KR20230100812A - 대뇌 오가노이드 및 이의 고속 및 대량 제조 방법 - Google Patents

대뇌 오가노이드 및 이의 고속 및 대량 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대뇌 오가노이드의 생산방법 및 이에 의해 제조된 3차원 대뇌 세포집합체에 관한 것으로서, 상기 제조방법은 오가노이드를 고속 생산할 수 있어 신속한 약물 스크리닝이 가능하고, 비정상적 분화 (out-growth)을 차단하며, 오가노이드 간의 편차를 감소시키므로, 이를 효과적으로 오가노이드의 제조에 이용할 수 있다.

Description

대뇌 오가노이드 및 이의 고속 및 대량 제조 방법{Cerebral organoids and high-speed and mass-production method thereof}
본 발명은 대뇌 (Cerebrum) 오가노이드 및 이의 고속 및 대량 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대뇌 오가노이드 제작에 필요한 초기 시작 세포 수 (starting cell number)와 배양방식 (culture format)을 조절함으로써 품질이 우수하고 개체간 변이가 적은 대뇌 오가노이드를 고속 및 대량 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
오가노이드란 줄기 세포의 분화능 (differentiation), 자기 재생능 (self-renewal), 자가 조직화능 (self-organization)을 활용하여 3차원 배양을 통해 체내 장기와 유사한 세포조성 및 구조를 재현해 내는 새로운 줄기 세포 분화기법으로, 체내 장기와 유사한 환경을 모사함으로써 다양한 질환의 질환 모사 연구 및 치료 약물 스크리닝 연구에 활용 가능한 기술이다. 나아가 환자 맞춤형 오가노이드 생산을 통해, 다양한 질환에 대한 환자 맞춤형 치료제를 저비용, 단기간에 생산할 수 있는 미래 기술로 평가받고 있다.
최근 다양한 뇌 부위 특성을 반영하는 뇌 오가노이드 생산이 보고되고 있으며, 뇌 오가노이드를 이용한 지카 바이러스(ZIKA virus) 연구 혹은 환자 유래 뇌 오가노이드를 이용한 질환 모사 및 신약개발 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.
그러나, 환자 맞춤형 오가노이드 생산에는 많은 비용과 오랜 시간이 소요된다. 도 1과 같이, 실제 환자 유래 유도만능줄기 세포 (induced pluripotent stem cell; iPSCs) 생산에는 보통 6 내지 8주 이상이 소요되며, 그 효율도 보통 0.02% 정도로 매우 낮다. 나아가 오가노이드 생산에 걸리는 시간은 각 장기별 오가노이드에 따라 상이하지만 뇌 오가노이드의 경우 대부분 3 내지 6개월 이상이 소요된다. 따라서, 환자의 연령이 높은 퇴행성 뇌질환 및 기타 시급한 약물 치료가 요구되는 환자의 경우 환자 맞춤형 신약개발 등이 현실적으로 어려운 상황이다.
또한, 뇌 오가노이드를 포함한 대부분의 오가노이드 생산에는 아래와 같은 문제점들이 있으며, 이는 오가노이드 연구의 실용화 또는 산업화를 위해 반드시 해결되어야 하는 문제점들이다.
첫째, 대부분 오가노이드 생산은 상용화 기술 기반의 대량생산이 아닌 연구실 수준의 소량 생산 체계를 통해 생산되고 있으며 오가노이드 기술의 상용화를 위해서는 반드시 대량 생산 기술의 개발이 필요하다.
둘째, 일반적으로 오가노이드 생산 효율 및 재현성은 낮은 편이며 따라서 오가노이드 기술의 상용화를 위해서는 표준화된 고효율 프로토콜 개발이 요구된다.
