JP7285591B2 - 体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患の予防または治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法 - Google Patents

体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患の予防または治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法 Download PDF

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Description

本発明は、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法に関する。
臨床等級の細胞を得るのは、疾病モデリングおよび薬物効能検査だけでなく、様々な神経疾患に対する治療におけるその細胞の適用という点から大いに重要性がある。ヒトiPSCおよびES細胞から異なる系統に相当する生理活性細胞を得ることが可能であるが、これら細胞の広範囲な適用は入手可能性、免疫感受性、機能的完全性、腫瘍発生危険および効率性の問題に関連する問題によって阻害される(1-3)。したがって、適当な免疫型一致供与体(immunotype-matched donor)由来細胞の移植が極めて重要な挑戦課題になる。
シュワン細胞(SC)は末梢神経系の主な神経膠細胞であって、いくつかの神経栄養因子を分泌しながら神経の健康を促進して効率的な神経伝導に寄与するうえで極めて重要な役割を果たす。また、SC細胞は末梢神経損傷後の神経再生過程に必須の役割を果たすので、損傷した神経部位へのSC細胞の移植は軸索再生を強化して、PNSおよびCNS損傷患者に治療的利点を提供するうえでの唯一の実行可能な治療法であり得る。
シュワン細胞が多くの神経疾患において唯一の選択であり得るが、移植可能なシュワン細胞を十分に得るうえでの主な困難は、かかる治療のための自己組織または同種異型のシュワン細胞が不足するということである。多くの場合、患者または同種異型供与者の健康な神経が移植可能なシュワン細胞のソースとして切除されなければならない。また、最終分化細胞である、培養されたシュワン細胞は増殖能力が制限されるので、任意の長期間の治療効果を達成するのに十分な細胞の量が制限される。
iPSC細胞の場合、誘導されたシュワン細胞は、神経堤の効率的な誘導および後の、複雑な培地条件および成長因子を有するシュワン細胞への分化に依存する。これに対し、神経幹細胞および機能性ニューロンへの体細胞の分化は、マスター転写因子であるSOX10およびKrox20の強制発現により達成される。このため、大韓民国公開公報第10-2017-0045356号では、遺伝子発現産物を導入して製造されたシュワン細胞に対する技術が開示されているが、このような遺伝子発現産物の導入は一部の局面では効果的であり得るが、ウイルスベクター媒介遺伝子伝達、後続の遺伝子組換えおよび副作用の危険のため、臨床での広範囲な使用において問題があった。
また、低分子化合物を用いた直接分化技術も開発されているが、従来の低分子化合物を適用して分化した細胞の場合、低分子物質が除去されれば再び元の細胞に戻る可能性があり、細胞治療剤としての開発に限界があるという点が指摘されている。
大韓民国公開公報第10-2017-0045356号
本発明は、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法に関する。
本発明は、従来技術上の問題点を解決して、遺伝子の組換えなくても分化可能であり、体細胞から化合物カクテルの処理だけでヒトおよび/動物に由来する神経膠細胞(neuroglial cell)のように損傷した神経の再生および/または回復のみならず、神経自体の保護活性を有する新規な神経膠様細胞(glia-like cell、GLC)を提供する。ここで、神経膠細胞とは、突起膠細胞あるいは希突起膠細胞(oligodendroglia)、星膠細胞あるいは星状膠細胞(astrocyte)、シュワン細胞(Schwann cells)、小膠細胞あるいは微小膠細胞(microglia)、衛星細胞(satellite cell)および上衣膠細胞(ependymal cell)などを含む。
本発明は、体細胞から分化してHGF20000pg/ml以上を分泌する神経膠様細胞を提供する。
また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導する分化誘導段階を含むものである、体細胞から分化した神経膠様細胞を提供する。
また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む神経膠様細胞製造用カクテル組成物を提供する。
また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導する分化誘導段階を含むものである、体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法を提供する。
また、本発明は、上述した体細胞から分化した新規な神経膠様細胞を有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤を提供する。
また、本発明は、上述した体細胞から分化した神経膠様細胞を投与して神経疾患を予防および治療する方法を提供する。
本発明において、神経膠細胞とは、突起膠細胞あるいは希突起膠細胞(oligodendroglia)、星膠細胞あるいは星状膠細胞(astrocyte)、シュワン細胞(Schwann cells)、小膠細胞あるいは微小膠細胞(microglia)、衛星細胞(satellite cell)および上衣膠細胞(ependyal cell)などを意味する。本発明が提供する新規な神経膠様細胞は、生体内に存在する神経膠細胞の神経再生、復旧および/または保護機能を有するものである。
また、本発明は、分化能のない体細胞を直接分化させるため、従来の細胞治療剤の開発に使用されている胚幹細胞、逆分化幹細胞のような全分化能細胞に比べて、癌発生の可能性がない新規な神経膠様細胞を提供することを目的とする。
また、本発明は、低分子化合物のみを使用するため、従来の遺伝子組換えによって行われる分化方法に対比して、遺伝体変形の可能性が少なく、その分化期間が短縮され、分化価格が割安であり、優れた効率で体細胞から分化した神経膠様細胞を提供可能な新規な神経膠様細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
さらに、本発明は、分化した細胞を低分子化合物のない一般の培養液で継代培養可能な安定した細胞に維持できる再培養技術を提供することにより、従来の低分子化合物を用いた直接分化の欠点の1つである分化細胞の不安定性を克服することを目的とする。
また、本発明は、損傷した神経細胞を優れた効率で復旧、再生および/または回復可能であり、神経細胞自体を保護する活性を有する体細胞から分化した新規な神経再生保護機能細胞を含む神経疾患の予防および/または治療用細胞治療剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、患者の体細胞を直接分化させて神経疾患に対する細胞治療剤として使用できるため、従来使用あるいは研究されている幹細胞を用いた細胞治療剤とは異なり、免疫拒絶反応のない細胞治療剤を提供することを目的とする。
本発明は、化合物カクテルを用いた体細胞の分化、逆分化および/または交差分化は、伝達、再現性および効率的な拡張性を含む適用の容易な利点があり、また、最も重要なことは、任意の遺伝子組換えなくても臨床目的で容易に外挿(extrapolation)可能な効果を提供することができる。
なお、本発明は、従来の遺伝子組換えによって行われる分化方法に対比して、その期間が短縮され、優れた効率で体細胞から分化した神経膠様細胞を製造できる方法を提供することを効果とする。
図1は、線維芽細胞(fibroblast)が新規な神経膠様細胞(以下の実施例およびこれに対応する図面では、具体的には、「Glia-like Cell」という。あるいは略記して「GLC」)に分化する化学ベースの転換方式の概要に関する図である。分化は3段階(Step I:Induction、Step II:Maturation、Step III:Reculture)からなるが、一番目の分化誘導段階で、第1化合物カクテルを用いて線維芽細胞を神経膠様細胞に転換させ、二番目の成熟(maturation)段階で、第2化合物カクテルを用いて転換された神経膠様細胞を成熟させる。最後の三番目の段階である再培養段階では、分化に使用される化合物(chemical)のない培養液で安定した細胞を培養する。この時、二番目のmaturation段階が必ずしも必要なわけではない。 図2は、神経膠様細胞への分化に使用された化合物に関する図である。 図3は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する図である(図2のVCRFPT6個の化合物を含む、第1化合物カクテルで分化誘導された後、CRF3個の化合物を含む第2化合物カクテルで成熟した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関するものである;Scale bar=100μm)。 図4は、VCRFTを含む化合物カクテルで分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであ(Scale bar=100μm)。 図5は、第1化合物カクテルの構成のうちCRFPTのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり(Scale bar=100μm)、分化効率が低下することを確認する。 図6は、第1化合物カクテルの構成のうちVRFPTのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり(Scale bar=100μm)、分化効率が低下することを確認する。 図7は、第1化合物カクテルの構成のうちVCFPTのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり(Scale bar=100μm)、分化効率が低下することを確認する。 図8は、第1化合物カクテルの構成のうちVCRPTのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり(Scale bar=100μm)、分化が行われないもので、「F」(Forskolin)がない場合、分化が全く行われないことを確認することにより、「F」が分化に必要であることを確認した。 図9は、第1化合物カクテルの構成のうちVCRFTのみから構成されたカクテル化合物で分化誘導された、新規な神経膠様細胞の形態学的特性に関するものであり(Scale bar=100μm)、分化効率が低下することを確認する。 図10は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する写真であり、化合物カクテルVCRFの組み合わせで進行させて体細胞から神経膠様細胞への分化効率が低下することを確認した。 図11は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する写真で、第1カクテル化合物の組み合わせであるVCRFPを含んで体細胞から神経膠様細胞への分化がうまく行われることを確認した。したがって、線維芽細胞の神経膠様細胞の分化は「T」なくても起こり得ることを確認した(Scale bar=100μm)。 図12は、神経膠様細胞への分化に使用される他の種類の化合物に関する図である。図2の化合物と同じ機能を有する化合物を使用した。 図13は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞の形態学的特徴に関する図である。図6の化合物の組み合わせによる第1化合物カクテルで線維芽細胞から分化誘導された新規な神経膠様細胞の形態学的特徴を示す(Scale bar=100μm)。 図14は、ヒト線維芽細胞を神経膠様細胞に分化させるための化合物ベースの転換方式に対するプロトコルに関するもので、分化誘導段階を3日に固定後に成熟させる段階を変化する方式に関するものである。 図15は、ヒト線維芽細胞を神経膠様細胞に分化させるための化合物ベースの転換方式に対するプロトコルに関するもので、分化誘導段階の日数を変化する方式後に成熟させる段階を含む方式に関するものである。 図16は、ヒト線維芽細胞を神経膠様細胞に分化させるための化合物ベースの転換方式に対するプロトコルに関するもので、化合物カクテル処理なしに再培養(re-culture)する段階を含む方式に関するものである。 図17は、顕微鏡写真であってヒトのシュワン細胞の形態に関する写真である。 図18は、プロトコル1で製造された神経膠様細胞(C1-GLC)に関する写真であり、第1カクテル化合物でVCRFPT組み合わせ、第2化合物カクテルでCRF処理し、ヒトのシュワン細胞(図17)とほぼ類似の形態を備えたが、線維芽細胞(図21)とは異なる形態を有することを確認した。 図19は、プロトコル2で製造された神経膠様細胞(C2-GLC)に関する写真であり、第1カクテル化合物でVCRFPT組み合わせ、第2化合物カクテルでCRF処理し、ヒトのシュワン細胞(図17)とほぼ類似の形態を備えたが、線維芽細胞(図21)とは異なる形態を有することを確認した。 図20は、プロトコル3で製造された神経膠様細胞(C3-GLC)に関する写真であり、第1カクテル化合物でVCRFPT組み合わせ、第2化合物カクテルでCRF処理し、ヒトのシュワン細胞(図17)とほぼ類似の形態を備えたが、線維芽細胞(図21)とは異なる形態を有することを確認した。 図21は、顕微鏡写真であって体細胞の線維芽細胞に対する写真である。 