CN116194127A

CN116194127A - 生成具有脊髓特性的神经祖细胞的方法

Info

Publication number: CN116194127A
Application number: CN202180061598.3A
Authority: CN
Inventors: M·G·费林斯; M·库萨耶; C·S·阿胡贾
Original assignee: University Health Network
Current assignee: University Health Network
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-05-30
Also published as: US20240009248A1; AU2021339479A8; EP4211229A1; WO2022051847A1; WO2022051847A9; CA3193659A1; AU2021339479A1; JP2023539924A

Abstract

本文提供了由iPSC或NPC产生spNPC的方法、细胞群、包含细胞群的组合物以及使用所述方法制备spNPC的用途。所述方法可以包括：a.获得未模式化的NPC，所述未模式化的NPC表达包括Pax6和Sox1的神经外胚层标记物；b.引发步骤a的未模式化的NPC；以及c.模式化引发的未模式化的NPC以产生spNPCS。

Description

生成具有脊髓特性的神经祖细胞的方法

相关申请

本专利合作条约申请要求基于2020年9月8日提交的美国临时专利申请号63/075,575的优先权的35U.S.C.§119的权益，其全部内容通过引用的方式纳入本文。

技术领域

本公开内容涉及由表达Sox2、Pax6、巢蛋白和至少一种脑标记物(如Otx2、Foxg1或Gbx2)的起始神经祖细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)生成具有脊髓特性的神经祖细胞的方法，以及本公开内容涉及包含所述细胞或用于制备所述细胞的组分的组合物的及其用途。

引言

脊髓损伤(SCI)通常是跌倒或道路交通事故引起的结果，对患者及其家属的身体、社会和经济造成了长期的破坏性影响(Furlan等人,2011；Sekhon和Fehlings,2001)。损伤时脊髓的机械压缩和拉伸导致轴突损伤以及由于坏死和凋亡引起的神经元和神经胶质的损失(Baptiste和Fehlings,2006；Rowland等人,2008；Tator等人,1993)。这些关键细胞的损失阻止了神经信号从大脑到身体其他部位的传输。没有这些信号，个体进行日常活动(如行走、抓握和控制肠/膀胱功能)的能力受到损害。神经干/祖细胞移植以修复和再生脊髓是一种有前景的SCI治疗策略(Khazaei等人,2017；Nagoshi等人,2018)。已经研究了处于不同发育阶段的广泛的神经祖细胞作为潜在的治疗。这些研究揭示了多种潜在的恢复机制，包括细胞替代和营养支持。这些机制被认为部分由移植细胞的来源和发育阶段决定。

表达不同神经表型的干细胞的生成是一个复杂的多阶段过程，其起始于神经管发育早期，伴随神经外胚层内陷形成神经上皮干/祖细胞(NPC)。吻侧神经管中具有前侧特性(identity)的NPC最终形成前脑NPC(fbNPC)。相反，在时间和空间上暴露于不同梯度的形态发生素(morphogen)的NPC逐渐成熟和尾侧化(caudalize)，这导致中脑和后脑的形成。在进一步时空成熟后，这些细胞进一步尾侧化，然后腹侧化(ventralize)形成脊髓NPCs(spNPC)(Gifford等人,2013)。fbNPC和spNPC在时间和空间上位于这个连续统一体(continuum)的不同光谱上(图1A)，且它们独特的分化特征可能导致移植后观察到的恢复差异。此外，移植细胞的命运受到脊髓损伤部位微环境的影响，其中几种细胞命运决定因子(如Shh、BMP、TGFβ和Notch)上调(Chamankhah等人,2013；Chen等人,2005；De Biase等人,2005)。

许多中枢神经系统(CNS)疾病涉及关键神经胶质细胞群的损失。因此，基于细胞的再生方法已经成为改善患者长期结果的有前景的策略。虽然早期研究采用了原代供体细胞，但有限的供应和CNS组织的相对不易接近性使这种方法不适用于大规模治疗。因此，该领域已经转向临床相关的多能干细胞(PSC)，因为这些细胞可以分化为任何人体细胞类型。

胚胎干细胞(ESC)是能够在胚胎中发育成三个初级生殖细胞层的PSC。ESC的研究形成了围绕干细胞培养和细胞分化途径的大量知识的基础。不幸的是，有限的可用性和潜在的伦理问题仍然是一个挑战。诱导性多能干细胞(iPSC)的及其相关培养方案的发现，使再生治疗研究重新兴起。iPSC是衍生自任何患者的任何体细胞的重编程细胞，并且能够形成所有三个生殖细胞层以及早期器官。它们的产后衍生(postnatal derivation)消除了伦理问题，且生产iPSC作为自体疗法的可能性显著降低了免疫排斥的风险。

神经祖细胞

虽然许多细胞类型，包括间充质干细胞、嗅鞘细胞和施万细胞已经被研究用于中枢神经系统(CNS)再生¹，但神经祖细胞(NPC)，也称为神经干细胞，是最有前景的，因为它们是能够分化为神经元、少突胶质细胞(oligodendrocyte)或星形胶质细胞(astrocyte)的三能细胞；大脑和脊髓的原代细胞类型。迄今为止，NPC已经被研究用于治疗许多CNS病症，包括脊髓损伤(SCI)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)和中风^2-8。

NPC表现出不同的区域特性

脑和脊髓NPC的区域特性在神经发育早期就已确立(图1、2)。在胚胎发生过程中，神经管是由早期外胚层细胞折叠形成的。这些神经管中的神经外胚层细胞表达神经特异性标记物Sox2和Pax6，成为最早的神经干细胞。这些细胞又称神经上皮细胞。早期的神经管是直的、细长的结构。然后，在转录因子如Otx2、Lim1和FoxA2的帮助下，神经管的最前侧膨胀成三个主要区域，形成前脑、中脑和后脑。管的后部发育成脊髓⁹。

最前面/吻部命运(fate)是第一个建立的区域特性⁹。这些细胞表达转录因子如Otx2、FoxG1、Dlx2、Tbr1和Tbr2^10,11。Foxg1在产后和成人海马齿状回(DG)中持续表达¹²。在获得吻侧神经命运后，尾侧特性将由模式因子(如Wnt、FGFs、DKK1和FRZB)的空间梯度提供的位置线索确定。脊髓中的这些细胞表达转录因子，包括HoxA2、HoxA3和HoxB3¹³(图2)。

如在体内一样，源自PSC的神经祖细胞在体外首先默认获得吻侧特性¹⁴，并且这种原始特性可以通过各种信号(如视黄酸(RA)、WNT或FGF)转化为更接近尾侧命运，从而模拟体内情况。

通过靶向区域NPC特性增强移植物-宿主整合

不幸的是，NPC研究中仍然存在的一个重大挑战是优化移植物-宿主整合以最大限度地恢复功能。区域特性已成为使用NPC作为治疗的关键考虑因素。几项研究表明，将细胞特性与目标组织匹配显著改善了移植物-宿主整合和细胞存活^15,16。对于主要在脊髓中的疾病，例如SCI和ALS，这表明需要建立脊髓特异性NPC系。从PSC获得纯NPC群的经典方案生成脑特性细胞。事实上，利用这些脑特性NPC的研究发现它们很少分化为重要的群体，例如脊髓V2a中间神经元和脊髓运动神经元。此外，它们的整合也会因外来皮质群的引入而受损，所述外来皮质群包括兴奋性锥体神经元、皮质丘脑谷氨酸能神经元和胆碱能神经元。移植成人脊髓NPC(spNPC)而非前脑NPC(fbNPC)后，也观察到皮质脊髓束(CST)的再生¹⁷。

人脊髓NPC方案的需求

支持区域特性匹配的越来越多的证据突出了当前再生脊髓研究中的一个显著差距。即，大多数现有的由人PSC(hPSC)产生细胞的生成NPC的方案表达前脑和/或中脑特性，包括转录因子如Otx2、FogG1、Six3和Dlx2^18-21。开发一种生成具有脊髓特性的NPC的方法是可取的，并且可以改善脊髓生态位中的细胞整合和存活。

发明内容

由人外周血或任何体细胞生成人诱导性多能干细胞(hiPSC)提供了方便且侵入性最小的获得患者特异性iPSC的方法。本文描述了用于由表达Sox2、Pax6、巢蛋白和至少一种脑标记物(例如Otx2、Foxg1或Gbx2)的起始神经祖细胞或人多能干细胞(hPSC)生成脊髓特性神经祖细胞(spNPC)的可重复方案。例如，本发明人已经建立了培养体系，并使用无血清培养基和RAR激动剂(如视黄酸(RA))，以将iPSC分化为具有脊髓特性的神经祖细胞(NPC)。

使用本文所述方法制备的spNPC可通过免疫细胞化学染色和/或RT-qPCR分析表征。

spNPC可终末分化为脊髓特异性神经元细胞类型，如腹侧运动神经元和脊髓中间神经元、闰绍(Renshaw)细胞、副嵴(paragriseal)、间质和脊髓本体中间神经元。这些神经元细胞类型不能由脑特性(例如，未模式化)NPC生产。另一方面，脑NPC可终末分化为不能由脊髓特性NPC生成的脑神经元细胞类型，如皮质、皮质下或深核神经元、兴奋性锥体神经元、钙结合蛋白或CART表达神经元、皮质丘脑谷氨酸能神经元和皮质胆碱能神经元。

表达Sox2、Pax6、巢蛋白和至少一种脑标记物(例如Otx2、Foxg1或Gbx2)的起始神经祖细胞(NPC)，或PSC(如hPSC、hiPSC和ESC)在它们已经分化为NPC之后可以使用。实施例1和2中使用的hPSC在NPC分化之前表达多能性相关基因Oct4、Sox2和Nanog。分化后，spNPC表达一般的NPC标记物(巢蛋白、Sox2和还原的Pax6)以及区域特性标记物(例如Hox基因)。本文证明了生成的spNPC可以在神经球悬浮体系或单层培养物中扩增。与其他具有其他区域特性的NPC一样，spNPC能够分化为表达神经元(例如Fox3和/或β-III-微管蛋白)、星形胶质细胞(例如GFAP和/或S100b)和少突胶质细胞(例如O1和/或O4和/或Olig2和/或Olig1)的细胞标记物的细胞。起始NPC(如未模式化的NPC)比脊髓特性NPC具有更高水平的脑标记物和更低水平的脊髓标记物(例如Hox基因)。例如，脊髓NPC不表达可检测水平的脑标记物(通过免疫染色)。

如本文进一步显示的，全细胞膜片钳记录揭示了由fbNPC和spNPC分化的神经元表现出了神经元的电生理学特性，包括动作电位。

本发明的第一方面包括产生脊髓特性神经祖细胞(spNPC)的方法，所述方法包括：

a.任选地在补充有FGF2激动剂、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的合适培养基中孵育解离的未模式化的神经祖细胞(NPC)，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的至少一种脑标记物Gbx2、Otx2和FoxG1的后侧化(posteriorized)NPC；

b.在补充有RAR激动剂(任选地为视黄酸(RA)或RA合成类似物(任选地为EC23))和Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a或BML-284盐酸盐)的培养基(例如NEM)中传代后侧化NPC并孵育后侧化NPC，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的一种或多

种Gbx2、Otx2或FoxG1水平的尾侧化NPC；

c.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地

为EC23))的合适培养基中传代尾侧化NPC；以及

d.在补充有FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)、EGF受体激动剂(任选地为EGF或NSC228155)和740Y-P或740Y-P合成激动剂的合适培养基中传代步骤c)的尾侧化NPC，直到NPC的特性稳定为spNPC；

其中，在每次或至少一次传代后的第1天向培养基中任选地加入ROCK抑制剂。该方法可以从未模式化的NPC或后侧化NPC开始。

当开始使用未模式化的NPC时，可以对未模式化的NPC进行引发(primed)。

本发明的第二方面包括引发未模式化的NPC以停留在外胚层细胞命运中的方法，所述方法包括：

a.获得未模式化的NPC，所述未模式化的NPC表达包括Pax6和Sox1的神经外胚层标记物；

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

i.将EGF-L7激动剂(优选地为EGF-L7)加入到包含步骤a的未模式化的NPC的培养基中；以及

ii.任选地向培养基中加入Notch信号传导激活剂(任选地为DLL4)，以维持外胚层命运中的未模式化的NPC。

本发明的另一方面包括由未模式化的NPC产生spNPC的方法，该方法包括：

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

ii.任选地向培养基中加入Notch信号传导激活剂(任选地为DLL4)，以维持外胚层命运中的未模式化的NPC；以及

c.模式化引发的未模式化的NPC以产生spNPCS，所述方法包括：

i.在补充有FGF2激动剂、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的合适培养基中解离引发的未模式化的NPC并孵育引发的未模式化的NPC，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的至少一种包括Gbx2、Otx2和FoxG1的脑标记物的后侧化NPC；

ii.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))和Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a或BML-284盐酸盐)的合适培养基中传代后侧化NPC并孵育所述细胞，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的Gbx2、Otx2和FoxG1水平的尾侧化NPC；

iii.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))的合适培养基中传代尾侧化NPC并孵育尾侧化NPC；以及

iv.在补充有FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)、EGF受体激动剂(任选地为EGF或NSC228155)和740Y-P或740Y-P合成激动剂的合适培养基中，将步骤iii)的尾侧化NPC再传代2至3代，直到NPC的特性稳定为spNPC；

其中，在每次或至少一次传代后的第1天向培养基中任选地加入ROCK抑制剂。

本发明的另一方面包括由诱导性多能干细胞(iPSC)产生spNPC的方法，所述方法包括：

a.由iPSC产生未模式化的NPC，所述方法包括：

i.在iPSC培养基中传代iPSC并孵育所述细胞约2天，例如36小时至4天，任选地其中所述iPSC培养基包含TGFβ抑制剂、FGF2激动剂、Wnt抑制剂和BMP抑制剂；

ii.在不含FGF2激动剂(任选地不含FGF2)的iPSC培养基中培养iPSC约4天，其中在约第2天，例如约36小时后直至约4天，将BMP抑制剂或双重SMAD抑制剂(用于抑制TGFβ和BMP途径)加入培养基；

iii.在不含FGF2激动剂(任选地不含FGF2)的NIM中培养iPSC约2天以产生拟胚体(EB)；以及

iv.在含FGF2激动剂(任选地含FGF2或SUN11602)的NIM中培养步骤iii的EB约7至约11天以产生神经玫瑰花状结构(neural rosette)，其中在约第2天从培养基中除去BMP抑制剂或双重SMAD抑制剂，以产生未模式化的NPC；

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

i.将EGF-L7激动剂(优选地为EGF-L7)加入到包含未模式化的NPC的培养基中；

c.模式化引发的未模式化的NPC以产生spNPCS，所述方法包括：

i.在补充有FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的合适培养基中解离引发的未模式化的NPC并孵育引发的未模式化的NPC，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的至少一种包括Gbx2、Otx2和FoxG1的脑标记物的后侧化NPC；

ii.在补充有RAR激动剂(任选地为视黄酸(RA)或RA合成类似物(任选地为EC23))和Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a或BML-284盐酸盐)的合适培养基中传代后侧化NPC并孵育后侧化NPC，以生产与后侧化NPC相比表达降低水平的Gbx2、Otx2和FoxG1水平的尾侧化NPC；

iii.在补充有RAR激动剂(任选地为视黄酸(RA)或RA合成类似物(任选地为EC23))的合适培养基中传代尾侧化NPC并孵育尾侧化NPC；以及

iv.在补充有B27、N2、FGF2或SUN11602、EGF或NSC228155和740Y-P或740Y-P合成激动剂的培养基中传代步骤iii)的尾侧化NPC，直到NPC的特性稳定为spNPC；

本发明的其他特征和优点将从以下具体实施方式中变得显而易见。然而，应当理解，具体实施方式和具体实施例在指明本公开内容的优选实施方案时仅以说明的方式给出，因为根据具体实施方式，在本公开内容的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

现在将结合附图描述本公开内容的实施方案，其中：

图1描绘了示意图，其示出了由具有不同区域特性的神经干祖细胞生成的神经元限于分化为特定神经元亚型。前脑衍生的祖细胞不能分化为脊髓特异性神经元亚型。

图2描绘了示意图，其示出了(左)在CNS的前脑、中脑、后脑和脊髓区域发现的关键转录因子。(右)胚胎发生过程中驱动不同CNS区域发育的选择性模式形态发生素。

图3描绘了示意图，其示出了从由人PSC生成脊髓NPC的概念途径。(下)体外模拟发育线索的关键模式形态发生素的时间暴露。

图4是描绘神经玫瑰花状结构(箭头)和神经管状结构(箭号)的形态的图像。

图5A是描绘EGF-L7引发的NPC的基因表达谱的图(log 2倍数变化)。图5B是一系列的两张图像，示出了引发的NPC(下)的形态与未引发/未模式化的NPC(上)相似。

图6A是示出后侧化人NPC相对于未模式化的NPC的基于qPCR的基因表达谱的图(log2倍数变化)。图6B是示出明视野显微镜的图，其示出了后侧化NPC的形态。

图7A是示出尾侧化人NPC与后侧化NPC相比的基于qPCR的基因表达谱的图(log2倍数变化)。图7B是示出明视野显微镜的图，其示出了尾侧化NPC的形态。

图8A是示出人脊髓NPC与尾侧化NPC和脊髓NPC相比的基于qPCR的基因表达谱的图(log2倍数变化)。图8B是在明视野显微镜下示出脊髓NPC形态的图，与常规前脑NPC相比，其显示了伸长的过程且不均匀的外观。

