WO2023033149A1 - 内耳血管条辺縁細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び薬剤評価用細胞培養物 - Google Patents

内耳血管条辺縁細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び薬剤評価用細胞培養物 Download PDF

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WO2023033149A1
WO2023033149A1 PCT/JP2022/033140 JP2022033140W WO2023033149A1 WO 2023033149 A1 WO2023033149 A1 WO 2023033149A1 JP 2022033140 W JP2022033140 W JP 2022033140W WO 2023033149 A1 WO2023033149 A1 WO 2023033149A1
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WO
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cells
inner ear
marginal
insulin
cell
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PCT/JP2022/033140
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智香 三枝
正人 藤岡
栄之 岡野
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学校法人北里研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing inner ear marginal cells of the stria vascularis, a method for evaluating drugs, and a cell culture for drug evaluation.
  • Hearing loss is a disease that causes a significant decrease in QOL, but there is no fundamental treatment method yet. In recent years, hearing loss has also attracted attention as a risk factor for dementia, etc., and understanding the onset mechanism of hearing loss and establishing treatment methods are important and urgent issues.
  • rodents such as genetically modified mice, drug-administered mice, and rats have been mainly used as model animals for the analysis of the onset of hearing loss, but the phenotypes of rodent model animals do not necessarily match the pathology of humans.
  • Many examples have been reported, and the use of human cells and tissues for pathophysiological analysis has been particularly important in recent years.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the laboratory to which the inventors belong has also developed a method for inducing the differentiation of human iPS cells into inner ear cell-like cells (Patent Document 1), and using this, constructs a pathological analysis system for hearing loss called Pendred syndrome (PDS) and We are searching for therapeutic agents (Non-Patent Document 1).
  • PDS Pendred syndrome
  • Non-Patent Document 1 some of the candidate drugs obtained as a result of the search have been confirmed to be effective in physician-initiated clinical trials (clinical trial registration ID: UMIN000033083).
  • the stria vascularis is an essential tissue for maintaining the homeostasis of the ionic environment in the cochlea of the inner ear (Fig. 21, left).
  • One of the causes of this type of hearing loss is believed to be dysfunction of the stria vascularis.
  • marginal cells are cells that have essential functions in unidirectional ion transport and barrier formation between tissue and endolymph (see FIG. 21, right).
  • Makoto Hosoya MasatoFujioka, Takefumi Sone,Satoshi Okamoto, Wado Akamatsu,Hideki Ukai, Hiroki R. Ueda, Kaoru Ogawa, TatsuoMatsunaga, andHideyuki Okano ⁇ CochlearCell Modeling UsingDisease-Specific iPSCs Unveils a DegenerativePhenotypeand Suggests Treatments for Congenital Progressive Hearing Loss ⁇ Cell Reports 18 , 68-81, January 3, 2017.
  • an object of the present invention is to provide a technique for producing functional marginal cells of the stria vascularis interna, which may be applied to pathological analysis of hearing loss and drug screening.
  • a step of culturing a cell population containing inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells in an insulin-free medium containing no insulin or only a trace amount comprising:
  • a cell population containing inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells is cultured in an insulin-free medium containing no insulin or only a trace amount. Therefore, we can obtain functional marginal cells of the stria vascularis of the inner ear, which may be applied to pathological analysis of hearing loss and drug screening.
  • the insulin-free medium preferably has an insulin concentration of 0 nM or more and 100 nM or less. According to this, it is possible to more reliably induce differentiation into good-quality marginal cells of the stria vascularis.
  • the insulin-free medium contains EGF and further contains at least one or more selected from the group consisting of bFGF, FGF3, and BMP4. is preferred.
  • EGF contains FGF3 and BMP4 as the initial insulin-free medium during the suspension culture period. According to this, it is possible to more reliably induce differentiation into good-quality marginal cells of the stria vascularis.
  • the method for producing inner ear vascular striatum cells preferably includes the following steps (1) and (2).
  • a step of subjecting a cell population containing inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells to cell detachment/dispersion treatment (2) The cells or cell population obtained in step (1) are Floating culture in the insulin-free medium below
  • the extracellular matrix material is preferably at least one or more selected from the group consisting of matrigel, pronectin, collagen, laminin, and fibronectin.
  • the cell population containing inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells is subjected to cell detachment and dispersion treatment, so that cells not suitable for culture are eliminated, resulting in inner ear progenitor cells of good quality. can be more certain.
  • suspension culture in the presence of an extracellular matrix material has the effect of serving as a scaffold for differentiation into striatal marginal cells. As a result, good-quality inner ear stria vascular marginal cells can be obtained with good reproducibility.
  • the method for producing inner ear vascular striatum cells preferably includes the following steps (1) to (3).
  • a step of subjecting a cell population containing inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells to cell detachment/dispersion treatment (2) The cells or cell population obtained in step (1) are (3) A step of seeding the cells or cell populations after suspension culture in step (2) onto feeder cells previously adherently cultured and culturing them in the insulin-free medium.
  • the feeder cells are preferably melanocytes or melanocyte-like cells.
  • the cell population containing inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells is subjected to cell detachment and dispersion treatment, so that cells not suitable for culture are eliminated, resulting in inner ear progenitor cells of good quality. can be more certain.
  • the cells are cultured in suspension in an insulin-free medium in the presence of an extracellular matrix material, the presence of the extracellular matrix material has the effect of serving as a scaffold for differentiation into striatal marginal cells.
  • the marginal cells of the stria vascularis co-cultured with the adherently cultured feeder cells are also , promotes the formation of a structure (layered) in which stria vascular marginal cells are two-dimensionally cultured on the surface of the feeder cells.
  • two-dimensional culturing of good-quality inner ear stria vascular marginal cells can be performed with better reproducibility.
  • the cell population containing inner ear progenitor cells obtained by differentiation induction from the pluripotent stem cells includes the following steps (1) to (4). It is preferably obtained by a method.
  • Step of culturing pluripotent stem cells in the presence of a ROCK inhibitor without the addition of a growth factor (2) The cell population obtained in step (1) without the addition of a growth factor in the absence of a ROCK inhibitor (3) Culturing the cell population obtained in step (2) in the presence of at least one growth factor selected from the group consisting of bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19, and BMP4 Step (4) the cell population obtained in step (3) in the presence of at least one growth factor selected from the group consisting of bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19 and in the absence of BMP4 culturing process
  • the marginal cells of the striatum vascularis are obtained under serum-free conditions. According to this, the risk of differentiation into unintended cells due to serum factors can be suppressed.
  • the marginal cells of the striatum vascularis preferably express a potassium channel protein and a tight junction protein. According to this, the quality of the obtained cells to be functional marginal cells of the stria vascularis in the inner ear can be ensured, and thus good-quality marginal cells of the stria vascularis in the inner ear can be obtained with high reproducibility. .
  • the present invention provides a cell culture for drug evaluation, containing inner ear marginal cells of the stria vascularis, which are differentiated from inner ear progenitor cells.
  • the cell culture for drug evaluation since it contains inner ear marginal cells of the stria vascularis that are differentiated from inner ear progenitor cells, it is used to evaluate drugs that affect the marginal cells of the inner ear striatum vascularis. effectively and efficiently.
  • the present invention provides the production of inner ear vascular marginal cells, comprising the step of culturing a cell population containing inner ear progenitor cells in an insulin-free medium that does not contain insulin or contains only a trace amount of insulin. It provides a method.
  • a cell population containing inner ear progenitor cells is cultured in an insulin-free medium containing no insulin or only a trace amount of insulin.
  • a functional marginal cell of the stria vascularis of the inner ear is obtained with potential application in drug screening.
  • FIG. 1 is a flow diagram illustrating an embodiment of a method for producing inner ear vascular stria marginal cells according to the present invention.
  • FIG. 2 is a flow diagram illustrating another embodiment of a method for producing inner ear vascular stria marginal cells according to the present invention.
  • FIG. 2 is a flow diagram illustrating still another embodiment of the method for producing inner ear vascular stria marginal cells according to the present invention.
  • Test Example 1 induction of differentiation from pluripotent stem cells to inner ear progenitor cells was performed, and the expression of PAX2, PAX8, and SOX2 known as marker molecules of inner ear progenitor cells was detected by immunostaining with respective specific antibodies. It is a chart showing.
  • inner ear progenitor cells were induced to differentiate into marginal cells of the stria vascularis in the inner ear. It is a chart which shows the result detected by staining.
  • inner ear progenitor cells were induced to differentiate into inner ear marginal cells of the stria vascularis. It is a chart which shows the detected result.
  • inner ear progenitor cells were induced to differentiate into inner ear marginal cells of the stria vascularis, and the expression of Na/K ATPase, known as a functional protein in marginal cells of the stria vascularis, was examined by immunostaining with its specific antibody. It is a chart which shows the detected result.
  • inner ear progenitor cells were induced to differentiate into inner ear marginal cells of the stria vascularis. It is a chart which shows the detected result.
  • inner ear progenitor cells were induced to differentiate into inner ear marginal cells of the stria vascularis, and the expression of occludin, known as an intercellular tight junction protein, in marginal cells of the stria vascularis was examined by immunostaining with its specific antibody. It is a chart which shows the detected result.
  • Test Example 2 inner ear progenitor cells were induced to differentiate into marginal cells of the stria vascularis in the inner ear, and the expression of ZO-1, known as an intercellular tight junction protein in marginal cells of the stria vascularis, was immunized with its specific antibody. It is a chart which shows the result detected by staining.
  • Test Example 3 pluripotent stem cells were induced to differentiate into inner ear progenitor cells, and further induced to differentiate into marginal cells of the stria vascularis in the inner ear. It is a chart showing the results detected by immunostaining with the specific antibody.
  • test Example 3 pluripotent stem cells were induced to differentiate into inner ear progenitor cells and further induced to differentiate into marginal cells of the stria vascularis in the inner ear.
  • Occludin known as an intercellular tight junction protein in marginal cells of the stria vascularis, induces differentiation of pluripotent stem cells into inner ear progenitor cells and further induces differentiation into marginal cells of the stria vascularis of the inner ear;
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of detecting the expression of Claudin-1 and ZO-1 by immunostaining with their specific antibodies.
  • Test Example 4 induction of differentiation from inner ear progenitor cells to inner ear marginal cells of the stria vascularis was carried out by co-culturing with feeder cells (melanocytes) that had been adherently cultured separately in advance.
  • FIG. 4 is a chart showing the results of detection of the expression of ZO-1 and Claudin-1, known as junction proteins, by immunostaining using their respective specific antibodies.
  • FIG. 4 induction of differentiation from inner ear progenitor cells to inner ear marginal cells of the stria vascularis was carried out by co-culturing with feeder cells (melanocytes) that had been adherently cultured separately in advance.
  • FIG. 4 induction of differentiation from inner ear progenitor cells to inner ear marginal cells of the stria vascularis was carried out by co-culturing with feeder cells (melanocytes) that had been adherently cultured separately in advance.
  • FIG. 4 is a chart showing the results of detecting the expression of Occludin, known as a junction protein, by immunostaining with its specific antibody.
  • FIG. 2 is a chart showing the results of detection of known NKCC1, KCNQ1, and LRP2 expression by immunostaining using their specific antibodies.
  • FIG. 10 is a chart showing the results of quantification of OTX2 gene expression by qPCR when using a culture medium prepared according to the present invention.
  • FIG. 10 is a chart showing the results of a barrier function assay performed in Test Example 6, where the left row is a photograph showing a fluorescence microscope image, and the right row is a photograph showing a bright field microscope image.
  • FIG. 2 is a chart showing the results of detection of caspase-3 expression by immunostaining with its specific antibody.
  • FIG. 10 is a chart showing the results of calculating the ratio of cleaved caspase-3 expressing cells to the total number of cells after drug treatment of marginal cells of the stria vascularis in the inner ear differentiated from pluripotent stem cells in Test Example 7.
  • FIG. . FIG. 4 is an explanatory view schematically showing an enlarged stria vascularis portion in a cross section of the cochlea of the inner ear.
  • the present invention relates to a method for inducing the differentiation of inner ear cells that constitute the inner ear organ, and more particularly, to promote the induction of differentiation from stem cells such as pluripotent stem cells and progenitor cells to inner ear vascular stria marginal cells. It relates to an improved method for producing inner ear vascular stria marginal cells.
  • pluripotent stem cell has the same meaning as generally understood by those skilled in the art, and refers to stem cells that have the ability to differentiate into almost all cells that make up the body.
  • Known pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • those prepared by reprogramming somatic cells of a healthy individual or those prepared by reprogramming somatic cells of a disease carrier may be used.
  • Diseases particularly include those related to the inner ear organ, hearing, hearing, and the like, such as Pendred's syndrome and Usher's syndrome.
  • the term "marginal cells of the stria vascularis in the inner ear” refers to cells that exhibit the same physiological functions as the marginal cells of the stria vascularis that are inherent in the inner ear organ.
  • the physiological functionality similar to that of the stria vascular marginal cells endogenous to the inner ear organ is not limited to cases in which all of the intrinsic functionality is provided, but in cases in which a part of the physiological functionality is partially expressed. It also means that Therefore, it is meant to include, for example, marginal cells of the stria vascularis inneris.
  • adhere to the bottom surface of the culture vessel, etc. means that the cells or cell populations adhere to the bottom surface of the culture vessel, etc. through the cell-substrate adhesion molecules contained in the extracellular matrix (ECM), etc. It refers to a state in which cells or cell clusters do not float in the culture solution even if the culture solution is gently shaken.
  • ECM extracellular matrix
  • ECM extracellular matrix
  • the bottom surface of the plastic dish is chemically treated or coated with an adhesive coating agent (gelatin, polylysine, agar, etc.) to promote adhesion of cells to the substrate. is preferred.
  • the surface of the plastic dish such as the bottom, should be left untreated or coated with an anti-adhesion coating agent (such as poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) to prevent cell adhesion to the substrate.
  • an anti-adhesion coating agent such as poly(2-hydroxyethyl methacrylate)
  • adherent culture promotes differentiation induction, conversely suppresses differentiation induction, and facilitates operations such as medium exchange for regulating them.
  • suspension culture facilitates the formation of three-dimensional organoids that mimic tissue in vivo. Even in adhesion culture, it takes time for the target cells to adhere, and they may remain in a floating state for a certain amount of time. To be included in adherent culture.
  • Step of culturing pluripotent stem cells in the presence of a ROCK inhibitor without the addition of a growth factor (2A)
  • the cell population obtained in step (1A) without the addition of a growth factor in the absence of a ROCK inhibitor (3A) Culturing the cell population obtained in step (2A) in the presence of at least one growth factor selected from the group consisting of bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19, and BMP4 process
  • (4A) The cell population obtained in step (3A) is cultured in the presence of at least one growth factor selected from the group consisting of bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19 and in the absence of BMP4.
  • the medium used in the above step (1A) is not particularly limited as long as it can maintain pluripotent stem cells or cells undergoing differentiation from pluripotent stem cells.
  • mTeSR1 STMCELL Technologies
  • STMCELL Technologies which is a feeder cell-free serum-free medium for maintaining pluripotent stem cells
  • a ROCK inhibitor has a cell death inhibitory effect on pluripotent stem cells.
  • Step (1A) is preferably carried out for 1 to 3 days, more preferably for 1 to 2 days.
