CN115109752A - 神经干细胞培养基、冻存液以及神经干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种神经干细胞培养基、冻存液以及神经干细胞的制备方法。所述神经干细胞培养基包含基础培养基以及FBS、L‑谷氨酰胺、D‑葡萄糖、ng/mL表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、孕酮、腐氨、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、Human Noggin、SB4315422和烟酰胺；所述基础培养基包含DMEM培养基和F12培养基。采用该特定配方的神经干细胞培养基对神经干细胞进行培养，能够实现神经干细胞的高效扩增，且扩增所得神经干细胞保持良好的干性，克服传统神经干细胞存在短期扩增量低、容易分化导致干性丧失的缺陷。

Description

神经干细胞培养基、冻存液以及神经干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学、神经生物学领域，特别是涉及一种神经干细胞培养基、冻存液以及神经干细胞的制备方法。
背景技术
中枢神经系统损伤一度被认为是一种难以修复的疾病，临床上采用的治疗方法只能改善患者症状，减少并发症的发生，并不能从根本上改善患者功能。近些年，随着再生医学的不断发展，研究人员发现通过移植神经干细胞可以有效的改善患者症状。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)具有自我更新及增殖能力，并具有多向分化潜能，因而被应用于中枢神经系统再生修复当中。临床上已有将神经干细胞应用于多种人神经系统损伤疾病治疗并取得很好疗效的报道。
尽管神经干细胞在中枢神经系统损伤中具有一定的修复作用，但是仍有许多问题亟待解决。首先，来源于引产的胚胎组织NSCs采用常规体外培养方法体外扩增效率较低，所获得神经干细胞数量有限，如需进行临床治疗研究，通常需要获得多个胚胎组织样本，如此存在较大的伦理学争议风险，同时不同样本来源的细胞其生物学性状存在差异，由此导致的结果也存在一定的变异性，因而影响了科学数据的准确性。另外，由于神经干细胞的单克隆形成能力低下，通常方法由一个神经干细胞进行贴壁培养或成球培养所获得的细胞效率较低，而由多个神经干细胞培养后获得的贴壁细胞或细胞球由于来源于多个细胞，细胞起始的不均一性更大，如此为之后的基础或临床研究增加难度。
短期内实现神经干细胞快速扩增有助于我们进一步进行神经干细胞移植治疗神经系统疾病的相关研究，但目前报道的快速增殖方法均基于转基因技术，即将与永生化相关的基因如端粒酶基因或原癌基因稳定转染神经干细胞，从而获得可以长期培养的神经干细胞。转基因技术可能会改变神经干细胞的部分生物学性状，甚至产生致瘤性，给研究带来风险与变数。因此，通过非转基因技术手段实现快速高效扩增神经干细胞有助于获得治疗神经系统疾病的准确研究结果。
如果可以建立高效扩增神经干细胞的方法，实现从一个样本中获得足够可供临床治疗研究的神经干细胞，且这些神经干细胞生物学性状维持不变，就能有效避免采用多个样本来源的神经干细胞进行临床治疗研究产生的技术问题和伦理问题以及规避基因技术手段扩增神经干细胞存在的风险。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明实施例的目的包括提供一种神经干细胞培养基，采用该神经干细胞培养基能够实现神经干细胞的高效扩增。
本发明实施例的目的可以通过以下技术方案实现：
在本发明的第一方面，提供一种神经干细胞培养基，所述神经干细胞培养基包含基础培养基以及8％-12％(v/v)FBS、0.8wt％-1.3wt％L-谷氨酰胺、1g/L-2g/L D-葡萄糖、18ng/mL-23ng/mL表皮生长因子、17ng/mL-22ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、80μg/mL-120μg/mL转铁蛋白、18nmol/L-22nmol/L孕酮、5μmol/L-15μmol/L腐氨、25nmol/L-35nmol/L亚硒酸钠、21μg/mL-29μg/mL胰岛素、4.5μg/mL-5.6μg/mL肝素、75ng/mL-125ng/mL HumanNoggin、1μM-5μM SB4315422和3mM-10mM烟酰胺；
所述基础培养基包含DMEM培养基和F12培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为1：(0.5-1.5)。
