BR112014010776B1 - Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes - Google Patents

Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes Download PDF

Info

Publication number
BR112014010776B1
BR112014010776B1 BR112014010776-9A BR112014010776A BR112014010776B1 BR 112014010776 B1 BR112014010776 B1 BR 112014010776B1 BR 112014010776 A BR112014010776 A BR 112014010776A BR 112014010776 B1 BR112014010776 B1 BR 112014010776B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cells
cell
neurons
differentiation
midbrain
Prior art date
Application number
BR112014010776-9A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112014010776A8 (pt
BR112014010776A2 (pt
Inventor
Lorenz Studer
Jae-Won Shim
Sonja Kriks
Original Assignee
Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48192829&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR112014010776(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Memorial Sloan-Kettering Cancer Center filed Critical Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
Priority to BR122020000182A priority Critical patent/BR122020000182B8/pt
Publication of BR112014010776A2 publication Critical patent/BR112014010776A2/pt
Publication of BR112014010776A8 publication Critical patent/BR112014010776A8/pt
Publication of BR112014010776B1 publication Critical patent/BR112014010776B1/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

neurônios dopaminérgicos (da) mesencefálicos para enxerto. a presente invenção refere-se ao campo da biologia das células tronco, em particular, a linhagem de diferenciação específica de células tronco pluripotentes ou multipotentes, que podem incluir, mas não se limitam a, células tronco embrionárias humanas (hesc) em adição células tronco pluripotentes induzidas não embrionárias humanas (hipsc), células tronco somáticas, células tronco para pacientes com uma doença, ou qualquer outra célula capaz de diferenciação específica de linhagem. especificamente descritos estão métodos para direcionar a diferenciação específica da linhagem hesc e/ou hipsc em células progenitoras do assoalho do mesencéfalo e, em seguida, além de em grandes populações de neurônios dopaminérgicos (da) foxa2+lmx1 a+ th+ de destino o mesencéfalo, usando novas condições de cultura. os neurônios dopaminérgicos (da) foxa2+lmx1 a+ th+ de destino o mesencéfalo feitas utilizando os métodos da presente invenção são ainda contemplado para várias utilizações, incluindo, mas não limitado a, o uso em ensaios in vitro de descoberta de drogas, pesquisa neurologia, e como um agente terapêutico para reverter doença de, ou dano a, uma falta de neurônios dopaminérgicos em um paciente. além disso, as composições e os métodos são fornecidos para diferenciar neurônios dopaminérgicos (da) foxa2+lmx1 a+ th+ de destino o mesencéfalo a partir de células tronco pluripotentes humanas para uso em modelagem de doenças, em particular a doença de parkinson. além disso, neurônios da autênticos são enriquecidos por marcadores, tais como o cd142 e células neuronais do tipo a9.

Description

[001] A presente invenção foi realizada em parte com o apoio do governo sob NIH/NINDS concessão NS052671 e NIH/NINDS concessão P50 NS047085, do Instituto de Saúde Nacional dos Estados Unidos (NIH) e Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e AVC (NINDS). Como tal, o Governo dos Estados Unidos detém determinados direitos sobre a invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se ao campo da biologia das células estaminais, em particular à diferenciação de linhagem específica de células estaminais pluripotentes ou multipotentes, as quais podem incluir, mas sem que tal constitua qualquer limitação, células estaminais embriónicas humanas (hESC) para além de células estaminais pluripotentes induzidas não embriónicas humanas (hiPSC), células estaminais somáticas, células estaminais de doentes com uma doença ou qualquer outra célula com capacidade de diferenciação específica de linhagem. Especificamente descritos são os métodos para direcionar a diferenciação de linhagem específica de hESC e/ou hiPSC para células progenitoras do mesencéfalo de placas de fundo e posteriormente para populações grandes de neurônios dopaminérgicos FOXA2+LMX1A+TH+ de destino mesencefálico, utilizando novas condições de cultura. Os neurônios dopaminérgicos FOXA2+LMX1A+TH+ de destino mesencefálico, produzidos utilizando métodos da presente invenção são ainda contemplados para várias utilizações, incluindo, sem que tal constitua qualquer limitação, utilização em análises de descoberta por resistência in vitro, pesquisa neurológica e como um tratamento para a doença reversa de, ou dano, ou falta de neurônios dopaminérgicos em um doente. Para além disso são apresentadas composições e métodos para diferenciar neurônios dopaminérgicos (DA) de destino mesencefálico, a partir de células estaminais pluripotentes humanas para utilização na moldagem da doença, em particular na doença de Parkinson. Para além disso os neurônios DA autênticos são enriquecidos por marcadores, tais como células neuronais do tipo CD 142 e A9 .
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] As populações celulares que retêm a capacidade de diferenciar para inúmeros tipos de células especializadas são úteis para desenvolver grandes números de populações celulares diferenciadas por linhagens específicas. Estas populações celulares que retêm uma capacidade para ainda diferenciar células especializadas contêm células pluripotentes. As células pluripotentes podem ter origem em células estaminais somáticas embriónicas e/ou não embriónicas.
[004] Estas populações celulares diferenciadas por linhagens específicas são contempladas para se encontrarem terapias de substituição de células para doentes com doenças que resultam na perda de função de uma população celular. Para além do seu valor terapêutico, as células diferenciadas por linhagem específica são igualmente ferramentas de pesquisa valiosas para uma série de fins incluindo análises de rastreio in vitro para identificar, confirmar e testar especificação da função ou para testar a administração de moléculas terapêuticas para tratar a doença de linhagem celular específica.
[005] Células estaminais somáticas e embriónicas anteriores foram utilizadas como sistemas e modelos terapêuticos para doenças neurodegenerativas. Foram realizadas pesquisas e desenvolvimentos tecnológicos relacionados com diferenciação direcionada de células estaminais somáticas e embriónicas no campo das doenças do sistema nervoso central (CNS), tais como, Huntington, Alzheimer, Parkinson e esclerose múltipla. No entanto, os resultados destes estudos revelam a fraca capacidade destas células utilizadas in vivo que permitem ao doente recuperar função neuronal e muitas vezes dão lugar ao crescimento de tumores não desejados nos doentes.
[006] Por conseguinte, existe a necessidade de composições e métodos para se obter populações de células com capacidade de serem tanto utilizadas na pesquisa como em métodos terapêuticos para tratar doenças resultando em uma perda de células com uma função particular.
RESUMO DA INVENÇÃO
[007] A presente invenção refere-se ao campo da biologia das células estaminais, em particular à diferenciação específica de linhagem de células estaminais pluripotentes ou multipotentes, as quais podem incluir, mas sem que tal constitua qualquer limitação, células estaminais embriónicas humanas (hESC) para além de células estaminais pluripotentes induzidas não embriónicas humanas (hiPSC), células estaminais somáticas, células estaminais de doentes com uma doença ou qualquer outra célula com capacidade de diferenciação específica de linhagem. Especificamente descritos são os métodos para direcionar a diferenciação específica de linhagem de hESC e/ou hiPSC para células progenitoras do mesencéfalo de placas de fundo e posteriormente para populações grandes de neurônios produtores de dopamina FOXA2+LMX1A+TH+ de destino mesencefálico, utilizando novas condições de cultura. Neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2+LMX1A+TH+ (DA) de destino mesencefálico levaram a que os métodos da presente invenção fossem ainda contemplados por várias utilizações incluindo, sem que tal constitua qualquer limitação, utilização de análises de descoberta de fármacos in vitro, pesquisa neurológica e como um método terapêutico para doença reversa de, ou dano ou falta de neurônios dopaminérgicos em um doente. Para além disso são apresentadas composições e métodos para diferenciar neurônios dopaminérgicos (DA) destinados ao mesencéfalo a partir de células estaminais pluripotentes humanas para utilização na moldagem da doença, em particular na doença de Parkinson. Para além disso os neurônios DA autênticos são enriquecidos por marcadores, tais como células neuronais do tipo CD 142 e A9.
[008] Um kit que inclui um primeiro inibidor de sinal, um segundo inibidor de sinal e um terceiro inibidor de sinal, em que o primeiro inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir o fator de transformação de crescimento beta (TGF[3)/sinal Activin-Nodal, o segundo inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir o sinal Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD) e o terceiro inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β) para ativação de sinal sem asas (Wnt). Em uma realização, o primeiro inibidor referido é LDN-193189. Noutras realizações, o primeiro inibidor referido é selecionado do grupo que consiste de LDN- 193189, derivados do mesmo e misturas dos mesmos. Em uma realização, o segundo inibidor referido é SB431542. Em outras realizações, o segundo inibidor referido é selecionado do grupo que consiste de SB431542, derivados do mesmo e misturas do mesmo. Em uma realização, o terceiro inibidor referido é CHIR99021. Em outras realizações, o terceiro inibidor referido é selecionado do grupo que consiste de CHIR99021, derivados do mesmo e misturas do mesmo. Em uma realização, o referido kit inclui ainda um ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) e um ativador do sinal da família do receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGF) 8. Em uma realização, o referido kit inclui ainda fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial, cAMP dibutirilo e fator de transformação de crescimento tipo β3. Em uma realização, o referido kit inclui anticorpos selecionados do grupo que consiste de anti-tirosina hidroxilase (TH), proteína A2 (FOXA2) de domínio anti-forkhead e um fator de transcrição 1 de homeodomínio anti-LIM, alfa (LMX1A). Em uma realização, o referido kit inclui ainda uma célula selecionada do grupo que consiste de uma célula estaminal, célula estaminal embriónica, célula estaminal pluripotente induzida e uma célula modificada. Em uma realização, o referido kit inclui ainda instruções para diferenciar células progenitoras e neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico. Em uma realização, o referido kit inclui ainda instruções para se obter uma célula de um doente com doença de Parkinson (PD). Uma composição que inclui uma população celular em contato com um primeiro inibidor de sinal e um segundo inibidor de sinal, em que mais do que 40% da referida população celular é positiva para a proteína A2 (FOXA2) de domínio forkhead, em que a referida população celular foi previamente contatada por um primeiro inibidor de sinal, um terceiro inibidor de sinal e um ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH), em que o primeiro inibidor de sinal referido tem capacidade para reduzir o fator de transformação de crescimento beta (TGFP)/sinal Activin-Nodal, o segundo inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir glicogénio sintase 3β (GSK3β) para ativação de sinal sem asas (Wnt) e o terceiro inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir o sinal Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD). Em uma realização, o primeiro inibidor referido é uma molécula pequena selecionada do grupo que consiste de LDN-193189, derivados do mesmo e misturas do mesmo. Em uma realização, o segundo inibidor referido é selecionado do grupo que consiste de CHIR99021 e derivados do mesmo. Em uma realização, o terceiro inibidor referido é selecionado do grupo que consiste de SB431542, derivados do mesmo e misturas do mesmo. Em uma realização, o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) referido é selecionado do grupo que consiste de Sonic hedgehog (SHH) C25II e agonista da pequena molécula receptora Smoothened (SMO), em que o referido agonista é purmofamina. Em algumas realizações, a população celular referida foi ainda previamente contatada com o fator de crescimento do Fibroblasto 8 (FGF8). Em uma realização, a referida maioria de células que inclui a população celular referida é a proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+LIM+ fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM+, alfa (LMX1 A),+ NGN2+ e DDC+ células progenitoras do mesencéfalo de placas de fundo. Em uma realização, a população celular referida é selecionada do grupo que consiste de células de roedores, células de primatas e células de humanos. Em uma realização, estas células são derivadas das células de doentes com a doença de Parkinson (PD). Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 50% positiva para a proteína de domínio forkhead (FOXA2). Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 60% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 70% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 80% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 90% positiva para a proteína de domínio forkhead A2. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 95% a 100% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Uma composição que inclui uma população celular in vitro, em que a maioria da população celular referida é tirosina hidroxilase(TH)+ proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+ fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM +, alfa (LMX1 A)+ neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, esses 40% mais dos neurônios dopaminérgicos (DA do mesencéfalo em placa basal referidos são tirosina hidroxilase positiva (TH+). Em uma realização, a população celular referida e, pelo menos, 50% tirosina hidroxilase positiva. Em uma realização, a população celular referida e, pelo menos, 60% tirosina hidroxilase positiva. Em uma realização, a população celular referida e, pelo menos, 70% tirosina hidroxilase positiva. Em uma realização, a população celular referida e, pelo menos, 80% tirosina hidroxilase positiva. Em uma realização, a população celular referida e, pelo menos, 90% tirosina hidroxilase positiva. Em uma realização, a população celular referida e, pelo menos, 95% a 100% tirosina hidroxilase positiva. Em algumas realizações, a população celular referida inclui uma maioria de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, os neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal referidos são positivos para marcadores selecionados do grupo que consiste de receptor nuclear NURR1 (NR4A2), beta- tubulina de classe III específica de neurônios (Tujl), TTF3, homeodomínio tipo emparelhado 3 (PITX3), complexo Achaete-Scute (ASCL), fator celular-B precoce 1 (EBF-1), fator 3 celular-B precoce (EBF-3) e transtiretina (TTR). Em uma realização, a população dos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal referida é positiva para uma molécula selecionada do grupo que consiste de DA, ácido 3,4- Dihidroxi-Fenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA). Em uma realização, o referido marcador é selecionado do grupo que consiste de uma proteína e um ácido nucleico. Em algumas realizações, a população dos neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ do mesencéfalo em placa basal referida é capaz de enxertar in vivo um doente selecionado do grupo que consiste de um doente com doença de Parkinson (PD). Em uma realização, os neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ do mesencéfalo em placa basal referidos têm capacidade de enxertar in vivo e facultar função neuronal da dopamina (DA).
[009] Em algumas realizações, as invenções apresentam uma composição, que inclui uma população celular em contato com LDN-193189 e CHIR99021, em que mais do que 40% da referida população celular é positiva para a proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2) e, em que a referida população celular foi previamente contatada por LDN-193189, SB431542, um ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) e CHIR99021. Em uma realização, o referido ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é selecionado do grupo que consiste de Sonic hedgehog C25ll (SHH) e purmorfamina. Em uma realização, os 10% mais referidos da população celular é duplamente positivo para proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2) e fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM (LMX1 A). Em uma realização, a referida maioria da população celular é uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em algumas realizações, a população celular referida foi previamente contatada com o fator de crescimento do Fibroblasto 8 (FGF8). Em uma realização, a população celular referida é selecionada do grupo que consiste de células de roedores, células de primatas e células de humanos. Em uma realização, as células humanas referidas são células de um doente com um sintoma neurológico de doença de Parkinson (PD). Em uma realização, a referida população celular é derivada de uma célula estaminal pluripotente induzida (iPSC). Em uma realização, mais do que 10% da referida população celular é selecionado do grupo que consiste de positivo duplo para proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)/fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa (LMX1A) e positivo duplo para proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)/ortodenticlo de homeodomínio 2 (OTX2).
[010] Em uma realização, as invenções apresentam um método para induzir diferenciações direcionadas de células em uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal, incluindo, a) a apresentação de i) uma população celular, em que a referida população celular é selecionada do grupo que consiste de uma célula estaminal não embriónica, uma célula estaminal embriónica, uma célula pluripotente não embriónica induzida e uma célula pluripotente modificada; e ii) um primeiro inibidor de sinal, um segundo inibidor de sinal, um ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) e um terceiro inibidor de sinal, em que o primeiro inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir o fator de transformação de crescimento beta (TGFP)/sinal Activin-Nodal, o segundo inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir o sinal Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD) e o terceiro inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β) para ativação de sinal sem asas (Wnt); b) contatando a referida população celular com o primeiro e segundo inibidores de sinal referidos, c) após contatar a referida população celular com o primeiro e segundo inibidores de sinal referidos contatando ainda as referidas células com o referido ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) sob condições para diferenciar uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal; e) após contatar a população celular referida com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) contatando ainda as referidas células com o referido terceiro inibidor para diferenciar a referida população celular para uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, o referido contato com o primeiro e segundo inibidores referidos é, sob condições, capaz de resultar na referida população diferenciada de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, o referido contato com o primeiro e segundo inibidores referidos está durante 1 hora em placas de células in vitro. Em uma realização, o referido contato com o primeiro e segundo inibidores referidos está durante 48 horas em placas de células in vitro. Em uma realização, o referido contato com o primeiro e segundo inibidores referidos está durante 62 horas em placas de células in vitro. Em uma realização, o contato referido das células referidas com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é, sob condições, capaz de resultar na referida população diferenciada de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, o contato referido das células referidas com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é de, pelo menos, 24 horas a 36 horas após contato da referida população celular com o primeiro e segundo inibidores referidos. Em uma realização, o contato referido das células referidas com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é de até 144 horas. Em uma realização, o referido contato das referidas células com o terceiro inibidor referido é, sob condições, capaz de resultar na referida população diferenciada de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, o contato referido das células referidas com o terceiro inibidor é de, pelo menos 24 horas a 36 horas após o contato com a referida população celular com o referido ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH). Em uma realização, o contato referido das células referidas com o terceiro inibidor é de até 192 horas. Em uma realização, a população celular referida é diferenciada para as células progenitoras do mesencéfalo em placa basal, pelo menos, ao dia 11 após contato das referidas células com o primeiro e segundo inibidores referidos. Em uma realização, o primeiro inibidor referido é SB431542. Em uma realização, o segundo inibidor referido é LDN-193189. Em uma realização, o terceiro inibidor referido é CHIR99021. Em uma realização, o referido ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é selecionado do grupo que consiste de Sonic hedgehog C25ll e purmorfamina. Em uma realização, o referido método apresenta ainda o fator de crescimento do fibroblasto 8 (FGF8) e o contato da referida população celular com o referido FGF8, sob condições capazes de resultar na referida população diferenciada de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, o contato referido das células referidas com FGF8 é de, pelo menos, 24 horas a 36 horas após contato da referida população celular com o primeiro e segundo inibidores referidos. Em uma realização, o contato referido das células referidas com FGF8 referido é de até 144 horas. Em uma realização, a população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal inclui mais do que 40% de células da proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+. Em uma realização, a população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal inclui mais do que 40% de células da proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+ fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, células alfa(LMX1 A)+ . Em uma realização, o referido método inclui ainda a fase e) contatar a referida população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal com meio de maturação de neurônios, sendo que este meio inclui meio N2, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial, cAMP dibutirilo (dbcAMP) e fator de transformação de crescimento tipo 133 para diferenciação de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal para neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, o referido método inclui ainda e) contato com a referida população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal com meio de maturação de neurônios com suplemento B27 para diferenciação de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal para neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, as referidas células com meio neurobasal com suplemento B27 são contactadas com fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial, cAMP dibutirilo e fator de transformação de crescimento tipo 133 para diferenciação de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal para neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal referidos são proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa (LMX1A)+, proteína 1 relacionada com receptor nuclear (NURR1)+ e tirosina hidroxilase (TH)+. Em uma realização, mais do que 40% dos neurônios dopaminérgicos (DA do mesencéfalo em placa basal referidos são tirosina hidroxilase (TH). Em uma realização, a referida população de neurônio dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal é diferenciada, pelo menos, ao dia 25 após contato com a referida população celular com o primeiro e segundo inibidores referidos. Em uma realização, os neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal são positivos para marcadores que identificam moléculas. Em uma realização, estes marcadores são selecionados do grupo que consiste de tirosina hidroxilase (TH), proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2), fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM , dopamina, ácido 3,4- Dihidroxi- fenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), receptor alfa, nuclear NURR1 (NR4A2), beta-tubulina de classe III específica de neurônios (Tujl), TTF3, homeodomínio tipo emparelhado 3 (PITX3), complexo Achaete-Scute (ASCL), fator celular-B precoce 1 (EBF-1), fator 3 celular-B precoce (EBF-3) e transtiretina (TTR), transtiretina (TTR), sinapsina, dopaminatransporter (DAT), e G-proteína acoplada e canal de potássio que retifica interiormente (Kir3.2/GIRK2). Em uma realização, a referida molécula é selecionada do grupo que consiste de uma proteína e um ácido nucleico. Em uma realização, a referida molécula é identificada utilizando um marcador selecionados do grupo que consiste de um anticorpo, um iniciador PCR, uma sequência de ácido nucleico e uma análise enzimática. Em uma realização, os referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal são capaz de enxertar in vivo um doente com a doença de Parkinson (PD) para facultar uma função neuronal da dopamina (DA). Em uma realização, o referido método inclui ainda, facultar a um doente com necessidade de neurônios produtores de dopamina, em que o referido doente apresenta, pelo menos, um sintoma neurológico e a fase de transplantar os neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal para este doente para lhe proporcionar função neuronal da dopamina (DA). Em uma realização, os referidos sintomas neurológicos são selecionados do grupo que consiste de tremor, bradiquinesia (extrema lentidão de movimentos), postura arqueada, instabilidade postural e rigidez. Em uma realização, este doente apresenta uma redução deste sintoma neurológico. Em uma realização, esta célula é selecionada a partir de células de roedores, células de primatas e células humanas. Em uma realização, as células humanas referidas são células de um doente com um sintoma neurológico de doença de Parkinson (PD).
[011] Em uma realização, as invenções apresentam um método para enxertar in vivo para tratamento terapêutico, incluindo a) facultar: i) uma população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal, em que mais do que 40% da referida população expressa tirosina hidroxilase (TH); e ii) um sujeito, em que o referido sujeito apresenta, Pelo menos, um sintoma neurológico; e b) transplantar os referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal para o referido sujeito sob condições que permitem enxerto in vivo para proporcionar função neuronal da dopamina (DA). Em uma realização, os referidos sintomas neurológicos são selecionados do grupo que consiste de tremor, bradiquinesia (extrema lentidão de movimentos), postura arqueada, instabilidade postural e rigidez. Em uma realização, este sujeito apresenta uma redução deste sintoma neurológico. Em uma realização, a referida população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal deriva da população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal tratada de acordo com os métodos das presentes invenções. Em uma realização, a referida população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal derivam da população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal tratada de acordo com um método que inclui ainda uma fase de contatar a referida população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal com meio de maturação neuronal, sendo que este meio inclui o meio N2, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial, cAMP dibutirilo e fator de transformação de crescimento tipo B3 a diferenciação de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal para neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, a referida população células progenitoras do mesencéfalo em placa basal derivam de uma população celular de acordo com um método das presentes invenções. Em uma realização, a referida população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal deriva de uma população celular tratada de acordo com um método para induzir diferenciação direcionada de células para uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal, incluindo, a) facultar i) uma população celular, em que a referida população celular é selecionada do grupo que consiste de uma célula estaminal não embriónica, uma célula estaminal embriónica, uma célula pluripotente não embriónica induzida e uma célula pluripotente modificada; e ii) um primeiro inibidor de sinal, um segundo inibidor de sinal, um ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) e um terceiro inibidor de sinal, em que o primeiro inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir o fator de transformação de crescimento beta (TGFP)/sinal Activin-Nodal, o segundo inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir o sinal Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD) e o terceiro inibidor de sinal referido tem capacidade de reduzir glicogénio sintase 3β (GSK3β) para ativação de sinal sem asas (Wnt); b) contatando a referida população celular com o primeiro e segundo inibidores de sinal referidos, c) após contatar a referida população celular com o primeiro e segundo inibidores de sinal referidos contatando ainda as referidas células com o referido ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) sob condições para diferenciar uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal; d) após contatar a população celular referida com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) contatando ainda as referidas células com o referido terceiro inibidor para diferenciar a referida população celular para uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, a referida população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal deriva de uma população celular selecionada do grupo que consiste de animais, primatas e humanos. Em uma realização, as células humanas referidas são células de um doente com um sintoma da doença de Parkinson (PD).
[012] Em uma realização, as invenções apresentam uma composição, que inclui uma população celular em contato com LDN-193189 e CHIR99021, em que mais do que 40% da referida população celular é positiva para a proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2) e, em que a referida população celular foi previamente contatada por LDN-193189, SB431542, um ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) e CHIR99021, em que o referido ativador do sinal Sonic hedgehog (SHH) é selecionado do grupo que consiste de Sonic hedgehog (SHH) C25ii e purmorfamina. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 50% positiva para a proteína de domínio forkhead (FOXA2). Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 60% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 70% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 80% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 90% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, a população celular referida é, pelo menos, 95% a 100% positiva para a proteína A2 de domínio forkhead. Em uma realização, mais do que 10% da referida população celular é selecionado do grupo que consiste de positivo duplo para proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)/fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM , alfa (LMX1A) e positivo duplo para proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)/ortodenticlo de homeodomínio 2 (OTX2). Em uma realização, a referida população celular é, pelo menos, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, pelo menos 95% a 100% positiva. Em uma realização, pelo menos 20% da referida população celular é positiva para um marcador selecionado do grupo que consiste de Nurrl+, CD142, DCSM1, CD63 e CD99. Em algumas realizações, a referida população celular é, pelo menos, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, pelo menos 95% a 100% positiva. Em algumas realizações, a referida população celular é, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, pelo menos 95% a 100% positiva. Em uma realização, a referida população célula'e selecionada do grupo que consiste de células de roedores, células de primatas, células de humanos e células de humanos de um doente com um sintoma neurológico da doença de Parkinson (PD).