図22は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、22Aは、分化に使用した線維芽細胞(Human Fibroblast)、22Bは、分化した神経膠様細胞(Class3 Glia-like cell、C3-GLC)、22Cは、シュワン細胞(Human Schwann cell)の形態学的特徴に関する図である。各細胞の形態学的な特徴を示すために代表的な形態を示すいくつかの細胞の外郭を赤い点線で表示した(Scale bar=100μm)。 図23は、マイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差別的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のunsupervised clusteringに対する図である(N_Hum_Schw:ヒトシュワン細胞;N_fibroblast:線維芽細胞;N_SC_12d:C1-GLC(6+3);N_SC_9d:Cl_GLC(6+6))。分化した細胞とシュワン細胞ではシュワン細胞のマーカーが発現しているが、線維芽細胞ではシュワン細胞のマーカーがほとんど発現しないことを確認できるもので、より具体的な発現物質に関する図面は以下に記載した(図71~74)。 図24は、マイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差別的に発現する突起膠細胞(Oligodendrocyte)マーカー遺伝子のunsupervised clusteringに対する図である(N_Hum_Schw:ヒトシュワン細胞;N_fibroblast:線維芽細胞;N_SC_12d:C1-GLC(6+3);N_SC_9d:C1-GLC(6+6))。分化した細胞で突起膠細胞から発現する多くの遺伝子が発現しているが、線維芽細胞では突起膠細胞のマーカーが発現しておらず、シュワン細胞では突起膠細胞のマーカーの一部が発現していることを確認することができる。 図25は、マイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差別的に発現する星膠細胞(Astrocyte)マーカー遺伝子のunsupervised clusteringに対する図である(N_Hum_Schw:ヒトシュワン細胞;N_fibroblast:線維芽細胞;N_SC_12d:C1-GLC(6+3);N_SC_9d:C1-GLC(6+6))。分化した細胞で星膠細胞から発現する多くの遺伝子が発現しているが、線維芽細胞では星膠細胞のマーカーが発現しておらず、シュワン細胞では星膠細胞のマーカーの一部が発現していることを確認することができる。 図26は、C1-GLC(6+6)のマイクロアレイにより発現が増加する遺伝子を機能的に分類した時、astrocyteおよびmicrogliaのような神経膠細胞で発現するサイトカインの発現が増加する結果を示す。 図27は、分化誘導段階の日数と成熟させる段階の日数が異なる神経膠様細胞(GLC)、線維芽細胞(fibroblast)およびヒトシュワン細胞(Human Schwann cell)で発現するマーカーとして使用される遺伝子のマイクロアレイの結果に関する図である。(A)神経膠細胞のマーカー遺伝子の発現、(B)線維芽細胞のマーカー遺伝子の発現。 図28は、免疫蛍光法(immunofluorescence)で示したC1-GLCに関するもので、A、B、Cはそれぞれ神経膠細胞のマーカーとしてS100、P0(MPZ)、GFAPを使用した写真である。核を染色するには共通してDAPIを使用した(Scale bar=100μm)。 図29は、免疫蛍光法(immunofluorescence)で示したC3-GLCに関するもので、神経膠細胞のマーカーとしてGFAP(緑色)を使用した写真である。核を染色するにはDAPI(青色)を使用し、増殖中の細胞を染色するためにはEDU(赤色)を使用した(Scale bar=50μm)。 図30は、プロトコルIによって分化した神経膠様細胞と体細胞および線維芽細胞における線維芽細胞のマーカー遺伝子の発現結果に対する具体的なグラフであって、発現程度はRT-PCRによって発現レベルが測定されて比較された。 図31は、プロトコルIIによって分化した神経膠様細胞と体細胞および線維芽細胞における線維芽細胞のマーカー遺伝子の発現結果に対する具体的なグラフであって、発現程度はRT-PCRによって発現レベルが測定されて比較された。 図32は、プロトコルII、IIIによって分化した神経膠様細胞と体細胞および線維芽細胞における神経膠細胞のマーカー遺伝子の発現結果に対する具体的なグラフであって、発現程度はRT-PCRによって発現レベルが測定されて比較された。 図33は、神経膠様細胞の培養液に分泌されたサイトカインおよび成長因子の量を分析した図である。MIF、CXCL12、IL8、BDNF、GRO-alpha、HGFなどが神経膠様細胞から線維芽細胞(fibroblast)に対比して過剰分泌されていることを確認することができる。神経保護および再生機能を有すると知られたMLF、BDNF、HGFなどはヒトシュワン細胞(hSC)に対比してより多い量が神経膠様細胞で発現することを確認することができる。 図34は、プロトコルI、II~IIIによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が28.2cmである60mm culture dishで3.2x10 cellsを3日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をELISAを用いて測定した。 図35は、プロトコルI、II~IIIによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が28.2cmである60mm culture dishで3.2x10 cellsを3日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をELISAを用いて測定した。 図36は、プロトコルI、II~IIIによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が28.2cmである60mm culture dishで3.2x10 cellsを3日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をELISAを用いて測定した。 図37は、プロトコルI、II~IIIによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が28.2cmである60mm culture dishで3.2x10 cellsを3日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をELISAを用いて測定した。 図38は、プロトコルI、II~IIIによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が28.2cmである60mm culture dishで3.2x10 cellsを3日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をELISAを用いて測定した。 図39は、プロトコルI、II~IIIによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたサイトカインおよび成長因子に対する量的分析グラフである。面積が28.2cmである60mm culture dishで3.2x10 cellsを3日間育てる間に培地に分泌されたタンパク質の量をELISAを用いて測定した。 図40の40Aは、体細胞(線維芽細胞)培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、40Bは、線維芽細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。 図41のAは、プロトコルIで分化させたC1-GLC(6+6)神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Bは、プロトコルIで分化させたC1-GLC(6+6)神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。 図42のAは、プロトコルIIで分化させたC2_GLC(15+3)神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Bは、プロトコルIIで分化させたC2-GLC(15+3)神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。 図43のAは、プロトコルIIIで分化させたC3_GLC(6+3+12)神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Bは、プロトコルIIIで分化させたC3-GLC(6+3+12)神経膠様細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。 図44のAは、シュワン細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細の神経突起成長の代表される顕微鏡写真に関するものであり、Bは、NSC34シュワン細胞培養液で処理されたモーターニューロンNSC34細胞の神経突起の長さの定量分析グラフである。 図45は、神経膠様細胞への転換率に対するもので、GFAPの発現を示す細胞によって測定されたところにより85%の収率を示す。 図46は、再培養された細胞が示す増殖特性に関するもので、細胞増殖能力の推定値としての、プロトコルIIIで分化させたC3-GLC(6+3+12)神経膠様細胞のEdU染色程度(A、赤色)を示すものである。(B)は、Hoechst33342染色(青色)として核を表示し、(C)は、(A)と(B)を重ねた写真である(Scale bar=50μm)。 図47は、EdU陽性細胞の比率に対する定量的グラフに関する図である。エラーバー(Error bar)は、平均の標準誤差(standard error of mean;SEM)を意味する。 図48は、顕微鏡によって観察された写真に関するもので、凍結後に解凍したC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の形態学的特徴に関する図である。凍結および解凍過程を進行させても細胞形態の側面で変化がないことを示す図である(Scale bar=50μm)。 図49は、プロトコルI、II~IIIによって製造されたそれぞれ異なる神経膠様細胞から分泌されたHGFをELISAを用いて測定した量的分析グラフである。特に、C3-GLC(6+3+6)およびC3-GLC(6+3+12)の場合、細胞を凍結してから(F、freezing)解凍(T、thawing)した後、細胞を育てながら分泌されるHGFを測定した(FT)。凍結および解凍過程を進行させてもHGF発現の側面で大きな変化がないことを示す図である。 図50は、凍結および解凍過程を進行させても細胞形態および神経突起の成長の側面で変化がないことを示す図で、プロトコルIIIのC3-GLC(6+3+12)神経膠様細胞培養液でのNSC34細胞の神経突起の成長写真である(Scale bar=100μm)。 図51は、凍結および解凍過程を進行させても細胞形態および神経突起の成長の側面で変化がないことを示す図で、プロトコルIIIのC3-GLC(6+3+12)神経膠様細胞培養液でのNSC34細胞の神経突起成長の定量分析に関するグラフである。 図52は、ロータロッド分析に関するグラフである。ネズミの大腿部神経を損傷させて慢性狭窄モデル(rat chronic constriction injury、CCI、model)を作り、損傷した神経にヒトの線維芽細胞、ヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、8週後に神経再生程度をrotaros分析により測定した。FB(Fibroblast、線維芽細胞)、SC(Schwann cell、シュワン細胞)、G3、G4、G5(C1-GLC)の場合、G2(無処理)、G6(線維芽細胞処理)、G7(ヒトシュワン細胞処理)に比べて神経再生がうまく行われたことを確認することができる。特に、G5(C1-GL 6+6)の場合、神経再生が最もよく行われていることを確認することができる。 図53は、EMG分析に関するグラフである。図37と同じ条件で実験を行い、神経再生程度をelectromyogram(EMG)で分析した。同じく、G5(C1-GLC(6+6)処理)の場合、G2(無処理)、G6(線維芽細胞処理)、G7(ヒトシュワン細胞処理)に比べて最も神経再生がよく行われたことを確認することができる 図54は、髄鞘化された神経の写真である。図52と同じ条件で実験をし、神経再生程度を髄鞘化された神経の分布で確認することができる。G5(C1-GLC(6+6)処理)の場合、G2(無処理)、G6(線維芽細胞処理)、G7(ヒトシュワン細胞処理)に比べて髄鞘化が最もよく行われたことを確認することができる。 図55は、図54の写真において髄鞘化された神経を定量的グラフで表現したものである。G5(C1-GLC(6+6)処理)の場合、G2(無処理)、G6(線維芽細胞処理)、G7(ヒトシュワン細胞処理)に比べて髄鞘化された神経が最も多いことから、神経再生が最もよく行われたことを確認することができる。 図56は、髄鞘化された神経の電子顕微鏡写真である。図52と同じ条件で実験をし、神経再生程度を神経の髄鞘化程度で確認することができる。G5(C1-GLC(6+6)処理)の場合、G2(無処理)、G6(線維芽細胞処理)、G7(ヒトシュワン細胞処理)に比べて髄鞘化が最もよく行われたことを確認することができる。 図57は、図56の電子顕微鏡写真において神経の髄鞘化程度を髄鞘の厚さを定量化してグラフで表現したものである。G5(C1-GLC(6+6)処理)の場合、G2(無処理)、G6(線維芽細胞処理)、G7(ヒトシュワン細胞処理)に比べて髄鞘の厚さが最も厚いことから、神経再生が最もよく行われたことを確認することができる。 