图9A是一系列图像，其示出了前脑神经球(左)和脊髓神经球(右)。图9B是示出神经球测定结果的图，其显示fb-NPC和spNPC在3次传代后具有相同的自我更新潜力。

图10A是一系列图像，其示出了表达神经元标记物(βIII-微管蛋白)的前脑(上图)和脊髓人PSC衍生的NPC(下图)之间的分化特征比较。图10B是一系列图像，其示出了表达少突胶质细胞标记物(O1)的前脑(上图)和脊髓人PSC衍生的NPC(下图)之间的分化特征比较。图10C是一系列图像，其示出了表达星形胶质细胞标记物(GFAP)的前脑(上图)和脊髓人PSC衍生的NPC(下图)之间的分化特征比较。图10D是描绘了在表达神经元标记物(βIII-微管蛋白)、少突胶质细胞标记物(O1)或星形胶质细胞标记物(GFAP)的细胞中的的前脑(上图)和脊髓人PSC衍生的NPC的分化百分比的图。

图11A-C描绘了fb-NPC衍生的神经元中自发突触后活动的电压钳记录。图11D-F描绘了spNPC衍生的神经元中自发突触后活动的电压钳记录。突触后事件的频率和幅度在fb-NPC和spNPC中的记录之间没有显著差异，这表明观察到的大部分活动取决于突触前动作电位引起的突触传递。

图12描绘了：fbNPC和spNPC的生成和体外表征。图12A描绘了在神经系统发育期间fbNPC和spNPC沿着神经管的空间和时间位置的示意图。图12B描绘了fbNPC被后侧化、尾侧化和腹侧化以生成spNPC的示意图。图12C描绘了示出培养物(GFP+)中fbNPC和spNPC的形态的图像。图12D-E是描绘了fbNPC和spNPC相对于hiPSC(D)以及spNPC相对于fbNPC(E)的表达谱的定量实时PCR分析的图。相对基因表达通过2-ΔΔ法测定且倍数变化值是相对于管家基因GAPDH的平均基因表达。(平均值±SEM；*p＜0.05，学生t检验，n＝3)。图12F描绘了用于fbNPC和spNPC之间差异基因表达(DEG)的RNA-seq分析的全局视图。热图描绘了标准化TMP值的log10比例(每百万转录本)。图12G描绘了神经管模式说明中涉及的显著富集基因的无监督分级聚类的热图。

图13A-B是分别描述fbNPC和spNPC的神经球形成试验的图；细胞以10个细胞/μl的克隆密度接种。在

条件下，fbNPC形成的神经球数量与spNPC相比没有差异，但SCI-h导致形成更多和更大的fbNPC神经球。(平均值±SEM；*p＜0.05，学生t检验，n＝5)。图13C是描绘了当暴露于SCI-h时，由fbNPC或spNPC生成的神经球的图像。比例尺：50μm。图13D描绘了说明fbNPC和spNPC在不同生态位中的体外增殖速率的比较的图(/>

相对于SCI-h)。在每个时间点，进行BrdU增殖试验以测定细胞数量。fbNPC和spNPC在天然的生态位中的总增殖相当。两组间总增殖率无显著差异，但在SCI生态位中，fbNPC的增殖远高于spNPC。(平均值±SEM；**p＜0.01，fbNPC与spNPC相比，双因素ANOVA，n＝3)。/>

图14：NPC系的体外分化测定。培养NPC并将其暴露于未损伤

或SCI损伤动物(SCI-h)的脊髓匀浆。图14A是描绘细胞被固定并针对神经祖细胞标记物(巢蛋白)、少突胶质细胞标记物(O1)、星形胶质细胞标记物(GFAP)或神经元标记物(βIII-微管蛋白)染色的图像。比例尺：20μm。图14B是描绘了对GFAP、O1、βIII-微管蛋白或巢蛋白呈阳性的细胞百分比被定量的图。(平均值±SD；*p＜0.05，**p＜0.01，颜色对应细胞型，单因素ANOVA，n＝3)。图14C描绘了示出在脊髓损伤(SCI-h)后的组织匀浆中在不同时间点，DLL1(Notch激活配体)表达增加的图。计算相对于天然的脊髓匀浆/>

和装载对照α微管蛋白的倍数变化(log2)。(平均值±SEM；**p＜0.01，单因素ANOVA，n＝3)。

图15：GFP+fbNPC或spNPC移植后脊髓损伤中心的代表性图像表征。图15A描绘的图像示出了fbNPC主要向损伤部位迁移以包围并部分填充空腔，而spNPC沿着白质向吻侧和尾侧迁移。图15B描绘的图像示出了fbNPC迁移到空腔中的更高放大率图像。fbNPC填充了大部分空腔空间(左)。spNPC沿着白质束向损伤中心的吻侧和尾侧迁移(右)。图15C是示出移植细胞分布的定量分析图像。(平均值±SEM；*p＜0.05，双因素ANOVA，n＝3)。图15D是神经管模式说明中涉及的显著富集基因的无监督分级聚类的热图。

图16：hiPSC衍生的fbNPC和spNPC在慢性损伤的脊髓内显示出独特的分化特征。图16A是一系列图像，其示出了移植细胞分化以表达spNPC和fbNPC组中未分化NPC(巢蛋白)、成熟少突胶质细胞(APC)、未成熟少突胶质细胞(Olig2)、星形胶质细胞(GFAP)和神经元(Fox3)的标记物。比例尺：20μm。图16B是一系列图像，其示出了三谱系体内分化谱的定量分析。(平均值±SEM；*p＜0.05，学生t检验，n＝5)。

图17：移植的spNPC有助于SCI后的髓鞘再生。图17A是一系列图像，其示出了通过与紧靠内源性NF200阳性轴突(箭头)的GFP+spNPC和MBP的共定位，髓磷脂的生成是明显的。比例尺：20μm。图17B是一系列图像，其示出了spNPC中Kv1.2(箭头)和Caspr(箭号)染色的矢状切面的代表性图像。Kv1.2+近结侧区(juxtaparanodal)电压门控钾通道和Caspr+结侧区蛋白识别郎飞结区(nodes of Ranvier)。图17C是一系列图像，其示出了GFP+spNPC和fbNPC的代表性免疫电子显微镜图像。通过GFP染色时观察到的黑点(黑色箭头)检测移植细胞。在spNPC的髓鞘外细胞质中经常观察到GFP+黑点。然而，在fbNPC组中，黑点沉积在轴浆内，轴浆被几层内源性髓磷脂包盖。这表明fbNPC组中的移植物衍生的神经元可被髓鞘化。比例尺：20nm。

图18A-B描绘了抗体阵列的结果，其示出了fbNPC和spNPC之间细胞因子的不同表达水平。使用抗体阵列检测从细胞收集的条件培养基中的细胞因子表达谱，其允许在一个实验中检测41种细胞因子和生长因子。不含细胞培养物的新鲜培养基用作背景对照。图18C描述了使用LFB和H&E染色的组织形态计量学分析的结果。脊髓在损伤中心处以及距载体、spNPC和fbNPC吻侧和尾侧0.96mm处区域的代表性图像。图18D是示出了不同移植组中保存的白质面积的空间量化的图(平均值±SEM；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝5)。图18E是示出了不同移植组中病变组织面积的空间量化的图(平均值±SEM；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，n＝5)。图18F是对空腔进行超高分辨率超声(VHRUS)分析的一系列代表性图像，图18G描绘了示出通过VHRUS评估的空腔体积定量分析的图表(平均值±SEM，n＝5，*p＜0.01，**p＜0.05，单因素ANOVA)。图18H是示出使用能量多普勒VHRUS测量的功能性血管分布的一系列图像，图18I是示出使用能量多普勒VHRUS测量的功能性血管分布的图。在移植组之间未观察到显著变化，尽管在fbNPC移植组中观察到改善的趋势。(平均值±SEM，*p＜0.05，**p＜0.01，单因素ANOVA，n＝5)。

图19：fbNPC和spNPC可与内源性细胞形成突触连接并参与电传导。图19A是示出了移植部位脊髓切面透射电子显微照片的一系列图像，其显示了抗GFP免疫金(黑点，白色箭头)标记的细胞和内源性轴突末梢之间突触的形成。图19B是示出了突触蛋白I(Syn1)免疫染色的一系列图像。比例尺：10nm。图19C是示出为了测试移植物衍生的神经元是否能够有助于电传递的示意图，我们分析了穿过损伤部位(C4到T1)的电诱发复合动作电位(CAP)传递。图19D是显示CAP随时间变化的图像。迹线表示每组六只动物的平均值。图19E是示出移植后10周CAP振幅的定量的图(平均值±SEM，n＝6，*P＜0.05，与载体相比的单因素ANOVA)。图19F是显示了假手术组、载体组、fbNPC组和spNPC组的CAP潜伏期的图。图19G是显示了假手术组、载体组、fbNPC组和spNPC组的CAP速率的图。传导速率计算为记录距离(10mm)除以潜伏期(t)(平均值±SEM，n＝6，单因素ANOVA，P＜0.05，与载体相比的单因素ANOVA)。

图20：细胞移植后大鼠的功能分析。图20A是示出了使用握力计评估前肢运动功能的图。颈髓损伤导致前肢握力严重不足，移植后8周内逐渐改善。与载体相比，fbNPC和spNPC移植后的握力显著改善，随后达到稳定水平(平均值±SEM，*p＜0.05，双因素ANOVA，每组n＝16)。图20B是示出了随时间被吃掉的颗粒的百分比的图，其表明了使用蒙托亚阶梯试验(Montoya staircase test)对熟练的前爪使用和运动机能的评估(平均值±SEM，非显著性，双因素ANOVA，每组n＝10)。图20C是示出移植后8周时不同前肢步态参数的定量的一系列图(平均值±SEM，*p＜0.05，**p＜0.01，单因素ANOVA，每组n＝12)。

图21A描绘的图示出了细胞存活的定量(平均值±SEM；非显著性，学生t检验，n＝5)。图21B是示出GFP+移植细胞与Ki67共定位的代表性图像的一系列图像。比例尺：20μm。移植的spNPC和fbNPC很少与增殖标记物Ki67共定位。图21C是示出了表达Ki67的移植细胞的百分比的图。定量分析示出少于4％的移植细胞表达Ki67。(平均值±SEM，非显著性，学生t检验，n＝5)。图21D是在NOD/SCID小鼠中移植后140天的一系列代表性图像。spNPC和fbNPC的GFP阳性细胞分散在组织中(白色箭头)，但在H&E染色中没有肿瘤形成。

图22A是示出了斜面随时间变化的图，其表明通过每只动物在从0°至90°范围内的平台上承受增加的倾斜度的能力来测试整体运动功能。动物耐受较大倾斜角度的能力与更好的功能恢复相关。细胞移植动物的表现优于载体处理动物，但不显著。(平均值±SEM，非显著性，双因素ANOVA，每组n＝16)。图22B是示出了甩尾试验中的热触诱发痛的评估的图。在时间进程中没有显著差异。图22C是示出了在前爪的冯弗雷试验中机械触诱发痛的评估的图，图22D是示出了在后爪的冯弗雷试验中机械触诱发痛的评估的图。在甩尾试验和冯弗雷试验中，各组之间没有显著差异。(平均值±SEM，单因素ANOVA，每组n＝8)。

图23是一系列图像，其示出了当细胞决定神经元命运时，前脑和腹侧脊髓NPC分化为相比后脑和背侧脊髓NPC更少地表达Ptf1a的细胞。表达Ptf1a的细胞将分化为抑制性GABA能中间神经元。

图24是示出了在移植后脑NPC(后-NPC)、背侧脊髓NPC(背-NPC)、前脑NPC(cNPC)和腹侧脊髓NPC(spNPC)的组中随时间被吃掉的颗粒的百分比的图。移植后脑和背侧脊髓NPC的移植导致功能恢复的改善低于前脑和腹侧脊髓NPC。

图25是一系列图像和图，其示出了在不添加任何匀浆的基线分化培养基中，细胞向少突胶质细胞(O1阳性细胞)的分化没有显著差异。

图26A是示出了fbNPC和spNPC之间具有最高变异的前2000个基因的差异表达的热图。图26B描绘了fbNPC和spNPC之间差异基因表达的基因本体富集的结果。图26C是图，其中水平轴示出了fbNPC中基因的log2 TPM。

图27是示出了fbNPC、spNPC和载体组中随时间被吃掉的颗粒的百分比的图。移植细胞立即开始表达和分泌营养因子，但分化和整合到神经网络或髓鞘形成需要时间。

具体实施方式

除非另有定义，否则结合本公开内容使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。例如，术语“细胞”包括单个细胞以及多个细胞或细胞群。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关使用的术语和技术是本领域周知和常用的(参见例如Green和Sambrook,2012)。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容明确地另外指明，否则单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此例如，含有“化合物(acompound)”的组合物包括两种或多种化合物的混合物。还应注意，除非内容明确地另外指明，否则术语“或”通常以其包括“和/或”的意义使用。

如本申请和权利要求书中所使用的，词语“组成”及其派生词是封闭式术语，其指定存在所述特征、元素、成分、组、整体和/或步骤，并且排除存在其他未指明的特征、元素、成分、组、整体和/或步骤。

本文所用的术语“约”、“基本上”和“大约”是指所修饰术语的合理偏差量，使得最终结果不会显著改变。这些程度术语应被解释为包括所修饰术语的至少±5％或至少±10％的偏差，前提是该偏差不会否定其所修饰词语的含义。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”或其变体旨在包括任何和所有溶剂、介质、等渗剂和吸收延迟剂等，它们与药物施用兼容并用于细胞。这种载体或稀释剂的任选实例包括但不限于缓冲盐水、培养基、Hanks平衡盐溶液、林格氏溶液和5％人血清白蛋白和牛血清白蛋白(BSA)。

术语“神经祖细胞”或其变体也可互换地称为神经干细胞(NSC)、神经前体细胞(NPC)、神经干祖细胞(NSPC)、神经上皮干/祖细胞(NPC)或神经外胚层细胞(NEC)，如本文所用，包括表达Sox2、Pax6和巢蛋白神经细胞，并且是三能的(tripotent)且可分化为神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

术语“具有脊髓特征的神经祖细胞”或“spNPC”指的是这样的神经祖细胞，其可以终末分化为脊髓特异性神经元细胞类型，如腹侧运动神经元和脊髓中间神经元、闰绍细胞、副嵴、间质和脊髓本体中间神经元细胞，并且其表达较高水平的脊髓基因，如Hox基因，如Hox A、B、C或D，1-10(例如，A4、A5、B4、C4)，其表达量高于脑NPC，并且与脑NPC相比表达较低量的脑标记物，例如Gbx2、Otx2、FoxG1、Emx2和/或Irx2以及Pax6。本文提供了体外产生spNPC的方法。

脑NPC可分化为不能由脊髓神经元产生的脑神经元细胞类型，如皮质、皮质下或深核神经元、兴奋性锥体神经元、钙结合蛋白或CART表达神经元、皮质丘脑谷氨酸能神经元和皮质胆碱能神经元。

本文所用的术语“未模式化的NPC”或其变体是指具有吻部特性的NPC，并且没有尾侧化和/或腹侧化。未模式化的NPC是原始的或确定的NPC，其尚未用任何模式化因子(如RA或Shh(及其激动剂))处理。未模式化的NPC表达Pax6、巢蛋白和Sox2以及至少一种脑标记物OTX2、FOXG1和GBX2。Gbx2、Emx2和Irx2的表达水平在未模式化的NPC中比中脑特性的NPC低，并且Hox基因(如A4、A5、B4、C4)的表达水平在未模式化的NPC中与脊髓特性的NPC相比更低。未模式化的NPC可以被称为具有前脑(forebrain)特性的NPC(fbNPC)、具有前脑(frontbrain)特性的NPC或前脑(anterior brain)NPC。所有这些术语均指未模式化的NPC。它们在本公开内容中可以互换使用。

本文所用的术语“后侧化NPC”或其变体是指与未模式化的NPC具有相同分化谱的三能神经祖细胞。后侧化NPC形成神经球的能力和增殖率略高于未模式化的NPC。用FGF8激动剂(任选地为FGF8)在如本文所述的特定浓度和时间段下处理未模式化的NPC将导致细胞的后侧化。与未模式化的细胞相比，后侧化NPC表达更多的Hox基因(如HoxA4和/或HoxA5)，并且具有至少一种脑标记物(如Dlx2、Six3、LmxA1、Gbx2、Otx2和/或FoxG1)的表达降低。

本文所用的术语“EGF-L7激动剂”或其变体是指EGF-L7(优选地为人EGF-L7)(登记号Ensembl:ENSG00000172889,MIM:608582)以及其活性片段、融合体和活性剪接变体以及同时或组合抑制Notch信号传导、激活EGFR(EGF受体)、抑制ICAM-1表达和增强抑制NF-κB激活的天然或合成的任何化合物或化合物的组合。也可以使用激活相应途径组的分子的组合来代替EGF-L7。例如可以使用组合：DLK1或DAPT(以抑制Notch)、NSC228155或β细胞素(以激活EGFR)、A-205804(以抑制ICAM-1)、以及硼替佐米(Bortezomib)和甲基巴多索隆(以抑制NF-κB)。本文所用的术语“EGF-L7”是指EGF-L7(优选地为人EGF-L7)(登记号Ensembl:ENSG00000172889,MIM:608582)以及其同时抑制Notch信号传导、激活EGFR(EGF受体)、抑制ICAM-1表达和增强抑制NF-κB激活的活性片段、融合体和活性剪接变体。

