JP3221681B2 - 動物細胞培養 - Google Patents

動物細胞培養

Info

Publication number
JP3221681B2
JP3221681B2 JP50431894A JP50431894A JP3221681B2 JP 3221681 B2 JP3221681 B2 JP 3221681B2 JP 50431894 A JP50431894 A JP 50431894A JP 50431894 A JP50431894 A JP 50431894A JP 3221681 B2 JP3221681 B2 JP 3221681B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
medium
cells
animal
derivative
growth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP50431894A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH06511389A (ja
Inventor
フィールド，レイモンド，ポール
Original Assignee
アルスイス・ホールディングス・アクチェンゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アルスイス・ホールディングス・アクチェンゲゼルシャフト filed Critical アルスイス・ホールディングス・アクチェンゲゼルシャフト
Publication of JPH06511389A publication Critical patent/JPH06511389A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3221681B2 publication Critical patent/JP3221681B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/005—Protein-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、動物細胞培養における改良、特に動物細胞
を増殖させる方法およびその栄養培地における改良に関
する。
発明の背景 細胞生成物、例えば免疫グロブリン、ホルモンおよび
酵素の大量生産のための動物細胞培養の使用は、商業的
観点からますます重要になってきており、現在、これら
の物質の大規模生産の最適化を求めて細胞培養技術の開
発に多大な努力がはらわれている。
培養中の動物細胞は、塩、蔗糖、アミノ酸およびビタ
ミンの基礎的栄養混合物を必要とする。通常この混合物
は、生物学的液体または抽出物で補充され、それらの非
存在下では殆どの細胞は活力を失い、または増殖するこ
とができない。もっと普通に用いられる補充物質は血清
である。
しかしながら補充物質の使用は、それらの性状が一般
的に未確認であるがゆえに、さらに与えられたタイプの
バッチ間に存在する変動ゆえに、培養の成功および再現
性に影響を与える可能性があるため、満足のいくもので
はない。したがって、培養細胞の増殖を支援するために
より確定された培地を提供するという観点から、血清の
ような補充物質中の活性因子を同定する多くの試みが為
されてきた。今日まで、この試みは限られた成功しかも
たらさなかったが、これは生物学的補充物質の複雑な性
状、およびそれらに含まれる活性因子の量が非常に少な
いことが大きな理由である。
しかし、補充物質を含まない多くの培地も報告され、
それらのいくつかは市販されている（例えば、ムラカミ
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,1159−1162（1982）;D
arflerら、Exp.Cell Res.138,287−295（1982）；国際
特許出願公開第WO90/03430号公報参照）。
補充物質を含まない培地は通常、アミノ酸、塩、ビタ
ミン、微量元素、炭水化物および他の増殖支援成分（例
えばアルブミン、インシュリン、グルタミン、トランス
フェリン、フェリチンおよびエタノールアミン）の複雑
な混合物を含んでいる（例えば米国特許第4816401号明
細書参照）。そのような培地で培養したとき、動物細胞
は、該培地中の１つまたは２つ以上の必須の栄養物が枯
渇するまでの限られた期間活力を維持する。そのような
ときに、該培地に１つまたは２つ以上のエネルギー源お
よび１つまたは２つ以上のアミノ酸を含む栄養物を補充
することができる（例えば国際特許出願公開第WO87/001
95号公報参照）。この方法で、培養を延長させ細胞また
は細胞生成物の収量を増加させることができる。
金属イオン、特に第一および第二鉄イオンは動物細胞