셋째, 오가노이드 생산에는 많은 비용과 시간이 소요된다. 오가노이드 분화 기법은 대부분 체내 장기의 발달과정을 체외에서 재현함으로써 개발된다. 체외에서 수개월에 걸친 체내 장기 발달과정을 모사함으로 인해, 오가노이드 생산에는 일반적으로 다단계 분화 과정이 필수적으로 사용된다. 나아가, 오가노이드의 기능적 구조적 성숙화를 위해서는 대부분 진탕 생물반응기 (shaking bioreactor)를 활용하여 CO2 인큐베이터 (incubator) 내에서 지속적인 진탕 (shaking) 과정과 함께 장기간 분화 및 성숙화 과정이 필요하다. 뇌 오가노이드의 경우 보통 수개월 이상 (3~6개월)의 분화 및 성숙화 과정이 요구되며 각 분화 단계별 장기간 고가의 분화촉진인자를 처리해야 하기 때문에 오가노이드의 생산에는 많은 비용이 소모된다 (도 1).
넷째, 오가노이드 간 개체간 변이 및 배치간 변이 (batch variation)가 매우 심하며 (도 2), 따라서, 이는 오가노이드를 활용한 질환 모사 연구 및 대용량 신약 스크리닝 연구에서 부정확한 결과를 야기할 수 있다.
다섯째, 뇌 오가노이드 분화시 "비정상적 분화 (out-growth)"라는 비정상적인 비외배엽성 조직이 만들어지며, 이는 뇌 오가노이드의 품질과 기능성 등을 저해하는 심각한 문제점이다 (도 2).
여섯째, 오가노이드 기반 고속 대량 스크리닝 (high-throughput screening; HTS)을 통한 약물 스크리닝 (drug screening) 혹은 약물 재창출 (drug repositioning) 연구를 위해서는 96웰, 384웰 플레이트 등 상용화된 HTS 포맷 (format)에 맞는 오가노이드 대량 생산 시스템 개발이 필요하다. 또한, HTS 포맷에서 오가노이드의 생산, 질환의 체외 재현과 약물 스크리닝의 전과정을 일원화하여 진행 가능한 전주기적 one-step 오가노이드 생산 및 신약개발 시스템 개발은 향후 오가노이드 기술 기반 신약개발 플랫폼 구축 및 다양한 난치성 질환의 치료제 개발을 위해서 반드시 필요한 부분이다.
이에 본 발명자들은 대뇌 오가노이드의 고속/대량 생산을 위하여 오가노이드 생산에 일반적으로 사용되는 진탕 생물반응기 (shaking bioreactor)를 사용하지 않고 개별 연구자에 의해 고안된 concave 멀티 웰 등 비상용화 플랫폼이 아닌 상용화되어 쉽게 구입가능하고 나아가 보편적 이미징 분석 기술 등을 활용한 오가노이드 기반 약물 스크리닝 분석연구 등에 적합한 96 또는 384 웰 (well) 마이크로 웰 플레이트 등 상용화된 고속 대량 스크리닝 (high throughput screening; HTS) 플랫폼 (platform)을 사용하여 대뇌 오가노이드를 생산하고자 하였다. 이를 통해 도 3과 같이 대뇌 오가노이드를 HTS 플랫폼에서 생산할 뿐만 아니라, 100% 효율로 표준화된 수준의 최소화된 개체간 변이를 보이며 비정상적 분화가 억제된 대뇌 오가노이드의 고속, 대량 생산 실현이 가능하였고 고속, 대량 생산 대뇌 오가노이드의 경우 기존 방법으로 생산된 대뇌 오가노이드에 비해 월등히 향상된 균질성과 기능성을 보였다. 나아가 대뇌 오가노이드 생산에 소요되는 시간과 비용을 절감할 수 있음을 확인하였다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, a) 동일한 마이크로 웰 플레이트에 적어도 100개 내지 9000개의 인간 줄기세포를 준비하는 단계; b) 상기 인간 줄기세포로부터 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계; c) 상기 배아체로부터 신경외배엽(Neuroectoderm) 분화를 유도하는 단계; d) 상기 신경외배엽으로부터 신경분화 즉 신경외배엽상피(Neuroepithelium) 형성을 유도하는 단계; 및 e) 상기 신경외배엽상피의 성숙화를 유도하는 단계; 를 포함하는, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 인간 줄기세포는 인간 배아줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함하는 인간 전분화능줄기세포 또는 인간 신경줄기세포를 포함하는 성체줄기세포 중 어느 하나일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 a) 단계 내지 e) 단계는 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속 비진탕 배양되는 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 마이크로 웰 플레이트는 마트리겔을 포함할 수 있다. 마트리겔의 농도는 0.1 내지 5%(v/v)일 수 있고, 보다 구체적으로는 마트리겔이 배지에 직접 첨가되는 것일 수 있다. 