RU2784072C1 - Улучшенный способ получения мозговых органоидов - Google Patents
Улучшенный способ получения мозговых органоидов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2784072C1 RU2784072C1 RU2022103395A RU2022103395A RU2784072C1 RU 2784072 C1 RU2784072 C1 RU 2784072C1 RU 2022103395 A RU2022103395 A RU 2022103395A RU 2022103395 A RU2022103395 A RU 2022103395A RU 2784072 C1 RU2784072 C1 RU 2784072C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- organelles
- mini
- bioreactor
- organoids
- brain
- Prior art date
Links
- 210000002220 Organoids Anatomy 0.000 title claims abstract description 27
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 title claims abstract description 21
- 210000003463 Organelles Anatomy 0.000 abstract description 32
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 abstract description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 10
- 230000001537 neural Effects 0.000 description 10
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 9
- 210000004263 Induced Pluripotent Stem Cells Anatomy 0.000 description 7
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000001671 Embryonic Stem Cells Anatomy 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 210000004129 Prosencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 102000014961 Protein Precursors Human genes 0.000 description 2
- 108010078762 Protein Precursors Proteins 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N Tretinoin Chemical compound OC(=O)/C=C(\C)/C=C/C=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-NWVFGJFESA-N 0.000 description 2
- 229960001727 Tretinoin Drugs 0.000 description 2
- 102000031061 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108091000118 Tyrosine 3-monooxygenases Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000002490 cerebral Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N precursor Substances N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 2
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-(4-piperazin-1-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 210000002469 Basement Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004958 Brain cells Anatomy 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-Derived Neurotrophic Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-Derived Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 210000001638 Cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003710 Cerebral Cortex Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 Colon Anatomy 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 102100006141 FOXA2 Human genes 0.000 description 1
- 101700049079 FOXA2 Proteins 0.000 description 1
- 102100012570 GFAP Human genes 0.000 description 1
- 101700069447 GFAP Proteins 0.000 description 1
- 102000004329 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000821 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 210000001320 Hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003016 Hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 210000001153 Interneurons Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 102100004938 MAP2 Human genes 0.000 description 1
- 101700017358 MAP2 Proteins 0.000 description 1
- 101710012506 METAP2 Proteins 0.000 description 1
- 101700059931 MPK4 Proteins 0.000 description 1
- 210000001259 Mesencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010008267 Nerve Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 210000001020 Neural Plate Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N Purmorphamine Chemical compound C1CCCCC1N1C2=NC(OC=3C4=CC=CC=C4C=CC=3)=NC(NC=3C=CC(=CC=3)N3CCOCC3)=C2N=C1 FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100007769 RIC8B Human genes 0.000 description 1
- 101700025865 RIC8B Proteins 0.000 description 1
- 210000001525 Retina Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 101710025594 TUBB3 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structures Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000003988 neural development Effects 0.000 description 1
- 210000004255 neuroglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic Effects 0.000 description 1
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к клеточной биологии, биотехнологии и медицине, в частности к способу получения мозговых органоидов из нейроэпителиальных сфероидов. Способ осуществляют в мини-биореакторе при 37±1 °С, в атмосфере 5±1% СО2, относительной влажности 80±5%, при вращении на орбитальном шейкере с частотой 60-70 об/мин. Мини-биореактор представляет собой чашку Петри с низкой адгезией, которая имеет внутренний диаметр не менее 60 мм и оснащена центральным островным элементом, имеющим форму шарового сегмента диаметром от 0,83 до 1,17 внутреннего диаметра мини-биореактора и высотой не менее 3 мм. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал средств для получения мозговых органоидов с возможностью сохранения поверхностного слоя клеток от повреждений. 6 ил., 3 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой способ получения мозговых органоидов из соответствующих нейроэпителиальных сфероидов.