代謝に必須で、未確認補充物質例えば血清として、また
は補充物質非含有培地中に含まれる塩および微量元素の
成分として培養液中に存在する。細胞の金属イオン要求
は動物細胞培養において、特に細胞密度が高密度になる
とき高くなるが、実際、このことは、細胞の増殖および
活力を支援するために金属イオンは培地中で持続的に利
用できることが必要であることを意味している。補充物
質非含有培地においてこれを達成するために、該金属の
高い単純塩濃度を用いることができるが、しかし、細胞
の該金属取り込みを促進するために、および／または高
金属イオン濃度につきものの溶解性の問題および毒性の
問題を避けるために、該金属がキレート型であることが
しばしば必要とされる。
補充物質非含有培地で増殖している細胞に十分な鉄を
供給するために、単純なまたは複雑な鉄塩、例えば硫酸
第一鉄、塩化第二鉄、硝酸第二鉄またはクエン酸第二鉄
アンモニウムが用いられてきたが、必要によりしばしば
キレート剤と組み合わせて用いることもできる。細胞培
養で用いられてきた特定の鉄キレート剤は、天然の蛋白
トランスフェリンおよびフェリチン、有機酸（例えばク
エン酸、イミノジ酢酸およびグルコン酸）、ピリドキサ
ルイソニコチノイルヒドラゾン、並びにオーリントリカ
ルボン酸を含む。
動物細胞培養用の補充物質非含有培地で一般的に使用
するための鉄キレート剤を選択する場合、多くの因子が
重要である。したがって、キレート剤は鉄に対して適切
な結合親和性を有し、細胞膜を効率よく通過して鉄を移
送することができなければならない。それはまた安価で
容易に手に入り、さらに無毒でなければならない。より
重要なことには、キレート剤は動物由来でなく合成のも
のであるべきである。それは、所望の細胞生成物の望ま
しくない汚染の可能性を避け、結果として純粋な生成物
の回収コストの増加を避けるためである。上記のキレー
ト剤のいずれもこれら全ての基準には適合しない。
発明の要旨 出願人は、２−ヒドロキシ−2,4,6−シクロヘプタト
リエン−１−オンがこれら基準のすべてに適合し、細胞
増殖を支援するために動物細胞培養に有利に用いること
ができることを見いだした。特に、この物質は、毒性問
題を避けるために低い鉄濃度を用いる必要があり、さら
に他の認知されたキレート剤（例えばクエン酸塩および
グルコン酸塩）の使用が失敗に終わった撹拌細胞培養で
の増殖を支援するために用いることができることが分か
った。出願人はこの発見を用いて動物細胞増殖のための
培地及び方法を開発した。
したがって、本発明の１つの特徴によれば動物細胞培
養の栄養培地が提供され、該培地は、炭素、窒素、アミ
ノ酸、鉄および他の無機イオン、微量元素および任意に
脂質の同化源並びに成長促進物質または調節物質を、２
−ヒドロキシ−2,4,6−シクロヘプタトリエン−１−オ
ンまたはその誘導体と混合された状態で含んでいる。
発明の詳細な説明 一般に、この栄養培地は、動物細胞の持続的増殖を支
援し、および／または定常期の間にそれらを維持する、
いずれかの既知基本培地またはその応用培地であり、そ
れに２−ヒドロキシ−2,4,6−シクロヘプタトリエン−
１−オン（以下では場合によってはトロポロンと呼ぶ）
又はその誘導体が添加されている。既知の基本培地およ
びその応用培地は、例えばダルベッコー修正イーグル培
地（Dulbecco's Modification of Eagle's Medium［DME
M］）、イスコフ修正ダルベッコー培地（Iscove Modifi
ed Dulbecco's Medium）、ハム培地（Ham's Medium）、
ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地
（Roswell Park Memorial Institute Medium［PRM
I］）、フィッシャー培地（Fischer's Medium）または
フー（Hu）らによりBiotechnol.Bioeng.（1985）、27、
585−595に記載されたもの、クレスピ及びチリー（Cres
pi and Thilly）によってBiotechnol.Bioeng.（1981）,
23,983−993）に記載されたものおよびファンベーツェ
ル（Van Wezel）によりDev.Biol.Stand.（1977）,37,14
3−147に記載されたものを含む。好ましい一つの特徴で
は該培地は蛋白非含有培地である。
本発明にしたがえば、トロポロンまたはその誘導体は
一般に細胞の増殖および活力を支援するために十分な濃
度で培地中に存在する。正確な濃度は使用する細胞系お
よび存在する他の培地成分によって変動するが、慣用的
な方法に従い予備的な小規模試験を用いて容易に決定す
ることができる。したがって、例えば選択されたいずれ
の培地についても、一連の濃度のトロポロンの存在下で
