JP7285591B2 - 体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患の予防または治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法 - Google Patents
体細胞から分化した新規な神経膠様細胞、その製造方法、その製造用カクテル組成物、これを含む神経疾患の予防または治療用細胞治療剤およびこれを投与して神経疾患を予防および治療する方法 Download PDFInfo
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Description
さらに、本発明は、ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して分化を誘導する分化誘導段階を含む神経膠様細胞を製造する方法を提供することができる。
ヒト包皮(foreskin)線維芽細胞(SCC058、Millipore社)を、10%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)が添加された高濃度グルコースDMEM(Welgene社)で培養した。ヒトシュワン細胞を、成長添加剤(Science社)および1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)を含有するシュワン細胞基本培地(ScienCell社)から構成されたシュワン細胞培地で培養した。ヒトニューロン細胞株NSC34を、10%FBSおよび1%ペニシリンおよびストレプトマイシン(Welgene社)が添加された高濃度グルコースDMEM(Welgene社)で培養した。
分化誘導培地(Reprogramming media;RM):ノックアウトDMEM(Gibco社)、15%ノックアウト血清補充物、5%FBS(Gibco社)、1%Glutamax(Gibco社)、1%非必須アミノ酸(Gibco社)、0.1mM β-メルカプトエタノール(Sigma社)およびIXペニシリン/ストレプトマイシン、第1化合物カクテル(表1、あるいは図2:500μMバルプロ酸(V)、10μM CHIR99021(C);5μM RepSox(R);25μMフォルスコリン(F);10μMトラニルシプロミン(P);1μM TTNPB(T))、(カクテルに使用されたすべての小分子物質はMedchemexpress社から入手)。
表1あるいは図2に示されている第1化合物カクテルに使用された化合物の代わりに、表2あるいは図6に示されている化合物に代替されたという点だけを除けば、製造例2と同一の構成で培地を製造した。第2化合物カクテルの場合、下記表2にて、LY2090314、SB-431542およびNKH477が含まれた以外は、製造例2の成熟培地の製造方法と同様に製造した。
図3に示されるように、初期転換を確認した後、我々はいくつかの他の転換プロトコルを用いて転換効率をモニタリングした。転換条件により、神経膠様細胞は3つのプロトコル、すなわち、プロトコルI(図14)、プロトコルII(図15)およびプロトコルIII(図16)の神経膠様細胞タイプに分類される(図14~16)。プロトコル1は、成熟時間の変化により誘導時間が固定される特徴があり、プロトコル2は、誘導時間が変化する特徴があり、プロトコル3は、分化した細胞が化学物質なしに再培養される特徴がある。プロトコルI、プロトコルIIおよびプロトコルIIIによって転換された神経膠様細胞は、それぞれC1-神経膠様細胞(C1-GLC)、C2-神経膠様細胞(C2-GLC)およびC3-神経膠様細胞(C3-GLC)と称し、これらそれぞれの細胞形態を顕微鏡分析により調査した時(図18~20)、分化に使用された本来のヒト包皮線維芽細胞(図17)とは異なる形態を見せたが、ヒトシュワン細胞(図21)と類似の形態であることが分かった。
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、RMに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた60mmの組織培養プレート(室温で2時間1:100のマトリゲル(BD Biosciences社)で予めコーティングされる)に6x105細胞数の密度で分注する。その培養液を3日ごとに新しいRM培地に入れ替えて、分化誘導段階による培養を進行させる。前記分化誘導段階による誘導(induction)を6日まで継続する。誘導6日目に、培養液をMMに入れ替え、追加の3~12日間成熟させる段階による培養を継続する。