마트리겔이 첨가 되는 단계는 바람직하게는 상기 c) 단계 내지 e) 단계 중 적어도 어느 하나 이상의 단계일 수 있으며 더욱 바람직하게는 상기 d) 단계의 신경분화 단계일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 b)단계는 DMEMF12, KSR, 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 글루타맥스(Glutamax), P/S(Penicillin/Streptomycin), 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 헤파린(heparin), Y27632 및 bFGF로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 c) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA(Non essential amino acids), 베타-머캅토에탄올, 헤파린, 도르소모르핀(Dorsomorphin), A83-01, SAG (sonic hedgehog agonist) 및 IWP2로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 d) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA, 베타-머캅토에탄올, 헤파린, EGF 및 bFGF로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 e) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA, 베타-머캅토에탄올, 헤파린, BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell-Derived Neurotrophic Factor), cAMP 및 아스코르브산(Ascorbic Acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 b) 단계의 배아체 형성은 적어도 1일이내에, 상기 c) 단계의 신경외배엽 분화는 적어도 7일이내에, 상기 d) 단계의 신경분화는 적어도 15일 이내에, 상기 e) 단계의 성숙화는 적어도 30일 이내에 완료될 수 있으며, 바람직하게는 전체 분화과정 및 성숙화가 20일 내지 30일 내에 완료될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제조방법 중 어느 하나의 방법으로 형성된, 3차원 대뇌 세포집합체가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 대뇌 세포집합체는 비정상 분화 발생율이 20% 이하일 수 있고, 바람직하게는 10% 이하일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 대뇌 세포집합체는 구형일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 구형의 대뇌 세포집합체는 직경이 0.5 내지 1.5mm로 형성될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 대뇌 세포집합체는 SOX2를 발현하는 뇌실영역(ventricular zone) 및 TUJ1을 발현하는 피질판(cortical plate)을 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 피질판은 CTIP2를 발현하는 내부층(deep layer)과 SATB2를 발현하는 표면층(superficial layer)를 포함할 수 있으며, REELIN 및 LAMININ을 발현하는 변연부(marginal zone)을 최외곽에 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 대뇌 세포집합체는 흥분성 및 억제성 신경세포, 성상세포, 희소돌기교세포 및 아교세포 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명은 대뇌 오가노이드의 제조방법과 이에 의해 생산되는 대뇌 오가노이드에 관한 것으로서, 상기 제조방법에 따르면 오가노이드를 고속 대량 생산할 수 있고, 오가노이드의 비정상적 분화 (out-growth)을 차단하며, 오가노이드 간의 편차를 감소시키고, 대뇌 오가노이드의 높은 기능성을 유도함으로, 이를 효과적으로 오가노이드의 제조에 이용할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 환자 맞춤형 오가노이드 생산을 위한 유도 만능 줄기 세포 (Induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs)의 제작 및 오가노이드 분화 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 종래 오가노이드 생산의 다양한 문제점들을 나타낸 모식도이다.
도 3은 종래 기술에 비교한 본 발명의 오가노이드 생산 전략을 나타낸 모식도이다.
도 4는 종래 기술인 대뇌 오가노이드 분화조건과 이에 따라 제조된 오가노이드의 형태분석이다.
도 5는 신규조건 1에 해당하는 분화조건 및 이에 따라 제조된 오가노이드의 형태분석이다.
도 6은 신규조건 2에 해당하는 분화조건 및 이에 따라 제조된 오가노이드의 형태분석이다.
도 7은 신규조건 3에 해당하는 분화조건 및 이에 따라 제조된 오가노이드의 형태분석이다.
도 8는 신규조건 4에 해당하는 분화조건 및 이에 따라 제조된 오가노이드의 형태분석이다.