本文所用的术语“EGF受体激动剂”是指天然或合成的任何化合物或化合物的组合，其结合和/或诱导EGF受体(也称为EGFR；ErbB-1；HER1)酪氨酸激酶活性，包括但不限于EGF和EGF类似物以及肝素结合EGF(HB-EGF)、转化生长因子(TGF)双调蛋白(AR)和β细胞素。还包括EGFR激活剂，如NSC 228155。

本文所用的术语“EGF”或其变体是指表皮生长因子。EGF，例如人EGF，包括活性片段、融合体和剪接变体(例如激活EGF受体的片段、融合体和剪接变体)，其可以从各种市售来源获得，如Cell Sciences.RTM.,Canton,Mass.,USA,Invitrogen Corporationproducts,Grand Island N.Y.,USA,ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.Rehovot,Israel和Sigma,St Louis,Mo.,USA。

本文所用的术语“FGF2激动剂”或其变体是指天然或合成的任何化合物或化合物的组合，其结合由FGF2结合的FGF受体，例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，并包括FGF2、其活性片段、融合体和剪接变体或具有类似功能的分子(如SUN11602)或其组合。

本文所用的术语“成纤维细胞生长因子2”或“FGF2”或其变体(也称为bFGF、basicFGF、FGFb或FGF-β以及肝素结合生长因子2)是指成纤维细胞生长因子家族的成员。FGF2，例如人FGF2，包括活性片段、融合体和剪接变体(例如激活FGF2结合的FGF受体的片段、融合体和剪接变体)，其可以从各种市售来源获得，如Cell Sciences.RTM.,Canton,Mass.,USA,Invitrogen Corporation products,Grand Island N.Y.,USA,ProSpec-TanyTechnoGene Ltd.Rehovot,Israel和Sigma,St Louis,Mo.,USA。

本文所用的术语“FGF8激动剂”或其变体是指天然或合成的任何化合物或化合物的组合，其结合由FGF8结合的FGF受体，例如FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4，并包括FGF8、其活性片段、融合体和剪接变体或具有类似功能的分子(如FGF9，或FGF17或其活性片段、融合体和剪接变体(例如激活FGF8结合的FGF受体的片段、融合体和剪接变体))及其组合。

本文所用的术语“FGF8”或其变体是指FGF8A、B或E同种型，例如称为FGF8a、FGF8b或FGF8e，并包括其所有天然存在或合成的变体，以及哺乳动物FGF8，特别是人FGF8，其活性片段、融合体和剪接变体及其组合。FGF8又称为雄激素诱导生长因子(AIGF)。

术语“740Y-P”、“740Y-P的类似物”或其变体是指PI3KRQIKIWFQNRRMKWKKSDGGYMDMS(其中Tyr-21＝pTyr)的细胞可渗透性磷酸肽激活剂及其类似物，并且包括激活PI3K激酶的任何天然或合成的化合物或化合物的组合，其包括例如芥酸或其活性片段、融合体和剪接变体及其组合。740Y-P也可以用高剂量的FGF2或FGF2激动剂替代，例如FGF2的浓度大于20ng/ml直至400ng/ml，例如至少或约200ng/mL。740Y-P是市售可得的并且可以例如从Tocris Bioscience和Fisher Scientific购买。

本文所用的术语“合适的培养基”是指支持待培养的特定细胞类型的培养基。例如，用于神经祖细胞或由其衍生的细胞的合适培养基，例如PSC培养基、NEM或NIM，例如如本文所述，包含一种或多种适合于细胞阶段的添加剂，例如B27或类似添加剂和任选的N2或类似的添加剂。典型地，培养基将包括非必需氨基酸，例如甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、葡萄糖或等同物、丙酮酸钠、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物歧化酶、全铁转铁蛋白、三碘甲状腺原氨酸(T3)、L-肉毒碱、乙醇胺、D+-半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、孕酮、视黄醇乙酸酯、DL-α-生育酚(维生素E)、DL-α-生育酚乙酸酯、油酸、哌可酸、生物素，任选地加入FGF2激动剂(如FGF2或SUN11602)、EGFR激动剂(如EGF或β细胞素)并任选地加入肝素。

本文所用的术语“NEM”或“神经扩增培养基”或其变体是指适合于培养神经祖细胞的基础培养基，例如DMEM/F12、Neuralbasal培养基等，其包含一种或多种丙酮酸钠、谷氨酰胺产物(如谷氨酰胺或GlutaMAXTM)一种或多种抗生素(如青霉素和/或链霉素)、补充剂(如不含维生素A或等效物(例如不含RA或RA类似物)的B27补充剂)和N2。可以根据细胞分化的阶段向NEM中加入激动剂，例如一种或多种FGFR激动剂(如FGF 2)、EGFR激动剂(如EGF)和/或肝素。实施例1中提供了合适的NEM的实例。其他合适的培养基、补充剂、抗生素等是本领域已知的并且可以使用。

本文所用的术语“Notch激动剂”或“Notch信号传导激活剂”或其变体包括天然或合成的任何化合物或化合物的组合，其包括结合任何Notch受体并诱导Notch受体胞内结构域的蛋白水解切割和释放的任何小分子或抗体。实例包括DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2，其包括其人类及其他哺乳动物形式。

本文所用的术语“Wnt激动剂”或“Wnt信号传导激活剂”或其变体包括天然或合成的任何化合物或化合物的组合，其包括结合并激活Wnt受体的任何小分子或抗体。实例包括AZD2858、Wnt激动剂1、CP21R7(CP21)、Wnt或BML-284盐酸盐。考虑了其生物分子亚组的人类和其他哺乳动物形式。

本文所用的术语“Wnt抑制剂”或其变体包括天然或合成的任何化合物或化合物的组合，其包括抑制Wnt信号传导途径的任何小分子或抗体。实例包括XAV939、DKK1、DKK-2、DKK-3、Dkk-4、POCN、C59、LGK-974、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-5、SFRP-3、SFRP-4、WIF-1、Soggy、IWP-2、IWR1、ICG-001、KY0211、Wnt-C59、LGK974、1WP-L6及其衍生物及其组合。

本文所用的术语“RAR激动剂”或其变体包括天然或合成的任何化合物或化合物的组合，其包括结合并激活RA受体的任何小分子或抗体，所述RA受体包括例如RA或RA类似物(包括例如EC23)。

本文所用的术语“B27”或其变体是指支持神经元并与神经元细胞培养物一起使用的无血清含维生素补充剂。可以使用允许滋养层独立生长的任何此类补充剂。B27补充剂包括例如过氧化氢酶、谷胱甘肽、胰岛素、超氧化物歧化酶、人全铁转铁蛋白、T3、L-肉毒碱、乙醇胺、D+-半乳糖、腐胺、亚硒酸钠、皮质酮、亚油酸、亚麻酸、孕酮、视黄醇乙酸酯、DL-α-生育酚(维生素E)、DL-α-生育酚乙酸酯、油酸、哌可酸和生物素。

本文所用的术语“玫瑰花状结构”或其变体是指柱状细胞的细胞模式。其表达Sox1。神经玫瑰花状结构是分化胚胎干细胞培养中神经祖细胞的发育标志；玫瑰花状结构是柱状细胞的放射状排列，柱状细胞表达许多在神经管的神经上皮细胞中表达的蛋白质。除了形态学相似之外，神经玫瑰花状结构内的神经祖细胞可以在体内分化为神经上皮细胞后代的主要类型：神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。

本文所用的术语“尾侧化NPC”或其变体是指具有尾侧脊髓祖细胞命运的NPC，其表达Sox2、Pax6和相对于未模式化的NPC增加的Nkx6.1表达，以及相对于未模式化的NPC减少的Six3、Dlx2、Otx2和FoxG1表达。例如，“尾侧化NPC”表达Sox2、巢蛋白和Pax6，其水平与未模式化的NPC相当，并且相对于未模式化的NPC，例如FoxG1、Otx2和Gbx2表达水平降低至少75％，Nkx6.1表达增加至少25％，HoxA4、HoxB4、HoxC4和HoxC5表达增加至少25-50％。例如，与腹侧化NPC相比，Nkx6.1的表达水平比该基因的表达水平降低至少25％。

本文所用的“神经诱导培养基”或“NIM”或其变体是指适合于培养神经前体细胞的基础培养基，例如DMEM/F12，其包含一种或多种丙酮酸钠、谷氨酰胺产物(如谷氨酰胺或GlutaMAXTM)、一种或多种抗生素(如青霉素和/或链霉素)、补充剂(如不含维生素A的B27补充剂)、非必需氨基酸(如甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸)、BMP抑制剂(如LDN 193189或头蛋白(Noggin))，TGFβ抑制剂(如SB431542)、FGFR激动剂(如FGF 2)，任选地肝素和EGFR激动剂，任选地EGF。合适的NIM的实例提供在表1的实施例1中。

本文所用的术语“多能干细胞”或其变体是指在不同条件下具有分化为一种以上分化细胞类型的能力的细胞，例如具有分化为三个生殖细胞层的特征性细胞类型的能力，并且包括胚胎干细胞和由体细胞重编程的诱导性多能干细胞。多能细胞的特征在于它们例如使用裸鼠畸胎瘤形成试验分化为一种以上细胞类型的能力。胚胎干(ES)细胞标记物的表达也证明了其多能性。包括人iPSC(hiPSC)的诱导性多能干细胞(iPSC)，可以来自任何体细胞(例如皮肤角质形成细胞或成纤维细胞)，并且可以衍生自受试者或细胞系。PSC例如可以是胎儿衍生的、胚胎衍生的或人胚胎干细胞衍生的。

本文所用的术语“干细胞”或其变体是指未分化的细胞，其能够增殖、自我更新并产生更多的祖细胞，所述祖细胞具有生成大量母细胞的能力，所述母细胞又能够产生分化的或可分化的子细胞。子细胞可以例如被诱导增殖并生产随后分化成一种或多种成熟细胞类型的子代，同时还保留一种或多种具有亲代发育潜力的细胞。

本文所指的术语“细胞培养基”或其变体(本文也称为“培养基(culture medium)”或“培养基(medium)”)是用于培养细胞的培养基，其含有维持细胞存活力和支持增殖以及任选地分化的营养物。细胞培养基可以适当含有以下任何物质的任何组合：盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代品以及其他组分，如肽生长因子、维生素等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。

本文所用的术语“传代(passaging)”、“传代的(passaged)”或“传代(passage)”或其变体是指将培养的细胞从其当前生长培养基转移到新的生长培养基。细胞可以例如根据实施例1中所述进行传代。然而，可以使用任何合适的传代方法。例如，hiPSC应该传代以避免过度生长并维持它们处于未分化状态。此外，可以优选使iPSC成团传代。

如本领域技术人员将理解的，可以使用酶和酶细胞分离溶液(例如酶细胞分离溶液Accutase^TM)将细胞从培养板移出。也可以使用其他酶，如Dispase、ReLeSR或TrypLE。此外，也可使用非酶方法，如EDTA溶液。

术语“N2”及其非市售制剂被称为“激素混合物”，是指包含转铁蛋白、胰岛素、腐胺、硒和孕酮的激素混合物。例如，N2可以包括10mg/ml转铁蛋白、2.5mg/ml胰岛素、1mg/ml腐胺、1ul/ml 15硒、1ul/ml孕酮。N2可以从Gibco(Invitrogen/Themor scientific)、Sigma等市售购得或可以制备。

如本领域技术人员将理解的，在特定部分中描述的定义和实施方案旨在适用于其所适用的本文描述的其他实施方案。

本文通过端点列举的数值范围包括包含在该范围内的所有数字和分数(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应当理解，假定其所有数字和分数均由术语“约”修饰。

本发明人已经确定了用于由未模式化的NPC和沿着至spNPC途径的中间细胞群产生脊髓特性神经祖细胞(spNPC)的改进方法。

该方法可以包括实施例1中步骤2和3的一个或多个特征。这些特征可以是时间、顺序、成分和/或因素的选择。

例如，实施例1证明了补充有FGF2、EGF和740Y-P或740Y-P的合成激动剂的合适培养基可用于促进和稳定来自尾侧化NPC的脊髓NPC的特性。实施例1还证明了确定740Y-P的有效范围。如实施例2所示，根据这种方法制备的细胞在移植时改善了功能恢复。

因此，本发明的第一方面包括产生脊髓特性神经祖细胞(spNPC)的方法，所述方法包括：

a.任选地在补充有FGF2激动剂和FGF8激动剂(任选地为FGF8)的合适培养基中孵育解离的未模式化的神经祖细胞(NPC)，任选地使用细胞分离溶液，任选地引发NPC，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(优选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的至少一种脑标记物Gbx2、Otx2和FoxG1的后侧化NPC；b.在补充有RAR激动剂(任选地为视黄酸(RA)或RA合成类似物(任选地为EC23))和任选地Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a或BML-284盐酸盐)的合适培养基中传代后侧化NPC并孵育后侧化NPC，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的Gbx2、Otx2和/或FoxG1水平的尾侧化NPC；

c.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地

为EC23))的合适培养基中传代尾侧化NPC；以及

如本文所述，该方法可以使用未模式化的祖细胞或后期细胞(如后侧化NPC)启动。

本发明人已经确定了Wnt信号传导激活剂能够提高RA的活性。例如，本发明人已经确定，当培养基在尾侧化步骤中(例如，当用RAR激动剂处理后侧化NPC时)补充有例如Wnt3a时，与后侧化细胞相比，Hox基因(例如HoxA4和/或HoxA5)表达水平的增加在尾侧化细胞中升高，并且与后侧化细胞相比，Gbx2、Otx2或FoxG1基因表达水平的降低在尾侧化细胞中也增强。

稳定化细胞具有固定的特性，并且不经额外处理不能例如通过自身回到其他发育特性。稳定化细胞将在增殖或维持培养基中保持其当前特性。例如，如果它们保持其如本文所述的特性和基因表达谱达至少5代、至少6代或至少10代，则认为它们是稳定的。

Rock抑制剂可在每次传代或传代子集(例如至少一步，任选地一步或多步)后培养的第一天后加入。如果在第1天添加，则可将其取出或留至随后几天。例如可以在传代后第2天通过更新培养基来除去。

Notch抑制是保持细胞在外胚层命运所必需的。视黄酸(RA)及其类似物可以将细胞从外胚层的命运中推出来。制备脊髓特性神经祖细胞(spNPC)需要notch抑制和RAR激活(例如由RA提供)。本发明人已经确定EGFL-7可以平衡这些所需的信号传导途径。它具有双重功能，它抑制Notch，同时对RA信号传导没有不利影响。

本发明的另一方面包括引发未模式化的NPC以停留在外胚层细胞命运中的方法，所述方法包括：

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

这些方法可以组合使用。

因此，本发明的另一方面包括由未模式化的NPC产生spNPC的方法，该方法包括：

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

c.模式化引发的未模式化的NPC以产生spNPCS，所述方法包括：

i.在补充有FGF2激动剂、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的合适培养基中任选地使用解离溶液解离引发的未模式化的NPC并孵育引发的未模式化的NPC，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的包括Gbx2、Otx2和FoxG1的脑标记物中的至少一种的后侧化NPC；

ii.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))和Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a或BML-284盐酸盐)的合适培养基中传代后侧化NPC，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的Gbx2、Otx2和/或FoxG1水平的尾侧化NPC；

iii.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))的合适培养基中传代尾侧化NPC；以及

iv.在补充有FGF2或SUN11602、EGF或NSC228155和740Y-P或740Y-P合成激动剂的合适培养基中，将步骤iii)的尾侧化NPC再传代2至3代，直到NPC的特性稳定为spNPC；

a.由iPSC产生未模式化的NPC，所述方法包括：

i.在iPSC培养基中传代iPSC约2天，例如36小时至4天，任选地其中所述iPSC培养基包含TGFβ抑制剂、FGF2激动剂、Wnt抑制剂和BMP抑制剂；

ii.在不含FGF2激动剂(任选地不含FGF2)的iPSC培养基中培养iPSC约4天，其中在约第2天，例如约36小时后至约4天，将BMP抑制剂或双重SMAD抑制剂(用于抑制TGFβ和BMP途径)加入培养基；

iv.在含FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)的NIM中培养步骤iii的EB约7至约11天以生产神经玫瑰花状结构，其中在约第2天从培养基中除去BMP抑制剂或双重SMAD抑制剂，以产生未模式化的NPC；

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

i.将EGF-L7激动剂(优选地为EGF-L7)加入到包含步骤a的未模式化的NPC的培养基中；并且

c.模式化引发的未模式化的NPC以产生spNPCS，所述方法包括：

i.在补充有FGF2激动剂(如FGF2或SUN11602)、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的合适培养基中任选地使用解离溶液解离引发的未模式化的NPC并孵育引发的未模式化的NPC，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的包括Gbx2、Otx2和FoxG1的脑标记物中的至少一种的后侧化NPC；

ii.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))和Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a或BML-284盐酸盐)的合适培养基中传代后侧化NPC并孵育后侧化NPC，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的Gbx2、Otx2和/或FoxG1水平的尾侧化NPC；以及

iii.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))的合适培养基中传代尾侧化NPC并孵育尾侧化NPC；

iv.在补充有FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)、EGF受体激动剂(任选地为EGF或NSC228155)和740Y-P或740Y-P合成激动剂的合适培养基中传代步骤iii)的尾侧化NPC，直到NPC的特性稳定为spNPC；