細胞を小規模で培養し、細胞増殖および活力における種
々の濃度の影響を観察することによって最適濃度を決定
することができる。
一般に、トロポロンまたはトロポロン誘導体は培地に
存在する鉄に対して過剰モル濃度、例えばおよそ5:1か
らおよそ70:1、例えばおよそ10:1からおよそ70:1のモル
比で存在する。したがって例えば、培地中の鉄濃度がお
よそ0.3μＭの場合、トロポロンまたはその誘導体はお
よそ1.5μＭからおよそ20μＭ、例えばおよそ３μＭか
らおよそ20μＭの濃度で用いることができる。鉄は第一
または第二鉄イオンとして存在するが、これは例えば培
地に単純または複雑な鉄塩（例えば硫酸第一鉄、塩化第
二鉄、硝酸第二鉄または特にクエン酸第二鉄アンモニウ
ム）を使用することによって生じる。
一般に本発明にしたがって使用するトロポロン誘導体
は、第一鉄または第二鉄イオンをキレートすることがで
きる誘導体である。この誘導体は、トロポロンの１つま
たは２つ以上の環状炭素原子が脂肪族、芳香族または複
素芳香族基、例えばアルキル、アルケニル、アルキニ
ル、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニ
ル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラル
ケニルまたはヘテロアラルキニル基によって置換された
ものを含む。トロポロンまたはその誘導体は市販されて
いる（例えばアルドリッチケミカルカンパニー（Aldori
ch Chemical Co.）から）か、または既知の文献記載の
方法を用いて調製できる。
本発明の培地は慣用的な方法を用いて個々の成分の適
切な混合によって調製され、液状形または使用前に適切
な緩衝液（例えば重炭酸塩緩衝液）を用いて再構成する
乾燥形のいずれかとして提供できる。本発明の培地を調
製する場合、トロポロンおよび鉄の濃縮液体混合物を使
用することは避けるべきである。
本発明の培地は動物細胞を培養するために用いること
ができる。したがって本発明の別の特徴によれば、炭
素、窒素、アミノ酸、鉄および他の無機イオン、微量元
素および任意に脂質の同化源並びに成長促進物質または
調節物質を、動物細胞の持続的増殖のために２−ヒドロ
キシ2,4,6−シクロヘプタトリエン−１−オンまたはそ
の誘導体と混合された状態で含む動物細胞培養栄養培地
が提供される。
本発明の培地は、撹拌培養、特に低い鉄濃度、例えば
およそ0.3μＭの鉄濃度での動物細胞の持続的増殖に特
に適している。
本発明にしたがって培養できる動物細胞は、例えば遺
伝子工学的につくられた細胞、リンパ球球細胞（例えば
ミエローマ細胞）、またはハイブリドーマ細胞もしくは
他の融合細胞でもよい。細胞タイプには特にヒト、ラッ
ト、マウスまたはハムスター由来の細胞が含まれる。本
発明の培地はリンパ球球、特にミエローマ細胞、特にマ
ウス由来、特にNS/O細胞との使用に特に適している。
本発明の培地は、動物細胞を培養し動物細胞生成物を
得るために使用することができる。したがって本発明の
別の特徴によれば、下記工程（１）−（３）を含む細胞
培養によって動物細胞生成物を得る方法が提供される：
（１）炭素、窒素、アミノ酸、鉄および他の無機イオ
ン、微量元素および任意に脂質の同化源並びに成長促進
物質または調節物質を、２−ヒドロキシ−2,4,6−シク
ロヘプタトリエン−１−オンまたはその誘導体と混合さ
れた状態で含む栄養培養培地中で該生成物を産生する動
物細胞を培養する工程と、（２）該生成物が蓄積するま
で培養を継続する工程と、（３）該生成物を回収する工
程。
本発明にしたがって得られる細胞生成物には、培養動
物細胞によって産生されるいずれの生成物も含まれる。
典型的な生成物はポリペプチドおよび蛋白質、例えば免
疫グロブリン例えばモノクロナル抗体および組換え体
（recombinant）抗体およびその断片、ホルモン例えば
エリスロポエチンおよびヒト成長ホルモン等の成長ホル
モン、リンホカイン例えばインターフェロン、インター
ロイキン例えばインターロイキン2,4,5および６並びに
工業的および治療的に有用な酵素例えば組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターを含む。
本発明の方法では、動物細胞は一般に、適切な容器、
例えば撹拌タンクまたはエアーリフト式ファーメンター
中で既知の培養技術を用いて浮遊状態で培養できる。
したがって、例えば、慣用的な技術によって得られた
適切な細胞の種培養を該培養培地に接種するために用い
ることができる。一般には接種に用いる細胞の数は１×
105から５×105細胞/mlの範囲またはそれ未満であろ
う。続いて細胞を所望の密度に達するまで、および／ま
たは十分な生成物が蓄積するまで培養する。
培養中の所望の生成物の産生は問題となっている特定