前記実施例1において成熟させる段階による培養を3日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例1において成熟させる段階による培養を6日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例1において成熟させる段階による培養を9日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例1において成熟させる段階による培養を12日にした以外は、実施例1と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、RMに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた60mmの組織培養プレート(室温で2時間1:100のマトリゲル(BD Biosciences社)で予めコーティングされる)に6xl05細胞数の密度で分注する。その培養液を3日ごとに新しいRM培地に入れ替えて分化誘導段階による培養を行う。分化誘導段階による培養を6~15日間継続し、誘導期間後、直ちに3日間の固定成熟期間(fixed maturation period)をおいた。あるいは成熟期間なしに18日間誘導した。
前記実施例2において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養を12日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例2において分化誘導段階による培養を9日、成熟させる段階による培養を9日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例2において分化誘導段階による培養を12日、成熟させる段階による培養を6日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例2において分化誘導段階による培養を15日、成熟させる段階による培養を3日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例2において分化誘導段階による培養を18日、成熟させる段階による培養を0日にした以外は、実施例2と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
ヒト包皮線維芽細胞をトリプシン処理し、RMに再懸濁する。細胞をマトリゲルがコーティングされた60mmの組織培養プレート(室温で2時間1:100のマトリゲル(BD Biosciences社)で予めコーティングされる)に6x105細胞数の密度で分注する。その培養液を3日ごとに新しいRM培地に入れ替える。誘導を6日まで継続する。誘導6日目に、培養液をMMに入れ替え、追加の3日間成熟させる段階による培養を継続するか、成熟させる段階を省略する。このような分化誘導段階または成熟段階による培養の終了時、その細胞をアクターゼ(accutase)細胞脱着溶液(Millipore社)処理により収獲し、その収獲された細胞をシュワン細胞培地に再懸濁し、新しい組織培養プレートに分注する。細胞を追加の6~12日間成長させる。培養液には3日ごとに新しい培地を補充した。
前記実施例3において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養を省略後、12日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例3と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例3において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養3日後、6日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例3と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
前記実施例2において分化誘導段階による培養を6日、成熟させる段階による培養6日後、12日間の再培養段階を進行させた以外は、実施例3と同様の方法で製造された体細胞から分化した新規な神経膠様細胞
プロトコルIIIで製造したC3-神経膠様細胞を6~12日の再培養の終了時にトリプシン処理し、凍結培地(20%FBS、10%DMSOを含有する高濃度グルコースDMEM(Welgene社)に再懸濁し、追加の使用時まで液体N2で凍結保存する。使用時、C3神経膠様細胞のバイアルを解凍し、その細胞を完全シュワン細胞培地に分注する。
実験例1:低分子化合物を用いた線維芽細胞の神経膠様細胞への直接分化
体細胞からの神経膠様細胞の分化に関連し、従来のいくつかの重要な信号伝達経路を調節する小分子物質(化合物)がマウス線維芽細胞を全分化能幹細胞(CiPSC)に転換できることが報告されてはいる。また、体細胞から全分化能プログラムの一時的な活性化はこれらの細胞を活性化した状態にするというのが、従来の研究で報告された。すなわち、このような活性化された細胞は、これらをいくつかの成長因子およびサイトカインに単純に露出させることでいくつかの系統(lineage)に誘導できる可能性が提示されてきた。そこで、本発明は、CiPSC細胞を生成するために使用されたものと類似の化学物質を用いて類似の活性化された状態を生成しようと試み、このような状態を様々な系統に誘導しようと試みた。我々はこのような化学物質を用いた簡略な処理方式により様々な系統に誘導できる活性化状態につながると仮定して、本発明を改良した(図1)。