図58は、神経膠様細胞誘導過程で使用される化合物カクテルに含まれた6種類の化合物の濃度による分化の有無に関するもので、図58には、最適化された濃度(working concentration)、最適化濃度の2倍の濃度(2x working concentration)、各化合物のIC50値に相当する濃度(IC50 values)、そしてIC50濃度の2倍の濃度(2xIC50 values)値を示しており、それぞれの濃度の化合物が混合されたカクテルを用いて分化を誘導させた時に得られる神経膠様細胞を顕微鏡で観察した写真をそれぞれ図59~62に示した(Scale bar=100μm)。 図59は、最適化された濃度の化合物カクテルを処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、神経膠様細胞の形態からみた時、分化がうまく行われたことを確認することができた。 図60は、最適濃度の2倍の濃度を処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、分化は行われたものの、転換された細胞数の減少からみて、化合物が細胞に対する毒性がややあることを確認した。 図61は、第1化合物カクテルの6種の化合物をIC50値で処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、分化効率が著しく減少したことを確認した。 図62は、IC50値の2倍の濃度の化合物カクテルで処理して分化させた神経膠様細胞に対する写真で、分化効率が著しく減少したことを確認した。 図63は、患者の皮膚細胞から分離した線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、CMT(charcot-marie-Tooth disease)疾患を患う患者の皮膚から採取した線維芽細胞をプロトコルIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=100μm)。 図64は、患者の皮膚細胞から分離した線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、CMT(charcot-marie-Tooth disease)疾患を患う患者の皮膚から採取した線維芽細胞をプロトコルIIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=100μm)。 図65は、6歳男児の真皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=100μm)。 図66は、6歳男児の真皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルIIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=100μm)。 図67は、82歳女性の皮膚由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=100μm)。 図68は、82歳女性の皮膚由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルIIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=100μm)。 図69は、47歳男性の包皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=l00μm)。 図70は、47歳男性の包皮由来線維芽細胞を用いた神経膠様細胞の分化に対するものであって、線維芽細胞をプロトコルIIIを用いて転換したC2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)神経膠様細胞の顕微鏡写真である(Scale bar=l00μm)。 図71は、図23のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のunsupervised clusteringに対する具体的な図である(N_Hum_Schw:ヒトシュワン細胞;N_fibroblast:線維芽細胞;N_SC_12d:C1-GLC(6+3);N_SC_9d:C1-GLC(6+6))。 図72は、図23のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のunsupervised clusteringに対する具体的な図である(N_Hum_Schw:ヒトシュワン細胞;N_fibroblast:線維芽細胞;N_SC_12d:C1-GLC(6+3);N_SC_9d:C1-GLC(6+6))。 図73は、図23のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のunsupervised clusteringに対する具体的な図である(N_Hum_Schw:ヒトシュワン細胞;N_fibroblast:線維芽細胞;N_SC_12d:C1-GLC(6+3);N_SC_9d:C1-GLC(6+6))。 図74は、図23のマイクロアレイで確認した各サンプルにおいて差次的に発現するシュワン細胞のマーカー遺伝子のunsupervised clusteringに対する具体的な図である(N_Hum_Schw:ヒトシュワン細胞;N_fibroblast:線維芽細胞;N_SC_12d:C1-GLC(6+3);N_SC_9d:C1-GLC(6+6))。 図75は、CMT患者の線維芽細胞から作った神経膠様細胞(C3-GLC 6+3+6)(図64)から分泌されるHGFの量に対するグラフである。 図76は、多様な線維芽細胞からプロトコルIIの方法で分化させた神経膠様細胞(C2-GLC(15+3))から分泌されたHGFの量に対するグラフである。 図77は、プロトコルIの方法で製造した神経膠様細胞において、分化誘導段階で使用される化合物カクテルの多様な組み合わせを用いて分化させた神経膠様細胞(C1-GLC(6+6))から分泌されたHGFの量に対するグラフである。 図78は、プロトコルIIおよびIIIの方法で製造した神経膠様細胞から分泌されるHGFの量に対するグラフである。 図79は、線維芽細胞、シュワン細胞および図58の化合物カクテルの各濃度に関連する組み合わせの化合物カクテルを用いて分化させて製造された神経膠様細胞から分泌されるHGFの量に対するグラフである。 図80は、ロータロッドおよびBBB分析に関するグラフである。ネズミの脊椎神経を損傷させて、脊髓損傷モデル(SCI、spinal cord injury、Rat)を作り、損傷した神経にヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、0日、14日および28日後の神経再生程度をrotarodおよびBBB分析(BBB scoring:Basso、Beattie and Breshen locomotor scale方法)により測定した。FB(Fibroblast、線維芽細胞)、SC(Schwann cell、シュワン細胞)、G3(C3-GLC(6+3+6)処理)の場合、G2(無処理)、G4(ヒトシュワン細胞処理)に比べて最も神経再生がよく行われたことを確認することができる。 図81は、神経様細胞の体内分布に対するものである。Green fluorescence protein遺伝子を有するウイルスに感染させて緑色蛍光を示すC3-GLCおよびヒトシュワン細胞にネズミ(Rat)の太腿筋肉に注射器を用いて入れた後、指定された時間に蛍光の位置および明るさを観察してC3-GL(6+3+6)の変化を観察した。実験結果、最小5日以上神経様細胞が残っていることを確認することができた。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、従来技術上の問題点を解決して、遺伝子の組換えなくても分化可能であり、体細胞から化合物カクテルの処理だけでヒトおよび/動物に由来する神経膠細胞のように損傷した神経の再生および/または回復のみならず、神経自体の保護活性を有する新規な神経膠様細胞(glia-like cell)を提供する。
本発明において、神経膠細胞とは、突起膠細胞あるいは希突起膠細胞(oligodendroglia)、星膠細胞あるいは星状膠細胞(astrocyte)、シュワン細胞(Schwann cells)、小膠細胞あるいは微小膠細胞(microglia)、衛星細胞(satellite cell)および上衣膠細胞(ependymal cell)などを含む。本発明が提供する新規な神経膠様細胞は、神経膠細胞が有する神経再生、復旧および/または保護機能を有するものである。
また、本発明は、分化能のない体細胞を直接分化させるため、従来の細胞治療剤の開発に使用されている胚幹細胞、逆分化幹細胞のような全分化能細胞に比べて、癌発生の可能性がない細胞を提供することを目的とする。
また、本発明は、低分子化合物のみを使用するため、従来の遺伝子組換えによって行われる分化方法に対比して、遺伝体変形の危険が少なく、分化期間が短縮され、優れた効率で体細胞から分化した神経膠様細胞を提供可能な新規な神経膠様細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、分化した細胞を低分子化合物のない一般の培養液で継代培養が可能な安定した細胞に維持できる再培養技術を提供することにより、従来の低分子化合物を用いた直接分化の欠点の1つである分化細胞の不安定性を克服することを目的とする。本発明において、低分子化合物とは、本願発明に含まれる第1化合物カクテルまたは第2化合物カクテルを構成可能な成分を意味するものである。
また、本発明は、損傷した神経細胞を優れた効率で復旧、再生および/または回復可能であり、体細胞から分化した神経細胞自体を保護する活性を有する新規な神経再生保護機能細胞を含む神経疾患の予防または治療用細胞治療剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、患者の体細胞を直接分化させて神経疾患に対する細胞治療剤として使用できるため、従来使用あるいは研究されている幹細胞を用いた細胞治療剤とは異なり、免疫拒絶反応のない細胞治療剤を提供することを目的とする。
本発明の新規な神経膠様細胞は、HGF分泌量が20,000pg/ml以上であってもよい。
また、本発明の神経膠様細胞は、MEF分泌量10ng/ml以上;およびBDNF分泌量150pg/ml以上を含む体細胞から分化した新規な神経膠様細胞を提供し、前記神経膠様細胞は、神経再生および保護用であってもよいし、具体的には、優れた効率で損傷した神経細胞の再生、回復および/または神経の保護を可能にする。
本発明の新規な神経膠様細胞は、より具体的には、神経再生機能があるタンパク質因子であるHGF分泌量が、分化に使用された細胞である線維芽細胞の分泌量に比べて10倍以上高いか、あるいは20,000pg/ml以上であってもよいし、好ましくは20,000~5,000,000pg/ml、より好ましくは30,000~5,000,000pg/ml、さらにより好ましくは50,000~5,000,000pg/mlであってもよい。HGFは、神経保護および再生機能があるタンパク質であるので、多く分泌されるほど優れた効果を発現することができる。また、神経再生機能がある他のタンパク質因子であるBDNF分泌量が、分化に使用された細胞である線維芽細胞の分泌量に比べて10倍以上高いか、あるいは150pg/ml以上であってもよいし、好ましくは200~5,000,000pg/ml、より好ましくは700~5,000,000pg/ml、さらにより好ましくは1,000~5,000,000pg/mlであってもよい。BDNFも、神経保護および再生機能があるタンパク質であるので、多く分泌されるほど効果が高い。また、神経再生機能があるさらに他のタンパク質因子であるMIF分泌量が、分化に使用された細胞である線維芽細胞の分泌量に比べて10倍以上高いか、あるいは10ng/ml以上であってもよいし、好ましくは15~1,000,000ng/ml、より好ましくは20~1,000,000ng/mlであってもよい。MIFは、神経保護および再生機能があるタンパク質であるので、多く分泌されるほど効果が高い。HGF、MIFおよびBDNFは、それぞれ神経保護および再生機能があると知られているタンパク質因子であるので、分泌量が前記範囲で分泌される場合、神経再生機能の側面で優れた効果を有することができる。
また、神経膠様細胞は、ヒトのシュワン細胞と類似の形態を示すが、より詳しくは、長さが50~500μLであり、直径が15~50μLである長い形態の細胞として膨らんでいる中心部分から両端あるいはいくつか(<10)の端に細くなり、ある場合、この端部分が幅1ミクロン程度の長い糸状を呈する(図22参照)。
さらに、神経膠様細胞は、分化させるのに使用した線維芽細胞のマーカーであるDKK1やFBLN5の発現が線維芽細胞の発現の20%以下で観測されなければならず、神経膠細胞で発現が増加すると知られたマーカー遺伝子であるMBP、GALC、NDRG1などの発現が線維芽細胞対比1.5倍以上増加する特徴を有する(図27参照)。
また、神経膠様細胞は、NSC-32のように運動神経細胞の神経突起の成長を助ける特徴を有する。より具体的には、神経様細胞培養液を運動神経細胞の培養時に添加すれば、70%以上の細胞が長さ50~500μMの神経突起を有する。
さらに、本発明は、新規な神経膠様細胞を製造可能な第1化合物カクテルおよび第2化合物カクテルを提供する。
前記第1化合物カクテルは、体細胞を新規な神経膠様細胞に誘導するためのものであって、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含むものであってもよい。
また、第2化合物カクテルは、第1化合物カクテル処理された体細胞に後処理して成熟する段階を含むようにするものであって、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤およびcAMP作用剤を含むものであってもよい。