の生成物のための適切なアッセーを用いてモニターする
ことができる。したがって、例えば生成物がポリペプチ
ドまたは蛋白質である場合、このものの産生は一般的な
アッセー技術、例えば特定のポリペプチドまたは蛋白質
と使用できるようにした酵素結合免疫吸着アッセーまた
は放射性免疫アッセーによってモニターできる。
本発明の方法で得られた細胞生成物を分離することを
望む場合は、これは慣用的な分離および精製技術を用い
て達成することができる。したがって、例えば該生成物
が培地中に細胞によって分泌される場合は、遠心分離お
よび濾過のような技術を用いて細胞から分離し、続いて
例えば親和性精製技術（例えばアフィニティークロマト
グラフィー）を用いてさらに精製することができる。生
成物が細胞によって分泌されない場合は、細胞をまず溶
解させ、該生成物を遊離させた後、上記の方法を用いる
ことができる。
図面の簡単な説明 本発明を添付の図表を参考に以下の実施例によって詳
述する。
図１−４はトロポロンおよび種々の他のキレーターの
存在下におけるマウスハイブリドーマ細胞の増殖を示
す。
図５および６はトロポロンの存在下でのマウスNS/O細
胞の増殖を示す。
具体例の説明 以下の実施例は本発明を詳述する。
実施例１ １μg/mlのヒトトランスフェリンを含む血清非含有培
地で予め継代培養したマウスハイブリドーマ細胞系を遠
心分離し、トランスフェリン非含有培地に２度再浮遊し
た。最終的に0.1mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウムを
含むトランスフェリン非含有培地に1.5×105細胞/mlの
密度で細胞を再浮遊させた。
100倍の濃度の被験鉄キレーター（８−ヒドロキシキ
ノリン、トロポロン、ミモシン、マルトール、ピコリン
酸）を水で調製し濾過滅菌した。10μｌの各鉄キレータ
ーを24ウェルコースタープレートのウェルに分散させ、
続いて1mlの細胞浮遊液を加えた。
アセチルアセトンをエタノール中の0.05Mの原液とし
て調製し、２μｌを組織培養ウェルに分散させた。その
後1mlの細胞浮遊液を加えた。コントロールのウェルは1
0μｌの水（陰性コントロール）または100μg/mlのヒト
トランスフェリン溶液の10μｌ（陽性コントロール）の
いずれかを含んでいた。
プレートを36.5℃静止状態で５％CO2−95％空気雰囲
気下で湿潤インキュベーターで３日間培養した。
３日後に個々のウェルの分散細胞浮遊液サンプルをコ
ールターマルチサイザー（Coulter Multisizer）を用い
て分析し、細胞濃度を求めた。
図1Aは、３μＭのトロポロンが、0.36μＭの鉄（≡0.
1mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウム）の存在下での細
胞増殖支援において１μg/mlのヒトトランスフェリンと
同じ効果があることを示している。他の親油性キレータ
ーは0.03−３μＭの濃度ではトランスフェリン非存在下
で細胞増殖を支援しなかった。
図1Bは、５μＭのトロポロンは細胞増殖支援に効果が
あったが、一方100μＭのアセチルアセトンおよび50μ
Ｍのピコリン酸はずった効果が小さかったことを示す。
ピコリン酸およびアセチルアセトンのこの濃度は予備実
験で最適なものとして選ばれた（データは提示せず）。
すべての培地は0.1mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウ
ムを含んでいた。
実施例２ 方法 予めヒトトランスフェリンを含む血清非含有培地で継
代培養したマウスハイブリドーマ細胞系を遠心分離し、
1.5×105細胞/mlの密度でトランスフェリン非含有また
はトランスフェリン含有血清非含有培地に再浮遊させ
た。すべての培地は0.1、１、又は10mg/lの添加クエン
酸第二鉄アンモニウムを含んでいた。このフラスコに５
％CO2−95％空気雰囲気で通気し密封して、静止状態ま
たは交互軌道型（orbital reciprocal）撹拌台（120rp
m）で36.5℃で３日間培養した。その後サンプルを取り
出し、細胞濃度を血球測定法で求めた。
結果 図2Aは、10mg/lまでのクエン酸第二鉄アンモニウムの
濃度の増加は、静止培養においてトランスフェリン非含
有培地中の細胞濃度の増加を支援することを示してい
る。しかし図2Bは、撹拌培養（交互撹拌台）では、1mg/
lより高いクエン酸第二鉄アンモニウムの濃度はトラン
スフェリンの存在下または非存在下ともに有毒であるこ
とを明らかにした。
実施例３ マウスハイブリドーマ細胞系を1mg/lのヒトトランス
フェリンおよび0.01mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウム
を含む血清非含有自家製培地（図3b）、または５μＭの