도 9는 각 분화 조건별 생산된 대뇌 오가노이드의 형태에 따른 효율을 분석한 도표이다.
도 10은 각 분화 조건별 생산된 대뇌 오가노이드의 유전자 발현양상을 비교한 것이다.
도 11은 생산된 대뇌 오가노이드의 구조적 분석을 위한 면역형광염색법 결과이다.
도 12는 생산된 대뇌 오가노이드의 세포조성 분석을 위한 면역형광염색법 결과이다.
도 13은 초기 시작세포수에 따른 대뇌 오가노이드의 형태를 분석한 것이다.
도 14는 초기 시작세포수에 따른 대뇌 오가노이드의 크기를 분석한 도표이다.
도 15는 초기 시작세포수에 따른 대뇌 오가노이드의 유전자 발현양상을 분석한 것이다.
도 16은 96웰 플레이트에 초기시작세포수 3000개를 이용하여 대량생산한 대뇌 오가노이드의 모습이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명은 대뇌 오가노이드의 고속 및 대량 제조방법과 이에 의해 제조된 대뇌 오가노이드에 관한 것으로, 본 발명에 따른 오가노이드 제조방법은 오가노이드를 고속, 대량 생산할 수 있어 신속한 약물 스크리닝이 가능하고, 오가노이드의 비정상적 분화(out-growth)을 차단하며, 오가노이드 간의 편차를 감소시키고, 대뇌 오가노이드의 신속한 성숙화를 통해 우수한 기능성을 유도한다.
본 발명자들은 오가노이드를 제조함에 있어서 초기 시작 세포 수 (starting cell number)를 100내지 9000개로 적용함으로써 오가노이드 제조에 소요되는 시간을 기존의 3 내지 6개월 이상에서 최대 30일 이내로 단축하는 성과를 도출하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, a) 동일한 마이크로 웰 플레이트에 적어도 100개 내지 9000개의 인간 줄기세포를 준비하는 단계; b) 상기 인간 줄기세포로부터 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계; c) 상기 배아체로부터 신경외배엽(Neuroectoderm) 분화를 유도하는 단계; d) 상기 신경외배엽으로부터 신경분화 즉 신경외배엽상피(Neuroepithelium) 형성을 유도하는 단계; 및 e) 상기 신경외배엽상피의 성숙화를 유도하는 단계; 를 포함하는, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 인간 줄기세포는 인간 배아줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함하는 인간 전분화능줄기세포 또는 인간 신경줄기세포를 포함하는 성체줄기세포 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "줄기 세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기 세포 (totipotent stem cell), 전분화능 줄기 세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기 세포 (multipotent stem cell) 및 역분화 줄기 세포로 분류할 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체는 오가노이드인 것일 수 있고, 예를 들어, 뇌 오가노이드인 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대뇌 오가노이드일 수 있다.
본 명세서상의 용어 "오가노이드"는 줄기 세포나 장기 기원 세포로부터 분리한 세포를 3D 배양법으로 다시 응집 또는 재조합하여 만들어진 세포집합체를 의미하는 것으로, 서스펜션 세포 배양물로부터 형성된 오가노이드 또는 세포 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 오가노이드는 소형 유사 장기, 장기 유사체, 유사 장기로도 명명될 수 있다. 상기 오가노이드는 구체적으로 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하며, 조직 또는 기관의 구조와 기능을 재현할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 a)단계에서의 상기 줄기세포는 바람직하게는 100개 내지 3000개일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 500 내지 3000개일 수 있고, 가장 바람직하게는 1000개 내지 3000개일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서 보이는 바와 같이, a) 단계의 시작 줄기세포 숫자를 변화시킴에 따라, 제조되는 세포집합체의 크기와 균일도 및 유전자 발현양상이 다르게 나타남을 확인하였다.
일 측에 따르면, 상기 a) 단계 내지 e) 단계는 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속 비진탕 배양되는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서 마이크로 웰 플레이트는, 오목부를 갖는 멀티 웰 플레이트인 것일 수 있다. 상기 오목부를 갖는 멀티 웰 플레이트는 바람직하게는 96 웰 플레이트, 384 웰 플레이트 또는 1,536 웰 플레이트인 것일 수 있다.