在本发明的一些实施方式中，所述神经干细胞培养基还包含100×青霉素-链霉素溶液，所述100×青霉素-链霉素溶液的浓度为0.8％-1.3％(v/v)。
在本发明的第二方面，提供一种神经干细胞的制备方法，所述制备方法包括：采用第一方面所述的神经干细胞培养基对神经干细胞进行原代培养或/和传代培养，制备神经干细胞。
在本发明的一些实施方式中，传代培养的步骤包括：
将所述神经干细胞悬于所述神经干细胞培养基中培养至汇合度达到80％-90％，弃原培养基，清洗，用神经干细胞消化液消化，吹打，收集分散细胞；
将所述分散细胞重悬于新鲜的所述神经干细胞培养基培养中传代培养。
在本发明的一些实施方式中，传代培养的代数为4代-7代。
在本发明的一些实施方式中，传代培养1.5天-3天后，开始更换新鲜的所述神经干细胞培养基培养，更换的频率为每1.5天-3天更换1次。
在本发明的一些实施方式中，原代培养的步骤包括：将从离体组织分离的神经干细胞悬于所述神经干细胞培养基进行原代培养，当汇合度达到80％-90％，弃培养基，清洗，制备原代培养产物。
在本发明的一些实施方式中，所述原代培养产物经细胞消化液消化、吹打和清洗后制备的分散原代培养细胞用于传代培养。
在本发明的一些实施方式中，清洗采用的清洗液为PBS缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述神经干细胞为人源脊髓神经干细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括对制备得到的神经干细胞进行冻存的步骤，冻存采用的冻存液包含第一方面所述的神经干细胞培养基以及PBS和二甲基亚砜。
在本发明的一些实施方式中，所述的神经干细胞培养基、PBS和二甲基亚砜的体积比为5-7：2.5-3.5：1。
在本发明的第三方面，提供一种神经干细胞冻存液，所述神经干细胞冻存液包含第一方面所述的神经干细胞培养基以及PBS和二甲基亚砜。
在本发明的一些实施方式中，所述的神经干细胞培养基、PBS和二甲基亚砜的体积比为5-7：2.5-3.5：1。
相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：
本发明对神经干细胞培养基进行整体优化，包括同时加入小分子Human Noggin、SB431542、烟酰胺并选择合适的腐胺用量，从而形成特定的神经干细胞培养基配方，采用该特定配方的神经干细胞培养基对神经干细胞进行培养，能够实现神经干细胞的高效扩增，且扩增所得神经干细胞保持良好的干性，克服传统神经干细胞存在短期扩增量低、容易分化导致干性丧失的缺陷。
本发明提供的神经干细胞培养基，仅添加FBS一种动物源性物质，其余成分明确，内毒素含量较低，降低致瘤性。
采用本发明提供的神经干细胞培养基扩增神经干细胞，能够基于同一组织样本获得足够量的所需神经干细胞，细胞稳定，在后续应用过程(例如研究)中误差降低。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中在普通光学倒置显微镜下观察贴壁培养的神经干细胞形态图；图中，神经干细胞呈梭形；
图2为实施例1中神经干细胞标志物Nestin和SOX2染色图；图中染色结果为阳性；
图3为实施例1中神经干细胞KI67染色图；图中，染色结果为阳性；
图4为实施例1中将初始量为5×103个细胞接种于细胞培养板后，显微镜下观察细胞连续培养6代形态变化图；
图5为实施例1中神经干细胞连续传代细胞增殖情况统计分析图；
图6为实施例1中克隆分析神经干细胞系可以由单个神经干细胞扩增获得结果图；
图7为实施例1中神经干细胞随机分化为神经元(MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(O4)免疫荧光结果；
图8为实施例1中神经干细胞分化为运动神经元(Hb9,Islet1/2,CHAT)以及中间神经元(Lmx1b,TLX3,SOX21)免疫荧光结果；
图9为实施例1中神经干细胞长期传代后仍维持脊髓特定位置特性；
图10为实施例1中神经干细胞长期传代后仍维持神经干细胞相关蛋白表达；
图11为实施例1中适用样本验证结果图；
图12为实施例1中采用传统培养基和本发明培养基的培养效果比较图；
图13为实施例2的培养效果图；
图14为实施例3的培养效果图；
图15为对比例1的培养效果图；
图16为对比例2的培养效果图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
传统的扩增神经干细胞的技术例如：CN130451153A记载的一种临床级神经干细胞系的建立方法，包括神经干细胞原代培养和神经干细胞传代培养两个步骤，其中，