DNase Iで処理した全体RNAを上述のようにRNeasy Miniキット(QIAGEN社、CA、USA)を用いて抽出した。GeneChip Mouse 2.0 ST arrays(Affymetrix社、CA、USA)への混成化を行った。得られるデータを要約し、AffymetrixR Power Tools(Affymetrix社、CA、USA)で実施されたロバスト多重平均(robust multi-average)方法を利用して正規化した。
誘導段階および/または成熟段階、あるいは再培養段階の後のヒト線維芽細胞由来の神経膠様細胞(Glia-like Cell、GLC)を収穫し、1XPBS(Welgene社)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich社)で10分間固定した後、22℃で10分間PBSで0.25%Triton X-100(USB Corporation社)で透過処理し、PBSで各5分ずつ2回洗浄した。次に、細胞をPBSで1%BSA(Amresco社)、22.52mg/mLグリシン(Affymetrix社)、0.1%Tween20(Affymetrix社)を含有するブロッキング溶液で60分間ブロッキングした。次に、その細胞を4℃で一晩ブロッキング溶液で希釈した適切な一次抗体で染色した。使用された抗体はウサギ抗-GFAP抗体(Abcam社、希釈1:100)、ウサギ抗S-100抗体(Abcam社、希釈1:100)、およびマウスモノクローンP0(MBP)抗体(Abcam社、希釈1:100)であった。一次抗体の培養後、細胞をPBSTで3回洗浄し、1:100で希釈したAlexa-488-接合ヤギ二次抗マウス抗体(A11001、Invitrogen社)またはAlexa-563-結合ヤギ二次抗ウサギ抗体(A21428、Invitrogen社)と室温で2時間培養した。細胞を1μg/mL DAPI(D9542、Sigma-Aldrich社)と5分間室温で培養して核を染色した。次いで、蛍光顕微鏡(IX71S1F3、Olympus社)を用いてサンプルを可視化した。
次に、我々は複数の時点でC1-神経膠様細胞のグローバル遺伝子の発現パターンをプロファイリングし、重要なシュワン細胞/神経膠細胞のマーカーについて調査した。
末梢神経系および中枢神経系で神経膠細胞を支持する神経保護および復旧特性は一般的に、その細胞によって放出されるいくつかの成長因子およびサイトカインによって付与される。様々な種類の生成された神経膠様細胞も類似のタンパク質分泌特性を有するか否かを確認するために、我々は分泌されたサイトカインおよび成長因子をプロファイリングした。線維芽細胞を実施例1、2~3のプロトコルに基づいて神経膠様細胞(GLC)に転換する。調節された培地(Conditioned media)を上記で各プロトコルの最後の段階で回収し遠心分離して任意の細胞カスまたは粒子状物質を除去した。前記調節された培地をドットブロットキット(Human proteome profiler、R&D systems社)に提供された希釈緩衝液に20倍希釈した。異なるプロトコルにより作製された神経膠様細胞の調節された培地で分泌される様々なサイトカインや成長因子を検出するためのドットブロット実験を製造会社のプロトコル(R&D systems)によって行った。基本培地を陰性対照群として使用した。前記ドットブロットキットで提供されるサイトカインや成長因子の分泌をドットブロットにより確認し、これらの中で線維芽細胞に比べて神経膠様細胞で分泌量が明確に増加する因子は図33に示されているものであった。
様々なプロトコルの神経膠様細胞によって培地内に放出された様々なサイトカインの定量(Quantitation)をBDNFおよびGDNF(Promega社)IL8、HGF、MIF、GRO-a(R&D systems社)に対する商業的に利用可能なキットを用いて行った。上述した様々なプロトコルによって線維芽細胞を神経膠様細胞に転換する。調節された培地を言及したように複数の時点で回収し、遠心分離して任意の細胞カスおよび粒子状物質を除去した。前記調節された培地をELISAキットに提供された希釈緩衝液に20倍希釈した。ELISA定量を製造会社のプロトコルによって行った。基本培地を陰性対照群として使用した。本実験では、面積が28.2cm2である60mm culture dishで3.2x106 cellsを3日間育てる間に培地に分泌された各因子の濃度に対して測定した。
シュワン細胞は、軸索の健康および機能性を促進し軸索の再生に役立つ多くの神経栄養および神経保護因子を分泌することが知られている。複数の部類に属する我々の化学的に誘導された神経膠様細胞が機能的な生理学的対応物(counterpart)と一致するか否かを確認するために、我々は調節された培地を製造し、運動神経細胞であるNSC-34を処理し、神経突起の成長に及ぼすその培地の影響を評価しようとした。
神経膠様細胞を神経膠細胞の特徴的なマーカーであるGFAP抗体で免疫染色した後、DAPI染色核を基準として免疫陽性細胞を計数することにより、転換効率の定量を行った(図28)。GFAPの発現を示す細胞によって決定されたもので、神経膠様細胞への転換収率は85%である(図45)。
