KR20220001503A - 중뇌 오가노이드의 고속 및 대량 제조 방법 및 이에 의해 제조된 중뇌 오가노이드 - Google Patents

중뇌 오가노이드의 고속 및 대량 제조 방법 및 이에 의해 제조된 중뇌 오가노이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중뇌 오가노이드의 고속대량 생산방법 및 이에 의해 제조된 중뇌 오가노이드에 관한 것으로서, 상기 제조된 오가노이드는 비정상적 분화 (out-growth)가 차단되고, 데드 코어 (dead core) 현상을 최소화하고, 오가노이드 간의 편차가 감소될 수 있다.

Description

중뇌 오가노이드의 고속 및 대량 제조 방법 및 이에 의해 제조된 중뇌 오가노이드 {High-speed and large-scale manufacturing method of midbrain organoids and midbrain organoids prepared thereby}
본 발명은 중뇌 (Midbrain) 오가노이드의 고속 및 대량 제조방법 및 이에 의해 제조된 중뇌 오가노이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 중뇌 오가노이드 제작에 필요한 초기 시작 세포 수 (starting cell number)와 배양방식 (culture format)을 조절함으로써 품질이 우수하고 개체간 변이가 적은 중뇌 오가노이드를 고속 및 대량 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
오가노이드란 줄기 세포의 분화능 (differentiation), 자기 재생능 (self-renewal), 자가 조직화능 (self-organization)을 활용하여 3차원 배양을 통해 체내 장기와 유사한 세포조성 및 구조를 재현해 내는 새로운 줄기 세포 분화기법으로, 체내 장기와 유사한 환경을 모사함으로써 다양한 질환의 질환 모사 연구 및 치료 약물 스크리닝 연구에 활용 가능한 기술이다. 나아가 환자 맞춤형 오가노이드 생산을 통해, 다양한 질환에 대한 환자 맞춤형 치료제를 저비용, 단기간에 생산할 수 있는 미래 기술로 평가받고 있다.
최근 다양한 뇌 부위 특성을 반영하는 뇌 오가노이드 생산이 보고되고 있으며, 뇌 오가노이드를 이용한 지카 바이러스(ZIKA virus) 연구 혹은 환자 유래 뇌 오가노이드를 이용한 질환 모사 및 신약개발 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.
그러나, 환자 맞춤형 오가노이드 생산에는 많은 비용과 오랜 시간이 소요된다. 도 1과 같이, 실제 환자 유래 유도만능줄기 세포 (induced pluripotent stem cell; iPSCs) 생산에는 보통 6 내지 8주 이상이 소요되며, 그 효율도 보통 0.02% 정도로 매우 낮다. 나아가 오가노이드 생산에 걸리는 시간은 각 장기별 오가노이드에 따라 상이하지만 대부분 3 내지 6개월 이상이 소요된다. 따라서, 환자의 연령이 높은 퇴행성 뇌질환 및 기타 시급한 약물 치료가 요구되는 환자의 경우 환자 맞춤형 신약개발 등이 현실적으로 어려운 상황이다.
또한, 뇌 오가노이드를 포함한 대부분의 오가노이드 생산에는 아래와 같은 문제점들이 있으며, 이는 오가노이드 연구의 실용화 또는 산업화를 위해 반드시 해결되어야 하는 문제점들이다.
첫째, 오가노이드 생산에는 많은 비용과 시간이 소요된다. 오가노이드로의 분화 및 성숙화를 위해 오가노이드 내부까지 산소 및 영양분의 공급이 필요하고, 이를 위해 대부분의 경우 진탕 생물반응기 (shaking bioreactor)를 활용한 CO2 인큐베이터 (incubator) 내에서 지속적인 진탕 (shaking) 및 분화가 필수적이며 장기 특이적 오가노이드로의 분화를 위해서 장기간 고가의 분화촉진인자를 처리해야 한다. 따라서 장기 특이적 오가노이드 생산을 위해서는 많은 비용이 소모된다 (도 1).
둘째, 오가노이드 간 개체간 변이 (batch variation)가 매우 심하며 (도 2), 따라서, 오가노이드를 활용한 질환 모사 연구 및 신약 스크리닝 연구에서 부정확한 결과를 야기할 수 있다.
셋째, 오가노이드 분화시 "비정상적 분화 (out-growth)"라는 비정상적인 조직이 만들어지며, 이는 오가노이드의 품질과 기능성 등을 저해하는 심각한 문제점이다 (도 2).
넷째, 현재 오가노이드 내부에는 혈관이 없고, 따라서 오가노이드의 코어까지 산소 및 영양분이 제대로 전달되지 못해 내부 세포들이 죽어나가는 "데드 코어 (dead core)" 현상이 일반적이며 이는 오가노이드의 성숙화를 저해하기 때문에 반드시 해결되어야 하는 문제점이다 (도 2).
다섯째, 오가노이드 기반 고속 대량 스크리닝 (high throughput screening; HTS)을 통한 약물 스크리닝 (drug screening) 혹은 약물 재창출 (drug repositioning) 연구를 위해서는 HTS 포맷 (format)에 맞는 오가노이드 대량 생산 시스템 개발이 필요하다. 또한, HTS 포맷에서 오가노이드의 생산과 약물 스크리닝을 일원화하여 진행 가능한 전주기적 one-step 오가노이드 생산 및 신약개발 시스템 개발은 향후 오가노이드의 자동화 생산을 통한 실용화 기반구축에 반드시 필요한 부분이다.