Уровень техники
Создание 3D-органоидов из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) - эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) - значительно облегчило исследования в области моделирования органогенеза человека in vitro и стало мощным инструментом изучения механизмов развития различных патологий и разработки новых подходов к их терапии. Были сделаны успешные попытки создания многоклеточных органоидов мозга человека, толстой кишки, почек, сетчатки, печени. Из уровня техники известно множество способов (протоколов) получения органоидов, состоящих из нескольких типов клеток головного мозга, или же клеток определенных зон. Добавление в среду для культивирования факторов морфогенеза позволяет получать органоиды различных региональных подтипов мозга, что представлено в разработках, опубликованных в работах (Kelava, I., and Lancaster, M.A. (2016) Stem cell models of human brain development, Cell Stem Cell, 18, 736-748, doi: 10.1016/j.stem.2016.05.022.; Di Lullo, E., and Kriegstein, A.R. (2017) The use of brain organoids to investigate neural development and disease, Nat. Rev. Neurosci., 18, 573-584, doi: 10.1038/nrn.2017.107.; Camp, J.G., Badsha, F., Florio, M., Kanton, S., Gerber, T., Wilsch-Brauninger, M., Lewitus, E., Sykes, A., Hevers, W., Lancaster, M., Knoblich, J.A., Lachmann, R., Paabo, S., Huttner, W.B., and Treutlein, B. (2015) Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 15672-15677, doi: 10.1073/pnas.1520760112). Разработаны протоколы получения коры головного мозга [Xiang, Y., Tanaka, Y., Patterson, B., Kang, Y.J., Govindaiah, G., Roselaar, N., Cakir, B., Kim, K.Y., Lombroso, A.P., Hwang, S.M., Zhong, M., Stanley, E.G., Elefanty, A.G., Naegele, J.R., Lee, S.H., Weissman, S.M., and Park, I.H. (2017) Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration,Cell Stem Cell, 21, 383-398, doi: 10.1016/j.stem.2017.07.007], мозжечка [Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., and Sasai, Y. (2015) Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells, Cell Rep., 10, 537-550, doi: 10.1016/j.celrep.2014.12.051], среднего мозга, переднего мозга, гипоталамуса [Qian, X., Jacob, F., Song, M.M., Nguyen, H.N., Song, H., and Ming, G.L. (2018) Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor, Nat. Protoc., 13, 565-580, doi: 10.1038/nprot.2017.152.], гиппокампа [Sakaguchi, H., Kadoshima, T., Soen, M., Narii, N., Ishida, Y., Ohgushi, M., Takahashi, J., Eiraku, M., and Sasai, Y. (2015) Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell-derived dorsomedial telencephalic tissue, Nat. Commun., 6, 8896, doi: 10.1038/ncomms9896.]. Все эти вышеперечисленные протоколы разделяются на две группы по способу получения 3D-структур и дальнейшему их культивированию с дифференцировкой. Первая группа - это различные модификации протокола Ланкастер (2014) или схожие по технологии схемы дифференцировки, различающиеся между собой сроками культивирования и индукторами дифференцировки с последующим вызреванием органоидов на шейкере в специальных низкоадгезионных приспособлениях по типу микропробирок или планшетов. Вторая группа протоколов подразумевает использование специальных биореакторов. Близкий к настоящему изобретению аналог описан в работе Krefft et al. (2018), где показана возможность получения органоидов мозга за четыре этапа [Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., and Ladewig, J. (2018) Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells, J. Vis. Exp., 131, 56768-56776, doi: 10.3791/56768.]. Этот протокол включает в себя следующие этапы: получение агрегатов ИПСК (предварительно клетки культивировали до состояния монослоя); индукцию передней нейроэктодермы; инкапсуляцию нейроэктодермальных агрегатов в матрицу (экстракт базальной мембраны); дифференцировку мозгоподобных органоидов, характерных для переднего мозга. Данный протокол позволяет получить стандартные по размеру органоиды, но в небольшом количестве, по причине большой технической трудоемкости, связанной иммобилизацией каждого отдельного органоида в капле матрицы. Помимо этого, использование приспособлений типа «paraffin film» для иммобилизации в геле несет высокие риски контаминации и делает невозможным использование этого протокола для наработки большого количества органоидов, например, для скрининговых исследований. В протоколе, предложенном Qian et al. (2018), были использованы высокотехнологичные механические лопастные планшетные миниреакторы, позволяющие регулировать частоту вращения лопаток роторов во всех лунках. Однако, несмотря на высокую эффективность предложенного способа получения органоидов, при масштабировании стоимость таких реакторов является существенной составляющей в исследованиях. К тому же большое количество механических составляющих в таких реакторах затрудняет его деконтаминацию и снижает надежность при длительной эксплуатации. Анализ протоколов указывает на необходимость культивирования органоидов в условиях циркулирующей питательной среды. Эти недостатки устранены в предлагаемом изобретении, где используются простые по конструкции минибиореакторы, в которых динамические условия реализуются с помощью шейкера внутри СО2 инкубатора.