本発明において、「ヒストンデアセチラーゼ抑制剤(Histone deacetylase inhibitor)」は、ヒストンデアセチラーゼを抑制する物質を意味し、ヒストンデアセチル化の阻害によりクロマチンを高アセチル化状態にして細胞増殖抑制因子および分化誘導に必須の遺伝子の発現を促進して癌細胞の分化を誘導し、血管新生を抑制し、細胞周期をG1状態に固定させて癌細胞のアポトーシス(apoptosis)を誘発して強い細胞増殖抑制(cytostatic)の抗癌活性を示すことが知られている。ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)は、pRB/E2Fを媒介として遺伝子転写(gene transcription)を抑制し、ヒストンアセチレーション(histone acetylation)の破壊が様々な癌の発生に関連しており、HDACは、低酸素症、低糖、細胞癌化などの劣悪な環境条件で高発現して細胞増殖抑制因子の発現を阻害して細胞増殖を促進させる役割を果たして、HDACは細胞癌化および分化調節に重要な調節因子として認識されていると知られている。特に、前記VPAは、イノシトールの減少を誘発し、GSK-3βを阻害し、ERK pathwayを活性化させ、PPARの活性を刺激することが知られている。前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤(HDAC inhibitor)は1nM~100mM含まれる。
前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はその種類が限られてはいないが、より具体的には、バルプロ酸(Valproic acid)、プラシノスタット(Pracinostat)、トリコスタチンA(Trichostatin A)、2,4-ピリジンジカルボン酸(2,4-Pyridinedicarboxylic Acid)、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(Suberoylanilide hydroxamic acid)、ヒドロキサム酸(hydroxamic acid)、サイクリックテトラペプチド(cyclic tetrapeptide)、デプシペプチド(depsipeptides)、ボリノスタット(Vorinostat)、ベリノスタット(Belinostat)、パノビノスタット(Panobinostat)、ベンズアミド(Benzamide)、エンチノスタット(Entinostat)およびブチレート(butyrate)から構成された群より選択された1種以上を含むことができ、バルプロ酸(Valproic acid)および/またはプラシノスタット(Pracinostat)がより好ましい。
前記化合物のうち、バルプロ酸は、50μM~5mM含まれ、好ましくは250μM~4mM含まれてもよいし、より好ましくは400μM~2mM、さらに好ましくは500μM~1mM含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。また、前記化合物のうち、プラシノスタットは、50nM~200nMの範囲に含まれる場合、毒性なく体細胞を神経膠様細胞に優れて分化させることができるという点で好ましい。
発明において、「GSK抑制剤(Glycogen synthease kinase inhibitor)」は、GSK信号伝達過程に関与するGSK1/2のアップストリーム(upstream)分子であるGSK1/2を標的とする物質であれば限定されない。前記GSK抑制剤(Glycogen synthease kinase inhibitor)は1nM~100mM含まれる。前記GSK抑制剤は種類が限定されないが、より具体的には、Chir99021(6-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethylamino)nicotinonitrile);LY2090314(3-imidazo[1,2-a]pyridin-3-yl-4-[1,2,3,4-tetrahydro-2-(1-piperidinylcarbonyl)-pyrrolo[3,2,jk][1,4]benzo diazepin-7-yl]);1-azakenpaullone(9-Bromo-7,12-dihydro-pyrido[3’,2’:2,3]azepino[4,5-b]indol-6(5H)one);BIO((2’Z,3’E)-6-Bromoindirubin-3’-oxime);ARA014418(N-(4-Methoxybenzyl)-N’-(5-nitro-1,3-thiazol-2-yl)urea);Indirubin-3’-monoxime;5-Iodo-indirubin-3’-monoxime;kenpaullone(9-Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one);SB-415286(3-[(3-Chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2-nitro-phenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione);SB-216763(3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1Hpyrrole-2,5-dione);Maybridge SEW00923SC(2-anilino-5-phenyl-1,3,4-oxadiazole);(Z)-5-(2,3-Methylenedioxyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione;TWS119(3-(6-(3-aminophenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yloxy)phenol);Chir98014(N2-(2-(4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1H-imidazol-1-yl)pyrimidin-2-ylamino)ethyl)-5-nitropyridine-2,6-diamine);SB415286(3-(3-chloro-4-hydroxyphenylamino)-4-(2-nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione);およびTideglusib(2-(1-naphthalenyl)-4-(phenylmethyl))から構成された群より選択された1種以上であってもよいし、好ましくは、Chir99021および/またはLY2090314であってもよい。
前記GSK抑制剤のうち、Chir99021および/またはLY2090314は5nM~1mM含まれ、好ましくは10nM~20μM含まれてもよいし、より好ましくは20nM~15μM、さらに好ましくは10μM~20μM含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。
本発明において、「ALK-5キナーゼ抑制剤(ALK-5 kinase inhibitor)」は、TGF-βタイプIレセプターに結合して、TGF-β Iの正常な信号伝達過程を妨げる物質を意味し、TGF-βタイプI(Transforming growth factor-β type I)は、細胞増殖、分化および多様な種類の細胞に多様な作用をする多機能性ペプチドであって、このような多機能性は、脂肪細胞形成、筋細胞形成、骨細胞形成、上皮細胞分化など様々な組織の成長および分化において中枢的な役割を果たす。
前記ALK-5キナーゼ抑制剤は1nM~100mM含まれる。
前記ALK-5キナーゼ抑制剤はその種類が限定されるものではない。より具体的には、前記ALK-5キナーゼ抑制剤(TGF-βタイプIレセプター抑制剤)は、RepSox(1,5-Naphthyridine、2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]);SB431542(4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide);SB525334(6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline);GW788388(4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide);SD-208(2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine);Galunisertib(LY2157299、4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide);EW-7197(N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine);LY2109761(7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline);SB505124(2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine):LY364947(Quinoline、4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]);K02288(3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]および;LDN-212854(Quinoline、5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])から構成された群より選択された1種以上であってもよいし、好ましくは、RepSoxおよび/またはSB431542であってもよい。
より具体的には、RepSoxおよび/またはSB431542は1nM~500μM含まれ、好ましくは4nM~20μM含まれてもよいし、より好ましくは8nM~7.5μM、さらに好ましくは5μM~10μM含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。
本発明において、「cAMP作用剤(cAMP agonist)」は、cAMP信号を活性化させる物質を意味する。cAMP作用剤は1nM~100mM含まれる。
前記cAMP作用剤はその種類が限定されないが、具体的には、フォルスコリン(Forskolin)、isoproterenol、NKH477(a novel forskolin derivative)、PACAP1-27(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide receptor antagonist:PACAP antagonist)、またはPACAP1-38(PACAP antagonist)を含むことができ、好ましくは、フォルスコリンおよび/またはNKH477であってもよい。
前記化合物のうち、フォルスコリンは1nM~500μM含まれ、好ましくは0.5μM~50μM含まれてもよいし、より好ましくは1μM~45μM、さらに好ましくは25μM~50μM含まれてもよいし、NKH477は0.5μM~100μM含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。
本発明において、「ヒストンデメチラーゼ抑制剤」は、ヒストンH3で発見される2つのリシンを選択的に脱メチル化する酵素であるLSD1を抑制する役割を果たし、モノアミンから酸化的脱アミン化を阻害する役割を果たす。ヒストンデメチラーゼ抑制剤は1nM~100mM含まれる。
前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はその種類が限定されないが、具体的には、パルネート(parnate;Tranylcypromine)、SP2509、Ciclipirox、Daminozide、GSK J1、GSK J2、GSK J4、GSK J5、GSK LSD1、(R)-2-hydroxyglutaric acid、IOX1、JIB04、NSC636819、OG-L002、PBIT、RN 1 dihydrochloride、S2101、TC-E5002であってもよいし、好ましくは、パルネート(parnate;Tranylcypromine)および/またはSP2509であってもよい。
前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤のうち、パルネートは1nM~1mM含まれ、好ましくは0.5μM~500μM含まれてもよいし、より好ましくは1μM~100μM、さらに好ましくは10μM~20μM含まれてもよく、SP2509は1nM~100nM含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。
本発明において、前記第1化合物カクテルおよび/または第2化合物カクテルは、RAR作用剤をさらに含む方が、神経保護および再生機能があるタンパク質因子がより優れて発現するという点でさらに好ましい。本発明において、RAR作用剤はその種類は限定されないが、具体的には、TTNPB(4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]benzoic acid;またはArotinoid acid)であってもよい。
前記RAR作用剤は1nM~500μM含まれ、好ましくは10nM~2μM含まれてもよいし、より好ましくは20μM~1.5μM、さらに好ましくは1μM~2μM含まれてもよい。前記範囲に含まれる場合、効果的で毒性なく効果を発現できるという点で好ましい。本発明において、体細胞(somatic cell)はその種類が限定されないが、各種組織から分離された線維芽細胞(fibroblast)、血液、脂肪細胞を含む完全分化した体細胞および/または臍帯、胎盤、臍帯血、骨髓、血、脂肪などで存在する成体幹細胞(adult stem cellあるいはsomatic stem cell)であってもよい。