[013] Em uma realização, as invenções apresentam um método para induzir diferenciações direcionadas de células em uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal, incluindo, a) apresentando i) uma população celular, em que a referida população celular é selecionada do grupo que consiste de uma célula estaminal não embriónica, uma célula estaminal embriónica, uma célula pluripotente não embriónica induzida e uma célula pluripotente modificada; e ii) um primeiro inibidor de sinal, um segundo inibidor de sinal, um ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) e um terceiro inibidor de sinal, em que o primeiro inibidor de sinal SB431542, o segundo inibidor de sinal referido é LDN-193189, sendo que o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é selecionado do grupo que consiste de Sonic hedgehog (SHH) C25II e uma purmorfamina e o terceiro inibidor referido é CHIR99021; b) o contato da referida população celular com o primeiro e segundo inibidores de sinal referidos, em que o referido contato com o primeiro e segundo inibidores é, sob condições, capaz de resultar na referida população diferenciada de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal de modo a que o referido contato com o primeiro e segundo inibidores referidos se encontrem durante 48 horas em placas de células in vitro, c) após contato da referida população celular com o primeiro e segundo inibidores de sinal referidos contatando ainda as referidas células com o referido ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) sob condições para diferenciar uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal; e d) após o contato da população celular referida com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) contatando ainda as referidas células com o referido terceiro inibidor para diferenciar a referida população celular para uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, o contato referido das células referidas com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é, sob condições, capaz de resultar na referida população diferenciada de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal de modo a que o referido contato das referidas células com o referido ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH) é de, pelo menos, 24 horas e até 36 horas após contato da referida população celular com o primeiro e segundo inibidor referidos. Em uma realização, o contato referido das células referidas com o terceiro inibidor referido é, sob condições, capaz de resultar na referida população diferenciada de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal de modo a que o referido contato das referidas células com o referido terceiro inibidor é de, pelo menos, 24 horas e até 36 horas após contato da referida população celular com o ativador de sinal Sonic hedgehog (SHH). Em uma realização, a população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal inclui mais do que 40% de células da proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+ fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM , células alfa (LMX1 A)+. Em uma realização, o método inclui ainda a fase e) contatar a referida população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal com meio de maturação de neurônios, sendo que este meio inclui meio N2, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial, cAMP dibutirilo e fator de transformação de crescimento tipo B3 para diferenciação de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal para neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal. Em uma realização, os referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal são positivos para grupos de marcadores selecionados do grupo que consiste de proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2); fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa (LMX1 A)/ tirosina hidroxilase (TH); proteína A2 de domínio forkhead / fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa (/tirosina hidroxilase /CD142; proteína A2 de domínio forkhead / fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa /tirosina hidroxilase/proteína 1 relacionada com receptor nuclear (NURR1); proteína A2 de domínio forkhead / fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM /tirosina hidroxilase//CD142/ proteína 1 relacionada com receptor nuclear e tirosina hidroxilase/ a-sinucleína. Em uma realização, estes marcadores são selecionado referido método inclui ainda a fase f) seleção dos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal para expressão CD 142 em uma população de células de, pelo menos, 80% positiva para CD 142. Em uma realização, os referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal são positivos para um marcador que identifica uma molécula selecionada do grupo que consiste de tirosina hidroxilase (TH), proteína A2 de domínio forkhead (FOXXA2), fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, dopamina, ácido 3,4- Dihidroxi-fenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA), receptor alfa, nuclear NURR1 (NR4A2), beta-tubulina de classe III específica de neurônios (Tujl), TTF3, homeodomínio tipo emparelhado 3 (PITX3), complexo Achaete-Scute (ASCL), fator celular-B precoce 1 (EBF-1), fator 3 celular-B precoce (EBF3) e transtiretina (TTR), transtiretina (TTR), sinapsina, dopaminatransporter (DAT), e G-proteína acoplada e canal de potássio que retifica interiormente (Kir3.2/GIRK2).CD142, DCSM1, CD63 e CD99. Em uma realização, o método inclui ainda, facultar a um doente em necessidade de neurônios produtores da dopamina e após uma fase após e) tratar o referido doente por meio do transplante dos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal ao proporcionar a função neuronal da dopamina (DA). Em uma realização, o referido doente possui, pelo menos um sintoma neurológico selecionado do grupo que consiste de tremor, bradiquinesia (extrema lentidão de movimentos), postura arqueada, instabilidade postural e rigidez. Em uma realização, o referido doente é observado para ter, pelo menos, um sintoma neurológico selecionado do grupo que consiste de tremor, bradiquinesia (extrema lentidão de movimentos), postura arqueada, instabilidade postural e rigidez. Em uma realização, o referido doente apresenta uma redução de, pelo menos, um sintoma neurológico.
[014] Em uma realização, as invenções apresentam um método para enxertar in vivo para tratamento terapêutico, incluindo a) facultar: i) uma população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal, em que mais do que 40% da referida população expressa tirosina hidroxilase (TH); e ii) um sujeito, em que o referido sujeito apresenta, pelo menos, um sintoma neurológico, em que os sintomas neurológicos são selecionados do grupo que consiste de tremor, bradiquinesia (extrema lentidão de movimentos), postura arqueada, instabilidade postural e rigidez e b) transplante dos referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal para o referido sujeito, sob condições que permitem in vivo enxerto para proporcionar função neuronal da dopamina (DA). Em uma realização, este sujeito apresenta uma redução de, pelo menos, um sintoma neurológico referido. Em uma realização, a esta população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal derivam de uma população de células que inclui ainda a fase de seleção dos referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal para a expressão CD 142 para uma população de células de, pelo menos, 80% positivas para CD 142. Em uma realização, os referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal derivam de uma população de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal após uma fase de seleção dos referidos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal para uma expressão CD 142 para uma população de células de, pelo menos, 80% positivas para CD 142. Em uma realização, esta população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal deriva de uma população celular selecionada do grupo que consiste de animais, primatas, humanos e um doente com sintoma de doença de Parkinson (PD). Em uma realização, esta população de neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal deriva de uma população celular isolada do grupo que consiste de animais, primatas, humanos e de um doente com o sintoma da doença de Parkinson (PD).
DEFINIÇÕES
[015] Tal como presentemente utilizado, o termo "modelagem de doença" refere-se ao processo de utilização de um organismo experimental ou cultura de células in vitro para simular sinais ou sintomas específicos observados em humanos como resultado de uma doença. Em uma realização, as células estaminais pluripotentes derivadas de um modelo animal com uma mutação genética que resultam em uma doença neurológica, tal como doença de Parkinson (PD), podem ser desenvolvidas e diferenciadas para células neurais para identificar novas características de neurônios relacionados com PD. Em uma realização, as células estaminais pluripotentes humanas derivadas de um indivíduo com uma mutação genética que resulta em uma doença neurológica, tal como doença de Parkinson (PD) podem ser desenvolvidas e diferenciadas para células neurais que albergam uma deficiência semelhante observada dentro do indivíduo.
[016] Tal como presentemente utilizado, o termo "parkinsonismo" refere-se a um grupo de doenças, todas elas ligadas a uma insuficiência de dopamina no gânglio basal o qual é uma parte do cérebro que controla o movimento. Os sintomas incluem tremor, bradiquinesia (extrema lentidão de movimentos), postura arqueada, instabilidade postural e rigidez. Um diagnóstico de parkinsonismo requer a presença de, pelo menos, dois destes sintomas, sendo que um destes deverá ser tremor ou bradiquinesia. A forma mais comum de parkinsonismo é a doença de Parkinson idiopática ou clássica (PD), mas para uma minoria significativa de diagnósticos, cerca de 15 por cento do total, poderá observar-se um dos síndromes acrescidos de Parkinson (PPS) . Estes sintomas, também conhecidos como parkinsonismo atípico, incluem degeneração cortibasal, demência de corpos de Lewi, sistematrofia múltipla e paralisia supranuclear progressiva. De modo geral, a doença de Parkinson envolve o mau funcionamento e morte de células nervosas no cérebro na área do cérebro denominada substância negra. Muitas destas células nervosas vitais produzem dopamina, à medida que estes neurônios vão morrendo, a quantidade de dopamina resultante da diferenciação no cérebro diminui, deixando o indivíduo sem capacidade de controlar normalmente os movimentos. Os intestinos também têm células de dopamina que degeneram em doentes com doença de Parkinson e isto poderá ser um fator determinante nos sintomas gastrointestinais que fazem parte desta doença. O grupo de sintomas que um indivíduo experimenta varia de pessoa para pessoa. Os sinais motores primários da doença de Parkinson incluem: tremor nas mãos, pernas, braços, maxilar e face, bradiquinesia ou lentidão de movimentos, rigidez ou dureza dos membros e tronco e instabilidade postural ou problemas de equilíbrio e coordenação.
[017] Tal como presentemente utilizado, o termo “sujeito” refere-se a um mamífero (humano e animal, i.e., animais não humanos) que será o receptor de um determinado tratamento incluindo qualquer tipo de controlo. Normalmente, os termos “sujeito” e “doente” são utilizados alternadamente como referência a um sujeito humano.
[018] Tal como presentemente utilizado, o termo "animais não humanos" refere-se a todos os animais não humanos incluindo, mas sem que tal constitua qualquer limitação, vertebrados, tais como, roedores, primatas não humanos, ovinos, bovinos, ruminantes, lagomorfos, suínos, caprinos, equídeos, caninos, felinos, aves, etc.
[019] Tal como presentemente utilizado, o termo “dopamina” refere-se a um químico produzido por neurônios dopaminérgicos que enviam mensagens para a parte do cérebro que contém neurônios que controlam o movimento e a coordenação.
[020] Tal como presentemente utilizado, o termo "LSB" refere-se a uma combinação de dois compostos LDN- 193189 e SB431542 que têm capacidade de reduzir ou bloquear o sinal que consiste em transformar o fator de transformação de crescimento beta (TGF(3)/sinal Activin-Nodal e sinal Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD) em uma célula.
[021] Tal como presentemente utilizado, o termo "SB431542" refere-se a uma molécula com capacidade de reduzir ou bloquear o fator de transformação do crescimento (TGF(3)/sinal Activin-Nodal com um número CAS 301836-41-9, uma fórmula molecular de C22Hi8N403; e um nome de 4-[4-(l,3- benzodioxol-5-il)-5-(2- piridinil)-lH-imidazol-2-il]-benzamida, por exemplo, ver estrutura abaixo:
Figure img0001
[022] Exemplificativamente, SB431542 é Stemolecule™ SB431542, Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos.
[023] Tal como presentemente utilizado, o termo "LDN-193189" refere-se a uma molécula pequena DM-3189, denominada IUPAC 4-(6-(4-(piperazin-1- il)fenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il)quinolina, com uma fórmula química C25H22N6. LDN-193189 tem capacidade para funcionar como um inibidor de sinal SMAD. LDN- 193189 é igualmente inibidor de molécula pequena altamente potente de ALK2, ALK3, e ALK6, proteína tirosina quinases (PTK), que inibe o sinal de membros de famílias ALK1 e ALK3 do tipo receptores I TGF|3, o que resulta na inibição da transmissão de sinais biológicos múltiplos, incluindo as proteínas morfogenéticas ósseas (BMP) BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, e sinais Activin citoquina e subsequentemente fosforilação SMAD de Smadl, Smad5, e Smad8 (Yu et al. (2008) Nat Med 14:1363-1369; Cuny et al. (2008) Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:4388-4392, presentemente incluído por referência).
Figure img0002
[024] Em uma realização de exemplo, LDN-193189 é StermoleculeTM LDN- 193189, Inc. Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos.
[025] Tal como presentemente utilizado, o termo "inibidor de glicogénio sintase quinase3β" ou "inibidor GSK3β" refere-se a um composto que inibe a enzima do glicogénio sintase quinase 3β, por exemplo, ver, Doble, et al., J Cell Sci. 2003;116:1175-1186, presentemente incorporado como referência. Para efeitos da presente invenção, um inibidor GSK3β tem capacidade de ativar um caminho de sinal WNT, ver, por exemplo, Cadigan, et al., J Cell Sci. 2006;119:395-402; Kikuchi, et al., Cell Signaling. 2007;19:659-671, presentemente incorporado por referência.
[026] Tal como presentemente utilizado, o termo "CHIR99021" ou "CHIR" ou "aminopirimidina" ou "3- [3-(2-Carboxietil)-4-metlpirrol-2-metilidenil]-2-indolinona" refere-se ao nome IUPAC 6-(2-(4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-metil-lH-imidazol-2- il)pirimidin-2- ilamino)etilamino)nicotinonitrilo. CHIR99021 é um exemplo de um inibidor químico de molécula pequena do glicogénio sintase quinases 3β (GSK3β) que ativa um caminho de sinal WNT, e que é altamente seletivo, apresentando aproximadamente mil vezes seletividade contra um painel de quinases relacionadas e não relacionadas com um IC50 = 6,7 nM contra GSK3β humano e valores IC50 nanomolares contra GSK3β roedores homólogos.
Figure img0003
[027] Em uma realização de exemplo, CHIR99021 é Stemolecule™ CHIR99021, Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos.
[028] Tal como presentemente utilizado, o termo "purmorfamina" refere-se a um derivado da purina, tal como CAS Número: 483367-10-8, para um exemplo, veja a estrutura abaixo, que ativa o caminho Hedgehog, incluindo o atingir de Smoothened.
Figure img0004
[029] Em uma realização de exemplo, purmorfamina é Stemolecule™ Purmorphamine, Stemgent, Inc. Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos.
[030] Tal como presentemente utilizado, o termo “sinal” em referência a uma “proteína de transdução de sinal" refere-se a proteínas que são ativadas ou, aliás, afetadas pelo ligando que se liga a uma proteína receptora de sinal ou ainda outros estímulos. Exemplos de proteína de transdução de sinal incluem um SMAD, uma proteína complexa WNT, em uma outra realização, uma proteína complexa WNT incluindo beta-catenina, Sonic hedgehog (SHH), NOTCH, fator de transformação de crescimento beta (TGFp), Activin, Nodal, proteínas do glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β) e semelhantes. Para muitos receptores de superfície celular ou proteínas receptoras internas, as interacções receptor-ligando não se encontram diretamente ligadas à resposta das células. O receptor ativado pelo ligando deve primeiro interagir com outras proteínas dentro da célula antes de se produzir o último efeito fisiológico do ligando no comportamento das células. Frequentemente, o comportamento de uma cadeia de inúmeras proteínas celulares de interação é alterado a seguir à ativação ou inibição do receptor. O grupo inteiro de alterações celulares induzido pela ativação do receptor é denominado um mecanismo de transdução de sinal ou caminho de sinal.
[031] Tal como presentemente utilizado, o termo "LSB/S/F8/CHIR" ou "LSB/SHH/FGF8/CHIR" refere-se a células em contato com LDN-193189 e SB431542 (i.e. LSB) para além de S, ativador Sonic Hedgehog, F8, FGF8, e CHIR das presentes invenções. Por outro lado, "LSB/S/F8" ou "SHH/FGF8" ou "SHH/FGF" que se referem a células de contato com LDN- 193189 e SB431542 (i.e. LSB) para além de S, ativador Sonic Hedgehog, F8, FGF8 mas sem CHIR tal como nos métodos anteriormente publicados. Em abreviaturas semelhantes, LDN/SB" refere-se a células de contato com LDNALDN-193189 e SB, SB431542.
[032] Tal como presentemente utilizado, o termo "inibir" ou "bloquear" significa uma redução no nível de atividade de um determinado caminho de sinal de uma célula mediante tratamento com um composto (i.e. um inibidor) por comparação com a atividade do referido caminho de sinal de uma célula que é deixada por tratar com tal composto ou tratada com um controlo.
[033] Tal como presentemente utilizado, o termo "ativar" significa um aumento no nível de atividade de um determinado caminho de sinal de uma célula mediante tratamento com um composto (i.e. um ativador) por comparação com a atividade do referido caminho de sinal de uma célula que é deixada por tratar com tal composto ou tratada com um controlo. Qualquer nível de inibição ou ativação de um determinado caminho de sinal é considerado uma realização da invenção se tal inibição ou ativação resulta na diferenciação direcionada de uma célula estaminada.
[034] Tal como presentemente utilizado, o termo "Sma Mothers Against Decapentaplegic" ou "Small Mothers Against Decapentaplegic" ou "SMAD" refere- se a uma molécula de sinal.
[035] Tal como presentemente utilizado, o termo "WNT" ou "sem asa" em referência a um ligando refere-se a um grupo de proteínas segregadas (i.e. Intl (integração 1) em humanos) com capacidade de interação com um receptor WNT, tal como um receptor no Frizzled e família do receptor LRPDerailed/RYK.
[036] Tal como presentemente utilizado, o termo "WNT" ou "sem asas" em referência a um caminho de sinal refere-se a um caminho de sinal composto por ligandos da família Wnt e receptores da família Wnt, tal como, receptores Frizzled e receptores LRPDerailed/RYK, mediados com ou sem P- catenina. Para os fins presentemente descritos, um caminho de sinal WNT preferido inclui mediação por p-catenina, i.e., WNT /p-catenina.
[037] Tal como presentemente descrita, "caminho canónico" ou "ativação clássica" em referência a WNT refere-se a um dos múltiplos caminhos de sinal ajusantes Wnt, por exemplo, no caminho canónico um efeito maior do ligando Wnt que se liga ao seu receptor é a estabilização de beta-catenina citoplásmica através da inibição do complexo de degradação de beta-catenina. Outros caminhos Wnt são não canónicos.
[038] Por exemplo, a pequena molécula CHIR afeta o caminho de sinal ajusante Wnt canónico.
[039] Tal como presentemente utilizado, o termo "Sonic hedgehog (SHH ou Shh)" refere-se a uma proteína que é uma de pelo menos três proteínas no caminho de sinal da família dos mamíferos denominada hedgehog, outra é hedgehog deserta (DHH) enquanto a terceira é a hedgehog indiana (IHH). Shh interage com, pelo menos, duas proteínas transmembranares ao interagir com moléculas transmembranares Patched (PTC) e Smoothened (SMO). Shh liga-se tipicamente a PCT, o qual permite posteriormente a ativação de SMO como um transdutor de sinal. Na ausência de SHH, PTC inibe inicialmente SMO, que, por sua vez, ativa um repressor de transcrição de modo a que a transcrição de determinados genes não ocorra. Quando o Shh se encontra presente e se liga ao PTC, PTC não pode interfere com o funcionamento de SMO. Com SMO inibido, algumas proteínas têm capacidade de entrar no núcleo e atuar como fatores de transcrição permitindo a ativação de alguns genes.
[040] (ver, Gilbert, 2000 Developmental Biology (Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates, Inc., Publishers).
[041] Tal como presentemente utilizado, o termo “ativador” ou “ativante” refere- se a pequenas moléculas, peptídeos, proteínas e compostos para ativar moléculas resultando na diferenciação direcionada das células das presentes invenções. Ativadores de exemplos incluem, mas não se limitam a: CHIR, Sonic hedgehog (SHH) C25II, uma purmorfamina agonista de uma pequena molécula Smoothened, fator do crescimentos do fibroblasto (FGF), etc.
[042] Tal como presentemente utilizado, o termo "ativador do sinal Sonic hedgehog (SHH)" refere-se a qualquer molécula ou composto que ative um caminho de sinal SHH incluindo uma molécula ou composto que se ligue ao PCT ou a um agonista Smoothened e semelhantes. Exemplos destes compostos são uma proteína Sonic hedgehog (SHH) C25II e purmorfamina agonista de uma pequena molécula Smoothened.
[043] Tal como presentemente utilizado, o termo "Sonic hedgehog (SHH) C25II" refere-se a um fragmento recombinante no terminal-N de uma proteína sonic hedgehog murina complete capaz de se ligar ao receptor SHH para ativar SHH, um exemplo é R e D Systems catálogo número: 464-SH-025/CF.
[044] Tal como presentemente utilizado, o termos “sinais” refere-se a fatores internos e externos que controlam mudanças na estrutura celular e funções. Estes são químicos ou físicos por natureza.
[045] Tal como presentemente utilizado, o termo "ligando" refere-se a moléculas e proteínas que se ligam a receptores (R), exemplos incluem, mas não se limitam a, o fator de transformação do crescimento beta, activinas, nodal,proteínas morfogênicas ósseas (BMPs), etc.
[046] Tal como presentemente utilizado, o termo "inibidor" ou "inibidor de sinal" é por referência à inibição de uma molécula de sinal ou caminhos de moléculas de sinal, tal como um inibidor do sinal SMAD, inibidor de glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β), e refere-se a um composto ou molécula (e.g., pequena molécula, peptídeo, peptidomimético, composto natural, proteína, siRNA, ácido nucleico antisense, aptâmero ou anticorpo) que interfere com (i.e. reduz ou suprime ou elimina ou bloqueia) a função de sinal da molécula ou caminho. Por outras palavras, um inibidor é um composto ou molécula que altera qualquer atividade de uma determinada proteína (molécula de sinal, qualquer molécula envolvida com a molécula de sinal denominada, uma molécula associada denominada, tal como glicogénio sintase de quinases 3β (GSK3β) (e.g., incluindo, mas não se limitando, às moléculas de sinal presentemente descritas), para um exemplo, por meio de contato direto com o sinal SMAD, contato com SMAD mARN, dando lugar a alterações conformacionais de SMAD, reduzindo os níveis da proteína SMAD, ou interferindo com as interacções SMAD com os parceiros de sinal (e.g., incluindo aqueles presentemente descritos), e afetando a expressão de genes alvo SMAD (e.g. aqueles presentemente descritos). Inibidores podem igualmente incluir moléculas que regulam indiretamente a atividade biológica SMAD ao interceptar as moléculas de sinal a montante. Assim, em uma realização, um inibidor das presentes invenções induz (muda) ou altera a diferenciação a partir de um tipo de célula padrão ou não padrão, por exemplo, um dos métodos das presentes invenções incluem LDN/SB, CHIR e um ativador SHH (o qual pode inibir células progenitoras diferenciadas do glicogénio sintase quinase 3(3) em células progenitoras neurais padrão. Em uma realização preferida, um inibidor das presentes invenções "altera" ou "reduz" ou "bloqueia" o sinal padrão de modo a direcionar a diferenciação celular no sentido de um tipo de células não padrão, tal como presentemente descrito para diferenciar células progenitoras do mesencéfalo em placa basal e neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ das presentes invenções. Assim, um inibidor das presentes invenções é um composto natural ou pequena molécula que muda a atividade da molécula de sinal de modo a que contribua para diferenciar uma população celular de partida (dia 0) em células progenitoras do mesencéfalo em placa basal. Quando as células progenitoras são contactadas por inibidores, estas pequenas moléculas contribuem para melhor diferenciar em neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico. Os inibidores são descritos em termos de inibição competitiva (ligações ao local ativo de modo a excluir ou reduzir a ligação de outro composto de ligação conhecido) e inibição alostérica (ligação a uma proteína de modo a mudar a conformação da proteína para que interfira com a ligação de um composto a esse local ativo da proteína) para além da inibição induzida pela ligação a e que afeta uma molécula a montante da molécula de sinal denominada que, por sua vez, causa inibição da molécula denominada. Em alguns casos, um inibidor é referido como um “inibidor direto” , o qual se refere à inibição de um avo de sinal ou um caminho de sinal alvo ao atualmente contatar o alvo sinal; por exemplo, um inibidor direto de uma gama secretase é uma molécula DAPT que se liga à proteína gama secretase.
[047] Tal como presentemente utilizado, o termo “derivado” refere-se a um composto químico com uma estrutura nuclear similar.
[048] Tal como presentemente utilizado, o termo “célula progenitora do mesencéfalo em placa basal” por referência a uma célula in vivo localizada em um mesencéfalo, que inclui o durante o desenvolvimento embriónico de neurônios mesencefálicos, refere-se a uma célula que pode ser diferenciada em uma célula produtora de dopamina Em algumas realizações, uma "célula progenitora do mesencéfalo em placa basal" refere-se a uma célula em cultura que é utilizada para artificialmente produzir uma célula em cultura in vitro que expressa grupos sobrepostos ou idênticos de marcadores quando comparado com marcadores expressos por células in vivo, i.e. co-expressão do marcador FOXA2 em placa basal e o marcador LMX1A, OTX2, NGN2, e DDC em placa basal, tal como em células de cultura das presentes invenções à volta do dia 11 após iniciação de diferenciação direcionada tal como presentemente descrito. Preferencialmente, a célula progenitora do mesencéfalo em placa basal é "FOXA2+LMX1A+" ou " FOXA2/LMX1A+". Em algumas realizações, pequenos números de células em uma população progenitora diferenciada são FOXA2/ LMX1A/TH+.
[049] Tal como presentemente utilizado, o termo "neurônios DA derivados de placa basal" ou "neurônios DA do mesencéfalo autênticos" ou "neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2+LMX1A+ de destino mesencefálico" ou "neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo em placa basal" ou "neurônio DA do mesencéfalo enxertável" ou "neurônio mDA" ou "FOXA2+LMX1A+TH+" ou "FOXA2/LMX1A/TH" ou "FOXA2+LMX1A+ NURR1+TH+" ou "FOXA2/LMX1A/NURR1/TH" refere-se a uma população de neurônios DA do mesencéfalo enxertáveis obtidos por métodos presentemente descritos, tipicamente à volta ou ao dia 25 após início da diferenciação direcionada. Em uma realização preferida, neurônios DA do mesencéfalo autênticos" são FOXA2+/LMX1A+/NURR1+/TH+. Estes neurônios foram marcados “enxertáveis” após experiências de Transplante em ratinhos e primatas que apresentavam a capacidade destes neurônios em reverter condições neurológicas do tipo Parkinson com menor interferência do sobrecrescimento neural e formação do teratoma.
[050] Os neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico das presentes invenções foram mantidos in vitro durante vários meses ao mesmo tempo que se retinha a sua capacidade para enxerto.Tal como presentemente utilizado, as células utilizadas para se obter células progenitoras do mesencéfalo em placa basal e neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico são obtidas a partir de uma variedade de fontes incluindo fontes embriónicas e não embriónicas, por exemplo, hESCs e hiPSCs não embriónicas, células estaminais somáticas, células estaminais da doença, i.e. células pluripotentes isoladas e células derivadas manipuladas isoladas dos doentes com doença de Parkinson, células estaminais cancerosas, células pluripotentes humanas ou de mamíferos.
[052] Tal como presentemente utilizado, o termo “célula estaminal” refere-se a uma célula com a capacidade de se dividir por períodos indefinidos em cultura e que dá lugar a células especializadas. Uma célula estaminal pode ser obtida a partir de animais e doentes, incluindo humanos, por exemplo, uma célula estaminal humana refere-se a uma célula estaminal que é humana. Uma célula estaminal pode ser obtida a partir de uma variedade de fontes, incluindo células embriónicas e não embriónicas, tal como, células do cordão umbilical, células de crianças e células de adultos. Para os efeitos das presentes invenções, as células estaminais adultas, em geral, referem-se a células que não foram originalmente obtidas a partir de um feto; por outras palavras, as células retiradas de bebés, células retiradas do cordão umbilical, células retiradas da placenta, células retiradas de crianças, células de adultos, etc.
[053] Tal como presentemente utilizado, o termo “células estaminais do sangue do cordão umbilical” refere-se a células estaminais colhidas de um cordão umbilical à nascença que têm a capacidade de, pelo menos, produzir todas as células sanguíneas no corpo (hematopoiéticas).
[054] Tal como presentemente utilizado, o termo “célula estaminal (adulta) somática refere-se a uma célula relativamente indiferenciada rara encontrada em muitos órgãos e tecidos diferenciados com uma capacidade limitada para auto renovação (no laboratório) e diferenciação. Estas células variam na sua capacidade de diferenciação, a qual é normalmente limitada a tipos de células no órgão de origem.
[055] Tal como presentemente utilizado, o termo “célula somática” refere-se a qualquer célula no corpo que não gametas (óvulo ou espermatozóide); às vezes referida como célula “adulta”.