본 발명에 따르면 종래 진탕(shaking) 배양하는 방법과 비교하여, 시판되는 마이크로 웰 플레이트에 비진탕 연속배양 함으로써 고속대량생산가능한 플랫폼을 제공할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 마이크로 웰 플레이트는 마트리겔을 포함할 수 있다. 마트리겔의 농도는 0.1 내지 5%(v/v)일 수 있고, 보다 구체적으로는 마트리겔이 배지에 직접 첨가되는 것일 수 있다. 마트리겔이 첨가되는 단계는 바람직하게는 상기 c) 단계 내지 e) 단계 중 적어도 어느 하나 이상의 단계일 수 있으며 더욱 바람직하게는 상기 d) 단계의 신경분화 단계일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 b)단계는 DMEMF12, KSR, 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 글루타맥스(Glutamax), P/S, 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 헤파린(heparin), Y27632 및 bFGF로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 c) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA(Non essential amino acids), 베타-머캅토에탄올, 헤파린, 도르소모르핀(Dorsomorphin), A83-01, SAG (sonic hedgehog agonist), 및 IWP2로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 d) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA, 베타-머캅토에탄올, 헤파린, EGF 및 bFGF로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 e) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA, 베타-머캅토에탄올, 헤파린, BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell-Derived Neurotrophic Factor), cAMP 및 아스코르브산(Ascorbic Acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 b) 단계의 배아체 형성은 적어도 1일이내에, 상기 c) 단계의 신경외배엽 분화는 적어도 7일이내에, 상기 d) 단계의 신경분화는 적어도 15일 이내에, 상기 e) 단계의 성숙화는 적어도 30일 이내에 완료될 수 있으며, 바람직하게는 전체 분화과정 및 성숙화가 20일 내지 30일 내에 완료될 수 있다.
즉, 본 발명에 있어서 3차원 세포집합체는, 20 내지 50일, 또는 20일 내지 40일 내에 형성되는 것일 수 있고, 예를 들어, 20일 내지 30일 내에 형성되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제조방법 중 어느 하나의 방법으로 형성된, 3차원 대뇌 세포집합체가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 3차원 대뇌 세포집합체는 비정상 분화 발생율이 20% 이하일 수 있고, 바람직하게는 10% 이하일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 대뇌 세포집합체는 구형일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 구형의 대뇌 세포집합체는 직경이 0.5 내지 1.5mm로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 0.8 내지 1.2mm로 균일하게 형성될 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 대뇌 세포집합체는 SOX2를 발현하는 뇌실영역(ventricular zone) 및 TUJ1을 발현하는 피질판(cortical plate)을 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 피질판은 CTIP2를 발현하는 내부층(deep layer)과 SATB2를 발현하는 표면층(superficial layer)를 포함할 수 있으며, REELIN 및 LAMININ을 발현하는 변연부(marginal zone)을 최외곽에 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 대뇌 세포집합체는 흥분성 및 억제성 신경세포, 성상세포, 희소돌기교세포 및 아교세포 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 3차원 세포집합체 형성 후, 추가적으로 진탕배양이 수행될 수 있다. 상기 추가적인 진탕배양을 통하여 장기간 배양이 가능해질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 배아체를 형성하는 단계로부터 세포집합체의 성숙화를 유도하는 단계까지 웰 플레이트의 이동 없이 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속적으로 수행하였으며, 멀티 마이크로 웰 플레이트를 이용한 30일 이내의 고속 대량 배양이 가능하였다. 따라서, 본 발명에 따른 대뇌 세포집합체는 적어도 30일 이내의 분화 및 성숙화가 완료되어 신속한 질환재현이 가능하며, 약물 반응성 및 스크리닝에 활용될 잠재성을 가지고 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1. 오가노이드의 제조 프로토콜 확립
대뇌 오가노이드의 고속/대량 생산에 앞서, 일반적으로 매우 낮은 분화 효율을 보이는 대뇌 오가노이드 생산 프로토콜을 표준화하기 위한 연구를 수행하였다. 이를 위하여 종래 기술 기반의 대뇌 오가노이드 생산 기법을 통해 대뇌 오가노이드를 생산하였다. 그 결과 대뇌 오가노이드가 형성되기는 하지만 비정상적 분화 (uncontrolled differentiation, out-growht) 양상이 빈번히 관찰되어 그 분화 효율이 매우 낮음을 확인하였다 (도4).