原代培养所采用的神经干细胞原代培养基由基础培养基、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、转铁蛋白、孕酮、腐胺、硒酸钠、胰岛素、肝素组成，其中，所述B27为1×；表皮生长因子浓度15-25ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子浓度15-25ng/mL，白血病抑制因子浓度7-13ng/mL，转铁蛋白浓度50-150μg/mL，孕酮10-30nmol/L，腐胺50-150μmol/L，硒酸钠20-40nmol/L，胰岛素10-49μg/mL，肝素3-10μg/mL，所述基础培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为体积比(1-3)∶1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/100mL；
传代培养所采用的神经干细胞传代培养基由基础培养基、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、转铁蛋白、孕酮、腐胺、硒酸钠、胰岛素、肝素组成，其中，表皮生长因子浓度15-25ng/ml，碱性成纤维细胞生长因子浓度15-25ng/ml，白血病抑制因子浓度7-13ng/ml，转铁蛋白浓度50-150μg/ml，孕酮10-30nmol/L，腐胺50-1500μmol/L，硒酸钠20-40nmol/L，胰岛素10-49μg/ml，肝素3-10μg/ml，所述基础培养基由DMEM、F12、HEPES和D-葡萄糖组成，其中，DMEM和F12比例为(1-3)∶1，HEPES浓度为10-20mmol/L，D-葡萄糖浓度为质量/体积比1-2g/100ml。
该传统技术存在样本来源受限以及扩增效率低的问题：首先，该传统技术集中于9周内流产胎儿分离的脊髓神经干细胞培养，大于9周的流产胎儿样本来源的脊髓神经干细胞体外扩增鲜有报道；其次，该传统方法培养的细胞第一次传代在细胞分离第16天，按照1：2-1：5传代，体外扩增效率较低。
相较于该传统技术，本发明的培养基及制备方法能够实现7-22周流产胎儿脊髓神经干细胞体外扩增(见表2)，第一次传代时间为细胞分离后的5-6天，传代比率为1：20-1：25，扩增效率是传统方法的10-12.5倍，极大扩展了资源的利率。
本发明的第一方面
本发明提供一种神经干细胞培养基，所述神经干细胞培养基包含基础培养基以及8％-12％(v/v)FBS、0.8wt％-1.3wt％L-谷氨酰胺、1g/L-2g/L D-葡萄糖、18ng/mL-23ng/mL表皮生长因子、17ng/mL-22ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、80μg/mL-120μg/mL转铁蛋白、18nmol/L-22nmol/L孕酮、5μmol/L-15μmol/L腐氨、25nmol/L-35nmol/L亚硒酸钠、21μg/mL-29μg/mL胰岛素、4.5μg/mL-5.6μg/mL肝素、75ng/mL-125ng/mL Human Noggin、1μM-5μMSB4315422和3mM-10mM烟酰胺；
所述基础培养基包含DMEM培养基和F12培养基。
在本发明的一些实施方式中，所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为1：(0.5-1.5)，例如为1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5。
在本发明的一些实施方式中，所述神经干细胞培养基还包含100×青霉素-链霉素溶液，所述100×青霉素-链霉素溶液的浓度为0.8％-1.3％(v/v)，例如为0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％。
本发明的第二方面
本发明提供一种神经干细胞的制备方法，所述制备方法包括：采用第一方面所述的神经干细胞培养基对神经干细胞进行原代培养或/和传代培养，制备神经干细胞。
在本发明的一些实施方式中，传代培养的步骤包括：
将所述神经干细胞悬于所述神经干细胞培养基中培养至汇合度达到80％-90％，弃原培养基，清洗，用神经干细胞消化液消化，吹打，收集分散细胞；
将所述分散细胞重悬于新鲜的所述神经干细胞培养基培养中传代培养。
在本发明的一些实施方式中，传代培养的代数为4代-7代，例如为4代、5代、6代、7代。
在本发明的一些实施方式中，传代培养1.5天-3天(例如1.5天、2.0天、2.5天、3天)后，开始更换新鲜的所述神经干细胞培养基培养，更换的频率为每1.5天-3天(例如1.5天、2.0天、2.5天、3天)更换1次。