[056] Tal como presentemente utilizado, o termo "célula de linhagem neural” refere-se a uma célula que contribui para o sistema nervoso (tanto central como periférico) ou destinos de células de crista neural durante o desenvolvimento no adulto. O sistema nervoso inclui o cérebro, espinal medula e sistema nervoso periférico. Os destinos de células de crista neural incluem crânio, tronco, vagal, sacral e cardíaca dando lugar a mesectoderme, cartilagem craniana, osso craniano, timo, dentes, melanócitos, células de pigmentação da íris, gânglios do nervo craniano, gânglio da raiz dorsal, gânglios simpáticos/parassimpáticos, células endócrinas, sistema nervoso entérico e partes do coração.
[057] Tal como presentemente utilizado, o termo “célula estaminal adulta” refere-se a uma célula estaminal somática, por exemplo, uma “célula estaminal hematopoiética”, a qual se refere a uma célula estaminal em bebés, crianças e adultos que origina todas as células dos glóbulos a vermelhos e brancos e plaquetas.
[058] Tal como presentemente utilizado, o termo “célula estaminal embriónica” refere-se a célula (indiferenciada) primitiva que deriva de uma de muitas fontes, incluindo, mas não se limitando, a um embrião em fase de pré implantação, um embrião artificialmente criado, i.e., fertilização in vitro etc., capaz de dividir sem diferenciar para um período prolongado em cultura e que é conhecida por ter a capacidade de se desenvolver em células e/ou tecidos das três camadas germinais primárias, a ectoderme, a mesoderme e a endoderme.
[059] Tal como presentemente utilizado, o termo "endoderme" refere-se a uma camada de células derivadas da massa interior da célula do blastocisto; tem a capacidade de criar os pulmões, outras estruturas respiratórias e órgãos digestivos ou, de modo geral, "o intestino" “in vivo" e uma variedade de tipos de células in vitro.
[060] Tal como presentemente utilizado, o termo “linhagem celular estaminal embriónica” refere-se a uma população de células estaminais embriónicas que foram colocadas em cultura sob condições in vitro e que permitem a proliferação sem diferenciação durante dias, meses, por exemplo, células em uma linhagem celular WA-09 humana.
[061] Tal como presentemente utilizado, o termo “célula estaminal embriónica humana” ou “hESC” refere-se a um tipo de células estaminais pluripotentes derivadas de embriões humanos em fase inicial, até e incluindo a fase blastocisto, a qual tem capacidade para dividir sem diferenciar durante um período de tempo prolongado em cultura e que é conhecida por desenvolver para as células e tecidos de três camadas germinais primárias, a ectoderme, a mesoderme e a endoderme.
[062] Tal como presentemente utilizado, o termo "célula estaminal pluripotente induzida” ou "iPSC" refere-se a um tipo de células estaminais pluripotentes, semelhantes a uma célula estaminal embriónica, em que as células (adultas) somáticas são reprogramadas para entrar em um estado tipo célula estaminal embriónica ao serem forçadas a expressar fatores importantes para manter a "dureza" de células estaminais embriónicas (ESCs). iPSCs de rato foram registados em 2006 (Takahashi e Yamanaka), e iPSCs humanas foram registadas no final de 2007 (Takahashi et al. e Yu et al.). iPSCs de rato demonstram características importantes de células estaminais pluripotentes, incluindo a expressão de marcadores de células estaminais, a formação de tumores que contêm células de todas as três camadas germinais e a capacidade de contribuir para muitos tecidos diferentes quando injetadas em embriões de ratos a uma fase muito inicial de desenvolvimento. iPSCs humanas expressam igualmente marcadores de células estaminais e têm capacidade de gerar características de células de todas as três camadas germinais. Ao contrário das células estaminais embriónicas, uma iPSC é formada artificialmente pela introdução de determinados genes embriónicos (tal como, transgenes OCT4, SOX2, e KLF4) (ver, por exemplo, Takahashi e Yamanaka Cell 126, 663-676 (2006), presentemente incorporado como referência) em células somáticas, por exemplo de linhagens celulares de células induzidas, C14, C72 e semelhantes. Outro exemplo de uma iPSC é uma célula da pele de um humano adulto, ou célula do fibroblasto, transformada com genes utilizados (OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, e KLF4) clonados em um plasmídeo, por exemplo, ver, Yu, et al., Science DOI: 10.1126/science.l 172482, presentemente incorporado como referência.
[063] Tal como presentemente utilizado, o termo "totipotente" refere-se a uma capacidade de produzir tipos de células do corpo mais todos os tipos de células que produzem os tecidos extraembriónicos, tal como a placenta.
[064] Tal como presentemente utilizado, o termo "multipotente" refere-se a uma capacidade de desenvolver em mais do que um tipo de célula no corpo.
[065] Tal como presentemente utilizado, o termo "pluripotente" refere-se a uma célula com capacidade de produzir pelo menos dois, mas frequentemente inúmeros tipos de células do corpo. Células pluripotentes geram frequentemente um teratoma após injeção em um rato imunosuprimido.
[066] Tal como presentemente utilizado, o termo "célula estaminal pluripotente" refere-se a uma capacidade desta célula se desenvolver em, pelo menos, dois tipos de células diferentes dependendo dos fatores ambientais, i.e. morfogénios, fatores de crescimento, moléculas de sinal, ativadores ou inibidores, etc. Em algumas realizações, uma célula estaminal pluripotente refere-se a uma capacidade da célula se desenvolver em qualquer uma das três camadas germinais de desenvolvimento do organismo, incluindo endoderme, mesoderme e ectoderme.
[067] Tal como presentemente utilizado, o termo "célula especializada" refere- se a um tipo de célula que desempenha uma função específica em organismos multicelulares. Por exemplo, grupos de células especializadas, tais como neurônios, trabalham juntamente para formar um sistema, tal como o sistema nervoso.
[068] Tal como presentemente utilizado, o termo "neuroetoderme" refere-se a uma célula ou destino de célula encontrada cedo no desenvolvimento ou durante a diferenciação de célula estaminal pluripotente o que pode originar células da linhagem neural.
[069] Tal como presentemente utilizado, o termo "marcadores de proliferação celular" refere-se à expressão de moléculas associadas a células de grande ritmo, as quais normalmente não se encontram presentes em células de ritmo lento matures ou células sem ritmo, i.e. de divisão ativa vs. Células com ritmos extensos ou células sem ritmo. Exemplos destes marcadores incluem um marcador Ki67 de proliferação celular (Gerdes, et alInt J Cancer 31:13-20 (1983), presentemente incorporado por referência) e marcadores H3 de fosfo-histona de G2/M-fases de mitose (Hendzel, et al., Chromosoma 106:348-360 (1997), presentemente incorporado por referência).
[070] Tal como presentemente utilizado, o termo "proliferação" refere-se a um aumento no número de células.
[071] Tal como presentemente utilizado, o termo “diferenciação" refere-se a um processo em que uma célula embriónica não especializada adquire as características de uma célula especializada, tal como um tipo específico de neurônio, célula do cérebro, do coração, fígado ou célula do músculo. Diferenciação é controlada pela interação de um gene da célula com as condições físicas e químicas for a da célula, normalmente através de caminhos de sinal que envolvem proteínas incorporadas na superfície da célula.
[072] Tal como presentemente utilizado, o termo "diferenciação" tal como utilizado relativamente às células em um sistema celular de diferenciação refere-se ao processo pelo qual as células se diferenciam de um tipo de célula (por ex., uma célula multipotente, totipotente ou pluripotente diferenciável) para outro tipo de célula, Tal como uma célula alvo diferenciada.
[073] Tal como presentemente utilizado, o termo "diferenciação da célula" refere-se a um caminho pelo qual uma célula menos especializada (i.e. célula estaminal) desenvolve ou amadurece para possuir uma forma mais distinta e função (por exemplo, uma iPSC que progride para um progenitor de crista neural, para uma célula de linhagem neuronal, para células progenitoras do mesencéfalo em placa basal, para neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico das presentes invenções).
[074] Tal como presentemente utilizado, o termo "indiferenciada" refere-se a uma célula que ainda não se desenvolveu em um tipo de célula especializada.
[075] Tal como presentemente utilizado, o termo "padrão" ou "passivo" na referência a um caminho de diferenciação da célula refere-se a um caminho em que uma célula menos especializada se torna um determinado tipo de célula diferenciada em cultura, quando não tratada com determinados compostos, i.e. condições normais de culturas celulares sem contato com pelo menos um morfogênico. Por outras palavras, uma célula padrão surge quando uma célula não é contatada por uma molécula capaz de modificar o tipo de célula diferenciada (i.e. um morfogênico), por exemplo culturas tratadas com LSB isoladamente, mas não um ativador de SHH ou um ativador de Wnt para produzir uma célula da proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+ das presentes invenções, resulta sim na expressão de marcadoresHES5, PAX6, LHX2, e EMX2. Por contraste, "não- padrão" em referência a uma célula refere-se a um tipo de célula diferenciada que resulta em um tipo de célula que é diferente de uma célula padrão, i.e. uma célula não-padrão é um tipo de célula diferenciada que resulta de condições não-padrão, tais como as células das presentes invenções, incluindo proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+ célula neuronal, uma célula progenitora do mesencéfalo em placa basal e neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico das presentes invenções, etc.
[076] Uma célula padrão pode igualmente ser uma célula padrão após a célula ter contato com um morfogênico para se tornar uma célula não-padrão sem composto de morfogênico subsequente, tal como uma célula progenitora do mesencéfalo em placa basal não-padrão que se torna subsequentemente em uma célula padrão que não são neurônios dopaminérgicos DA FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico devido a uma falta de contato com um morfogênico como CHIR.
[077] Tal como presentemente utilizado, o termo "morfogênico" refere-se a um composto que influencia a diferenciação de uma célula, i.e., determina, pelo menos, em parte o destino da célula. Um morfogênico pode igualmente influenciar uma célula para se diferenciar em um tipo de célula não-padrão.
[078] Tal como presentemente utilizado, o termo "diferenciação direcionada" refere-se a uma manipulação das condições de cultura da célula estaminal para induzir diferenciação em um tipo de célula particular (por exemplo, tipo de célula desejado), tal como células progenitoras do mesencéfalo em placa basal e neurônios dopaminérgicos DA FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico das presentes invenções. Em uma realização, o termo "diferenciação direcionada" como referência a uma célula refere-se à utilização de pequenas moléculas, proteínas do fator de crescimento e outras condições de crescimento para promover a transição de uma célula de um estado pluripotente para um destino de célula mais maturo ou especializado (por ex. célula do sistema nervoso central, célula neural, células progenitoras do mesencéfalo em placa basal e neurônios dopaminérgicos DA FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico das presentes invenções, etc.). Em uma realização preferida, o início da diferenciação direcionada é o contato de uma célula ao dia 0 com LDN/SB. Uma célula submetida a diferenciação direcionada, como presentemente descrito, resulta na formação de um tipo de célula não-padrão de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal e neurônios dopaminérgicos DA FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico das presentes invenções.
[079] Tal como presentemente utilizado, o termo "induzir diferenciação" com referência a uma célula refere-se à modificação do tipo de célula padrão (genótipo e/ou fenótipo) para um tipo de célula não-padrão (genótipo e/ou fenótipo). Deste modo, "induzir diferenciação em uma célula estaminal " refere-se à indução de uma célula para a dividir em células progenitoras com características diferentes das da célula estaminal, tal como genótipo (i.e. mudança na expressão do gene como determinado pela análise genética tal como um microarra fenótipo (i.e. mudança na expressão de uma proteína, tal como proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2) ou um grupo de proteínas, tal como proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2) e fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM , alfa (LMX1A) positivo (+) enquanto negativo (-) para PAX6).
[080] Tal como presentemente utilizado, o termo "destino" com referência a uma célula, tal como "determinação do destino celular" , em geral, refere-se a uma célula com uma linhagem geneticamente determinada, e cujas células progenitoras têm capacidade de se tornar em uma variedade de tipos de células ou poucos tipos de células específicas dependendo das condições de cultura in vivo ou in vitro. Por outras palavras, o destino pré-determinado de uma célula é determinado pelo seu ambiente a ser destinado para um determinado caminho de diferenciação, de modo a que a célula se torne em um tipo de célula em vez de em um outro tipo de célula, por exemplo, células estaminais de uma célula estaminal cujo "destino neural" se tornará em uma célula nervosa em vez de uma célula de músculo ou célula da pele.
[081] Tal como presentemente utilizado, o termo "resultado de neurite" ou "resultado neural " refere-se à observação de protrusões anexadas à membrana e alongadas do citoplasma de células.
[082] Em oposição a "resultado neural " o qual se refere a crescimento neural não condicionado e indesejado, i.e. crescimento de neurônios não controlado, de células transplantadas no local do enxerto. Tal como presentemente utilizado, o termo "teratoma" refere-se a um tumor não cancerígeno de qualquer tipo de tecido das células transplantadas.
[083] Tal como presentemente utilizado, o termo "formação de teratoma" refere-se ao crescimento indesejado de uma variedade de tipos de tecido para tumores não cancerígenos a partir do crescimento de células transplantadas.
[084] Tal como presentemente utilizado, o termo "neurônio da dopamina" ou "neurônio dopaminérgico" refere-se, de modo geral, a uma célula com capacidade de expressar a dopamina. "Neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo " ou "mDA" referem-se a células expressoras de dopamina simples em estruturas do prosencéfalo e células expressoras de dopamina em estruturas do prosencéfalo.
[085] Tal como presentemente utilizado, o termo "célula estaminal neural " refere-se a uma célula encontrada no tecido neural adulto e que produz neurônios e células (de apoio) gliais. Exemplos de células gliais incluem astrocitos e oligodendrocitos.
[086] Tal como presentemente utilizado, o termo "placa de placa basal" ou "FP" ou "fp" refere-se a uma região do tubo neural in vivo que se estende ao longo da linha mediana ventral, também descrita como zona longitudinal ventral não emparelhada do tubo neural ou referida como centro de sinal do tubo neural. Por outras palavras, o tubo neural foi dividido em regiões diferentes onde as células ventrais mais próximas da linha mediana constituíam a placa basal. Como exemplo de outra identificação celular, a FP do mesencéfalo do pintainho pode ser dividida em região mediana (MFP) e região lateral (LFP) com base na expressão do gene, modo de indução e função. As células em placa basal são encontradas in vivo em várias áreas do embrião em desenvolvimento, por exemplo, células em placa basal no mesencéfalo, na base cerebral posterior, etc. In vivo, células em placa basal na região do mesencéfalo são contempladas para produzir células que são diferentes das células diferenciadas das células em placa basal em outras regiões. Um marcador primário em placa basal na região do mesencéfalo é FOXA2.
[087] Tal como presentemente utilizado, o termo "placa dorsal" refere-se às células dorsais mais próximas da linha mediana. Um marcador de placa dorsal é LMX1 A. Durante o desenvolvimento embriónico, as células em placa basal e em placa dorsal encontram-se localizadas em posições distintas na CNS (ventral versus dorsal) com requisitos padrão diametricamente opostos para respectiva indução.
[088] Tal como presentemente utilizado, o termo "mesencéfalo" refere-se a uma região do cérebro do vertebrado em desenvolvimento que se situa entre a região anterior do cérebro e a região posterior do cérebro. As regiões mesocefálicas originam muitas áreas do cérebro, incluindo, mas não se limitando, à formação reticular, que faz parte do tegmentum, uma região do tronco cerebral que influencia as funções motoras, o crus cerebri, que é constituído por fibras nervosas e que ligam os hemisférios cerebrais ao cerebelo, e de um grande núcleo pigmentado denominado substância negra. Uma característica única do mesencéfalo em desenvolvimento é a co-expressão do marcador de placa basal FOXA2 e do marcador de placa dorsal LMX1 A.
[089] Tal como presentemente utilizado, o termo "neurônio" refere-se a uma célula nervosa, as unidades funcionais principais do sistema nervoso. Um neurônio consiste de um corpo celular e seus processos -um axónio de um ou mais dendritos. Os neurônios transmitem informação para outros neurônios ou células libertando neurotransmissores em sinapses.
[090] Tal como presentemente utilizado, o termo "cultura celular" refere-se a um crescimento de células in vitro em um meio artificial para pesquisa ou tratamento médico.
[091] Tal como presentemente utilizado, o termo "meio de cultura" refere-se um líquido que cobre as células em um vaso de cultura, tal como uma placa Petri, uma placa com poços múltiplos e semelhantes e contém nutrientes para alimentar e suportar as células. O meio de cultura pode igualmente incluir fatores de crescimento adicionados para induzir mudanças desejáveis nas células.
[092] Tal como presentemente utilizado, o termo "meio de maturação " ou meio "B AGCT" refere-se a um meio de cultura que inclui um meio N2, incluindo ainda o fator neurotrófico derivado pelo cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial, dibutirilo cAMP e fator de transformação de crescimento tipo 133 para diferenciar neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ destinados ao mesencéfalo.
[093] Tal como presentemente utilizado, o termo "camada de alimentação" refere-se a uma célula utilizada em co-cultura para manter células estaminais pluripotentes. Para uma cultura de células estaminais embriónicas humanas, as camadas de alimentação típicas incluem fibroblastos embriónicos de ratos (MEFs) fibroblastos embriónicos humanos que foram tratados de forma a evitar que de dividam quando em cultura.
[094] Tal como presentemente utilizado, o termo "passagem" com referência a uma cultura de células, refere-se ao processo no qual as células são dissociadas, lavadas e semeadas em novos vasos de cultura depois de uma fase de crescimento da célula e proliferação. O número de passagens pelas quais passa uma linhagem de células em cultura é uma indicação da sua idade e estabilidade esperada.
[095] Tal como presentemente utilizado, o termo "expressar" com relação a um gene ou proteína refere-se à produção de uma mRNA ou proteína, a qual pode ser observada utilizando análises, tal como ensaio microarray, ensaios de coloração do anticorpo e semelhantes.
[096] Tal como presentemente utilizado, o termo "gene 6 em caixa emparelhada" ou "PAX6" refere-se a um marcador de uma célula neuroprogenitora não-padrão.
[097] Tal como presentemente utilizado, o termo "TUJ1" ou "beta-tubulina de classe III específica de neurônios " com referência a uma célula diferenciadora das presentes invenções refere-se a um marcador de diferenciação precoce de célula neural humana, tal como células progenitoras neurais, e encontra-se expresso em neurônios de PNS e CNS.
[098] Tal como presentemente utilizado, o termo "homodímero" com referência a uma molécula SMAD refere-se a, pelo menos, duas moléculas SMAD ligadas em conjunto, tal como por ligações de dissulfeto.
[099] Tal como presentemente utilizado, o termo "contatar" células com um composto das presentes invenções refere-se a colocar o composto em um local que lhe permitirá tocar na célula de modo a produzir (obter) células “contactadas”. O contato pode ser obtido por meio de qualquer método adequado. Por exemplo, em uma realização, o contato é estabelecido ao se adicionar o composto a um tubo de células. O contato pode ser igualmente conseguido ao se adicionar o composto a uma cultura de células.
[100] Tal como presentemente utilizado, o termo "célula aderente" refere-se a uma célula que cresce in vitro, a célula adere ao fundo ou à parte lateral do vaso de cultura, uma célula aderente pode contatar o vaso por meio de moléculas matriz extracelulares e semelhantes e requer a utilização de uma enzima para separar esta célula do prato/recipiente de cultura, i.e. tripsina, dispase, etc.. Uma "célula aderente" é oposta a uma célula que se encontra em uma cultura em suspensão que não se encontra ligada e que não requer a utilização de uma enzima para remover células do vaso de cultura.
[101] Tal como presentemente utilizado, o termo "marcador" ou "marcador de célula" refere-se a um gene ou proteína que identifica uma determinada célula ou tipo de célula. Um marcador para uma célula não se pode limitar a um marcador, marcadores podem referir-se a um "modelo" de marcadores de modo a que um grupo designado de marcadores possa identificar uma célula ou tipo de célula a partir de outra célula ou tipo de célula. Por exemplo, neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ destinados ao mesencéfalo das presentes invenções expressam um ou mais marcadores que distinguem uma célula progenitora do mesencéfalo em placa basal de uma célula precursora menos diferenciada, i.e. proteína A2 (FOXA2) de domínio forkhead positiva e fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa (LMX1 A) positivo vs. células HES5+ e PAX6+, por exemplo, tal como apresentado pelos modelos exemplificativos de expressão de genes na Figura le e If.
[102] Tal como presentemente utilizado, o termo "positivo" com relação a uma célula, incluindo uma "célula positiva" refere-se a uma célula que expressa um marcador, por exemplo, um anticorpo "colora" esse marcador quando utiliza um sistema de coloração (detecção) de anticorpos ou uma sequência de ácido nucleico que hibridiza para a sequência do marcador de ácido nucleico, tal como medido por uma molécula relatora, i.e. uma molécula fluorescente que se liga a sequências de ácido nucleico de cadeia dupla, em uma quantidade quantitativa detectável e/ou qualitativa acima duma célula controlo ou comparativa. Por exemplo, uma célula positiva para um marcador, tal como uma proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2), etc., refere-se a uma célula que expressa FOXA2 mRNA e/ou proteína detectada em uma análise, tal como em um grupo de genes ou anticorpos, respectivamente. Como positiva, a célula pode ser referida como FOXA2+. Quando uma célula é positiva para mais do que um marcador, tal como quando se utiliza a notação FOXA2/LMX1A+, a célula ou a maioria da população celular é positiva tanto para FOXA2 como para LMX1A
[103] Tal como presentemente utilizado, o termo "negativo" com relação a uma célula ou população celular, incluindo uma "célula negativa " refere-se a um sinal detectável ausente de célula ou população para um marcador ou sinal a níveis de populações de controlo. Por exemplo, uma célula que não colore após contato com o método de detecção de anticorpo de uma proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2) ou análise do gene que inclua a detecção de FOXA2 mRNA, etc., é FOXA2- ou negativo para FOXA2.
[104] Tal como presentemente utilizado, os termos "gene reporter" ou "construção reporter" referem-se a construções genéticas que incluem um ácido nucleico codificador de uma proteína que é facilmente detectável ou facilmente analisável, tal como uma proteína colorida, proteína fluorescente tal como uma enzima, tal como GFP ou uma enzima, tal como P-galactosidase (lacZ gene).
[105] Tal como presentemente utilizado, o termo "GFP" refere-se a uma sequência da proteína de ADN a verde fluorescente capaz de produzir uma proteína fluorescente mediante expressão em uma célula tipicamente utilizada como marcador de indicação para expressão de um gene alvo. Exemplos de GFP incluem sequências GFP isoladas de coelenteratos, tais como medusa do Pacífico, Aequoria Victoria e derivados sintéticos da sequência, tal como "eGFP".• termo "amostra" é utilizado no seu sentido mais amplo. Duma maneira pode referir-se a uma célula ou a um tecido. De outra forma, pressupõe- se que inclui um espécime ou cultura obtida de qualquer fonte e que compreende fluidos, sólidos e tecidos. Amostras ambientais incluem material ambiental, tal como matéria de superfície, solo, água e amostras industriais. Estes exemplos não se devem considerar como limitativos aos tipos de amostras aplicáveis às presentes invenções.
[106] Os termos "purificado," "purificar," "purificação," "isolado," "isolar," "isolamento" e equivalentes gramaticais dos mesmos, tal como presentemente utilizado, referem-se à redução da quantidade de, pelo menos, um contaminante de uma amostra. Por exemplo, um tipo de célula desejado é purificado em, pelo menos, 10%, preferencialmente em, pelo menos, 30%, mais preferencialmente em, pelo menos, 50%, e ainda mais preferencialmente em, pelo menos, 75%, e mais preferencialmente ainda em, pelo menos, 90%, com uma redução correspondente na quantidade de tipos de células indesejadas, por exemplo, diferenciação direcionada das presentes invenções deram lugar a um aumento desejado na pureza de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal diferenciadas ou neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico das presentes invenções. Por outras palavras “purificar" e seus equivalentes, referem- se à remoção de determinadas células (por ex. células indesejadas) de uma amostra, seja mecanicamente, tal como por seleção da célula por citometria de fluxo seja por diferenciação direcionada. Por exemplo, para diferenciar uma população purificada de proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2)+ células progenitoras do fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM , alfa (LMX1 A)+ das presentes invenções, as células progenitoras são purificadas por remoção das células neuronais PAX6 contaminantes ao se selecionar uma população celular mista em uma proteína A2 positiva dupla em caixa de forkhead (FOXA2)+ células do fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa (LMX1A)+ por citometria de fluxo; neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico que são igualmente purificados ou “selecionados” da não dopamina (DA) (células padrão) utilizando um método específico de cultura celular que inclui composições e métodos das presentes invenções. A remoção ou seleção de células neuronais dopaminérgicas (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino não mesencefálico dá gera um aumento na percentagem de neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ desejados de destino mesencefálico na amostra. Deste modo, a purificação de um tipo de célula resulta em um “enriquecimento”, i.e., aumento na quantidade, da célula desejada, i.e., neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2/LMX1A+ de destino mesencefálico na amostra.• termo “que ocorre naturalmente”, tal como presentemente utilizado quando aplicado a um objeto (tal como célula, tecido, etc) e/ou químico (tal como, proteína, sequência aminoácida, sequência de ácido nucleico, codão, etc) significa que o objeto e/ou composto são/foram encontrados na natureza. Por exemplo, uma célula de ocorre naturalmente refere-se a uma célula que se encontra presente em um organismo que pode ser isolado de uma fonte na natureza, tal como uma célula embriónica, em que a célula não foi intencionalmente modificada pelo homem em laboratório.
[107] Tal como utilizado presentemente, o termo “in vitro” refere-se a um ambiente artificial e a processos ou reações que ocorrem dentro de um ambiente artificial. Nos ambientes in vitro exemplificados, mas não se limitam a, tubos teste e culturas de células.
[108] Tal como presentemente utilizado o termo, “in vivo” refere-se ao ambiente natural (por ex. um animal ou uma célula) e a processos que ocorrem dentro de um ambiente natural, tal como desenvolvimento embriónico, diferenciação celular, formação de tubo neural, etc.• termo “derivado de” ou “estabelecido por” ou “diferenciado de” quando utilizado em referência a qualquer célula presentemente divulgada, refere- se a uma célula que foi obtida de (por ex. isolada, purificada, etc) uma célula progenitora em uma linhagem celular (tal como, um embrião dissociado ou fluidos que utilizam qualquer manipulação, tal como, sem limitação, isolamento de célula única, em cultura in vivo, tratamento e/ou mutagênese. Uma célula pode derivar de outra célula, utilizando, por exemplo, tratamento químico, radiação, induzindo expressão de nova proteína, por exemplo, por infecção com vírus, transfecção de sequências ADN, contatando (tratando) com um morfogênico, etc., e seleção (tal como por cultura em série) de qualquer tipo de célula que se encontra contida em células progenitoras em cultura). Uma célula derivada pode ser selecionada a partir de uma população mista em virtude de resposta a um fator de crescimento, citoquina, progressão selecionada de tratamentos com citoquina, aderência, procedimento de seleção e semelhantes.
