チミジン濃度は０．１〜４■ＩＱの範囲で添加するこ
とが効果的であるが、用いられる細胞の特性や目的によ
ってはこれらの核酸物質を添加しなくてもよい。

本発明の合成培地を用いて培養することのできる動物細
胞としては、ＣＨＯ−Ｋｌ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ｃＯ８
７、Ｖｅｒｏなどの細胞が挙げられ、さらにこれらの細
胞に、生理活性物質の遺伝子を導入した細胞を挙げるこ
とができるが、特にＣＨＯ細胞が好ましい。

本発明の合成培地は、動物細胞の増殖や生理活性物質の
産生を促進させるものであり、この合成培地を通常使用
されている５％透析牛脂児血清を加えたアルファＭＥＭ
培地と比較した場合に、１％透析牛脂児血清と同等か、
またはそれ以上の効果がある。従来５％濃度のものが必
要であった牛胎児血清が、１％濃度に減らすことができ
るのは、大幅なコスト低減をもたらすことを意味してい
る。

以下実施例に基づいてさらに詳細に説明する。

（実施例）培地を評価する細胞として、ＣＨ○細胞の標準株である
ＣＨＯ−に１細胞とそのデヒドロ葉酸リダクターゼ（ｄ
　ｈ　ｆ　ｒ）遺伝子欠損株であるＤＸＢ　１１（１）
に、ｄｈｆ　ｒ遺伝子とヒト成長ホルモン（ｈａＨ）遺
伝子（２）を導入した遺伝子導入細胞を用いた。遺伝子
導入細胞は、５Ｖ−４０ウイルスのプロモーターにつな
いだヒト成長ホルモン遺伝子を、ＣＨＯ細胞にエレクト
ロボレーシミン法（３）により導入し、クローニングを
行い、ヒト成長ホルモン産生細胞株を樹立した。

培地は、アルファＭＥＭ培地（４）と本発明の培地を用
い、細胞の培養には、コーニング社製１２Ｗ　ｅ　ｌ　
１のマルチウェルプレートを使用した。まず５．０％透
析牛脂児血清を含むアルファＭＥＭ培地と、１．０％透
析牛脂児血清を含むアルファ６− ＭＥＭ培地および本発明の培地をマルチウェルプレート
ＩＷｅｌｌあたり１．ＯｍＱ分注し、ＣＩ（Ｏ−Ｋ］、
細胞とヒト成長ホルモン産生細胞を各々１ｘ１０４個植
え込んだ。そして炭酸ガスインキュベーター（フォマー
社製、５％炭酸ガス＋９５％空気、水蒸気飽和）で４日
間培養した。到達細胞数は、タタイ式血球計算盤により
計算し、産生じたヒト成長ホルモンの定量は、ＲＩＡ法
であるファルマシアＧＨ（ファルマシア社）キットを用
いて測定した。その結果を第３表に示す。なお、本実施
例に用いた本発明の培地の組成を第２表に示す。

Ｌ−アスパラギン酸Ｌ−アラニンＬ−アルギニン塩酸塩Ｌ−インロイシングリシンＬ−グルタミンＬ−グルタミン酸Ｌ−システィン塩酸塩Ｌ−シスチン２塩酸塩Ｌ−スレオニンし−セリン０５１２６．４５２．５０９２５００３１．３４７．６５Ｌ−チロシンＬ−トリプトファンＬ−バリンＬ−ヒスチジン塩酸塩Ｌ−プロリンＬ−フェニールアラニンＬ−メチオニンＬ−リジン塩酸塩り一ロイシンｉ−イノシトールジアノコバラミンニコチン酸アミドパントテン酸カルシウムピルビン酸ナトリウム塩酸ピリドキサールＤ−ビオチン塩酸チアミンリボフラビングルタチオン（還元型）プトレッシン２塩酸塩葉酸リポ酸塩化カリウム塩化カルシウム塩化コリン塩化ナトリウムコハク酸ブドウ糖リン酸二水素−ナトリウム１水硫酸マグネシウム無水硫酸第一鉄７水ヒボキサンチンチミジン３６．２１０．２４６．９４１．９０３ ■４．９７３．１５２．５８１．４１００．１０．１０．１６０．２００００４８００２３．６０００４０９７．７０．８０．４７８− Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン第３表２０いても、１．０％透析牛脂児血清を含む本発明の培地は
、到達細胞数、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）産生量とも
５．○％透析牛脂児血清を含むアルファＭＥＭ培地のそ
れを上回る成績が得られた。

（発明の効果）本発明によれば、従来使用されている５〜１０％の血清
濃度を添加したアルファＭＥＭ培地に比較して、わずか
１％前後の低濃度の血清添加でも、細胞の増殖や細胞の
産生ずる生理活性物質量が、同等かそれ以上の成績をあ
げることができる。

従って産生された生理活性物質の分離、精製が容易とな
り、高価な血清を大量に添加する必要もなくなるので実
用上の価値は大なるものがある。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アルファＭＥＭ培地を基礎培地とし、これに培養
添加物を加えることを特徴とする動物細胞用合成培地
（２）アルファＭＥＭ培地組成に硫酸第一鉄、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン、コハク酸、グルタチオン、プ
トレッシンを添加することを特徴とする請求項（１）記
載の動物細胞用合成培地