이러한 대뇌 오가노이드의 낮은 분화 효율 및 높은 빈도의 비정상적 분화를 제어하기 위한 최적의 프로토콜 확립을 위하여, 먼저 아래와 같은 4가지 분화 조건을 활용하여 대뇌 오가노이드를 생산하여 15일차와 45일차의 대뇌 오가노이드 형태를 분석하였다(도5 내지 도8).
각 조건은 도5 내지 도8에서 기록된 바와 같이, 배지 조성물의 처리기간을 상이하게 설정하였다. 신규조건1의 경우 100% 효율로 대뇌 오가노이드 생산이 가능하였고 비정상적 분화양상이 전혀 관찰되지 않았다 (도5).
신규조건2, 3, 4 역시 매우 높은 효율로 대뇌 오가노이드 생산이 가능하였으나 일부 대뇌 오가노이드에서는 cyst 형성을 포함한 낮은 빈도의 비정상적 분화양상이 관찰되었다(도 6 내지 도 8).
본 발명에서 확인한 4가지 새로운 조건에서 생산된 분화 45일경 대뇌 오가노이드의 분화효율을 조사한 결과 종래 방법의 경우 우수한 품질의 대뇌 오가노이드는 11%의 매우 낮은 빈도로 형성되고 77%가량이 경도 수준 비정상적 분화가 수반되는 중간 품질의 대뇌 오가노이드가 형성되며, 12%정도는 매우 낮은 품질의 대뇌 오가노이드 분화가 관찰되었다. 그러나 신규 조건의 경우, 각 조건별 다소 차이는 있으나 대부분 80~90% 이상이 우수한 품질을 가지는 대뇌 오가노이드로 분화가 이루어짐을 확인하였다 (도9).
본 발명에서 검증한 4가지 신규 분화조건을 통해 생산된 대뇌 오가노이드의 유전자 발현 양상을 비교하여 도 10에 나타내었으며, 모든 신규조건에서 기존방법 유래 대뇌 오가노이드 대비 우수한 유전자 발현양상을 보임을 확인하였다 (도10). 이들 신규조건 중에서도 신규조건 1이 분화 효율과 형성된 대뇌 오가노이드의 품질 및 유전자 발현양상이 가장 우수하여 이를 표준 프로토콜로 확립하였으며, 이하 실험예들은 모두 신규조건 1의 프로토콜을 통해 이루어졌다.
실시예 2. 신규조건 1의 프로토콜을 통해 제조된 대뇌 오가노이드의 구조 및 세포조성 분석
상기 신규조건 1 프로토콜을 통해 생산된 대뇌 오가노이드의 구조적 분석을 수행하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 대뇌 오가노이드는 실제 사람의 대뇌 조직과 유사한 구조를 보임을 확인하였다. SOX2 양성의 뇌실영역(ventricular zone)과 TUJ1 양성의 피질판(cortical plate)이 관찰되었고 성숙화 과정을 거친 피질판은 CTIP2양성의 내부층과 SATB2양성의 표면층으로 구분되고 가장 바깥쪽에는 REELIN 및 LAMININ을 발현하는 변연부(marginal zone, Cajal-Retzius neuron)이 존재함을 확인하였다. 이는 생산된 대뇌 오가노이드가 임신 중기 태아의 대뇌와 유사한 구조 및 발달단계를 보임을 시사한다(도11).
또한, 생성된 대뇌 오가노이드는 인간 대뇌조직과 세포조성에 있어서도 유사함을 면역조직염색기법으로 확인하여 이를 도 12에 나타내었다. 도 12에서 나타나듯, 대뇌 오가노이드는 아교세포 (성상세포 및 희돌기교세포) 및 흥분성 신경세포, 억제성 신경세포를 포함하고 있었으며, 시냅스 형성도 관찰되었다.