トロポロンおよび0.1mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウ
ムを含む蛋白非含有自家製培地（図3a）で継代培養し
た。各培地で該細胞系の通気撹拌型（agitated,sparge
d）バッチ式培地補給発酵を実施した。
図3aおよび図3bは、通気撹拌型ファーメンターシステ
ムではトロポロン（図3a）またはトランスフェリン（図
3b）のいずれを用いても、類似の細胞増殖および生成特
性が認められることを明らかにした。
実施例４ マウスハイブリドーマ細胞系を0.1mg/lのクエン酸第
二鉄アンモニウムおよび５μＭトロポロンを含むトラン
スフェリン非含有培地で継代培養した。細胞を遠心分離
し、0.01mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウムおよび５μ
Ｍのトロポロンを含む培地に1.5×105細胞/mlの密度で
Ｔ−25フラスコ中に再浮遊させた。余分のクエン酸第二
鉄アンモニウムをフラスコに加え、0.01−2mg/lの範囲
の濃度にした。フラスコに５％CO2−95％空気雰囲気で
通気し交互撹拌台（120rpm）で３日間36.5℃で培養し
た。
３日後サンプルをフラスコから取り出し、コールター
マルチサイザーを用いて細胞濃度を求めた。
結果 ３日間の増殖後の細胞濃度は鉄濃度、細胞増殖率およ
び最大バイオマス量の結合関数である。したがって、最
大バイオマス量は0.075−1mg/lのクエン酸第二鉄アンモ
ニウムの範囲で得られたが（増殖収量は3.3×107細胞／
μｇクエン酸第二鉄アンモニウムである（データーは提
示せず））、最大増殖率（図４）は0.15−0.5mg/lのク
エン酸第二鉄アンモニウムで認められる。
実施例５ トランスフェリン代替物としてのトロポロン使用の効
果を、さらに組換え体（recombinant）のGS−ミエロー
マ細胞系［マウスNS/O］を用いて調べた。この細胞系は
グルタミン合成酵素（GS）発現系を用いてヒト化（huma
nised）抗体を発現している［Bebbingtonら、Bio/Techn
ology,10,169−175;欧州特許公開256055号公報］。異な
る抗体を産生する３種の組換え体細胞系を、0.2mg/lの
クエン酸第二鉄アンモニウムおよび、５μＭのトロポロ
ンまたは1mg/lのトランスフェリンのいずれかを含む培
地で浮遊培養として増殖させた。最高生細胞濃度と同
様、増殖速度はいずれの培地でも類似していた。３種の
細胞系のすべてについて、トランスフェリンがトロポロ
ンで置換されたとき、該曲線の終末点の抗体濃度は類似
していた（表１参照）。トロポロンまたはトランスフェ
リンのいずれかの非存在下、0.2mg/lのクエン酸第二鉄
アンモニウムの存在下では、ミエローマ細胞は増殖する
ことができず、48時間以内に死滅した。
実施例６ マウスミエローマ細胞系［GS−NSO、実施例５参照］
を0.2mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウムおよび５μＭ
のトロポロンを含むトランスフェリン非含有培地で継代
培養した。細胞を遠心分離し、0.2mg/lのクエン酸第二
鉄アンモニウムおよび５μＭのトロポロンを含む蛋白非
含有培地［LS1］に２×105細胞/mlの密度で撹拌フラス
コに再浮遊した。フラスコに５％CO2−95％空気雰囲気
で通気し、軌道撹拌台（120rpm）で36.5℃で培養した。
図５は得られた細胞増殖を示している。
LS1は、コレステロールおよび脂肪酸と複合化した２
−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（HPB;
1.2g/l）［LS1に添加する前に水にHPB（0.6mg/l）を溶
解し、等容量の補充物（予め無水アルコールに溶解した
コレステロールおよび脂肪酸を含む）に加え、続いて３
時間撹拌しその後遠心分離および濾過することによって
調製］をさらに含んでいる。コントロールとして、コレ
ステロールおよび脂肪酸を補充し、さらに0.2mg/lのク
エン酸第二鉄アンモニウムおよび５μＭのトロポロンを
含むがHPBの代わりにウシ血清アルブミン（BSA）を用い
たLS1培地で同じ細胞を増殖させた。図５は、トロポロ
ンは両方の培養の増殖を支援することができ、さらに、
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンはコ
レステロールおよび脂肪酸のための担体としてウシ血清
アルブミンの有効な代替物であることを示している。
図６は、5Lのエアーリフト式ファーメンターでの同じ
ミローマ細胞系の0.2mg/lのクエン酸第二鉄アンモニウ
ムおよび５μＭのトロポロンを含むLS1培地を用いたと
きの増殖を示す。