이에 본 발명자들은 중뇌 오가노이드의 고속/대량 생산을 위하여 일반적인 진탕 생물반응기 (shaking bioreactor)가 아닌 96 또는 384 웰 (well) 등 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 중뇌 오가노이드를 고속 대량 스크리닝 (high throughput screening; HTS) 플랫폼 (platform)으로 생산하고자 하였다. 이를 통해 도 3과 같이 중뇌 오가노이드를 HTS 플랫폼에서 생산할 뿐만 아니라, 표준화된 수준의 개체간 변이가 적으며 비정상적 분화 및 데드코어가 억제된 중뇌 오가노이드의 고속, 대량 생산 실현이 가능하였고 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드의 경우 기존 방법으로 생산된 중뇌 오가노이드에 비해 월등히 향상된 균질성과 기능성을 보였다. 나아가 중뇌 오가노이드 생산에 소요되는 시간과 비용을 절감할 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 인간 줄기세포로부터 3차원 세포집합체를 고속 배양하는 방법으로,
인간으로부터 분리된 세포로부터 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계;
상기 배아체로부터 특정 조직으로 분화를 유도하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계를 포함하고,
상기 배아체를 형성하는 단계부터 상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계는, 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 배양하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 의해 제조된, 3차원 세포집합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 3차원 세포집합체를 함유하는 오목 배양부; 및
상기 오목 배양부를 커버하는 커버부를 포함하는, 3차원 세포집합체 배양 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간배아줄기세포, 인간 유도만능줄기세포, 및 성체줄기세포 중 어느 하나로부터 배양된 3차원 중뇌 세포집합체로,
상기 3차원 중뇌 세포집합체는, 뉴로멜라닌을 형성하는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 줄기세포로부터 3차원 세포집합체의 고속 배양 방법으로,
인간으로부터 분리된 세포로부터 배아체를 형성하는 단계;
상기 배아체로부터 특정 조직으로 분화를 유도하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계를 포함하고,
상기 배아체를 형성하는 단계부터 상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계는, 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 비진탕 배양하며,
상기 고속 배양 방법은, 피펫팅 로봇, 자동화된 핸들링, 플레이트 운송 수단을 포함하는 자동화 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 3차원 세포집합체의 고속 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 도파민성 신경세포 관련 질환 약물의 스크리닝 방법에 있어서,
도파민성 신경세포 관련 질환 환자-유래 유도만능줄기세포로부터 3차원 세포집합체를 생성하는 단계;
상기 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체로부터 도파민성 신경세포의 생존율을 판별하는 단계를 포함하는, 도파민성 신경세포 관련 질환 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 도파민성 신경세포 관련 질환 환자 유래 세포로부터 3차원 세포집합체를 배양하는 단계;
상기 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체로부터 도파민성 신경세포 생존율을 판별하는 단계를 포함하고,
상기 도파민성 신경세포 생존율에 기초하여 환자에게 적합한 치료제의 정보를 제공하는 단계를 포함하는, 도파민성 신경세포 관련 질환 치료를 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약물 테스트용 3차원 세포집합체의 판별 방법으로,
(i) 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계:
상기 후보물질의 접촉은, 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 포함되는 어느 하나 이상의 단계에서 수행되고, 및
(ii) 상기 각 단계에서의 3차원 세포집합체에 대하여 후보물질의 존재 및 부존재에 따른 반응을 비교하는 단계를 포함하는, 약물 테스트용 3차원 세포집합체의 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 3차원 세포집합체를 이용한 약물의 체외 독성 스크리닝 방법으로,
(i) 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 포함되는 어느 하나 이상의 단계에서 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키고,
(ii) 상기 각 단계에서의 3차원 세포집합체에 대하여 후보물질의 존재 및 부존재에 따른 반응을 비교하고,
(iii) 상기 3차원 세포집합체 내에 존재하는 세포의 사멸 여부를 판별하는 단계를 포함하는,
3차원 세포집합체를 이용한 약물의 체외 독성 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 중뇌 (Midbrain) 오가노이드의 고속 및 대량 제조방법, 이를 이용한 신경독성물질 스크리닝 방법 및 도파민성 신경세포 관련 질환 치료제 스크리닝 (drug screening) 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 오가노이드 제조방법은 오가노이드를 고속, 대량 생산할 수 있어 신속한 약물 스크리닝이 가능하고, 비정상적 분화(out-growth)을 차단하며, 데드 코어(dead core) 현상을 최소화하고, 오가노이드 간의 편차를 감소시키며, 중뇌 오가노이드의 신속한 성숙화를 통해 우수한 기능성을 유도한다.
본 발명자들은 오가노이드를 제조함에 있어서 초기 시작 세포 수 (starting cell number)를 50 내지 3,000개로 적용함으로써 오가노이드 제조에 소요되는 시간을 기존의 3 내지 6개월 이상에서 최대 30일 이내로 단축하는 성과를 도출하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 인간 줄기세포로부터 3차원 세포집합체를 고속 배양하는 방법으로,
인간으로부터 분리된 세포로부터 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계;
상기 배아체로부터 특정 조직으로 분화를 유도하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계를 포함하고,
상기 배아체를 형성하는 단계부터 상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계는, 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 배양하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법이다.
본 발명에 있어서 인간으로부터 분리된 세포는, 인간 배아 줄기 세포(human embryonic stem cell; hESC), 역분화 줄기 세포(induced pluripotent stem cell), 및 성체 줄기 세포 중 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "줄기 세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기 세포 (totipotent stem cell), 전분화능 줄기 세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기 세포 (multipotent stem cell) 및 역분화 줄기 세포로 분류할 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체는 오가노이드인 것일 수 있고, 예를 들어, 뇌 오가노이드인 것일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "오가노이드"는 줄기 세포나 장기 기원 세포로부터 분리한 세포를 3D 배양법으로 다시 응집 또는 재조합하여 만들어진 세포집합체를 의미하는 것으로, 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 오가노이드는 소형 유사 장기, 장기 유사체, 유사 장기로도 명명될 수 있다. 상기 오가노이드는 구체적으로 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하며, 조직 또는 기관의 구조와 기능을 재현할 수 있어야 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 제조된 뇌 오가노이드는 대부분 지름 0.9 내지 1.4 mm 내외의 범위로 형태 및 크기가 균질하여 개체간 변이가 적고 일정한 품질을 나타내는 것으로 판단되었다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체는, 20 내지 50일, 또는 20일 내지 40일 내에 형성되는 것일 수 있고, 예를 들어, 20일 내지 30일 내에 형성되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 7일 동안 배양한 경우 중뇌 유전자의 활성화가 확인되었다. 14일 동안 배양한 경우 중뇌 특이적 도파민 작동성 뉴런 (midbrain dopaminergic neuron; mDA neuron)을 관찰할 수 있었으며, 21일 동안 배양한 경우 상기 mDA 뉴런의 개수가 증가하였다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체 형성 후, 추가적으로 진탕배양을 수행하는 것일 수 있다. 상기 추가적인 진탕배양을 통하여 장기간 배양이 가능해질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 3차원 세포집합체 형성 후 300일 이상 진탕배양을 수행함으로써 3차원 세포집합체를 배양하였다.
본 발명에 있어서 마이크로 웰 플레이트는, 오목부를 갖는 멀티 웰 플레이트인 것일 수 있다. 상기 오목부를 갖는 멀티 웰 플레이트는 96 웰 플레이트, 384 웰 플레이트 또는 1,536 웰 플레이트인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 인간으로부터 분리된 세포의 초기 시작 세포수는, 50개 내지 3,000개인 것일 수 있다.
상기 초기 시작 세포수는, 96 웰 플레이트를 이용하는 경우 300 내지 3,000개인 것이 바람직하고, 300 내지 1,000개인 것이 더욱 바람직하며, 500개인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 초기 시작 세포수는, 384 웰 플레이트를 이용하는 경우 50 내지 500개인 것이 바람직하고, 50 내지 200개인 것이 더욱 바람직하며, 100개인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 고속 대량 배양 방법은, 3차원 세포집합체 형성 전 과정에 걸쳐 바이오리액터를 이용하지 않는 것일 수 있고, 예를 들어, 진탕(shaking) 과정을 수행하지 않는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체는 중뇌 세포집합체인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체는 간, 심장 및 폐로 이루어진 군으로부터 선택되는 소화기계 장기인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, 외배엽 형성 단계 또는 중뇌 조직 분화 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 외배엽 형성 단계는, CHIR99021, Dorsomorphin 및 A83-01(dual SMAD inhibitors)를 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 중뇌 조직 분화 단계는, CHIR99021, Dorsmorphin, A83-01, IWP, SAG 및 FGF-8b를 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계는, SAG, FGF-8b, 인슐린(Insulin), 라미닌(Laminin)을 포함하고, 성장인자가 억제된 용해성 마트리젤을 추가적으로 포함하는 배지에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계를 수행함에 있어서 배지에 마트리젤을 직접 첨가하여 배양하는 방법을 사용하였다. 그러나 기존의 알려진 방법에 따르면, 통상적으로 플레이트 상의 마트리젤에 세포를 임베딩하여 배양하는 방법이 수행된다는 점이 상이하다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, 조직 분화 유도 후 7일 이내에 중내배엽 마커의 활성화 없이 외배엽 형성 인자가 발현되는 것일 수 있다. 상기 외배엽 형성 인자는 N-CAD, PLZF, SOX1, SOX2 및 NESTIN으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는, 조직 분화 유도 후 14일 이내 전뇌 또는 후뇌 마커의 발현 없이 중뇌 마커가 발현되는 것일 수 있다. 상기 중뇌 마커는 LMX1B, ASCL1 및 TH로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계는, 수행 이후 중뇌 도파민성 세포의 마커가 발현되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 중뇌 마커는 14일째 또는 그 이전에 활성화되나, 21일째 마커의 발현 수준이 더 높았다. 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계 후 중뇌 도파민성 세포 마커인 TH 등이 높은 수준으로 발현된다는 점을 알 수 있었다.