  • ROCK inhibitor used in the above step (1A) examples include Y-27632 ((R)-(+)-trans-N-(4-Pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide), Fasudil hydrochloride, K-115 (ripasudil hydrochloride hydrate), DE-104 and the like.
  • the optimum concentration of the ROCK inhibitor may be appropriately determined depending on the type of ROCK inhibitor.
  • the concentration is preferably 1-100 ⁇ M, more preferably 10-20 ⁇ M.
  • the medium used in the above step (2A) is not particularly limited as long as it can maintain pluripotent stem cells or cells undergoing differentiation from pluripotent stem cells.
  • "mTeSR1" STMCELL Technologies
  • culture is performed in the absence of a growth factor and in the absence of a ROCK inhibitor.
  • the medium is transferred to the basal medium used in the subsequent steps (for example, serum-free medium "DMEM/F12" (trade name “D- MEM/Ham's F-12", Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the cells are preferably maintained by culturing while replacing the medium with fresh medium every day.
  • the basal medium used in the subsequent steps for example, serum-free medium "DMEM/F12” (trade name “D- MEM/Ham's F-12", Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • the cells are preferably maintained by culturing while replacing the medium with fresh medium every day.
  • Step (2A) is preferably carried out for 1 to 10 days in total, more preferably for 2 to 8 days, and carried out for 3 to 6 days. is even more preferred.
  • the absence of growth factors and/or ROCK inhibitors means that the growth factors and/or ROCK inhibitors are substantially absent, Growth factors and/or ROCK inhibitors may be included at ineffective levels of concentration.
  • the medium used in the above step (3A) is not particularly limited as long as it is a medium that can maintain cells undergoing differentiation from pluripotent stem cells.
  • serum-free medium “DMEM/F12” (trade name “D-MEM/Ham's F-12", Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • serum-free supplement "B27” (trade name “Gibco B-27 Supplement", Thermo Fisher Scientific)
  • serum-free supplement "N2” (trade name “Gibco N-2 Supplement” (Thermo Fisher Scientific)
  • serum-free supplement "Gibco GlutaMAX” (Thermo Fisher Scientific)
  • medium supplemented with serum-free supplement "Nonessential aminoacid” (Nacalai Tesque, Inc.), etc.
  • Step (3A) a growth factor and cultured in the presence of at least one growth factor selected from the group consisting of bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19, and BMP4, where all of bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19 are present
  • concentration range of the growth factors bFGF, FGF3, FGF10, FGF19, and BMP4 in the medium is preferably 10 to 50 ng/mL, more preferably 10 to 25 ng/mL.
  • Step (3A) is preferably performed for a total of 1 to 6 days, more preferably 2 to 5 days, and even more preferably 3 to 4 days.
  • the medium used in the above step (4A) is not particularly limited as long as it is a medium that can maintain cells heading for differentiation from pluripotent stem cells.
  • serum-free medium "DMEM/F12” (trade name “D-MEM/Ham's F-12", Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • serum-free supplement “B27” (trade name “Gibco B-27 Supplement", Thermo Fisher Scientific)
  • serum-free supplement "N2” (trade name “Gibco N-2 Supplement” (Thermo Fisher Scientific)
  • Preferred examples include media supplemented with serum-free supplement “Gibco GlutaMAX” (Thermo Fisher Scientific), serum-free supplement "Nonessential aminoacid” (Nacalai Tesque, Inc.), etc.
  • the concentration range of the growth factors bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19 in the medium is preferably 10 to 50 ng/mL, preferably 25 ng/mL.
  • the effect of directing the desired differentiation by the growth factor Step (4A) is preferably carried out for a total of 1 to 6 days, more preferably 2 to 5 days, and even more preferably 3 to 4 days.
  • step (4A) the absence of BMP4 means that BMP4 is substantially absent, and may be included at a concentration level that has no effect.
  • a series of culturing from step (1A) to step (4A) is preferably by adherent culture, in which culture is performed while adhering to the bottom of a culture dish. According to this, cells can be efficiently cultured. In addition, it is easy to promote the induction of differentiation, conversely suppress the induction of differentiation, and perform operations such as medium exchange for regulating them. Moreover, it is preferable to culture in a serum-free medium. According to this, the risk of differentiation into unintended cells due to serum factors can be suppressed.
  • inner ear progenitor cell markers PAX2 and PAX8 is used as an index to evaluate the degree of differentiation into inner ear cells. That is, when the progenitor cells, which are immature to a certain degree of differentiation, are differentiated into inner ear cells through a predetermined culture, the expression of PAX2 and PAX8 increases accordingly (Reference 1: Ealy M, Ellwanger DC, Kosaric N, Stapper AP, Heller S. "Single-cell analysis delineates a trajectory toward the human early otic lineage.” Proc Natl Acad Sci USA 2016 Jul.
  • the degree of differentiation into inner ear cells can also be evaluated by examining the expression of PAX2 and PAX8 at the protein expression level and mRNA expression level of the inner ear progenitor cells obtained by the method described above. . That is, when the expression of PAX2 or PAX8 is examined at the protein expression level or the mRNA expression level, the cell population reaches at least the level at which the expression can be detected.
  • inner ear progenitor cell refers to a pre-differentiated cell that has the ability to differentiate into inner ear cells that constitute the inner ear organ. Therefore, it includes, for example, those called inner ear stem cells, ectodermal placode cells, cochlear stem cells, cochlear progenitor cells, tissue stem cells contained in inner ear organ tissues, and the like.
  • FIG. 1 shows a flow diagram illustrating an embodiment of the method for producing marginal cells of the stria vascularis according to the present invention.
  • inner ear progenitor cells are induced to differentiate into more mature inner ear cells by subjecting inner ear progenitor cells to specific treatments.
  • a cell population containing inner ear progenitor cells is cultured in an insulin-free medium containing no insulin or only a trace amount of insulin to induce differentiation into inner ear marginal cells of the stria vascularis.
  • a basal medium used for culture in an insulin-free medium for example, "DMEM/F12" (trade name “D-MEM/Ham's F-12", Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like can be used.
  • supplementary nutrients may be added to the basal medium as appropriate. Examples thereof include serum-free supplement “Gibco GlutaMAX” (Thermo Fisher Scientific) and serum-free supplement "Nonessential aminoacid” (Nacalai Tesque, Inc.).
  • the insulin-free medium used in the present invention should limit the insulin concentration in the medium. This is because, as will be shown in Examples described later, a medium with a normal insulin concentration hinders differentiation induction into the desired marginal cells.
  • the lower limit of insulin concentration is 0 nM or more, and the upper limit is preferably 100 nM or less, for example.
  • the upper limit of insulin concentration is 90 nM or less, 80 nM or less, 70 nM or less, 60 nM or less, 50 nM or less, 40 nM or less, 30 nM or less, 20 nM or less, 10 nM or less, 5 nM or less, 4 nM or less, 3 nM or less, 2 nM or less, or 1 nM or less.
  • serum-free supplements that can be added or supplemented to the basal medium are serum-free supplement "B27” (trade name “Gibco B-27 Supplement", Thermo Fisher Scientific), serum-free Supplement “N2" (trade name “Gibco N-2 Supplement” (Thermo Fisher Scientific) was exemplified, but these contain insulin at a certain concentration or higher.Therefore, according to these product protocols, the normal amount
  • serum-free supplement containing similar components a serum-free supplement "N21-Ins” containing no insulin (trade name "N21-MAX Insulin Free Media Supplement ", R&D Systems, Inc.), etc.
  • Such supplement products for culture that do not contain insulin can be added or replenished to the insulin-free medium used in the present invention in a normal amount according to the product protocol. It is possible.
  • EGF, bFGF, FGF3, BMP4, etc. are generally known as growth factors that contribute to differentiation induction from inner ear progenitor cells to more mature inner ear cells. Therefore, even in the culture in the above-mentioned insulin-free medium, the culture can be performed by adding one or more of these growth factors to the medium.
  • the concentration range of these growth factors in the medium is preferably 10 to 50 ng/mL, more preferably 20 to 30 ng/mL for EGF.
  • bFGF preferably ranges from 10 to 50 ng/mL, more preferably from 10 to 30 ng/mL.
  • FGF3 it is preferably 10-100 ng/mL, more preferably 20-80 ng/mL.
  • BMP4 it is preferably 10-50 ng/mL, more preferably 20-30 ng/mL.
  • Cultivation in the insulin-free medium can be performed in an environment in which at least EGF is present as a growth factor and at least one or more selected from the group consisting of bFGF, FGF3, and BMP4 are present.
  • at least EGF is present as a growth factor and at least one or more selected from the group consisting of bFGF, FGF3, and BMP4 are present.
  • Each growth factor is present at each timing, such as culturing in the presence of EGF and FGF3 in the middle of the period, and culturing in the presence of EGF and bFGF in the latter half of the period. It is more preferable to replace the culture medium.
  • the medium does not contain IGF-1. This avoids giving an insulin-like signal by IGF-1.
  • the culture method may be adherent culture or suspension culture, but from the viewpoint of facilitating the formation of three-dimensional organoids that mimic tissue in vivo, suspension culture is more preferable. .
  • the culture period is preferably 50 to 70 days in total, more preferably 55 to 65 days, and even more preferably 60 to 65 days from the start of differentiation induction of pluripotent stem cells.
  • the culture period in the insulin-free medium is preferably 30 to 50 days in total, more preferably 35 to 45 days, and even more preferably 40 to 45 days.
  • FIG. 2 shows a flow chart explaining another embodiment of the method for producing marginal cells of the stria vascularis according to the present invention.
  • inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells are subjected to the following steps (1B) and (2B) to induce differentiation into inner ear striatum cells. I am trying to be more certain.
  • the cells or cell population obtained in step (1B) are Floating culture in the insulin-free medium below
  • a cell population containing inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells is first subjected to cell detachment and dispersion.
  • the proliferated cells adhere to each other. Dissociated into a small number of cell clusters, such as ⁇ 10, individual cells become susceptible to direct exposure to culture medium or incubator.
  • the cells are undifferentiated or have weak growth activity, they die without surviving.
  • cells unnecessary for differentiation into inner ear cells are selected, and the expression levels of, for example, PAX2 and PAX8 can be reliably maintained.
  • the detachment/dispersion treatment of cells is not particularly limited as long as it is a means capable of detaching the adhered cells from the culture substrate and dispersing the cells into individual cells.
  • Examples include enzymatic treatment with a formulation (trade name "TrypLE Select", Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) and actase (enzyme preparation for cell detachment: trade name "Accutase", Nacalai Tesque Co., Ltd.).
  • dissociation of cells can be ensured by pipetting in a liquid medium or the like.
  • remaining cell aggregates may be removed by passing through a mesh having a predetermined pore size.
  • a mesh used for such a purpose a cell strainer equipped with a nylon mesh having a predetermined pore size stepwise in the range of 1 to 1000 ⁇ m is commercially available. A suitable pore size may be selected from the above and used.
  • cells or cell populations subjected to cell detachment/dispersion treatment contain no insulin or only a trace amount of insulin in the presence of an extracellular matrix material.
  • Suspension culture in non-insulin-free medium For suspension culture, cells or cell populations that have undergone cell detachment/dispersion processing are suspended in an appropriate liquid medium and placed in a suspension culture incubator that can be cultured in a non-adherent state. It is preferable to culture the cells in the medium.
  • the incubator for non-adhesive culture specifically, for example, a plastic dish for non-adhesive cell culture can be used.
  • the above-mentioned insulin-free medium may be used as the medium for the suspension culture.
  • an extracellular matrix material is added to this.
  • the presence of the extracellular matrix material facilitates the formation of cell polarity and has the effect of serving as a scaffold for differentiation into striatal marginal cells.
  • the extracellular matrix material is not particularly limited as long as it functions as a scaffold when cells grow three-dimensionally. Examples thereof include matrigel, pronectin, collagen, laminin, and fibronectin. These may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • the content of the extracellular matrix material in the insulin-free medium is not particularly limited as long as it is within the range normally used by those skilled in the art, but is typically, for example, 0.01 to 10 mg/in terms of protein, which is not limited. mL, such as 0.05-5 mg/mL, such as 0.1-1 mg/mL.
  • This suspension culture is preferably performed for a total of 30 to 50 days, more preferably 35 to 45 days, and even more preferably 40 to 45 days from the start of suspension culture in an insulin-free medium.
  • the spheres (cell masses) formed by centrifugation or the like are collected so as not to be broken, replaced with fresh medium, or fresh medium is added, and the suspension culture is further performed. may continue. In this case, it is preferable to replace the medium in the additional suspension culture or add fresh medium every 3 to 4 days.
  • the three-dimensionally cultured striatal marginal cells which can be prepared in this manner, have intrinsic characteristics similar to striatal marginal cells endogenous to the inner ear organ, such as expressing intercellular tight junction proteins and ion transporters. It is a cell that expresses various physiological functions.
  • FIG. 3 shows a flow diagram illustrating still another embodiment of the method for producing marginal cells of the striatum vascularis according to the present invention.
  • inner ear progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells are subjected to the following steps (1C) to (3C) to induce differentiation into inner ear striatum cells.
  • steps (1C) to (3C) to induce differentiation into inner ear striatum cells.
  • a two-dimensional structure is formed by the marginal cells of the stria vascularis in the inner ear. That is, two-dimensional culture (2D culture) of inner ear marginal cells of the stria vascularis can be performed.
  • the cells or cell population obtained in step (1C) are (3C) a step of seeding the cells or cell populations after suspension culture in step (2C) onto feeder cells previously adherently cultured separately and culturing them in the insulin-free medium;
  • steps (1C) and (2C) for the suspension culture in insulin-free medium described above are replaced by the steps described above with reference to FIG. Common to (1B) and step (2B), in the process, the cells are collected as appropriate for the cell population in the suspension culture, and if necessary, the cells are pipetted in an enzyme-added solution to disperse them. After that, the cells are separately seeded on feeder cells that have been adherently cultured in advance. Then, in that state, the culture in the insulin-free medium described above is further continued. Melanocytes, melanocyte-like cells, or the like can be used as feeder cells.
  • the two-dimensional structure is formed along the surface of the two-dimensional structure such as the inner bottom surface of the culture vessel, and is seeded thereon.
  • feeder cells such as melanocytes
  • the co-culture with feeder cells is preferably carried out for a total of 30 to 50 days, more preferably 35 to 45 days, and even more preferably 40 to 45 days from the start.
  • fresh medium may be replaced or fresh medium may be added, and the co-culture with the feeder cells may be continued. In this case, it is preferable to replace the medium in additional co-cultivation or add fresh medium every 3 to 4 days.
  • the concentration of potassium ions is reduced.
  • the present invention can provide a drug evaluation method. That is, a step of treating inner ear marginal cells of the stria vascularis that have been differentiated from pluripotent stem cells with a test drug, and a step of evaluating the state of the inner ear stria vascular marginal cells treated with the test drug A drug evaluation method is provided.
  • an arbitrary test drug is allowed to act on the marginal cells of the stria vascularis induced to differentiate from pluripotent stem cells, and the effect of the test drug on the marginal cells of the stria vascularis of the inner ear is determined. influence or can be evaluated. Thus, for example, it is useful as a tool for effectively and efficiently screening substances involved in inner ear organ functionality.
  • a test agent for example, but not limited to, marginal cells obtained as described above are suspended in a buffer solution, and the test agent is added to the solution at a predetermined concentration.