Другим близким аналогом способа получения органоидов мозга является изобретение, описанное в патенте Китая №108456659 B (опубл. 28.08.2018; МПК: C12N5/079), в котором описано получение органоидов мозга с помощью ассоциации клеток, полученных из диспергированных аккутазой нейросфер и поэтапным их культивированием в средах с нейротрофическими факторами (BDNF/GDNF) и ретиноевой кислотой. Данный способ отличается от предложенного в данной заявке тем, что присутствует этап энзиматической обработки нейросфер, что может снизить жизнеспособность. При этом длительный срок формирования органоидов через периодическое наслоение на сфероиды дифференцированных клеток, усложняет масштабирование. В настоящем изобретении также не использовали ретиноевую кислоту в связи с ее плейотропным эффектом и риском получения ненейрональных прогениторных клеток.
Наиболее близким аналогом (прототипом) способа получения мозговых органоидов по предлагаемому изобретению является способ, описанный в работе Еремеев и др., 2018 [А.В. Еремеев, Е.А. Воловиков, Л.Д. Шувалова, А.В. Давиденко, Е.А. Хомякова, М.Е. Богомякова, О. С. Лебедева, О.А. Зубкова, М. А. Лагарькова «ГОЛЬ НА ВЫДУМКИ ХИТРА», ИЛИ ДЕШЕВЫЙ, НАДЕЖНЫЙ И ВОСПРОИЗВОДИМЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНОИДОВ// БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 3, с. 448 - 456]. В данной публикации раскрыт способ получения органоидов с использованием минибиореактора, представляющего собой плоскую чашку Петри с приклеенным ко внутренней поверхности дна пластиковым цилиндром, при этом культивирование органоидов осуществляется на орбитальном шейкере. Цилиндры изготавливали из центрифужных пробирок, которые затем вклеивали в чашки Петри.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала способов получения мозгоподобных органоидов, а также создание нового усовершенствованного способа, лишенного недостатков, присущих известным из уровня техники аналогам.
Под нейроэпителиальными сфероидами (далее сфероидами) понимают 3D структуры, состоящие из нейроэпителиальных (прогениторных) клеток и имеющие однородную структуру. Под мозговыми органоидами понимают клеточные структуры, состоящие из разных типов клеток нейрональной природы - глия, нейроны и т.п.), имеющие сложную морфологию и электрофизиологическую активность.
Раскрытие изобретения
При воспроизведении способа, раскрытого в публикации [Еремеев и др., 2018], авторами был обнаружен ряд недостатков.
Основной недостаток заключался в том, что при использовании для выращивания мозгоподобных органоидов минибиореактора, содержащего цилиндрический островной элемент, наблюдалось повреждение органоидов в результате трения их об указанный элемент в процессе культивирования на орбитальном шейкере. Шлифование кромок и поверхности цилиндрического элемента не улучшило существенным образом эту проблему. В ходе дальнейших экспериментов с островными элементами разных форм нами было неожиданно обнаружено, что органоиды не повреждаются, если элемент имеет форму шарового сегмента. Дополнительным преимуществом использования сферического островного элемента вместо цилиндрического является увеличение полезного объем питательной среды примерно на 1-1,5 мл, что позволяет реже проводить ее замену и уменьшает риск контаминации. Также в предлагаемом способе используется более совершенные параметры культивирования по сравнению со способом, выбранным в качестве прототипа [Еремеев и др., 2018]. В частности, в указанной публикации, используется плотность клеток ИПСК на старте дифференцировки 80-85% конфлуэнтности и заменитель сыворотки, а также более низкая концентрация дорсоморфина, что несет риск дифференцировки в не нейрональном направлении.
Предлагаемое изобретение представляет собой способ получения мозговых органоидов in vitro из популяции плюрипотентных стволовых клеток, который включает следующие стадии:
1. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток (индуцированные плюрипотентные или эмбриональные стволовые клетки) в стандартных для плюрипотентных клеток средах в монослойной культуре до достижения конфлюэнтной плотности не менее 90%.
2. Культивирование в среде, стимулирующей дифференцировку плюрипотентных клеток в нейрональном направлении до стадии нейроэпителиальных прогениторных клеток (розеткообразования) - без заменителя сыворотки и с повышенным содержанием дорсоморфина до 5 мкМ.
3. Снятие нейрональных предшественников с культуральной посуды щадящим неэнзиматическим способом с в виде суспензии и последующей реагрегацией в микролунках плашек AggreWell TM400.