본 발명의 일 구현예에서, 배아체를 형성하는 단계로부터 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계까지 웰 플레이트의 이동 없이 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 수행하였으며, 멀티 마이크로 웰 플레이트를 이용한 30일 이내의 고속 대량 배양이 가능하였다.
본 발명의 다른 양태는 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 의해 제조된, 3차원 세포집합체이다.
본 발명의 또 다른 양태는 3차원 세포집합체를 함유하는 오목 배양부; 및
상기 오목 배양부를 커버하는 커버부를 포함하는, 3차원 세포집합체 배양 키트이다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체 배양 키트는, 보존액을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 인간배아줄기세포, 인간 유도만능줄기세포, 및 성체줄기세포 중 어느 하나로부터 배양된 3차원 중뇌 세포집합체로,
상기 3차원 중뇌 세포집합체는, 뉴로멜라닌을 형성하는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체이다.
상기 3차원 중뇌 세포집합체는 배양 후 20 내지 50일, 20 내지 40일, 20 내지 35일, 25 내지 50일, 또는 25 내지 40일 후에 뉴로멜라닌을 형성하는 것일 수 있고, 예를 들어, 25 내지 35일 후에 뉴로멜라닌을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 중뇌 이외의 다른 뇌 조직을 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 비정상 분화(out growth) 발생율이 5% 이하인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 심부세포사멸 현상 발생율이 상기 세포집합체 전체 면적의 40% 이하인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 직경이 0.9 내지 1.4 mm의 균일한 사이즈와 균질의 형태를 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 중뇌 도파민 세포를 10% 이상 포함하는 것일 수 있다.
상기 3차원 중뇌 세포집합체는 30% 이상의 중뇌 도파민 세포를 포함할 수 있고, 또는 50% 이상의 중뇌 도파민 세포를 포함할 수 있다. 초기 단계의 경우, 약 80%의 중뇌 도파민 세포를 포함할 수 있으나, 성숙된 3차원 중뇌 세포집합체의 경우, 다양한 중뇌 세포가 형성되므로, 전체 세포집합체 내의 중뇌 도파민 세포의 함량이 감소할 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 유전자 발현의 변이율이 10% 이하로 균질하게 형성되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 3차원 중뇌 세포집합체는 유전자 발현 퀄리티가 매우 우수하여, 약 90% 이상의 균질성을 나타내었다. 3차원 세포집합체 중 나머지 약 10%의 경우도, 종래의 방법에 의해 제조하는 경우보다 대등한, 혹은 우수한 유전자 발현의 균질성이 관찰되었다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 억제성 신경 및 흥분성 신경을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 3차원 중뇌 세포집합체는 억제성 신경 및 흥분성 신경을 포함하고, 이는 전체 세포집합체의 10 내지 30% 이상인 것으로 확인되었다. 이는 본 명세서상의 도 11 및 15a의 조직염색 데이터의 실험결과로부터 확인될 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 세포 분화 후 15일부터 전기생리활성이 관찰 가능한 것일 수 있다. 종래의 방법의 경우, 세포 분화 후 수 개월 후부터 전기생리활성이 나타난다는 점에서, 성숙화 양상이 매우 빠르게 나타나는 본 발명의 방법이 월등히 우세함을 입증할 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 흑질, 청색반점, 적핵, 중심회백질, 내측모대, 동안신경핵 및 활차신경핵으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 중뇌 세포집합체는, 신경아교세포 및 희소돌기신경교세포를 포함하는 것일 수 있고, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 신경아교세포 및 희소돌기신경교세포를 1 내지 10% 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 3차원 중뇌 세포집합체가 신경아교세포 및 희소돌기신경교세포를 포함하는 정도는 본 명세서상의 도 11 및 15a의 조직염색 데이터의 실험결과로부터 확인될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 인간 줄기세포로부터 3차원 세포집합체의 고속 배양 방법으로,
인간으로부터 분리된 세포로부터 배아체를 형성하는 단계;
상기 배아체로부터 특정 조직으로 분화를 유도하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계를 포함하고,
상기 배아체를 형성하는 단계부터 상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계는, 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 비진탕 배양하며,
상기 고속 배양 방법은, 피펫팅 로봇, 자동화된 핸들링, 플레이트 운송 수단을 포함하는 자동화 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 3차원 세포집합체의 고속 배양 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 도파민성 신경세포 관련 질환 약물의 스크리닝 방법에 있어서,
도파민성 신경세포 관련 질환 환자-유래 유도만능줄기세포로부터 3차원 세포집합체를 생성하는 단계;
상기 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체로부터 도파민성 신경세포의 생존율을 판별하는 단계를 포함하는, 도파민성 신경세포 관련 질환 약물의 스크리닝 방법이다.
본 발명에 있어서 도파민성 신경세포 관련 질환은, 파킨슨병 (Parkinson's disease), 알츠하이머 (Alzheimer's disease), 뇌졸중, 중풍,　헌팅턴병 (Huntington's disease), 피크병, 크로이츠펠트-야콥병, 자폐증 및 뇌 발달장애 증후군 중 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 정보제공 방법은 3차원 세포집합체를 도파민성 신경세포 관련 질환 약물의 스크리닝 용도로 적용함으로써 약물의 독성 및 효능을 평가하는 방법으로 사용될 수 있다.
상기 후보물질에 의하여 도파민성 신경세포 관련 질환의 발병이 예방되거나, 치료되거나, 대조군 물질에 비하여 예후가 증진된 경우에 상기 후보물질을 도파민성 신경세포 관련 질환 치료제로서 효능을 갖는다고 결정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 도파민성 신경세포 관련 질환 환자 유래 세포로부터 3차원 세포집합체를 배양하는 단계;
상기 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 3차원 세포집합체로부터 도파민성 신경세포 생존율을 판별하는 단계를 포함하고,
상기 도파민성 신경세포 생존율에 기초하여 환자에게 적합한 치료제의 정보를 제공하는 단계를 포함하는, 도파민성 신경세포 관련 질환 치료를 위한 정보제공방법이다.
본 발명에 있어서 후보물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태는 약물 테스트용 3차원 세포집합체의 판별 방법으로,
(i) 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키는 단계:
상기 후보물질의 접촉은, 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 포함되는 어느 하나 이상의 단계에서 수행되고, 및
(ii) 상기 각 단계에서의 3차원 세포집합체에 대하여 후보물질의 존재 및 부존재에 따른 반응을 비교하는 단계를 포함하는, 약물 테스트용 3차원 세포집합체의 판별 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 3차원 세포집합체를 이용한 약물의 체외 독성 스크리닝 방법으로,
(i) 3차원 세포집합체의 고속 대량 배양 방법에 포함되는 어느 하나 이상의 단계에서 3차원 세포집합체에 후보물질을 접촉시키고,
(ii) 상기 각 단계에서의 3차원 세포집합체에 대하여 후보물질의 존재 및 부존재에 따른 반응을 비교하고,
(iii) 상기 3차원 세포집합체 내에 존재하는 세포의 사멸 여부를 판별하는 단계를 포함하는,
3차원 세포집합체를 이용한 약물의 체외 독성 스크리닝 방법이다.