[109] Tal como presentemente utilizado, o termo “células" refere-se a uma única célula assim como a uma população de (i.e. mais do que uma) células. A população pode ser uma população pura que inclui um tipo de célula, tal como uma população de células neuronais ou uma população de células embriónicas indiferenciadas. Alternativamente, a população pode incluir mais do que um tipo de célula, por exemplo, uma população celular mista. Não se pretende limitar o número de células em uma população, por exemplo, em uma realização, uma população mista de células pode incluir, pelo menos, uma célula diferenciada. Nas presentes invenções, não existe limite no número do tipo de células que uma população celular pode compreender.
[110] Tal como presentemente utilizado, o termo “população altamente enriquecida” refere-se a uma população de células em um prato de cultura, expressando um marcador a uma percentagem ou quantidade mais alta comparativamente a uma população, por exemplo, tratar uma cultura de células contactadas por LSB no dia 1 com purmorfamina e no dia 3 com CHIR resulta em uma população altamente enriquecida de células progenitoras do mesencéfalo em placa basal comparativamente ao tratamento com LSB isoladamente. Em outros exemplos, uma população enriquecida é uma população que resulta da seleção ou separação de células que expressam um ou mais marcadores das células que não expressam o marcador desejado, tal como população CD 142 enriquecida, uma população A9 enriquecida e semelhantes. • termo “biologia da célula” ou “biologia celular" refere-se ao estudo de uma célula viva, tal como anatomia e função de uma célula, por exemplo, características de uma célula fisiológica, estrutura, organelas e interacções com o seu ambiente, seu ciclo de vida, divisão e morte.• termo “sequência de nucleotídeos de interesse” refere-se a qualquer sequência de nucleotídeos (por ex. ARN ou ADN), sendo que a sua manipulação pode ser considerada necessária por qualquer razão (por ex. tratar doença, conferir qualidades melhoradas, expressão de uma proteína de interesse em uma célula hospedeira, expressão ou ribozima, etc.), por um especialista na técnica. Estas sequências de nucleotídeos incluem, sem que tal constitua qualquer limitação, sequências codificadoras de genes estruturais (por ex. genes repórter, genes de marcador de seleção, oncogenes, genes resistentes a fármaco, fatores de crescimento, etc.) e sequências reguladoras não codificadoras, as quais não codificam um mARN ou produto da proteína (por ex. sequência promotora, sequência de poliadenilação, sequência de terminação, sequência intensificadora, etc.).
[111] Tal como presentemente utilizado, o termo “proteína de interesse” refere- se a uma proteína codificada por um ácido nucleico de interesse.• termo “gene” refere-se a uma sequência de ácido nucleico (por ex. ADN ou ARN) que inclui sequências codificadoras necessárias para a produção de um polipeptídeo ou percursor (por ex. proinsulina). O polipeptídeo pode ser codificado por uma sequência codificadora integral ou por qualquer porção da sequência codificadora desde que se retenha a atividade desejada ou características funcionais (por ex. atividade enzimática, ligação do ligando, transdução de sinal, etc.) da totalidade ou fragmento. O termo abrange igualmente a região codificadora de um gene estrutural e inclui sequências localizadas adjacentes à região codificadora em ambas as extremidades 5 e 3 para uma distância de cerca de 1 kb ou mais em cada extremidade de modo a que o gene corresponda ao cumprimento total de mARN. As sequências que se localizam em 5 da região codificadora e as quais se encontram presentes em mARN são referidas como sequências 5’ não traduzidas. As sequências que se localizam em 3 ou na região codificadora ajusante e as quais se encontram presentes em mARN são referidas como sequências 3’ não traduzidas. O termo “gene” abrange tanto cADN como as formas genómicas de um gene. Uma forma genômica ou clone de um gene contém a região codificadora interrompida com sequências não codificadores denominados “intrões” ou "regiões intervenientes” ou “sequências intervenientes”. Intrões são segmentos de um gene que são transcritos para ARN nuclear (hnARN); intrões podem conter elementos reguladores tais como intensificadores. Intrões são removidos ou “expulsos” da transcrição nuclear ou primária A mARN funciona durante a tradução para especificar a sequência ou ordem dos aminoácidos em um polipeptídeo nascente.
[112] Tal como presentemente utilizado, o termo "expressão do gene” refere- se ao processo de converter informação genética codificada em um gene para ARN (por ex., mARN, rARN, tARN, ou snARN) através da "transcrição" do gene (i.e., por meio da ação enzimática de uma polimerase de ARN), e para genes codificadores de proteínas para proteínas através de “translação” de mARN. Expressão do gene pode ser regulada em várias fases no processo. “Supra regulação” ou “ativação” refere-se a regulação que aumenta a produção de produtos de expressão de genes (i.e., ARN ou proteína), enquanto "sub-regulação" ou "repressão" refere-se a regulação que diminui produção. Moléculas (por ex, fatores de transcrição) que estão envolvidas na supra-regulação ou sub-regulação são frequentemente denominados “ativadores” e “repressores” respectivamente.
[113] Tal como presentemente utilizado, os termos “molécula de ácido nucleico codificadora”, “sequência ADN codificadora”, “ADN codificador”, “sequência ARN codificadora” e “ARN codificador” referem-se à ordem ou sequência de deoxiribonucleótidos ou ribonucleótidos ao longo da cadeia de ácido deoxiribonucleico ou ácido ribonucleico. A ordem destes deoxiribonucleótidos ou ribonucleótidos determina a ordem dos aminoácidos ao longo da cadeia de polipeptídeos (proteína). A sequência AND ou ARN codifica assim a sequência de aminoácidos.• termo “isolado” quando utilizado em relação a um ácido nucleico, tal como em "um oligonucleótido isolado” ou “polinucleótido isolado” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é identificada e separada de, pelo menos, um componente ou contaminante com o qual é normalmente associado na sua fonte natural. Ácido nucleico isolado encontra-se assim presente em uma forma ou estabelecimento que é diferente daquele em que é encontrado na natureza. Contrariamente, ácidos nucleicos não isolados como ácidos nucleicos, tal como ADN e ARN encontrados no estado em que existem na natureza. Por exemplo, uma determinada sequência AND (por ex. um gene) é encontrado no cromossoma da célula hospedeira na proximidade dos genes circundantes; sequências ARN, tais como uma sequência mARN específica codificadora de uma proteína específica, são encontradas na célula como uma mistura com inúmeras outras mARNs que codificam uma multitude de proteínas. No entanto, o ácido nucleico isolado que codifica uma determinada proteína envolve, a título de exemplo, esse ácido nucleico em células que comummente expressam a referida proteína na qual o ácido é um local cromossomal diferente do das células naturais, ou então é flanqueado por uma sequência de ácido nucleico diferente da encontrada na natureza. O ácido nucleico isolado, oligonucleótido ou polinucleótido pode estar presente em uma forma de cadeia simples ou cadeia dupla. Quando um ácido nucleico isolado, oligonucleótido ou polinucleótido vai ser utilizado para expressar uma proteína, o oligonucleótido ou polinucleótido irá conter, no mínimo, ou cadeia sense ou codificadora (i.e., o oligonucleótido ou polinucleótido pode ser de cadeia simples), mas pode conter tanto a cadeia sense como a cadeia anti-sense (i.e., oligonucleótido ou polinucleótido podem ser de cadeia dupla).
[114] Tal como presentemente, o termo “kit” refere-se a qualquer sistema de entrega para entrega de materiais. No contexto da diferenciação celular, um kit pode referir-se a uma combinação de materiais para contatar células estaminais, tal como sistemas de entrega que permitem armazenamento, transporte ou entrega de reagentes de reação de um local para outro nos recipientes apropriados (tal como, tubos, etc.) e/ou materiais de suporte (por ex., tampões, instruções escritas para realizar diferenciação celular, etc.) (por ex., compostos, proteínas, agentes de detecção (tal como, anticorpos que se ligam a tirosina hidroxilase (TH), proteína A2 de domínio forkhead (FOXA2), fator de transcrição 1 de homeodomínio LIM, alfa (LMX1A), etc.), etc. Por exemplo, os kits incluem um ou mais compartimentos (por ex. caixas, sacos, tubos de teste, tubos Eppendorf, tubos capilares, placas de múltiplos alvéolos, e semelhantes) que contêm reagentes de reação relevantes para inibir caminhos de sinal, por exemplo, um inibidor para reduzir o fator de transformação de crescimento fator beta (TG F P)/sinal Activin-Nodal, tal como SB431542 (ou substituição de SB431542), e semelhante, um inibidor para reduzir o sinal SMAD, LDN- 193189 (ou substituição de LDN-193189), e semelhantes, um inibidor para reduzir glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β), por exemplo, para ativação de sinal sem asas (Wnt ou Wnts) também conhecido como ativador de sinal WNT (agonista WNT), tal como CHIR99021 (ou substituição de CHIR99021), etc.), e semelhantes, um ativador do sinal Sonic hedgehog (SHH) (tal como um agonista do receptor de pequena molécula (SMO)), por exemplo, uma molécula Sonic hedgehog (SHH) C25II, purmorfamina, e semelhantes, uma molécula com atividade do fator de crescimento do fibroblasto 8 (FGF8), tal como fator de crescimento do Fibroblasto 8 (FGF8), etc., e moléculas de maturação neuronal, por exemplo, fator neutrófico derivado do cérebro (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrófico da linhagem celular glial, dibutiritilo cAMP e fator de transformação do crescimento do tipo B3, incluindo moléculas com capacidade de substituir estes componentes e/ou materiais de suporte. Os reagentes no kit, em uma realização, podem encontrar-se como solução, ser gelados ou liofilizados. Os reagentes, no kit, em uma realização, podem encontrar-se em recipientes individuais ou podem ser facultados como combinações específicas, tal como uma combinação de LSB (LDN-193189 com SB431542), molécula Sonic hedgehog (SHH) C25II com purmorfamina, molécula Sonic hedgehog (SHH) C25II com purmorfamina com CHIR99021 ou purmorfamina com CHIR99021, moléculas de maturação neuronal e semelhantes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[115] Figura 1 apresenta uma indução de exemplo e conversão neurogênica de percursores mesencefálicos em placa basal, derivados da célula ES humana dependente da adição de CHIR990221, a) Análise imunocitoquímica ao dia 11 da diferenciação para expressão de FOXA2 (a vermelho), NESTIN (a verde, painéis superiores), LMX1A (a verde, painéis intermédios) e OTX2 (a verde, painéis inferiores) b,c) Quantificação dos dados apresentados em (a). Dados de três experiências independentes realizadas cada uma em triplicado (média ± SEM). Os níveis de significação para marcadores individuais são apresentados comparativamente ao único tratamento LSB. ANOVA; Dunnett test: *** p < 0,001; ** p < 0,01; p < 0,05). d) Ilustração esquemática das condições de cultura utilizadas para as três condições de tratamento. e,f) Listas dos genes de expressão selecionados diferencialmente ao dia 11 por comparação das condições LSB/S/F8/CHIR tanto com LSB (e) como com LSB/S/F8 (f). g,h) Análise temporal da expressão genética de marcadores selecionados característicos da identidade do percursor DA do mesencéfalo (g), identidade do percursor não DA do prosencéfalo e ventral (h). As barras das escalas correspondem a 50 μm.
[116] A figura 2 apresenta uma análise imunocitoquímica e molecular de exemplo de neurônios DA mesencefálicos de destino em LSB/S/F8/CHIR tratados comparativamente com LSB/S/F8 (ventral/hipotalâmico) e destino LSB (prosencéfalo dorsal), a) Análise imunocitoquímica ao dia 25 para expressão de FOXA2 (a azul) em combinação com Tujl (a vermelho)/LMXlA (a verde) (painéis superiores) e NURRl (a vermelho)/TH (a verde) (painéis inferiores), b) Análise quantitativa de co-expressão em culturas tratadas com LSB/S/F8/CHIR. Os dados provêm de três experiências independentes realizadas cada uma em triplicado (média ± SEM). c,d) A análise global da expressão do gene foi realizada ao dia 25 (amostras e,m triplicado para todas as três condições). Listas selecionados dos genes expressos de forma mais diferenciada comparando o dia 13 com o dia 25 na condição LSB/S/F8/CHIR (c) e comparando o tratamento LSB/S/F8/CHIR com LSB (d, painel da esquerda) e LSB/S/F8 (d, painel da direita), e) Análise da expressão do gene diferencial normalizado para marcadores chave de neurônios DA mesencefálicos Níveis de significação para marcadores individuais são apresentados comparativamente ao único tratamento LSB. ANOVA; Teste Dunnett: *** p < 0,001; ** p < 0,01; p < 0,05). As barras das escalas correspondem a 50 μm.
[117] As figuras 3-1 e 3-2 apresentam um exemplo de maturação in vitro, caracterização e avaliação funcional e neurônios DA do mesencéfalo derivados de roseta versus placa basal. Figura 3-1: apresenta um exemplo: a) Análise imunocitoquímica ao dia 50 de diferenciação para TH (a vermelho), em combinação com LMX1A (a verde, painéis à esquerda), FOXA2 (a azul, painéis à esquerda) e NURR1 (a verde, painéis à direita), b) Quantificação de células TH+, FOXA2+, LMX1+ e NURR1+ de um total de células em culturas derivadas de roseta versus derivadas de placa basal (LSB/S/F8/CHIR), c) Quantificação de subtipos neuronais seronina + (5-HT), e GABA+ ao dia 50 em culturas de neurônios DA derivados de placa basal e de roseta. d,e) Análise HPLC para medição de DA e metabolitos d) Cromatograma representativo para detecção eletroquímica de DA em uma amostra de culturas derivadas de placa basal, e) Comparação de níveis DA, DOPAC e HVA entre culturas derivadas de roseta versus de placa basal, f) Análise imunocitoquímica de culturas derivadas em placa basal (dia 80) para TH (a vermelho) e sinapsina (a verde), g-i) Análises eletrofisiológicas de culturas derivadas em placa basal ao dia 80 de diferenciação de neurônios DA. Imagem de contraste de fase de um neurônio alterado (g) e respectivos registos (h). i) Análise da potência que apresenta oscilações potenciais da membrana características da identidade de neurônios DA (2 a aproximadamente 5Hz). Níveis significativos para marcadores individuais (painéis b, c, e) são apresentados em comparação a FP - versus culturas derivadas de roseta: T-teste de Student: *** p < 0,001; ** p < 0,01; p < 0,05). As barras de escala correspondem a 50 μm em (a), 20 μm em (f, painel superior), 5 μm em (f, painel inferior) e 20 μm em (g) j: Maturação de neurônios mDA in vitro (d65). Neurônios TH positivos continuam a expressar FoxA2 e estendem fibras longas típicas de neurônios mDA, e k: Medição de libertação de DA por HPLC: neurônios TH+ d65 de idade são funcionais in vitro. Figura 3-2: apresenta um sumário de exemplo de células produzidas por um protocolo de neurônios DA do mesencéfalo com base em placa basal tal como presentemente descrito, a) Contrariamente a estratégias do passado (por exemplo, Perrier, A.L. et al. Derivação de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo a partir de células estaminais embriónicas humanas. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12543-8 (2004)), o novo protocolo presentemente descrito tem por base gerar placa basal do mesencéfalo positivo para LMX1A/FOXA2 (painel à esquerda) seguido de conversão neuronal (painel intermédio) e maturação de neurônios DA (painel à direita) Células neuronais DA maduras geradas em placa basal retêm a expressão FOXA2/LMX1A.
[118] A figura 4 apresenta um exemplo de sobrevivência e função in vivo de neurônios DA humanos derivados de placa basal em cérebros hospedeiros do modelo PD em ratinhos, ratos e macacos, a-d) Transplante de neurônios DA derivados de placa basal em ratinhos adultos lesionados com 6-OHDA (estirpe null NOD-SCID IL2Rgc), a) Expressão de TH e morfologia do enxerto aos 4,5 meses após o transplante, b) Expressão de marcador específico humano (hNCAM, a azul), TH (a verde) e FOXA2 (a vermelho), c) Quantificação de FOXA2+, TH+ e células duplamente marcadas em enxertos derivados de placa basal (média ± SEM, n=4 a 4,5 meses após enxerto), d) Análise de rotação induzida por anfetamina em enxertos derivados de placa basal (a azul) versus derivados por roseta (a verde). As barras de escala correspondem a 500 μm em (a), 100 μm em (b) e 40 μm em (4c). e-p) Transplante de neurônios DA derivados de placa basal em ratos adultos lesionados com 6-OHDA. Análise imuno-histoquímica para co-expressão de TH (a verde) e os marcadores específicos humanos (a vermelho) hNA. e) e hNCAM (4f). g) Qualificação estereológica do número total de células (hNA+), células TH+ e células TH+ co-expressoras de FOXA2. O volume de enxerto médio foi de 2,6 +/0,6 mm3), h-j) Imagens de alta potência que apresentam a co-expressão de TH (a verde) com os fatores de transcrição específicos do mesencéfalo FOXA2, PITX3 e NURR1 (a vermelho), k-m) Análise comportamental de animais tratados com enxertos de neurônios DA derivados de placa basal versus animais submetidos a tratamento de controlo, k) Assimetria rotacional induzida com anfetamina. 1) teste de marcha: medição de aquinesia nos membros anteriores nos lados afetados versus não afetados, m) Teste do cilindro: medição da preferência ipsilateral versus contra-lateral da pata com recúo. Animais enxertados apresentaram uma melhoria significativa em, pelo menos, três testes (p < 0,01 a 4,5 - 5 mês; n=4-6 cada), n- p) Análise imuno-histoquímica para TH (a verde) e co-expressão (a vermelho) com DAT (n), GIRO (o) e calbindina (p). Níveis significativos (painéis d, k, 1, m) são: ** p < 0,01; p < 0,05). Barras de escala correspondem a 200 μm em (e), 50 μm em (f), 20 μm em (h-j) e 40 μm em (n-p). q-t) Transplante de neurônios DA derivados de placa basal em macacos rhesus adultos lesionados com l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetra- hidropiridina (MPTP), q) Resumo de um local de enxerto representativo ao mês 1 após transplante marcado pela expressão do marcador citoplasmático específico humano SC-121 (a verde), r) expressão TH em enxerto com a auréola circundante fibras TH+ (setas), s) Análise da co-expressão de SC-121 (a vermelho) com TH (a verde) em núcleo de enxerto, t) Análise da co-expressão de FOXA2 (a vermelho) em neurônios TH+ (a verde). As barras de escala correspondem a 2 mm para (q), 500 μm para (r), 200 μm para (s), e 50 μm para (t). u) o desenvolvimento de fibras derivado do enxerto (huNCAM+) no corpo estriado corpo estriado do hospedeiro, v) Células derivadas do enxerto não se diferenciam em célula da glia. No entanto, os enxertos continham algumas fibras serotonérgicas para além da população celular TH+.
[119] Figura 5 apresenta um momento de exemplo de CHIR99021 cuja exposição determina a indução de percursores em placa basal do mesencéfalo FOXA2/LMX1A, a) Análise imunocitoquímica de FOXA2 (a vermelho)/LMXlA (a verde) ao dia 11 de diferenciação seguido de tratamento LSB/S/F8 isoladamente ou em combinação com CHIR começando nos vários momentos indicados, b) Quantificação da percentagem de FOXA2+, LMX1A+ e células duplamente marcadas ao dia 11 de diferenciação seguida de início diferencial de exposição CHIR tal como descrito em (a). Níveis de significação para marcadores individuais são apresentados em comparação a nenhuma condição CHIR: ANOVA; teste Dunnett: *** p < 0,001; ** p < 0,01; p < 0,05). As barras de escala correspondem a 50 μm.
[120] Figura 6 apresenta um exemplo da exposição de FGF8 que não desempenha um papel importante na indução dos percursores FOXA2/LMX1A em placa basal do mesencéfalo. Imagens representativas da expressão FOXA2 (a vermelho)/LMXl A (a verde) por imunocitoquímica ao dia 11 de diferenciação. As células foram expostas a LSB/CHIR na presença ou ausência de SHH (purmorfamina + SHH C25II) e FGF8. As barras de escala correspondem a 50 μm.
[121] A figura 7 mostra que é necessária uma exposição de exemplo a alta dosagem de SHH e/ou um agonista da pequena molécula smoothened (purmorfamina) para indução eficaz em placa basal do mesencéfalo na presença de CHIR99021. Imagens representativas da expressão FOXA2 (a vermelho)/LMXl A( a verde) por imunocitoquímica ao dia 11 de diferenciação. As células foram tratadas com LSB/F8/CHIR na presença de várias concentrações de SHH (SHH- C25II) e purmorfamina agonista smoothened. As barras de escala correspondem a 50 μm.
[122] A figura 8 apresenta uma análise de exemplo de genes diferencialmente expressos em LSB/S/F8/CHIR tratados versus culturas de LSB e LSB/S/F8 tratadas aos dias 11 e 25 de diferenciação, a) Grupo hierárquico dos dados gerais de expressão dos genes obtidos a partir das três condições ao dias 0, 1, 3, 5, 7, 11 e 13 (amostras foram avaliadas em triplicado para cada condição e cada dia), b) Análise de enriquecimento do gene de acordo com classes GO utilizando DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov. Comparações ao dia 11 revelam enriquecimento tanto do sinal SHH como do sinal WNT na condição LSB/S/F8/CHIR de acordo com ativação mediada por CHIR99021 de sinal WNT canónico. Os destinos de células alternativas, tal como "desenvolvimento do prosencéfalo" e "diencéfalo" assim como "homeodomínio" são outros termos GO altamente enriquecidos aos dias 11 e 25. c) Validação online utilizando a base de dados da expressão humana do gene Allen (http://human.brain-map.org) para marcadores candidatos enriquecidos na condição neurônio DA do mesencéfalo (LSB/S/F8/CHIR). TTF3, EBF1, EBF3 e TTR foram expressos com base em dados da micro-série específicos da região do cérebro humano. TTR, um alvo transcripcional clássico de FOXA2 é apenas fracamente expresso na substância negra adulta, sugerindo que a sua função principal ocorre durante o desenvolvimento ou que o tratamento SHH pode causar níveis de expressão elevada de TTR na diferenciação in vitro.
[123] A figura 9 apresenta um protocolo de diferenciação de exemplo para indução de placa basal e desenvolvimento de neurônios DA no mesencéfalo nas linhagens representativas independentes hESC e hiPSC. Dados da linha HI de hESC e das linhagens 2C6 de hiPSC (de um doente PD esporádico) e SeV6 (com base em Sendai, livre de integração) encontram-se presentes. O protocolo baseado em placa basal descrito na Figura 1d e Figura 10, foi utilizado de acordo com a análise da expressão FOXA2 (a vermelho) ao dia 11 e TH (a verde)/FOXA2 (a vermelho) ao dia 25 de diferenciação
[124] A figura 10 apresenta um resumo esquemático das condições de diferenciação utilizadas para culturas de células derivadas da roseta e derivadas em placa basal. Ambos os protocolos utilizaram inibição de SMAD dupla para acelerar aquisição de destino neural. LDN foi utilizado para inibição BMP no protocolo em placa basal enquanto o a indução noggin tradicional foi utilizada para culturas de rosetas. As abreviaturas são: LDN: LDN-193189, SB: SB431542, SHH (purmorfamina + SHH C25II), FGF8: FGF8, BAGCT: BDNF + ácido ascórbico + GDNF + dbcAMP + TGFP3. SHH/FGF8 no protocolo roseta foi utilizado SHH C25I isoladamente na ausência de purmorfamina segundo a recomendação inicial para moldar as culturas de neurônios DA derivados de roseta. Nota: Tratamento com purmorfamina em uma fase de roseta apresenta toxicidade a uma concentração adequada para definir padrões das células em placa basal. BASF: BDNF + ácido ascórbico + SHH/FGF8.
[125] A figura 11 apresenta uma maturação in vitro de exemplo de culturas de neurônios DA derivados de placa basal, a) Análise imunocitoquímica de neurônios TH derivados de placa basal (a verde) para expressão DAT (a vermelho; dia 80). b) Tujl+ extensivo (a vermelho) tratos fibrosos foram observados ao dia 60 de diferenciação estendendo sobre distâncias de > 2 mm. c) Ao dia 80 de diferenciação, co-expressão de GIRK2 (a vermelho) em neurônios TH+ (a verde). Barras de escala correspondem a 20 μm em (a) 100 μm em (b) e 20 μm em (c).
[126] A figura 12 apresenta uma análise imunohistoquímica de estudos de sobrevivência em curto prazo (6 semanas) in vivo de corpos corpo estriados de ratos adultos intactos (não lesionados) (NOD-SCID IL2Rgc estirpe null). Análise de enxertos derivados de placa basal (dia 25 células; 150 x 103 células/animal), a) Imagem representativa de núcleo de enxerto que mostra células TH+ rodeadas por fibras hospedeiras TH+. Uma média de 6.200 células TH+ (n=3) estavam presentes no enxerto a 6 semanas após transplante, b) células expressoras de FOXA2 (a vermelho) foram apenas encontradas no enxerto mas não no corpo estriado hospedeiro circundante demonstrando origem do enxerto e identidade do mesencéfalo das células. Quase todos os neurônios TH+ (a verde) co-expressaram FOXA2 (a vermelho). No entanto, uma proporção considerável de células FOXA2+ não co-expressaram TH sugerindo que estas células não adquiriram ainda um fenótipo DA maduro ou representam outra população neuronal negativa FOXA2+ para marcadores de neurônios DA. As barras de escala correspondem a 50 μm.