실시예 3. 시작 세포수에 따른 대뇌 오가노이드 고속대량생산방법 확립
본 발명에서 최적화한 대뇌 오가노이드 분화조건 (상기 실시예 1의 신규조건1)을 기반으로 96웰 및 384 웰의 마이크로웰 플레이트를 이용한 대뇌 오가노이드 고속/대량 생산기술 개발을 위한 연구를 수행하였다. 이를 위해, 초기 시작세포를 100, 250, 500, 1000, 3000, 5000, 9000개로 달리하여 대뇌 오가노이드로의 분화를 수행하였다. 그 결과, 100개와 250개를 사용한 경우 초기 배상체 형성 및 대뇌 오가노이드 형성이 제대로 이뤄지지 못하였고 500, 1000, 3000, 5000, 9000개를 사용한 경우는 대뇌 오가노이드가 적절하게 형성되었다 (도13).
특히, 종래 기법으로 생산한 대뇌 오가노이드의 경우 직경의 편차가 매우 컸으나 1000, 3000, 5000, 9000개의 시작세포를 사용하여 연속 비진탕 과정을 통해 생산된 대뇌 오가노이드는 그 직경이 1 mm 정도로 균일하게 형성됨을 관찰하였고 이를 도 14에 나타내었다. 이는 본 발명을 통해 개발된 연속 비진탕 배양 기법으로 생산된 대뇌 오가노이드에서 개체간 변이가 매우 효율적으로 차단되었음을 보여준다.
대뇌 오가노이드 크기 편차가 상대적으로 적었던 1000, 3000 및 5000개의 시작 세포 수에서 제조된 대뇌 오가노이드의 유전자 발현양상을 조사한 결과 시작 세포 수가 3000개 및 5000개에서 제조된 오가노이드의 유전자 발현양상이 1000개 시작 세포 수에서 제조된 대뇌 오가노이드보다 우수한 것으로 나타났으며 이를 도 15에 나타내었다.
최종적으로, 96웰 플레이트에서 시작세포수를 3000개로 하여 연속 비진탕 생산한 결과를 도 16에 나타내었다. 매우 균질한 형태 및 크기를 보이는 대뇌 오가노이드를 마이크로웰 플레이트에서 생산가능하였으며, 이는 본 발명을 통해 대뇌 오가노이드 기술의 상용화를 위한 고속, 대량 생산기법이 확립되었음을 의미한다.
구체적인 일자별 처리과정은 하기와 같다.
(Day 0) 단일-세포로 해리된 인간 배아 줄기 세포 (human embryonic stem cell; hESC) 100, 250, 500, 1000, 3000, 5000, 9000개를 50 uM Y-27632 및 4ng/ml 기본 섬유 모세포 성장 인자 (bFGF)을 갖는 u-bottom 96-웰 (well) 플레이트 상에 플레이팅하였다. (COB1: 20% KSR, 1% p/s(penicillin/streptomycin), 1% 글루타맥스(glutamax), 55 uM 베타-머캅토에탄올, 3% FBS(fetal bovine serum) 및 1 μg/ml 헤파린이 보충된 DMEM/F12의 혼합물)
(Day 1~7) 배양체 (embryoid body; EB)의 형성을 확인하고 COB2와 함께 2 uM 도르소모르핀(dorsomorphin), 2 uM A83-01, 2.5 uM WNT 신호전달체계 억제제 IWP2을 함유하는 배지를 첨가하였다. 이 시기 처리기간은 day 2, day 3 내지 day 4으로 한정하였다(COB2: N2 supplement 100X, 2% B27 w/o 비타민 A, 1% p/s, 1% 글루타맥스, 1% NEAA, 55 uM 베타-머캅토에탄올 및 1 μg/ml 헤파린이 보충된 DMEM/F12 및 Neurobasal Medium의 1:1 혼합물). 100 nM SAG (sonic hedgehog agonist)를 day 4 부터 1, 2, 내지 3일간 처리 하였다.