  • the state of the cells may be observed after a predetermined period of time has elapsed, or, under the culture of marginal cells of the stria vascularis obtained as described above, a predetermined concentration is added to the medium for the culture. Then, the cells may be cultured for a predetermined period of time, and the state of the cells thereafter may be observed.
  • the state of the marginal cells of the stria vascularis in the inner ear after the treatment for example, but not limited to, the ion permeability, barrier function, apoptosis, oxidative stress, etc. of the cells involved in the functionality of the inner ear organ are examined. You may
  • the present invention provides a cell culture for drug evaluation. That is, the present invention provides a cell culture for drug evaluation, containing inner ear marginal cells differentiated from pluripotent stem cells.
  • any test drug can be allowed to act on it, and it is possible to evaluate how the test drug affects the marginal cells of the stria vascularis interna.
  • the cell culture may be in the form of cells or cell populations containing at least the marginal cells of the stria vascularis, and is usually in the form of cell clusters obtained by suspension culture.
  • a storage solution such as a medium or culture medium, and at the time of use, replace the storage solution with a test solution containing the test drug. It can be used to evaluate a test drug by observing the state of cells after a predetermined period of time has elapsed.
  • the storage solution should be placed in a culture container so as to cover the cell culture with a storage solution such as a medium or a storage solution for the purpose of protecting or storing the two-dimensional structural (layered) form.
  • a storage solution such as a medium or a storage solution for the purpose of protecting or storing the two-dimensional structural (layered) form.
  • the storage solution can be replaced with a test solution containing the test drug, and the state of the cells can be observed after the lapse of a predetermined period of time to evaluate the test drug.
  • the evaluation may include, but is not limited to, examining ion permeability, barrier function, apoptosis, oxidative stress, etc. of cells that are involved in the functionality of the inner ear organ.
  • ampicillin was used at a concentration of 100 ⁇ g/mL as an appropriate antibacterial agent in the medium for cell culture as needed. Unless otherwise specified, culture was performed under normal oxygen conditions (O 2 20%, CO 2 5%).
  • Test Example 1 In this test example, inner ear progenitor cells were induced to differentiate from human iPS cells.
  • Serum-free medium (Day 6) Serum-free medium (DMEM/F12 + 2% B27 + 1% N2 + 1% GlutaMAX + 1% Nonessential aminoacid) was replaced with a medium supplemented with growth factors bFGF, FGF3, FGF10, and FGF19 (all growth factor concentrations were 25 ng/mL) until Day 8. cultured.
  • L-glutamine was added to serum-free medium (DMEM/F12 + 2% B27 + 1% N2) to a concentration of 2 mM, and growth factors bFGF, EGF, and IGF-1 were added to concentrations of 20 ng/mL and 20 ng/mL, respectively.
  • the medium was replaced with a medium prepared by adding 50 ng/mL in mL.
  • PAX2, PAX8, SOX2 (Day 12) Cells on day 12 from the start of differentiation induction (Day 12) were fixed by treating with 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature, treated with 0.3% PBST for 30 minutes, and then treated with 10% normal donkey serum. /0.3% PBST for 1 hour at room temperature.
  • As primary antibodies mouse anti-PAX2 antibody, rabbit anti-PAX8 antibody and goat anti-SOX2 antibody were used at concentrations of 1:500, 1:500 and 1:500, respectively, and reacted at room temperature for 2 hours. Fluorescent-labeled secondary antibodies specific for each primary antibody's IgG animal species were reacted for 1 hour at room temperature. Nuclei were also stained with Hoechst33258.
  • FIG. 4 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 50 ⁇ m).
  • Cells were suspended to a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells/10 mL, seeded in a low-adhesion 6-well plate (trade name “Corning Ultra-Low Attachment Plate”, Corning), and hypoxic. Suspension culture was initiated under the conditions (4% O 2 , 5% CO 2 ). At this time, the medium used was a serum-free medium (DMEM/F12+2%B27+1%N2) containing growth factors bFGF, EGF, IGF-1, FGF3, and FGF10 at concentrations of 10 ng/mL, 10 ng/mL, and 25 ng/mL, respectively.
  • DMEM/F12+2%B27+1%N2 serum-free medium
  • growth factors bFGF, EGF, IGF-1, FGF3, and FGF10 at concentrations of 10 ng/mL, 10 ng/mL, and 25 ng/mL, respectively.
  • L-glutamine was added to a concentration of 2 mM
  • Y-27632 was added to a concentration of 10 ⁇ M
  • Matrigel was added to a concentration of 1 %
  • SB431542 was added to a concentration of 2 ⁇ M
  • heparin was added to a concentration of 50 ng/mL to suspend the cells and perform suspension culture. started.
  • the growth factors bFGF and EGF were added to serum-free medium (DMEM/F12 + 2% N21-Ins) at concentrations of 2 ng/mL and 10 ng/mL, respectively. Furthermore, L-glutamine was added to a concentration of 2 mM, and a medium prepared by adding SB431542 to a concentration of 2 ⁇ M was used. Suspension culture was continued at (O 2 20%, CO 2 5%).
  • the expression state of various marker proteins was examined by immunostaining for cells in the process of differentiation induction by the above method and cells after differentiation induction.
  • KCNQ1, KCNE1, LRP2 Day 63
  • Day 63 Fifty-one days after the initiation of suspension culture (Day 63), the cells were fixed by treatment with 4% paraformaldehyde at 4°C for 3 hours, and 7 ⁇ m cryosections were prepared. The frozen sections were treated with 0.3% PBST for 10 minutes and then blocked with 10% normal donkey serum/0.1% PBST at room temperature for 1 hour.
  • primary antibodies mouse anti-LRP antibody, rabbit anti-KCNE1 antibody and goat anti-KCNQ1 antibody were used at concentrations of 1:200, 1:200 and 1:100, respectively, and reacted overnight at 4°C.
  • FIG. 5 shows microscopic observation images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 20 ⁇ m on the left, 20 ⁇ m on the right).
  • NKCC1, KCNQ1 Day 63
  • NKCC1, KCNQ1 Day 63
  • Fifty-one days after the initiation of suspension culture Day 63
  • the cells were fixed by treatment with 4% paraformaldehyde at 4°C for 3 hours, and 7 ⁇ m cryosections were prepared.
  • the frozen sections were treated with 0.3% PBST for 10 minutes and then blocked with 10% normal donkey serum/0.1% PBST at room temperature for 1 hour.
  • primary antibodies a rabbit anti-KCNQ1 antibody and a goat anti-NKCC1 antibody were used at a concentration of 1:200, respectively, and reacted overnight at 4°C.
  • Fluorescent-labeled secondary antibodies specific for each primary antibody's IgG animal species were reacted for 1 hour at room temperature. Nuclei were also stained with Hoechst33258.
  • FIG. 6 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 50 ⁇ m).
  • NKCC1 and KCNQ1 which are known as functional proteins in marginal cells of the striatum vascularis, was detected. In addition, they were not co-localized at the cell membrane, suggesting that the expression pattern in endogenous marginal cells could be reproduced.
  • the expression of Na/K ATPase known as a functional protein, was detected in marginal cells of the striatum vascularis. In addition, it was localized in the cell membrane, and it was thought that the expression pattern in endogenous limbic cells could be reproduced.
  • LMX1, ESRRB 28 days after the start of suspension culture (Day40), the cells were fixed by treating with 4% paraformaldehyde for 20 minutes at room temperature, treated with 0.3% PBST for 20 minutes, and then treated with 10% normal donkey serum. /0.3% PBST for 1 hour at room temperature.
  • primary antibodies a mouse anti-ESRRB antibody and a rabbit anti-LMX1 antibody were used at a concentration of 1:100, respectively, and reacted overnight at 4°C. Fluorescently labeled secondary antibodies specific for the IgG animal species of each primary antibody were reacted for 2 hours at room temperature. Nuclei were also stained with Hoechst33258.
  • FIG. 8 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 20 ⁇ m).
  • Occludin (Day 52) 40 days after the start of suspension culture (Day52), the cells were treated with 10% TCA at 4 ° C. for 15 minutes and fixed, treated with 0.3% PBST for 10 minutes, and then treated with 10% normal donkey serum / Blocking was performed with 0.1% PBST at room temperature for 1 hour.
  • a primary antibody a rabbit anti-Occludin antibody was used at a concentration of 1:100 and allowed to react overnight at 4°C.
  • Fluorescently labeled secondary antibody specific to the primary antibody IgG animal species was allowed to react at room temperature for 1 hour and observed with a confocal microscope.
  • FIG. 9 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 20 ⁇ m).
  • Occludin known as an intercellular tight junction protein
  • the expression of Occludin was detected in the marginal cells of the stria vascularis in the inner ear.
  • it showed a characteristic cobblestone-like signal, suggesting that the differentiation-induced cells were inner ear vascular stria marginal cells, which are epithelial cell-like cells.
  • FIG. 10 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 20 ⁇ m).
  • the expression of ZO-1 known as a functional protein, was detected in marginal cells of the stria vascularis in the inner ear.
  • it showed cobblestone-like signals characteristic of epithelial cells, suggesting that the cells induced to differentiate were epithelial cell-like cells, the stria vascular marginal cells.
  • inner ear progenitor cells obtained by differentiation induction from pluripotent stem cells can be further induced to differentiate into inner ear vascular stria marginal cells by culturing using this induction method.
  • Test Example 3 human iPS cells were induced to differentiate into inner ear progenitor cells by a method different from that in Test Example 1, and the inner ear progenitor cells were induced to differentiate into inner ear vascular stria marginal cells.
  • L-glutamine was added to serum-free medium (DMEM/F12 + 2% B27 + 1% N2) to a concentration of 2 mM, and growth factors bFGF, EGF, and IGF-1 were added to concentrations of 20 ng/mL and 20 ng/mL, respectively.
  • the medium was replaced with a medium prepared by adding 50 ng/mL in mL.
  • NKCC1 (Day 60) Cells 49 days after initiation of suspension culture (Day 60) were treated with 4% paraformaldehyde at room temperature for 15 minutes to fix, and 7 ⁇ m cryosections were prepared. The frozen sections were treated with 0.3% PBST for 10 minutes and then blocked with 10% normal goat serum/0.1% PBST at room temperature for 1 hour.
  • a primary antibody a rabbit anti-NKCC1 antibody was used at a concentration of 1:100 and allowed to react overnight at 4°C. Fluorescently-labeled secondary antibody specific for the primary antibody IgG animal species was reacted for 1 hour at room temperature. Nuclei were also stained with Hoechst33258.
  • FIG. 11 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 10 ⁇ m).
  • NKCC1 known as a functional protein
  • ESRRB, KCNQ1 (Day 60) Cells 49 days after initiation of suspension culture (Day 60) were treated with 4% paraformaldehyde at room temperature for 15 minutes to fix, and 7 ⁇ m cryosections were prepared. The frozen sections were treated with 0.3% PBST for 10 minutes and then blocked with 10% normal donkey serum/0.1% PBST at room temperature for 1 hour.
  • primary antibodies a mouse anti-ESRRB antibody and a rabbit anti-KCNQ1 antibody were used at a concentration of 1:100, respectively, and reacted overnight at 4°C. Fluorescently-labeled secondary antibody specific for the primary antibody IgG animal species was reacted for 1 hour at room temperature. Nuclei were also stained with Hoechst33258.
  • FIG. 12 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 10 ⁇ m).
  • ESRRB and KCNQ1 which are known as functional proteins in marginal cells of the stria vascularis, was detected.
  • ESRRB is localized in the nucleus, and it was considered that the expression pattern in endogenous marginal cells could be reproduced.
  • FIG. 13 shows a microscopic image obtained by observing with a Keyence BZ-X810 microscope (scale bar: 10 ⁇ m).
  • Test Example 4 In this test example, two-dimensional culture of inner ear marginal cells of the stria vascularis was attempted in order to differentiate inner ear marginal cells from the inner ear progenitor cells.
  • Inner ear progenitor cells were obtained from human iPS cells in the same manner as in Test Example 1, and cultured until Day 20 in the same manner as in Test Example 2 using the inner ear progenitor cells.
  • the cells were collected and treated with a trypsin-like enzyme preparation (trade name “TrypLE Select”, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) to which EDTA was added to 1 mM at 37° C. for 20 minutes.
  • a double amount of DMEM/F12 was added, passed through a nylon mesh (pore size 40 ⁇ m), and the number of cells was counted with a hemocytometer.
  • the cells after detachment treatment were suspended in a medium having the same composition as the medium on Day 20 to a concentration of 1.2 ⁇ 10 6 cells/10 mL, and seeded separately on previously cultured feeder cells.
  • melanocytes trade name “normal human epidermal melanocytes”, TAKARA
  • TAKARA normal human epidermal melanocytes
  • IWAKI 8-well chamber
  • FIG. 14 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 20 ⁇ m).
  • the expression of ZO-1 and Claudin-1 was detected in marginal cells of the stria vascularis in the inner ear.
  • it shows cobblestone-like signals characteristic of epithelial cells, and is an epithelial cell-like cell even in a two-dimensional culture that proliferates and spreads in a monolayer on melanocytes by co-culturing with melanocytes that have been adherently cultured in advance. It was considered that the inner ear striatum cells could be induced to differentiate.
  • Inner ear progenitor cells were obtained from human iPS cells in the same manner as in Test Example 1, and cultured until Day 21 in the same manner as in Test Example 2 using the inner ear progenitor cells.
  • FIG. 15 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 10 ⁇ m).
  • Occludin known as an intercellular tight junction protein
  • FIG. 15 shows cobblestone-like signals characteristic of epithelial cells, and is an epithelial cell-like cell even in a two-dimensional culture that proliferates and spreads in a monolayer on melanocytes by co-culturing with melanocytes that have been adherently cultured in advance. It was considered that the inner ear striatum cells could be induced to differentiate.
  • Inner ear progenitor cells were obtained from human iPS cells in the same manner as in Test Example 1, and cultured until Day 20 in the same manner as in Test Example 2 using the inner ear progenitor cells.
  • NKCC1, KCNQ1, LRP2 (Day 65) 48 days after the start of suspension culture (Day60), the cells were fixed by treating with 4% paraformaldehyde overnight at 4°C, treated with 0.3% PBST for 10 minutes, and treated with 10% normal donkey. Blocking was performed with serum/0.1% PBST at room temperature for 1 hour.
  • primary antibodies goat anti-NKCC1 antibody, rabbit anti-KCNQ1 antibody, and mouse anti-LRP2 antibody were used at a concentration of 1:100, respectively, and reacted overnight at 4°C. Fluorescently-labeled secondary antibody specific for the primary antibody IgG animal species was reacted for 1 hour at room temperature. Nuclei were also stained with Hoechst33258.
  • FIG. 16 shows microscopic observation images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: upper 10 ⁇ m, lower 5 ⁇ m).
  • NKCC1, KCNQ1, and LRP2 known as functional proteins in marginal cells of the striatum vascularis was detected.
  • KCNQ1 and LRP2 co-localize at the plasma membrane
  • NKCC1 and KCNQ1 do not co-localize at the plasma membrane. It was considered that differentiation induction of the expressing cells could be achieved.