在本发明的一些实施方式中，原代培养的步骤包括：将从离体组织分离的神经干细胞悬于所述神经干细胞培养基进行原代培养，当汇合度达到80％-90％，弃培养基，清洗，制备原代培养产物。
在本发明的一些实施方式中，所述原代培养产物经细胞消化液消化、吹打和清洗后制备的分散原代培养细胞用于传代培养。
在本发明的一些实施方式中，清洗采用的清洗液为PBS缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述神经干细胞为人源脊髓神经干细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述制备方法还包括对制备得到的神经干细胞进行冻存的步骤，冻存采用的冻存液包含第一方面所述的神经干细胞培养基以及PBS和二甲基亚砜。
在本发明的一些实施方式中，所述的神经干细胞培养基、PBS和二甲基亚砜的体积比为5-7：2.5-3.5：1，例如为5:3.5:1、7:2.5:1、6:3:1。
本发明制备的神经干细胞，以及由其分化得到的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，能应用于治疗神经系统疾病药物中，所述神经系统疾病包括但不限于：脑性瘫痪、脑白质损伤、缺氧缺血性脑损伤、脊髓性肌萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓损伤和智力发育迟滞。
本发明的第三方面
本发明提供一种神经干细胞冻存液，所述神经干细胞冻存液包含第一方面所述的神经干细胞培养基以及PBS和二甲基亚砜。
在本发明的一些实施方式中，所述的神经干细胞培养基、PBS和二甲基亚砜的体积比为5-7：2.5-3.5：1，例如为5:3.5:1、7:2.5:1、6:3:1。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1
一、本实施例中所用各种液体及组织说明如下：
1.神经干细胞培养基
所述神经干细胞培养基由DMEM、F12、FBS(胎牛血清)、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、D-葡萄糖、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素、小分子抑制剂Human Noggin(重组人头蛋白)、SB431542和烟酰胺组成，其中DMEM和F12的体积比为1：1，以在所述神经干细胞培养基中的用量计：FBS的体积占比为10％(v/v)，L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素的体积占比均为1％(v/v)，D-葡萄糖浓度为1.56g/L，表皮生长因子浓度为20ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子浓度为20ng/mL，转铁蛋白浓度为100μg/mL，孕酮浓度为20nmol/L，腐氨浓度为10μmol/L，亚硒酸钠浓度为30nmol/L，胰岛素浓度为25μg/mL，肝素浓度为5μg/mL，Human Noggin浓度为100ng/mL，SB4315422浓度为2μm，烟酰胺浓度为6mM。
2.神经干细胞冻存液
神经干细胞冻存液由神经干细胞培养基、FBS和二甲基亚砜组成；
其中，神经干细胞培养基由DMEM、F12、FBS、L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、D-葡萄糖、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、胰岛素、肝素，小分子抑制剂Human Noggin、SB431542和烟酰胺组成，DMEM和F12的体积比为1：1，以在所述神经干细胞培养基中的用量计：FBS的体积占比为10％(v/v)，L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素的体积占比均为1％，D-葡萄糖的浓度为1.56g/L，表皮生长因子浓度为20ng/mL，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为20ng/mL，转铁蛋白浓度为100μg/mL，孕酮浓度为20nmol/L，腐氨浓度为10μmol/L，亚硒酸钠浓度为30nmol/L，胰岛素浓度为25μg/mL，肝素浓度为5ug/mL，Human Noggin浓度为100ng/mL，SB4315422浓度为2μM，烟酰胺浓度为6mM；
神经干细胞培养基、FBS和二甲基亚砜的体积比为6：3：1。