再生医学および治療分野において神経膠様細胞の適用の可能性に関連して重要な特徴の1つは、細胞増殖および拡張の能力である。このような特徴を評価するために、再培養の6日目にC3-神経膠様細胞を12時間Eduを混入した後(Click-iTTM EdU Alexa FluorTM 555、Invitrogen、MA、USA)を用いて、製造会社のプロトコルによって細胞の製造を行った。次に、その細胞を核を検出するためにHoechst33342で同時染色した。EDU+Hoechst33342陽性細胞を2つの個別的な顕微鏡視野(microscopic field)で計数し、その顕微鏡視野に存在する全体Hoechst33342陽性細胞の百分率で表した。
神経膠様細胞を用いた治療剤の開発において最も重要な点の1つは、作製された細胞を安定して保管し運搬できなければならないという点である。細胞を補完する最も良い方法の1つは、細胞を低い温度で凍結させる方法がある。本技術により作製された神経膠様細胞を凍結し解凍した時、活性変化を調査するために、C3-GLC冷凍培養液(20%FBS、10%DMSを含有した高濃度ブドウ糖DMEM)に培養後、液体窒素で急速に凍結させ、1週間後に解凍してシュワン細胞培養液で再培養しながら細胞の特徴を調査した。
体細胞から分化した神経膠様細胞の細胞治療剤への適用の可能性を確認するために、動物モデルにおいてこの細胞の神経細胞の保護および再生機能を確認しなければならない。このような目的でネズミの大腿部神経を損傷させて慢性狭窄モデル(rat chronic constriction injury、CCI、model)を作り、損傷した神経にヒトの線維芽細胞、ヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、8週後に神経再生程度を様々な方法で分析して神経の再生程度を測定した。
神経膠様細胞への転換に必要なカクテルで使用された化学物質の用量(dose)は、使用された化学物質のIC50値および文献に報告された用量から選択された。追加的に最適化し転換に使用された化学物質の用量範囲のアイディアを得るために、我々は初期転換に使用された濃度の2倍を含む用量およびIC50値などの様々な用量範囲を選択して細胞転換実験を行った。我々は使用された化学物質の毒性とともに転換収率をモニタリングした。化合物カクテルは表4(図58)によって製造され、分化結果に対する効果の評価は図59~62に示した。前記図59~62による結果をみると、最適化された濃度より多い濃度が使用された時、細胞に対する毒性が一部見えるが、細胞転換は効果的に行われるということを確認することができ、IC50またはその2倍程度の濃度を使用した時は、細胞転換が効果的に行われないことを確認することができた。
本技術を患者に合わせた細胞治療剤の開発に用いるためには、本技術が多様な線維芽細胞に適用可能であることを確認しなければならない。したがって、CMT(charcot-marie-Tooth disease)疾患を患う患者の皮膚およびCoriell Instituteから購入した、互いに異なる3つの線維芽細胞を用いてそれぞれ異なる細胞を使用したことを除けば、実施例2、3の方法と同様に、C2-GLC(15+3)およびC3-GLC(6+3+6)を作製した。神経膠様細胞の分化の確認は顕微鏡の観察により分化した細胞の形態をみて判断した。
体細胞から分化した神経膠様細胞の中枢神経関連の疾患に対する細胞治療剤への適用の可能性を確認するために、動物モデルにおいてこの細胞の神経細胞の保護および再生機能を確認しなければならない。このような目的でネズミの脊髄を損傷させて脊髓損傷モデル(rat spinal cord injury model、SCI)を作り、損傷した神経にヒトのシュワン細胞、神経膠様細胞を移植した後、2週後に神経再生程度を様々な方法で分析して神経の再生程度を測定した。
体細胞から分化した神経膠様細胞の細胞治療剤への適用の可能性のために、細胞が体内移植後どの程度体内に留まるかを確認することが必要である。ウイルスを用いて緑色蛍光を発するタンパク質(GFP、green fluorescence protein)の遺伝子を神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞で発現させ、PBSに入った5.5x105個のGFP-発現神経膠様細胞およびヒトシュワン細胞を同量のTissel溶液に混合してネズミ(Rat)の大腿部に移植した。指定された時間後、蛍光イメージングによりネズミの大腿部で発生する蛍光の強度を測定した(図81)。
Claims (10)
- 体細胞から分化し、20,000pg/ml以上のHGFを分泌し、150pg/ml以上のBNDFを分泌し、かつ、10ng/ml以上のMIFを分泌する神経膠様細胞であって、
前記体細胞は皮膚由来線維芽細胞であり、
前記神経膠様細胞は、
(i)ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導し、
ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はプラシノスタット(Pracinostat)であり、前記GSK抑制剤はLY2090314であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はSB431542であり、前記cAMP作用剤はNKH477であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はSP2509である、または
ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はバルプロ酸(Valproic acid)であり、前記GSK抑制剤はChir99021であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はRepSoxであり、前記cAMP作用剤はフォルスコリン(Forskolin)であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はパルネート(parnate;Tranylcypromine)である、
分化誘導段階と、
(ii)Chir99021、RepSoxおよびフォルスコリン(Forskolin)、または、LY2090314、SB431542およびNKH477を含む第2化合物を用いる処理を含む、分化誘導後の成熟段階と、
(iii)成熟後の再培養(re-culture)段階と
を含む方法により製造されるものである、神経膠様細胞。 - 前記第1化合物カクテルは、RAR作用剤をさらに含むものである、請求項1に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
- 前記皮膚は、表皮、真皮および脂肪層からなる群より選択される1種以上である、請求項1に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
- 前記皮膚由来線維芽細胞は、包皮由来線維芽細胞である、請求項1に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞。
- 体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法であって、
前記体細胞は皮膚由来線維芽細胞であり、
(i)ヒストンデアセチラーゼ抑制剤、GSK抑制剤、ALK-5キナーゼ抑制剤、cAMP作用剤およびヒストンデメチラーゼ抑制剤を含む第1化合物カクテルを、前記体細胞に処理して誘導し、
ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はプラシノスタット(Pracinostat)であり、前記GSK抑制剤はLY2090314であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はSB431542であり、前記cAMP作用剤はNKH477であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はSP2509である、または
ここで前記ヒストンデアセチラーゼ抑制剤はバルプロ酸(Valproic acid)であり、前記GSK抑制剤はChir99021であり、前記ALK-5キナーゼ抑制剤はRepSoxであり、前記cAMP作用剤はフォルスコリン(Forskolin)であり、前記ヒストンデメチラーゼ抑制剤はパルネート(parnate;Tranylcypromine)である、
分化誘導段階と、
(ii)
- Chir99021、RepSoxおよびフォルスコリン(Forskolin)、または、
- LY2090314、SB431542およびNKH477を含む、第2化合物で処理することを含む、分化誘導後の成熟段階と、
(iii)成熟後の再培養(re-culture)段階と
を含む、製造方法。 - 再培養する段階は、体細胞から分化した神経膠様細胞を低分子化合物およびマトリゲルを含まない培養液で追加培養する段階を含むものである、請求項5に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
- 前記分化誘導段階は、3日以上行われるものである、請求項5または6に記載の神経膠様細胞の製造方法。
- 前記再培養する段階は、3日以上である、請求項5、6または7に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
- 前記体細胞から分化した神経膠様細胞は、第1化合物カクテルにRAR作用剤をさらに含むものである、請求項5に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞の製造方法。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載の体細胞から分化した神経膠様細胞を有効成分として含む神経疾患治療用細胞治療剤。
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