본 명세서상의 용어 "스크리닝"이란, 여러 물질로 이루어진 후보군으로부터 목적으로 하는 어떤 특정한 성질을 갖는 물질을 특정한 조작 또는 평가 방법으로 선별하는 것이다.
상기 체외 독성 스크리닝 방법은, 독성 물질의 확인 또는 신약 후보물질의 신경 독성 여부를 검증하는 용도의 약물 독성 평가용 플랫폼으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 초기 세포 수 50 내지 3000개의 인간전분화능줄기세포를 배양하여 얻어지는 3차원 세포집합체로서, 상기 3차원 세포집합체는 배양 후 15일 이내에 집합체의 형성이 완료되는것인, 3차원 세포집합체가 제공된다.
상기 세포 집합체의 제조단계에 있어서 바람직하게는 인간으로부터 분리된 세포로부터 초기 시작 세포수를 50개 내지 3,000개로 하여 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계; 상기 배아체로부터 특정 조직으로 분화를 유도하여 20 내지 30일 내에 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및 상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계를 포함하고, 상기 배아체를 형성하는 단계부터 상기 3차원 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계는, 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 비진탕 배양하는 것을 특징으로 하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 인간전분화능줄기세포는 인간배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 세포집합체는 3차원 중뇌 세포집합체로서, 분화 30일 이내에 뉴로멜라닌을 생성하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 분화 20일 이내에 전기생리적 활성을 나타낼 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 90% 이상의 세포의 직경이 1.0 내지 1.2mm범위로 균질한 것일 수 있다. 상기 세포의 직경은 도 19에 나타낸 바와 같다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 집합체의 10 내지 30 중량%의 억제성 신경세포 및/또는 흥분성 신경세포를 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 집합체의 1 내지 10 중량%의 신경아교세포 및 희소돌기신경교세포를 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 유전자 발현의 변이율이 10% 이하로 균질하게 형성될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 배양은 연속비진탕배양하는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 LMX1B, ASCL1 및 TH로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 중뇌마커를 발현할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 전뇌 및/또는 후뇌 마커를 발현하지 않을 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 N-CAD, PLZF, SOX1, SOX2 및 NESTIN로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 신경외배엽 마커를 발현할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 중뇌 세포집합체는 전분화능 마커 및/또는 중내배엽 마커를 발현하지 않을 수 있다.
본 발명은 중뇌 오가노이드, 이의 제조방법, 이를 이용한 신경독성물질 스크리닝 방법 및 도파민성 신경세포 관련 질환 치료제 스크리닝 (drug screening) 방법에 관한 것으로서, 상기 제조방법은 오가노이드를 고속 생산할 수 있어 신속한 약물 스크리닝이 가능하고, 비정상적 분화 (out-growth)을 차단하며, 데드 코어 (dead core) 현상을 최소화하고, 오가노이드 간의 편차를 감소시키며, 중뇌 오가노이드의 높은 기능성을 유도함으로, 이를 효과적으로 오가노이드의 제조에 이용할 수 있다.
도 1은 환자 맞춤형 오가노이드 생산을 위한 유도 만능 줄기 세포 (Induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs)의 제작 및 오가노이드 분화 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 오가노이드 생산의 다양한 문제점들을 나타낸 모식도이다.
도 3은 기존 기술 대비 본 발명의 오가노이드 생산 전략을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 96웰 플레이트에서 생산된 분화 7일째의 중뇌 오가노이드의 형태를 나타낸 사진(상), 분화율 및 형태상 분류를 나타낸 그래프(중) 및 형태 기준을 나타낸 사진(하)이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 96웰 플레이트에서 생산된 분화 7일째의 중뇌 오가노이드에서의 전분화능 (Pluripotency) 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 96웰 플레이트에서 생산된 분화 7일째의 중뇌 오가노이드에서의 중내배엽 (Mesoendoderm) 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 96웰 플레이트에서 생산된 분화 7일째의 중뇌 오가노이드에서의 신경외배엽 (Neuroectoderm) 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 96웰 플레이트에서 생산된 분화 14일째의 중뇌 오가노이드의 형태를 나타낸 사진(상), 분화율 및 형태상 분류를 나타낸 그래프(중) 및 형태 기준을 나타낸 사진(하)이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 96웰 플레이트에서 생산된 분화 14일째의 중뇌 오가노이드의 세포자연사, 전뇌 (Forebrain), 중뇌 (Midbrain) 및 후뇌 (Hindbrain) 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 500개 이하의 초기 시작 세포 수 조건에서 96웰 플레이트에서 생산된 분화 14일째의 중뇌 오가노이드의 형태를 나타낸 사진(상), 분화율 및 형태상 분류를 나타낸 그래프(중) 및 형태 기준을 나타낸 사진(하)이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 500개 이하의 초기 시작 세포 수 조건에서 96웰 플레이트에서 생산된 분화 7일째의 중뇌 오가노이드에서의 신경외배엽 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따른 500개 이하의 초기 시작 세포 수 조건에서 96웰 플레이트에서 생산된 분화 14일째의 중뇌 오가노이드에서의 중뇌 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 500개 이하의 초기 시작 세포 수 조건에서 96웰 플레이트에서 생산된 분화 14일째의 중뇌 오가노이드에서의 후뇌 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 10a는 본 발명의 일 실시예에 따른 384웰 플레이트에서 초기 시작 세포 수를 달리하여 형성된 중뇌 오가노이드의 크기를 비교한 사진이다.
도 10b는 본 발명의 실시예에 따른 384웰 플레이트 유래 중뇌 오가노이드의 중뇌 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 분화 14일째의 중뇌 오가노이드에서의 중뇌 특이적 도파민 작동성 뉴런 (midbrain dopaminergic neuron; mDA neuron)을 티로신 수산화효소 (tyrosine hydroxylase; TH)로 나타낸 면역염색분석 결과 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 분화 21일째의 중뇌 오가노이드의 형태를 나타낸 사진(상), 분화율 및 형태상 분류를 나타낸 그래프(중) 및 형태 기준을 나타낸 사진(하)이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 분화 21일째의 세포자연사, 전뇌, 중뇌 및 후뇌 마커 유전자 발현양상을 나타낸 그래프이다.
도 14a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 시작 세포 수를 달리하여 형성된 중뇌 오가노이드의 크기를 날짜별로 비교한 사진이다.
도 14b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 시작 세포 수를 달리하여 형성된 중뇌 오가노이드의 크기를 날짜별로 비교한 그래프이다.
도 15a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 시작 세포 수를 달리하여 형성된 분화 21일째의 중뇌 오가노이드에서의 중뇌 특이적 도파민 작동성 뉴런을 TH로 나타낸 면역염색분석 결과 사진이다.