4. После формирования сфероидов - агрегатов в микролунках плашек AggreWell TM400, сфероиды инкубировали в Матригеле и переносили в заранее приготовленные минибиореакторы.
5. Выращивание мозговых органоидов из сфероидов в минибиореакторе, представляющем собой чашку Петри с центральным островным элементом в форме шарового сегмента, выполненным из того же материала, что и чашка Петри. В предпочтительном варианте осуществления изобретения шаровой сегмент имеет диаметр от 0,83 до 1,17 внутреннего диаметра минибиореактора, а высота указанного шарового сегмента - не менее 3 мм. При этом предпочтительный внутренний диаметр минибиореактора составляет не менее 60 мм.
Главный технический результат, достигаемый при реализации способа по настоящему изобретению, заключается в реализации изобретением своего назначения (при решении задачи расширении арсенала технических средств, применяемых для получения электрофизиологически активных мозгоподобных органоидов). Дополнительный технический результат заключаются в получении мозгоподобных органоидов, не имеющих повреждений поверхностного слоя клеток. Представленные на Фиг. 4 микрофотографии наглядно показывают, что органоиды, полученные, согласно предлагаемому способу (Пример 2), характеризуются ровной гладкой поверхность по сравнению с органоидами, выращенными при аналогичных условиях в миниреакторе, имеющем цилиндрический центральный островной элемент (Пример 3).
Краткое описание чертежей
Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены Фиг. 1-6.
На Фиг. 1 представлен способ создания минибиореактора с центральным островным элементом в форме шарового сегмента согласно Примеру 1 путем нанесения жидкого пластикового клея по центру на донышко чашки Петри (A) и готовый минибиореактор с центральным островным элементом в форме шарового сегмента (Б).
На Фиг. 2 представлена схема получения органоидов согласно Примеру 2, из культуры ИПСК (А), которые дифференцируются в нейроэпителий (Б), с последующей диссоциацией на суспензию единичных клеток - нейрональных предшественников (В) и посадки их на микролунки плашек AgreWell, в которых они реагрегируют в нейроэпителиальные сфероиды (Г-Д) в течение суток. Через сутки сфероиды смывают с микролунок и переносят в минибиореактор (Е - сфероиды, посаженные в миниреакторы), в котором они образуют органоиды мозга при длительном культивировании (Ж - мозговые органоиды через 1 месяц культивирования).
На Фиг.3 представлена схема расположения минибиореакторов на шейкере в СО2 инкубаторе (А), а также внешний вид органоидов в минибиореакторе (Б).
На Фиг.4 представлена макрофотография мозгоподобных органоидов, полученных по Примеру 2, при культивировании в течение 1 месяца в минибиореакторах по Примеру 1 (А) и, для сравнения, в минибиореакторе того же размера, имеющего центральный островной элемент цилиндрической формы (Б). На изображении (Б) видны некоторые повреждения на всех органоидах в виде неровной поверхности, при этом органоиды имеют меньший размер и более рыхлую структуру.
На Фиг.5. Показано иммуногистохимическое окрашивание, демонстрирующее, что в органоидах, полученных по Примеру 2, экспрессируются нейрональные маркеры -А -SOX2 (ранний маркер, красный), Б - β-3-тубулин (красный) , В - GFAP (красный), MAP2 (зеленый), Г - нестин (красный), Д - TH (тирозингидроксилаза) красный, FOXA2 - зеленый (ядерная локализация).
На Фиг.6. Изображена электрофизиологическая активность нейронов (справа), меченных флуоресцентной меткой (с помощью вируса AAV GFP под hSyn промотором). Анализ электрофизиологической активности нейронов в составе органоида (по Примеру 2) методом patch-clamp показал наличие потенциалов действия, характерных для зрелых нейронов.
Осуществление изобретения
Возможность осуществления заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование и подготовка минибиореактора
Вид и приготовление минибиореактора приведена на Фиг. 1 (А, Б). В центре чашки Петри с низкой адгезией (ultra low adhesion, «Corning», США или другого производителя) с внутренним диаметром не менее 6о мм создают центральный элемент в форме шарового сегмента диаметром от 0,83 до 1,17 внутреннего диаметра минибиореактора и высотой не менее 3 мм путем многократного наслаивания клея, приготовленного из таких же чашек Петри с низкой адгезией. Для получения клея пластиковую крошку, полученную из чашек Петри, растворяют в хлороформе в течение суток до получения вязкой однородной массы из расчета 1 г пластиковой крошки на 10 мл хлороформа. Поскольку растворенный пластик идентичен пластику чашки Петри, достигается высокая адгезия и растворенный пластик интегрируется в чашку.