[127] Figura 13 apresenta uma análise histológica de exemplo de ratinhos lesionados com 6-OHDA, enxertados a longo prazo (4,5 meses) (NOD-SCID IL2Rgc estirpe null) comparando o comportamento de enxertos derivados de roseta versus placa basal. Análise de enxertos derivados de placa basal, a) Exemplo de um dos maiores enxertos derivados de placa basal. O enxerto mantém uma citoarquitetura hNCAM+ (a vermelho) bem circunscrita. b) Observou-se desenvolvimento robusto da fibra hNCAM+ na periferia do enxerto, c) Fibras serotonérgicas (5-HT+) (a verde) em enxerto são em grande parte negativas para hNCAM (a vermelho) sugerindo origem no hospedeiro, d) neurônios GABAérgicos e fibras (a verde) em enxerto. Análise de enxertos derivados de roseta: e) Desenvolvimento neuronal com compressão de tecido cerebral hospedeiro. A maioria de células foi positiva para ambos NCAM (a vermelho) e DCX (a verde) sugerindo destino neuronal, f) fibras NCAM+/DCX+ estenderam-se para o lado contra-lateral não transplantado do cérebro, g) Foram observadas múltiplos grupos DCX+ dentro do núcleo do enxerto, h) Foram observadas poucas células TH+ (a verde) e fibras na periferia do enxerto e quase todas as células TH+ derivadas da roseta in vivo eram negativas para FOXA2 (a azul). Análise imunohistoquímica de enxertos derivados de placa basal versus derivados de roseta a 4,5 meses. São apresentadas imagens representativas para expressão do marcador de proliferação Ki67 (a vermelho) e do marcador percursor neural PAX6 (a verde) (i), expressão de FOXA2/DCX (j), FOXGl/hNCAM (j, inserção), e marcador de astrócitos GFAP (a verde) (k). Barras de escala correspondem a 500 μm em (a), 50 μm em (b-d), para 500 μm (e), 50 μm em (g- h), 50 μm em (i), 40 μm em (j) e 20 μm em (k).
[128] A figura 14 apresenta um exemplo de análise histológica de ratos SD lesionados com 6-OHDA, enxertados a longo prazo (5 meses), a) A grande maioria de células hNA+ (a vermelho) expressaram Tuj 1 (a verde) indicando uma identidade de destino neuronal, b) GFAP+ fibras (a verde) dentro do enxerto não co-expressaram hNA (a vermelho) sugerindo assim origem hospedeira, c) Foram observados alguns corpos celulares (5- HT+) serotonérgicos humanos (a verde) enquanto a maioria das fibras serotonérgicas derivaram do hospedeiro semelhantemente aos dados obtidos no hospedeiro rato (Figura 13C). d) Exemplo adicional de neurônios TH+ (a verde) dentro do enxerto, caracterizados pela expressão de hNCAM (a vermelho) para confirmar identidade humana de células em cérebro hospedeiro. Barras de escala correspondem a 25 μm em painéis.
[129] A figura 15 apresenta um exemplo de análise histológica de enxertos derivados de placa basal no cérebro de primata. Neurônios DA derivados de placa basal derivaram de H9 hESCs e de H9- GFP hESCs (dia 25 culturas; 1,25 x 106 células/trato, 3 tratos/por hemisfério, 6 tratos no total) foram enxertados para o corpo estriado de macacos rhesus lesionados com MPTP adultos (=2). a) Painel superior e painel à direita Reconstruções de imagem de alta resolução de locais representativos de enxerto (1 mês após Transplante). Citoarquitetura de enxerto é ilustrada por imunohistoquímica para o marcador humano específico SC-121 (sem interreações com tecidos de primata não humano). Painel inferior esquerdo: SC- 121+ fibras que se estendem do núcleo de enxerto. Painel inferior direito: Imagem de alta resolução de células SC-121+ que apresentam morfologias de precursor neural, b) Análise de expressão GFP em núcleos de enxerto que confirmaram ainda a identidade humana das células que complementam os dados SC-121. Nota: Para ambos os animais, cada hemisfério foi enxertado com células derivadas de H9 não marcadas, enquanto outro hemisfério recebeu células derivadas de células H9-GFP (expressão de GFP sob controlo de promotor EFla), c) Imagem de alta resolução de enxerto GFP+ utilizando detecção DAB apresentando inúmeras células GFP+ na periferia do enxerto que exibe morfologia de neuroblasto, d) Análises imunohistoquímicas de áreas no núcleo do enxerto negativo para GFP e SC-121. Estas áreas continham grandes números de micróglias hospedeiras baseadas na expressão Ibal (a vermelho) assim como poucos macrófagos ED1+ (a azul), sugerindo inflamação persistente apesar da imunossupressão de ciclosporina. Barras de escala correspondem a 500 μm em (a, painel superior), 50 μm em (a, painel inferior esquerdo), 20 μm em (a, painel inferior direito), 2 μm em (b), 500 μm em (c, painel à esquerda), 50 μm (c, painel superior direito), 100 μm (c, painel inferior direito), 100 μm (d).
[130] A figura 16 apresenta um de exemplo derivação de células TH+ de hESCs utilizando um método anterior baseado na célula alimentadora MS5 que diferencia as células em células do tipo neurônio DA via (através) de intermediários celulares da roseta. Topo) em P0 foram postas em contato hESCs com moléculas para iniciar indução neuronal de células Oct4+ em células roseta utilizando células alimentadoras MS5 (Perrier et al., 2004). Na fase PI, as células roseta foram expandidas ao contatar células com moléculas diferenciadas em células na fase P2 com padrões de expressão específicos incluindo células progenitoras Pax2+/Enl+ DA ainda diferenciadas em neurônios TH+/Enl+ DA. Estas células foram utilizadas para enxerto em ratos com lesão com 60HDA, imunossuprimidos por tratamento A com ciclosporina. Estes estudos de transplante revelaram uma viabilidade in vivo muito fraca de neurônios tipo DA, incluindo perda do fenótipo TH+ e revelaram preocupações sobre crescimento adicional de células indesejadas, possivelmente letais para os animais com enxerto, i.e., teratomas e crescimento de células em tipos neurais inapropriados que causariam problemas médicos adicionais ao doente. A: Registaram-se muito poucos neurônios TH+ sobreviventes 4,5 meses após o transplante (< 50 TH+ células / animal) em enxertos de precursores de neurônios DA derivados de roseta.
[131] No entanto, em contraste com as células TH+, as células marcadas GFP (GFP foram induzidas por um promotor omnipresente) sobreviveram bastante bem após transplante. Esta situação sugere que a maioria das células sobreviventes após transplante eram células neurais de identidade de neurônios não DA (16B). Fig. 16C: poucas células derivadas do enxerto (hNA+ (a verde) co-expressam TH (a vermelho) sugerindo que a maioria das células humanas enxertadas adoptam um fenótipo do neurônio não DA. Ps painéis 16 D-E mostram que D-E, apesar da sobrevivência in vivo muito fraca, registou alguma melhoria (embora muito modesta e altamente variável) em algumas análises de comportamento, tal como rotações induzidas por anfetamina (D), teste do cilindro e rotações espontâneas (E).
[132] A figura 17 apresenta um de exemplo de protocolo para derivação de números baixos de células em placa basal. Um protocolo de inibição SMAD dupla modificado gerou células (fp) em placa basal. Foram necessárias concentrações altas de SHH para a indução de células FoxA2+ fp e que a adição de sinais de definição de padrão caudal, tal como FGF8, Wntl ou RA não deram lugar a uma redução na expressão FOXA2 mas mudaram a identidade regional A) Painel à esquerda: Células ao dia 11 de diferenciação a seguir ao tratamento com NSB (Noggin/SB431542); painel central esquerdo: Tratamento NSB+SHH (Sonic C25II); Painel central: NSB+SHH+RA; Painel central direito:
[133] NSB+SHH+Wntl; NSB+SHH+FGF8; Nota: • tratamento único NSB não induz a expressão FoxA2. FoxA2+ células em placa basal são apenas induzidas na presença de altas doses de SHH. Adição de RA. Wntl e FGF8 não inibem a indução de FoxA2. B) Análise qRT-PCR para expressão genética de FOXA2 e SIX6 revelando manutenção (ou mesmo aumento) de expressão para FOXA2 a seguir ao tratamento com RA ou FGF com uma subregulação concomitante de expressão SIX6 marcando a placa basal mais anterior como células. C) Indução de expressão do gene para precursores do mesencéfalo e marcadores em placa basal do mesencéfalo na presença de FGF8 e Wntl.
[134] Figura 18 apresenta um exemplo de protocolo para derivação de células em placa basal revelando níveis altos de características mesencéfalas comparativamente aos níveis baixos ou ausentes produzidos por procedimentos utilizados nas Figuras 16 e 17 A: Indução de placa basal do mesencéfalo em populações de células postas em contato com níveis altos de SHH, FGF8 e CHIR resultaram na co-expressão FoxA2 com marcadores do mesencéfalo LMX1A e expressão Otx2 ao dia 11 de diferenciação em contraste com células postas em contato com moléculas descritas em dois outros procedimentos tal como mostrado nas Figs. 16 e 17 (N/SB e SHH/FGF8, respectivamente). B: Análise de expressão genética global ao dia 11 comparando os três grupos de células postas em contato com moléculas de cada um dos três procedimentos, incluindo o terceiro procedimento das presentes invenções (LDN/SB, SHH/FGF8, LSB/SHH/FGF8/CHIR). O gráfico B apresenta especificamente os genes que são comuns entre as três condições de tratamento versus aqueles genes que são únicos para cada condição individual. O gráfico B é uma análise preliminar utilizada para resultados micro-série apresentados na Figura 1.C: Níveis mARN de marcadores mesencefálicos FoxA2, LMX1A, são altamente enriquecidos no grupo tratado com LSB/SHH/FGF8/CHIR por comparação ao grupo tratado com SHH/FGF.
[135] Figura 19 apresenta um exemplo de caracterização in vitro de neurônios dopaminérgicos derivados da região do mesencéfalo da placa basal. A: Co- marcação dos neurônios FoxA2+ com marcadores de neurônios mDA TH, Nurrl e LMX1A a d25 de diferenciação. B: Níveis de expressão mARN por marcadores de neurônios mDA QRT-PCR assim como tipos de células do mesencéfalo em grupos tratados LDN/SB + SHH/FGF8 + SHH/FGF8+CHIR.
[136] A figura 20 apresenta um exemplo de diferenciação potencial comparável relativamente ao destino do neurônio DA do mesencéfalo de células PD-iPS mutante PINK1 versus células hES (ou iPS) do tipo selvagem. Linhagem PD-iPSC mutante PINK1 Q456X foi diferenciada utilizando os novos métodos de neurônios DA do mesencéfalo com base em placa basal das presentes invenções obtendo-se perfis de diferenciação do mesencéfalo comparáveis aos obtidos da linhagem H9. A-C) Análise imunocitoquímica da linhagem PD-iPSC mutante PINK1 ao dia 11 de diferenciação (fase do precursor do mesencéfalo) para FOXA2 (a vermelho), LMX1A (a verde) e DAPI (a azul) (A), dia 25 de diferenciação (fase neuronal DA pós mitótica precoce) para FOXA2 (a vermelho) e TH (a verde) (B) e para NURR1 (a vermelho) e TH (a verde) (C). D-F) Mesmo grupo de análises imunocitoquímicas realizadas utilizando células derivadas de H9 ao dia 11 de diferenciação para FOXA2 (a vermelho), LMX1A (a verde) e DAPI (a azul) (D), ao dia 25 de diferenciação para FOXA2 (a vermelho) e TH (a verde) (E) e para NURR1 (a vermelho) e TH (a verde) (F).
[137] A figura 21 apresenta um de exemplo de PD-iPSC mutante PINK1 que apresentou um fenótipo do tipo PD de agregação de proteína a seguir a diferenciação a longo prazo e maturação in vitro. Ao dia 55 de diferenciação, PD- iPSC mutante PINK1 revelou evidência de expressão de a-sinucleína (um componente importante da formação de corpos de Lewy em doentes PD) em citosol de neurônios DA TH+.
[138] As células mostraram alta expressão de ubiquitina (um marcador clássico dos corpos de Lewys).
[139] Em contraste, os neurônios DA derivados do controlo da linhagem iPS apresentaram uma expressão de sináptica expressão de a-sinucleína normal (em oposição à citosólica) e níveis extremamente baixos de ubiquitina. A, B) Análise imunocitoquímica de PINK1 de linhagem mutante PD-iPSC ao dia 55 de diferenciação para a-sinucleína (LB509, a vermelho), TH (a verde) e imagem fundida (A) e a-sinucleína (a vermelho) e Ubiquitina (a verde) (B).
[140] C, D) Análise imunocitoquímica de linhagem de controlo -iPSC ao dia 55 de diferenciação para α-sinucleina (a vermelho) e TH (a verde) (C) e α-sinucleina (a vermelho) e Ubiquitina (a verde) (D).
[141] Figura 22 apresenta um exemplo de expressão de forma agregada de α- sinucleína. No cérebro do doente PD, formas insolúveis dimerizadas de α- sinucleína geram a agregação em corpos de Lewy. A forma dimerizada de α- sinucleína revela fosforilação de Serina 129 em a-sinucleína. Células derivadas PD- iPSC mutantes PINK1 apresentaram forte expressão para a-sinucleína fosforilada em Serl29 em contraste com células derivadas iPSC do controlo que revelaram níveis muito baixos de expressão. A, B) Análise imunocitoquímica para a-sinucleína fosforilada em Serl29 (a verde) e DAPI (a azul) em células derivadas de PD-iPSC mutantes PINK1 ao dia 55 diferenciação (A) e células derivadas iPSC (B) controladas e compatíveis.
[142] Figura 23 apresenta um exemplo de diferenças em modelos padrão de expressão de a-sinucleína que são observados independentemente do protocolo de diferenciação. Os autores da invenção demonstram que os neurônios DA “autênticos” do mesencéfalo possuem uma vulnerabilidade específica PD e respectivos fenótipos específicos in vitro. Os neurônios DA obtidos utilizando o protocolo de diferenciação baseado em alimentador estromal clássico MS5 (Perrier et al., PNAS 2004, presentemente incorporado por referência) pode render grandes números de neurônios TH+. No entanto, com base nos dados das presentes invenções, as células TH+ que resultam de diferenciação pelo protocolo de alimentação estromal clássico MS5 não são neurônios DA do mesencéfalo autênticos. Em culturas diferenciadas por meio do protocolo MS5, existiam muitas células positivas a-sinucleína. No entanto, essas células não co-expressavam TH. Para além disso, não se registou qualquer diferença nos modelos de expressão entre PD- iPSC e -iPSC controladas ao se utilizar a estratégia de diferenciação MS5. Estes dados indicam que a a-sinucleína é igualmente expressada em outros tipos de células e que essa a-sinucleína não DA é inalterável na doença versus células derivadas -iPSC controladas - em particular quando se utilizam os protocolos padrão de diferenciação MS5. Finalmente, o novo protocolo de diferenciação com base em placa basal das presentes invenções rende um grande número de células TH+ que co-expressam a-sinucleína. Estas células TH+ expressem a-sinucleína em um modelo de expressão citosólico. A, B) Análise imunocitoquímica para a-sinucleína (LB509, a vermelho), TH (a verde) da linhagem PD-iPSC mutante PINK1 ao dia 60 de diferenciação baseada em MS5 (A) e -iPSC controlada (B). C) Análise imunocitoquímica de linhagem PD-iPSC mutante PINK1 ao dia 55 de diferenciação baseada em placa basal para a-sinucleína (a vermelho), TH (a verde).
[143] A figura 24 apresenta um exemplo de neurônios DA derivados de PD- iPSC mutante PINK1 que são mais vulneráveis a estimulação tóxica. Os neurônios DA TH+ derivados de PD-iPSC derivados através dos protocolos baseados em placa basal das presentes invenções apresentaram-se mais vulneráveis ao desafio da toxina (valinomicina: mitocondria ionofore, 5uM, 48 horas) comparativamente às células derivadas iPSC controladas. Por contraste, os neurônios TH+ derivados do protocolo baseado no MS5 clássico não apresentaram vulnerabilidade diferencial entre PD - versus células derivadas controladas. A-F) Imunocitoquímica de TH representativa ao dia 60 de diferenciação Condição normal (nenhum tratamento com toxina) para ambas as células PD-iPSC e iPSC de controlo obtidas através do protocolo baseado nas placas de (A, células PD-iPSC derivadas apresentadas), que quase completam a degeneração de neurônios DA TH+ em PD-iPSC a seguir ao tratamento com toxina (B), neurônios DA TH+ parcialmente degenerados de iPSC de controlo (C), Condição normal para culturas derivadas de PD-iPSC e iPSC de controlo, obtidas por meio de protocolo baseado em MS5 (D, células derivadas PD-iPSC apresentadas), neurônios TH+ a seguir a desafio com toxina em PD-iPSC (E), e culturas derivadas de iPSC de controlo (F) obtidas por meio do protocolo MS5. G-H), imagens de imunocitoquímica de baixa potência para Tujl (a vermelho) e TH (a verde) por protocolo baseado em placa basal ao dia 60 de diferenciação: PD-iPSC de desafio normal (G), versus desafio com toxina (H) condições e controlo iPSC normal (I), versus condições desafio com toxina (J). K-N) imagens de imunocitoquímica de baixa potência para Tuj 1 (a vermelho) e TH (a verde) por protocolo baseado em MS5 ao dia 60 de diferenciação: PD-iPSC de condições normal (K) contra desafio com toxina (L) e controlo iPSC de condições normal (M) contra condições desafio com toxina (N).
[144] A figura 25 apresenta um exemplo de qualificação de uma análise de resposta a viabilidade de dose celular para um desafio com toxina. Uma análise sobre viabilidade da célula com azul de alamar após 48 horas de tratamento com valinomicina apresentou sobrevivência células diferencial em um intervalo específico de dose para o desafio com toxina (5 e 10 uM) comparativamente a PD- iPSC e iPSC controlada (dia 60 de diferenciação baseada em placa basal das presentes invenções). Nota: esta análise avalia a morte celular global enquanto os efeitos mais dramáticos foram observados especificamente nos neurônios DA (ver Figura 14). Por conseguinte, a quantificação baseada em azul de alamar irá provavelmente subestimar a dimensão do efeito diferencial observado em linhagens de neurônios DA.
[145] Figura 26 apresenta um exemplo de neurônios DA humanos enxertados derivados de células estaminais pluripotentes que têm características eletrofisiológicas típicas das observadas na parte compacta da substância negra em ratinhos (SNpc). A) Uma reconstrução de topo de um neurônio marca-passo na região de enxerto. Fotomicrografia inferior de uma fatia de cérebro retirada de um rato no qual foram injetados neurônios derivados de hES nos 9 meses anteriores; o enxerto é delineado; uma imagem altamente ampliada é montada no fundo. A fatia foi processada para tirosina hidroxilase, ver partes brancas. B). Topo - O registo de mancha ligado à célula de um neurônio DA putativo no enxerto; Fundo - registo de toda a célula a partir da mesma célula. Os registos foram realizados na presença de glutamato e antagonistas do receptor GABA ((50 (μm AP5,10 μm CNQX e 10 μm GAB Azine) para eliminar a entrada sináptica. Estes registos demonstram que os neurônios PS-derivados foram marca-passo autónomos com as trajetórias normais de voltagem intrasomática. Outro neurônio registado no enxerto tinha características similares. C) Para comparação, são apresentados registos de célula total e da célula ligada de um neurônio dopaminérgico em SNpc em um ratinho adulto. Abreviaturas (CTx= córtex, STr= corpo estriado, SNpc= parte compacta da substância negra , DA= dopaminérgico).
[146] A figura 27 apresenta um marcador de superfície candidato A9 de exemplo e ecrã CD em hPSCs. a) Diagrama de Venn de dados transcriptoma de neurônios DA derivados de ESC de ratos purificados por FACS. Entre os 107 genes partilhados entre PITX3 e Nurr1, na sua maioria eram marcadores conhecidos de neurônios DA do mesencéfalo assim como marcadores novos, foram confirmados por expressão dentro do mesencéfalo ventral. b) Um destes marcadores era DCSM1, um marcador de superfície putativo que aparece para ser enriquecido na região A9, baseado em dados de expressão de mARN in situ (Allen Brain Atlas, Lein, E.S. et al., Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain, Nature 445: 168-176 (2007)). c-f) CD ecrã: c) placa de 96 poços representativa (1 em 3 x 96 placas utilizadas para examinar completamente o painel CD). Poços escuros identificam marcadores CD que são altamente expressos em neurônios DA hESC ao dia 25. e) Sumário dos resultados do rastreio resulta em neurônios DA hESC derivados, f) Um exemplo de marcador, CD142, marcador de superfície que enriquece especificamente os neurônios DA na fase Nurrl+ descoberta a seguir a isolamento mediado por FACS de células CD 142+ versus CD 142- e análise ao dia 7 após seleção.
[147] Figura 28 apresenta exemplo de fase de CD 142 enriquecido Nurrl + para neurônios DA do mesencéfalo e elimina neurônios GABA e Serotonérgicos, a) Citometria de fluxo revelou expressão significativa de CD 142 ao dia 25 de diferenciação, b) fase de CD 142 enriquecida para Nurrl+ entre neurônios DA FOXA2/TH do mesencéfalo em hESCs (por ex. WA09; Figura 27f) e linhagens hiPSC testadas (C29, e M3X representam duas linhagens iPSC humanas ao dia 25 de diferenciação), c, d) CD 142 elimina contaminantes GABAergic e Serotonérgicos a seguir ao dia 25 selecionado cultura in vitro durante 3 semanas , e, f) CD 142 elimina neurônios GABAergic Serotonérgicos in vivo 3 meses após Transplante. As células foram selecionadas para CD 142 ao dia 25. Nota: As células CD 142 enriqueceram também TH e AADC.
[148] Figura 29 apresenta um exemplo de utilização experimental contemplada de PSA. Neurônios DA hESC derivados expostos a PSTnm e que expressam PST- serão avaliados in vitro para efeitos de impacto no fenótipo DA e resultado de fibras. Estudos in vivo em modelos de ratos 60HDA serão testados no sentido de se apurar da viabilidade de números pequenos de neurônios DA com expressão PSA forçada coincidirem com recuperação comportamental de enxertos padrão e se a expressão PSA em neurônios DA hESC derivados tem capacidade de induzir análises de recuperação de função motora complexa.
[149] Figura 30 apresenta um exemplo de utilização de PST. Sobreexpressão (rato PST) resultou em níveis aumentados de PSA-NCAM em células ES de rato diferenciadoras. (A) Quantificação de PST mARN por qPCR em células controlo (Nurrl) e em células que sobre-expressam PST (Nurrl/PST). Dados são expressos como enriquecimento de níveis PST em células Nurrl/PST versus Nurrl. (B) imunocoloração PSA em culturas de neurônios DA ao dia 14 de diferenciação apresenta níveis aumentados de PSA em células Nurrl/PST (Barras de escala: 100 (μm). (C) Western Blot para NCAM em células diferenciadas. Células Nurrl/PST (pista 2) apresenta níveis elevados de forma polissialildada de NCAM (esfregaço, ) comparativamente ao controlo (pista 1). PSA é removido de NCAM após tratamento endoN (pista 3). (D) Quantificação da intensidade do esfregaço de PSA expresso em unidades arbitrárias. (E) Análise PSA FACS ao dia 14 de diferenciação. Tratamento de células com 20 unidades de endoN 24 horas antes do final da diferenciação, aboliu o efeito PST. (F) Fotomicrografias significativas que comparam células diferenciadas Nurrl e Nurrl/PST para imunofluorescência GFP e marcadores DA. Células selecionadas para GFP e recolocadas em placas ainda retêm fenótipo DA (póst seleção). Barras de escala : 100 (μm).
[150] Figura 31 apresenta um exemplo de análise FACS de neurônios DA ES derivados. Isolamento de células GFP + SSEA-1 com base em citometria de fluxo. Como controlos duplamente negatives e GFP 5 negativo, foram utilizadas células ES do rato J1. Cerca de 5 a 10% das células foram positivamente selecionadas.
[151] Figura 32 apresenta um exemplo de enxertos Nurrl/PST que foram mais eficazes na indução da recuperação comportamental no modelo de rato 60HDA. Nurrl: células GFP foram diferenciadas e selecionados ao dia 14 para população GFP+/SSEA-1. Células tratadas com endoN foram colocadas em cultura durante 12 horas antes de se ordenarem com 20 unidades da enzima. 55,000 células foram enxertadas em 1 ml de meio N2 com BDNF e AA. (A) Animais classificaram para rotação induzida por anfetamina (rotações/min duração 20 m) durante 3 semanas antes do enxerto durante 7 semanas depois. Células Nurrl/PST melhoraram significativamente o seu resultado comparativamente ao controlo Nurrl (ANOVA- dois sentidos: p<0,01, com pós teste Bonferroni: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001; 6 animais/grupo). Remoção de PSA por endoN elimina o efeito PST (p= 0,26). (B) Observaram-se mais células GFP+ no enxerto PST no endpoint do que no control (p < 0,05, teste-t). (C) Proporção deimunofluorescência no núcleo. **p<0,01. Teste- t do Estudante (n=5/tipo de enxerto). (D) imunofluorescência GFP, TH e PSA. Barras de escala: 200 (μm). (E) células enxertadas expressam marcadores DA. São apresentados planos z individuais de micrográficos confocais. Barras de escala: 20 (am. Valores são médias +/- SEM.
[152] Figura 33 apresenta um exemplo de aumento de PSA que aumentou o a inervação do corpo estriado por neurônios DA ES derivados. Sobre-expressão PSA-NCAM aumentou õ resultado do processo. (A) Fotomicrográficos representativos de GFP/TH+, GFP/Girk2+ e GFP/sinapsina+ processos em controlos. Coloração em amostras Nurrl/PST foram similares. Barras de escala: 20 (μm). (B) Projeções de empilhamento em z representativas apresentam processos GFP+ que alargam enxertos Nurrl e Nurrl/PST. Existem mais processos GFP+ que alargam o enxerto Nurrl/PST (barras de escala: 50 μm). Inserções mostram processos GFP+/TH+ nas mesmas secções. Seta: direção do crescimento. (C-E) Quantificação da intensidade de processos GFP+ (C, E) e TH+ (D) a diferentes distâncias do local do enxerto normalizado para a intensidade mais próxima do local da injeção (áreas foram divididas e separadas em cinco zonas de ~ 100 μm. Normalização refere-se à zona I; ANOVA dois sentidos, p < 0,01 para dados GFP e TH , n=5/valores de tipos de células são médias +/-SEM). Enxertos Nurrl/PST cresceram mais neuritos para o corpo estriado hospedeiro, o qual foi parcialmente suprimido pelo (E) tratamento endoN. (F) Recuperação do animal correlacionada com o grau de resultado do crescimento. O gráfico apresenta a correlação (análise de regressão linear) entre a intensidade de neuritos GFP+ na zona IV e recuperação animal para animais enxertados não tratados e Nurrl e Nurrl/PST tratados com endoN. Cada valor representa um animal (r 2 =0,65, p<0,001, n=17).