도 15b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 시작 세포 수를 달리하여 형성된 분화 21일째의 중뇌 오가노이드에서의 중뇌 특이적 도파민 작동성 뉴런의 비율을 나타낸 면역염색분석 결과 그래프이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 시작 세포 수를 달리하여 형성된 분화 21일째의 중뇌 오가노이드에서의 데드코어의 크기를 나타낸 면역염색분석 결과 사진이다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 시작 세포 수를 달리하여 형성된 분화 21일째의 중뇌 오가노이드에서의 데드코어의 크기를 나타낸 면역염색분석 결과 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 초기 시작 세포 수 500개 조건에서 생산된 중뇌 오가노이드의 뉴런 타입과 그 외 세포조성을 확인한 면역염색분석 결과 사진이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 96, 384 웰 고속 대량 스크리닝 (high throughput screening; HTS) 플랫폼에서 생산된 중뇌 오가노이드의 고용량 이미징 (high content imaging; HCI) 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 기존 방법으로 생산한 중뇌 오가노이드와 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드의 형태 (상) 및 크기 (하)를 나타낸 사진 및 결과 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드의 개체간 변이를 확인하기 위해 각 중뇌 오가노이드 개체간 유전자 발현양상을 비교한 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드에서 뉴로멜라닌의 생성 결과를 분석한 사진이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드에서 뉴로멜라닌의 생성을 Fontana-Masson 염색기법을 통해 확인한 사진이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 기존 방법으로 생산한 중뇌 오가노이드와 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드의 전기생리학적 활성을 비교한 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경독성물질인 6-OHDA와 MPTP를 처리한 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드의 형태와 크기 변화를 나타내는 사진 (상) 및 그래프 (하)이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 신경독성물질인 6-OHDA와 MPTP를 처리한 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드에서 세포사멸 마커 (상)와 중뇌 마커 (하) 유전자의 발현 양상을 나타내는 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 HTS 약물 효능 및 독성평가를 위한 오가노이드 신약개발 플랫폼 구축을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1. 오가노이드의 제조
하기와 같은 과정에 따라 오가노이드를 제조하였다.
(Day 0) 5x101, 1x102, 2.5x102, 5x102, 1x103, 3x103, 5x103, 7x103, 1x104 단일-세포로 해리된 인간 배아 줄기 세포 (human embryonic stem cell; hESC)를 COB1과 함께 50 uM Y-27632 및 4ng/ml 기본 섬유 모세포 성장 인자 (bfgf)을 갖는 u-bottom 96-웰 (well) 플레이트 상에 플레이팅하였다. (COB1: 100x N2 보충제(Gibco), 50x B27 w/o 비타민 A (Gibco), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin; PS)(Gibco), 1% GlutaMAXTM (Gibco), 1% NEAA(Gibco), 55 uM β-머캅토에탄올 (mercaptoethanol)(Gibco), 1 μg/ml 헤파린 (Sigma)이 보충된 DMEM/F12 (Corning) 및 Neurobasal Medium (Gibco)의 1:1 혼합물)
(Day 1~4) 배양체 (embryoid body; EB)의 형성을 확인하고 COB1과 함께 3 uM CHIR99021, 2 uM 도르소모르핀, 2 uM A83-01, 1 uM WNT 신호전달체계 억제제 IWP2을 함유하는 배지를 첨가하였다. 이 시기 처리기간은 day 2, day 3 내지 day 4으로 한정하였다.
(Day 4~7) COB1과 함께 3 uM CHIR99021, 2 uM 도르소모르핀, 2 uM A83-01, 1 uM WNT 신호전달체계 억제제 IWP2, 2 μg/ml SAG (statoacoustic ganglion) 및 100 ng/ml FGF8 (Fibroblast growth factor 8)을 포함하는 배지로 교체하였다. 이후 7일까지 배지를 교체하였다. 이 시기 처리기간은 day 5, day 6 내지 day 7로 한정하였다.
(Day 7) 얼음에 마트리겔을 약 4시간 동안 용해시켰다. COB1과 함께 100 ng/ml FGF8, 2 ug/ml SAG, 2.5 ug/ml 인슐린 (Insulin), 200 ng/ml 라미닌 (Laminin) 포함 배지를 만들었다. 용해된 마트리겔 (Matrigel)을 배지에 넣었다. 그 다음 오가노이드의 배지를 변경하였다.
(Day 9) COB2와 함께 10 ng/ml 뇌-유래 신경성장 인자 (Brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 10 ng/ml 교세포 신경성장인자 (Glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF), 200 uM 아스코르브산, 및 125 uM cAMP를 함유하는 BMM으로 배지로 교체하였다. 이틀마다 배지를 교체하였다. (COB2: 100x N2 보충제 (Gibco), 50x B27 w/o (Gibco), 1% PS (Gibco), 1% GlutaMAXTM (Gibco), 1% NEAA (Gibco), 55 uM β-머캅토에탄올 (Gibco), 1 μg/ml 헤파린 (Sigma)이 보충된 DMEM/F12 (Corning) 및 Neurobasal Medium (Gibco)의 1:1 혼합물)
실시예 2. 분화 7일째의 오가노이드 특성 확인
2-1. 오가노이드의 생존율 및 품질 확인
고속 대량 스크리닝 (high throughput screening; HTS) 플랫폼 (platform), 즉 96 웰에서 EB 형성, 중뇌 오가노이드로 분화 유도, 성숙화, 그리고 신약개발 등 응용연구의 일원화를 위한 첫 단계로 다양한 초기 시작 세포 수 (starting cell number)를 테스트하였다. 이를 위하여, 단일 세포로 해리된 hESC를 웰 별로 500, 1,000, 3,000, 5,000, 7,000 및 10,000 개씩 96웰 플레이트에 플레이팅한 후, 분화양상을 관찰하여, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 오가노이드의 품질은 Class 1 (신경 로젯 발달), Class 2 (밝고 둥근 EB) 및 Class 3 (파열된 EB)으로 구분하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 7일째의 생존율 및 EB 품질을 비교한 결과, 500, 1,000 및 3,000개의 단일 세포를 플레이팅한 경우 오가노이드의 크기는 다소 작지만 Class 2로 전반적인 품질이 우수하였고 5,000 이상의 단일 세포를 플레이팅한 경우 Class 1로 가장 우수하였다.
2-2. 오가노이드의 유전자 발현 양상 확인
오가노이드의 유전자의 발현 양상을 알아보기 위하여 전분화능 (Pluripotency) 마커로는 OCT4 및 NANOG, 중내배엽 (mesoendoderm) 마커로는 EOMES, MXL1 및 T, 신경외배엽 (neuroectoderm) 마커로는 N-CAD, PLZF, SOX1, SOX2 및 NESTIN을 선택하였다. 상기 마커들에 대하여 오가노이드에서의 발현량을 확인하고, 그 결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다. qPCR에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 명칭 서열(5' -> 3')
1 Oct4_F primer GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG
2 Oct4_R primer CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC
3 Nanog_F primer TGCAACCTGAAGACGTGTGA
4 Nanog _R primer CTATGAGGGATGGGAGGA
5 Eomes_F primer CTCAAAAGGCATGGGAGGGTA
6 Eomes_R primer CACCACCAAGTCCATCTGCAA
7 MXL1 F primer ACAACGCTCTTGAACGACGAA
8 MXL1 R primer CGGCAACATCAACTGACAAC
9 T_F primer CGCCTCATAGCCTCATGGAC
10 T_R primer CACTGGCTGCCACGACAAA
11 NCAD-F primer TGATGAAGAAGGTGGAGGAGAAGA
12 NCAD-R primer ATTCGTCGGATTCCCACAGG
13 PLZF-F primer TCCCGCCCGACTGGAGGATA
14 PLZF-R primer TTCTTTCCTGGCTCCCCGCTC
15 SOX1-F primer GCCGAGTGGAAGGTCATGTC
16 SOX1-R primer TTCTTGAGCAGCGTCTTGGTC
17 SOX2-F primer AGACTGCACATGAGCCAGCA
18 SOX2-R primer CGTCTCCAGCCAGCTTCAAC
19 NESTIN-F primer AGGAAAAGACCATCTGCCCG
20 NESTIN-R primer GCCTCTCAGCCAGAAACCAT
도 5a 내지 5c에서 확인할 수 있듯이, 유전자의 발현 양상도 대체적으로 비슷한 패턴을 보였다. 전분화능 및 중내배엽 마커는 발현하지 않고, 신경외배엽 마커만 발현하여, HTS 플랫폼에서 생산된 중뇌 오가노이드에서 초기 신경분화가 제대로 이루어짐을 확인하였다.