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】炭素、窒素、アミノ酸、無機イオン、微量
    元素および任意に脂質の同化源並びに成長促進物質また
    は調節物質を２−ヒドロキシ−2,4,6−シクロヘプタト
    リエン−１−オンまたはその１つ以上の環炭素原子が脂
    肪族、芳香族又は複素芳香族基で置換された誘導体と混
    合された状態で含む動物細胞培養栄養培地。
  2. 【請求項２】２−ヒドロキシ−2,4,6−シクロヘプタト
    リエン−１−オンまたはその１つ以上の環炭素原子が脂
    肪族、芳香族又は複素芳香族基で置換された誘導体が、
    含まれている鉄に対して過剰のモル濃度で存在する、請
    求の範囲第１項に記載の培地。
  3. 【請求項３】２−ヒドロキシ−2,4,6−シクロヘプタト
    リエン−１−オンまたはその１つ以上の環炭素原子が脂
    肪族、芳香族又は複素芳香族基で置換された誘導体およ
    び鉄が、およそ5:1からおよそ70:1のモル比で存在す
    る、請求の範囲第２項に記載の培地。
  4. 【請求項４】動物細胞の持続的増殖のための先行する請
    求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の培地。
  5. 【請求項５】前記動物細胞が哺乳類細胞である、請求の
    範囲第４項に記載の培地。
  6. 【請求項６】前記哺乳類細胞がリンパ球細胞である、請
    求の範囲第５項に記載の培地。
  7. 【請求項７】前記リンパ球細胞がミエローマ細胞であ
    る、請求の範囲第６項に記載の培地。
  8. 【請求項８】請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記
    載の蛋白質非含有動物細胞培養培地。
  9. 【請求項９】細胞培養によって動物細胞生成物を得る方
    法であって、該細胞培養は、 （１）該生成物を産生する動物細胞を、炭素、窒素、ア
    ミノ酸、鉄および他の無機イオン、微量元素および任意
    に脂質の同化源並びに成長促進物質または調節物質を２
    −ヒドロキシ−2,4,6−シクロヘプタトリエン−１−オ
    ンまたはその１つ以上の環炭素原子が脂肪族、芳香族又
    は複素芳香族基で置換された誘導体と混合された状態で
    含む栄養培養培地で培養する工程と、 （２）該生成物が蓄積されるまで該培養を継続する工程
    と、 （３）該生成物を回収する工程とを含む細胞培養によっ
    て動物細胞生成物を得る方法。
JP50431894A 1992-07-24 1993-07-26 動物細胞培養 Expired - Lifetime JP3221681B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9215834A GB9215834D0 (en) 1992-07-24 1992-07-24 Cell culture
GB9215834.4 1992-07-24
PCT/GB1993/001572 WO1994002592A1 (en) 1992-07-24 1993-07-26 Animal cell culture