[153] Figura 34 apresenta um exemplo de utilização de PST em métodos associados com lesões na espinal medula para expressão em motoneurônios. No control da espinal medula, as células GFP de Schwann (SCs) são limitadas ao local da lesão pelo tecido cicatrizante hospedeiro (A), enquanto SCS PST-modificado migram facilmente distâncias consideráveis (B). Esta manipulação de PSA resultou na melhoria da locomoção, subpontuação BBB, linhagem superior em (C) apresentada vs linhagem de controlo inferior e destreza dos membros posteriores (teste de gridwalk, linhagem inferior em (D) vs controlos linhagem superior). E, H): diferenciação de rato HB9 GFP ESCs em motoneurônios nos quais a introdução de PST aumenta o germinar da fibra e migração da célula (pontas de seta) in vitro (E, F). O enxerto destas células PST no nervo ciático resulta em uma melhor inervação alvo tal como mostrado pelos números de junções neuromusculares (setas) no músculo EDL (G, H).
[154] Figura 35 apresenta um exemplo de utilização da enzima PSTnm. (A) PSA produzido por PSTnm inibe a adesão das células de Schwann em suspensão a uma monocamada celular de Schwann de modo cada vez mais eficaz (linha a vermelho - linha mais inferior) comparativamente ao PSA produzido pela expressão PST forçada (linha a verde - linha intermédia). (B) Imunotransferência de PSA em motoneurônios HB9 ESC derivados revelam que as amostras de controlo tratadas com PSTnm possuem níveis não detectáveis de PSA. Incubação com substrato de ácido salicílico PSTnm+ CPM- produz uma grande banda PSA a qual é removida com tratamento endoN. (C, D) Semelhantemente aos efeitos obtidos com o gene PST, a polissialilação destas células por PSTnm e substrato durante a diferenciação intensifica o resultado da neurite e migração de células (cabeças de setas). (E) imunocoloração de PSA ao dia 30 de neurônios DA hESC derivados. (F) Esta coloração é significativamente aumentada após tratamento com PSTnm e substrato. (G) injeção in vivo de PSTnm isoladamente não produz qualquer efeito, enquanto a sua co-administração dom substrato (H) produz grandes quantidades de expressão PSA no corpo estriado do rato.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[155] A presente invenção refere-se ao campo da biologia de células estaminais, em particular, a diferenciação de linhagem específica de células estaminais, multipotentes ou pluripotentes, que podem incluir mas não se limitam a células estaminais embriónicas humanas (hESC) além de células estaminais humanas, não-embriónicas, pluripotentes induzidas (hiPSC), células estaminais somáticas, células estaminais de doentes com uma doença ou qualquer outra célula capaz de uma diferenciação de linhagem específica. Descrevem-se os métodos específicos para direcionar a diferenciação da linhagem específica de hESC e/ou hiPSC para células progenitoras da placa basal do mesencéfalo e depois em grandes populações de neurônios dopaminérgicos FOXA2+LMX1A+TH+ (DA), de destino mesencefálico usando condições de cultura inovadoras. Os neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2+LMX1A+TH+ de destino mesencefálico obtidos usando os métodos desta invenção são ainda considerados para várias utilizações, incluindo, mas não se limitando a ensaios de descoberta de fármacos “in vitro”, em pesquisa neurológica e como produto terapêutico na reversão da doença, ou lesão causada pela falta de neurônios dopaminérgicos em um doente. Além disso, a invenção refere composições e métodos para diferenciar neurônios dopaminérgicos (DA) FOXA2+LMX1A+TH+ de destino mesencefálico de células estaminais humanas pluripotentes para serem usadas na modelagem da doença, em particular da doença de Parkinson.
[156] Estas invenções referem-se às características da doença de Parkinson (PD) incluindo a degeneração seletiva dos neurônios dopaminérgicos (mDA) do mesencéfalo no cérebro dos doentes. Porque os sintomas de PD devem-se principalmente à perda seletiva de neurônios dopaminérgicos na substância negra do mesencéfalo ventral, considera-se que a Doença de Parkinson é uma das doenças mais adequadas para terapêuticas de substituição celular em estratégias de tratamento. Assim, muitas tentativas foram feitas para transplantar células para os cérebros dos doentes, no sentido de substituir a perda de função dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo (mDA). No entanto, estas experiências não tiveram sucesso e atualmente os tratamentos sintomáticos usados em doentes, apresentam uma grande variação no sucesso. Portanto, são necessários novos tratamentos para doentes com PD no sentido de retardar a perda da função neuronal.
[157] As células estaminais humanas e pluripotentes (hPSCs) são uma fonte de células para aplicações em medicina regenerativa. A diferenciação direcionada de hPSCs em células especializadas tais como os neurônios motores da medula espinal (Li, et al. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005), aqui incorporados por referência) ou neurônios semelhantes aos dopaminérgicos do mesencéfalo (DA) resultantes da diferenciação por outros métodos diferentes desta invenção. Os inventores descobriram, como se descreve aqui, que os anteriores neurônios dopaminérgicos (DA) (ou seja, em Perrier, et al Proc Natl AcadSci USA 101, 125438 (2004), aqui incorporados por referência) referidos neste documento como neurônios semelhantes aos dopaminérgicos (DA) não são os neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo das presentes invenções (ver Figura 3,10, 13 e 16). Portanto, os inventores designaram os neurônios produtores de dopamina, derivados da placa basal, obtidos pelos métodos aqui descritos, ou seja, neurônios produtores de dopamina das presentes invenções como "autênticos" porque diferente dos neurônios produtores de dopamina, obtidos pelos métodos publicados, quando os neurônios produtores de dopamina das presentes invenções "autênticos", são transplantados em roedores e primatas conseguem reverter situações semelhantes a Parkinson com menos interferência de crescimento neuronal excessivo e formação de teratomas. Além disso, ao contrário dos métodos anteriores de produção de neurônios produtores de dopamina, os "autênticos" neurônios produtores de dopamina das presentes invenções são produzidos em maiores percentagens das populações iniciais e retêm a capacidade de transplante durante vários meses em cultura. Assim, os métodos para tornar os neurônios DA do mesencéfalo autênticos foram descobertos usando os métodos de diferenciação aqui descritos. Mas, a utilização eficaz de hPSCs para a terapia celular tem ficado bastante para trás em relação aos avanços da cultura celular. Embora os neurônios DA de ratinhos, derivados de PSC tenham demonstrado eficácia em modelos da Doença de Parkinson (PD) (Tabar, et al. Nature Med. 14, 379-381 (2008); Wernig, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 5856- 5861 (2008), tendo sido todos aqui incorporados por referência), os neurônios DA derivados dos PSC humanos, geralmente demonstram um desempenho fraco in vivo (Lindvall and Kokaia, J. Clin. Invest 120, 29-40 (2010), aqui incorporados por referência). Além de não compensarem a perda endógena da função neuronal, há graves preocupações de segurança quando os neurônios derivados de hPSC são usados para o transplante e são relacionados com o potencial para formação de teratomas ou crescimento neural excessivo (Roy, et al. Nature Med. 12, 1259- 1268 (2006); Elkabetz, et al. Genes Dev. 22,152-165 (2008), aqui incorporados por referência).
[158] Outra fonte possível de células para transplante são os neurônios DA derivados de ESCs humanos. As tentativas anteriores usando estas células como uma população celular inicial para tornar as células diferenciadas que parecem ser semelhantes aos neurônios DA do mesencéfalo derivados de células estaminais embriónicas humanas (hESCs) que foram transplantadas em modelos de roedores PD resultaram em sobrevivência fraca in vivo dos transplantes após o transplante. Considerou-se este insucesso como sendo mais provavelmente devido a uma diferenciação incompleta dos neurônios DA do mesencéfalo in vitro resultando em células que pareciam ser neurônios DA do mesencéfalo, mas não conseguiram que o enxerto substituísse a função perdida do neurônio. De facto, os inventores mostraram aqui que os neurônios semelhantes a DA, obtidos anteriormente nos seus laboratórios e descritos em publicações não eram do mesmo tipo celular nem tinham funções semelhantes ou capacidade de enxerto como as células neuronais DA da placa basal do mesencéfalo das presentes invenções, ver, Figs. 16 e 17 para exemplos. Assim, os inventores também descobriram que para as células passarem pela diferenciação direcionada no laboratório para produzirem populações celulares contendo grandes números de neurônios a funcionarem corretamente, as células precisavam passar pelas fases de desenvolvimento específico para se tornarem uma substituição adequada de populações celulares para terapias de substituição à base de células. Os inventores também descobriram que, pelo menos para obterem os neurônios DA enxertáveis das presentes invenções, certas fases do desenvolvimento precisam estar presentes, tais como os intermediários de FOX2A/LIM1A+ Dia 11. Se tais fases de desenvolvimento não estiverem presentes, os inventores descobriram que os neurônios resultantes semelhantes a DA não possuem as mesmas capacidades funcionais que os neurônios DA do mesencéfalo das presentes invenções que derivaram dos intermediários de FOX2A/LIM1A+ Dia 11.
[159] Em contraste com as observações anteriores, descrevem-se aqui as inovadoras técnicas de cultura relacionadas com estratégias baseadas na indução de células da placa basal para a derivação de neurônios DA humanos que conseguem enxertos eficientes in vivo. Assim, os insucessos passados para obter populações celulares compreendendo principalmente neurônios DA afetados, das presentes invenções (isto é, neurônios DA FOXA2+ and LMX1A + capazes de enxertia eficiente) foram considerados como sendo a razão do insucesso dos enxertos dos neurônios semelhantes a DA, ou seja, devido a uma especificação incompleta de células semelhantes a DA. As hipóteses anteriores foram que o insucesso do transplante se devia à vulnerabilidade específica das células, ou seja, neurônios de cultura, semelhante a DA não conseguiram sobreviver ao stress do transplante. Como se descreveu aqui, os precursores da placa basal do mesencéfalo FOXA2+/LMX1A+ eram derivados de hPSCs em 11 dias após a exposição a ativadores de pequenas moléculas Sonic Hedgehog (SHH) e sinalização canónica WNT. Estas células de dia 11, de duplamente positivas para FOXA2+ e LMX1A +, são postas em contato com pequenas moléculas adicionais para induzir mais diferenciação em neurônios DA enxertáveis do mesencéfalo, positivos para TH+ FOXA2+ e LMX1A +, pelo dia 25. Estes neurônios DA do mesencéfalo, maduros, da placa basal, podem ser mantidos in vitro durante vários meses. Os dados extensivos in vitro, o perfil molecular, bioquímico e dados eletrofisiológicos definiram a evolução do desenvolvimento e confirmaram a identidade de neurônios DA do mesencéfalo, derivados de hPSC. A sobrevivência in vivo e a função foram demonstradas em modelos de animais PD em três espécies hospedeiras. O enxerto a longo prazo em ratinhos e ratos com lesões 6-OHDA demonstra a sobrevivência robusta de neurônios DA do mesencéfalo, restauração completa do comportamento da rotação induzida por anfetamina e melhorias em testes da utilização das patas anteriores e acinesia. Finalmente, a escalabilidade é demonstrada pelo transplante em macacos parkinsonianos. A excelente sobrevivência do neurônio DA, a função e falta de crescimento excessivo neural nos três modelos animais testados mostraram-se promissores para o desenvolvimento de terapias com base celular em PD baseadas em composições e métodos das presentes invenções.
[160] Portanto, os inventores consideram a utilização principal das suas descobertas como a capacidade para produzir um fornecimento ilimitado de neurônios DA do mesencéfalo, totalmente funcionais derivados da placa basal, adequados para aplicações terapêuticas clínicas e pré-clínicas. Especificamente, os inventores descobriram um novo protocolo para a diferenciação eficiente de neurônios mDA de, pelo menos, populações de células pluripotentes isoladas de roedores e humanos (célula estaminal humana embriónica (hESC) e células estaminais humanas pluripotentes (hiPSCs)). Estes estudos incluíram linhagens celulares PINK1 mutantes iPS derivados de um doente humano a sofrer de uma forma genética da doença de Parkinson. Seibler, et al., The Journal of Neuroscience, 2011, 31(16):5970-5976, aqui incorporados por referência. As populações de células estaminais humanas (hESC ou hiPSC) diferenciaram-se em um fenótipo do mesencéfalo, que após o contato com moléculas de maturação neuronal deu origem a mais neurônios enxertáveis, autênticos. Este protocolo foi usado para demonstrar grande produção de progenia hESC pelo dia 11, de diferenciação direta no fenótipo neuronal de um mesencéfalo DA (mDA) que incluíram expressão dos fatores chave de transcrição, por exemplo, TH, FoxA2 e LMX1A que após mais diferenciação produziu proteínas adicionais, por exemplo, TH, transplante destes neurônios mDA derivados de hESC, em roedores imunocomprometidos e hospedeiros primatas, diferente dos anteriores derivados de neurônios DA in vitro, demonstraram-se bons na sobrevivência in vivo de células enxertadas com a restauração funcional de défices de comportamento.
[161] As vantagens de usar métodos das presentes invenções para produzir células neuronais DA, sobre outros métodos são, em parte, evidentes das seguintes informações. A utilização de células estaminais somáticas em outros métodos com o objetivo de gerar autênticos neurônios DA do mesencéfalo cujos enxertos eficientes, in vivo não tiveram sucesso (para revisão, ver Kriks & Studer, Protocols for generating ES cell-derived dopamine neurons in Development and engineering of dopamine neurons (eds. Pasterkamp, et al.) (Landes Biosciences, 2008, aqui incorporados por referência). As células estaminais pluripotentes como as células ES foram então usadas para gerar células enxertáveis. Os estudos iniciais, nos anos 90, usando células de ratinho ES, demonstraram a viabilidade de derivarem linhagens específicas de células pluripotentes in vitro incluindo neurônios (Okabe, et al., Mech. Dev. 59:89-102 (1996); Bain, et al., Dev. Biol. 168v342-357 (1995), todos os quais estão aqui incorporados por referência). De facto, os neurônios DA do mesencéfalo foram gerados usando uma estratégia direcionada de diferenciação (Lee, et al., Nat. Biotechnol. 18v675-679 (2000), aqui incorporados por referência) baseados nas perspectivas internas de desenvolvimento de estudos precoces de explantes (Ye, et al., Cell 93:755-766 (1998), aqui incorporados por referência). Foram usadas outras estratégias de diferenciação para produzir outros tipos de neurônios tais como neurônios motores (Wichterle, et al., Cell 110, 385397 (2002), aqui incorporados por referência). No entanto, estes esforços não resultaram em populações de células contendo grandes percentagem de neurônios DA do mesencéfalo ou células capazes de restaurar a função neuronal in vivo. De facto, a população resultante contendo uma mistura de tipos de células, além dos neurônios DA do mesencéfalo. Mesmo os inventores desenvolveram outros métodos de obter neurônios DA do mesencéfalo, em parte, ver abaixo, contudo estas populações celulares foram também misturas de tipos de células e não conseguiram restaurar a função neuronal. Em particular, as células humanas ES foram diferenciadas em células neuroepiteliais precoces, designadas rosetas neurais, seguidas pela indução de fase de células roseta em células expressando o precursor do neurônio DA de mesencéfalo e mercadores diferenciados. Estas células continuaram a demonstrar características neuronais funcionais por eletrofisiologia, in vitro, libertação DA e a formação dos contatos sinápticos positivos de imunogold TH (Perrier, et al. From the Cover: Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12543-8 (2004), aqui incorporados por referência). No entanto, apesar destes dados promissores in vitro, o transplante das células em hospedeiros de murino lesionados em 60HDA, resultou em um número muito pequeno de neurônios dopaminérgicos de sobrevivência. Este foi um resultado negativo surpreendente, dando forte evidência de funcionalidade in vivo de ratinho ES derivados de neurônios DA (Barberi, et al., Nat. Biotechnol. 21:1200-1207 (2003); Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008); Bjorklund, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A. 99:2344-2349 (2002); Kim, et al. Nature 418:50-56 (2002), sendo todos aqui incorporados por referência), robustos em características funcionais in vitro de neurônios derivados DA, humanos ES (Perrier, et al., From the Cover: Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 101:12543-8 (2004), aqui incorporados por referência) e evidência clara que os neurônios DA fetais humanos podem sobreviver como xenotransplantes do corpo estriado (Brundin, et al. Exp. Cérebro Res. 70:192-208 (1988); Bjorklund, et al., Neuronal replacement by intracerebral neural implants in animal models of neurodegenerative disease. Raven. Press., New. York. 455-492 (1988), sendo todos aqui incorporados por referência). Durante quase 8 anos, após falharem as tentativas iniciais de enxertar células humanas ES, em neurônios derivados de DA, houve muito pouca evolução em campo. Observaram-se algumas melhorias limitadas usando fontes estaminais de células estaminais pluripotentes de primatas (Sanchez-Pernaute, et al. Long-term survival of dopamine neurons derived from parthenogenetic primate embryonic stem cells (Cynol) in rat and primate striatum. Células estaminais 23:914-922 (2005), aqui incorporados por referência), células pré-tratadas com FGF20 ou Wnt5A ou células humanas ES diferenciadas na presença de fatores secretados de astrócitos imortalizados de mesencéfalo (Roy, et al., Nature Med. 12:1259-1268 (2006), aqui incorporados por referência). Mas, nenhuma das estratégias anteriores tiveram sucesso na produção de uma população enriquecida de neurônios DA das presentes invenções para utilização, nos procedimentos de transplante para restaurar a função neuronal, in vivo.
[162] Métodos de cultura de células para induzir as células (linhagem) de precursores neuronais: Contactando células estaminais humanas pluripotentes com SB431542 e LDN-193189 resultou em células de linhagem neural diferenciada.• exemplo seguinte descreve métodos exemplares para proporcionar células de uma linhagem neural para utilização durante o desenvolvimento das presentes invenções.
[163] A inibição SMAD dupla foi usada anteriormente como um método rápido e altamente eficaz para induzir um tipo de células de linhagem neural para hPSCs (Chambers, et al., Nat Biotechnol 27, (2009), aqui incorporados por referência). Estas células de linhagem neural induzidas por moléculas, incluindo Noggin, tinham uma via definida que permitia o desenvolvimento em células do sistema nervoso central, isto é, o destino da célula neural. Os estudos de acompanhamento referiram a utilização de uma pequena molécula de dorsomorfina (DM) em vez de Noggin que, pelo menos, em parte, resultaram em similares, mas não as mesmas células diferenciadas com diferenças principais na consistência de culturas (Kim, et al., Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS células regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem cell Rev 6, 270-281, (2010); Zhou, et al., High-Efficiency Induction of Neural Conversion in hESCs and hiPSCs with a Single Chemical Inhibitor of TGF-beta Superfamily Receptors. Stem Cells, 504, (2010), aqui incorporados por referência).
[164] Os inventores observaram que as células geradas usando Noggin, apesar de mostrarem a mesma fase de desenvolvimento como as células tratadas a LDN, expressaram a grande maioridade dos mesmos marcadores, e são capazes de um potencial desenvolvimento semelhante para fazer várias linhagens neurais, mas também mostraram diferenças, tais como sendo mais anterior em um eixo anterior - posterior (ou seja, prosencéfalo, mais células expressam FOXG1, e semelhantes) comparado a células neurais induzidas usando LDN. Portanto, embora LDN tivesse sido usado em vez de Noggin para inibir BMP entre outras vias de sinalização, Noggin e LDN podem ter outros tipos de atividade que são diferentes da inibição de BMP.
[165] Em parte, devido ao custo elevado de usar Noggin, os inventores consideraram que a utilização de um inibidor BMP pode conseguir substituir Noggin em diferenciar células de destino de célula neural. Portanto, uma pequena molécula do inibidor BMP, LDN-193189, (Yu, et al., Nat Med 14, 1363-1369, (2008), aqui incorporados por referência) foi usada e encontrada durante o desenvolvimento das invenções atuais para substituir Noggin, em combinação com SB431542, para gerar a neuroectoderma primitiva de hPSCs, as células que possuem destino celular neural, ou seja, células do SNC (Figura 2A). Este tratamento de combinação foi designado LSB para a combinação destes dois inibidores LDN-193189 e SB431542.
[166] Em geral, a diferenciação celular foi iniciada pelo tratamento de alta confluência de monocamadas hES ou hiPS com inibição dupla de sinalização SMAD. Um embodiment preferido utiliza uma percentagem de confluência de 50%- 100%, mas o mais preferido embodiment usa uma confluência de 70%-80%. Será óbvio para alguém com competência na arte que a densidade inicial da placa, necessária para conseguir uma confluência preferida da invenção presente será dependente do tipo de célula, tamanho, eficiência da placa, sobrevivência, adesão e outros parâmetros que podem ser determinados empiricamente sem a devida experimentação da parte do artesão competente. A inibição dupla de SMAD pode ser conseguida com uma variedade de componentes incluindo Noggin, SB431542, LDN-193189, Dorsomorphin, ou outras moléculas que bloqueiam TGFJ3, BMP, e sinalização Activin/Nodal. Um embodiment preferido, utiliza a composição compreendendo SB431542 e LDN-193189 (coletivamente, LSB) a uma concentração de 0,1|j,M-250(j,M, ou preferivelmente l-25|aM, ou mais preferível 10 μM of SB431542 e 10-5000nM, ou mais preferivelmente 100-500nM de LDN- 193189. II. Derivação de neurônios DA de hESCs através de intermediários de células roseta e resultados de estudos de transplante que usaram estes neurônios semelhantes a DA.
[167] Antes os inventores usaram vários outros métodos de diferenciação direcionada que resultaram em populações celulares contendo neurônios semelhantes a DA. Estes neurônios semelhantes a DA foram usados em estudos de transplante que resultaram em preocupações sobre outras utilizações destas células para aplicações terapêuticas. Por exemplo, os procedimentos descritos em Perrier et al., 2004 and Fasano et al., 2010, incluindo a indução neural MS5, resultou na formação de células roseta e foram usadas para obter os precursores do Dia 11, ver Figs. 2, 16 e 17 para exemplo, que foram usados para derivar os neurônios semelhantes ao DA. Estes neurônios resultaram de uma baixa percentagem de células precursoras nas populações de células resultantes do Dia 11. Os estudos de transplante que usaram estes neurônios, demonstraram uma viabilidade fraca pós-transplante e perda do fenótipo neuronal semelhante a DA além das observações de desenvolvimento pós-transplante de tipos neurais inapropriados junto a perda do controlo de crescimento, que levou ao desenvolvimento de teratomas. Ver Figs. 16 e 17.
[168] Especificamente, em P0 hESCs foram postas em contato com moléculas para indução de início neural de células Oct4+ em células roseta usando alimentador de células MS5 (Perrier et al., 2004). Na fase PI, as células roseta foram expandidas por células de contato com moléculas adicionais para diferenciação de células com moléculas adicionais para a diferenciação de células em células na fase P2 com padrões de expressão específica incluindo células progenitoras Pax2+/Enl+ DA e foram ainda diferenciadas em neurônios DA TH+/Enl+. Estas células foram usadas para enxertos em ratos lesionados de 60HDA, imunosuprimidos com ciclosporina A. Estes estudos de transplante demonstraram uma viabilidade fraca in vivo, perda do fenótipo TH+, preocupações sobre mais crescimento em células não desejadas, possivelmente letais, células, ou seja, teratomas e crescimento de células em tipos neurais inadequados que causariam problemas médicos adicionais para o doente.
[169] Houve números muito pequenos de neurônios de sobrevivência TH+ a 4,5 meses após transplante (<50 TH+ células / animal) em enxertos da roseta derivados dos precursores Figl6A do neurônio DA. Mas, em contraste com células TH+, as células marcadas GFP (GFP foi direcionada por um promotor ubíquo) sobreviveu bastante bem após o transplante. Isto sugere que a maioria das células sobreviventes após o transplante foram células neurais de identidade neuronal não- DA (16B). Poucas células derivadas de enxertos (hNA+ (verde) co-expressão TH (vermelho) sugeriram mais uma vez que a maioria das células humanas enxertadas adotam um fenótipo de neurônio não-DA Figl6C. Os painéis 16 D-E mostram que D-E, apesar de uma sobrevivência muito baixa in vivo houve alguma melhoria (baixa e altamente variável) em alguns ensaios de comportamento tal como as rotações induzidas por anfetamina (D), teste de cilindro e rotações espontâneas (E). indução neural sem alimentador foi realizada como se descreveu anteriormente (Chambers et al., 2009, aqui incorporados por referência) mas modificada posteriormente para produzir células da placa basal (Fasano et al., 2010, aqui incorporados por referência).
[170] No método de inibição duplo SMAD para a diferenciação de células pluripotentes em células da placa basal, os inventores tinham descoberto anteriormente que eram necessárias altas concentrações de SHH para a indução de FP pelo dia 11. Por exemplo, em alguns embodiments, Sonic C25II foi adicionada a 200 ng/ml. Em algumas experiências, DKK-1 (R&D; 100 ng/ml) FGF8 (R&D; 50 ng/ml), Wnt-1 (Peprotech; 50 ng/ml) e ácido retinoico (R&D; 1 mM) foram adicionados, Ver Figura 17. No entanto, nenhuma das populações de células resultantes no dia 11, que usaram métodos anteriores, continham alta percentagem de células progenitoras de placa neural do mesencéfalo FOXA2+/LMX1A+ usando métodos das presentes invenções. III. Compostos para utilização em diferenciação direcionada: triagem de pequenas moléculas usando células de linhagem neuronal das presentes invenções resultaram em compostos que se diferenciaram em células FOX2A+ e LIMX1A+ neuronais, pelo dia 11 de cultura.• seguinte exemplo descreve, usando células exemplares da Secção I para a triagem de compostos candidatos de células pequenas e determinar se a sua utilização resultaria na diferenciação direta de uma população de células contendo uma percentagem elevada de neurônios da placa basal do mesencéfalo, pelo 11° dia após o contato inicial com os inibidores Dual-SMAD. Os resultados desta triagem mostraram inicialmente que uma molécula de ativação SHH, com ativação de FGF8 e Wnt levou a uma derivação eficiente das células FOXA2+/LMX1A+ positivas da placa basal do mesencéfalo de hESC pelo 11°. Dia de diferenciação. Os inventores mostraram resultados de experiências exemplares que definiram quais as moléculas que foram necessárias e o tempo ótimo de contato, para derivar a população desejada de células FOXA2+/LMX1A+ positivas no 11°. dia.