3.其他液体说明
神经干细胞消化液购自Invitrogen公司，货号为A1110501。DMEM、F12为细胞培养中常见的培养基，可购自于商业公司，本实施中这两种培养基购自Invitrogen公司。DMEM货号为11960044，F12货号为11765054。FBS购自于Gibco公司，货号为10099141。L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素可购自于商业公司，本实施中购自Invitrogen公司，货号为L-谷氨酰胺(25030081)，青霉素-链霉素(15140122)。D-葡萄糖、孕酮、腐胺、亚硒酸钠、肝素、胰岛素、烟酰胺均可购自Sigma公司，货号分别为D-葡萄糖:G8270，孕酮：P0130，腐胺：P5780、亚硒酸钠：S5261、肝素：H3149、胰岛素：I2643、烟酰胺：N0636。表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、Human noggin是干细胞培养中常见的细胞因子，可购自于商业公司。本实施中购Peprotech公司，货号为：表皮生长因子AF-100-15，碱性成纤维生长因子AF-100-18B，Humannoggin96-120-10C-20。SB431542购自于Selleck公司，货号：S1067。
本发明中的FBS是Gibco原装进口产品(原产品编号为10099141)，产地澳大利亚。血源由美国农业部和欧盟所认证的无疯牛病区域的屠宰场所提供,Gibco胎牛血清从血液收集到最终产品检验和审核的每一个步骤，都采用专用设备和标准操作程序，保证高品质和各批次的一致性，可应用于临床治疗及研究工作。
4.关于胚胎来源细胞的伦理说明
神经干细胞来源的胚胎是自然流产的胚胎组织，属于医学上废弃的胚胎，并且家长完全知情同意，签署知情同意书。
建立一株神经干细胞系只需一个胚胎，建立细胞系后的细胞拥有快速高效的增殖能力，需要神经干细胞进行研究时无需再采集废弃胚胎，只需大量扩增神经干细胞即可。
根据卫生部2013年3月发布的《干细胞临床试验研究管理办法(试行)》(http://www.moh.gov.cn/mohkjjys/s3582/201303/824dda95d2c048c685160657cf8c18d c.shtml)中规定，来源于胎儿组织的细胞已经被允许作为临床试验研究的种子细胞，因此本方法采用胎儿脊髓来源细胞建立神经干细胞系符合当前卫生部的规定。
二、本实施包括以下步骤：
1.在完全知情同意告知下，无菌条件下分离无发育障碍流产胎儿的脊髓组织(本次实验脊髓组织来源于13周流产胎儿)，置于无菌的10cm平皿中，手术刀机械分离；
单个细胞来源的神经干细胞系建立方法如下：
采用流式细胞分离方法，将单细胞悬液接种到48孔板，使得每个孔只含有1个细胞，采用神经干细胞培养基进行培养；
2.将机械分离后的细胞悬液按1000转/分钟的离心速度离心5分钟以收集细胞；
3.将细胞重悬于神经干细胞培养基中；
4.将细胞悬液接种于10cm平皿中，置于细胞培养箱中培养；
5.当培养的神经干细胞达到80％-90％汇合度时，将神经干细胞培养基弃去，加入10ml PBS清洗一次，弃去PBS，再加入5ml神经干细胞消化液，置于37℃培养箱中消化2分钟，待可见细胞出现略微松散时，加入5mL神经干细胞培养液终止消化，使用5mL移液管轻轻吹打分散；
6.离心收集细胞，条件为1000转/分钟，5分钟；
7.取前一天预处理好的10cm培养皿，PBS洗三次；
8.用神经干细胞培养基重悬消化后的神经干细胞，按照1：20体积比传代接种于预处理的细胞培养皿；
9.将传代后的细胞培养皿置于细胞培养箱中培养；
10.换液：传代2天后，开始换液，吸弃细胞培养液，加入新鲜的预热细胞培养液，频率为2天/次；
11.重复步骤4-9方法进行神经干细胞传代培养，获得大量神经干细胞。
12.神经干细胞冻存
方法如下：
(1)细胞传代4-6天后进行细胞冻存，将神经干细胞收集至离心管中，1000转/分钟离心5分钟，收集细胞；
(2)将收集到的神经干细胞重悬于细胞冻存液中，冻存密度1×106/mL；
冻存液成分如下：
表1
组份 含量
神经干细胞培养基 6mL
FBS 3mL
DMSO(二甲基亚砜) 1mL
(3)、将冻存细胞置于异丙醇冻存盒中，-80℃过夜；
(4)、将细胞转移至液氮罐中长期保存。
13.神经干细胞鉴定
神经干细胞鉴定包括：神经干细胞形态鉴定、神经干细胞标志物免疫荧光染色、细胞增殖能力分析、神经干细胞自我更新能力鉴定、神经干细胞分化能力检测，长期传代后神经干细胞特性的维持。鉴定方法如下：
(1)细胞形态学鉴定：在普通光学倒置显微镜下观察贴壁培养的神经干细胞呈梭形，见附图1。