  • Cells were suspended to a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells/10 mL, seeded in a low-adhesion 6-well plate (trade name “Corning Ultra-Low Attachment Plate”, Corning), and hypoxic. Suspension culture was initiated under the conditions (4% O 2 , 5% CO 2 ). At this time, the medium used was a serum-free medium (DMEM/F12+2%B27+1%N2) containing growth factors bFGF, EGF, IGF-1, FGF3, and FGF10 at concentrations of 10 ng/mL, 10 ng/mL, and 25 ng/mL, respectively.
  • DMEM/F12+2%B27+1%N2 serum-free medium
  • growth factors bFGF, EGF, IGF-1, FGF3, and FGF10 at concentrations of 10 ng/mL, 10 ng/mL, and 25 ng/mL, respectively.
  • L-glutamine was added to a concentration of 2 mM
  • Y-27632 was added to a concentration of 10 ⁇ M
  • Matrigel was added to a concentration of 1 %
  • SB431542 was added to a concentration of 1 ⁇ M
  • heparin was added to a concentration of 50 ng/mL to suspend the cells and perform suspension culture. started.
  • Insulin-containing serum replacement medium used Suspension culture was continued until Day 59 in the same manner as Test Example 2-Day 20 and thereafter, except that a serum-free medium (DMEM/F12 + 2% B27 + 1% N2) was used as the medium.
  • a serum-free medium DMEM/F12 + 2% B27 + 1% N2
  • Insulin-free medium Suspension culture was continued until Day 59 in the same manner as Test Example 2-Day 20 and thereafter, except that a serum-free medium (DMEM/F12+2% N21-Ins) was used as the medium.
  • the cells are collected 48 days after the start of the suspension culture (Day60), and are known to be expressed in the Reissner's membrane, which is the inner ear organ.
  • the expression level of the OTX2 gene which is known to be poorly expressed in limbal cells, was quantified by qPCR in the same manner as in Test Example 1.
  • Inner ear progenitor cells were obtained from human iPS cells in the same manner as in Test Example 1, and suspension culture was continued in the same manner as in Test Example 2 until day 49 (Day 61) after the initiation of suspension culture using the inner ear progenitor cells. .
  • a barrier function assay was performed on the obtained cells. Specifically, the culture after floating culture was placed in a 1.5 mL microtube together with the cells, centrifuged, the medium was discarded, and 0.5 mL of HBSS containing 2 mM EDTA was added. As a control, a sample to which HBBS containing no EDTA was added under the same conditions was also prepared. Each was placed in a container on ice for 15 minutes, then 4 kDa FITC-Dextran was added to each to a concentration of 2 mg/mL, suspended, and immediately observed with a confocal microscope.
  • the method of the present invention yields cells exhibiting the same intrinsic physiological functionality as marginal cells of the stria vascularis that are endogenous to the inner ear organ.
  • Test Example 7 In this test example, the marginal cells of the stria vascularis induced to differentiate in the same manner as in test example 3 were used to evaluate drugs.
  • frozen sections were prepared in the same manner using cells 49 days after initiation of suspension culture (Day 60) without drug treatment. Each frozen section was treated with 0.3% PBST for 10 minutes and then blocked with 10% normal donkey serum/0.1% PBST at room temperature for 1 hour.
  • FIG. 19 shows microscopy images obtained by observing with a confocal microscope (scale bar: 20 ⁇ m).

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Abstract

難聴の病態解析や薬剤スクリーニングへの応用可能性のある機能的な内耳血管条辺縁細胞を作製する技術を提供する。内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養する工程を含む、内耳血管条辺縁細胞の製造方法である。

Description

内耳血管条辺縁細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び薬剤評価用細胞培養物
　本発明は、内耳血管条辺縁細胞の製造方法、薬剤の評価方法、及び薬剤評価細胞培養物に関する。
　難聴はＱＯＬの著しい低下をもたらす疾患であるが根本的な治療方法は未だ存在しない。また難聴は近年認知症などのリスクファクターとしても注目され、難聴の発症機構の理解および治療方法の確立は重要かつ緊急の課題である。
　これまで難聴発症機構解析には遺伝子改変マウスや薬剤投与マウス・ラットなどの齧歯類がモデル動物として主に用いられてきたが、齧歯類モデル動物の表現型が必ずしもヒトの病態と一致しない例も数多く報告されており、ヒトの細胞・組織を用いて病態解析を行うことが近年特に重要視されている。しかしながら、他の内耳組織と同様に血管条をヒトから解剖学的に非侵襲的に採取することが困難であり、更に難聴自体は致死的な疾患ではないためヒト病理組織を入手することが困難であるなどの理由から、ヒトの細胞・組織を用いて難聴の発症機構を解析することは容易ではない。
　このような問題点を解決するリサーチツールとして、近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞)、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞)等の多能性幹細胞由来分化細胞が注目されている。発明者らの所属研究室においてもヒトｉＰＳ細胞から内耳細胞様細胞を分化誘導する方法を開発し（特許文献１）、これを用いてペンドレッド症候群（ＰＤＳ）という難聴の病態解析系の構築および治療薬の探索を行っている（非特許文献１）。また、その探索の結果得られた候補薬の一部では、医師主導治験で有効性を確認している（臨床試験登録ＩＤ：ＵＭＩＮ００００３３０８３）。
　一方、内耳蝸牛血管条は内耳蝸牛におけるイオン環境の恒常性維持に必須の組織であり（図２１左段参照）、遺伝性・薬剤性・加齢性・騒音性・ウイルス感染性難聴など多くの種類の難聴の原因の一つは血管条の機能不全であると考えられている。血管条を構成する３種類の細胞のうち、辺縁細胞は一方向性イオン輸送や組織－内リンパ間のバリア形成において必須の機能を持つ細胞である（図２１右段参照）。
Makoto Hosoya, MasatoFujioka, Takefumi Sone,Satoshi Okamoto, Wado Akamatsu,Hideki Ukai, Hiroki R. Ueda, Kaoru Ogawa, TatsuoMatsunaga, andHideyuki Okano「CochlearCell Modeling UsingDisease-Specific iPSCs Unveils a DegenerativePhenotypeand Suggests Treatments for Congenital Progressive Hearing Loss」Cell Reports 18, 68-81, January 3, 2017.
特許第６２１８１５２号公報
　従来の技術により分化誘導された辺縁細胞様細胞においては、一部のマーカー発現が認められるものの、カリウムイオン濃度の恒常性維持に必要な細胞間のタイトジャンクションタンパク質による敷石状平面構造も形成しないため、内耳器官に内在している血管条辺縁細胞と同様の生理機能性をあらわす細胞とはいい難く、よって、内耳血管条辺縁細胞が関与する難聴の病態解析や薬剤スクリーニングへの応用には至らなかった。
　よって、本発明の目的は、難聴の病態解析や薬剤スクリーニングへの応用可能性のある機能的な内耳血管条辺縁細胞を作製する技術を提供することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を重ね、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、その第１の観点において、多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養する工程を含む、内耳血管条辺縁細胞の製造方法を提供するものである。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法によれば、多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養するので、難聴の病態解析や薬剤スクリーニングへの応用可能性のある機能的な内耳血管条辺縁細胞が得られる。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法においては、前記インスリン不含培地はインスリン濃度が０ｎＭ以上１００ｎＭ以下であることが好ましい。これによれば、品質の良好な内耳血管条辺縁細胞への分化誘導をより確実にすることができる。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法においては、前記インスリン不含培地は、ＥＧＦを含み、更にｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上を含むことが好ましい。また、特に浮遊培養において、その浮遊培養期間における最初のインスリン不含培地としては、ＥＧＦにＦＧＦ３及びＢＭＰ４を含むことが好ましい。これによれば、品質の良好な内耳血管条辺縁細胞への分化誘導をより確実にすることができる。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法においては、以下の工程（１）及び工程（２）を含むことが好ましい。
　（１）多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理する工程
　（２）工程（１）で得られた細胞又は細胞集団を、細胞外マトリクス素材の存在下に前記インスリン不含培地で浮遊培養する工程
　その細胞外マトリクス素材としては、マトリゲル、プロネクチン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上であることが好ましい。
　上記製造方法によれば、多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理するので、培養適性のない細胞が淘汰され、品質の良好な内耳前駆細胞であることをより確実にすることができる。また、細胞外マトリクス素材の存在下の浮遊培養により、血管条辺縁細胞への分化の足場となるという効果がある。ひいては、品質の良好な内耳血管条辺縁細胞をより再現性よく得ることができる。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法においては、以下の工程（１）～工程（３）を含むことが好ましい。
　（１）多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理する工程
　（２）工程（１）で得られた細胞又は細胞集団を、細胞外マトリクス素材の存在下に前記インスリン不含培地で浮遊培養する工程
　（３）工程（２）の浮遊培養後の細胞又は細胞集団を、別に予め接着培養したフィーダー細胞に播種して前記インスリン不含培地で培養する工程
　そのフィーダー細胞としては、メラノサイト又はメラノサイト様細胞であることが好ましい。
　上記製造方法によれば、多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理するので、培養適性のない細胞が淘汰され、品質の良好な内耳前駆細胞であることをより確実にすることができる。また、細胞外マトリクス素材の存在下にインスリン不含培地で浮遊培養するので、その細胞外マトリクス素材の存在により、血管条辺縁細胞への分化の足場となる効果がある。更に、浮遊培養後の細胞又は細胞集団を、別に予め接着培養したフィーダー細胞に播種してインスリン不含培地で培養するので、接着培養したフィーダー細胞と共培養される内耳血管条辺縁細胞についても、そのフィーダー細胞の表面上に血管条辺縁細胞が二次元的に培養された構造（層状）の形成が促進される。ひいては品質の良好な内耳血管条辺縁細胞の二次元培養をより再現性よく行うことができる。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法においては、前記多能性幹細胞から分化誘導して得られた内耳前駆細胞を含む細胞集団が、以下の工程（１）～工程（４）を含む方法で得られたものであることが好ましい。
　（１）多能性幹細胞を、成長因子無添加、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する工程
　（２）工程（１）で得られた細胞集団を、成長因子無添加、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で培養する工程
　（３）工程（２）で得られた細胞集団を、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子、及びＢＭＰ４の存在下で培養する工程
　（４）工程（３）で得られた細胞集団を、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子の存在下であって、ＢＭＰ４の非存在下で培養する工程
　上記製造方法によれば、多能性幹細胞からより確実に内耳前駆細胞を分化誘導することができ、ひいては品質の良好な内耳血管条辺縁細胞をより再現性よく得ることができる。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法においては、前記内耳血管条辺縁細胞を無血清条件下に得るものであることが好ましい。これによれば、血清因子に起因して目的外の細胞に分化してしまうリスクを抑えることができる。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法においては、前記内耳血管条辺縁細胞は、カリウムチャネルタンパク質及びタイトジャンクションタンパク質を発現するものであることが好ましい。これによれば、得られた細胞が機能的な内耳血管条辺縁細胞であることの品質をより確実にして、ひいては品質の良好な内耳血管条辺縁細胞をより再現性よく得ることができる。
　本発明は、その第２の観点において、内耳前駆細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞を被検薬剤で処理する工程と、前記被検薬剤で処理した前記内耳血管条辺縁細胞の状態を評価する工程とを含む、薬剤の評価方法を提供するものである。
　本発明による薬剤の評価方法によれば、内耳血管条辺縁細胞に影響を与える薬剤の評価を有効かつ効率的に行うことができる。
　本発明は、その第３の観点において、内耳前駆細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞を含有する、薬剤評価用細胞培養物を提供するものである。
　本発明による薬剤評価用細胞培養物によれば、内耳前駆細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞を含有するので、これを用いて内耳血管条辺縁細胞に影響を与える薬剤の評価を有効かつ効率的に行うことができる。
　本発明は、その第４の観点において、内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養する工程を含む、内耳血管条辺縁細胞の製造方法を提供するものである。
　本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法によれば、内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養するので、難聴の病態解析や薬剤スクリーニングへの応用可能性のある機能的な内耳血管条辺縁細胞が得られる。