실시예 3. 분화 14일째의 오가노이드 특성 확인
3-1. 오가노이드의 생존율 및 품질 확인
실시예 1의 방법에 따라 제조된 분화 14일째의 오가노이드는 생존율 및 형태 측면에서 초기 시작 세포 수 별 상이한 양상을 보였다. 오가노이드의 품질은 Class 1 (신경 로젯과 밝은 테두리), Class 2 (비정상적 분화 형성), Class 3 (비정상적 분화로 덮임) 및 Class 4 (진하고 어두운 EB)로 구분하였다. 그 결과를 표 2, 도 6에 나타내었다.
세포수 500 1,000 3,000 5,000 7,000 10,000
Class 1(개) 30 25 26 16 15 15
Class 2(개) 0 5 1 1 3 1
Class 3(개) 0 0 3 11 12 11
Class 4(개) 0 0 0 2 0 3
총합(개) 30 30 30 30 30 30
표 1, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 세포가 5,000개 이상 사용된 경우 중뇌 오가노이드 표면에 비정상적 분화 (out-growth)이 많이 나타났지만 500 내지 3,000개 사용된 경우 비정상적 분화 없이 높은 품질의 중뇌 오가노이드가 생산되었다.
3-2. 오가노이드의 유전자 발현 양상 확인
또한, 유전자의 발현 양상을 알아보기 위하여 세포자연사 (Apoptosis) 마커로는 BAX, BAD 및 PMA1P1, 전뇌(Forebrain) 마커로는 FOXG1, LHX2 및 SIX3, 중뇌(Midbrain) 마커로는 LMX1B, ASCL1 및 TH, 및 후뇌(Hindbrain) 마커로는 HA1, HB4 및 HC9를 선택하여 오가노이드에서의 발현량을 확인하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. qPCR에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3과 같다.
서열번호 명칭 서열(5' -> 3')
21 BAX-F primer TGCTGACGTGGACACGGACT
22 BAX-R primer CCAGCCACCCTGGTCTTGGA
23 BAD-F primer TCGGAGTCGCCACAGTTCGT
24 BAD-R primer GCGCTCTTTGGGCGAGGAAG
25 PMAIP1-F primer GGGAAGAAGGCGCGCAAGAA
26 PMAIP1-R primer AGTTTCTGCCGGAAGTTCAGTTTGT
27 FOXG1-F primer GCGGGCCAGAACAGTTACTT
28 FOXG2-R primer CCCAGACAGTCCCGTCGTAA
29 LHX2-F primer ACTTCTGTGCCTGGCAACCTG
30 LHX2-R primer TCTGTTTCCAGGCGAGATCCT
31 SIX3-F primer AACCTCCAGCGACTCGGAAT
32 SIX3-R primer TTCGGTTTGTTCTGGGGATG
33 LMX1B-F primer GGCATCAAGATGGAGGAGCA
34 LMX1B-R primer TGGTGAGGGCTTGCTGACAC
35 ASCL1-F primer GGTGATCGCACAACCTGCAT
36 ASCL1-R primer GTTCTGAGCGCTTCCCGTT
37 TH-F primer CTGAGATTCGGGCCTTCGAC
38 TH-R primer TGCACCTAGCCAATGGCACT
39 HA1-F primer AGATCAACACATACCGGAGCC
40 HA1-R primer AGCGCACGAAGGAATTGCAG
41 HB4-F primer AGCTGGCAGTGGCATTGGCTA
42 HB4-R primer TGCTGCTCTAGGAACCGAACC
43 HC9-F primer TTGCTGTACATTGGCTGGGA
44 HC9-R primer ACACAGCTGCAGCGCTATTA
도 7에서 확인할 수 있듯이, 모든 경우 중뇌 마커만 특이적으로 활성화되었으며, 초기 시작 세포 수가 증가할수록 세포자연사 마커의 발현이 증가함을 확인하였다.
3-3. 초기 시작 세포 수에 따른 오가노이드 형성에 미치는 영향 확인
500개 이하의 세포를 사용할 경우, 중뇌 오가노이드 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 상기 실험을 100, 250 및 500개를 사용하여 다시 실시하여, 그 결과를 도 8, 9a 내지 9c에 나타내었다. qPCR에 사용한 프라이머 서열은 표 1, 3 및 하기 표 4에서 활용하였다.
서열번호 명칭 서열(5' -> 3')
45 KROX20-F primer ACCGCCTCCTCCTCCTTATT
46 KROX20-R primer GGGTAGGCCAGAGAGGAAGA
도 8에서 확인할 수 있듯이, 분화 14일째의 오가노이드는 분화 7일째의 오가노이드에 대비하여 형태상의 큰 차이가 없었다. 그러나 도 9a 내지 9c에서 확인할 수 있듯이, 100개 및 250개의 경우 초기(7일) 신경외배엽 마커 N-CAD, SOX2 및 PLZF의 발현과, 14일째 중뇌 마커 LMX1B, ASCL1 및 TH의 발현이 다소 낮았으며, 오히려 후뇌 마커 HC9, HA1, HB4 및 KROX20의 발현이 증가된 양상을 보였다. 따라서, 상기 결과는 500개 세포를 사용한 경우 중뇌 오가노이드 생산이 가장 효율적임을 나타내었다.
3-4. 384웰 플레이트에서 초기 시작 세포 수가 오가노이드 형성에 미치는 영향 확인
중뇌 오가노이드 대량생산을 위해 384웰 플레이트 기반 중뇌 오가노이드 생산 조건을 확인하였다. 웰의 부피가 96웰 (~330 ul)에 비해 적은 384웰 (~90 ul)에서의 중뇌 오가노이드 생산을 위해 시작 세포의 수를 50, 100, 200, 300 및 500으로 나누어서 그 효과를 확인하여, 그 결과를 도 10a과 10b에 나타내었다.
도 10a에서 확인할 수 있듯이, 분화 30일째의 중뇌 오가노이드가 시작 세포의 수와 상관없이 유사한 형태와 크기를 보이는 것을 확인하였다.
그러나 도 10b에서 확인할 수 있듯이, 시작 세포 수 50, 100 및 200개의 경우 500개인 경우에 비해 중뇌 마커인 TH, ACSL1, LMX1B의 발현이 더 높았다. 따라서, 상기 결과는 384웰 플레이트를 이용하여 중뇌 오가노이드를 생산할 경우, 50, 100 및 200개의 시작 세포의 사용이 가장 효율적임을 나타낸다.
3-5. 오가노이드의 중뇌 특이적 도파민 신경세포 수 확인
분화 14일째의 중뇌 오가노이드에서 중뇌 특이적 도파민 작동성 뉴런(midbrain dopaminergic neuron; mDA neuron)을 관찰하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인할 수 있듯이, 500개의 초기 시작 세포를 사용한 경우 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase; TH)를 발현하는 mDA 뉴런이 가장 균질하게 존재함을 확인하였다.