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤、ヒストンデメチラーゼ抑制剤、RAR作用剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化を誘導する分化誘導段階を含んで製造される体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法を提供する。
前記分化誘導段階は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化誘導するものであってもよい。本発明は、前記分化誘導段階を含んで製造された体細胞から分化した神経膠様細胞であれば制限なく使用可能であるが、前記分化誘導段階の後、再培養(re-culture)する段階をさらに含むことがより好ましい。
また、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化を誘導する分化誘導段階;前記分化誘導段階および再培養段階の間に、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤およびcAMP作用剤を含む第2化合物カクテルを、第1化合物カクテル処理された体細胞に追加的に処理して成熟させる段階をさらに含むことができる。前記成熟させる段階が含まれる場合、成熟させる段階は、分化誘導段階の日数に等しいか短いことが好ましい。
さらに、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化を誘導する分化誘導段階を含む神経膠様細胞を製造する方法を提供することができる。
また、本発明は、前記分化誘導段階の後、再培養(re-culture)する段階をさらに含むことができ、再培養段階が含まれる場合、低分子化合物のない培養液および/または培地で安定して継代培養可能な神経膠様細胞が提供可能であるという点でより好ましい。
本発明の製造方法は、誘導段階および再培養する段階の間に、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤およびcAMP作用剤を含む第2化合物カクテルを、第1化合物カクテル処理された体細胞に追加的に処理して成熟させる段階をさらに含むことができる。前記成熟させる段階が含まれる場合、成熟させる段階は、分化誘導段階の日数に等しいか短いことが好ましい。
また、本発明は、前記分化誘導段階の後、細胞を成熟させる段階(maturation);および前記誘導段階の後あるいは誘導および成熟段階の後、再培養(re-culture)する段階をさらに含むものである、体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法を提供する。
前記分化誘導段階は、線維芽細胞のような分化対象細胞(例えば、線維芽細胞など)を活性化させて分化目標細胞(例えば、新規な神経膠様細胞)段階に進入させる役割を果たす。分化誘導段階は3日以上行われ、好ましくは、3日以上18日以下であってもよい。
前記成熟させる段階は、分化目標細胞に進入した細胞が完全に目標細胞の活性を有するように培養することを意味する。分化成熟段階は3日以上行われるが、前記分化誘導段階を長く調節すれば、成熟させる段階を代替することができ、この場合、成熟段階は省略可能できる。
前記再培養段階は、分化した細胞が低分子化合物なしに継代培養可能な安定した細胞に維持できるようにするのに必要である。前記再培養段階は、分化誘導された細胞を3日以上追加培養する段階を含むことができ、再培養された細胞は安定して継代培養可能で長期間培養可能であるが、3日以上12日以下の再培養期間がさらに好ましい。前記再培養段階は、マトリゲルが除去された状態で細胞を培地に培養させる段階を含むもので、より具体的には、再培養段階は、低分子化合物およびマトリゲル(Matrigel、BD Biosciences社)が含まれていないまま、体細胞から分化誘導された神経膠様細胞を追加培養する段階を含むことを意味する。
より具体的には、再培養段階は下記の方法により行われ、これに限定されるものではない。1XPBSで体細胞から分化誘導段階および/または成熟段階を経た細胞を2回洗浄し、15分間インキュベータで暖かいaccutase溶液(37℃の恒温水槽で保管)3mlを追加する。15分後、光学顕微鏡(bright-field microscope)で細胞分離が観察されるか否かを確認する。Complete DMEMを添加し、前記溶液を柔らかくピペッティングして60mmの皿から細胞入りのマトリゲル層を分離する。セルストレーナー(cell strainer)に溶液を通過させてマトリゲル塊を除去する。1000rpm/5分/RTで前記濾過した細胞を遠心分離する。上澄液を捨ててcompleteシュワン細胞培地(science research laboratory)に細胞ペレット(cell pellet)を柔らかく振って再度混合する過程(resuspend)を進行させ、これをマトリゲルなどのコーティングのない新しいプレートに添加する。細胞が添加されたプレートを37℃のインキュベータに保管しながら、3日ごとに培地を入れ替えながら計3~12日、好ましくは6~12日間培養する。
前記再培養段階前の分化誘導段階および/または成熟させる段階は、マトリゲルが含まれる。
また、前記再培養段階は、液体窒素(N)下で凍結させる段階を含むことができる。すなわち、12日以上長期間保管しなければならない場合、培養を継続する方法の代わりに凍結乾燥をして長期間保管し、必要時に解凍して再び再培養培地で培養することができる。
本発明の新規な神経膠様細胞は、体細胞から分化するもので、分化の効率は、神経膠様細胞で特徴づけられる形態を有する細胞の程度、あるいはHGF、MIFやBDNFで特徴づけられる神経膠様細胞で過発現するタンパク質因子の分泌程度、あるいは各細胞の発現するgeneをマーカー(maker)として判断することができるが、前記マーカーは、線維芽細胞で発現するFBLN5、DKK1、FBN1、PRRX1および/またはECM1などと、神経膠細胞で発現するMBP、NDGR1、GALC、GFAPおよび/またはMPZなどに区分することができる。優れた効率で体細胞が神経膠様細胞に分化する場合、線維芽細胞で優れて発現するFBLN5、DKK1、FBN1、PRRX1および/またはECM1などの発現量が低くなり、神経膠細胞のマーカーであるMBP、NDGR1、GALC、GFAPおよび/またはMPZなどの発現量が高くなる(図23~27参照)。
また、本発明は、上述した体細胞から分化した新規な神経膠様細胞を有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤を提供する。前記神経疾患とは、神経退行性疾患、遺伝による神経疾患、神経損傷による疾患などを意味し、前記神経退行性疾患とは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭葉痴呆(FTD)、アルツハイマー病、パーキンソン病、老人性痴呆、ハンチントン病などを含み、遺伝による神経疾患は、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症侯群(Gilles de la Tourettes’ syndrome)、先天性運動および感覚神経病症、シャルコー・マリー・トゥース病(CMT)、家族性自律神経失調症(Familial Dysautonomia)、ロー症候群、ロウエ症侯群(Lowe syndrome)、レット症候群(Rett Syndrome)、Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy(CADASIL)、結節性硬化症(Tuberous Sclerosis)、毛細管拡張性運動失調症候群(Ataxia telangiectasia)、神経線維腫症(Neurofibromatosis)などがあり、損傷による神経疾患には、多発性硬化症(multiple sclerosis)、ギラン・バレー症候群(GBS)、急性炎症性脱髄鞘性神経病症(polyradiculopathy型)、schwannomatosisおよび慢性炎症性脱髄鞘性神経病症(CIDP)、糖尿病性神経病症、抗癌剤による神経病症、外傷による末梢神経切断、および脊椎損傷(spinal cord injury)、緑内障などの末梢および中枢神経系組織を含む様々な神経損傷疾患などが挙げられる。
また、本発明は、上述した体細胞から分化した神経膠様細胞を、神経疾患が誘発された個体に投与する段階を含む、神経疾患を予防および治療する方法を提供することができる。
本発明による細胞治療剤は、薬学的に有効な量の神経膠様細胞を含むか、1つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記薬学的に有効な量とは、免疫疾患の症状を予防、改善および治療するのに十分な量をいう。
本発明による活性成分である神経膠様細胞は、1xl0~1x1015の細胞数で含まれ、前記薬学的に有効な量は、免疫疾患症状の程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別、投与経路および治療期間などによって適宜変化可能である。
また、前記薬学的に許容されるとは、生理学的に許容され、ヒトおよび/または哺乳動物などに投与される時、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応、またはこれと類似の反応を起こさない組成物をいう。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などを追加的に含むことができる。
さらに、本発明の細胞治療剤は、ヒトおよび/または哺乳動物などに投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供できるように当業界にて公知の方法を使用して剤形化可能である。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってもよい。
また、本発明による神経疾患を治療および/または予防するための治療剤は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む様々な経路を通して投与可能であり、損傷部位に直接注射するか、および/または手術による移植方法などで投与可能である。さらに、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重および患者の重症度などの様々な因子によって適宜選択可能であり、本発明による免疫疾患の予防または治療用組成物は、免疫疾患の症状を予防、改善または治療する効果を有する公知の化合物と並行して投与することができる。
本発明は、シュワン細胞と非常に類似の特性を有する神経再生、復旧および神経保護細胞機能を有する新規な神経膠様細胞へのヒト線維芽細胞の化学ベースの転換の開発を報告する。我々はヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む化合物カクテルがこのような転換に重要と判断し、このような新規な神経細胞タイプの様々な様相を特定して究明し、その機能性を評価するために、下記のような製造例、実施例などを提供する。ただし、本発明の実施が下記に限るものではない。
製造例:多様なプロトコル下での神経膠様細胞(神経復旧および神経保護機能を有する細胞;Neurorepair-and-protection cell;以下、「神経膠様細胞」という)の製造、神経膠様細胞の生成
製造例1:細胞培養
ヒト包皮(foreskin)線維芽細胞(SCC058、Millipore社)を、10%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)が添加された高濃度グルコースDMEM(Welgene社)で培養した。ヒトシュワン細胞を、成長添加剤(Science社)および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)を含有するシュワン細胞基本培地(ScienCell社)から構成されたシュワン細胞培地で培養した。ヒトニューロン細胞株NSC34を、10%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)が添加された高濃度グルコースDMEM(Welgene社)で培養した。
製造例2:分化に使用される培地の製造
分化誘導培地(Reprogramming media;RM):ノックアウトDMEM(Gibco社)、15%ノックアウト血清補充物、5%FBS(Gibco社)、1%Glutamax(Gibco社)、1%非必須アミノ酸(Gibco社)、0.1mM β-メルカプトエタノール(Sigma社)およびIXペニシリン/ストレプトマイシン、第1化合物カクテル(表1、あるいは図2:500μMバルプロ酸(V)、10μM CHIR99021(C);5μM RepSox(R);25μMフォルスコリン(F);10μMトラニルシプロミン(P);1μM TTNPB(T))、(カクテルに使用されたすべての小分子物質はMedchemexpress社から入手)。
Figure 0007285591000001
成熟培地(MM):ノックアウトDMEM(Gibco社)、15%ノックアウト血清補充物、5%FBS(Gibco社)、1%Glutamax(Gibco社)、1%非必須アミノ酸(Gibco社)、0.1mM β-メルカプトエタノール(Sigma社)および1Xペニシリン/ストレプトマイシン)、10μM CHIR99-21(C);5μM RepSox(R);25μMフォルスコリン(F)から構成された第2化合物カクテルを含有。
再培養培地(reculture media):成長添加剤(Science社)および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)を含有するシュワン細胞基本培地(ScienCel1社)から構成されたシュワン細胞培地で培養した。
製造例3:分化に使用される培地の製造