(2)神经干细胞标志物免疫荧光染色：细胞高效表达神经干细胞标志物Nestin和SOX2，见附图2。
(3)细胞增殖能力分析：免疫荧光染色细胞高效表达增殖相关标志物Ki67，见附图3。将初始量为5×103个细胞接种于细胞培养板中，可观察到细胞在第二天开始增殖，见附图4。
(4)神经干细胞连续传6代，1个月内可获得1.6×1010细胞量，见附图5。
(5)神经干细胞自我更新能力鉴定：利用流式分选技术分选单个细胞进行培养，细胞能够贴壁生长并且能够增殖，见附图6。
(6)神经干细胞分化能力检测：细胞传代第二天，弃去神经干细胞培养基，加入神经干细胞分化培养基(除FBS浓度下调为1％，其余组分相对于神经干细胞培养基不变)，两天换半液，10天后固定细胞，进行免疫荧光鉴定。神经干细胞可以分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，结果如图7。定向分化21天后可分化为运动神经元以及中间神经元，结果如图8。
(7)RNA-seq分析长期传代(9代)后细胞仍维持脊髓位置鉴定的同源框基因HOX基因，如图9；并维持神经干细胞相关基因的表达，如图10。
(8)神经干细胞致瘤性分析：神经干细胞传代后第二天进行致瘤实验，神经干细胞致瘤性采用NOD/SCID鼠皮下注射，采用胶质细胞瘤细胞系U251作为致瘤实验的阳性对照，结果显示没有致瘤性。
在培养过程中，观察神经干细胞的增殖分化能力和干细胞标志物的表达，并进行细胞长期培养后神经干细胞特性分析。所获得的神经干细胞为贴壁生长，形态呈梭形。将初始量为5×103个细胞贴壁培养，一个月内可获得1.6×1010个细胞，细胞倍增时间为4-6天，表达SOX2，Nestin等神经干细胞标志物，并高效表达细胞增殖相关蛋白ki67。体外可分化为GFAP、O4或MAP2阳性细胞，即可分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元，以及功能性神经元包括运动神经元表达Hb9、Islet1/2、CHAT蛋白；中间神经元表达Lmx1b、TLX3、SOX21蛋白。长期培养后细胞仍维持干细胞特性。
本实施例采用方法适用于GMP标准制备具备临床生物安全的NSCs细胞系，具有技术简便、无污染风险的特性。所获得的神经干细胞分化所得的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞作为治疗神经系统疾病药物中的应用，所述神经系统疾病包括：脑性瘫痪、脑白质损伤、缺氧缺血性脑损伤、脊髓性肌萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、脊髓损伤和智力发育迟滞。
14.适用样本验证
本发明提供的神经干细胞培养基及用其制备神经干细胞的方法能够实现7周-22周流产胎儿脊髓神经干细胞的体外扩增(见表2)，第一次传代时间为细胞分离后的5天，传代比率为1：20。
表2
Figure BDA0003737083630000121
Figure BDA0003737083630000131
结果见图11。根据图11可知，本发明的培养基及方法适用于各妊娠时间段的流产胎儿脊髓神经干细胞的体外扩增。
15.神经干细胞扩增数量
将初始细胞量为5×103个细胞分别置于传统培养基(NBM)以及本发明培养基(HSCM)中培养。
结果如图12所示，NBM传代比例为1：5传代，而HSCM传代比率为1：20，相较于传统培养基，本发明培养基有效的扩增了细胞数量。
实施例2
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处包括神经干细胞培养基中各成分的用量，具体见表3。培养结果见图13。
实施例3
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处包括神经干细胞培养基中各成分的用量，具体见表3。培养结果见图14。
神经干细胞培养基成分如下：
表3
Figure BDA0003737083630000132
Figure BDA0003737083630000141
对比例1和对比例2
对比例1相对于实施例1的差别在于神经干细胞培养基中采用LDN-193189代替Human Noggin。其中，LDN-193189(厂家：Selleck,货号：S2618)是与Human Noggin功能接近的物质，在用其替代Human Noggin之后的培养基中神经干细胞不能扩增，见图15。