本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法の一実施形態を説明するフロー図である。 本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法の他の実施形態を説明するフロー図である。 本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法の更に他の実施形態を説明するフロー図である。 試験例１において、多能性幹細胞から内耳前駆細胞への分化誘導を行い、内耳前駆細胞のマーカー分子として知られるＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＳＯＸ２の発現を、それぞれの特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例２において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＫＣＮＱ１、ＫＣＮＥ１、ＬＲＰ２の発現を、それぞれの特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例２において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮＫＣＣ１、ＫＣＮＱ１の発現を、それぞれの特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例２において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅの発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例２において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＬＭＸ１、ＥＳＲＲＢの発現を、それぞれの特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例２において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＯｃｃｌｕｄｉｎの発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例２において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＺＯ－１の発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例３において、多能性幹細胞から内耳前駆細胞を分化誘導し、更に内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮＫＣＣ１の発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例３において、多能性幹細胞から内耳前駆細胞を分化誘導し、更に内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＥＳＲＲＢ、ＫＣＮＱ１の発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例３において、多能性幹細胞から内耳前駆細胞を分化誘導し、更に内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を行い、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＯｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－１、及びＺＯ－１の発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例４において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を、別に予め接着培養させたフィーダー細胞（メラノサイト）との共培養により行い、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＺＯ－１及びＣｌａｕｄｉｎ－１の発現を、それぞれの特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例４において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を、別に予め接着培養させたフィーダー細胞（メラノサイト）との共培養により行い、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＯｃｃｌｕｄｉｎの発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例４において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導を、別に予め接着培養させたフィーダー細胞（メラノサイト）との共培養により行い、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮＫＣＣ１、ＫＣＮＱ１、ＬＲＰ２の発現を、それぞれの特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例５において、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞へと分化誘導する過程において、その培地としてインスリン含有血清代替物を含む培地、インスリン不含培地、又は、インスリン不含培地にインスリンを添加した培地を用いたときのＯＴＸ２の遺伝子発現をｑＰＣＲにより定量した結果を示す図表である。 試験例６において、バリア機能アッセイを行った結果を示す図表であり、左段は蛍光顕微鏡像を示す写真であり、右段は明視野顕微鏡像を示す写真である。 試験例７において、多能性幹細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞に薬剤処理を行なった後、細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＺＯ－１と、アポトーシスのマーカーとして知られるｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３との発現を、その特異抗体による免疫染色により検出した結果を示す図表である。 試験例７において、多能性幹細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞に薬剤処理を行なった後、総細胞数に対するｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３発現細胞の割合を計算した結果を示す図表である。 内耳蝸牛断面における血管条部分を拡大して模式的に示す説明図である。
　本発明は、内耳器官を構成する内耳細胞を分化誘導する方法に関し、より詳細には、多能性幹細胞等の幹細胞や前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導が促進されるように改良された、内耳血管条辺縁細胞の製造方法に関する。
　本明細書において「多能性幹細胞」とは、一般に当業者に理解される意味と同義であり、身体を構成するほとんどすべての細胞に分化する能力のある幹細胞のことをいう。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などが知られている。また、ヒト由来のものであってもよく、ヒト以外の生物に由来するものであってもよい。更に、健常人の体細胞から初期化して調製されたものを用いてもよく、疾患保有者の体細胞から初期化して調製されたものを用いてもよい。疾患としては、特には、内耳器官、聴覚、聴力等に関するものが挙げられ、例えば、ペンドレッド症候群、アッシャー症候群等が挙げられる。
　本明細書において「内耳血管条辺縁細胞」とは、内耳器官に内在している血管条辺縁細胞と同様の生理機能性をあらわす細胞のこという。ただし、内耳器官に内在している血管条辺縁細胞と同様の生理機能性とは、その本来的な機能性をすべて備える場合だけでなく、その一部の生理機能性を部分的にあらわす場合も含む意味である。したがって、例えば、内耳血管条辺縁様細胞を含む意味である。
　本明細書において「接着培養」とは、目的の細胞や細胞集団を培養器の底面等に接着させて培養することを意味し、また、「浮遊培養」とは、目的の細胞や細胞集団を培養器の底面等に接着させずに培養することを意味する。この場合、培養中、細胞や細胞集団が培養器の底面等に接着するとは、細胞や細胞集団が、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）などに含まれる細胞－基質接着分子を通じて、培養器の底面等と接着している状態を意味し、培養液を軽く揺らしても細胞や細胞集団が培養液中に浮かんでこない状態をいう。一方、培養中、細胞や細胞集団が培養器の底面等に接着しないとは、細胞や細胞集団が、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）などに含まれる細胞－基質接着分子を通じて、培養器の底面等と接着していない状態を意味し、たとえ底面等に触れていても培養液を軽く揺らすと細胞や細胞集団が培養液中に浮かんでくるような状態をいう。接着培養の際は、細胞の基質への接着を促進するために、プラスティックディッシュの底表面を化学処理したり、接着を促進する接着用コーティング剤（ゼラチン、ポリリジン、寒天など）でコートしたりすることが好ましい。浮遊培養の際は、プラスティックディッシュの底面等の表面は処理しないか、細胞の基質への接着を阻止するための接着阻止用コーティング剤（ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）など）でコートしたりすることが好ましい。一般に、接着培養によると、分化誘導を促進したり、逆に分化誘導を抑えたり、それらを調節するための培地交換等の操作が容易である。一方、浮遊培養によると、生体内の組織を模した三次元のオルガノイド形成を促しやすい。なお、接着培養であっても、目的の細胞が接着するまでに時間がかかり、ある程度の時間、浮遊状態にある場合があるが、時間がかかってもその細胞が最終的に接着する場合は、接着培養に含めることとする。
　［１］多能性幹細胞から内耳前駆細胞への分化誘導
　多能性幹細胞から内耳前駆細胞への分化誘導は、例えば、以下に説明するような工程（１Ａ）～工程（４Ａ）を経ることにより成し得る。ただし、本発明の技術的範囲は、以下に説明する方法により調製される内耳前駆細胞を用いることに限定されずに、その他のいかなる分化誘導法により調製されたものであっても、その内耳前駆細胞を用いることができる。例えば、上述した特許第６２１８１５２号公報に記載の方法や、Ｍａｋｏｔｏ　Ｈｏｓｏｙａら（Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１８，　６８－８１，　Ｊａｎｕａｒｙ　３，　２０１７）に記載の方法、Ｓｈｏ　Ｋｕｒｉｈａｒａら（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｒａｎｓｌ　Ｍｅｄ．　２０２２　Ｍａｒ　３１；１１（３）：２８２－２９６.）に記載の方法によっても、本発明に用いる内耳前駆細胞を調製し得る。
　（１Ａ）多能性幹細胞を、成長因子無添加、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する工程
　（２Ａ）工程（１Ａ）で得られた細胞集団を、成長因子無添加、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で培養する工程
　（３Ａ）工程（２Ａ）で得られた細胞集団を、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子、及びＢＭＰ４の存在下で培養する工程、
　（４Ａ）工程（３Ａ）で得られた細胞集団を、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子の存在下であって、ＢＭＰ４の非存在下で培養する工程
　上記の工程（１Ａ）で用いる培地としては、多能性幹細胞もしくは多能性幹細胞から分化に向かう細胞を維持できる培地であればよく、特に限定されない。例えば、多能性幹細胞維持用のフィーダー細胞不要な無血清培地である「ｍＴｅＳＲ１」（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが好ましく例示される。ただし、この工程（１Ａ）では、成長因子の非存在下であって、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）の阻害剤の存在下で培養を行う。ＲＯＣＫ阻害剤により、多能性幹細胞に対して、細胞死抑制効果がある。工程（１Ａ）は、１～３日間行うことが好ましく、１～２日間行うことがより好ましい。
　上記の工程（１Ａ）で用いるＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－Ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ｆａｓｕｄｉｌ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｋ－１１５（リパスジル塩酸塩水和物）、ＤＥ－１０４などが例示される。ＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、ＲＯＣＫ阻害剤の種類に応じて、適宜最適濃度を決定すればよいが、例えばＹ－２７６３２の場合、１～１００μＭが好ましく、１０～２０μＭがより好ましい。
　上記の工程（２Ａ）で用いる培地としては、多能性幹細胞もしくは多能性幹細胞から分化に向かう細胞を維持できる培地であればよく、特に限定されない。例えば、工程（１Ａ）の培養に好ましく使用される培地と同様に、多能性幹細胞維持用のフィーダー細胞不要な無血清培地である「ｍＴｅＳＲ１」（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などが好ましく例示される。ただし、この工程（２Ａ）では、成長因子の非存在下であって、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で培養する。また、その際、好ましい態様においては、上記ｍＴｅＳＲ１メディウムで１日程度培養した後、培地を、続く工程で使用する基礎培地（例えば、無血清培地である「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（商品名「Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２」、富士フイルム和光純薬株式会社）に交換し、１日毎に新鮮培地に交換しつつ培養して細胞を維持することが好ましい。これによれば、成長因子を作用させるために用いる基礎培地に細胞をよくなじませることができる。また、その基礎培地には、適宜、補充栄養成分を添加してもよい。例えば、無血清サプリメント「Ｂ２７」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎ２」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｇｉｂｃｏ　ＧｌｕｔａＭＡＸ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ」（ナカライテスク株式会社）などが挙げられる。工程（２Ａ）は、トータルで１～１０日間行うことが好ましく、２～８日間行うことがより好ましい。３～６日間行うことが更により好ましい。
　なお、上記の工程（１Ａ）及び工程（２Ａ）において、成長因子及び／又はＲＯＣＫ阻害剤の非存在下の意味は、成長因子及び／又はＲＯＣＫ阻害剤が実質的に非存在であればよく、成長因子及び／又はＲＯＣＫ阻害剤は効果がないレベルの濃度で含まれていてもよい。
　上記の工程（３Ａ）で用いる培地としては、多能性幹細胞から分化に向かう細胞を維持できる培地であればよく、特に限定されない。例えば、工程（２Ａ）の後半培養で好ましく使用される培地と同様に、無血清培地である「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（商品名「Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２」、富士フイルム和光純薬株式会社）に、無血清サプリメント「Ｂ２７」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎ２」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｇｉｂｃｏ　ＧｌｕｔａＭＡＸ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ」（ナカライテスク株式会社）を補充した培地などが好ましく例示される。ただし、この工程（３Ａ）では、成長因子としてｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子、及びＢＭＰ４の存在下に培養する。その際、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９は、それらの全部を存在させることが好ましい。成長因子であるｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９、及びＢＭＰ４の培地中の濃度範囲としては、それぞれにおいて１０～５０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、１０～２５ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。また、培地は、例えば、およそ１日毎に新鮮なものに交換しつつ培養して、細胞を維持することが好ましい。これによれば、上記成長因子による所望の分化に向かわせる効果を更に高めることができる。工程（３Ａ）は、トータルで１～６日間行うことが好ましく、２～５日間行うことがより好ましい。３～４日間行うことが更により好ましい。
　上記の工程（４Ａ）で用いる培地としては、多能性幹細胞から分化に向かう細胞を維持できる培地であればよく、特に限定されない。例えば、工程（３Ａ）の培養に好ましく使用される培地と同様に、無血清培地である「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（商品名「Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２」、富士フイルム和光純薬株式会社）に、無血清サプリメント「Ｂ２７」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎ２」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｇｉｂｃｏ　ＧｌｕｔａＭＡＸ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ」（ナカライテスク株式会社）を補充した培地などが好ましく例示される。ただし、この工程（４Ａ）では、成長因子としてｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子の存在下であって、ＢＭＰ４の非存在下に培養する。その際、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９は、それらの全部を存在させることが好ましい。成長因子であるｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９の培地中の濃度範囲としては、それぞれにおいて１０～５０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２５ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。また、培地は、例えば、およそ１日毎に新鮮なものに交換しつつ培養して、細胞を維持することが好ましい。これによれば、上記成長因子による所望の分化に向かわせる効果を更に高めることができる。工程（４Ａ）は、トータルで１～６日間行うことが好ましく、２～５日間行うことがより好ましい。３～４日間行うことが更により好ましい。
　なお、工程（４Ａ）において、ＢＭＰ４の非存在下の意味は、ＢＭＰ４が実質的に非存在であればよく、効果がないレベルの濃度で含まれていてもよい。
　工程（１Ａ）～工程（４Ａ）の一連の培養は、培養皿の底面等に付着させつつ培養する、接着培養によることが好ましい。これによれば、細胞を効率よく培養することができる。また、分化誘導を促進したり、逆に分化誘導を抑えたり、それらを調節するための培地交換等の操作が容易である。また、無血清培地で培養することが好ましい。これによれば、血清因子に起因して目的外の細胞に分化してしまうリスクを抑えることができる。
　ここで、一般に、内耳細胞への分化の程度を評価するには、内耳前駆細胞マーカーであるＰＡＸ２やＰＡＸ８の発現を指標にすることが行われている。すなわち、分化の程度の未熟な前駆細胞から所定の培養を経ることにより内耳細胞への分化に向かうと、それにともなってＰＡＸ２やＰＡＸ８の発現が上昇する（参考文献１：Ｅａｌｙ　Ｍ，　Ｅｌｌｗａｎｇｅｒ　ＤＣ，　Ｋｏｓａｒｉｃ　Ｎ，　Ｓｔａｐｐｅｒ　ＡＰ，　Ｈｅｌｌｅｒ　Ｓ．「Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｄｅｌｉｎｅａｔｅｓ　ａ　ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ　ｔｏｗａｒｄ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｅａｒｌｙ　ｏｔｉｃ　ｌｉｎｅａｇｅ．」Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．　２０１６　Ｊｕｌ　２６；１１３（３０）：８５０８－１３．；参考文献２：Ｋｏｅｈｌｅｒ　ＫＲ，　Ｎｉｅ　Ｊ，　Ｌｏｎｇｗｏｒｔｈ－Ｍｉｌｌｓ　Ｅ，　Ｌｉｕ　ＸＰ，　Ｌｅｅ　Ｊ，　Ｈｏｌｔ　ＪＲ，　Ｈａｓｈｉｎｏ　Ｅ．「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｎｅｒ　ｅａｒ　ｏｒｇａｎｏｉｄｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｈａｉｒ　ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ．」Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　２０１７　Ｊｕｎ；３５（６）：５８３－５８９．）。よって、上記に説明した方法を経ることにより得られた内耳前駆細胞についても、ＰＡＸ２やＰＡＸ８の発現をタンパク発現レベルやｍＲＮＡ発現レベルで調べることにより、内耳細胞へ分化の程度を評価することができる。すなわち、ＰＡＸ２やＰＡＸ８の発現をタンパク発現レベルやｍＲＮＡ発現レベルで調べたとき、少なくともその発現を検知することができるレベルに達した細胞集団となっている。ここで、内耳細胞へ分化の程度を評価する指標としては、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８以外にも、ＦｏｘＧ１、ＧＡＴＡ３、ＴＦＡＰ２Ａ、ＥＣＡＤ、ＳＯＸ１０、ＪＡＧ１など、内耳前駆細胞のマーカーとして周知であり、これらを含むマーカーのうちいずれか１種又は２種以上を用いて評価してもよい。なお、本明細書において「内耳前駆細胞」とは、内耳器官を構成する内耳細胞へ分化できる能力をもつその分化前の細胞のことをいう。よって、例えば、内耳幹細胞と称されるものや、外胚葉性プラコード細胞、蝸牛幹細胞、蝸牛前駆細胞、内耳器官の組織中に含まれる組織幹細胞などを含む意味である。
　［２］内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞への分化誘導
　図１には、本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法の一実施形態を説明するフロー図を示す。図１に示されるように、本発明においては、内耳前駆細胞に対して特定の処理を施すことにより、内耳前駆細胞からより成熟した内耳細胞へと分化誘導する。具体的には、内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養することにより、内耳血管条辺縁細胞へと分化誘導する。
　インスリン不含培地での培養に用いる基礎培地としては、上述した内耳前駆細胞の調製の場合と同様に、例えば「ＤＭＥＭ／Ｆ１２」（商品名「Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２」、富士フイルム和光純薬株式会社）などを使用し得る。また、その基礎培地には、適宜、補充栄養成分を添加してもよい。例えば、無血清サプリメント「Ｇｉｂｃｏ　ＧｌｕｔａＭＡＸ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ」（ナカライテスク株式会社）などが挙げられる。ただし、本発明に用いるインスリン不含培地は、その培地中でのインスリン濃度が制限される必要がある。後述する実施例で示されるように、通常インスリン濃度の培地であると目的とする辺縁細胞への分化誘導が妨げられるからである。インスリン濃度の下限値として０ｎＭ以上であり、その上限値としては、例えば１００ｎＭ以下であることが好ましい。インスリン濃度の上限値としては９０ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７０ｎＭ以下、６０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、又は１ｎＭ以下などであってもよい。
　なお、上述した内耳前駆細胞の調製においては、基礎培地に添加・補充可能な無血清サプリメントとして、無血清サプリメント「Ｂ２７」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、無血清サプリメント「Ｎ２」（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）などが例示されたが、これらには一定濃度以上のインスリンが含まれている。よって、これらの製品プロトコルに従って通常量で上記インスリン不含培地に添加・補充することは好ましくない。一方、類似の成分を含む無血清サプリメントとして、インスリンを含有しない無血清サプリメント「Ｎ２１－Ｉｎｓ」（商品名「Ｎ２１－ＭＡＸ　ＩｎｓｕｌｉｎＦｒｅｅ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）などがある。このようなインスリンを含有しない培養用サプリメント製品であれば、その製品プロトコルに従い、通常量で、本発明に用いる上記インスリン不含培地に添加・補充することが可能である。