表1あるいは図2に示されている第1化合物カクテルに使用された化合物の代わりに、表2あるいは図6に示されている化合物に代替されたという点だけを除けば、製造例2と同一の構成で培地を製造した。第2化合物カクテルの場合、下記表2にて、LY2090314、SB-431542およびNKH477が含まれた以外は、製造例2の成熟培地の製造方法と同様に製造した。
Figure 0007285591000002
実施例:プロトコルI、II~IIIで製造した神経膠様細胞の製造
図3に示されるように、初期転換を確認した後、我々はいくつかの他の転換プロトコルを用いて転換効率をモニタリングした。転換条件により、神経膠様細胞は3つのプロトコル、すなわち、プロトコルI(図14)、プロトコルII(図15)およびプロトコルIII(図16)の神経膠様細胞タイプに分類される(図14~16)。プロトコル1は、成熟時間の変化により誘導時間が固定される特徴があり、プロトコル2は、誘導時間が変化する特徴があり、プロトコル3は、分化した細胞が化学物質なしに再培養される特徴がある。プロトコルI、プロトコルIIおよびプロトコルIIIによって転換された神経膠様細胞は、それぞれC1-神経膠様細胞(C1-GLC)、C2-神経膠様細胞(C2-GLC)およびC3-神経膠様細胞(C3-GLC)と称し、これらそれぞれの細胞形態を顕微鏡分析により調査した時(図18~20)、分化に使用された本来のヒト包皮線維芽細胞(図17)とは異なる形態を見せたが、ヒトシュワン細胞(図21)と類似の形態であることが分かった。
実施例1:プロトコル1(C1-神経膠様細胞の製造):
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、RMに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた60mmの組織培養プレート(室温で2時間1:100のマトリゲル(BD Biosciences社)で予めコーティングされる)に6x10細胞数の密度で分注する。その培養液を3日ごとに新しいRM培地に入れ替えて、分化誘導段階による培養を進行させる。前記分化誘導段階による誘導(induction)を6日まで継続する。誘導6日目に、培養液をMMに入れ替え、追加の3~12日間成熟させる段階による培養を継続する。
実施例1-1:C1-神経膠様細胞(6+3)
前記実施例1において成熟させる段階による培養を3日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例1-2:C1-神経膠様細胞(6+6)
前記実施例1において成熟させる段階による培養を6日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例1-3:C1-神経膠様細胞(6+9)
前記実施例1において成熟させる段階による培養を9日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例1-4:C1-神経膠様細胞(6+12)
前記実施例1において成熟させる段階による培養を12日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例2:プロトコルII(C2-神経膠様細胞の製造):
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、RMに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた60mmの組織培養プレート(室温で2時間1:100のマトリゲル(BD Biosciences社)で予めコーティングされる)に6xl0細胞数の密度で分注する。その培養液を3日ごとに新しいRM培地に入れ替えて分化誘導段階による培養を行う。分化誘導段階による培養を6~15日間継続し、誘導期間後、直ちに3日間の固定成熟期間(fixed maturation period)をおいた。あるいは成熟期間なしに18日間誘導した。
実施例2-1:C2-神経膠様細胞(6+12)
前記実施例2において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養を12日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例2-2:C2-神経膠様細胞(9+9)
前記実施例2において分化誘導段階による培養を9日、成熟させる段階による培養を9日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例2-3:C2-神経膠様細胞(12+6)
前記実施例2において分化誘導段階による培養を12日、成熟させる段階による培養を6日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例2-4:C2-神経膠様細胞(15+3)
前記実施例2において分化誘導段階による培養を15日、成熟させる段階による培養を3日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例2-5:C2-神経膠様細胞(18+0)
前記実施例2において分化誘導段階による培養を18日、成熟させる段階による培養を0日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例3:プロトコルIII(C3-神経膠様細胞の製造)
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、RMに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた60mmの組織培養プレート(室温で2時間1:100のマトリゲル(BD Biosciences社)で予めコーティングされる)に6x10細胞数の密度で分注する。その培養液を3日ごとに新しいRM培地に入れ替える。誘導を6日まで継続する。誘導6日目に、培養液をMMに入れ替え、追加の3日間成熟させる段階による培養を継続するか、成熟させる段階を省略する。このような分化誘導段階または成熟段階による培養の終了時、その細胞をアクターゼ(accutase)細胞脱着溶液(Millipore社)処理により収獲し、その収獲された細胞をシュワン細胞培地に再懸濁し、新しい組織培養プレートに分注する。細胞を追加の6~12日間成長させる。培養液には3日ごとに新しい培地を補充した。
実施例3-1:C3-神経膠様細胞(6+0+12)
前記実施例3において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養を省略後、12日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例3と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例3-2:C3-神経膠様細胞(6+3+6)
前記実施例3において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養3日後、6日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例3と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例3-3:C3-神経膠様細胞(6+3+12)
前記実施例2において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養6日後、12日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例3と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
実施例4:プロトコルIII-1(C3-神経膠様細胞の凍結後の再培養)
プロトコルIIIで製造したC3-神経膠様細胞を6~12日の再培養の終了時にトリプシン処理し、凍結培地(20%FBS、10%DMSOを含有する高濃度グルコースDMEM(Welgene社)に再懸濁し、追加の使用時まで液体Nで凍結保存する。使用時、C3神経膠様細胞のバイアルを解凍し、その細胞を完全シュワン細胞培地に分注する。
C3-神経膠様細胞が機能性の損失なしに安全に凍結され、解凍後に再び再培養できるか否かを確認するために、我々は前記凍結および再培養実験を行った。凍結されたC3-神経膠様細胞の解凍および培養後、我々は細胞形態(morphology)(図48)、サイトカイン放出(図49)および神経突起の成長促進能力(図50および51)において凍結前の細胞との有意な変化を観察することができなかった。
実験例
実験例1:低分子化合物を用いた線維芽細胞の神経膠様細胞への直接分化
体細胞からの神経膠様細胞の分化に関連し、従来のいくつかの重要な信号伝達経路を調節する小分子物質(化合物)がマウス線維芽細胞を全分化能幹細胞(CiPSC)に転換できることが報告されてはいる。また、体細胞から全分化能プログラムの一時的な活性化はこれらの細胞を活性化した状態にするというのが、従来の研究で報告された。すなわち、このような活性化された細胞は、これらをいくつかの成長因子およびサイトカインに単純に露出させることでいくつかの系統(lineage)に誘導できる可能性が提示されてきた。そこで、本発明は、CiPSC細胞を生成するために使用されたものと類似の化学物質を用いて類似の活性化された状態を生成しようと試み、このような状態を様々な系統に誘導しようと試みた。我々はこのような化学物質を用いた簡略な処理方式により様々な系統に誘導できる活性化状態につながると仮定して、本発明を改良した(図1)。
したがって、我々はヒト線維芽細胞を6~18日間分化誘導培地(RM)で6種の化学物質、すなわち、バルプロ酸(V)、Chir99021(C)、RepSox(R)、フォルスコリン(F)、Parnate(P)およびTTNPB(T)で処理した後(表1あるいは図2)、追加の3~12日間CHIR99021(C)、RepSox(R)およびフォルスコリン(F)を含有した成熟培地(MM)で維持して神経膠様細胞に転換し、転換された細胞を化合物なしにシュワン細胞培地で再培養した(図1)。このように得られた神経膠様細胞は、ヒト線維芽細胞とは全く異なる形態を有するが、ヒトシュワン細胞に似ている核/細胞質の比を有するスピンドル状の細胞形態(morphology)を有することを確認した。(図3、図22)。より詳しくは、神経膠様細胞は長さが50~300vL、直径が15~50vLの長い形態の細胞として膨らんでいる中心部分から両端あるいは数個(<10)の端に細くなり、ある場合、この端部分が幅1ミクロン程度の長い糸状を呈する。
神経膠様細胞は、誘導段階(induction)、成熟段階(maturation)、そして再培養(reculture)過程を経て作られるが(図1)、各段階のために細胞をそれぞれ誘導培地、成熟培地あるいは再培養培地に維持するが、この時、維持時間を多様に変化させても(3~15日、図14~16)、神経膠様細胞の分化に大きな変化はなかった(図18~20)。
成功的分化の有無は、このような細胞形態(morphology)に基づく基準により判断され(図3)、我々は最小限の必要な化合物カクテルを把握した。このために、我々は基本化学カクテルから1回に1つの化学物質を除去し(図4~11参照。)、顕微鏡的明視野イメージを用いて、6種の化合物(V、C、R、F、PおよびT)を用いて、転換された神経膠様細胞に対する、得られた細胞の類似性(resemblance)を評価した(図3)。よって、V、C、R、およびPのいずれか1つを除去した時は、神経膠様細胞の分化効率が低下することを観察した(図4~9)。また、我々はフォルスコリンの除去が転換収率に最も激しい影響を及ぼすことを観察した(図8)。ParnateおよびTTNPBの除去は、転換収率が低下したものの転換は可能であることを確認し(図10)、TTNPBの除去は、最小限の影響あるいはほとんど影響を及ぼさなかった(図11)。このような観察結果をまとめて、我々はV、C、R、FおよびPが線維芽細胞を神経膠様細胞の形態を示すのに必要、充分条件に該当するもので、第1化合物カクテルとして選定した。
これに加えて、製造例2の化合物カクテル(図12)で処理された場合のヒト線維芽細胞も、製造例1の化合物カクテルで処理された線維芽細胞と同じ細胞形態(morphology)の変化を示し、製造例1の化合物カクテルにより得たものと非常に類似して神経膠様細胞に分化した(図13)。
実験例2:Microarray(図23~27および図71~74)
DNase Iで処理した全体RNAを上述のようにRNeasy Miniキット(QIAGEN社、CA、USA)を用いて抽出した。GeneChip Mouse 2.0 ST arrays(Affymetrix社、CA、USA)への混成化を行った。得られるデータを要約し、AffymetrixR Power Tools(Affymetrix社、CA、USA)で実施されたロバスト多重平均(robust multi-average)方法を利用して正規化した。
遺伝子クラスタリング(clustering)のためには、GSEデータベース(GSE87385)に入っているヒトシュワン細胞、星膠細胞および突起膠細胞のマイクロアレイの結果から各細胞で発現が増加する遺伝子と、本実験で使用した線維芽細胞、神経膠様細胞、シュワン細胞のマイクロアレイの結果から発現が2倍以上増加する遺伝子とを、Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)fmfを用いて比較分析して、2つのグループで共通して発現が増加する遺伝子を選択し、ClustVis(https://biit.cs.ut.ee/clustvis/)を用いて遺伝子clusteringをしてheatmapを描いた(図23~25参照;図23のより具体的な図面は図71~74に記載した)。