실시예 4: 분화 21일째의 오가노이드 특성 확인
4-1. 오가노이드의 생존율 및 품질 확인
실시예 1의 방법에 따라 제조된 분화 21일째의 중뇌 오가노이드의 생존율과 품질 (quality)을 조사하였다. 오가노이드의 품질은 Class 1 (신경 로젯 발달), Class 2 (매끄러운 오가노이드), Class 3 (비정상적 분화로 덮임) 및 Class 4 (파열된 오가노이드)로 구분하였다. 그 결과를 표 5 및 도 12에 나타내었다.
세포수 500 1,000 3,000 5,000 7,000 10,000
Class 1(개) 24 8 0 0 0 0
Class 2(개) 6 17 10 10 11 16
Class 3(개) 0 5 20 15 14 8
Class 4(개) 0 0 0 5 5 6
총합(개) 30 30 30 30 30 30
표 5 및 도 12에서 확인할 수 있듯이, 500개 또는 1,000개가 사용된 경우 비정상적 분화의 가능성을 완벽히 차단하고 신경상피세포층 형성이 관찰되는 중뇌 오가노이드가 생성되는 반면, 3,000개 이상을 사용한 경우 비정상적 분화 현상이 매우 심해져 낮은 품질의 중뇌 오가노이드만 생성되었다.
4-2. 오가노이드의 유전자 발현 양상 확인
유전자의 발현 양상을 알아보기 위하여 세포자연사 마커로는 BAX, BAD 및 PMA1P1, 전뇌 마커로는 FOXG1, LHX2 및 SIX3, 중뇌 마커로는 LMX1B, ASCL1 및 TH, 후뇌 마커로는 HA1, HB4 및 HC9를 선택하여 오가노이드에서의 발현량을 확인하여, 그 결과를 도 13에 나타내었다. qPCR에 사용한 프라이머 서열은 표 3에서 활용하였다.
도 13에서 확인할 수 있듯이, 3,000개 이상의 세포가 사용된 경우 세포자연사 마커의 발현이 증가되었으며, 3,000 내지 10,000개의 세포가 사용된 경우 일부 중뇌 유전자에서 그 발현양이 다소 감소함을 확인하였다.
이에 따라 HTS 플랫폼에서 중뇌 오가노이드 생산 시 초기 시작 세포 수가 매우 중요하게 작용한다는 점을 확인하였다.
4-3. 오가노이드의 크기 비교
분화 7, 14 및 21일째의 500 내지 10,000개 세포가 사용된 중뇌 오가노이드의 크기를 비교하여, 그 결과를 도 14a 및 14b에 나타내었다.
도 14a 및 14b에서 확인할 수 있듯이, 500 내지 10,000개까지의 모든 조건에서 유사한 크기를 보였으며 이는 500 내지 1,000개의 초기 시작 세포 수로도 충분히 중뇌 오가노이드 생산이 가능함을 시사하였다.
4-4. 오가노이드의 중뇌 특이적 도파민 신경세포 수 확인
분화 21일째의 중뇌 오가노이드에서 중뇌 특이적 도파민 신경세포의 수를 확인하여, 그 결과를 표 6, 도 15a 및 15b에 나타내었다.
세포수 500 1,000 3,000 5,000 7,000 10,000
세포 내 비율(%) 12.6 7.0 4.9 3.0 3.9 1.4
표 6, 도 15a 및 15b에서 확인할 수 있듯이, 500, 1,000개의 경우 중뇌 특이적 도파민 신경세포가 보다 많고 균질 하게 존재함을 확인하였다. 이는 HTS 플랫폼에서 초기 시작 세포 수로 500, 1,000개가 최적임을 나타내었다.
특히, 도 16a 및 16b에서 확인할 수 있듯이, 오가노이드에서 발생하는 공통된 문제점인 "데드 코어" 현상이 초기 시작 세포 수 1,000개 이하의 경우 매우 효율적으로 억제되는 것을 확인하였다.
또한, 도 17에서 확인할 수 있듯이, 500개의 초기 시작 세포에서 생산된 중뇌 오가노이드는 TH 양성의 mDA 뉴런을 균질하게 함유하고 있고, GIRK2 (G protein-activated inward rectifier potassium channel 2)를 발현하는 성숙화된 A9 타입 (type) mDA 뉴런들도 존재하였다. 나아가 성상세포 (astrocyte), 희돌기교세포 (oligodendrocyte)와 여러가지 서브타입 (subtype) 신경세포들도 존재하는 것을 확인하였다.
4-5. 오가노이드의 형태 확인
최종적으로 500개의 세포를 사용하여 96, 384 웰 HTS 플랫폼에서 생산된 오가노이드의 형태를 고용량 이미징 (high content imaging; HCI) 장비로 관찰하여 도 18과 같이 나타내었다.
도 19에서 확인할 수 있듯이, 분화 30일째 96 웰 플레이트 상의 모든 오가노이드가 대부분 지름 0.9 내지 1.4 mm 범위에서 매우 균질하게 동일한 양상의 중뇌 오가노이드를 생산하였다. 반면, 마이크로 웰 플레이트를 사용하지 않고 일반적인 방법으로 생산한 중뇌 오가노이드의 경우 형태와 크기가 매우 비균질한 양상을 보이는 것을 확인하였다. 다른 종류의 인간 배아줄기세포 또는 인간 역분화줄기세포에서도 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
도 20에서 확인할 수 있듯이, 고속, 대량 생산된 96 웰 플레이트 상의 중뇌 오가노이드의 유전자 발현양상을 개개의 중뇌 오가노이드에서 확인한 결과, 90% 이상의 중뇌 오가노이드는 기존 기술로 생산한 중뇌 오가노이드보다 우수한 양상을 나타내고, 나머지 약 10%의 경우도 기존 기술로 생산한 중뇌 오가노이드와 유사한 수준의 유전자 발현양상을 보이는 것이 관찰되었다. 이는 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드가 개체간 변이 없이 매우 균질한 특성을 가지고 있음을 의미한다. 따라서, 중뇌 오가노이드 고속, 대량 생산 기술은 향후 중뇌 오가노이드 기술의 산업화를 위한 표준화기술로 활용 가능하다.
실시예 5: 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드의 기능성 검증
고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드의 기능성 검증을 위해 뉴로멜라닌 생성과 전기생리 분석을 실시하였고 그 결과를 도 21 및 22와 같이 나타내었다.
도 21에서 확인할 수 있듯이, 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드의 경우 분화 30일째 뉴로멜라닌을 생성함을 확인하였다. 일반적인 방법으로 생산한 중뇌 오가노이드에서 뉴로멜라닌 형성은 분화를 100일 이상 유도할 경우 관찰되는 점을 고려할 때, 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드는 30일 이내에 수개월 이상 분화 유도한 중뇌 오가노이드와 유사한 기능성을 가지고 있음을 확인하였다.
도 22에서 확인할 수 있듯이, 고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드 내 뉴로멜라닌 형성은 Fontana-Masson 염색을 통해 다시 확인하였다.
고속, 대량 생산된 중뇌 오가노이드의 기능성 검증의 일환으로 신경 신호 발화율 측정을 통한 전기생리분석을 실시하였다.