其中，在每次或至少一次传代后的第1天向培养基中任选地加入ROCK抑制剂。在一些实施方案中，用于产生未模式化的NPC的方法还包括如实施例1中所述的其他步骤。

在一些实施方案中，FGF2激动剂为FGF2，优选地为人FGF2。

在一些实施方案中，FGF8激动剂为FGF8，优选地为人FGF8。

在一些实施方案中，EGFR激动剂为EGF。

在一些实施方案中，RAR激动剂为RA。

在实施例中证明，所述步骤中的FGF8、EGF-L7和/或740Y-P可用于获得spNPC。

胚状体是多能干细胞的三维聚集体，并表达多能细胞标记物，例如Klf4和/或Oct4。

神经外胚层细胞由衍生自外胚层的细胞组成。这些细胞的一个显著标记物是Sox1。

FGF8激动剂任选地为FGF8，优选地为FGF8b，尽管也可以使用FGF8a、FGF8e或其组合。

本发明人已经发现，例如，由可以是任何来源的未模式化的NPC开始，因素的组合和顺序，例如暴露于EGF-L7，随后是高浓度的FGF2和/或FGF8，用RA激活Wnt的短脉冲，随后是单独的RA以及用740-YP的步骤产生spNPC。

双重SMAD抑制是指同时抑制BMP途径和TGFβ途径。这可以通过“双重SMAD抑制剂”来实现，“双重SMAD抑制剂”是指抑制两种途径的抑制剂或抑制BMP途径和TGFβ途径的抑制剂组合，例如BMP抑制剂和TGFβ抑制剂。BMP抑制剂的实例是：头蛋白、多索吗啡(Dorsomorphin)、LDN-193189、ML347、LDN-212854和DMH1。其他已知的抑制剂例如SB431542、LDN-193189、PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、GW788388、GW6604、SB-505124、乐德木单抗(lerdelimumab)、美替木单抗(metelimumab)、GC-I 008、AP-12009、AP-110I4、LY 550410、LY 580276、LY 364947、LY 2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI 6、NPC-30345、K26894、SB-203580、SD-093、激活素-M108A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、盐酸多索吗啡(Dorsomorphin dihydrochloride)和其衍生物及其组合。

TGFβ抑制剂的实例包括：SB431532，PD169316，Galunisertib(LY2157299)或LY3200882及其组合。其他抑制剂也是已知的。

在另一个实施方案中，iPSC由哺乳动物(例如人)的体细胞制备。在一个实施方案中，iPSC是人iPSC(hiPSC)。在一个实施方案中，iPSC由患有脊髓损伤的受试者制备。这些细胞可用于制备自体spNPC，其可用于例如自体移植。

各种分子可以被替代，例如，用于BMP抑制：可以使用LDN-193189、ML 347、LDN-212854和/或DMH 1，用于TGF-β抑制：可使用PD169316、Galunisertib(LY2157299)和/或LY3200882，以及用于Wnt激活：可以使用KYA 1797K、JW 55和/或POCN。

在另一个实施方案中，将未模式化的NPC孵育约3天。

在另一个实施方案中，将后侧化NPC额外孵育约3天。

在另一个实施方案中，将尾侧化NPC额外孵育约2天。

在另一个实施方案中，在用于产生后侧化NPC的培养基中的FGF 2浓度为20ng/ml至约150ng/ml，例如约40ng/mL。

其他FGF2激动剂可以以提供与FGF2类似效果的浓度使用。

在另一个实施方案中，FGF8的浓度为约50ng/ml至约400ng/ml，例如约200ng/mL。

其他FGF8激动剂可以以提供与FGF8类似效果的浓度使用。

在另一个实施方案中，RA合成类似物为约0.1μM EC23。

在另一个实施方案中，Wnt 3a浓度为约100μg/ml。

其他Wnt3a激动剂可以以提供类似效果的浓度使用。

在另一个实施方案中，FGF 2激动剂，任选地为FGF 2或SUN 11602，在用于传代NPC直到NPC特性稳定的培养基中的浓度为约10ng/ml。

在另一个实施方案中，EGF浓度为约10ng/ml。

其他EGFR激动剂可以以提供与EGF类似效果的浓度使用。

在另一个实施方案中，740Y-P的浓度为约1μM。

在另一个实施方案中，其中ROCK抑制剂为Y-27632。

在另一个实施方案中，ROCK抑制剂的浓度为约10μM。

其他ROCK抑制剂可以以提供与Y-27632类似效果的浓度使用。

在另一个实施方案中，spNPC传代3至10代。

在另一个实施方案中，EGF-L7的浓度为约10ng/mL。

在另一个实施方案中，DLL4的浓度为约0.5μM。

其他Notch信号传导激活剂可以以提供与DLL4类似效果的浓度使用。

当激动剂、激活剂或抑制剂是生物分子(如蛋白质)时，使用哺乳动物序列，优选人序列。

在某些实施方案中，所述方法还包括富集和/或分离所需细胞。

本发明的另一方面是一种包含如实施例中所述的一个或多个步骤的方法。

spNPC还可以进一步分化，例如，对于神经元分化，spNPC可以在不存在EGF和FGF但存在BDNF、GDNF、抗坏血酸和cAMP的条件下培养。如实施例1所述，分化细胞显示神经元形态，并表达神经元标志物β-III-微管蛋白(图10)。暴露于BMP4和CNTF可诱导spNPC的星形胶质细胞分化，获得具有星形胶质细胞形态的细胞，其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色均匀(图10)。此外spNPC可以向少突神经胶质细胞命运分化，例如通过依次施用Shh激动剂，然后施用PDGF-A。分化3周后，染色显示O1阳性细胞具有特征性少突胶质细胞形态。

本发明的另一方面包括根据本文所述方法产生的包含spNPC或由其分化的细胞的细胞群。所述细胞群可包含在组合物中，任选地与载体(任选地为药学上可接受的载体)组合。在一些实施方案中，所述细胞群用于在需要其的接受者中移植。药学上可接受的载体可以是培养基或基质，或冷冻培养基，任选地为GMP级或无菌的。

本发明的另一方面包括分离的引发的未模式化的NPC细胞群，其与未引发的未模式化的NPC相比包含更高的Nest、Pax 6和Sox 2表达。本发明的另一方面包括分离的后侧化NPC细胞群，其与未模式化的NPC相比包含HoxA 4的较高表达和Six 3、Dlx 2、LmxA 1、FoxG1、Gbx 2和/或Otx 2的较低表达。本发明的另一方面包括分离的尾侧化NPC细胞群，其与后侧化NPC相比包含HoxA4的更高表达和FoxG1、Gbx2和Otx2的更低表达。本发明的另一方面包括分离的脊髓NPC细胞群，其与尾侧化NPC相比包含HoxA4和HoxA5的更高表达以及Gbx2和Otx2的更低表达。本文所述的spNPC不能从组织中分离或收获任何量(如果有的话)。本文所述的方法可用于制备例如自体spNPC，例如使用来自受试者(例如患有脊髓损伤的受试者)的成纤维细胞或其他体细胞来制备分离的spNPC。

在一些实施方案中，较高或增加的表达是较高/增加的至少1倍变化(log 2比例)和/或较低或降低的表达是较低/降低的至少1倍变化(log 2比例)。

本公开内容的另一方面包括分离的细胞群，其包含根据本文所述的任何方法产生的spNPC，任选地其中所述spNPC衍生自患者，任选地为脊髓损伤患者，任选地其中所述分离的细胞群用于移植，任选地用于自体移植。

本公开内容的另一方面包括组合物，其包含本文所述的任何分离的细胞群和药学上可接受的载体，任选地为培养基或基质，或冷冻培养基，任选地为GMP级、无异源培养基和/或无菌的。

在一些实施方案中，本文所述的任何细胞群或组合物用于治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者。

本公开内容的另一方面是治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者的方法，或在制备用于治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者的药物中的方法，所述方法包括给予本文所述的任何分离的细胞群或组合物以治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者或用于制备用于治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者的药物。

在一些实施方案中，脊髓损伤是颈、胸或腰脊髓损伤，任选地为急性或慢性。

在一些实施方案中，神经退行性疾病为多发性硬化(MS)、脑瘫(CP)、帕金森症、阿尔茨海默症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、弗里德希氏共济失调、路易体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、颅神经疾病、外周感觉神经病、癫痫、朊病毒病、克雅二氏症、阿尔珀病、小脑/脊髓小脑变性、贝敦氏症、皮质基底变性、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和/或自闭症。

本公开的另一方面包括生成具有脊髓特性的人神经干/祖细胞或神经前体细胞(spNPC)的方法，其包括以下步骤：

a)将多能干细胞悬浮在含有TGFβ抑制剂、FGF2激动剂、Wnt抑制剂和BMP抑制剂的培养基中；

b)将步骤(a)中获得的细胞在含有Wnt抑制剂和BMP抑制剂的培养基中悬浮培养；

c)通过使所述多能人细胞与基本无血清的培养基接触形成胚状体；

d)培养所述胚状体以形成玫瑰花状结构和神经管状结构以及神经外胚层细胞；

e)优选地通过使用EGF-L7或其激动剂(例如组合：DLK1或DAPT(以抑制Notch)、NSC228155或β细胞素(以激活EGFR)、A-205804(以抑制ICAM-1)、以及硼替佐米和甲基巴多索隆(以抑制NF-κB))来引发神经外胚层细胞停留在外胚层细胞命运中，并通过DLL4或任何Notch信号传导激活分子激活Notch信号传导。

f)在高浓度的FGF 2激动剂(优选地为FGF 2)和FGF 8激动剂(优选地为FGF 8)(例如对于FGF 2或FGF 8，大于20ng/ml且最高达约400ng/mL)中后侧化e)中引发的细胞；

g)优选地通过用RAR激动剂(任选地为任何视黄酸类似物)和Wnt激动剂(如AZD2858、Wnt激动剂1、CP21R7(CP21)或Wnt)处理，尾侧化在f中后侧化的细胞；以及

h)优选使用740Y-P，通过PI 3-激酶-Akt途径和FGF途径的双重激活，诱导步骤g)中生成的细胞的脊髓NPC的增殖能力。

本公开内容的另一方面包括用于由多能干细胞体外衍生脊髓NPC的步骤的细胞培养组合物，其中所述脊髓NPC表达Sox2、Pax6、巢蛋白或波形蛋白的一种或多种可检测的标记物，并且脊髓NPC具有分化为神经谱系细胞的能力，其包含基础细胞培养组合物，任选地其中每个步骤的基础细胞培养组合物如表1中所提供，并且还包含EGF-L7激动剂(任选地为EGF-L7)，如权利要求27e所述用于引发神经外胚层细胞停留在外胚层细胞命运中；FGF2激动剂(优选地为FGF2)和FGF8激动剂(优选地为FGF8)，如权利要求27e)所述用于后侧化引发的细胞；RAR激动剂(任选地为RA)或Wnt3a，如权利要求27g所述用于尾侧化所述后侧化细胞；和/或740Y-P，如权利要求27h所述用于诱导增殖能力，任选地在本文所述的浓度或浓度范围内。在一些实施方案中，表1中描述了用于每个步骤的基础培养基。

在一些实施方案中，BMP抑制剂选自头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347和LDN-212854、DMH1 SB 431542、LDN-193189、PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、GW788388、GW6604、SB-505124、乐德木单抗、美替木单抗、GC-I 008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI 6、NPC-30345、

SB-203580、SD-093、激活素-M108 A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、盐酸多索吗啡和其衍生物及其组合，优选地选自头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347以及LDN-212854、DMH1。在一些实施方案中，BMP抑制剂为LDN193189。

在一些实施方案中，双重SMAD抑制剂包含选自以下的TGFβ抑制剂：SB431532、PD169316、Galunisertib(LY2157299)或LY 3200882和选自以下的BMP抑制剂：头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347、和LDN-212854、DMH1、SB 431542、LDN-193189、PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、GW788388、GW 6604、SB-505124、乐德木单抗、美替木单抗、GC-I 008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI 6、NPC-30345、

SB-203580、SD-093、激活素-M108 A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、盐酸多索吗啡和其衍生物及其组合，优选地选自头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347以及LDN-212854、DMH1。其他的也是已知的。在一些实施方案中，TGFβ抑制剂为SB 431542或A-83-01。

在一些实施方案中，Wnt抑制剂选自XAV 939、DKK 1、DKK-2、DKK-3、Dkk-4、POCN抑制剂、C59、LGK-974、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-5、SFRP-3、SFRP-4、WIF-1、Soggy、IWP-2、IWR 1、ICG-001、KY 0211、Wnt-C59、LGK 974、1WP-L6和其衍生物及其组合。在其他实施方案中，Wnt抑制剂为POCN。在其他实施方案中，Wnt抑制剂为C59或LGK-974。

在一些实施方案中，多能干细胞为人多能干细胞。在其它实施方案中，人多能干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。

在一些实施方案中，培养基还含有血清或血清替代物。在其它实施方案中，培养基包含ROCK抑制剂。

本公开内容的另一方面包括根据本文所述的任何方法产生的人多能干细胞衍生的脊髓神经干/祖细胞(spNPC)的分离群体，其特征在于所述脊髓神经干细胞表达巢蛋白、Sox2、Pax6中的至少一种，任选地其中所述spNPC包含与常规神经干细胞(NSC)相似的表型并至少表达Hox基因(优选地为Hox A4或Hox A5)中的一种。在一些实施方案中，至少一种培养的细胞表达一种可检测的标记物(HoxA4或HoxA5)连同一种或多种选自巢蛋白、Sox 2和Pax 6的可检测的标记物，其中神经干/祖细胞中HoxA4的表达量与常规衍生的前脑NPC中HoxA4的表达量相比增加至少50％。在一些实施方案中，所述细胞是后侧化细胞，并且与未模式化的细胞或fbNPC相比表达更多的Hox基因(例如HoxA 4和/或HoxA 5)，并且表达更少的脑标记物(例如Gbx 2、Otx 2和FoxG 1)。在一些实施方案中，spNPC分化为神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

本公开内容的另一方面包括组合物，其包含本文所述的任何分离的细胞群和载体，任选地为药学上可接受的载体，任选地为培养基或基质，任选地为GMP级、无异源培养基或无菌的。

本公开内容的另一方面包括本文所述的任何一种spNPC群体或本文所述的任何组合物在制备用于治疗神经退行性疾病的脊髓损伤的药物中的用途。

在一些实施方案中，神经退行性疾病为多发性硬化、脑瘫、帕金森症、阿尔茨海默症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、弗里德希氏共济失调、路易体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、颅神经疾病、外周感觉神经病、癫痫、朊病毒病、克雅二氏症、阿尔珀病、小脑/脊髓小脑变性、贝敦氏症、皮质基底变性、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和/或自闭症。

在一些实施方案中，所述spNPC用于移植到患者的脑或脊髓中。

本公开内容的另一方面是治疗神经退行性疾病的脊髓损伤的方法，所述方法包括给予需要其的患者本文所述的任何spNPC群体或本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述spNPC用于移植到患者的脑或脊髓中。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病为多发性硬化、脑瘫、帕金森症、阿尔茨海默症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、弗里德希氏共济失调、路易体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、颅神经疾病、外周感觉神经病、癫痫、朊病毒病、克雅二氏症、阿尔珀病、小脑/脊髓小脑变性、贝敦氏症、皮质基底变性、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和/或自闭症。

还提供了一种组合物，其包含使用本文所述的方法生成的一种或多种细胞，任选地与载体组合。

如实施例所示，本发明的另一方面包括本文所述的任何细胞群或组合物在治疗需要其的受试者(例如患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者)中的用途。脊髓损伤可以是颈或胸脊髓损伤，任选地为急性或慢性。在一个实施方案中，所述神经退行性疾病为多发性硬化(MS)、脑瘫(CP)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森症(PD)、阿尔茨海默症(AD)、亨廷顿氏病(HD)、弗里德希氏共济失调、路易体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、脑损伤(例如，中风)、颅神经疾病、外周感觉和神经病症。

在其它方面还包括所述细胞和包含所述细胞的组合物用于移植和/或治疗需要其的受试者的用途，例如用于移植和/或治疗患有脊髓损伤或退化的受试者，所述脊髓损伤或退化例如由神经退行性疾病(任选地为MS或CP)引起。

所述细胞或组合物可以与一种或多种神经保护因子组合，和/或给予本文所述的细胞群的受试者也可以给予一种或多种神经保护因子，例如GDNF、BDNF、NT 3、NGF和/或CNTF。在一个实施方案中，给予的细胞包括spNPC或由其分化的细胞。在一个实施方案中，将所示的可表达更多有助于髓鞘再生的前少突神经胶质生成因子的spNPC与fbNPC或其它细胞类型一起给药。

此外，如本领域技术人员将理解的，在特定部分中描述的定义和实施方案旨在适用于其所适用的本文描述的其他实施方案。例如，在以下段落中，更详细地定义了本公开内容的不同方面。如此定义的每方面可以与任何其它方面组合，除非清楚地指示与此相反。具体而言，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其它特征组合。

以上公开内容总体上描述了本申请。通过参考以下具体实施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是旨在限制本申请的范围。形式上的改变和等同物的替换被认为是情况可能建议的或提供的便利。尽管本文使用了特定术语，但是这些术语旨在描述性的意义，而不是为了限制的目的。

以下非限制性实施例是本公开内容的说明：

实施例

实施例1

本文提供了用于由hPSC开始生成具有脊髓特性的hPSC-NPC(spNPC)的逐步方案的实施例。该程序的三个主要步骤：1)生成未模式化的NPC或胚状体(EB)形成和双重SMAD抑制，2)引发NPC到外胚层细胞命运，以及3)将NPC模式化为spNPC(图3)。

步骤1：由hPSC生成未模式化的NPC

体外生成NPC的不同方法，包括使用“默认途径(default pathway)”^22,23，或通过抑制SMAD信号传导途径。有一些方案使用BMP抑制剂仅抑制BMP途径，或使用双重SMAD抑制剂同时抑制TGFβ和BMP。用这些方案在体外生成的NPC，在它们被模式化以获得其他特性之前，首先默认获得吻侧特性¹⁴。