また、分析結果は遺伝子水準分析として送り出され、差別発現遺伝子(DEG)分析が行われた。発現データの統計的有意性は倍数変化(fold change)を用いて確認した。DEGセットの場合、類似性の尺度として完全連結(complete linkage)およびユークリッド距離(Euclidean distance)を用いて階層的群集分析を行った。有意なプローブリストに対する遺伝子増幅および機能的注釈(Gene-Enrichment and Functional Annotation)分析を遺伝子オントロジー(Gene Ontology)(http://geneontology.org)およびKEGG(http://kegg.jp)を用いて行った(図26)。データ分析および差別発現遺伝子の視覚化はすべてR3.0.2(www.r-proiect.org)を用いて行った。
前記実験例2で実施された実験に対する結果値は図23-25に記載した。
前記図23~25による結果をみると、ヒトシュワン細胞で過発現すると知られた遺伝子は、本実験で使用した線維芽細胞では発現しないものの、本実験で使用したヒトシュワン細胞および神経膠様細胞で大部分発現していることを確認することができた。また、ヒト星膠細胞で過発現すると知られた遺伝子は、本実験で使用した線維芽細胞では発現せず、本実験で使用したヒトシュワン細胞では一部発現するものの神経膠様細胞で大部分発現していることを確認することができた。さらに、ヒト突起膠細胞で過発現すると知られた遺伝子は、本実験で使用した線維芽細胞では発現せず、本実験で使用したヒトシュワン細胞では一部発現するものの神経膠様細胞で大部分発現していることを確認することができた。
前記図26による結果をみると、神経膠様細胞で発現する遺伝子をみると、astrocyteやmicrogliaのような神経膠細胞で発現する遺伝子の発現が増加していることを確認することができる。
前記図27の結果をみると、神経膠細胞のマーカー遺伝子であるMBP、GFAP、NDRG1、GALC、MPZなどの発現は、神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞で増加しているが、線維芽細胞の特徴的なマーカー遺伝子であるFBN1、FBLN5、PRRX1、ECM1、DKK1などは神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞で著しく減少していることを確認することができる。
実験例3:免疫染色
誘導段階および/または成熟段階、あるいは再培養段階の後のヒト線維芽細胞由来の神経膠様細胞(Glia-like Cell、GLC)を収穫し、1XPBS(Welgene社)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)で10分間固定した後、22℃で10分間PBSで0.25%Triton X-100(USB Corporation社)で透過処理し、PBSで各5分ずつ2回洗浄した。次に、細胞をPBSで1%BSA(Amresco社)、22.52mg/mLグリシン(Affymetrix社)、0.1%Tween20(Affymetrix社)を含有するブロッキング溶液で60分間ブロッキングした。次に、その細胞を4℃で一晩ブロッキング溶液で希釈した適切な一次抗体で染色した。使用された抗体はウサギ抗-GFAP抗体(Abcam社、希釈1:100)、ウサギ抗S-100抗体(Abcam社、希釈1:100)、およびマウスモノクローンP0(MBP)抗体(Abcam社、希釈1:100)であった。一次抗体の培養後、細胞をPBSTで3回洗浄し、1:100で希釈したAlexa-488-接合ヤギ二次抗マウス抗体(A11001、Invitrogen社)またはAlexa-563-結合ヤギ二次抗ウサギ抗体(A21428、Invitrogen社)と室温で2時間培養した。細胞を1μg/mL DAPI(D9542、Sigma-Aldrich社)と5分間室温で培養して核を染色した。次いで、蛍光顕微鏡(IX71S1F3、Olympus社)を用いてサンプルを可視化した。
前記実験例3で実施された実験に対する結果値は図28および図29に記載した。前記図28および29の結果をみると、大部分の神経膠様細胞が神経膠細胞の特徴的なマーカータンパク質であるS100、MBP、GFAPを発現していることを確認することができる。神経膠様細胞が神経の復旧および保護に必須の重要な神経膠細胞のマーカーを発現したため、神経膠様細胞が神経膠細胞と類似して神経細胞を保護および復旧する特性を有するという結論を得た。
実験例4:定量的RT-PCR
次に、我々は複数の時点でC1-神経膠様細胞のグローバル遺伝子の発現パターンをプロファイリングし、重要なシュワン細胞/神経膠細胞のマーカーについて調査した。
神経膠様細胞を複数の時点で収穫し、全体RNAをRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて抽出し、5μgの全体RNAをRNA to cDNA EcoDry Premix(Oligo dT、Clontech社)を用いてcDNAで合成した。Bio-Rad Prime PCR機器上でSYBR Green PCR Master Mix(Bio-Rad社)を用いて定量的RT-PCRを行った。前記qRT-PCRの条件は95℃で30秒、58℃で15秒および72℃で15秒を1サイクルとする40サイクルであった。本実験で使用されたプライマーは表3に示す。
Figure 0007285591000003
体細胞、シュワン細胞および1、2~3のプロトコルによって製造された神経膠様細胞の前記RT-PCRの各遺伝子の発現レベルの結果は図30~32に示した。
前記図30~32による結果をみると、神経膠様細胞では線維芽細胞の代表的なマーカー遺伝子であるDKK1やFBLN5の発現はほとんどないか著しく減少しているが、神経膠細胞のマーカー遺伝子であるMBP、GALC、そしてNDRG1の発現量が高くなっていることを確認することができた。このような結果は、神経膠様細胞が線維芽細胞の特徴を失って神経膠細胞の特徴を得たことを物語る。
実験例5:サイトカイン検出およびドットブロット
末梢神経系および中枢神経系で神経膠細胞を支持する神経保護および復旧特性は一般的に、その細胞によって放出されるいくつかの成長因子およびサイトカインによって付与される。様々な種類の生成された神経膠様細胞も類似のタンパク質分泌特性を有するか否かを確認するために、我々は分泌されたサイトカインおよび成長因子をプロファイリングした。線維芽細胞を実施例1、2~3のプロトコルに基づいて神経膠様細胞(GLC)に転換する。調節された培地(Conditioned media)を上記で各プロトコルの最後の段階で回収し遠心分離して任意の細胞カスまたは粒子状物質を除去した。前記調節された培地をドットブロットキット(Human proteome profiler、R&D systems社)に提供された希釈緩衝液に20倍希釈した。異なるプロトコルにより作製された神経膠様細胞の調節された培地で分泌される様々なサイトカインや成長因子を検出するためのドットブロット実験を製造会社のプロトコル(R&D systems)によって行った。基本培地を陰性対照群として使用した。前記ドットブロットキットで提供されるサイトカインや成長因子の分泌をドットブロットにより確認し、これらの中で線維芽細胞に比べて神経膠様細胞で分泌量が明確に増加する因子は図33に示されているものであった。
前記図33による結果をみると、試験された様々なサイトカインや成長因子のうち、いくつかは線維芽細胞におけるものより有意に多い量で誘導および分泌された。例えば、MIF、CXCL12、IL8、BDNF、GRO-alpha、HGFなどが誘導神経膠細胞で多く分泌された。これらのうち、MIF、BDNFおよびHGFの量はヒトシュワン細胞におけるものより有意に多く分泌される(図33)。
実験例6:ELISA
様々なプロトコルの神経膠様細胞によって培地内に放出された様々なサイトカインの定量(Quantitation)をBDNFおよびGDNF(Promega社)IL8、HGF、MIF、GRO-a(R&D systems社)に対する商業的に利用可能なキットを用いて行った。上述した様々なプロトコルによって線維芽細胞を神経膠様細胞に転換する。調節された培地を言及したように複数の時点で回収し、遠心分離して任意の細胞カスおよび粒子状物質を除去した。前記調節された培地をELISAキットに提供された希釈緩衝液に20倍希釈した。ELISA定量を製造会社のプロトコルによって行った。基本培地を陰性対照群として使用した。本実験では、面積が28.2cmである60mm culture dishで3.2x10 cellsを3日間育てる間に培地に分泌された各因子の濃度に対して測定した。
前記実験例6に対する結果値は図34~39に記載した。
前記図34~39による結果をみると、大部分のサイトカインや成長因子の分泌が線維芽細胞に比べて体細胞から分化した神経膠様細胞(GLC)で有意により高いことを確認した(図34~図39参照)。興味深いことに、実施例3のプロトコルIIIによって製造されたC3-神経膠様細胞(GLC)は、他の実施例によって作られた神経膠様細胞(C1-GLCとC2-GLC)と比較してBDNF、GDNF、MIF、HGFの分泌がより多く(図34~39)、C3-神経膠様細胞は、ヒトシュワン細胞および他のプロトコルによる神経膠様細胞より画期的に多いHGFを分泌した(図75~79参照)。
実験例7:神経膠様細胞用調節培地の製造および神経突起の成長促進分析
シュワン細胞は、軸索の健康および機能性を促進し軸索の再生に役立つ多くの神経栄養および神経保護因子を分泌することが知られている。複数の部類に属する我々の化学的に誘導された神経膠様細胞が機能的な生理学的対応物(counterpart)と一致するか否かを確認するために、我々は調節された培地を製造し、運動神経細胞であるNSC-34を処理し、神経突起の成長に及ぼすその培地の影響を評価しようとした。
実施例1~3で示したプロトコルによって線維芽細胞を神経膠様細胞(GLC)に転換する。それぞれの場合ごとに転換の終了時、調節された培地を回収し、遠心分離して任意の細胞カスまたは粒子状物質を除去した。このような調節された培地を後の使用のために-80℃で保管する。
NSC-34運動神経細胞を用いて神経突起の成長促進分析を行った。このような細胞を、10%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)が添加された高濃度グルコースDMEM(Welgene社)で維持する。分析のために、このような細胞を1XPBSで洗浄し、SC細胞用調節培地に移動させ、追加の48時間成長させた。次に、神経突起の促進を顕微鏡分析により評価し、ImageJを用いて定量した。
前記に対する結果値は図40~44に記載した。
前記図40~44による結果をみると、我々の仮説と一致して、前記調節された培地は、シュワン細胞用調節培地と非常に類似して(図44A)、神経突起の成長を促進した(図41、図42および図43のA)。しかし、このような成長促進活性が線維芽細胞用調節培地では確認されなかった(図40A)。また、調節培地による神経突起の成長程度を定量した結果、神経膠様細胞調節培地を処理した結果、長さの長い神経突起を有する運動神経細胞数が、シュワン細胞調節培地を処理した場合と同じく、神経膠様細胞調節培地を処理した場合に増加することを確認することができた(図41、図42および図43のB)。しかし、線維芽細胞調節培地を処理した場合、長さの長い神経突起を有するニューロンがほとんど発見されなかった(図40B)。
実験例8:分化効率
神経膠様細胞を神経膠細胞の特徴的なマーカーであるGFAP抗体で免疫染色した後、DAPI染色核を基準として免疫陽性細胞を計数することにより、転換効率の定量を行った(図28)。GFAPの発現を示す細胞によって決定されたもので、神経膠様細胞への転換収率は85%である(図45)。
実験例9:C3-神経膠様細胞の増殖能(5-エチニル-2’-ジオキシウリジン染色分析)
再生医学および治療分野において神経膠様細胞の適用の可能性に関連して重要な特徴の1つは、細胞増殖および拡張の能力である。このような特徴を評価するために、再培養の6日目にC3-神経膠様細胞を12時間Eduを混入した後(Click-iTTM EdU Alexa FluorTM 555、Invitrogen、MA、USA)を用いて、製造会社のプロトコルによって細胞の製造を行った。次に、その細胞を核を検出するためにHoechst33342で同時染色した。EDU+Hoechst33342陽性細胞を2つの個別的な顕微鏡視野(microscopic field)で計数し、その顕微鏡視野に存在する全体Hoechst33342陽性細胞の百分率で表した。
前記に対する結果値は図46および47に記載した。
前記図46および47による結果をみると、実際に免疫蛍光データはC3-神経膠様細胞が有糸分裂活性があることを示し(図46)、定量結果は培養液内の30%がEdu/DAPI二重陽性細胞であることを示す(図47)。
実験例10:神経膠様細胞の凍結および解凍
神経膠様細胞を用いた治療剤の開発において最も重要な点の1つは、作製された細胞を安定して保管し運搬できなければならないという点である。細胞を補完する最も良い方法の1つは、細胞を低い温度で凍結させる方法がある。本技術により作製された神経膠様細胞を凍結し解凍した時、活性変化を調査するために、C3-GLC冷凍培養液(20%FBS、10%DMSを含有した高濃度ブドウ糖DMEM)に培養後、液体窒素で急速に凍結させ、1週間後に解凍してシュワン細胞培養液で再培養しながら細胞の特徴を調査した。
前記に対する結果値は図48~51に記載した。
前記図48~51による結果をみると、凍結後に解凍された細胞は、凍結前の細胞と比較して同じ形態の細胞形態を維持しており(図48)、解凍された細胞を培養した時、凍結前の細胞と比較してやや減少したが(図49)、線維芽細胞およびヒトシュワン細胞に比べて過剰のHGFが分泌されていることを確認することができた。また、解凍細胞培養液を用いて運動神経細胞の細胞突起の成長を誘導した時、凍結前の細胞と類似の活性を示すことを確認することができた(図50および51)。このような結果は、今後、本発明により長期保存後にも使用可能な神経膠様細胞を提供可能であることを確認できるようにしたものである。
実験例11:RAT CCIモデルの確立および神経膠様細胞の移植