　ここで一般に、内耳前駆細胞からより成熟した内耳細胞への分化誘導に寄与する成長因子としては、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＢＭＰ４などが知られている。よって、上記インスリン不含培地による培養においてもこれら成長因子の１種又は２種以上を培地に含有せしめて培養することができる。この場合、これら成長因子の培地中の濃度範囲としては、ＥＧＦでは、１０～５０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２０～３０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。ｂＦＧＦでは、１０～５０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、１０～３０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。ＦＧＦ３では、１０～１００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２０～８０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。ＢＭＰ４では、１０～５０ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２０～３０ｎｇ／ｍＬであることがより好ましい。
　上記インスリン不含培地による培養は、特に、成長因子としてＥＧＦが少なくとも存在し、更にｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上が存在する環境下に行うことが好ましい。特に浮遊培養において、インスリン不含培地として最初に培地交換される培地では、ＥＧＦに更にＦＧＦ３及びＢＭＰ４が含まれている培地で培養することが重要である。より具体的には、インスリン不含培地での浮遊培養においては、少なくとも成長因子としてＥＧＦの存在下に培養を行うことが好ましく、更に、その浮遊培養期間における前半においてはＥＧＦに加えてＦＧＦ３及びＢＭＰ４の存在下に培養し、その半ばにおいてはＥＧＦに加えてＦＧＦ３の存在下に培養し、その後半においてはＥＧＦに加えてｂＦＧＦの存在下に培養するなど、それぞれのタイミングで各成長因子を存在させるよう培地交換することがより好ましい。
　一方、上記インスリン不含培地による培養においては、その培地にＩＧＦ－１を含有させないことがより好ましい。これによれば、ＩＧＦ－１によりインスリン様のシグナルを与えることを避けることができる。
　上記インスリン不含培地を用いるとともに、これらの好ましい成長因子の存在やその入れ替えにより、内耳血管条辺縁細胞への分化誘導をより確実にすることができる。培養方式としては、接着培養で行ってもよく、浮遊培養で行ってもよいが、生体内の組織を模した三次元のオルガノイド形成を促しやすいという観点からは、浮遊培養で行うことがより好ましい。また、無血清培地で培養することが好ましい。これによれば、血清因子に起因して目的外の細胞に分化してしまうリスクを抑えることができる。また、培養期間は、多能性幹細胞の分化誘導の開始からトータル５０～７０日間行うことが好ましく、５５～６５日間行うことがより好ましく、６０～６５日間行うことが更により好ましい。また、インスリン不含培地での培養期間が、トータル３０～５０日間であることが好ましく、３５～４５日間であることがより好ましく、４０～４５日間であることが更により好ましい。
　図２には、本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法の他の実施形態を説明するフロー図を示す。この実施形態においては、多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞に対して、以下の工程（１Ｂ）及び工程（２Ｂ）の処理を施すことにより、内耳血管条辺縁細胞への分化誘導をより確実にするようにしている。
　（１Ｂ）多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理する工程
　（２Ｂ）工程（１Ｂ）で得られた細胞又は細胞集団を、細胞外マトリクス素材の存在下に前記インスリン不含培地で浮遊培養する工程
　具体的には、図２に示されるように、この実施形態においては、多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団について、まず細胞の剥離・分散の処理を施す。多能性幹細胞の培養により内耳細胞へと分化誘導させる過程では、増殖した細胞は細胞同士が接着した状態となるところ、細胞の個々を分離したうえで次の培養に移すと、単細胞化もしくは２～１０個の少数の細胞塊などに解離して、細胞の個々が培地や培養器に直接に暴露して影響を受けやすくなる。このとき、細胞が未分化であったり、細胞の生育活性が弱かったりすると、生き残れずに死滅する。これにより、内耳細胞への分化にとって不必要な細胞が淘汰されて、例えばＰＡＸ２やＰＡＸ８の発現レベルを確実に維持することができる。細胞の剥離・分散の処理は、接着している細胞を培養基材から剥離し、細胞を個々の細胞に分散することができる手段であればよく、特に制限はないが、例えば、トリプシン様酵素製剤（商品名「ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社）やアクターゼ（細胞剥離用酵素製剤：商品名「Ａｃｃｕｔａｓｅ」、ナカライテスク株式会社）などによる酵素処理が挙げられる。酵素処理後には、液体培地中でのピペッティングなどで細胞同士の解離を確実にすることができる。また、所定の孔径を有するメッシュを通すことにより、残存する細胞塊を除去してもよい。そのような目的で用いられるメッシュとしては、孔径１～１０００μｍなどの範囲で段階的に所定の孔径を有するナイロンメッシュを備えたセルストレーナーが市販されているので、そのような市販のセルストレーナーのなかから適宜適当な孔径のものを選択して利用してもよい。
　また、図２に示されるように、この実施形態においては、細胞の剥離・分散の処理を施した細胞又は細胞集団を、細胞外マトリクス素材の存在下にインスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で浮遊培養する。浮遊培養のためには、細胞の剥離・分散の処理を施した細胞又は細胞集団を、適当な液体培地に懸濁させたうえ、非接着状態で培養することができる浮遊培養用の培養器に入れて培養することが好ましい。非接着培養用の培養器としては、具体的には、例えば、非接着性細胞培養用プラスティックディッシュなどを用いることができる。
　上記浮遊培養のための培地としては、上述したインスリン不含培地を用いればよい。ただし、これに細胞外マトリクス素材を添加する。その細胞外マトリクス素材の存在により、細胞の極性を形成させやすくなり、血管条辺縁細胞への分化の足場となる効果がある。細胞外マトリクス素材としては、細胞が三次元的に生育するときの足場として機能する素材であればよく、特に制限はないが、例えばマトリゲル、プロネクチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。これらは１種類を単独で用いてもよく２種以上を併用してもよい。細胞外マトリクス素材のインスリン不含培地中の含有量としては、通常当業者に用いられる範囲であればよく、特に制限されないが、典型的に、例えば限定されないタンパク量換算で０．０１～１０ｍｇ／ｍＬなどであり、０．０５～５ｍｇ／ｍＬなどであってよく、０．１～１ｍｇ／ｍＬなどであってよい。
　この浮遊培養は、インスリン不含培地での浮遊培養開始からトータル３０～５０日間行うことが好ましく、３５～４５日間行うことがより好ましく、４０～４５日間行うことが更により好ましい。また、その浮遊培養においては、遠心分離等により形成されたスフェア（細胞塊）を壊さないように回収して、新鮮な培地を入れ替えたり、新鮮な培地を追加したりして、更にその浮遊培養を続けてもよい。この場合、追加的な浮遊培養における培地交換や新鮮培地の追加を３～４日間ごとに行うことが好ましい。
　このようにして調製することができる三次元培養血管条辺縁細胞は、細胞間タイトジャンクションタンパク質やイオントランスポーターを発現するなど、内耳器官に内在している血管条辺縁細胞と同様な本来的な生理機能性をあらわす細胞である。
　［３］内耳血管条辺縁細胞の二次元培養
　図３には、本発明による内耳血管条辺縁細胞の製造方法の更に他の実施形態を説明するフロー図を示す。この実施形態においては、多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞に対して、以下の工程（１Ｃ）～工程（３Ｃ）の処理を施すことにより、内耳血管条辺縁細胞への分化誘導をより確実にするとともに、内耳血管条辺縁細胞による二次元的な構造（層状）が形成されるようにしている。すなわち、内耳血管条辺縁細胞の二次元培養（２Ｄ培養）を行うことができるようにしている。
　（１Ｃ）多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理する工程
　（２Ｃ）工程（１Ｃ）で得られた細胞又は細胞集団を、細胞外マトリクス素材の存在下に前記インスリン不含培地で浮遊培養する工程
　（３Ｃ）工程（２Ｃ）の浮遊培養後の細胞又は細胞集団を、別に予め接着培養したフィーダー細胞に播種して前記インスリン不含培地で培養する工程
　具体的には、図３に示されるように、この実施形態においては、上述したインスリン不含培地での浮遊培養のための工程（１Ｃ）及び工程（２Ｃ）は、図２によって説明した上記工程（１Ｂ）及び工程（２Ｂ）と共通であるが、その過程で浮遊培養中の細胞集団について、適宜、細胞を回収し、必要に応じて酵素を添加した溶液中でピペッティングして分散処理を行ったうえ、別に予め接着培養したフィーダー細胞に播種する。そして、その状態で上述したインスリン不含培地での培養を更に続ける。フィーダー細胞としては、メラノサイトあるいはメラノサイト様細胞などを用いることができる。これにより、メラノサイト等のフィーダー細胞を接着培養することにより、培養容器の内側底面等の二次元構造体の表面に沿って二次元構造状（層状）に形成されているところ、その上に播種して共培養することで、内耳血管条辺縁細胞についても二次元的な構造（層状）の形成が促される。
　このフィーダー細胞との共培養は、開始からトータル３０～５０日間行うことが好ましく、３５～４５日間行うことがより好ましく、４０～４５日間行うことが更により好ましい。また、そのフィーダー細胞との共培養においては、新鮮な培地を入れ替えたり、新鮮な培地を追加したりして、更にそのフィーダー細胞との共培養を続けてもよい。この場合、追加的な共培養における培地交換や新鮮培地の追加を３～４日間ごとに行うことが好ましい。
　このようにして調製することができる二次元培養化した内耳血管条辺縁細胞によれば、後述する実施例で示されるように、バリア機能を備えた層状の構造となるので、カリウムイオン濃度の恒常性維持に必要な細胞間のタイトジャンクション機能や一方向性イオン輸送など、内耳器官に内在している血管条辺縁細胞と同様な本来的な生理機能性をあらわす細胞が層構造を有して平面的に培養された機能的なツール細胞として、より好適に利用し得る。
　［４］薬剤の評価方法
　本発明の別の観点では、本発明は薬剤の評価方法を提供することができる。すなわち、多能性幹細胞から分化誘導した内耳血管条辺縁細胞を被検薬剤で処理する工程と、前記被検薬剤で処理した前記内耳血管条辺縁細胞の状態を評価する工程とを含む、薬剤の評価方法を提供するものである。
　本発明による薬剤の評価方法においては、多能性幹細胞から分化誘導した内耳血管条辺縁細胞に対して任意の被験薬剤を作用させて、その被験薬剤が内耳血管条辺縁細胞にどのような影響を与えるか評価することができる。よって、例えば、内耳器官の機能性にかかわる物資を有効に且つ効率的にスクリーニングするためのツールとして有用である。被験薬剤で処理する工程においては、限定されないが、例えば、上記に説明したようにして得られる内耳血管条辺縁細胞を緩衝液中に懸濁させその溶液中に被験薬剤を所定濃度で添加し、所定時間経過後に細胞の状態を観察するようにしてもよく、あるいは、上記に説明したようにして得られる内耳血管条辺縁細胞の培養下、その培養のための培地中に所定濃度を添加して、所定時間培養し、その後の細胞の状態を観察するようにしてもよい。また、その処理後に内耳血管条辺縁細胞の状態を評価する工程においては、限定されないが、例えば、内耳器官の機能性にかかわる細胞のイオン透過能、バリア機能、アポトーシス、酸化ストレス等を調べたりしてもよい。
　［５］薬剤評価用細胞培養物
　本発明の更に別の観点では、本発明は薬剤評価用細胞培養物を提供するものである。すなわち、多能性幹細胞から分化誘導した内耳血管条辺縁細胞を含有する、薬剤評価用細胞培養物を提供するものである。
　本発明による薬剤評価用細胞培養物によれば、これに任意の被験薬剤を作用させて、その被験薬剤が内耳血管条辺縁細胞にどのような影響を与えるか評価することができる、よって、例えば、内耳器官の機能性にかかわる物資を有効に且つ効率的にスクリーニングするためのツールとして有用である。当該細胞培養物の形態としては、上記内耳血管条辺縁細胞を少なくとも含む細胞又は細胞集団の形態であればよく、通常は浮遊培養により得られる細胞塊状の形態となっている。この場合、その細胞塊状の形態を保護したり保管したりする目的でメディウムや培地等の保存溶液中で保存することが好ましく、使用時には当該保存溶液を、被験薬剤を含む試験液で置換して、所定時間経過後に細胞の状態を観察するようにして、被験薬剤の評価に用いることができる。
　あるいは、上述したようにメラノサイト等のフィーダー細胞との共培養により、培養容器の内側底面等の二次元構造体の表面に沿って二次元構造状（層状）にも形成させることができるので、当該細胞培養物の形態としては、そのように二次元培養（２Ｄ培養）させた形態を採用することもできる。この場合、その二次元構造状（層状）の形態を保護したり保管したりする目的のメディウムや培地等の保存溶液で当該細胞培養物を覆うように培養容器に保存溶液を入れて保存することが好ましく、使用時には、当該保存溶液を、被験薬剤を含む試験液で置換して、所定時間経過後に細胞の状態を観察するようにして、被験薬剤の評価に用いることができる。評価は、限定されないが、例えば、内耳器官の機能性にかかわる細胞のイオン透過能、バリア機能、アポトーシス、酸化ストレス等を調べたりしてもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　（試薬）
（１）マトリゲル：コーティング剤（商品名「Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ基底膜マトリックス」、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）
（２）アクターゼ：細胞剥離用酵素製剤（商品名「Ａｃｃｕｔａｓｅ」、ナカライテスク株式会社）
（３）トリプシン様酵素製剤（商品名「ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社）
（４）Ｙ－２７６３２：ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼの特異的阻害剤）（商品名「Ｙ－２７６３２」、富士フイルム和光純薬株式会社）
（５）ｍＴｅＳＲ１：ｉＰＳ細胞用維持培地（商品名「ｍＴｅＳＲ１」、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
（６）ＤＭＥＭ／Ｆ１２：無血清培地（商品名「Ｄ－ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２」、富士フイルム和光純薬株式会社）
（７）Ｂ２７：無血清サプリメント（５０Ｘ）（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｂ－２７　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
（８）Ｎ２：無血清サプリメント（１００Ｘ）（商品名「Ｇｉｂｃｏ　Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
（９）Ｎ２１－Ｉｎｓ：無血清サプリメント（５０Ｘ）（商品名「Ｎ２１－ＭＡＸ　Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）
（１０）ＧｌｕｔａＭＡＸ：無血清サプリメント（１００Ｘ）（商品名「Ｇｉｂｃｏ　ＧｌｕｔａＭＡＸ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
（１１）Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ（１００Ｘ）：非必須アミノ酸サプリメント（商品名「ＭＥＭ　非必須アミノ酸溶液」、ナカライテスク株式会社）
（１２）ｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ／ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ：コーティング剤（商品名「Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）、（商品名「Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）
（１３）ｂＦＧＦ（商品名「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－ｂａｓｉｃ」、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）
（１４）ＦＧＦ３（商品名「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－３　ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）
（１５）ＦＧＦ１０（商品名「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－１０　ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）
（１６）ＦＧＦ１９（商品名「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ－１９　ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）
（１７）ＢＭＰ４（商品名「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＭＰ－４　ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）
（１８）ＩＧＦ－１（商品名「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＧＦ－１　Ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社）
（１９）ＳＢ４３１５４２：ＴＧＦ－β受容体阻害剤（商品名「ＳＢ４３１５４２」、リプロセル社）
（２０）ヘパリン（商品名「へパラン硫酸ナトリウム塩」、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）
（２１）Ｌ－グルタミン（商品名「Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ」、ナカライテスク株式会社）
（２２）ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ：コーティング剤（商品名「ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ」、ｎｉｐｐｉ社）
（２３）ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ：ｉＰＳ細胞用維持培地（商品名「ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ」、味の素社）
（２４）ＣＨＩＲ９９０２１：ＧＳＫ－３阻害剤（商品名「ＣＨＩＲ－９９０２１」、Ｆｏｃｕｓ　ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ社）
（２５）ｑＰＣＲに用いたプライマーの配列を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

　なお、以下の試験例において細胞培養の培地には、必要に応じて、適宜抗菌剤としてアンピシリン１００μｇ／ｍＬの濃度で使用した。また、特に言及しない場合には、培養は通常酸素条件下（Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）に行った。
　［試験例１］
　本試験例では、ヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞を分化誘導した。
　［分化誘導方法］
（分化誘導前：（－）Ｄａｙ２）
１）　６ウェルプレートをマトリゲルでコーティングした。
２）　コンフルエントなｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅヒトｉＰＳ細胞にアクターゼを添加して３７℃で２～３分インキュベートし、ディッシュから剥離した。
３）　ＰＢＳで希釈後遠心し、細胞を回収した。
４）　上澄みをすてＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）（１０μＭ）を加えたｍＴｅＳＲ１メディウムに細胞を懸濁した。
５）　ナイロンメッシュ（孔径４０μｍ）を通し、血球計算盤で細胞数をカウントした。
６）　前記１）でマトリゲルコーティングしたウェルにＹ－２７６３２を添加したｍＴｅＳＲ１メディウムを加えた。
７）　１ウェルあたり２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように細胞懸濁液を播種した。
（分化誘導前：（－）Ｄａｙ１）
　ＲＯＣＫ阻害剤を含まないｍＴｅＳＲ１メディウムに培地交換した。
（Ｄａｙ０）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ）に培地交換した。以後、Ｄａｙ２まで、毎日培地交換した。
（Ｄａｙ３）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ）に、成長因子ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９、ＢＭＰ４を、それぞれ濃度が２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地に培地交換した。以後、Ｄａｙ５まで、毎日培地交換した。