Чашки оставляют открытыми до полного высыхания в ламинарном шкафу. После высыхания чашки дополнительно обрабатывают в ламинарном шкафу ультрафиолетовым светом в течение 45 мин. Собранные по нескольку штук в большие чашки Петри или другие стерильные контейнеры миниреакторы располагают ярусами на полках СО2-инкубатора (Фиг. 3) при необходимости масштабирования работы.
Пример 2. Получение мозговых органоидов in vitro из популяции плюрипотентных стволовых клеток в минибиореакторе с центральным островным элементом в форме шарового сегмента.
Для дифференцировки ИПСК в нейрональном направлении брали культуру при достижении максимальной 90-100% конфлуэнтности (пошаговая схема представлена на Фиг.2 А-Ж), то есть, по достижении полного монослоя (Фиг.2А). Дифференцировку проводили в среде advancedDMEM/F12 с добавлением 0,1 мкМ LDN-193189 («MACS Miltenyi Biotec», Германия), увеличенная концентрация до 5 мкМ дорсоморфина («MACS Miltenyi Biotec», Германия), 10 мкМ SB431542 («MACS Miltenyi Biotec», Германия), 50 мкМ β-меркаптоэтанола, добавок N2 и Neuromax (ПанЭко, Россия), глутамина (ПанЭко, Россия) или глутамакса (Thermofisher Sci, USA). При появлении «розеткоподобных» - нейроэпителиальных структур (обычно на через 1 неделю, Фиг. 2 Б) переходили к процедуре диспергирования на единичные клетки культуры ИПСК раствором Версена с добавлением ингибитора Rho киназы в концентрации 5 мкМ Y27632 («MACS Miltenyi Biotec», Германия) для увеличения выживаемости ИПСК в суспензии при дальнейших манипуляциях. Диспергированные клетки высаживали на плашки AggreWell TM400 или 800 (Фиг.2 В) в среде advanced DMEM/F12 с добавлением 5 мкМ Y27632 («MACS Miltenyi Biotec», Германия), 50 мкМ β-меркаптоэтанола, добавок N2 и Neuromax (ПанЭко, Россия). Клетки осаждали в мягких условиях при 500-600 об/мин на плашечном роторе при комнатной температуре в течение 1 минуты.
Через один день образовавшиеся нейроэпителиальные сфероиды (будущие органоиды, состоящие на этот момент только из прогениторных клеток) аккуратно собирали из лунок серологической пипеткой объемом 2-5 мл в пробирку на 15 мл, отстаивали 2-3 мин, затем супернатант отбирали. Будущие органоиды, которые под действием силы тяжести опускались на дно пробирки, помещали сначала в только что размороженный при 4 °С неразведенный Матригель («Corning», США), через 30 мин отмывали от него путем пассивной седиментации в пробирке объемом 15 мл или мягким центрифугированием в течение 1 мин при 100 g, затем сфероиды перемещали в описанные выше минибиореакторы по Примеру 1, которые размещали на орбитальном шейкере («Inforse» Швейцария) в СО2 инкубаторе. Дальнейшее культивирование органоидов проводили при 37±1 °С, в атмосфере 5±1% СО2, относительной влажности 80±5%, при частоте вращения 60-70 об/мин. Островные элементы не давали сфероидам концентрироваться в центре чашки, что позволяло избежать образования агрегатов и адгезии клеток на чашке. Через сутки среду меняли на DMEM/F12 с добавлением 1×N2 и 1×Neuromax («ПанЭко», Россия), 100×GlutaMAX, 50 ед/мл смеси пенициллина и стрептомицина, 3 мкМ пурморфамина («MACS Miltenyi Biotec», Германия) и 50 мкМ β-меркаптоэтанола. Дальнейшую смену среды проводили через каждые 4-6 дней без центрифугирования за счет оседания органоидов под действием силы тяжести в серологической пипетке объемом 5-10 мл с последующим декантированием надосадочной жидкости. В пробирку добавляли объем среды, равный удаленному, после чего органоиды возвращали в миниреакторы.
Данный способ позволяет получать стандартные по размерам органоиды мозга в большом количестве с сохранением внешней и внутренней структурной целостности. Качество полученных органоидов оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии (внешний вид, Фиг.4), наличие неповрежденной нейрональной природы и внутренней структуры оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии (Фиг.5). Оценку целостности нейрональной сети оценивали с помощью GFP-мечения клеток, включенных в структуру органоидов и образующих нейроны с отростками-дендритами, а также по наличию электрофизиологической активности, которая наблюдается только у зрелых, живых и неповрежденных нейронов (Фиг.6).