그 결과, 도 23에서 확인할 수 있듯이, 일반적인 방법으로 생산된 중뇌 오가노이드의 경우, 분화 70일째까지 전기생리적 활성을 보이지 않았으나 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드의 경우 분화 20일째부터 유의적으로 높은 수준의 신경 발화율을 보였으며 분화 30일째에 신경 발화율이 급격히 증가됨을 확인할 수 있었다.
이는 기존 방법에 비해 본 기술을 통해 생산된 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드의 기능적 성숙화 양상이 매우 빠르게 이뤄짐을 의미하며 따라서, 본 기술을 통해서 분화 30일째에 기능적으로 성숙한 중뇌 오가노이드 생산이 가능함을 의미한다.
실시예 6: 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드 기반 체외 약물 독성 평가
약물 효능 및 독성 평가 플랫폼으로써 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드의 활용 가능성을 검증하기 위해 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드 기반 체외 약물 독성 평가 연구를 수행하였고 그 결과를 도 24 및 25와 같이 나타내었다.
구체적으로, 고속, 대량 생산 중뇌 오가노이드에 도파민 신경세포의 사멸을 유도하는 신경독성 물질인 6-OHDA (6-hydroxydopamine)와 MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)를 100, 250, 500 uM 농도로 10일간 처리 후 중뇌 오가노이드의 면적을 측정하였다.
도 24에서 확인할 수 있듯이, 각 신경독성물질의 농도에 비례하여 중뇌 오가노이드의 크기가 감소함을 확인하였다.
또한 도 25에서 확인할 수 있듯이, 신경독성물질이 처리된 중뇌 오가노이드의 경우 독성물질의 농도에 비례하여 세포사멸관련 마커의 발현은 증가하고 중뇌 마커의 발현은 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 체외 약물 효능 및 독성 평가를 위한 신약개발 플랫폼으로써 중뇌 오가노이드가 그 활용 가능성을 가짐을 시사한다.
결론적으로 도 26과 같이 중뇌 오가노이드 초고속, 대량생산 및 표준화 기술을 기반으로 약물의 효능 및 독성을 평가하기 위한 신약개발 플랫폼 개발 등 다양한 중뇌 오가노이드 기술 기반 산업화 연계 기술 개발이 가능하다.
<110> Organ Factory, Inc. <120> High-speed and large-scale manufacturing method of midbrain organoids and midbrain organoids prepared thereby <130> APC-2021-0757-DIV1 <150> KR 10-2020-0079093 <151> 2020-06-29 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_F primer <400> 1 gacaggggga ggggaggagc tagg 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_R primer <400> 2 cttccctcca accagttgcc ccaaac 26 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_F primer <400> 3 tgcaacctga agacgtgtga 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog _R primer <400> 4 ctatgaggga tgggagga 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eomes_F primer <400> 5 ctcaaaaggc atgggagggt a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eomes_R primer <400> 6 caccaccaag tccatctgca a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MXL1 F primer <400> 7 acaacgctct tgaacgacga a 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MXL1 R primer <400> 8 cggcaacatc aactgacaac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T_F primer <400> 9 cgcctcatag cctcatggac 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T_R primer <400> 10 cactggctgc cacgacaaa 19 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCAD-F primer <400> 11 tgatgaagaa ggtggaggag aaga 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCAD-R primer <400> 12 attcgtcgga ttcccacagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLZF-F primer <400> 13 tcccgcccga ctggaggata 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLZF-R primer <400> 14 ttctttcctg gctccccgct c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1-F primer <400> 15 gccgagtgga aggtcatgtc 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX1-R primer <400> 16 ttcttgagca gcgtcttggt c 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2-F primer <400> 17 agactgcaca tgagccagca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2-R primer <400> 18 cgtctccagc cagcttcaac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NESTIN-F primer <400> 19 aggaaaagac catctgcccg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NESTIN-R primer <400> 20 gcctctcagc cagaaaccat 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAX-F primer <400> 21 tgctgacgtg gacacggact 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAX-R primer <400> 22 ccagccaccc tggtcttgga 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD-F primer <400> 23 tcggagtcgc cacagttcgt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAD-R primer <400> 24 gcgctctttg ggcgaggaag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAIP1-F primer <400> 25 gggaagaagg cgcgcaagaa 20 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMAIP1-R primer <400> 26 agtttctgcc ggaagttcag tttgt 25 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXG1-F primer <400> 27 gcgggccaga acagttactt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXG2-R primer <400> 28 cccagacagt cccgtcgtaa 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHX2-F primer <400> 29 acttctgtgc ctggcaacct g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LHX2-R primer <400> 30 tctgtttcca ggcgagatcc t 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIX3-F primer <400> 31 aacctccagc gactcggaat 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SIX3-R primer <400> 32 ttcggtttgt tctggggatg 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1B-F primer <400> 33 ggcatcaaga tggaggagca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMX1B-R primer <400> 34 tggtgagggc ttgctgacac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASCL1-F primer <400> 35 ggtgatcgca caacctgcat 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASCL1-R primer <400> 36 gttctgagcg cttcccgtt 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH-F primer <400> 37 ctgagattcg ggccttcgac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TH-R primer <400> 38 tgcacctagc caatggcact 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA1-F primer <400> 39 agatcaacac ataccggagc c 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA1-R primer <400> 40 agcgcacgaa ggaattgcag 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HB4-F primer <400> 41 agctggcagt ggcattggct a 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HB4-R primer <400> 42 tgctgctcta ggaaccgaac c 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HC9-F primer <400> 43 ttgctgtaca ttggctggga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HC9-R primer <400> 44 acacagctgc agcgctatta 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KROX20-F primer <400> 45 accgcctcct cctccttatt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KROX20-R primer <400> 46 gggtaggcca gagaggaaga 20

Claims (13)

  1. 초기 세포 수 50 내지 3000개의 인간전분화능줄기세포를 배양하여 얻어지는 3차원 세포집합체로서,
    상기 3차원 세포집합체는 배양 후 15일 이내에 집합체의 형성이 완료되는것인, 3차원 세포집합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간전분화능줄기세포는 인간배아줄기세포, 유도만능줄기세포 및 성체줄기세포로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인, 3차원 세포집합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 3차원 세포집합체는 3차원 중뇌 세포집합체로서, 분화 30일 이내에 뉴로멜라닌을 생성하는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 분화 20일 이내에 전기생리적 활성을 나타내는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 90% 이상의 세포의 직경이 1.0 내지 1.2mm범위로 균질한 것인, 3차원 중뇌 세포집합체.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 집합체의 10 내지 30 중량%의 억제성 신경세포 및/또는 흥분성 신경세포를 포함하는, 3차원 중뇌 세포집합체.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 집합체의 1 내지 10 중량%의 신경아교세포 및 희소돌기신경교세포를 포함하는, 3차원 중뇌 세포집합체.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 유전자 발현의 변이율이 10% 이하로 균질하게 형성되는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양은 연속비진탕배양하는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체.
  10. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 LMX1B, ASCL1 및 TH로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 중뇌마커를 발현하는, 3차원 중뇌 세포집합체.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 전뇌 및/또는 후뇌 마커를 발현하지 않는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체.
  12. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 N-CAD, PLZF, SOX1, SOX2 및 NESTIN로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 신경외배엽 마커를 발현하는, 3차원 중뇌 세포집합체.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 3차원 중뇌 세포집합체는 전분화능 마커 및/또는 중내배엽 마커를 발현하지 않는 것인, 3차원 중뇌 세포집합체.

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