（Ｄａｙ６）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ）に、成長因子ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９を添加した培地（成長因子の濃度は全て２５ｎｇ／ｍＬ）に培地交換し、Ｄａｙ８まで培養した。
（Ｄａｙ９）
　細胞にアクターゼを添加して３７℃で２～３分インキュベートし、ディッシュから剥離し、ＰＢＳで希釈した。遠心して細胞を回収し、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２）に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、更に、成長因子ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９を、それぞれ濃度が２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加して調製した培地で懸濁した。この細胞懸濁液を、１ウェルあたり細胞剥離処理前のおよそ３分の１の細胞濃度となるようにｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ／ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングしたウェルに播種し、低酸素条件下（Ｏ２４％、ＣＯ２５％）で接着培養を行った。
（Ｄａｙ１０）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２）に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、更に、成長因子ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１を、それぞれ濃度が２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して調製した培地で培地交換を行った。
（Ｄａｙ１２）
　分化誘導の開始から１２日目（Ｄａｙ１２）の細胞について、ＲＮｅａｓｙスピンカラムキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、各サンプル１μｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡから逆転写酵素（商品名「Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＶ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によりｃＤＮＡ合成を行い、マーカー遺伝子の発現量をｑＰＣＲにより定量した。
　その結果、内耳前駆細胞のマーカー分子であることが知られたＰＡＸ２、ＰＡＸ８など、内耳前駆細胞に特有の遺伝子の発現が確認された。
　また、分化誘導の開始から１２日目（Ｄａｙ１２）の細胞について、各種マーカータンパク質の発現状態を免疫染色により調べた。
　［１］ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＳＯＸ２（Ｄａｙ１２）
　分化誘導の開始から１２日目（Ｄａｙ１２）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で２０分間処理して固定し、０．３％ＰＢＳＴで３０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．３％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、マウス抗ＰＡＸ２抗体、ウサギ抗ＰＡＸ８抗体、ヤギ抗ＳＯＸ２抗体をそれぞれ１：５００、１：５００、１：５００の濃度で用い、室温で２時間反応させた。それぞれの一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図４には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：５０μｍ）。
　その結果、図４に示されるように、内耳前駆細胞のマーカータンパク質として知られるＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＳＯＸ２の発現が確認された。したがって、上記方法によって、ヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞が分化誘導されることが確認された。
　［試験例２］
　本試験例では、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞を分化誘導した。
　［分化誘導方法］
（Ｄａｙ１２）
　試験例１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞への分化誘導を行い、分化誘導の開始から１２日目（Ｄａｙ１２）の細胞をアクターゼで剥離し、等量のＰＢＳを加えて、ナイロンメッシュ（孔径４０μｍ）を通し、血球計算盤で細胞数をカウントした。
　５×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍLの濃度になるように細胞を懸濁し、低接着６ウェルプレート（商品名「Ｃｏｒｎｉｎｇ超低接着表面（Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）プレート」、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、低酸素条件下（Ｏ２４％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を開始した。このとき、培地としては、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２）に、成長因子ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０を、それぞれ濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、Ｙ－２７６３２を濃度が１０μＭとなるように添加し、マトリゲルを濃度が１％となるように添加し、ＳＢ４３１５４２を濃度が２μＭとなるように添加し、ヘパリンを濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して調製した培地を使用して、細胞を懸濁して浮遊培養を開始した。
（Ｄａｙ１６）
　浮遊培養の開始後４日目（Ｄａｙ１６）に、浮遊培養を開始したときの培地からマトリゲルとＹ－２７６３２を除いた組成の培地で全量培地交換を行い、更に低酸素条件下（Ｏ２４％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を継続した。
（Ｄａｙ２０）
　浮遊培養の開始後８日目（Ｄａｙ２０）に、培地として、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｎ２１－Ｉｎｓ）に、成長因子ＥＧＦ、ＦＧＦ３、ＢＭＰ４を、それぞれ濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、ヘパリンを濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して調製した培地を使用し、全量培地交換を行い、更に通常酸素条件下（Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を継続した。
（Ｄａｙ２４）
　浮遊培養の開始後１２日目（Ｄａｙ２４）に、培地として、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｎ２１－Ｉｎｓ）に、成長因子ＥＧＦ、ＦＧＦ３を、それぞれ濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、ＳＢ４３１５４２を濃度が２μＭとなるように添加して調製した培地を使用し、全量培地交換を行い、更に通常酸素条件下（Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を継続した。
（Ｄａｙ３２）
　浮遊培養の開始後２０日目（Ｄａｙ３２）に、培地として、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｎ２１－Ｉｎｓ）に、成長因子ｂＦＧＦ、ＥＧＦを、それぞれ濃度が２ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、ＳＢ４３１５４２を濃度が２μＭとなるように添加して調製した培地を使用し、全量培地交換を行い、更に通常酸素条件下（Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を継続した。
（Ｄａｙ３６）
　浮遊培養の開始後２４日目（Ｄａｙ３６）に、培地として、Ｄａｙ３２で培地交換に使用したのと同じ組成の培地を使用し、全量培地交換を行い、更に通常酸素条件下（Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を継続した。
（Ｄａｙ４０）
　浮遊培養の開始後２８日目（Ｄａｙ４０）に、培地として、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｎ２１－Ｉｎｓ）に、成長因子ＥＧＦを、その濃度が１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、ＳＢ４３１５４２を濃度が２μＭとなるように添加して調製した培地を使用し、全量培地交換を行った。その後は、Ｄａｙ６３まで３日に１度の頻度で培地交換を行い、更に通常酸素条件下（Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を継続した。
　上記方法による分化誘導の過程にある細胞や分化誘導後の細胞について、各種マーカータンパク質の発現状態を免疫染色により調べた。
　［２－１］ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＥ１、ＬＲＰ２（Ｄａｙ６３）
　浮遊培養の開始後５１日目（Ｄａｙ６３）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて４℃で３時間処理して固定し、７μｍの凍結切片を作成した。その凍結切片を０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、マウス抗ＬＲＰ抗体、ウサギ抗ＫＣＮＥ１抗体、ヤギ抗ＫＣＮＱ１抗体をそれぞれ１：２００、１：２００、１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。それぞれの一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図５には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：左段２０μｍ、右段２０μｍ）。
　その結果、図５に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＫＣＮＱ１、ＫＣＮＥ１、ＬＲＰ２の発現が検出された。また、それらは細胞膜に共局在しており、内在辺縁細胞での発現様式を再現できていると考えられた。
　［２－２］ＮＫＣＣ１、ＫＣＮＱ１（Ｄａｙ６３）
　浮遊培養の開始後５１日目（Ｄａｙ６３）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて４℃で３時間処理して固定し、７μｍの凍結切片を作成した。その凍結切片を０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ウサギ抗ＫＣＮＱ１抗体、ヤギ抗ＮＫＣＣ１抗体をそれぞれ１：２００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。それぞれの一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図６には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：５０μｍ）。
　その結果、図６に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮＫＣＣ１、ＫＣＮＱ１の発現が検出された。また、それらは細胞膜で共局在しておらず、内在辺縁細胞での発現様式を再現できていると考えられた。
　［２－３］Ｎａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅ（Ｄａｙ２４）
　浮遊培養の開始後１２日目（Ｄａｙ２４）の細胞を、１０％ＴＣＡを用いて４℃で１５分間処理して固定し、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ウサギ抗Ｎａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅ抗体を１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させ、共焦点顕微鏡で観察した。図７には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：２０μｍ）。
　その結果、図７に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅの発現が検出された。また、それは細胞膜に局在しており、内在辺縁細胞での発現様式を再現できていると考えられた。
　［２－４］ＬＭＸ１、ＥＳＲＲＢ（Ｄａｙ４０）
　浮遊培養の開始後２８日目（Ｄａｙ４０）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で２０分間処理して固定し、０．３％ＰＢＳＴで２０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．３％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、マウス抗ＥＳＲＲＢ抗体、ウサギ抗ＬＭＸ１抗体をそれぞれ１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。それぞれの一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で２時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図８には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：２０μｍ）。
　その結果、図８に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＬＭＸ１、ＥＳＲＲＢの発現が検出された。また、それは核に局在しており、内在辺縁細胞での発現様式を再現できていると考えられた。
　［２－５］Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（Ｄａｙ５２）
　浮遊培養の開始後４０日目（Ｄａｙ５２）の細胞を、１０％ＴＣＡを用いて４℃で１５分間処理して固定し、０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ウサギ抗Ｏｃｃｌｕｄｉｎ抗体を１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させ、共焦点顕微鏡で観察した。図９には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：２０μｍ）。
　その結果、図９に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＯｃｃｌｕｄｉｎの発現が検出された。また、それは特徴的な敷石状のシグナルを示し、分化誘導した細胞は上皮細胞様細胞である内耳血管条辺縁細胞であると考えられた。
　［２－６］ＺＯ－１（Ｄａｙ４３）
　浮遊培養の開始後３１日目（Ｄａｙ４３）の細胞を、１０％ＴＣＡを用いて４℃で１５分間処理して固定し、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ヤギ抗ＺＯ－１抗体を１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で２時間反応させ、共焦点顕微鏡で観察した。図１０には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：２０μｍ）。
　その結果、図１０に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＺＯ－１の発現が検出された。また、それは上皮細胞に特徴的な敷石状のシグナルを示し、分化誘導した細胞は上皮細胞様細胞である血管条辺縁細胞であると考えられた。
　以上の結果から、本誘導法を用いて培養することで、多能性幹細胞から分化誘導して得られた内耳前駆細胞を、更に内耳血管条辺縁細胞にまで分化誘導できることが明らかとなった。
　［試験例３］
　本試験例では、試験例１とは異なる方法でヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞を分化誘導し、該内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞を分化誘導した。
　［内耳前駆細胞の分化誘導方法］
（分化誘導前：（－）Ｄａｙ２）
１）　６ウェルプレートをｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋでコーティングした。
２）　コンフルエントなｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅヒトｉＰＳ細胞にアクターゼを添加して３７℃で２～３分インキュベートし、ディッシュから剥離した。
３）　ＰＢＳで希釈後遠心し、細胞を回収した。
４）　上澄みをすてＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ－２７６３２）（１０μＭ）を加えたＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎに細胞を懸濁した。
５）　ナイロンメッシュ（孔径４０μｍ）を通し、血球計算盤で細胞数をカウントした。
６）　前記１）でｉＭａｔｒｉｘ－５１１　ｓｉｌｋ　コーティングしたウェルにＹ－２７６３２を添加したＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎを加えた。
７）　１ウェルあたり２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように細胞懸濁液を播種した。
（分化誘導前：（－）Ｄａｙ１）
　ＲＯＣＫ阻害剤を含まないＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎに培地交換した。
（Ｄａｙ０）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ）に培地交換した。以後、Ｄａｙ２まで、毎日培地交換した。
（Ｄａｙ３）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ）に、成長因子ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９、ＢＭＰ４を、それぞれ濃度が２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した培地に培地交換した。以後、Ｄａｙ５まで、毎日培地交換した。
（Ｄａｙ６）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２＋１％ＧｌｕｔａＭＡＸ＋１％Ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏａｃｉｄ）に、成長因子ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９、ＣＨＩＲ９９０２１を添加した培地（成長因子の濃度は全て２５ｎｇ／ｍＬ、ＧＳＫ－３阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は８μＭ）に培地交換し、Ｄａｙ８まで培養した。
（Ｄａｙ９）
　細胞にアクターゼを添加して３７℃で２～３分インキュベートし、ディッシュから剥離し、ＰＢＳで希釈した。遠心して細胞を回収し、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２）に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、更に、成長因子ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１９を、それぞれ濃度が２５ｎｇ／ｍＬとなるように添加して調製した培地で懸濁した。この細胞懸濁液を、１ウェルあたり細胞剥離処理前のおよそ３分の１の細胞濃度となるようにｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ／ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎでコーティングしたウェルに播種し、低酸素条件下（Ｏ２４％、ＣＯ２５％）で接着培養を行った。
（Ｄａｙ１０）
　無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２）に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、更に、成長因子ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１を、それぞれ濃度が２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して調製した培地で培地交換を行った。
　［内耳血管条辺縁細胞の分化誘導方法］
（Ｄａｙ１１）
　試験例２－Ｄａｙ１２以降と同様の方法で内耳血管条辺縁細胞を分化誘導した。
　上記方法による分化誘導後の細胞について、各種マーカータンパク質の発現状態を免疫染色により調べた。
　［３－１］ＮＫＣＣ１（Ｄａｙ６０）
　浮遊培養の開始後４９日目（Ｄａｙ６０）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で１５分処理して固定し、７μｍの凍結切片を作成した。その凍結切片を０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｇｏａｔ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ウサギ抗ＮＫＣＣ１抗体を１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図１１には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：１０μｍ）。