Пример 3. Получение мозговых органоидов in vitro из популяции плюрипотентных стволовых клеток в минибиореакторе с центральным островным элементом в форме цилиндра
Мозгоподобные органоиды получали по методике, приведенной в Примере 2, с тем отличием, что в качестве минибиореактора использовали аналогичные чашки Петри с центральным островным элементом в форме цилиндра.
Полученные органоиды имели неоднородную рыхлую структуру и неровную поверхность (Фиг. 4 Б).
Claims (1)
- Способ выращивания мозговых органоидов из нейроэпителиальных сфероидов в мини-биореакторе при 37±1 °С, в атмосфере 5±1% СО2, относительной влажности 80±5%, при вращении на орбитальном шейкере с частотой 60-70 об/мин, отличающийся тем, что указанный мини-биореактор представляет собой чашку Петри с низкой адгезией, которая имеет внутренний диаметр не менее 60 мм и оснащена центральным островным элементом, имеющим форму шарового сегмента диаметром от 0,83 до 1,17 внутреннего диаметра мини-биореактора и высотой не менее 3 мм.
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2784072C1 true RU2784072C1 (ru) | 2022-11-23 |
Family
ID=
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019098256A1 (ja) * | 2017-11-16 | 2019-05-23 | 株式会社幹細胞&デバイス研究所 | デバイス |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019098256A1 (ja) * | 2017-11-16 | 2019-05-23 | 株式会社幹細胞&デバイス研究所 | デバイス |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
KREFFT O. et al., Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells, J. Vis. Exp., 2018, 131, 56768-56776, doi: 10.3791/56768. QIAN X. et al., Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor, Nat. Protoc., 2018, 13, 565-580, doi: 10.1038/nprot.2017.152. * |
ЕРЕМЕЕВ А.В. и др. "Голь на выдумки хитра", или дешёвый, надёжный и воспроизводимый способ получения органоидов, БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 3, с. 448 - 456, DOI: 10.1134/S032097251903014X. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Talkhabi et al. | Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art | |
Ouyang et al. | Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation | |
CN112226363B (zh) | 利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法 | |
CN106609263B (zh) | 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 | |
Meng et al. | Optimizing human induced pluripotent stem cell expansion in stirred-suspension culture | |
CN108456659B (zh) | 3d大脑类器官的制备方法 | |
CN103013909B (zh) | 一种高效分离禽类胚胎干细胞的方法 | |
CN108728356B (zh) | 用于不同三维细胞团配对的装置及共培养方法 | |
CN114149971A (zh) | 用hPSCs诱导分化得到中脑类器官的方法及中脑类器官 | |
CN113846016B (zh) | 一种高通量多孔阵列芯片、装置、制备方法及应用 | |
CN114807034A (zh) | 一种人多能干细胞来源的Müller细胞的制备方法 | |
RU2784072C1 (ru) | Улучшенный способ получения мозговых органоидов | |
CN112326952A (zh) | 筛选细胞的方法、试剂盒及其用途 | |
CN1795266B (zh) | 由源于虹彩组织的神经干细胞生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞 | |
WO2020048141A1 (zh) | 高通量微流控芯片、其制备方法及应用 | |
US20230399612A1 (en) | Method for the generation of neurospheres | |
Anastasaki et al. | Generation of human induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids for cellular and molecular characterization | |
CN113151151B (zh) | 一种iPSC来源肝细胞的仿生微球大规模培养的方法及应用 | |
Huang et al. | Automatic differentiation of human induced pluripotent stem cells toward synchronous neural networks on an arrayed monolayer of nanofiber membrane | |
Revishchin et al. | Structure of cell clusters formed in cultures of dissociated human embryonic brain | |
CN115354029B (zh) | 神经类器官的制备方法和神经类器官 | |
CN117384844A (zh) | 一种高通量一步式制备适用于神经药物筛选的中脑类器官的方法 | |
CN216303865U (zh) | 生物培养芯片及其用于制备所述生物培养芯片的模板 | |
US20080089865A1 (en) | Materials and Methods for Regulating Process Formation in Cell Culture | |
CN114645013B (zh) | 一种通过物理途径促进干细胞分化的材料及方法 |