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH06511389A JPH06511389A (ja) 1994-12-22
JP3221681B2 true JP3221681B2 (ja) 2001-10-22

Family

ID=10719290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP50431894A Expired - Lifetime JP3221681B2 (ja) 1992-07-24 1993-07-26 動物細胞培養

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6593140B1 (ja)
EP (1) EP0610474B1 (ja)
JP (1) JP3221681B2 (ja)
AT (1) ATE207115T1 (ja)
AU (1) AU677960B2 (ja)
CA (1) CA2116221C (ja)
DE (1) DE69330945T2 (ja)
DK (1) DK0610474T3 (ja)
ES (1) ES2165368T3 (ja)
GB (1) GB9215834D0 (ja)
PT (1) PT610474E (ja)
WO (1) WO1994002592A1 (ja)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4330597A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US6767741B1 (en) 1999-08-27 2004-07-27 Invitrogen Corporation Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions
IL136232A0 (en) * 2000-05-18 2001-05-20 Bar Ilan University Res Author Measurements of enzymatic activity in a single, individual cell in population
WO2003035824A1 (en) * 2001-10-25 2003-05-01 Bar-Ilan University Interactive transparent individual cells biochip processor
IL154677A0 (en) * 2003-02-27 2003-09-17 Univ Bar Ilan A method and apparatus for manipulating an individual cell
US7888110B2 (en) * 2003-06-26 2011-02-15 Seng Enterprises Ltd. Pico liter well holding device and method of making the same
EP1654347B1 (en) * 2003-06-26 2014-06-04 Seng Enterprises Limited Improved materials for constructing cell-chips, cell-chip covers, cell-chip coats, processed cell-chips and uses thereof
US9200245B2 (en) 2003-06-26 2015-12-01 Seng Enterprises Ltd. Multiwell plate
US8597597B2 (en) 2003-06-26 2013-12-03 Seng Enterprises Ltd. Picoliter well holding device and method of making the same
US7982751B2 (en) * 2003-07-11 2011-07-19 The University Of North Carolina Methods and systems for controlling a computer using a video image and for combining the video image with a computer desktop
KR101050176B1 (ko) * 2003-08-08 2011-07-19 메디뮨 리미티드 트랜스페린 무함유 및 저농도의 철 함유 배지 중에서의골수종 세포 배양
GB2404665B (en) * 2003-08-08 2005-07-06 Cambridge Antibody Tech Cell culture
US20050064524A1 (en) * 2003-08-11 2005-03-24 Mordechai Deutsch Population of cells utilizable for substance detection and methods and devices using same
GB0319451D0 (en) * 2003-08-19 2003-09-17 Lonza Biologics Plc Tropolone assay
BRPI0506610A (pt) * 2004-02-03 2007-05-02 Chemagis Ltd montelucaste sódico amorfo, processo de preparação de montelucaste sódico amorfo, composição farmacêutica, método de tratamento utilizando a administração de montelucaste sódico amorfo, co-precipitado amorfo de montelucaste sódico e processo de preparação de co-precipitado amorfo de montelucaste sódico
US7403647B2 (en) * 2004-09-13 2008-07-22 Seng Enterprises Ltd. Method for identifying an image of a well in an image of a well-bearing component
US20080063251A1 (en) * 2004-07-07 2008-03-13 Mordechai Deutsch Method and Device for Identifying an Image of a Well in an Image of a Well-Bearing
WO2006021959A2 (en) * 2004-08-25 2006-03-02 Seng Enterprises Ltd. Method and device for isolating cells
DK2368975T3 (en) 2004-12-23 2015-01-05 Medimmune Llc Non-tumorigenic MDCK cell line for the propagation of viruses
ES2352344T3 (es) 2005-01-25 2011-02-17 Seng Enterprises Limited Dispositivo de microfluido para estudio de células.
US20070004036A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for keratinocyte culture
US20070003541A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for therapeutics
US20070128685A1 (en) * 2005-07-01 2007-06-07 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for cell culture
US20070141555A1 (en) * 2005-10-11 2007-06-21 Mordechai Deutsch Current damper for the study of cells
US8288120B2 (en) * 2005-11-03 2012-10-16 Seng Enterprises Ltd. Method for studying floating, living cells
US20060223999A1 (en) * 2006-05-10 2006-10-05 Chemagis Ltd. Process for preparing montelukast and precursors thereof
RU2487935C2 (ru) 2006-09-15 2013-07-20 Медиммун, Ллк. Линии клеток почки собаки майдин-дэрби (mdck), поддерживающие рост вирусов до высоких титров, и способ применения этих клеток в биореакторе
ITMI20061770A1 (it) * 2006-09-18 2008-03-19 Carlo Ghisalberti Metodo cosmetico di riduzione delle occhiaie
GB0710614D0 (en) 2007-06-04 2007-07-11 Lonza Biologics Plc Mammalian expression vector with a highly efficient secretory signal sequence
US9145540B1 (en) 2007-11-15 2015-09-29 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
EP2237887A2 (en) 2007-12-26 2010-10-13 Seng Enterprises Ltd. Device for the study of living cells
AU2009296628B2 (en) 2008-09-24 2015-01-15 Medimmune, Llc Methods for purification of viruses
US20140322758A1 (en) 2011-10-21 2014-10-30 Pfizer Inc. Addition of iron to improve cell culture