　その結果、図１１に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮＫＣＣ１の発現が確認された。したがって、上記方法によって、試験例１とは異なる方法でヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された内耳前駆細胞から、内耳血管条辺縁細胞が分化誘導されることが確認された。
　［３－２］ＥＳＲＲＢ、ＫＣＮＱ１（Ｄａｙ６０）
　浮遊培養の開始後４９日目（Ｄａｙ６０）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で１５分処理して固定し、７μｍの凍結切片を作成した。その凍結切片を０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、マウス抗ＥＳＲＲＢ抗体、ウサギ抗ＫＣＮＱ１抗体をそれぞれ１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図１２には、共焦点顕微鏡で観察して得られた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：１０μｍ）。
　その結果、図１２に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＥＳＲＲＢ、ＫＣＮＱ１の発現が検出された。また、ＥＳＲＲＢは核に局在しており、内在辺縁細胞での発現様式を再現できていると考えられた。
　［３－３］ＺＯ－１、Ｃｌａｕｄｉｎ－１、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（Ｄａｙ６０）
　浮遊培養の開始後４９日目（Ｄａｙ６０）の細胞を、１０％ＴＣＡを用いて４℃で１５分間処理して固定し、７μｍの凍結切片を作成した。その凍結切片を０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｇｏａｔ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった（ＺＯ－１抗体はブロッキングなし）。一次抗体としては、ヤギ抗ＺＯ－１抗体、ウサギ抗Ｃｌａｕｄｉｎ－１抗体、ウサギ抗Ｏｃｃｌｕｄｉｎ抗体をそれぞれ１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図１３には、キーエンスＢＺ－Ｘ８１０顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：１０μｍ）。
　その結果、図１３に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＺＯ－１、Ｃｌａｕｄｉｎ－１及びＯｃｃｌｕｄｉｎの発現が検出された。また、それらは特徴的な敷石状のシグナルを示し、分化誘導した細胞は上皮細胞様細胞である内耳血管条辺縁細胞であると考えられた。
　［試験例４］
　本試験例では、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞を分化誘導するにあたり、その内耳血管条辺縁細胞の二次元培養を試みた。
　［分化誘導方法（その１）］
（Ｄａｙ２０）
　試験例１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞を得、その内耳前駆細胞を用いて試験例２と同様の方法でＤａｙ２０まで培養した。
　細胞を回収し、トリプシン様酵素製剤（商品名「ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ」、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社）にＥＤＴＡを１ｍＭとなるよう添加したものを使用して、３７℃で２０分間処理した後、３～５倍量のＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えて、ナイロンメッシュ（孔径４０μｍ）を通し、血球計算盤で細胞数をカウントした。
　剥離処理後の細胞を１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／１０ｍLの濃度になるようにＤａｙ２０の培地と同じ組成の培地に懸濁し、別に予め培養したフィーダー細胞に播種した。なお、フィーダー細胞としてはメラノサイト（商品名「正常ヒト表皮メラノサイト」、ＴＡＫＡＲＡ社）を８ウェルチャンバー（商品名「チャンバースライドＩＩ」、ＩＷＡＫＩ社）の１ウェルあたり１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で播種して、メラノサイト増殖用Ｍ２培地（ＴＡＫＡＲＡ社）で６～７日間培養することより、コンフルエントになるまで接着培養することにより調製した。
　以後、浮遊培養を行ったときと同じ組成の培地を用いて、培地交換のタイミングも同様に行って、浮遊培養の開始後５３日目（Ｄａｙ６５）までフィーダー細胞（メラノサイト）との共培養を行った。
　［４－１］ＺＯ－１、Ｃｌａｕｄｉｎ－１（Ｄａｙ６５）
　浮遊培養の開始後５３日目（Ｄａｙ６５）の細胞を、１０％ＴＣＡを用いて４℃で１５分間処理して固定し、０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ヤギ抗ＺＯ－１抗体、ウサギ抗Ｃｌａｕｄｉｎ－１抗体をそれぞれ１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図１４には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：２０μｍ）。
　その結果、図１４に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における細胞間タイトジャンクションタンパク質として知られるＺＯ－１及びＣｌａｕｄｉｎ－１の発現が検出された。また、それは上皮細胞に特徴的な敷石状のシグナルを示しており、予め接着培養したメラノサイトとの共培養によりメラノサイト上に単層で増殖・伸展した二次元培養においても、上皮細胞様細胞である内耳血管条辺縁細胞を分化誘導できたと考えられた。
　［分化誘導方法（その２）］
（Ｄａｙ２０）
　試験例１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞を得、その内耳前駆細胞を用いて試験例２と同様の方法でＤａｙ２１まで培養した。
　以後、「分化誘導方法（その１）」と同様にして、フィーダー細胞（メラノサイト）との共培養を、浮遊培養の開始後４８日目（Ｄａｙ６０）まで行った。
　［４－２］Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（Ｄａｙ６０）
　浮遊培養の開始後４８日目（Ｄａｙ６０）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で１５分間処理して固定し、０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ウサギ抗Ｏｃｃｌｕｄｉｎ抗体を１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図１５には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：１０μｍ）。
　その結果、図１５に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における細胞間のタイトジャンクションタンパク質として知られるＯｃｃｌｕｄｉｎの発現が検出された。また、それは上皮細胞に特徴的な敷石状のシグナルを示しており、予め接着培養したメラノサイトとの共培養によりメラノサイト上に単層で増殖・伸展した二次元培養においても、上皮細胞様細胞である内耳血管条辺縁細胞を分化誘導できたと考えられた。
　［分化誘導方法（その３）］
（Ｄａｙ２０）
　試験例１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞を得、その内耳前駆細胞を用いて試験例２と同様の方法でＤａｙ２０まで培養した。
　以後、「分化誘導方法（その１）」と同様にして、フィーダー細胞（メラノサイト）との共培養を、浮遊培養の開始後５３日目（Ｄａｙ６５）まで行った。
　［４－３］ＮＫＣＣ１、ＫＣＮＱ１、ＬＲＰ２（Ｄａｙ６５）
　浮遊培養の開始後４８日目（Ｄａｙ６０）の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて４℃で一晩処理して固定し、０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ヤギ抗ＮＫＣＣ１抗体、ウサギ抗ＫＣＮＱ１抗体、マウス抗ＬＲＰ２抗体をそれぞれ１：１００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図１６には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：上段１０μｍ、下段５μｍ）。
　その結果、図１６に示されるように、内耳血管条辺縁細胞における機能性タンパク質として知られるＮＫＣＣ１、ＫＣＮＱ１、ＬＲＰ２の発現が検出された。また、ＫＣＮＱ１、ＬＲＰ２は細胞膜に共局在している一方、ＮＫＣＣ１、ＫＣＮＱ１は細胞膜で共局在しておらず、二次元培養においても、辺縁細胞マーカーを内在辺縁細胞と同様の極性で発現する細胞を分化誘導できたと考えられた。
　［試験例５］
　本試験例では、内耳前駆細胞から内耳血管条辺縁細胞へと分化誘導する過程において、その培地としてインスリン不含培地を用いることによる効果を検討した。
　［分化誘導方法］
（Ｄａｙ１２）
　試験例１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞への分化誘導を行い、分化誘導の開始から１２日目（Ｄａｙ１２）の細胞をアクターゼで剥離し、等量のＰＢＳを加えて、ナイロンメッシュ（孔径４０μｍ）を通し、血球計算盤で細胞数をカウントした。
　５×１０５ｃｅｌｌｓ／１０ｍLの濃度になるように細胞を懸濁し、低接着６ウェルプレート（商品名「Ｃｏｒｎｉｎｇ超低接着表面（Ｕｌｔｒａ－Ｌｏｗ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）プレート」、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、低酸素条件下（Ｏ２４％、ＣＯ２５％）で浮遊培養を開始した。このとき、培地としては、無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２）に、成長因子ｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ－１、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０を、それぞれ濃度が１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、更に、Ｌ－グルタミンを濃度が２ｍＭとなるように添加し、Ｙ－２７６３２を濃度が１０μＭとなるように添加し、マトリゲルを濃度が１％となるように添加し、ＳＢ４３１５４２を濃度が１μＭとなるように添加し、ヘパリンを濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して調製した培地を使用して、細胞を懸濁して浮遊培養を開始した。
　浮遊培養の開始後８日目（Ｄａｙ２０）から、以下の３種類の異なる培養条件で培養を行った。
・条件１）インスリン含有血清代替物使用培地：
　培地として無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｂ２７＋１％Ｎ２）を用いる以外は、試験例２－Ｄａｙ２０以降と同様の方法でＤａｙ５９まで浮遊培養を継続した。
・条件２）インスリン不含培地：
　培地として無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｎ２１－Ｉｎｓ）を用いる以外は、試験例２－Ｄａｙ２０以降と同様の方法でＤａｙ５９まで浮遊培養を継続した。
・条件３）インスリン不含培地にインスリンを添加した培地：
　培地として無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％Ｎ２１－Ｉｎｓ）に、インスリンを１.５μＭとなるように添加した培地を用いる以外は、試験例２－Ｄａｙ２０以降と同様の方法でＤａｙ５９まで浮遊培養を継続した。
（Ｄａｙ６０）
　上記条件１）～３）のいずれの場合も、浮遊培養の開始後４８日目（Ｄａｙ６０）の細胞を回収して、内耳器官であるライスナー膜に発現することが知られる一方、内耳血管条辺縁細胞には発現が乏しいことが知られるＯＴＸ２の遺伝子の発現量を、試験例１と同様にしてｑＰＣＲにより定量した。
　その結果、図１７に示されるように、培地にインスリンを含有する場合（インスリン含有血清代替物使用培地及びインスリン不含培地にインスリンを添加した培地）と比較して、インスリンを含有しない場合に、ＯＴＸ２の発現量が低いことがわかった。すなわち、インスリンを培地に添加しないことでＯＴＸ２発現量を低下させることができた。このことにより、内在辺縁細胞と同様な本来的な生理機能性をあらわす細胞を得るには、インスリン不含培地を用いることが必要であると考えられた。
　［試験例６］
　試験例１と同様の方法でヒトｉＰＳ細胞から内耳前駆細胞を得、その内耳前駆細胞を用いて試験例２と同様の方法で浮遊培養の開始後４９日目（Ｄａｙ６１）まで浮遊培養を継続した。
　得られた細胞について、バリア機能アッセイを行った。具体的には、浮遊培養後の培養物を細胞ごと１．５ｍＬ容量のマイクロチューブに入れ、遠心分離して、培地を捨て、２ｍＭＥＤＴＡを含むＨＢＳＳを０．５ｍＬ加えた。また、対照として、同様の条件でＥＤＴＡを含まないＨＢＢＳを添加したしたものも用意した。それぞれを容器ごと氷上で１５分間置き、その後、それぞれに４ｋＤａ　ＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎを２ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう加えて、懸濁し、直ちに共焦点顕微鏡で観察した。
　その結果、図１８上段に示されるように、ＥＤＴＡ非処理ではＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ(蛍光）が細胞塊内部へ移行することを示す蛍光像は観察できなかったのに対して、図１８下段に示されるように、ＥＤＴＡ処理によりＦＩＴＣ－Ｄｅｘｔｒａｎ(蛍光）が細胞塊内部へ移行することを示す蛍光像は観察された。これは、ＥＤＴＡ非処理では細胞間のバリア機能が発揮されて細胞塊内部へ移行がみられなかったのに対して、ＥＤＴＡ処理により、カルシウム依存的なバリア機能が損なわれて細胞塊内部へ移行がみられたものであると考えられた。
　以上から、本発明の方法により、内耳器官に内在している血管条辺縁細胞と同様な本来的な生理機能性をあらわす細胞が得られることが明らかとなった。
　［試験例７］
　本試験例では、試験例３と同様の方法で分化誘導した内耳血管条辺縁細胞を用いて、薬剤の評価を行なった。
　具体的には、試験例３における浮遊培養の開始後４７日目（Ｄａｙ５８）に、培地に１０μＭシスプラチン（抗ガン剤）または１００μＭネオマイシン（アミノ配糖体系抗生剤）を添加し、通常酸素条件下（Ｏ２２０％、ＣＯ２５％）でＤａｙ６０まで４８時間、浮遊培養を継続した。
　上記方法による薬剤処理後の細胞について、各種マーカータンパク質の発現状態を免疫染色により調べた。
　[７－１］ｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３、ＺＯ－１（Ｄａｙ６０）
　浮遊培養の開始後４９日目（Ｄａｙ６０）、薬剤処理の開始後２日目の細胞を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で３０分処理して固定し、７μｍの凍結切片を作成した。また、対照として、薬剤処理を行わない浮遊培養の開始後４９日目（Ｄａｙ６０）の細胞を用いて、同様に凍結切片を作成した。それぞれの凍結切片を０．３％ＰＢＳＴで１０分間処理した後、１０％ｎｏｒｍａｌ　ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍ／０．１％ＰＢＳＴにより室温で１時間ブロッキングを行なった。一次抗体としては、ウサギ抗ｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３抗体、ヤギ抗ＺＯ－１抗体をそれぞれ１：２００の濃度で用い、４℃で一晩反応させた。一次抗体のＩｇＧ動物種に特異的な蛍光標識二次抗体を室温で１時間反応させた。また、核をＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で染色した。図１９には、共焦点顕微鏡で観察して得らえた顕微鏡観察像を示す（ｓｃａｌｅ　ｂａｒ：２０μｍ）。
　更に、それぞれの顕微鏡観察像においてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８により総細胞数をカウントし、またｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３を発現している細胞数をカウントし、総細胞数に対するｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３発現細胞の割合を計算した。結果を図２０に示す。
　その結果、図１９及び図２０に示されるように、各薬剤で処理を行うと、アポトーシスのマーカーとして知られるｃｌｅａｖｅｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３を発現している細胞が、対照と比較して増加することが確認された。以上から、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞を用いることにより、各種薬剤による耳毒性を評価できることが明らかとなった。

Claims (14)

  1. 　多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養する工程を含む、内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
  2. 　前記インスリン不含培地はインスリン濃度が０ｎＭ以上１００ｎＭ以下である、請求項１記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
  3. 　前記インスリン不含培地は、ＥＧＦを含み、更にｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、及びＢＭＰ４からなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上を含む、請求項１又は２記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
  4. 　前記インスリン不含培地は、ＦＧＦ３及びＢＭＰ４を選択するものである、請求項３に記載の血管条辺縁細胞の製造方法。
  5. 　請求項１記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法であって、以下の工程（１）及び工程（２）を含む、該内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
    　（１）多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理する工程
    　（２）工程（１）で得られた細胞又は細胞集団を、細胞外マトリクス素材の存在下に前記インスリン不含培地で浮遊培養する工程
  6. 　前記細胞外マトリクス素材は、マトリゲル、プロネクチン、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種又は２種以上を含む、請求項５記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
  7. 　請求項１記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法であって、以下の工程（１）～工程（３）を含む、該血管条辺縁細胞の製造方法。
    　（１）多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団を、細胞剥離・分散処理する工程
    　（２）工程（１）で得られた細胞又は細胞集団を、細胞外マトリクス素材の存在下に前記インスリン不含培地で浮遊培養する工程
    　（３）工程（２）の浮遊培養後の細胞又は細胞集団を、別に予め接着培養したフィーダー細胞に播種して前記インスリン不含培地で培養する工程
  8. 　前記フィーダー細胞がメラノサイト又はメラノサイト様細胞である、請求項７記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
  9. 　前記多能性幹細胞から分化誘導した内耳前駆細胞を含む細胞集団が、以下の工程（１）～工程（４）を含む方法で得られたものである、請求項１記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
    　（１）多能性幹細胞を、成長因子無添加、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養する工程
    　（２）工程（１）で得られた細胞集団を、成長因子無添加、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で培養する工程
    　（３）工程（２）で得られた細胞集団を、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子、及びＢＭＰ４の存在下で培養する工程
    　（４）工程（３）で得られた細胞集団を、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ３、ＦＧＦ１０、及びＦＧＦ１９からなる群から選ばれた少なくとも１種の成長因子の存在下であって、ＢＭＰ４の非存在下で培養する工程
  10. 　前記内耳血管条辺縁細胞を無血清条件下に得るものである、請求項１記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
  11. 　前記内耳血管条辺縁細胞は、カリウムチャネルタンパク質及びタイトジャンクションタンパク質を発現するものである、請求項１記載の内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
  12. 　内耳前駆細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞を被検薬剤で処理する工程と、前記被検薬剤で処理した前記内耳血管条辺縁細胞の状態を評価する工程とを含む、薬剤の評価方法。
  13. 　内耳前駆細胞から分化誘導してなる内耳血管条辺縁細胞を含有する、薬剤評価用細胞培養物。
  14. 　内耳前駆細胞を含む細胞集団を、インスリンを含有しないか又はトレース量しか含有しないインスリン不含培地で培養する工程を含む、内耳血管条辺縁細胞の製造方法。
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