[171] Estudos genéticos recentes em ratinho demonstraram um papel importante para o fator de transcrição FOXA2 no desenvolvimento e sobrevivência dos neurônios DA do mesencéfalo. Uma característica exclusiva do desenvolvimento do mesencéfalo é a co-expressão do marcador FOXA2 da placa basal e do marcador LMX1 A do teto da placa neural. Normalmente, as células do e do teto da placa neural localizam-se em posições distintas no SNC (ventral versus dorsal) com requisitos padrão diametricamente opostos para a sua indução. A derivação dos precursores da placa basal, específicos da região, de hESCs usando um protocolo de inibição duplo-SMAD modificado, foi descrito recentemente. A sinalização canónica Wnt foi importante para a função do teto da placa e do desenvolvimento do neurônio DA do mesencéfalo.A. CHIR99021 (CHIR) induziu uma produção elevada de destino de precursor de neurônio DA de mesencéfalo, pelo Dia 11 da cultura. Como se descreve aqui, a exposição a CHIR99021 (CHIR), um potente GSK3 (3 inibidor que se sabe ativar fortemente a sinalização WNT, induziu LMX1A em precursores FOXA2+ da placa basal (Figura la). CHIR foi mais potente que o Wnt3A ou Wntl recombinantes ao induzir a expressão LMX1A. A eficiência da indução LMX1A dependeu do momento da exposição CHIR com um efeito máximo no dia 3-11 (Figura 5). CHIR induziu a co-expressão de FOXA2/LMX1 A, enquanto outros fatores como FGF8 tiveram apenas efeitos marginais (Figura 6). A indução da co- expressão de FOXA2/LMX1A exigiu uma ativação forte da sinalização SHH usando purmorfamina, uma pequena molécula agonista, sozinha ou em combinação com SHH recombinante (Figura 7).• tratamento com agonistas SHH (purmorfamina + SHH) e FGF8 (S/F8) na ausência de CHIR99021 demonstrou uma expressão significativamente inferior de FOXA2 no dia 11 e ausência total de expressão de LMX1A (Figura la,b). A inibição Dual-SMAD (exposição a LDN-193189 + SB431542 = "LSB") não produziu células com expressão FOXA2, mas produziu um subconjunto de células LMX1A+ (Figura la,b). O marcador anterior OTX2 foi induzido, de forma robusta, em culturas tratadas LSB e LSB/S/F8/CHIR, mas não em condições LSB/S/F8 (Figura la,c). As comparações sistemáticas de três condições de culturas (Figure Id) foram feitas usando um perfil de expressão de gene global e temporal. Os nichos hierárquicos de genes expressos diferencialmente, segregaram as três condições de tratamento pelo dia 11 de diferenciação (Figura 8a). FOXA1, FOXA2 e vários outros alvos descendentes SHH, incluindo PTCH1, encontravam-se entre as transcrições mais diferencialmente reguladas em LSB/S/F8/CHIR versus os conjuntos de tratamento LSB (Figura le). A expressão de LMX1A, NGN2, e DDC indicaram o estabelecimento do destino do precursor do neurônio DA do mesencéfalo já pelo dia 11 (Figura le,f). Em contraste, as culturas LSB foram enriquecidas pelos marcadores dos precursores do prosencéfalo dorsal como HES5, PAX6, LHX2, e EMX2. A comparação direta do tratamento LSB/S/F8/CHIR versus o tratamento LSB/S/F8 (Figure It) confirmaram o enriquecimento seletivo para os marcadores do precursor DA do mesencéfalo no grupo LSB/S/F8/CHIR e sugeriram uma identidade hipotalâmica do precursor em culturas tratadas a LSB/S/F8 com base na expressão diferencial de RAX 1, SIX3, e SIX6 (ver também, a expressão POMC, OTP na Figura 2d abaixo). A lista completa de transcrições expressas diferencialmente dos Quadros 1, 2 e a análise da ontologia genética da Figura 8b (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov) confirmaram o enriquecimento para a sinalização canónica WNT mediante o tratamento CHIR. Os dados em bruto ainda não estão disponíveis acedendo a GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ accession#: [TBD]). A análise comparativa e temporal da expressão genética dos marcadores do precursor DA do mesencéfalo (Figura lg) versus os marcadores dos destinos dos neurônios anterior e ventral não-DA (Figure lh) dividiram as três condições de indução em: i) LSB: prosencéfalo dorsal; ii) LSB/S/F8: ventral / hipotalâmico e iii) LSB/S/F8/CHIR: identidade do precursor DA do mesencéfalo.
[172] As células resultantes do protocolo derivado durante o desenvolvimento destas invenções foram comparadas a células derivadas de métodos anteriores. Ver, Figs. 2 e 18 para uma comparação visual exemplar para as células tratadas SHH/FGF8+CHIR das presentes invenções. A Figura 19A mostra exemplos de células de marcação dupla F0XA2/Tujl após o tratamento LSB/S/F8/CHIR (painéis superiores) e F0XA2 co-marcação com TH, Nurrl e LMX1A (painéis inferiores). Estas combinações de marcadores são diagnósticos para a fase inicial dos precursores dos neurônios DA do mesencéfalo. A Figura 19 B mostra os dados de expressão genética (para comparação para a Figura 2E) para marcadores chave do precursor de neurônio dopaminérgico.
[173] Em geral, os Materiais e Métodos Usados aqui são descritos: ESC Humanos (H9, HI) e linhagens iPSC (2C6 and SeV6) foram submetidas a uma inibição modificada Dual SMAD (Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), aqui incorporados por referência) baseado no protocolo da indução da placa basal (Fasano, et al., Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), aqui incorporados por referência). A exposição a SHH C25II, Purmorfamina, FGF8 e CHIR99021 foram otimizadas para a placa basal do mesencéfalo e produção de novas populações de neurônios DA (ver Figura Id). Após a indução da placa basal, foi realizada mais maturação (dias 11- 25 ou mais do que 25 dias em cultura e até 100 dias de cultura) em meio de diferenciação baseado em Neurobasal/B27 na presença da sobrevivência do neurônio DA e fatores de maturação (Perrier, et al. Proe Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), aqui incorporados por referência) tais como AA, BDNF, GDNF, TGF(33 e dbcAMP (ver os métodos completos para mais informações). As populações resultantes de neurônios DA foram sujeitas a uma caracterização fenotípica extensa, via imunocitoquímica, qRT-PCR, perfil de expressão genética global, análise HPLC para a detecção de dopamina e registos eletrofisiológicos in vitro. Os estudos in vivo foram realizados em roedores hemiparkinsonianianos (ratinhos ou ratos injetados com toxina 60HDA, de um lado do cérebro do animal. Os estudos foram feitos em ratinhos adultos NOD-SCID IL2Rgc (laboratórios Jackson) e ratos adultos Sprague Dawley em Taconic Farms, que receberam injeções estereostáticas em lesões 6-hidroxidopamina da toxina, como se descreveu anteriormente, assim como em dois macacos Rhesus adultos que foram tratados com injeções de MPTP, unilaterais na carótida.
[174] Neurônios DA foram injetados estereostaticamente no corpo estriado dos animais (150 x 103 células em ratinhos, 250 x 103 células em ratos) e um total de 7,5 x 106 células (distribuídos em 6 tratos; 3 em cada lado do cérebro) em macacos. Foram realizados ensaios de comportamento em intervalos mensais, pós-enxertos, incluindo análise rotacional mediada por anfetamina assim como um teste para acinesia focal ("teste de degrau") e utilização de membros (teste do cilindro). Os ratos e os ratinhos foram sacrificados nas semanas 18-20 e os primatas 1 mês depois dos enxertos. A caracterização dos enxertos foi realizada através de análises estereológicas do número de células volumes de enxertos, assim como uma caracterização fenotípica completa, via imunocitoquímica.
[175] A cultura de células humanas ES indiferenciadas, linhagens H9 hESC (WA-09, XX, passagens 27-55 de onde 10/2009), HI (WA-01, XY, passagens 30-40 das quais 6/2010) e linhagens celulares iPS 2C6 (Kim, et al. Cell stem cell 8:695706 (2011), aqui incorporados por referência) (XY, passagens 20-30) e SeV6 (XY, passagens 20-30; derivados de fibroblastos embriónicos MRC-5 usando sistema de vetor não integrado Sendai fator 4 (Ban, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A (2011) 108(34):14234-14239:10.1073/pnas.l 103509108, aqui incorporados por referência) foram mantidos nos fibroblastos embriónicos do ratinho na placa as estimativas de concentrações variaram de 0,5 x103 por cm2 para 100x103 por cm2 com base em células humanas ES que tendem a formar nichos de células. (MEF, Global Stem, Rockville, MD) é um ótimo soro sedativo de substituição a 20% (KSR, Invitrogen, Carlsbad, California)- contendo meio de células ES humanas (como se descreveu anteriormente (Kim, et al. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), aqui incorporados por referência). A utilização de soro sedativo de substituição pode variar de 0% a 40%. Indução Neural. Para a indução do neurônio dopaminérgico da placa basal, uma versão modificada da inibição dual-SMAD (Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), aqui incorporados por referência) e protocolo da indução da placa basal (Fasano, et al. Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), aqui incorporados por referência) foi usada baseada no exposição cronometrada a LDN- 193189 (lOOnM (variando em concentração de 0.5-50 μM, Stemgent, Cambridge, Massachusetts), SB431542 (10 μM (variando em concentração de 0.5-50 μM, Tocris, Ellisville, MI), SHH C25II (lOOng/ml (variando em concentração de 10-2000 ng/ml„ R&D, Minneapolis, MN), Purmorphamine (2p,M (variando em concentração de 10-500 ng/ml, Stemgent), FGF8 (100 ng/ml (variando em concentração de 10500 ng/ml, R&D) e CHIR99021 (CHIR; 3(xM (variando em concentração de 0.1-10 \μM, Stemgent).
[176] Para o tratamento do protocolo de indução da placa basal "SHH" refere- se à exposição, ou seja, o contato de células de uma combinação de SHH C25II lOOng/ml + Purmorfamina (2μM). As células foram revestidas (35-40 x 103 células/cm2) e estiveram em cultura durante 11 dias em matrigel ou geltrex (usado como se comprou) (BD, Franklin Lakes, Nova Jersey) em meio sorológico sedativo de substituição (KSR) contendo DMEM, 15% soro sedativo de substituição, 2 mM L- glutamina e 10-AM (variando em concentração de 1 - 25 μM β-mercaptoetanol. O meio KSR foi gradualmente alterado para meio N2 a começar no 5°. dia de diferenciação, ao misturar em rácios de 75%(KSR):25%(N2) nos dias 5-6, 50% (KSR):50%(N2) nos dias 7-8 e 25% (KSR):75% (N2) nos dias 9-10, como se descreveu anteriormente (Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), aqui incorporados por referência). No dia 11, o meio foi alterado para meio neurobasal/meio B27 (diluição 1:50)/L-Glut (intervalos efetivos 0,2- 2 mM)) contendo meio (NB/B27; Invitrogen) complementado com CHIR (até ao 13° dia) e com BDNF (fator neutrófico derivado do cérebro, 20ng/ml variando de 5 a 100; P&D), ácido ascórbico (AA; 0.2mM (variando em concentração de 0.01- ImM), Sigma, St Louis, MI), GDNF (fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais, 20ng/ml (variando em concentração de 1-200 ng/ml); P&D), TGF(33 (tipo de fator de transformação de crescimento (33, lng/ml (variando em concentração de 0.1 - 25 ng/ml); P&D), dibutirilo cAMP (0.5mM (variando em concentração de 0,052 mM); Sigma), e DAPT (lOnM (variando em concentração de 0,5-50 nM); Tocris,) durante 9 dias. No dia 20, as células foram dissociadas usando Accutase® (Tecnologia Celular Inovadora, San Diego, Califórnia) e revestidas em condições de densidade celular elevada (por exemplo de 300-400k células/cm2) em placas pré-revestidas com poliornitina (PO); 15jj,g/ml (variando em concentração de 1 - 50 ug/ml)/ Laminin (1 jig/ml) (variando em concentração de 0,1-10 |ig/ml)/Fibronectin (2jj,g/ml (variando em concentração de 0.1-20 jJ.g/ml) em meio de diferenciação (NB/B27 + BDNF, AA, GDNF, dbcAMP (variando em concentração como aqui se descreve), TGF(33 e DAPT (variando em concentração como aqui se descreve) até à fase desejada de maturação para uma dada experiência.
[177] Para a indução de neurônios DA, com base em roseta, seguiram-se parcialmente os protocolos previamente descritos (Perrier, et al. ProcNatl Acad Sci U S A 101:12543-8 (2004), incorporado aqui como referência) com, pelo menos, uma exceção onde a inibição dupla-SMAD foi usada para acelerar a fase inicial de indução neural. Em breve, hESCs foram induzidos para o destino neural por cocultura com células irradiadas MS5 em meio complementado KSR com SB431542 e Noggin (250ng/ml (variando em concentração de 10-1000 ng/ml); R&D), entre os dias 2-8 e SHH+FGF8 entre o dia 6-11 de diferenciação. Após 11 dias em KSR, as rosetas neurais foram isoladas manualmente e em cultura (fase PI) em meio N2 complementado com SHH, FGF8, BDNF e AA como descrito anteriormente (Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci U SA 101:12543-8 (2004), aqui incorporados por referência). Após 5-7 dias em fase PI, as rosetas foram mais uma vez colhidas mecanicamente e trituradas após incubação em solução salina equilibrada de Hanks, isenta de Ca2/Mg2 (HBSS) durante 1 hora e revestidas em placas revestidas de poliomitina(PO)/Laminina/Fibronectina. O padrão com SHH/FGF8 continuou durante 7 dias na fase P2, seguida pela diferenciação final na presença de BDNF, AA, GDNF, TGFb3 e dbcAMP como se descreve acima até à fase desejada de maturação para uma dada experiência (tipicamente 5-7 dias para estudos de transplante ou 32 dias para estudos funcionais in vitro).
[178] Análises de expressão genética. O RNA Total foi extraído durante a diferenciação nos dias: 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 25 de cada condição de controlo LSB, LSB/SHH/FGF8 e LSB/SHH/FGF8/CHIR usando o kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). Para análise de microarranjo, o RNA total foi processado pelo centro nuclear genômico MSKCC e hibridizado em arranjos de contas ref-12 de Illumina Humana de acordo com as especificações do fabricante. Foram feitas comparações, entre os dias e as condições usando a embalagem LIMMA de Biocondutor (worldwideweb.bioconductor.org). Achou-se que os genes tinham um valor P ajustado < 0,05 e uma alteração de dimensão superior a dois eram considerados significativos. Algumas das análises descritivas de dados de microarranjo e a apresentação foi realizada usando uma aplicação informática comercialmente disponível (Partek Genomics Suite (versão 6.10.0915)). Para análises qRT-PCR, o RNA total no dia 25 de cada condição foi transcrita em reverso (Quantitech, Qiagen) e o material amplificado foi detectado usando os ensaios de expressão genética disponíveis Taqman (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) com os dados normalizados para HPRT. Cada ponto de dados representa 9 réplicas técnicas de 3 amostras biológicas independentes. Os dados brutos dos estudos de microarranjo ainda não estão disponíveis em GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
[179] Cirurgia Animal. Realizaram-se procedimentos cirúrgicos em roedores e macacos conforme as diretrizes NIH, e foram aprovados pela Comissão de Utilização e Cuidados Animais Institucionais (IACUC) locais, a Comissão de Biosegurança Institucional (IBC) assim como a Comissão de Pesquisa de Células Estaminais Embriónicas (ESCRO).
[180] Ratinhos. Ratinhos anulados NOD-SCID IL2Rgc (20-35 g de peso; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram anestesiados com Cetamina (90mg/kg; Akorn, Decatur, IL) e Xilazina (4mg/kg Fort Dodge, LA). Injetou-se, estereostaticamente, 6-hidroxidopamina (1 Oug (variando em concentração de 1- 20ug) 6-OHDA (Sigma-Aldrich) no corpo estriado nas coordenadas seguintes (em milímetros): AP, 0,5 (de bregma; uma sutura craniana usada como referência para cirurgia estereostática); ML, -2.0; DV, -3.0 (a partir da duramáter, uma membrana que cobre o cérebro é usada para referência). Os ratinhos com lesões de sucesso (uma média de > 6 rotações / minutos) foram selecionados para transplante. Injetou-se um total de 150 x 103 células em um volume de 1,5jil no corpo estriado, nas coordenadas seguintes (em mm): AP, 0,5; ML, - 1,8; DV, 3,2. Os ratinhos foram sacrificados 18 semanas após o transplante. Ratos. Ratos adultos fêmeas Sprague- Dawley (Taconic, Hudson, NY) (180-230g) foram anestesiados com cetamina (90mg/kg) e xilazina (4mg/kg) durante os procedimentos cirúrgicos. As lesões unilaterais, do feixe do prosencéfalo mediano da via negro-estriatal foram estabelecidas por injeção estereostática de 6-OHDA (3,6 mg/ml em 0,2% de ácido ascórbico e 0,9% solução salina, Sigma) em dois locais (Studer, et al. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), aqui incorporados por referência). Os ratos foram selecionados para transplante se a rotação induzida por anfetaminas excedesse as 6 rotações/min pelas 6-8 semanas após a injeção. 250 x 103 células foram transplantadas para o corpo estriado de cada animal (Coordenadas: AP +1,0mm, ML - 2,5mm e V-4,7mm; barra de dentes definida em -2.5). Os ratos de controlo receberam PBS em vez disso. Os procedimentos cirúrgicos foram descritos anteriormente (Studer, et al. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), aqui incorporados por referência). As injeções intraperitoneais, diárias, de ciclosporina 15 mg/kg (Bedford Labs, Bedford, OH) foram iniciadas 24 horas antes dos enxertos de células e continuaram até ao sacrifício, 20 semanas depois do enxerto de células. Primatas. Dois macacos Rhesus adultos (17-18 anos; 10-12 kg; fêmea) tornaram-se hemiparkinsonianos pela administração de MPTP, via carótida, seguida pela administração de MPTP, semanalmente para criar uma síndrome parkinsoniana bilateral (Kordower, et al. Science 290:767-773 (2000), aqui incorporados por referência). Ambos os animais manifestaram sintomas parkinsonianos consistentes com uma lesão moderadamente grave baseada na análise de comportamento, incluindo a postura disforme, o arrastamento da perna e sintomas de rigidez (inflexibilidade de movimentos), negligência (reação motora a estímulo lateral) e bradicinesia (início lento de movimentos). Estes parâmetros podem ser avaliados em macacos usando uma escala de classificação clínica Parkinsoniana (CRS) modificada. No dia da cirurgia de transplante, os animais foram tranquilizados com cetamina (3,0 mg/kg, IM) e dexdomitor (0,02-0,04 mg/kg IM), intubados para manterem as vias aéreas estáveis e anestesiados com isoflurano. Foram depois colocados em um suporte estereostático para cirurgia. Ambos os macacos Rhesus foram submetidos a uma única cirurgia com três injeções intracranianas de culturas DA derivadas da placa basal humana, baseado em coordenadas estereostáticas (Paxinos, et al. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press, 2000), aqui incorporados por referência). As injeções bilaterais de células (lOul/injeção; 125.000 células/ul) realizaram-se em três locais (1-caudal posterior, 2- putamen pré- commissural e em sobreposição à substância branca) para um volume total de 30|il por hemisfério. Foi usada uma bomba de infusão ligada a um micromanipulador para distribuir as células a uma taxa de ljol/min através de uma seringa Hamilton 50pi com uma agulha de 28 G. Depois de acabar as injeções, a agulha foi deixada no local por mais 2-5 minutos para permitir que a infusão se difundisse da ponta da agulha antes de, lentamente, retrair a seringa. Imediatamente após a cirurgia, os animais receberam analgésicos (buprenex, 0,0lmg/kg IM, duas vezes por dia, durante 72 horas após a cirurgia; meloxicam, 0,1 mg/kg SQ, SID durante 72 horas após a cirurgia) assim como um antibiótico (cefazolina, 25 mg/kg IM, duas vezes por dia) até 72- horas após a cirurgia. Os animais receberam ciclosporina A (Neoral, Sandimmune) oralmente (30 mg/kg reduzindo para 15 mg/kg) uma vez por dia, a começar 48 horas antes da cirurgia e até ao sacrifício, um mês após o transplante.
[181] Ensaios de comportamento. As rotações induzidas pela anfetamina (ratinhos e ratos) e teste de degrau (rato) foram realizados antes do transplante e 4, 8, 12, 18 semanas após o transplante. O comportamento de rotação em ratinhos foi registados 10 min após injeção i.p. de d-anfetamina (10 mg/kg, Sigma) e gravado durante 30 minutos. O comportamento de rotação em ratos foi registado 40 min após injeção i.p. de d-anfetamina (5 mg/kg) e observado automaticamente pelo sistema TSE VideoMot2 (Alemanha). Os dados foram apresentados como o número médio de rotações por minuto. O teste de degraus foi modificado a partir de Blume, et al. Exp. Neurol. 219:208-211 (2009) e Crawley, et al. What's Wrong With My Ratinho: Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Ratinhos (Wiley-Liss, 2000), sendo todos aqui incorporados por referência. Em resumo, cada rato foi colocado em uma superfície plana; as patas posteriores foram levantadas ao segurar suavemente a cauda para permitir que apenas as patas da frente tocassem na mesa. O experimentador puxou o rato para trás, 1 metro, a um passo estável. Contaram-se os números de passos de ajustamento das patas da frente, tanto contralaterais como ipsilaterais. Os dados foram apresentados como uma percentagem dos passos de ajustamento contralaterais / (contralateral + ipsilateral). O teste de cilindro foi realizado ao colocar cada animal em um cilindro de vidro e contando o número de toques das patas ipsilaterais versus contralaterais (de cada 20 toques) para a parede do cilindro como descrito anteriormente (Tabar, etal. Nature Med. 14:379-381 (2008), aqui incorporados por referência). Descreve-se abaixo o processamento de tecidos para roedores e primatas.
[182] Ratinhos e ratos: os animais (ratinhos e ratos) receberam sobredoses de Pentobarbital intraperitonealmente (50 mg/kg) para induzir uma anestesia profunda e foram perfundidos com 4% de paraformaldeído (PFA). O cérebro foi extraído, depois fixado em 4% PFA depois imerso em soluções de sucrose a 30% durante 25 dias. Foram seccionados em crióstato após serem embebidos em composto O.C.T. (Sakura-Finetek, Torrance, Califórnia).
[183] Primatas: os animais foram sacrificados sob anestesia profunda com cetamina (10 mg/kg, Intramuscular (IM)) e pentobarbital (25 mg/kg, intravenoso (IV)) via perfusão cardíaca com solução salina a 0,9% heparinizada, seguida por fixador frio e fresco a 4% PFA (pH 7,4). Imediatamente após a fixação primária, os cérebros foram removidos do crânio e pós-fixados em 4% PFA, em flutuação livre, durante 24-36 horas. Foram depois lavados e voltados a suspender em sucrose a 10%, em um agitador lento a 4°C, e deixados "afundar". O processo foi depois repetido em sucrose a 20% seguido por sucrose a 30%. Todos os cérebros foram cortados coronariamente, em secções séricas de 40um, em um micrótomo congelado deslizante, e guardados em flutuação livre em meio criopreservativo a - 20° Celsius.
[184] Imunocitoquímica: as células foram fixas em PFA a 4% e bloqueadas com albumina sérica de bovino (BSA) a 1% com Triton a 0,3%. As secções de tecido cerebral foram lavadas em PBS frio e processadas de forma semelhantes. Os anticorpos principais foram diluídos em BSA 1-5% ou Soro Normal de Cabra e incubados de acordo com as recomendações do fabricante. Uma lista extensa de anticorpos e fontes é dada no Quadro 6. Para anticorpos adequados, secundários e conjugados de Alexa488, Alexa555 e Alexa647 (Molecular Probes, Carlsbad, California) foi usado o contramarcador nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Thermo Fisher, Rockford, Illinois). Para algumas análises usaram-se anticorpos secundários biotinilados, após visualização via DAB (3,3'-Diaminobenzidina) cromogénica. Análise HPLC. A fase reversa de HPLC com detecção eletroquímica para medição dos níveis de dopamina, ácido homovanilico (HVA) e DOPAC (3,4- ácido dihidroxi-fenilacético) foi realizada como se descreveu anteriormente (Roy, et al. Nature Med. 12:1259-1268 (2006); Studer, et al. Cérebro Res. Bull. 41:143-150 (1996), sendo todos aqui incorporados por referência). As amostras de cultura foram recolhidas em ácido perclórico no dia 65 da diferenciação. Em algumas experiências, DA foi medido diretamente no meio, usando o mesmo sistema de detecção mas seguindo a extração do alumínio de dopamina e dos seus metabólitos, usando um kit comercialmente disponível como descrito anteriormente (Studer, et al. Cérebro Res. Bull. 41:143-150 (1996), aqui incorporados por referência). Registos eletrofisiológicos: transferiram-se culturas para uma câmara de registo em um microscópio vertical equipado com uma objetiva imersa em água de 40X (Eclipse E600FN; Nikon); as culturas foram perfundidas com solução salina contendo em mM: 125 NaCl, 2.5 KC1, 25 NaHC03,1.25 NaH2P04, 2 CaCl, 1 MgCl2, e glucose a 25 (34 °C; saturado com 95% 02-5% CO2; pH 7.4; 298 mOsm/L). A taxa de fluxo de solução salina foi de 2-3 ml/min correndo através de um aquecedor em-linha (SH-27B com controlador TC-324B; Warner Instruments). Os neurônios foram visualizados por videomicroscopia com uma câmara digital arrefecida-CCD (CoolSNAP ES2, Photometries, Roper Scientific, Tucson, Arizona). As células selecionadas para registos eletrofisiológicos tinham formas semelhantes aos neurônios com ramificações finas de neurites. Os registos somáticos, de toda a célula, patch-clamp na configuração atual de clamp foram realizados em um amplificador MultiClamp 700B (Dispositivos Moleculares). Os sinais foram filtrados a 1-4 kHz e digitalizados a 5-20kHz com um Digidata 1440A (Dispositivos Moleculares). Fabricaram-se eletródos de registo de patch de vidro de borosilicato filamentado (Sutter Instruments) puxado em puxador Flaming-Brown (P-97, Sutter Instruments) e tinham resistências de 4-6 MQ no banho. Os elétrodos foram cheios com solução interna contendo em mM: 135 K-MeS04, 5 KC1, 5 HEPES, 0.25 EGTA, 10 fosfocroetina-di(tris), 2 ATP-Mg, e 0,5 GTP-Na (pH 7,3, osmolaridade ajustada a 290-300 mOsm/L). O circuito de amplificação de ponte foi ajustado para compensar a resistência do elétrodo e monitorizado. Foi compensada a capacitância do elétrodo. Quando a resistência de série aumentou >20% durante o registo, os dados foram eliminados dada a maior resistência a sugerir uma falha técnica parcial durante as gravações.