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4816401A (en) 1985-09-09 1989-03-28 University Of Rochester Serum free cell culture medium
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
NO162160C (no) 1987-01-09 1989-11-15 Medi Cult As Serumfritt vekstmedium, samt anvendelse derav.
EP0435911B1 (en) 1988-09-23 1996-03-13 Cetus Oncology Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression

Also Published As

Publication number Publication date
PT610474E (pt) 2002-04-29
DE69330945D1 (de) 2001-11-22
EP0610474B1 (en) 2001-10-17
WO1994002592A1 (en) 1994-02-03
CA2116221A1 (en) 1994-02-03
ATE207115T1 (de) 2001-11-15
AU4716493A (en) 1994-02-14
DK0610474T3 (da) 2001-12-03
AU677960B2 (en) 1997-05-15
GB9215834D0 (en) 1992-09-09
JPH06511389A (ja) 1994-12-22
DE69330945T2 (de) 2002-06-20
EP0610474A1 (en) 1994-08-17
US6593140B1 (en) 2003-07-15
CA2116221C (en) 2005-05-31
ES2165368T3 (es) 2002-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3221681B2 (ja) 動物細胞培養
JP2783294B2 (ja) 増強された細胞増殖、培養寿命および生産物発現のための細胞培養培地
Ham et al. [5] Media and growth requirements
US4533637A (en) Culture medium
US6048728A (en) Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US20150329830A1 (en) Myeloma cell culture in transferrin-free low iron medium
CN102317440B (zh) 改进的培养基添加剂及其应用方法
Shacter Serum-free media for bulk culture of hybridoma cells and the preparation of monoclonal antibodies
Shintani et al. Polyethylene glycols for promoting the growth of mammalian cells
Shirai et al. Growth kinetics of hybridoma cells in high density culture
KR101050176B1 (ko) 트랜스페린 무함유 및 저농도의 철 함유 배지 중에서의골수종 세포 배양
JP2749011B2 (ja) 無血清培地で増殖継代可能な細胞およびその取得方法
EP0172178B1 (en) Method for cell culture
JP3375140B2 (ja) モノクローナル抗体生産用培地の作製法及びそのキット
JPS6163284A (ja) 動物細胞の培養方法
JP3239446B2 (ja) 細胞培養用無血清又は低血清培地
JPS63141584A (ja) 細胞培養用培地
CA1198701A (en) Animal cell culture medium containing cyclodextrin
Schlaeger et al. Improvement of mammalian cell fed-batch culture
Weiss et al. Enhancement of Biological Productivity in Serum-Free Culture
JP2525436C (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070817

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080817

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090817

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100817

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110817

Year of fee payment: 10

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120817

Year of fee payment: 11

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130817

Year of fee payment: 12

EXPY Cancellation because of completion of term