体細胞から分化した神経膠様細胞の細胞治療剤への適用の可能性を確認するために、動物モデルにおいてこの細胞の神経細胞の保護および再生機能を確認しなければならない。このような目的でネズミの大腿部神経を損傷させて慢性狭窄モデル(rat chronic constriction injury、CCI、model)を作り、損傷した神経にヒトの線維芽細胞、ヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、8週後に神経再生程度を様々な方法で分析して神経の再生程度を測定した。
手術により坐骨神経を露出させた後、外科縫合で収縮させてRAT CCIモデルを製造した。成熟の終了時、様々なプロトコルによって製造された多様な種類の神経膠様細胞を収穫し、PBSに入った5.5xl0個の細胞に同量のTissel溶液を混合し、それぞれのネズミに移植した。8週後、ロータロッドレイテンシ(rotarod latency)試験、筋電図測定、染色分析により治療的改善を評価し、移植のないネズミまたは神経損傷のない野生型ネズミと比較した。ヒトシュワン細胞および線維芽細胞も同一の方式で試験した。ロータロッド(図52)および筋電図測定(EMG)(図53)の試験結果は、神経膠様細胞(G3~G5)は、対照群(G2、無処理;G6、線維芽細胞処理;G7、ヒトシュワン細胞処理)と比較して神経復旧機能を有することを立証する。また、坐骨神経の染色写真(図54)を用いてミエリンが回復した神経の数を定量した結果(図55)も、試験群が対照群に比べて高い治療効果を奏することを見せた。さらに、坐骨神経のエクソン部位を電子顕微鏡で観察し(図56)、およびミエリン層(Myelin layer)の厚さを観察した結果(図57)、試験群が対照群に比べて有意にミエリン層が厚くなっているという事実を確認することができた(図57)。このような結果は、低分子化合物を用いて誘導された神経膠様細胞はネズミCCIモデルで神経再生を促進することを確認する。
実験例12:カクテル化合物の濃度による効果検討
神経膠様細胞への転換に必要なカクテルで使用された化学物質の用量(dose)は、使用された化学物質のIC50値および文献に報告された用量から選択された。追加的に最適化し転換に使用された化学物質の用量範囲のアイディアを得るために、我々は初期転換に使用された濃度の2倍を含む用量およびIC50値などの様々な用量範囲を選択して細胞転換実験を行った。我々は使用された化学物質の毒性とともに転換収率をモニタリングした。化合物カクテルは表4(図58)によって製造され、分化結果に対する効果の評価は図59~62に示した。前記図59~62による結果をみると、最適化された濃度より多い濃度が使用された時、細胞に対する毒性が一部見えるが、細胞転換は効果的に行われるということを確認することができ、IC50またはその2倍程度の濃度を使用した時は、細胞転換が効果的に行われないことを確認することができた。
Figure 0007285591000004
実験例13:多様な体細胞を用いた神経膠様細胞の分化
本技術を患者に合わせた細胞治療剤の開発に用いるためには、本技術が多様な線維芽細胞に適用可能であることを確認しなければならない。したがって、CMT(charcot-marie-Tooth disease)疾患を患う患者の皮膚およびCoriell Instituteから購入した、互いに異なる3つの線維芽細胞を用いてそれぞれ異なる細胞を使用したことを除けば、実施例2、3の方法と同様に、C2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)を作製した。神経膠様細胞の分化の確認は顕微鏡の観察により分化した細胞の形態をみて判断した。
(1)CMT(charcot-marie-Tooth disease)患者の皮膚由来線維芽細胞(図63および64)
(2)6歳男児の真皮由来線維芽細胞(図65および66)
(3)82歳女性の皮膚由来線維芽細胞(図67および68)
(4)47歳男性の包皮由来線維芽細胞(図69および70)
前記細胞に対する神経膠様細胞の分化に対する結果値は図63~70に記載した。
本実験結果は、患者を含む多様な起源の体細胞を用いても神経膠様細胞への転換が可能であることを確認することができた。
また、前記図75~76による結果をみると、患者を含む多様なヒト由来線維芽細胞から分化した神経膠様細胞においても多い量のHGFが分泌されていることを確認することができた。
前記図63~70、図75~76による結果をみると、ヒト由来の多様な線維芽細胞が神経膠様細胞に効果的に分化できることが分かる。このような結果は、今後、神経膠様細胞を用いた細胞治療剤の開発時に患者の線維芽細胞を用いることにより、他人から得られた、あるいは由来の細胞治療剤において問題になる免疫拒絶反応のような副作用がない治療剤の開発が可能であることを意味する。
実験例14:RAT SCIモデルの確立および神経膠様細胞の移植
体細胞から分化した神経膠様細胞の中枢神経関連の疾患に対する細胞治療剤への適用の可能性を確認するために、動物モデルにおいてこの細胞の神経細胞の保護および再生機能を確認しなければならない。このような目的でネズミの脊髄を損傷させて脊髓損傷モデル(rat spinal cord injury model、SCI)を作り、損傷した神経にヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、2週後に神経再生程度を様々な方法で分析して神経の再生程度を測定した。
手術により脊髓を露出させた後、圧力をかけてRAT SCIモデルを製造した。成熟の終了時、様々なプロトコルによって製造された多様な種類の神経膠様細胞を収穫し、PBSに入った5.5x10個の細胞をネズミの脊髓に移植した。2週後、ロータロッドレイテンシ(rotarod latency)試験、BBB分析により治療的改善を評価し、移植のないネズミまたは神経損傷のない野生型ネズミと比較した。ヒトシュワン細胞も同一の方式で試験した。ロータロッドおよびBBB分析の結果(図80)をみると、損傷直後(0週)に損傷を与えたすべての群において活動性が格段に低下していたが、細胞の投入後2週後に、神経膠様細胞処理群(G3)およびヒトシュワン細胞処理群(G4)において対照群(G2、無処理)に比較して神経復旧機能をみることができた。また、神経膠様細胞処理群(G3)においてヒトシュワン細胞処理群(G4)に比べてより向上した治療効果を観察することができた。このような結果は、低分子化合物を用いて誘導された神経膠様細胞はネズミSCIモデルで神経再生を促進することを確認する。また、この結果は、神経膠様細胞が中枢神経疾患に細胞治療剤として使用できることを物語る。
実験例15:神経膠様細胞移植後の体内残存
体細胞から分化した神経膠様細胞の細胞治療剤への適用の可能性のために、細胞が体内移植後どの程度体内に留まるかを確認することが必要である。ウイルスを用いて緑色蛍光を発するタンパク質(GFP、green fluorescence protein)の遺伝子を神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞で発現させ、PBSに入った5.5x10個のGFP-発現神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞を同量のTissel溶液に混合してネズミ(Rat)の大腿部に移植した。指定された時間後、蛍光イメージングによりネズミの大腿部で発生する蛍光の強度を測定した(図81)。
図81の結果を分析すれば、細胞注入直後から5日まで蛍光を観察することができたが、7日からは蛍光を観察することができなかった。この結果は、注入された細胞が5日~6日の間に死滅するということを物語る。
本結果は、免疫低下のない野生のネズミにヒトの細胞を注入したにもかかわらず、移植された細胞が生体内に5日以上留まることができるという事実を確認した。したがって、免疫活性のない生体あるいは患者から分離した細胞を用いて作製した神経様細胞を患者に移植した場合より長い期間移植された細胞が活性を示し得ると判断される。
本発明は、体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法およびこれを含む神経疾患治療用細胞治療剤および上述した細胞を投与して神経疾患を予防および治療する方法を提供する。

Claims (10)

  1. 細胞から分化し、20,000pg/ml以上のHGFを分泌し、150pg/ml以上のBNDFを分泌し、かつ、10ng/ml以上のMIFを分泌する神経膠様細胞であって
    前記体細胞は皮膚由来線維芽細胞であり、
    前記神経膠様細胞は、
    (i)ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導し、
    ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はプラシノスタット(Pracinostat)であり、前記GSK抑制剤はLY2090314であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はSB431542であり、前記cAMP作用剤はNKH477であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はSP2509である、または
    ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はバルプロ酸(Valproic acid)であり、前記GSK抑制剤はChir99021であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はRepSoxであり、前記cAMP作用剤はフォルスコリン(Forskolin)であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はパルネート(parnate;Tranylcypromine)である、
    分化誘導段階と、
    (ii)Chir99021、RepSoxおよびフォルスコリン(Forskolin)、または、LY2090314、SB431542およびNKH477を含む第2化合物を用いる処理を含む、分化誘導後の成熟段階と、
    (iii)成熟後の再培養(re-culture)段階と
    を含む方法により製造されるものである、神経膠様細胞。
  2. 前記第1化合物カクテルは、RAR作用剤をさらに含むものである、請求項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
  3. 前記皮膚は、表皮、真皮および脂肪層からなる群より選択される1種以上である、請求項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
  4. 前記皮膚由来線維芽細胞は、包皮由来線維芽細胞である、請求項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
  5. 細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法であって、
    前記体細胞は皮膚由来線維芽細胞であり、
    (i)ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導し、
    ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はプラシノスタット(Pracinostat)であり、前記GSK抑制剤はLY2090314であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はSB431542であり、前記cAMP作用剤はNKH477であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はSP2509である、または
    ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はバルプロ酸(Valproic acid)であり、前記GSK抑制剤はChir99021であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はRepSoxであり、前記cAMP作用剤はフォルスコリン(Forskolin)であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はパルネート(parnate;Tranylcypromine)である、
    分化誘導段階と、
    (ii)
    - Chir99021、RepSoxおよびフォルスコリン(Forskolin)、または、
    - LY2090314、SB431542およびNKH477を含む、第2化合物で処理することを含む、分化誘導後の成熟段階と、
    (iii)成熟後の再培養(re-culture)段階と
    を含む、製造方法
  6. 再培養する段階は、体細胞から分化した神経膠様細胞を低分子化合物およびマトリゲルを含まない培養液で追加培養する段階を含むものである、請求項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
  7. 前記分化誘導段階は、3日以上行われるものである、請求項5または6に記載の神経膠様細胞の製造方法。
  8. 前記再培養する段階は、3日以上である、請求項5、6または7に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
  9. 前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、第1化合物カクテルにRAR作用剤をさらに含むものである、請求項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
  10. 請求項1~のいずれか1項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞を有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤。
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