我们使用EB培养和双重SMAD抑制来生成具有吻侧特性的NPC。这些细胞在本文中称为未模式化的NPC。

如果在成纤维细胞饲养层上培养hPSC，则在诱导神经祖细胞之前，它们可以在无饲养层的条件下进一步扩增3-4代。该作用使细胞适应环境，提高培养物质量和产量。

为了生成EB，将小的hPSC团在超低粘附培养皿上在hPSC培养基(不含FGF2)和神经诱导培养基中培养7天。在此期间，hPSC生长为称为EB的细胞聚集体。

当EB转移到神经诱导型培养基(NIM)中时(大约第4-5天)，神经外胚层诱导开始。在NIM中将EB接种在Matrigel或Geltrex上促进细胞转变成具有表达Sox 1的神经外胚层谱系的玫瑰花状结构。Sox 2也存在于hPSC中，但Sox 1在细胞获得神经外胚层命运后开始。

FGF2信号传导是玫瑰花状结构极化所必需的。然后加入成纤维细胞生长因子2(FGF2)以引导神经外胚层细胞转变为玫瑰花状结构。

NEM用于转化NPC以产生表达巢蛋白、Sox2和Pax6的NPC(例如未模式化的NPC)。

方案：

1)按照制造商说明书将Accutase或ReLeSR(干细胞技术)应用于hPSC的健康和均质培养物，以将它们分离为细胞团(由20-50个细胞组成)。将细胞以1×10⁴个团/mL的密度悬浮于hPSC培养基中，并向超低粘附6孔培养皿中加入2mL。在加湿培养箱中，在37℃和5％CO₂的标准培养条件下孵育两天。

推荐使用不含FGF的hPSC培养基(表1)。

表1：培养基组成

传代至Accutase解离的替代方法包括使用在不含MgCl₂、CaCl₂或ReLeSR的Dulbecco's PBS中的0.5mM EDTA。ReLeSR选择性地仅提升iPSC细胞，将分化的细胞留在平板上。这也允许快速和容易地选择常规iPSC培养物。

2)在第2天，轻轻倾斜平板，使细胞团聚集在孔的底角，并用补充有BMP抑制剂多索吗啡(2μM)和TGFβ抑制剂SB431542(10μM)的新鲜hPSC培养基替换顶部的一半培养基。在第4天重复此过程。

多索吗啡和SB431542阻断BMP和TGF-β信号传导途径，已证明可将神经诱导效率提高至总细胞的80％以上¹⁴。

3)在第5天，轻轻倾斜平板并用不含FGF2的NIM替换培养基(表1)。

应在第5天观察到EB形式的细胞聚集体。EB模拟内源性条件，在该条件下多能hPSC转变为神经外胚层细胞。

4)在第7天，将含有FGF2的NIM中的EB转移至标准6cm培养板中，在37℃下用Matrigel或Geltrex预涂布1小时。等待24小时后进行显微镜检查，以确认EB已完全沉降并粘附在平板上。

5)在第8天，用含FGF2但不含多索吗啡的新鲜NIM替换一半培养基。每天重复该过程，直至第13-17天(根据PSC细胞系而变化)，此时将形成第一个神经玫瑰花状结构，然后应观察到神经管状结构。玫瑰花状结构或神经管状结构中的细胞，与周围的细胞不同，应表达早期神经外胚层标记物，如Pax 6和Sox 1。

6)在观察神经玫瑰花状结构或神经管状结构两天后，使用精细移液器吸头提取并转移玫瑰花状结构至含有NEM的15mL Falcon管中。确保将非神经细胞留在平板的外围，因为选择不当会损害NPC纯度(图4)。

或者，可以使用神经玫瑰花状结构选择试剂(干细胞技术)，或与分散酶短暂孵育(3-5分钟)，轻敲，和PBS洗涤以提取神经玫瑰花状结构。已发现神经玫瑰花状结构选择试剂对于选择性地提升单层分化培养物的神经玫瑰花状结构不是最佳的，因此建议仅在EB培养物中使用。

7)在1×10⁵个细胞/mL下将选择的玫瑰花状结构重悬于NEM中，并在1×10⁵个细胞/cm²下将细胞接种于PLL(0.1mg/mL溶液)和层粘连蛋白预涂布平板上。避免在较低密度下重新涂板，因为这会促进不期望的分化和次级玫瑰花状结构形成的损失。

层粘连蛋白-511(但不是-332、-111或-411)优于其他ECM替代品，如Matrigel或Geltrex，因为它不含生长因子，其可能会干扰分化过程。

7-8天后，手动(或用分散酶)提取次级神经玫瑰花状结构，并将其转移至另一个含有N2B27培养基的Matrigel涂布平板上。然后，解剖三级玫瑰花状结构以纯化NPC。

重新涂板后，培养物应含有表达巢蛋白、Pax6和Sox2但不表达Oct4的分离的NPC。

克隆扩增神经球(初级、次级、三级)。

8)在NEM中在超低粘附平板上以10个细胞/μL培养细胞。倾斜平板，每2-3天用新鲜培养基更换一半培养基，持续一周。在此阶段，初级神经球应被观察为具有光滑轮廓的完美球形细胞簇，大小至少为50μm至高达150μm。神经球不应出现深色和粗糙，也不应含有液泡或死细胞。它们也可以表达Oct 4，即原始NPC的标记物。

9)检测后，将神经球转移至含有500μL NEM的15mL Falcon管中。使用火焰抛光的巴斯德吸管上下吸取培养基10-20次，或直至观察到分离成单个细胞。将悬浮液以10个细胞/μL接种于NEM中的超低粘附平板上。

细胞扩增

10)在含10μM ROCK抑制剂的NEM中的PLL/层粘连蛋白预涂布的标准培养板上以1×10⁴个细胞/cm²培养单细胞。第二天，更换为仅含NEM的新鲜培养基。

11)5-6天后，使用Accutase将细胞传代至含有NEM的新PLL/层粘连蛋白预涂布平板。传代1天后，补充10μM ROCK抑制剂。

注：默认情况下，使用该方法生成的hPSC-NPC将表达FoxG1、Gbx2和Otx2，即前脑与中脑特性的标记物。细胞将不表达HoxC4，HoxC4是NPC中脊髓特性的标记物。

步骤2：将NPC保持在外胚层细胞命运

在步骤1期间，骨形态发生蛋白4(BMP4)信号传导被BMP抑制剂多索吗啡抑制。也可使用LDN193189(LDN)或头蛋白，SB431542(SB)抑制TGFβ以阻止中胚层和内胚层分化。在下一步(步骤3)中，我们将使用视黄酸(RA)。RA倾向于使细胞分化偏离中胚层命运²⁶。

为了保持细胞的外胚层命运，我们需要在RA活跃时抑制Notch信号传导²⁷。已经显示，Notch信号传导的抑制抑制了向中胚层命运的分化并将细胞保持在外胚层中²⁸。为了抑制Notch信号传导，我们使用Notch拮抗剂EGF-L7(10ng/mL)。EGF-L7与所有四种Notch受体(Notch 1-4)相互作用，并抑制/竞争Jagged 1和Jagged 2蛋白(非DLL 4)与Notch受体的相互作用²⁹。EGF-L7敲除刺激了Notch途径，而EGF-L7过表达抑制了Notch途径。当NPC活跃增殖时，Notch信号传导有助于维持未分化状态。

此外，在该步骤中，通过用10ng/ml EGF-L7代替培养基中的EGF，EGF-L7激活EGF受体，但其不如EGF有效，并调节Notch信号传导，其减少NPC的过度增殖。任选地我们也可以加入0.5μM的DLL 4(DLL4：类德尔塔4；Notch信号传导激活剂)与EGF-L7以平衡Notch活性的降低并保持神经祖细胞基因(如巢蛋白和Pax 6)的表达水平(图5)。

有证据表明，在发育过程中，脊髓祖细胞不同于前神经祖细胞，也可以来源于神经中胚层祖细胞(NMP)。NMP能够在体外分化为轴旁中胚层组织和后神经组织，甚至进一步分化为特定的神经元亚群，例如运动神经元^30,31。在斑马鱼体内实验中发现，NMP亚群的命运受到限制并在空间上分离，同时在自我更新潜力方面存在很大差异³²。

步骤3：将NPC模式化为脊髓特异性特性：

为了生成spNPC，我们使用形态发生素的逐步处理将细胞模式化³³。以胚胎发生期间脊髓形成中涉及的发育线索为模型，将引发的NPC向脊髓特性模式化。

在分化早期，所有的神经细胞都具有吻侧特性。然而，未来的尾侧细胞逐渐变得后侧化，然后获得尾侧中脑和脊髓的特征。FGF、Wnt、视黄酸(RA)和Shh参与了脊髓的特化和随后的延长。在RA、Wnt和FGF信号中，RA引起最强水平的尾侧化：诱导抑制前脑分化和促进尾侧CNS特化。

神经板产生脊髓的区域以FGF依赖性方式指定。几种FGF，包括FGF3、FGF4、FGF8、FGF13、FGF18，参与脊髓的特化。体外实验已经显示，神经组织暴露于升高的FGF水平导致HOXC6、HOXC8、HOXC9或HOXC10的水平逐渐升高^34,35。此外，几种信号传导途径影响FGF8表达。在神经管的尾侧区域是活跃的Wnt和Shh途径本身可以增加FGF8水平^36,37。

1)使用Accutase将细胞解离为单细胞。在补充有B27、N2、FGF2(40ng/ml)、FGF8(200ng/ml)的DMEM:F12培养基，将细胞以1×10⁴个细胞/cm²接种在PLL/层粘连蛋白预涂布的标准培养板上。在标准条件下孵育3天³³。

表2包含可用于本方案的材料列表。

在该步骤中，我们使用至少2倍以上的FGF2(从20ng/ml至150ng/ml)和高浓度的FGF8(从50ng/ml至400ng/ml)。在胚胎中，尾侧细胞比吻侧细胞暴露于所选择的FGF更长时间，它们参与脊髓沿吻侧-尾测轴的区域化。在脊髓延长的后期，FGF8更广泛地表达。FGF8的表达持续数天，但在体节发生的最后阶段和轴延长停止时下降^38,39。在该浓度和时间段用FGF8处理导致细胞的后测化。在这一阶段结束时产生的后侧化NPC与未模式化的细胞相比表达更多的Hox基因(如HoxA4)，并且具有至少一种脑标记物(如Gbx2、Otx2和FoxG1)的减少的表达(图6)。后侧化NPC同样为三能的，并具有与未模式化的NPC相同的分化特征。后侧化NPC形成神经球的能力和增殖率略高于未模式化的NPC。

2)第3天，使用Accutase将细胞传代至补充B27、N2、0.1μM EC23和Wnt3a(100μg/ml)的DMEM:F12培养基中的新PLL/层粘连蛋白预涂布的标准培养板上。再孵育3天。

在该步骤中，我们使用视黄酸(RA)或合成的视黄酸类似物EC23诱导细胞的尾侧化。优选使用EC23，因为其在孵育温度下更耐光。

FGF和RA信号传导(单独或一起)不足以在体外生长的神经细胞中诱导尾侧特征，并且进一步需要Wnt信号传导(Wnt3a)来将神经细胞特化为尾侧特性⁴²。

3)第6天，使用Accutase将细胞传代至补充B27、N2和0.1μM EC23的DMEM:F12培养基中的新PLL/层粘连蛋白预涂布的标准培养板中。再孵育2天。

在此阶段不需要Wnt3a。

用RA和Wnt处理3天导致细胞尾侧化。这些尾侧化NPC表达Hox基因，如HoxA4。传代后，EC23再持续2天，以稳定NPC的尾侧特性。与后侧化细胞相比，这种额外的RA途径激活导致Gbx2、Otx2和FoxG1水平的显著降低(几乎无表达)(图7)。尾侧化NPC也是三能的，具有与引发的NPC相同的分化特征。然而，尾侧化NPC形成神经球的能力和其增殖率与未模式化的NPC相比显著降低(图7)。

4)在补充有B27、N2、FGF2(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)和740Y-P(1μM)的DMEM:F12中将尾侧化NPC传代2-3代，直到细胞的特性稳定，在此阶段形成脊髓NPC。脊髓NPC可在该培养基中传代并维持多达3-5代以上以获得最佳结果，但根据培养条件，传代至P10(及以上)也是可接受的(图8)。

在维持期，细胞的增殖速率降低。为了生成足够数量的细胞，需要延长培养几代。在此阶段FGF2的浓度不能增加。为了克服这个问题，加入740Y-P，其在通过PI 3-激酶-Akt途径促进神经元细胞存活和增殖方面与FGF2一样有效⁴³。740Y-P的作用具有剂量依赖性。

我们建议使用约P3-P10之间的spNPC。然而，较晚传代的细胞可能发育为具有混合特性的NPC和生成更多GABA能中间神经元的细胞。

每次传代后，在培养的第1天加入10μM Rock抑制剂(Y-27632)。

表2：材料

6孔超低粘附平板
	740Y-P
Accutase
	多索吗啡
含有表皮生长因子样结构域的蛋白7(EGFL-7)
	成纤维细胞生长因子2(FGF2)
成纤维细胞生长因子8b(FGF-8b)
	肝素
hPSC培养物(hESCs或hiPSCs)(表1)
	mTeSR Plus*
层粘连蛋白511
	人工基底膜
Geltrex*
	神经扩增培养基(NEM)(表1)
神经诱导性培养基(NIM)(表1)
	多聚赖氨酸(PLL)70-150KDa
重组小鼠Wnt-3a
	ReLeSR
视黄酸激动剂EC23
	ROCK抑制剂(Y-27632)
SB431542
	音猬因子(Shh)激动剂Purmorphamine

如使用克隆分析所确定的，spNPC的自我更新能力与fbNPC的自我更新能力相当(图9)。在神经球试验中，神经球被机械分离成单细胞悬液，并以克隆密度接种(图9)。3次传代期间，发现fbNPC或spNPC的自我更新能力无显著差异。

如通过分析分化为三个主要神经谱系的能力所评估的，spNPC的发育潜力与fbNPC的发育潜力相当。对于神经元分化，在不存在EGF和FGF但存在BDNF、GDNF、抗坏血酸和cAMP的情况下培养NPC。分化细胞显示神经元形态，并表达神经元标志物β-III-微管蛋白(图10)。暴露于BMP 4和CNTF可诱导fbNPC和spNPC的星形胶质细胞分化，获得具有星形胶质细胞形态的细胞，其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色均匀(图10)。为了比较fbNPC和spNPC向少突神经胶质细胞分化的能力，我们采用了一种方案：依次施用Shh激动剂，然后施用PDGF-A。分化3周后，染色显示O1阳性细胞具有特征性少突胶质细胞形态。

衍生自spNPC的神经元的自发突触活性与衍生自fbNPC的相当，如使用全细胞膜片钳记录所确定的，证明了两种细胞系具有相似的内向钠电流并且能够产生动作电位。此外，两组之间钠电流的幅度和神经元的放电特性没有显著差异(图11)。

损伤后或由于退行性疾病对脊髓的多方面损伤可引起持久的感觉运动缺陷，其阻碍了患者的功能。这些损伤很大程度上是由于组织损失，使得靶向细胞置换成为一种有前景的治疗策略⁴⁴。由iPSC成功生成spNPC标志着为目前尚未存在的患者开发有效的基于细胞的治疗的重要里程碑。由于具有与目标组织的生态位匹配的独特能力，spNPC在移植到脊髓中时表现出改善的整合和存活^15,16。特别令人感兴趣的是它们再生CST和V2a回路中间神经元的能力，这在恢复丧失的运动功能中是至关重要的^15,16。相比之下，常规脑NPC分化为这些群体的能力较差，并且还产生不需要的皮质细胞，这阻碍了它们产生有意义结果的潜力。总之，这些发现强调了将细胞特性与受影响区域相匹配以最大限度地再生和恢复的重要性。

从前脑-NPC到spNPC的转变标志着退行性脊髓疾病的基于细胞的治疗优化的关键步骤。

神经退化和随后缺乏再生是脊髓患者功能恢复的主要障碍。准备施用干细胞疗法消除这一障碍，细胞编程的最新进展使该疗法更接近临床应用。具体而言，赋予iPSC-NPC脊髓特性导致改善的整合，用适当的细胞再植入损伤部位，而不引入源自脊髓外的外来细胞。

实施例2

本研究旨在确定脊髓微环境如何调节移植的神经干/祖细胞的分化状态以促进恢复。使用颈脊髓损伤的啮齿动物模型，将不同发育阶段的NPC(fbNPC对spNPC)移植到颈脊髓损伤的啮齿动物模型中，并检查恢复的机制。

三能神经干/祖细胞移植治疗创伤性脊髓损伤(SCI)是很有前景的治疗策略，但移植细胞的最佳时间和空间发育阶段仍有待确定。在本研究中，我们比较了在损伤的脊髓微环境中具有前侧前脑特性(fbNPC)的神经上皮干/祖细胞(NPC)和具有腹侧脊髓特性(spNPC)的NPC的命运决定，这两种NPC均生生谷氨酸能或GABA能中间神经元。生成人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的fbNPC和spNPC并移植到损伤的脊髓中。fbNPC主要分化为神经元，而spNPC主要分化为髓鞘少突胶质细胞。这种独特的分化特征主要是由于两个细胞系之间Pax6表达的差异，并受到损伤的脊髓微环境中Notch信号传导激活的影响。两种NPCNPCS系的移植导致神经行为恢复，如通过Catwalk评估，包括前肢握力和前肢/后肢运动力量度的改善。fbNPC通过分化为神经元而在功能恢复中发挥其作用，其向空腔迁移并形成细胞桥。然而，spNPC通过髓鞘再生发挥其作用。两种细胞系都为组织保存和再生提供营养支持。