对比例2相对于实施例1的差别主要包括神经干细胞培养基中采用CHIR-99021代替SB431542。其中，CHIR-99021(厂家：Selleck,货号：S2924)是与SB431542功能接近的物质，在用其替代SB431542之后的培养基中神经干细胞不能扩增，见图16。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (15)

1.一种神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基包含基础培养基以及8％-12％(v/v)FBS、0.8wt％-1.3wt％L-谷氨酰胺、1g/L-2g/L D-葡萄糖、18ng/mL-23ng/mL表皮生长因子、17ng/mL-22ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、80μg/mL-120μg/mL转铁蛋白、18nmol/L-22nmol/L孕酮、5μmol/L-15μmol/L腐氨、25nmol/L-35nmol/L亚硒酸钠、21μg/mL-29μg/mL胰岛素、4.5μg/mL-5.6μg/mL肝素、75ng/mL-125ng/mL Human Noggin、1μM-5μMSB4315422和3mM-10mM烟酰胺；
所述基础培养基包含DMEM培养基和F12培养基。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述DMEM培养基和F12培养基的体积比为1：(0.5-1.5)。
3.根据权利要求1或者2所述的神经干细胞培养基，其特征在于，所述神经干细胞培养基还包含100×青霉素-链霉素溶液，所述100×青霉素-链霉素溶液的浓度为0.8％-1.3％(v/v)。
4.一种神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：采用权利要求1至3任一项所述的神经干细胞培养基对神经干细胞进行原代培养或/和传代培养，制备神经干细胞。
5.根据权利要求4所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，传代培养的步骤包括：
将所述神经干细胞悬于所述神经干细胞培养基中培养至汇合度达到80％-90％，弃原培养基，清洗，用神经干细胞消化液消化，吹打，收集分散细胞；
将所述分散细胞重悬于新鲜的所述神经干细胞培养基培养中传代培养。
6.根据权利要求5所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，传代培养的代数为4代-7代。
7.根据权利要求5所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，传代培养1.5天-3天后，开始更换新鲜的所述神经干细胞培养基培养，更换的频率为每1.5天-3天更换1次。
8.根据权利要求4所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，原代培养的步骤包括：将从离体组织分离的神经干细胞悬于所述神经干细胞培养基进行原代培养，当汇合度达到80％-90％，弃培养基，清洗，制备原代培养产物。
9.根据权利要求8所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述原代培养产物经细胞消化液消化、吹打和清洗后制备的分散原代培养细胞用于传代培养。
10.根据权利要求5至9任一项所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，清洗采用的清洗液为PBS缓冲液。
11.根据权利要求4至9任一项所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述神经干细胞为人源脊髓神经干细胞。
12.根据权利要求4至9任一项所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对制备得到的神经干细胞进行冻存的步骤，冻存采用的冻存液包含权利要求1至3任一项所述的神经干细胞培养基以及PBS和二甲基亚砜。
13.根据权利要求12所述的神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述的神经干细胞培养基、PBS和二甲基亚砜的体积比为5-7：2.5-3.5：1。
14.一种神经干细胞冻存液，其特征在于，所述神经干细胞冻存液包含权利要求1至3任一项所述的神经干细胞培养基以及PBS和二甲基亚砜。
15.根据权利要求14所述的神经干细胞冻存液，其特征在于，所述的神经干细胞培养基、PBS和二甲基亚砜的体积比为5-7：2.5-3.5：1。
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