(Day 7-15) COB2와 함께 20ng/ml의 EGF 및 20ng/ml의 bFGF 를 포함하는 배지로 교체하였다. 1% 성장인자 억제된 용해성 마트리겔이 BGM에 직접적으로 첨가되었다
(Day 15-45) COB2와 함께 10 ng/ml 뇌-유래 신경성장 인자 (Brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 10 ng/ml 교세포 신경성장인자 (Glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF), 200 uM 아스코르브산, 및 125 uM cAMP를 함유하는 BMM으로 배지로 교체하였다. BMM은 처리기간 동안 매일 교체하였다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (17)

  1. a) 동일한 마이크로 웰 플레이트에 적어도 100개 내지 9000개의 인간 줄기세포를 준비하는 단계;
    b) 상기 인간줄기세포로부터 배아체(Embryoid body)를 형성하는 단계;
    c) 상기 배아체로부터 신경외배엽(Neuroectoderm) 분화를 유도하는 단계;
    d) 상기 신경외배엽으로부터 신경외배엽상피 형성을 유도하는 단계; 및
    e) 상기 신경외배엽상피의 성숙화를 유도하는 단계;
    를 포함하는, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 상기 인간 줄기세포는 인간 배아줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함하는 인간 전분화능줄기세포 또는 인간 신경줄기세포를 포함하는 성체줄기세포 중 어느 하나인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계 내지 e) 단계는 동일한 마이크로 웰 플레이트에서 연속 비진탕 배양되는 것인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 a) 단계 내지 d) 단계는 동일한 마이크로 플레이트에서 연속 비진탕 배양되는 것인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    0.5 내지 5%의 마트리겔이 상기 c)단계 내지 e)단계 중 적어도 어느 하나 이상의 단계에서 배지에 직접 첨가되는, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 b)단계는 DMEMF12, KSR, 소태아혈청(FBS, Fetal Bovine Serum), 글루타맥스(Glutamax), P/S(penicillin/streptomycin), 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 헤파린(heparin), Y27632 및 bFGF로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 c) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA(Non essential amino acids), 베타-머캅토에탄올, 헤파린, 도르소모르핀(Dorsomorphin), A83-01, SAG 및 IWP2로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 d) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA, 베타-머캅토에탄올, 헤파린, EGF 및 bFGF로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 e) 단계는 DMEMF12, Neurobasal Medium, N2 100X, 비타민A 없는 B27, 글루타맥스, P/S, NEAA, 베타-머캅토에탄올, 헤파린, BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), GDNF(Glial cell-Derived Neurotrophic Factor), cAMP 및 아스코르브산(Ascorbic Acid)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 수행되는 것인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 b) 단계의 배아체 형성은 적어도 1일이내에, 상기 c) 단계의 신경외배엽 분화는 적어도 7일이내에, 상기 d) 단계의 신경분화는 적어도 15일 이내에, 상기 e) 단계의 성숙화는 적어도 30일 이내에 완료되는 것인, 3차원 대뇌 세포집합체의 형성방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 형성된, 3차원 대뇌 세포집합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 3차원 대뇌 세포집합체는 비정상 분화 발생율이 20% 이하인, 3차원 대뇌 세포집합체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 3차원 대뇌 세포집합체는 구형인, 3차원 대뇌 세포집합체.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 구형의 대뇌 세포집합체는 직경이 0.5 내지 1.5mm인, 3차원 대뇌 세포집합체.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 대뇌 세포집합체는 SOX2를 발현하는 뇌실영역(ventricular zone) 및 TUJ1을 발현하는 피질판(cortical plate)을 포함하는, 3차원 대뇌 세포집합체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 피질판은 CTIP2를 발현하는 내부층(deep layer)과 SATB2를 발현하는 표면층(superficial layer)를 포함할 수 있으며, REELIN 및 LAMININ을 발현하는 변연부(marginal zone)을 최외곽에 더 포함하는, 3차원 대뇌 세포집합체.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 대뇌 세포집합체는 흥분성 및 억제성 신경세포, 성상세포, 희소돌기교세포 및 아교세포 중 어느 하나 이상을 포함하는, 3차원 대뇌 세포집합체.

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