结果

体外生成细胞的表征

GFP阳性hiPSC，由非病毒、piggyBac转座子介导的重编程生成(Hussein等人,2011)，用于通过模拟关键形态发生线索和体外复制发育神经管模式来建立fbNPC和spNPC(图12A-C)。应用不同生长因子和模式因子的组合来诱导fbNPC和spNPC的生成。为了建立fbNPC，使用双重SMAD抑制法(Varga等人)。在fbNPC生成后的最早阶段，将它们维持在培养基中以保持细胞的前侧特性(前脑特性)(Payne等人,2018年；Varga等人)。使用双重SMAD抑制生成spNPC，使用视黄酸(RA)和音猬因子(Shh)的激动剂尾侧化和腹侧化，并使用实施例1中描述的方法维持在培养基中以保存它们的腹侧脊髓特性。

比较基因表达分析显示，与原始hiPSC相比，两种细胞系中多能细胞标记物(Oct4、Nanog)的表达降低，而神经细胞标记物(Sox2、Pax6和巢蛋白)的表达增加。巢蛋白和Sox2的表达在fbNPC和spNPC之间是相当的(图12D)，但是观察到fbNPC相比spNPC表达多2.2倍的Pax6(图12D)。fbNPC的基因表达谱显示，与spNPC相比，转录因子Otx2和FoxG1的表达水平更高，Otx2和FoxG1是前侧特性细胞的标记物。相反，spNPC表达Nkx2.2、Nkx6.1、HoxA4和HoxA5转录因子的水平增加，这些转录因子代表脊髓特性(图12E)。为了比较fbNPC和spNPC的全转录组，我们进行了RNA-seq分析(图12F)。尽管fbNPC和spNPC的基因表达模式相当相似，但我们发现了一些重要的差异。与fbNPC相比，spNPC中脊髓特异性Hox基因表达增加，脑相关模式转录因子表达降低(图12G)。

损伤的脊髓微环境对fbNPC和spNPC的增殖和分化具有不同的影响

在CNS发育期间，神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞在环境信号的动态相互作用指导的过程中由普通神经上皮祖细胞产生(Silbereis等人,2016年)。然而，SCI后，这些发育线索不存在，表达不同的环境因子。

损伤和未损伤的脊髓微环境之间分化因子组成的这种差异可能对来自不同发育阶段的NPC的增殖和命运决定具有不同的影响。为了评估这种影响，我们在体外将fbNPC和spNPC暴露于天然的脊髓匀浆(天然的h，

)或损伤的匀浆(SCI-h)。从未损伤的颈脊髓组织或损伤后两周的颈损伤组织中准备这些匀浆。

为了研究

或SCI-h对不同发育阶段的NPC自我更新能力的影响，对fbNPC和spNPC进行克隆分析。在神经球试验中，神经球被机械分离成单细胞悬液，并以克隆密度接种(图13A-C)。当用/>

处理时，fbNPC和spNPC的自我更新能力没有显著差异，因为两个细胞系生成的神经球数量没有显著差异(图13A-C)。相反，当用SCI-h处理时，fbNPC生成了显著更多的神经球，并且与spNPC相比，表现出更大的平均神经球大小，这表明在暴露于SCI-h后，形成神经球的fbNPC的增殖速率高于spNPC(图13A-C)。使用BrdU试验进一步证实了这一点(图13D)。

为了研究天然的或损伤的脊髓微环境中存在的因子对NPC系分化的影响，我们在存在

或SCI-h的情况下分化细胞。在/>

存在下培养NPC细胞系4周，导致其分化为神经元(βIII-微管蛋白⁺)、星形胶质细胞(GFAP⁺)和少突胶质细胞(O1⁺)，证实了其三能性。在/>

组，与spNPC相比(20.5±1.9％，p<0.5)，fbNPC分化为更多的神经元(31.7±2.0％)，而spNPC分化为更多的表达O1的少突胶质细胞(fbNPC；31.7±2.0％对spNPC；20.5±1.9％，p＜0.5)。然而，与spNPC相比，在SCI-h存在下的培养对fbNPC具有不同的影响。大部分fbNPC保持未分化(巢蛋白⁺；27.7±3.5％)或向神经元分化(29.4±2.8％)，而spNPC主要沿星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系分化(O1⁺；37.8±5.3，GFAP⁺34.0±3.1)。此外，较低百分比的spNPC保持未分化(巢蛋白⁺；18.29±3.8％)(图14)。

Notch信号传导对fbNPC和spNPC的不同影响

我们的结果显示SCI-h在NPC处于早期发育阶段(fbNPC)时诱导它们的增殖，而在它们处于后期发育阶段(spNPC)时诱导它们分化为星形胶质细胞谱系。这一发现表明SCI生态位中存在对早期与晚期发育阶段NPC具有不同影响的因素。

Notch信号传导是参与二元细胞命运决定以及诱导或增强终末分化的途径。在早期CNS发育期间，Notch信号传导首先用于诱导细胞的自我更新和增殖。然而，在发育晚期，Notch诱导细胞向神经胶质的分化(Grandbarbe等人,2003；Namihira等人,2009；Tanigaki等人,2001)。因此，Notch信号传导是一个潜在的候选方式，其负责观察到的暴露于SCI-h后分化的发育阶段差异。我们使用蛋白质印迹法分析了Notch激活配体DLL1在

和SCI-h中的表达，并发现SCI后DLL1的表达高度上调(图14C)。DLL1表达在损伤2周后达到最大值，并在损伤约2个月后开始下降。Notch对发育不同的神经祖细胞的不同影响与它们的Pax6表达水平相关(Sansom等人2009)。Pax6在fbNPC中的表达水平高于spNPC。神经干细胞中Pax6调节的活性是高度剂量敏感的，Pax6水平的增加驱使系统向神经发生(neurogenesis)进行。Pax6和Notch信号传导的相对水平是控制神经干细胞是否自我更新、分化为神经元或生成神经胶质祖细胞的动态平衡中的因素。在Notch信号传导存在的情况下，Pax6活性增加抑制神经发生并(部分是通过抑制Neurog2)促进自我更新。相反，在Notch信号传导存在下Pax6水平降低导致胶质细胞再生(gliogenesis)。

fbNPC和spNPC在损伤的脊髓中存活、迁移和分化。

为了研究fbNPC和spNPC在移植后的体内行为，T细胞缺陷型RNU大鼠接受C6/7颈部SCI，然后在损伤2周后进行细胞移植。在白质和灰质中均发现移植细胞(GFP⁺)。移植的fbNPC主要位于损伤中心周围(图15A，B)，并显示出向损伤中心迁移并填充空腔的趋势(图15A，B)。相反，spNPC从中心向吻侧和尾侧迁移远至7mm，并且主要沿白质束迁移(图15A，C)。

神经干细胞对损伤部位的趋化反应与其分化状态和损伤类型密切相关(Filippo等人,2013；Imitola等人,2004)。趋化因子(如CXCL12)在SCI中心表达，并吸引表达CXCL12受体、CXCR4或CXCR7的神经祖细胞(Chen等人,2015；Imitola等人,2004)。与spNPC相比，fbNPC表达更高水平的趋化因子受体CXCR4和CXCR7、细胞粘附分子(例如CD44)和整联蛋白(例如ITGA4)，这可以解释这种趋化反应(图15D)(Filippo等人,2013；Imitola等人,2004)。

GFP+细胞的定量显示移植细胞在损伤的脊髓内广泛存活(图15E)。与fbNPC组(6.1±1.1％)相比，spNPC组(11.2±4.6％)的细胞存活率更高，尽管没有统计学显著差异(图15E)。

在分化方面，fbNPC和spNPC在体内均分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，然而，两种细胞系中的一部分细胞保持未分化的巢蛋白阳性状态。fbNPC系的巢蛋白阳性细胞的数目比spNPC多两倍以上(fbNPC：31.2±7.1和spNPC：13.21±4.5％)(图16A、B)，与SCI-h暴露后观察到的体外结果一致。移植的spNPC中APC阳性的成熟少突胶质细胞百分比(54.23±5.24％)显著高于fbNPC(30.4±2.14％；p＜0.05)。类似地，在spNPC组中观察到更多未成熟的Olig2阳性少突胶质细胞(spNPC：39.9±7.9，fbNPC：18.3±3.7％)。移植的spNPC(25.4±5.1％)中GFAP阳性星形胶质细胞的存在与fbNPC(16.2±4.2％)相比没有显著差异。相比之下，Fox3阳性神经元在移植的fbNPC(22.6±1.9％)中显著多于spNPC(6.5±0.8％)(图16A，B)。

我们研究了GFP+移植细胞中Ki67的表达，以鉴定过度增殖的或不成熟的移植细胞(图21A、B和C)。Ki67在spNPC和fbNPC中的阳性率分别为2.67±0.48％和3.56±0.80％，无显著差异(图21)。这表明，即使具有大比例的未分化巢蛋白+细胞，移植物也不是过度增殖的，并且两种细胞系的致肿瘤性风险均很低。

移植细胞对髓鞘再生的贡献

为了完全发挥功能，来自移植细胞的神经元需要髓鞘化。除髓鞘形成外，移植物衍生的少突胶质细胞还有助于裸露轴突的髓鞘再生。为了研究这一点，我们使用髓磷脂碱性蛋白(MBP)以及NF200进行了免疫组织学分析。在fbNPC组中观察到很少的GFP⁺/MBP⁺细胞，而在spNPC组中观察到大量GFP⁺/MBP⁺双阳性细胞，这表明移植的spNPC分化为髓鞘化少突胶质细胞(图17A)。免疫组织化学分析显示，这些GFP⁺/MBP⁺细胞围绕宿主神经丝200(NF 200+)轴突(图17A)。此外，移植物衍生的髓鞘形成促进了郎飞氏结的形成，同时表达结侧区Caspr和近结侧区电压门控钾通道Kv1.2(图17B)。我们使用免疫电子显微镜进一步评估髓鞘形成(图17C)。透射电镜显示衍生自fbNPC的神经元由内源性髓鞘形成细胞髓鞘化。相反，在spNPC组中，免疫金标记的GFP+髓磷脂层被发现包裹了无损伤的(spared)大鼠轴突(图17C)。这些结果清楚地证明移植的人spNPC衍生的少突胶质细胞使内源性轴突髓鞘化。

fbNPC和spNPC移植提高SCI后的组织保存

移植的NPC的主要有益作用之一是分泌营养因子。这些营养因子具有保存内源性组织的促神经原性、促轴突原性以及各种抗凋亡和促血管生成作用(Ruff等人,2012)。为了研究fbNPC和spNPC分泌的营养因子，我们使用人生长因子抗体阵列分析fbNPC和spNPC之间不同生长因子的分泌。两个细胞系都显示不同的成纤维细胞生长因子(FGF)同种型的表达水平增加。FGF同种型与某些神经元亚型的存活和轴突生长有关(Pataky等人,2000)。此外，前神经源性营养因子，如NT3、NGF和GDNF，在两个细胞系中都以高水平表达。有趣的是，诱导胶质细胞谱系分化和增殖的营养因子，如PDGF和TGF同种型，在spNPC中表达增加，而促血管生成因子(如VEGF)在fbNPC中大量表达(图18A、B)。

这些营养因子在体内的分泌可增强内源性组织保存。我们使用LFB和H/E染色进行的组织形态学分析表明，与载体处理的动物相比，spNPC处理的动物中存在更多的白质，但仅在尾部距中心240和480μm处(图18C、D)。然而，两个细胞移植组的病变均较小(图18C、E)。spNPC和fbNPC组的病变组织体积与载体组相比显著更小(载体：3.82±0.45mm³，spNPC：1.74±0.20mm³，fbNPC：1.89±0.26mm³，p＜0.01)(图18E)。

除了这种组织形态学分析，我们还通过使用高分辨率超声(VHRUS)成像进一步研究了空腔和功能性血管分布(Soubeyrand等人,2014年)。VHRUS成像能够生成原位空腔的平面全深度图像和3D重建体积。这有助于克服在常规组织学处理过程中发生的组织收缩的困难(Soubeyrand等人,2014)。与载体处理的动物相比，VHRUS下fbNPC和spNPC移植动物中的空腔尺寸显著更小(载体：2.79±2.55mm³，spNPC：1.37±0.25mm³；p＜0.05，fbNPC：0.15±0.05mm³，p＜0.005，n＝5，图18F、G)。fbNPC组中较小的空腔尺寸不仅由NPC分泌的营养因子引起，还由fbNPC向空腔迁移并填充空腔引起。有趣的是，与载体组相比，fbNPC组中的血管分布得到改善(图18H、I)。尽管该改善不显著，但其反映了fbNPC的促血管生成生长因子的更高分泌。

spNPC衍生的神经元与内源性细胞形成突触连接并增强电传导

由移植细胞分化的神经元必须与内源性细胞形成突触连接并整合到局部网络中以促进功能恢复。使用突触蛋白I(SYN1)抗体的免疫染色和免疫透射电子显微镜，我们评估了金标记的GFP+细胞是否与标记阴性的内源性细胞形成突触连接(图19)。fbNPC和spNPC均能形成突触连接。fbNPC或spNPC与内源性细胞之间形成的突触连接是电功能性的突触，则可有助于功能恢复。具体而言，这些新的连接可能潜在地有助于使更大的电传输通过损伤部位。为了测试这一点，我们分析了通过损伤部位(C5至T1)的电诱发复合动作电位(CAP)传输。与对照fbNPC组相比，spNPC移植组中的CAP振幅显著更高(图19C)。通过脊髓病变dCST的CAP测量结果显示，与接受fbNPC(0.1±0.05mV)或载体组(0.1±0.06mV)的动物相比，接受脊髓NPC的动物的平均CAP振幅更高(0.6±0.5mV)。平均而言，与载体组(5.8±1.0ms)相比，在接受NPC的动物中观察到更高的dCST传导速度(spNPC为9.6±1.7ms，fbNPC为10.8±7.9ms)(图19D-G)。

fbNPC和spNPC的移植促进功能恢复

接下来，我们研究了fbNPC和spNPC的移植是否与功能恢复相关。通过握力和斜面行为任务评估前肢力量和躯干稳定性(Wilcox等人,2017)。在评估期间，所有损伤的动物的前肢握力均一致恢复，但在移植后约4周时恢复轨迹出现分歧。与载体对照组相比，fbNPC和spNPC组的前肢握力均有显著改善(p＜0.05)(图20A)。尽管我们在两组斜面试验中均测量到更好的恢复趋势，但与载体组相比，恢复无显著差异(图20B)。使用CatWalk(NoldusInc.)数字步态分析系统，在移植后8周我们同样量化了与颈部SCI相关的几个静态和动态运动参数。所有损伤组均表现出异常的行走模式、缓慢的运动速度和异常的爪印(图19C)。与载体对照组相比，移植fbNPC和spNPC的大鼠前肢摆动速度显著提高(图20C)。尽管spNPC移植动物的前肢印迹面积和步长没有显著改善，但fbNPC组的前肢印迹面积和步长显著改善。此外，两种细胞系的正常步序比(四肢协调性的指标)均显著改善(图20C)。

基于细胞的治疗后，神经性疼痛的增加是一个潜在的问题(Hofstetter等人,2005年)。因此，我们评估了热触诱发痛和机械触诱发痛(补充信息中的实验程序)。各组大鼠从焦点热源移开尾巴的延迟时间(图22A)在任何时间点均无显著差异。此外，在损伤后8周和10周，对前爪和后爪足底表面应用冯弗雷细丝的反应没有显著差异(图22B、C)。这些数据表明，在我们的模型中，细胞移植治疗并没有增加神经性疼痛。

我们选择比较具有前脑与腹侧脊髓特性的细胞，因为这些细胞与其后侧/背侧对应物相比显示出较低的Ptf 1a表达(图23)。Ptf 1a是一种转录因子，其诱导分化为后脑(小脑)和脊髓背角中的GABA能抑制性神经元。我们已经证明与载体相比，对功能恢复无显著影响(图24)。此发现的一个潜在原因可能是向GABA能神经元的更高分化。虽然GABA能神经元已显示出对于平衡神经网络和调节神经性疼痛是重要的，但是移植具有初级分化为抑制性神经元的潜力的细胞可能对于传递信号无效。

我们证实了在我们的RNU大鼠颈SCI模型中，相对于未损伤的(天然的)颈脊髓，在损伤后2周BMP、TFGβ、Jagged 1/2和Notch蛋白的表达上调。当我们在基线分化培养基中培养细胞时，与fbNPC相比，spNPC分化为O1+细胞的细胞数量没有显著差异(图25)。

然而，为了全面了解fbNPC和spNPC的基因表达谱，我们在两个细胞系之间进行了RNAseq分析。我们证明了与spNPC相比，fbNPC表达更高水平的趋化因子受体CXCR4和CXCR7、细胞粘附分子(例如CD44)和整联蛋白(例如ITGA4)，这可以解释这种趋化反应(图26)。

了解参与获得功能恢复的各种机制是重要的，并且对SCI再生疗法的设计具有意义。一般而言，营养支持对功能恢复的影响更快速，因此移植后前2-3周出现的功能恢复最可能归因于营养支持。人类细胞分化为功能活跃的神经元或髓鞘形成细胞需要3周以上⁷。因此，这段时间后出现的恢复部分可能具有营养支持和细胞整合的叠加效应(图27)。

神经干/祖细胞的最佳时空发育阶段必须被确定，以产生最有可能改善SCI后结果的细胞移植策略。在目前的研究中，我们比较了hiPSC衍生的神经上皮干祖细胞在SCI的颈模型中发育的两个不同阶段的治疗潜力。fbNPC代表神经祖细胞发育的极早期阶段，其具有前侧特性，而spNPC显示神经祖细胞发育的较晚期阶段，其具有尾侧腹侧特性。我们的结果表明，两种细胞类型都有助于功能恢复，但通过不同的机制。

了解SCI微环境和不同特性的细胞之间的相互作用将允许在该领域更紧密地针对患者的需求进行移植。损伤的脊髓微环境对fbNPC和spNPC的增殖和分化具有不同的影响。fbNPC的自我更新潜力在暴露于SCI生态位时增加，而这种环境使spNPC的分化偏向于神经胶质细胞谱系。这种矛盾的效应是Notch信号传导在原始神经祖细胞与最终神经祖细胞上的典型标志(Grandbarbe等人,2003；Namihira等人,2009；Salewski等人,2013；Tanigaki等人,2001)。这与SCI微环境中Notch信号传导的激活一致(图14C)。与spNPC相比，Pax6在fbNPC中的表达水平更高(图12D)。Pax6表达和Notch信号传导的动态平衡具体指明了自我更新而非向胶质祖细胞的分化，或者反之亦然(Sansom等人,2009)。

在这里，我们证明移植物和宿主组织之间的相互作用是双向的。移植的NPC通过细胞自主(细胞替代)和非细胞自主(营养)机制对损伤组织产生影响。两种NPC细胞系都分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，尽管比例不同。分化的fbNPC主要由神经元组成，而spNPC主要分化为少突胶质细胞。重要的是，NPC衍生的神经元可能与内源性神经元形成突触并通过将脊柱上的神经元从皮质桥接和传导到它们的脊髓目标(Bonner和Steward,2015)从而改善神经回路传导(Lu等人,2012,2014)。

NPC衍生的少突胶质细胞可能有助于髓鞘再生。spNPC主要分化为Olig2和/或APC阳性的少突胶质细胞。这些细胞可以分化为MBP阳性的髓鞘形成少突胶质细胞(图17B)，我们的EM分析显示移植的spNPC衍生的少突胶质细胞可以有助于裸露的内源性轴突的髓鞘再生(图17B)。SCI后，发生不同程度的脱髓鞘(Karimi-Abdolrezaee等人,2006；Nashmi和Fehlings,2001)，且移植物衍生的髓鞘再生对功能恢复具有重要影响(Karimi-Abdolrezaee等人,2006；Salewski等人,2015)。尽管内源性少突胶质前体细胞或迁移性施万细胞可发生一定程度的自发髓鞘再生(Franklin和Hinks,1999；Stangel和Hartung,2002)，但由于髓鞘形成细胞的最小增殖，其程度是有限的(Li等人,1996)。

SCI后，由于细胞死亡和吞噬细胞清除受损组织而形成囊腔(Dusart和Schwab,1994；Liu等人,1997)。这种脊髓损伤显著影响功能恢复。除了替代丢失的细胞，移植的NPC(主要是fbNPC)有助于形成穿过囊腔的细胞桥。这种细胞桥提供了一个结构基底，其允许损伤的轴突生长到一个容许的环境。向空腔的迁移(亲病灶性)对于形成这种细胞桥非常重要。然而，神经干细胞对损伤部位的趋化反应与其分化状态和趋化因子受体的表达有关(Filippo等人,2013；Imitola等人,2004)。趋化因子，如CXCL12(SDF1)，由SCI后的损伤部位表达，并吸引表达CXCL12受体、CXCR4或CXCR7的细胞(Chen等人,2015；Imitola等人,2004)。事实证明，神经干/祖细胞在其发育的早期阶段显示这些受体的较高表达和较高程度的亲病灶性(Chang等人,2013；Ferrari等人,2012)。这与我们的结果一致，即早期NPC(fbNPC)比spNCE表达更高水平的CXCR4和CXCR7，并且显示更高的向空腔迁移并形成细胞桥的倾向。

除细胞替代外，移植的NPC还为损伤组织提供营养支持。营养因子的分泌通过防止组织损伤和增强内源性神经细胞的存活来促进组织修复。它还重建了神经和胶质细胞之间的功能性相互作用(Ruff等人,2012)。两种NPC细胞系都分泌较高水平的营养因子，如FGF、NT3、NGF和GDNF，它们参与损伤组织的存活和再生。分泌的生长因子的组成在细胞类型之间略有不同，spNPC表达更多的前少突神经生长因子，其有助于髓鞘再生，而fbNPC表达更多的前血管生成因子，其有助于恢复受损组织中的血管分布。

随着对生成具有不同特性的神经干/祖细胞的策略的继续研究，识别用于移植以治疗SCI的细胞的最佳分化状态对于临床转化至关重要。总之，我们的研究表明，人fbNPC和spNPC移植可以通过营养支持和细胞替代发挥积极作用。fbNPC和spNPC均分泌过多的不同营养因子。在fbNPC移植动物中观察到的功能恢复的一部分可归因于在空腔中提供容许的细胞桥以及fbNPC衍生的神经元整合和连接到宿主神经网络中。相反，大部分spNPC的影响似乎是髓鞘再生增强的结果。这两种机制对功能恢复均很重要。需要进一步的实验来确定移植fbNPC和spNPC两者的组合的协同效应。

实验步骤

fbNPC和spNPC的生成和表征

人iPSC(hiPSC)系PB1-53，如前所述(Hussein等人，2011)，在单层培养中使用双重SMAD抑制分化为NPC，并进行了一些修改(Varga等人)。将fbNPC在补充有N2、含有FGF2(10ng/ml)的B27-VA培养基和靶向TGFβ(SB 431542)和WNT信号传导(CHIR 99021)的抑制剂组合的DMEM:F12中维持(Payne等人,2018；Varga等人)。对于spNPC，我们用模式化因子逐步处理来模式化细胞(Lippmann等人,2015)。第一步在补充有B27、N2、FGF2(20ng/ml)、FGF8(200ng/ml)的DMEM:F12培养基中培养3天(Lippmann等人,2015)。然后通过向培养物中补充0.1μM视黄酸激动剂EC23额外培养5天使细胞尾侧化。通过用1μM音猬因子(Shh)激动剂Purmorphamine处理3天使细胞腹侧化。在这个阶段，细胞显示出腹侧脊髓特性。移植前spNPC在含有B27、N2、FGF2(10ng/ml)、EGF(10ng/ml)和740Y-P(1μM)的培养基中维持3代。传代期间，在第1天加入10μM Rock抑制剂(Y-27632)。

实施例1中提供了进一步的细节。

mRNA表达谱

使用定量RT-PCR检测fbNPC和spNPC的表达谱。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen74104)分离mRNA。使用Nanodrop分光光度计评估mRNA的浓度和纯度。使用SensiFAST^TMcDNA合成试剂盒(Bioline 65053)和随机六聚体引物合成cDNA。使用TaqMan设计的引物和SensiFAST Probe Hi-ROX master mix(Bioline 82020)在推荐的热循环参数下在7900HT实时PCR系统上进行RT-PCR。样品一式三份运行。将数值标准化为GAPDH管家基因。为了检查基因表达水平，将结果标准化为GAPDH和参照细胞。使用2^-ΔΔCT方法计算基因表达水平。

脊髓匀浆的制备

损伤后两周，用冰冷的PBS灌注大鼠，并取出以损伤中心为中心的5mm长的损伤脊髓段。对于天然的大鼠，取出与损伤大鼠相同的脊髓区域进行制备。将每组5只大鼠的脊髓合并在1ml DMEM:F12中。使用小锥形研钵和研杵将组织均质化2分钟，同时置于冰上。通过以12000g离心15分钟澄清匀浆，并使用BCA试验测量澄清上清液的总蛋白浓度。调整总蛋白浓度后，将等分试样保存在-80℃下直至使用。

用脊髓匀浆进行体外处理

为了研究损伤诱导因子在体外对NPC系分化潜力的影响，将NPC培养在其不含生长因子的维持培养基上(对于fbNPC不含FGF 2，对于spNPC不含FGF2/EGF)，并用100μg/ml来自损伤的(SCI-h)或天然的

脊髓的澄清匀浆处理30天。然后在室温下用4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和40％蔗糖固定细胞20分钟。固定后，将细胞在0.1％ TritonX-100和0.1％柠檬酸钠的PBS溶液中透性化5分钟(除了O1染色)，然后置于封闭缓冲液(5％BSA)中1小时。用封闭缓冲液稀释一级抗体，并在4℃下与细胞孵育过夜。充分洗涤后，将样品与荧光团缀合的二级抗体孵育1小时。

人生长因子抗体阵列

为了研究fbNPC和spNPC分泌的营养因子的差异，使用基于膜的抗体阵列(Abcam，#ab134002)来比较41种生长因子在由细胞制备的条件培养基中的表达。将fbNPC和spNPC以1×10⁶细胞的等效密度接种在10cm层粘连蛋白涂布的平板上，18小时后收集条件培养基。根据生产商的说明书，将条件培养基与抗体阵列一起孵育，并用生物素缀合抗体和HRP-链霉亲和素一起发育(develop)。

神经球试验

将fbNPC和spNPC以10个细胞/μL的克隆密度接种于其各自的维持培养基w/wo

或SCI-h(100μg/ml)中，培养基的最终体积为500μl，置于未包被的24孔板(Nunc,Rochester,NY)中。在无干扰地培养7天后，对直径＞50μm的神经球进行定量。在成像前，将每个孔的内容物转移至基质胶包被的培养皿中，孵育30分钟，并用4％PFA固定。

细胞增殖试验

将fbNPC和spNPC以1×10³个细胞/100μl/孔的密度接种于层粘连蛋白包被的96孔组织培养板(可移除的条形板(strip plate)，Corning)上，且在接种后12、24、48及72小时如制造商所推荐使用BrdU细胞增殖测定法(Abcam，#ab126556)测定细胞数目。

动物护理

根据加拿大动物护理理事会关于实验动物使用的政策，所有动物实验均获得了动物护理委员会、大学健康网络(Toronto,Ontario,Canada)的批准，并接受了临床兽医的监督。将180-230g的成年Rowett裸(ATN)大鼠(查尔斯河实验室)用于细胞移植。

诱导大鼠脊髓损伤的手术步骤

颈SCI的夹式压迫模型(clip compression model)已经在我们的实验室广泛表征，并如前文所述(Wilcox等人,2014)。简而言之，使用4％异氟烷麻醉ATN大鼠并给予0.05mg/kg丁丙诺啡(buprenorphine)和10ml盐水，并且在手术的剩余时间中用2％异氟烷镇静。大鼠接受C6和C7椎板切除术。在C6脊椎水平将校准为21.5g的改良动脉瘤夹(Walsh,Oakville,Ontario,Canada)在硬膜外应用于脊髓60秒，然后取出。对于假手术组，仅进行了椎板切除术，未进行夹式压迫。在手术步骤结束时，将凝胶泡沫(Ferrosan,Denmark)置于脊髓上，并使用标准丝线逐层缝合切口。使动物在热灯(heat-lamp)下的笼子中恢复，并随后在26℃下以12小时光照-黑暗循环饲养，自由进食和饮水。动物接受广泛的术后护理，包括在损伤前3天在饮用水中加入Clavamox，直至研究结束。对动物给予丁丙诺啡(0.1mg/kg)3天、美洛昔康(1.0mg/kg)3天。损伤的大鼠被给予液体和营养支持，并且根据需要每天三次手动排空它们的膀胱，持续14天。

脊髓内移植

动物随机分为3组，分别于损伤后14天接受4×10⁵fbNPC、spNPC移植或载体(对照)注射。在异氟烷(1-2％)和1：1的O₂/N₂O混合物下，将大鼠置于立体定向框架中，并给予0.05mg/kg丁丙诺啡和10ml盐水，小心地再次暴露损伤。通过用Accutase(0.05ml/cm²细胞培养面积)处理两种NPC系的单层细胞，并在37℃下孵育2分钟，使细胞准备用于移植。然后通过培养基中和Accutase，分离细胞并以400g离心4分钟，重悬于培养基中并计数活细胞。以50,000个细胞/μl的密度将细胞移植到脊髓内。每个部位注射2μl细胞悬液，每只大鼠有4个注射部位(吻侧和尾侧2mm处、中线两侧1.0mm)。以0.6μl/min的速度进行注射，静置2分钟，然后使用Hamilton注射器和立体定位注射系统再额外回缩2分钟(具有Micro4的SystemUMP3 with，World Precision Instruments,Sarasota,FL)。对照组动物也接受相同次数的脊髓注射，仅使用培养基。

组织处理和病变形态测定

在损伤后10周，用异氟烷深度麻醉大鼠，并经心脏灌注180ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和180ml 4％多聚甲醛的PBS溶液。收集后，将脊髓组织固定5小时，然后在30％蔗糖的PBS溶液中冷冻保护24小时。将脊髓段包埋、冷冻并储存在-80℃下。沿着1.5cm长的脊髓部分制备30μm厚的冷冻切片，并在吻侧至尾侧(rostrocaudally)以损伤部位为中心。

连续切片用Luxol Fast Blue(LFB)和苏木精-曙红(H&E)染色。LFB是髓磷脂选择性染色剂，而H&E分别是所有细胞核和细胞质蛋白的染色剂(Nguyen等人,2012)。从-80℃下取出载玻片，在56℃下烘烤15分钟，并在各种培养基中清洗，以准备在56℃下过夜LFB染色。第二天，从烘箱中取出组织，并通过各种洗涤步骤以进行H&E染色。然后，用浓度递增的酒精、二甲苯依次对组织进行脱水并盖上盖玻片。

设盲研究者对以损伤中心为中心的组织±2,440μm进行LFB和H&E分析。使用Stereo Investigator(MBF,Bioscience,Wilson,VT)的Cavalieri体积探针进行无偏测量，以生成保存的白质和病变组织的面积和体积估计(Wilcox等人,2014)。病变组织定义为具有以下异常组织学的区域：小圆囊肿、不规则形状的空泡、白质和灰质以及嗜酸性神经元的结构紊乱。对每240μm的组织切片进行计算和分析。

体内超高分辨率超声(VHRUS)成像

如前所述进行VHRUS和能量多普勒成像(Soubeyrand等人,2014)。在异氟烷麻醉下，将动物置于成像平台(Vevo imaging station,Visualsonics,Toronto,Canada)上的定制稳定框架内。通过中线切口再次暴露损伤部位，并将超声凝胶(Scanning Gel,Medi-Inn,Canada)置于硬脑膜上。用VHRUS探针(44MHz,Vevo 770,Visualsonics,Toronto,Canada)扫描脊髓。使用ImageJ软件和TrakEM2插件分析3D B模式扫描，以生成可再现的空腔体积。对于能量多普勒分析，定义了固定面积的视野，并手动将其置于中心矢状切片的中心。多普勒信号通过图像阈值转换法进行二值化，并对所有矢状切面进行批量分析。将阳性多普勒信号的面积分数乘以实际图像面积，得到每个矢状切片的多普勒阳性面积，最终将其相加，得到每个脊髓的总多普勒面积(称为“功能性血管分布”)。为清楚起见，所有值均已标准化为假损伤多普勒信号。

免疫组织化学和定量

如前所述进行免疫组织化学(Wilcox等人,2014)。首先将冷冻切片在PBS中孵育5分钟，然后于室温下在封闭缓冲液(1％ BSA、5％脱脂牛奶和0.3％ Triton-X 100的PBS溶液)中孵育1小时。去除封闭液后，将一级抗体在4℃下孵育过夜，然后用PBS洗涤三次，每次10分钟(表S1)。冲洗载玻片，并于室温下在适当的荧光二级抗体(均为1：500，ThermoFisher Scientific)中孵育2小时。使用Zeiss LSM 510或LSM880共焦显微镜拍摄图像。

免疫电子显微镜

将冷冻切片与抗GFP小鼠单克隆抗体一起孵育，然后与纳米金缀合的抗小鼠IgG二级抗体(1：100Invitrogen)一起孵育。切片用2.5％戊二醛固定，用0.5％ OsO4后固定，并包埋在环氧树脂中。制备超薄切片(70nm厚)，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜(TEM,JEOL 1400plus)下观察。为了分析突触密度和不对称/对称突触的比率，使用对照-hiPSC-NPC组中的4只大鼠和GDNF-hiPSC-NPC组中的4只大鼠的显微照片组。突触计数表示为100μm膜长度单位上的突触数量。突触参数的估计来自hiPSC-NPC组中的145个突触和GDNF-hiPSC-NPC组中的185个突触。通过使用对称和不对称突触的成熟标准(Gray,1959)，我们在电子显微镜图像上计数了每种类型的突触的数量。

记录体内复合动作电位

在异氟烷麻醉(1.0-1.5％吸入浓度)下进行电生理记录。扭曲的双极刺激电极用聚酰亚胺绝缘不锈钢丝制成，其外径为0.2mm，电极尖端间距为0.1mm(Plastics One,Roanoke,VA,USA)。使用尖端直径为100～120μm的aCSF填充玻璃微电极进行记录。在脊髓段T1的1.2mm深度施加刺激，靶向皮质脊髓背侧束(dCST)。刺激方案包括每10秒输送脉冲宽度为0.1ms且振幅为1.5mA的阴极矩形波。使用PSIU6刺激隔离单元Grass S88刺激器产生刺激脉冲(Grass Technologies,USA)。从脊髓段C4的1.2mm深度记录诱发复合动作电位(CAP)，同样靶向dCST(Li等人,2016)。刺激电极和记录电极之间的间距为10mm。使用Axoprobe 1A放大器(Molecular Devices,CA,USA)在DC模式下记录CAP，并使用pClamp8软件和Digidata1320A(Molecular Devices,CA,USA)以83.33kHz的采样率进行处理。使用2kHz低通滤波器和100Hz高通滤波器进行这些记录。使用Matlab(Math Works,Natick,MA,USA))中的定制编写程序离线进行数据分析，以测量每只动物中诱发CAP反应的峰值振幅和峰值潜伏期。通过将电极间距(10mm)除以测得的峰潜伏期计算CAP传导速度。

行为评估

每个实验组的大鼠每周进行神经行为测试，以评估前肢力量、数字灵活性、躯干稳定性和功能。由两名独立的设盲观察员测量每个参数。使用测力计测量握力来评估前肢力量(García-Alías等人,2009)。躯干和前肢力量使用斜面试验进行评估(Bresnahan等人,1987)，该方法要求大鼠保持站立姿势，同时其下方表面的角度逐渐增加。当大鼠不能再保持其位置5秒时，试验结束。记录大鼠能够保持5秒的最后角度。使用Catwalk步态评估系统(Noldus Information Technology,Wageningen,Netherlands)进行前肢步态分析(Dai等人,2011)，(Miyagi等人,2011)。

统计分析

结果表示为平均值的平均值±标准误差(SEM)或标准偏差(SD)，如图例所示。使用学生t检验分析神经球测定和免疫组织学数据。如图例所示，使用双因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验或单因素ANOVA和Turkey事后检验分析组织形态学和行为数据。所有分析的显著性水平均设定为p＜0.05。使用Prism 6分析数据(GraphPad Software,San Diego,CA)。

实施例3

脊髓-NPC将在任何载体(可以是生理盐水或任何FDA批准的溶剂)中解离成浓度范围为1×10⁴至1×10⁶个细胞/μl的单细胞悬液，或将细胞封装在生物材料/支架或基质中以填充病变空腔。将细胞以规定的速率定向注射到脊髓中。

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Claims

1.一种产生脊髓特性神经祖细胞(spNPC)的方法，所述方法包括：

a.获得后侧化NPC，任选地其中所述后侧化NPC由以下方法获得：

在补充有FGF2激动剂(任选地为FGF2)、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的培养基中孵育解离的未模式化的神经祖细胞(NPC)，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的至少一种脑标记物(如Gbx2、Otx2和FoxG1)的后侧化NPC；

b.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))和任选地Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a或BML-284盐酸盐)的培养基中传代后侧化NPC并孵育后侧化NPC，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的至少一种Gbx2、Otx2和FoxG1水平的尾侧化NPC；

c.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))的合适培养基中传代尾侧化NPC；以及

2.一种引发未模式化的NPC以停留在外胚层细胞命运中的方法，所述方法包括：

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

ii.任选地向培养基中加入Notch信号传导激活剂(任选地为DLL4)，以维持未模式化的NPC在外胚层命运中。

3.根据权利要求1或2所述的用于由未模式化的NPC产生spNPC的方法，所述方法包括：

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

ii.任选地向培养基中加入Notch信号传导激活剂(优选地为DLL4)，以维持未模式化的NPC在外胚层命运中；以及

c.模式化引发的未模式化的NPC以产生spNPCS，所述方法包括：

i.在补充有B27、N2、FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的培养基中解离引发的未模式化的NPC并孵育引发的未模式化的NPC，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的至少一种脑标记物(如Gbx2、Otx2和FoxG1)的后侧化NPC；

ii.在补充有B27、N2、RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))和Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a、AZD2858、Wnt激动剂、CP21R7(CP21)、Wnt或BML-284盐酸盐)的培养基中传代后侧化NPC并孵育，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的至少一种脑标记物(如Gbx2、Otx2或FoxG1)水平的尾侧化NPC；

iii.在补充有B27、N2、RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))的培养基中传代尾侧化NPC并孵育尾侧化NPC；以及

iv.在补充有FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)、

EGF受体激动剂(任选地为EGF或NSC228155)和740Y-P或740Y-P合成激动剂的合适培养基中，将步骤iii)的尾侧化NPC再传代2至3代，直到NPC的特性稳定为spNPC；

4.根据权利要求1或2所述的用于产生spNPC的方法，所述方法包括：

a.由诱导性多能干细胞(iPSC)产生未模式化的NPC，所述方法包括：

i.在iPSC培养基中传代iPSC并孵育所述细胞约2天，例如36小时至4天，任选地所述培养基包含BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、FGF2激动剂、Wnt抑制剂；

ii.在不含FGF2激动剂(任选地不含FGF2)的iPSC培养基中培养iPSC约4天，其中在约第2天，例如约36小时至约4天后，将BMP抑制剂或双重SMAD抑制剂加入培养基；

iv.在含FGF2激动剂(任选地为FGF2或SUN11602)的NIM中培养步骤iii的EB约7至约11天以产生神经玫瑰花状结构，其中在约第2天从培养基中除去BMP抑制剂或双重SMAD抑制剂，以产生未模式化的NPC；

b.引发步骤a的未模式化的NPC，所述方法包括：

i.将EGF-L7激动剂(优选地为EGF-L7)加入到步骤a的包含未模式化的NPC的培养基中；以及

ii.任选地向培养基中加入Notch信号传导激活剂(任选地为DLL4)，以维持未模式化的NPC在外胚层命运中；以及

c.模式化引发的未模式化的NPC以产生spNPCS，所述方法包括：

i.在补充有FGF2激动剂、FGF8激动剂(任选地为FGF8)的合适培养基中解离引发的未模式化的NPC并孵育引发的未模式化的NPC，以产生与未模式化的NPC相比表达更高水平的至少一种Hox基因(任选地为HoxA4和/或HoxA5)和更低水平的包括Gbx2、Otx2和/或FoxG1的脑标记物的后侧化NPC；

ii.在补充有RAR激动剂(任选地为RA或RA合成类似物(任选地为EC23))和Wnt信号传导激活剂(任选地为Wnt3a、AZD2858、Wnt激动剂1、CP21R7(CP21)、Wnt或BML-284盐酸盐)的合适培养基中传代后侧化NPC并孵育后侧化NPC，以产生与后侧化NPC相比表达降低水平的至少一种脑标记物(如Gbx2、Otx2和FoxG1)水平的尾侧化NPC；

iv.在补充有FGF2或SUN11602、EGF或NSC228155和740Y-P或740Y-P合成激动剂的合适培养基中传代步骤iii)的尾侧化NPC，直到NPC的特性稳定为spNPC；

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述iPSC为人iPSC(hiPSC)。

6.根据权利要求1、3或4中任一项所述的方法，其中将所述未模式化的NPC孵育约3天。

7.根据权利要求1、3-4或6中任一项所述的方法，其中将所述后侧化NPC额外孵育约3天。

8.根据权利要求1、3-4或6-7中任一项所述的方法，其中将所述尾侧化NPC额外孵育约2天。

9.根据权利要求1、3-4或6-8中任一项所述的方法，其中所述FGF2在用于产生后侧化NPC的培养基中的浓度为约20ng/ml至约400ng/ml，任选地为约20ng/ml至约150ng/ml，任选地为约40ng/mL。

10.根据权利要求1、3-4或6-9中任一项所述的方法，其中所述FGF8的浓度为约50ng/ml至约400ng/ml，例如为约200ng/mL。

11.根据权利要求1、3-4或6-10中任一项所述的方法，其中所述RA合成类似物为约0.1μM EC23。

12.根据权利要求1、3-4或6-11中任一项所述的方法，其中所述Wnt3a浓度为约100μg/ml。

13.根据权利要求1、3-4或6-12中任一项所述的方法，其中所述用于传代NPC直至NPC的特性稳定的培养基中的FGF2浓度为约10ng/ml。

14.根据权利要求1、3-4或6-13中任一项所述的方法，其中所述EGF浓度为约10ng/ml。

15.根据权利要求1、3-4或6-14中任一项所述的方法，其中所述740Y-P浓度为约1μM。

16.根据权利要求1、3-4或6-15中任一项所述的方法，其中所述FGF8激动剂为FGF8b。

17.根据权利要求1、3-4或6-16中任一项所述的方法，其中所述未模式化的NPC为起始神经祖细胞，其表达Sox2、Pax6、巢蛋白和至少一种脑标记物，任选地为至少一种Otx2、Foxg1或Gbx2。

18.根据权利要求1、3-4或6-17中任一项所述的方法，其中所述未模式化的NPC衍生自胎儿细胞，任选地获自胚胎或胎儿。

19.根据权利要求2-18中任一项所述的方法，其中所述EGF-L7激动剂为EGF-L7，并且任选地EGF-L7的浓度为约10ng/mL。

20.根据权利要求2-19中任一项所述的方法，其中所述DLL4的浓度约为0.5μM。

21.一种分离的细胞群，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的方法产生的spNPC，任选地其中所述spNPC衍生自患者，任选地为脊髓损伤患者，任选地其中所述分离的细胞群用于移植，任选地为自体移植。

22.一种组合物，其包含根据权利要求21所述的分离的细胞群和药学上可接受的载体，任选地为培养基或基质，或冷冻培养基，任选地为GMP级、无异源培养基和/或无菌的。

23.根据权利要求22所述的组合物的权利要求21所述的细胞群，其用于治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者。

24.一种治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者的方法，或用于制备治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者的药物的方法，所述方法包括给予本文中权利要求21所述的分离的细胞群或权利要求22所述的组合物以治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者，或用于制备用于治疗患有脊髓损伤或神经退行性疾病的受试者的药物。

25.根据权利要求23所述的细胞群或组合物或根据权利要求24所述的方法，其中所述脊髓损伤是颈、胸或腰脊髓损伤，任选地为急性或慢性。

26.根据权利要求23所述的细胞群或组合物或根据权利要求24所述的方法，其中所述神经退行性疾病为多发性硬化(MS)、脑瘫(CP)、帕金森症、阿尔茨海默症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、弗里德希氏共济失调、路易体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、颅神经疾病、外周感觉神经病、癫痫、朊病毒病、克雅二氏症、阿尔珀病、小脑/脊髓小脑变性、贝敦氏症、皮质基底变性、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和/或自闭症。

27.根据权利要求1所述的生成具有脊髓特性的人神经干/祖细胞或神经前体细胞(spNPC)的方法，其包括以下步骤：

e)优选地通过使用EGF-L7或其激动剂(例如组合：DLK1或DAPT(以抑制Notch)、NSC228155或β细胞素(以激活EGFR)、A-205804(以抑制ICAM-1)、以及硼替佐米和甲基巴多索隆(以抑制NF-κB))来引发神经外胚层细胞停留在外胚层细胞命运中，并通过DLL4或任何Notch信号传导激活分子激活Notch信号传导，

f)在高浓度的FGF2激动剂(优选地为FGF2)和FGF8激动剂(优选地为FGF8)(例如对于FGF2或FGF8，大于20ng/ml且最高达约400ng/mL)中后侧化e)中引发的细胞；

28.一种细胞培养组合物，其用于在体外由多能干细胞衍生权利要求27所述的脊髓NPC的步骤，其中所述脊髓NPC表达Sox2、Pax6、巢蛋白或波形蛋白的一种或多种可检测的标记物，并且脊髓NPC具有分化为神经谱系细胞的能力，其包含基础细胞培养组合物，任选地其中每个步骤所述的基础细胞培养组合物如表1中所提供，并且还包含EGF-L7激动剂(任选地为EGF-L7)，如权利要求27e所述用于引发神经外胚层细胞停留在外胚层细胞命运中；FGF2激动剂(优选地为FGF2)和/或FGF8激动剂(优选地为FGF8)，如权利要求27e)所述用于后侧化引发的细胞；RAR激动剂(任选地为RA)或Wnt3a，如权利要求27g所述用于尾侧化所述后侧化细胞；和/或740Y-P，如权利要求27h所述用于诱导增殖能力，任选地在本文所述的浓度或浓度范围内。

29.根据权利要求28所述的细胞培养组合物，其用于将人多能干细胞分化为脊髓NPC，其中用于每个步骤的基础培养基在表1中描述。

30.根据权利要求4-29中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述BMP抑制剂选自：头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347、和LDN-212854、DMH1SB431542、LDN-193189、PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、GW788388、GW6604、SB-505124、乐德木单抗、美替木单抗、GC-I008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI6、NPC-30345、

SB-203580、SD-093、激活素-M108 A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、盐酸多索吗啡和其衍生物及其组合，优选地选自头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347、或LDN-212854、DMH1及其组合。

31.根据权利要求4-29中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述双重SMAD抑制剂包含选自以下的TGFβ抑制剂：SB431532、PD169316、Galunisertib(LY2157299)或LY3200882及其组合；和选自以下的BMP抑制剂：头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347、和LDN-212854、DMH1、SB431542、LDN-193189、PD169316、SB203580、LY364947、A77-01、A-83-01、GW788388、GW6604、SB-505124、乐德木单抗、美替木单抗、GC-I008、AP-12009、AP-110I4、LY550410、LY580276、LY364947、LY2109761、SB-505124、E-616452(RepSox ALK抑制剂)、SD-208、SMI 6、NPC-30345、

SB-203580、SD-093、激活素-M108 A、P144、可溶性TBR2-Fc、DMH-1、盐酸多索吗啡或其衍生物及其组合，优选地选自头蛋白、多索吗啡、LDN-193189、ML347或LDN-212854、DMH1及其组合。

32.根据权利要求4-31中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述Wnt抑制剂选自XAV939、DKK1、DKK-2、DKK-3、Dkk-4、POCN抑制剂、C59、LGK-974、SFRP-1、SFRP-2、SFRP-5、SFRP-3、SFRP-4、WIF-1、Soggy、IWP-2、IWR1、ICG-001、KY0211、Wnt-C59、LGK974、1WP-L6和其衍生物及其组合。

33.根据权利要求27-32中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述多能干细胞为人多能干细胞。

34.根据权利要求27-33中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述人多能干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。

35.根据权利要求4-34中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述TGFβ抑制剂为SB431542或A-83-01。

36.根据权利要求4-35中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述Wnt抑制剂为POCN。

37.根据权利要求4-35中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述Wnt抑制剂为C59或LGK-974。

38.根据权利要求4-37中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述BMP抑制剂为LDN193189。

39.根据权利要求27-38中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述培养基还含有血清或血清替代物。

40.根据权利要求27-39中任一项所述的方法、细胞群、组合物或细胞培养组合物，其中所述培养基包含ROCK抑制剂。

41.根据权利要求27-40中任一项所述的方法产生的人多能干细胞衍生的脊髓神经干/祖细胞(spNPC)的分离群体，其特征在于，所述脊髓神经干细胞表达巢蛋白、Sox2、Pax6中的至少一种，任选地其中所述spNPC包含与常规神经干细胞(NSC)相似的表型并至少表达一种Hox基因(优选地为Hox A4或Hox A5)。

42.根据权利要求41所述的spNPC群体，其中至少一种培养的细胞表达一种可检测的标记物(HoxA4或HoxA5)连同一种或多种选自巢蛋白、Sox2和Pax6的可检测的标记物，其中神经干/祖细胞中HoxA4的表达量与常规衍生的前脑NPC中HoxA4的表达量相比增加至少50％。

43.一种组合物，其包含权利要求41或42所述的分离的细胞群和载体，任选地为药学上可接受的载体，任选地为培养基或基质，任选地为GMP级、无异源培养基或无菌的。

44.根据权利要求41所述的分离的细胞群，其中所述细胞是后侧化细胞，并且与未模式化的细胞或fbNPC相比表达更多的Hox基因(例如HoxA4和/或HoxA5)，并且表达更少的脑标记物(例如Gbx2、Otx2和FoxG1)。

45.根据权利要求41-42或44中任一项所述的spNPC群体，其中所述spNPC分化为神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。

46.根据权利要求41-42或44-45中任一项所述的spNPC群体或权利要求43所述的组合物在制备用于治疗神经退行性疾病的脊髓损伤的药物中的用途。

47.根据权利要求23-24或46中任一项所述的用途，其中所述spNPC用于移植到患者的脑或脊髓中。

48.根据权利要求46-47中任一项所述的用途，其中所述神经退行性疾病为多发性硬化、脑瘫、帕金森症、阿尔茨海默症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、弗里德希氏共济失调、路易体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、颅神经疾病、外周感觉神经病、癫痫、朊病毒病、克雅二氏症、阿尔珀病、小脑/脊髓小脑变性、贝敦氏症、皮质基底变性、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和/或自闭症。

49.一种治疗神经退行性疾病的脊髓损伤的方法，所述方法包括向需要其的患者给予权利要求41-42或44-45中任一项所述的spNPC群体或权利要求43所述的组合物。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述spNPC用于移植到患者的脑或脊髓中。

51.根据权利要求49-50中任一项所述的方法，其中所述神经退行性疾病为多发性硬化、脑瘫、帕金森症、阿尔茨海默症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、弗里德希氏共济失调、路易体病、脊髓性肌萎缩、多系统萎缩、痴呆、精神分裂症、麻痹、多发性硬化、脊髓损伤、脑损伤(例如，中风)、颅神经疾病、外周感觉神经病、癫痫、朊病毒病、克雅二氏症、阿尔珀病、小脑/脊髓小脑变性、贝敦氏症、皮质基底变性、贝尔氏麻痹、格林-巴利综合征、皮克病和/或自闭症。