[185] Contagens celulares e análises estereológicas. As percentagens de células com marcadores positivos na placa basal (dia 11) Figura 1, precursor do neurônio dopaminérgico do mesencéfalo (dia 25), Figura 2 e fases maduras do neurônio DA (dia 50 ou mais tarde) Figura 3 e 11, foram determinadas em amostras derivadas de pelo menos 3 experiências independentes, cada. As imagens para a quantificação foram selecionadas de uma forma uniforme aleatória e cada imagem foi marcada primeiro para o número de núcleos positivos DAPI, seguido pela contagem do número de células que expressam um marcador de interesse. Os dados são apresentados como média ± SEM. A quantificação de células humanas (identificadas com anti-hNA) e neurônios TH+ dentro dos enxertos foi realizado em cada décima secção onde se identificaram enxertos. As contagens celulares e o volume dos enxertos foi determinado usando a sonda de fracionador e o calculador Cavalieri usando a aplicação informática Investigador Stereo (MBF bioscience, Vermont) como descrito anteriormente em Tabar, et al. Nat. Biotechnol. 23:601-606 (2005), aqui incorporados por referência. Os dados são apresentados como um cálculo do número total de células e volume total do enxerto +/- o erro do desvio padrão do meio (SEM).
[186] As formulações seguintes descrevem o meio de cultura celular exemplar para ser usado nos embodiments de desenvolvimento destas invenções.
[187] Meio de hESC para manutenção (1 litro): 800 mL DMEM/F12, 200 mL de soro sedativo de substituição, 5 mL de 200 mM L- Glutamina, 5 mL de 'Pen/Strep', 10 mL de 10 mM de solução de mínimo de 15 aminoácidos não- essenciais MEM, 55 uM de 13- mercaptoetanol, e bFGF (concentração final é final 4 ng/mL). Meio KSR para a diferenciação hESC (1 litro): 820 mL de sedativo DMEM, 150 mL de soro sedativo de substituição, 10 mL de 200 mM L-Glutamina, 10 mL de Pen/Strep, 10 mL de 10 mM MEM, e 55 |uM de 13- mercaptoetanol. • meio N2 para a diferenciação hESC (1 litro): 985 ml dist. H20 com pó DMEM/F12, 1.55 g de glicose (Sigma, cat. no. G7021), 2.00 g de bicarbonato de sódio (Sigma, cat. no. S5761), putrescina (100 uL alíquota de 1,61 g dissolvido em 100 mL de água destilada; Sigma, cat. no. P5780), progesterona (20 uL alíquota de 0,032g dissolvido em 100 mL 100% etanol; Sigma, cat. no. P8783), selenite de sódio (60 uL alíquota de 0.5 mM solução em água destilada; Bioshop Canada, cat. no. SEL888), e 100 mg de transferrina (Celliance/Millipore, cat. no. 4452-01), e 25 mg de insulina (Sigma, cat. no. 16634) em 10 mL de 5 mM NaOH.• Meio de Modificação Eagles da Dulbecco (DMEM), com 10% FBS para preparar PMEF (células principais de alimentação do embriofibroblasto de ratinho (PMEF)) (1 litro): 885 mL de DMEM, 100 mL de FBS, 10 mL de Pen/Strep, e 5 mL de L-Glutamina. Meio Essencial Mínimo Alfa (MEM) com 10% FBS para preparar o alimentador de meio celular MS-5 (1 litro): 890 mL de Alpha MEM, 100 mL de FBS, 10 mL de Pen/Strep Solução de Gelatina (500 ml): Dissolver 0,5 g de gelatina em 500 mL de água morna (50-60 °C) Milli- Q. Deixar arrefecer até à temperatura ambiente.
[188] Em geral, o seguinte é um resumo breve de métodos exemplares de monitorização da produção de neurônios DA maduros para utilização em enxertos (ver ainda, as condições mostradas no Quadro 7. O Dia 13 é uma fase da placa basal do mesencéfalo, caracterizada pela co-expressão de FOXA2/LMX1 A. Além da expressão de FOXA2 e LMX1A, encontrou-se uma perda da expressão de OCT4 e falta de indução dos marcadores do prosencéfalo PAX6 e FOXG1. O dia 25 é a fase de precursor de neurônio DA do mesencéfalo, caracterizado pela expressão contínua de FOXA2/LMX1A e expressão de marcadores neuronais (TUJ1) e marcadores DA (NURR1, TH). A proliferação de células Ki67+ e o número de precursores neurais do prosencéfalo, PAX6 e FOXG1 são controlado, onde estes marcadores não são desejados. Para uma quantificação imparcial e rápida de dados de imunofluorescência, foi usado um microscópio, a Operetta (Perkin Elmer) High Content, para medições. Os ensaios qRT-PCR também foram usados para cada marcador para confirmar os dados de imunofluorescência. Em alguns embodiments, as linhagens celulares (culturas) que passaram estes testes preliminares in vitro, são usados para enxertos, ver Quadro 7. Em alguns embodiments, os neurônios DA maduros foram criopreservados sem soro no dia 25 (variando entre o dia 20 - dia 25) em meio de cultura + 7% DMSO (variando entre 3%-12%) até serem descongelados para utilização em enxertos. Em alguns embodiments, as amostras celulares são conservadas em nitrogénio líquido. Em alguns embodiments, as células são guardadas em congeladores de baixas temperaturas. Em outros embodiments, os crioprotetores como mioinositol, álcool polivinilo, soro de substituição, compostos de inibição de caspase, são considerados para utilização em adição a DMSO. Após a descongelação, as células são testadas para viabilidade, expressão de marcadores, etc., antes de serem utilizados para enxertos. Em alguns embodiments, foram testadas as células descongeladas para manutenção da função em ensaios a longo prazo, in vitro e in vivo para controlar as condições de congelação e conservação.
[189] B. Estudos para identificar fatores adicionais para a geração de neurônios DA funcionais. Experiências adicionais de "desistência" e "adições" para componentes da cultura de tecidos são considerados para utilizar em células produzidas por estas invenções. Por exemplo, demonstrou-se que embora a utilização de FGF8 resultasse em células destas invenções, não era necessário para a produção destas células. Estas experiências serão alargadas a reagentes adicionais, como as eem umeradas no Quadro 8, como aditivos a culturas de células junto às quatro moléculas "nucleares" que resultaram em células neuronais DA destas invenções, ou seja, i) inibidor Alk4/5/7 ("TGF|3-) (SB431542), ii) Alk2/3 ("BMP")- inibidor (LDN-193189), iii) Agonista atenuado ("SHH")- (Purmorfamina), e iv) GSK3|3- inibidor (CHIR99021).
[190] Como se descreve aqui, a utilização de SB431542 e LDN193189 demonstraram a conversão neural eficiente de células estaminais pluripotentes enquanto a adição de Purmorfamina e CHIR99021 a estas células demonstrou a indução da placa basal do mesencéfalo. Outras substâncias químicas e proteínas recombinantes foram ou podem ser usadas para proporcionarem suporte trófico, a longo prazo, e/ou aceleram a diferenciação. Alguns destes compostos serão usados em outros testes para definir as suas funções na diferenciação celular aqui descritos.
[191] Para estas experiências, o desempenho de outros compostos será comparado aos limites exemplares para a diferenciação dos neurônios DA (Quadro 7) versus a utilização dos 4 fatores nucleares (Quadro 8).
[192] Este tipo de experiências são consideradas para definirem o número mínimo de fatores necessários para produzir células neuronais DA, autênticas, destas invenções. C. Os embodiments para estabelecer as curvas de resposta de dose para contaminantes com potencial de proliferação (hESCs pluripotentes, rosetas neurais). Durante o desenvolvimento das presentes invenções, não se observaram teratomas ou crescimento excessivo dentro dos enxertos em até, pelo menos, 5 meses de sobrevivência in vivo. Para monitorizar a segurança, em estudos a longo prazo para refletir a longevidade considerada para enxertos em humanos, considera-se um limiar de números de células para determinar um limite de contaminação relevante de tipos de células problemáticas, tal como hESCs indiferenciados que podem evoluir para o teratomas ou precursores primitivos da neuroectoderma de proliferação significativa. Portanto, alguns embodiments são considerados para mais enriquecimento de neurônios dopaminérgicos em células para utilização em enxertos, ou seja, a depleção dos tipos de células contaminadas antes do enxerto, ver Quadro 7 para limites exemplares. • seguinte descreve o exemplar do conjunto padronizado adicional em ensaios para estratégias de validação de melhorias. Para hESCs, uma mistura pré-determinada de células indiferenciadas (Oct4+/Nanog+) com neurônios DA derivados de hES serão usados para monitorizar os sintomas clínicos sugestivos de efeito de massa e/ou morte animal em experiências animais. Uma resposta de dose de uma célula hES por 10.000 células DA derivadas de hESC, 1/5000, 1/1000 e 1/100 será realizada. As células serão injetadas intra-corpo estriado e os animais vão receber imunossupressão. Os ratos serão controlados de perto e serão sacrificados mediante manifestação de sintomas neurológicos ou a um máximo de 6 meses. Os cérebros serão analisados para volumes de enxertos e composição como se descreve aqui. Os rácios celulares serão ajustados até ser estabelecido um limiar claro, in vivo para o aparecimento de teratomas. Para determinar níveis contaminantes de precursores do neuroectoderma primitivo, foi seguida uma estratégia semelhante. A presença de precursores neurais iniciais tem um potencial significativo para a proliferação e ampla diferenciação no sistema nervoso central assim como nos destinos do sistema nervoso periférico (PNS). A análise do enxerto vai consistir de IHC para células roseta (expressão PLZF), a progenia do SNC (precursores neurais a expressarem Nestin/Sox2 ou precursores do prosencéfalo, expressando FoxGl) assim como volumes de enxerto e um índice de proliferação (% Ki67+ do total de células sobreviventes). IV. Doença de Parkinson.
[193] A doença de Parkinson (PD) é a segunda mais comum doença neurodegenerativa e calcula-se que afete entre 4,1-4,6 milhões de doentes em todo o mundo, um número que se prevê duplicar bem por volta de 2030. É a segunda doença neurodegenerativa mais comum depois de Alzheimer, afetando aproximadamente 1 milhão de doentes nos EUA com 60.000 novos doentes diagnosticados, por ano. A doença tem um impacto socioeconómico importante causando uma morbilidade e mortalidade significativas, e os custos combinados, diretos e indiretos de PD, incluindo custo dos cuidados de saúde e rendimentos perdidos, calcula-se como sendo de aproximadamente $25 mil milhões por ano nos EUA. Atualmente, não existe cura para a doença de Parkinson (PD), uma disfunção relacionada com a idade, progressiva e incapacitante. PD caracteriza-se patologicamente por uma perda seletiva de neurônios DA do mesencéfalo na substância negra. Uma característica fundamental de PD é portanto a perda progressiva, grave e irreversível dos neurônios dopaminérgicos (DA) do mesencéfalo, resultando finalmente na incapacitação da disfunção motora. Enquanto as terapias farmacológicas, à base de exercícios, genes e cirurgias tenham sido desenvolvidas para PD, nenhum desses métodos conseguiu restaurar uma função adequada do neurônio DA. O controlo a longo prazo dos sintomas motores em doentes, permanece frequentemente sub-ótimo, e embora reconhecendo a importância progressiva da resposta a não-dopaminas através de sintomas ou não-sintomas, o problema fundamental do controlo dos sintomas de resposta a dopamina, a longo prazo, mantém-se uma área de necessidade terapêutica crítica. A patologia disseminada é reconhecida em PD, afetando tanto o sistema nervoso central como periférico, as características cardeais de PD (bradicinesia, rigidez e tremor, parcialmente) são fundamentalmente relacionados com uma perda de célula neuronal DA e respondem a dopamina. Assim, considera- se o tratamento de PD usando substituição de célula neuronal devido à perda seletiva de neurônios DA do mesencéfalo que é responsável pela maioria dos sintomas motores da doença, um cérebro humano saudável aloja aproximadamente um milhão de neurônios DA. Assim, em um embodiment, considera-se que a substituição do neurônio DA precisa de um número relativamente pequeno de células sobreviventes como comparado à maioria das outras disfunções do SNC.
[194] Um desafio no desenvolvimento de uma terapia à base de células para PD foi a identificação de uma fonte de células apropriadas para utilização em substituição neuronal. Esta pesquisa está em curso há mais de 30 anos, tendo sido propostas muitas fontes potenciais para a substituição de neurônios DA (Krilcs, Protocols for generating ES cell-derived dopamine neurons in Development and engineering of dopamine neurons (eds. Pasterkamp,R.J., Smidt, & Burbach) (Landes Biosciences, 2008; Fitzpatrick, et al., Antioxid. Redox. Signal. 11:21892208 (2009)). No passado, várias destas fontes evoluíram para uma fase inicial de ensaios clínicos incluindo células catecolaminérgicas da medula adrenal Madrazo, et al., N. Engl. J. Med. 316, 831-834 (1987), transplantes do corpo da carótida (Arjona, et al., Neurosurgery 53: 321-328 (2003)), ou células epiteliais do pigmento retinal encapsulado (Spheramine trial Bakay, et al., Front Biosci. 9, 592-602 (2004). No entanto, estes ensaios falharam na sua maioria na demonstração da eficácia clínica e resultaram em baixa sobrevivência a longo prazo, e uma baixa libertação de DA das células enxertadas. Outro método foi o transplante de neurônios DA fetais do mesencéfalo realizados em mais de 300 doentes no mundo inteiro (Brundin, et al., Prog. Brain Res. 184, 265-294 (2010); Lindvall, & Kokaia, J. Clin. Invest 120:29-40 (2010). A terapia usando tecido fetal humano nestes doentes demonstrou evidência de sobrevivência de neurônio DA e na libertação DA in vivo até 10 ou 20 anos após o transplante em alguns doentes. No entanto, em muitos doentes, o transplante do tecido fetal não consegue substituir a função neuronal DA. Além disso, o transplante de tecido fetal está cheio de desafios múltiplos incluindo pouco quantidade e qualidade do tecido do dador, assuntos éticos e práticos relativos à aquisição do tecido e a natureza mal definida de células transplantadas, que são alguns dos fatores que contribuem para os vários resultados clínicos. Os exemplos do transplante são descritos em; Mendez, et al. Nature Med.(2008)); Kordower, et al. N. Engl. J. Med. 332:1118-1124 (1995); Piccini, et al. Nature Neuroscience 2:1137-1140 (1999). No entanto, os resultados clínicos foram misturados com alguns dados positivos em estudos iniciais e abertos (Lindvall, et al. Science 247:574-577 (1990); Widner, et al. N. Engl. J. Med. 327:1556-1563 (1992); Brundin, et al. Brain 123:1380-1390 (2000); Freed, et al. N. Engl. J. Med. 327:1549-1555 (1992); Freeman, et al. Bilateral fetal nigral transplantation into the postcommissural putamen in Parkinson's disease. Ann Neurol 38:379-388 (1995). Contudo, obtiveram-se resultados modestos em dois ensaios clínicos de maiores dimensões, controlados por placebo, realizados nos EUA e patrocionados pelo NIH (Freed, et al. N. Engl. J. Med. 344, 710-719 (2001); Olanow, et al. Ann. Neurol. 54:403-414 (2003)). Há muitas mais hipóteses quanto à eficácia limitada observada nos ensaios de enxertos humanos fetais incluindo que o enxerto fetal pode não proporcionar um número suficiente de células na fase correta de desenvolvimento para um benefício terapêutico ótimo. Além disso, o tecido fetal é bastante mal definido por tipo de célula e variável no que se refere à fase e qualidade de cada amostra de tecido Bjorklund, et al. Lancet Neurol. 2, 437445 (2003). Outro fator de contribuição pode ser uma resposta de hospedeiro de baixo nível ao enxerto (Bjorklund, et al. Lancet Neurol. 2, 437-445 (2003)).
[195] Em contraste, considera-se que a fonte celular derivada de célula estaminal ou outro tipo de célula consistente para utilização no fornecimento de células para transplante supera qualquer dos desafios associados com o enxerto de tecido fetal e pode oferecer uma fonte ilimitada de neurônios DA na fase ótima para transplante. Após quase 20 anos de tentativas usando várias fontes potenciais de célula estaminal, os inventores conseguiram obter neurônios DA humanos do mesencéfalo, autênticos, de células estaminais pluripotentes capazes de reverterem os efeitos neurológicos em animais murinos e primatas. Esta inovadora estratégia de diferenciação tem sido muito eficiente e levou a um enxerto robusto in vivo das células, a indução da recuperação funcional em modelos PD de doença, e falta de efeitos adversos tal como proliferação celular inadequada como suportado pelos dados pré-clínicos. Aprovação FDA para uma célula ES humana para tratar PD está a ser considerada porque a FDA aprovou testes de outros derivados celulares humanos de células ES em lesão da medula espinal (Strauss, Nat. Biotechnol. 28:989-990 (2010) e degeneração macular (Schwartz, et al. Lancet 379:713-720 (2012)).
[196] Os embodiments adicionais incluindo estratégias de "melhorias" para controlar a pureza das células promovem o crescimento excessivo de fibras axonais e incluem consideração de características inovadoras de segurança/regulamentares. Por exemplo, em alguns embodiments, um método de purificação celular demonstrou iniciar de um simples marcador de superfície de rastreio contra um tipo de célula de interesse, (tal como CD 142) no sentido de uma estratégia significativa de enriquecimento para um tipo específico de neurônio. Em alguns embodiments, este método é considerado para ser usado no fornecimento de células para utilização em seres humanos. Além disso, em outros embodiments, a expressão de engenharia de PSA- NCAM é considerada para melhorar o crescimento excessivo axonal para usar na reparação neural in vivo. Tais aplicações incluem a promoção a longa distância do crescimento axonal para o tratamento da doença de neurônios motores, doença de Huntington ou outras disfunções que afetem principalmente a projeção de neurônios. São considerados embodiments adicionais para uma fonte celular qualificada e pluripotente de GMP, e similares. Dado que os métodos de enxertos aqui descritos, exigem um pequeno número de neurônios DA e se baseiam em métodos relativamente simples, rentáveis e de pequenas moléculas desenvolvidas para a indução de neurônios DA, considera-se que a terapia de substituição neuronal DA deve ser de um custo razoável com base em cada doente.
[197] Uma limitação biológica potencial do método de transplante em PD é o facto que a degeneração neuronal em PD vai continuar a afetar muitos tipos celulares além dos neurônios DA do mesencéfalo, particularmente nas últimas fases da doença. De facto, em um estudo a longo prazo, os sintomas de resposta não-DA predominam na fase tardia de PD, levando a disfagia, quedas, demência e outras morbilidades significativas. No entanto, considera-se que alguns sintomas não motores beneficiam da recuperação da função dopaminérgica. Além disso, considera-se que a utilização de neurônios DA derivados de hESC, nas fases iniciais da doença evitaria alguns dos sintomas secundários de PD, incluindo a degeneração das populações recetoras de dopamina do corpo estriado. Mas, na ausência de impacto de sintomas de resposta não-DA da doença, a recuperação dopaminérgica funcional, a longo prazo do corpo estriado seria um sucesso importante para tratar esta doença atualmente incurável. No caso de doença de Parkinson houve várias terapias alternativas incluindo estratégias baseadas em medicamentos e métodos cirúrgicos tal como a estimulação profunda do cérebro. Em alguns embodiments, a eficácia da recuperação é considerada como sendo comparável a, ou além dos níveis conseguidos com terapias alternativas. Em outros embodiments, considera-se que a utilização desta terapia de enxerto de células de neurônios é particularmente benéfica para um subconjunto particular de doentes. Em outros embodiments, considera-se a utilização da terapia de enxerto de células de neurônios DA maduros em adição às terapias existentes de medicamentos e cirurgia. Um benefício importante de usar terapia de enxerto celular de neurônio DA maduro destas invenções é a natureza exclusiva de neurorestauração pós-enxerto, ou seja, a recuperação a longo prazo da função neuronal que é considerada para utilização em doentes para a remoção progressiva da terapia medicamentosa. Considera-se que o transplante celular afeta um espectro diferente de sintomas relacionados com DA do que os respondem a fármacos ou outras terapias. Portanto em um embodiment, considera-se o transplante de neurônio DA maduro para ser usado com DBS. Em outro embodiment, considera-se a utilização do neurônio DA com terapia.A) Doença de Parkinson e terapias atuais. Foi feito um grande progresso na identificação de alterações genéticas raras contribuindo para formas familiares de PD. Mas, para a maioria de casos PD, a contribuição do potencial de qualquer predisposição genética mantém-se pouco claro. As estratégias terapêuticas tradicionais em PD são limitados pelo facto que no início dos sintomas clínicos 30-70% de todos os neurônios DA na substância negra degeneraram irreversivelmente. Uma opção terapêutica é a substituição farmacológica da deficiência neuronal DA usando o precursor DA, L-Dopa. No entanto, apesar da resposta dramática inicial de alguns doentes PD à terapia L-Dopa, o resultado clínico a longo prazo, mantém-se reservado e os graves efeitos secundários da terapia L-Dopa, incluindo as flutuações motoras e discinesias, ocorrem frequentemente na fase final da doença. A distribuição pulsátil de L-Dopa tem uma função importante no desenvolvimento destas complicações motoras de fase final, portanto uma distribuição 'mais suave' mais fisiológica de dopamina, ou seja, tais como as células enxertadas destas invenções, seriam portanto altamente desejáveis. Além das estratégias farmacológicas, há várias opções de tratamento cirúrgico. Estas incluem a ablação ou inativação funcional das células dentro dos gânglios basais, via palidotomia, ou estimulação profunda do cérebro tendo como alvo o núcleo subtalâmico ou a parte interna do globo pálido. Embora estas opções cirúrgicas sejam alternativas para alguns doentes, proporcionam o alívio sintomático da doença mas não recuperam a função DA normal. Além disso, foram referidos os efeitos secundários cirúrgicos e não-cirúrgicos, incluindo mau funcionamento do equipamento, infeções, trombose, hemorragia e similar. Outras opções de tratamento incluem a distribuição de fatores de crescimento como GDNF ou Neurturin usando uma infusão direta intra-parênquima ou expressão viral através de terapia genética. Embora os estudos iniciais abertos em PD tenham mostrado resultados promissores para ensaios controlados posteriores para GDNF, em um conjunto maior de doentes, não conseguiram confirmar qualquer benefício e levantaram preocupações potenciais de segurança devido à produção de anticorpos anti-GDNF em um subconjunto de doentes. A distribuição de Neurturin baseada em AAV, uma molécula relacionada com GDNF, também não conseguiu demonstrar nenhum benefício clínico em um grande ensaio clínico multicêntrico, controlado a placebo. Os dados iniciais de um ensaio de Fase 2 das injeções de descarboxilase de ácido glutâmico AAV-borne (GAD) no núcleo subtalâmico foram recentemente registados (Lancet Neurology, Abril 2011) no entanto, na melhor das hipóteses, os benefícios clínicos foram modestos neste estudo. Embora os esforços sobre estratégias neurotróficas baseadas em fatores ou estratégias alternativas de neuroproteção possam trazer o alívio temporário a doentes, nenhum deles pode trazer de volta/substituir os neurônios DA já perdidos devido a doença, o principal objetivo de uma terapia de substituição celular.B) Terapia celular em PD. Os sintomas clínicos tornaram-se evidentes em PD, quando se perderam 70- 80% de dopamina estriatal e cerca de 50% de neurônios de dopamina da substância negra. Mas os neurônios de dopamina do mesencéfalo desenvolveram-se em 8,5 semanas após a concepção com pouca evidência de substituição de neurônios de dopamina durante o resto da vida. Portanto, os neurônios de dopamina, no momento do início da doença já têm muitas décadas de idade sem um mecanismo natural para substituir estas células, portanto pode ser necessário substituir estas células nos cérebros de doentes PD. A substituição dos neurônios DA em PD foi feita nos anos oitenta, com base na utilização de medula adrenal derivada de células de cromafina. Estas células produtoras de hormonas demonstraram mudar o fenótipo do neurotransmissor de adrenalina para DA quando colocado ectopicamente no SNC. Embora várias centenas de doentes PD fossem enxertados em todo o mundo, usando este método, tornou-se claro ao longo do tempo que as células enxertadas sobrevivem muito mal com um efeito transitório, na melhor das hipóteses. Portanto, este método foi rapidamente abandonado para utilização clínica. Em contraste, a utilização do enxerto de tecido do mesencéfalo fetal foi baseado em estudos pré-clínicos mais extensos em modelos roedores que demonstraram um enxerto robusto a longo prazo e melhoria funcional através de um painel de ensaios de comportamento relacionados com DA. Encorajados por estes dados pré-clínicos, continuaram-se os enxertos fetais em muitos centros no final dos anos 80 e início dos anos 90. Estes estudos demonstraram evidência clara que o enxerto funcional a longo prazo com maior libertação de DA na área enxertada como foi medido por Fluorodopa PET e estudos histológicos posteriores em alguns doentes que morreram devido a causas diferentes. No entanto, a utilização do enxerto fetal levantou dois problemas potenciais com métodos terapêuticos baseados em células. Primeiro, um problema inesperado de enxertos fetais foi a indução de discinesias induzidas por enxertos (GID) em cerca de 15% de doentes. Embora o mecanismo de GID se mantenha controverso, a evidência recente indica que os neurônios serotonérgicos foram capazes de conservação e libertação inadequada de DA. Outro mecanismo potencial sugerido para explicar GID foi a distribuição irregular de neurônios DA, ou seja, causando pontos quentes de libertação de DA. Em contraste, durante o desenvolvimento das presentes invenções, os métodos para detetar e reduzir os neurônios serotonérgicos foram descobertos que reduziria a incidência de GID. Além disso, a injeção de neurônios maduros DA proporcionaria uma distribuição regular de neurônios maduros incluindo terminais de fibra dopaminérgica alargado dentro do corpo estriado hospedeiro. Outro problema com o tratamento de enxerto fetal foi (e é) a disponibilidade limitada do tecido fetal do mesencéfalo na fase de desenvolvimento adequado. Uma estratégia alternativa foi testada clinicamente para tratar do problema de fornecimento limitado pela utilização de neurônios DA derivados de porco fetal. No entanto, a sobrevivência do neurônio DA nestes xenotransplates foi fraca e o método geral foi abandonado. Um ensaio recente usando epitélio pigmentado de retina também não conseguiu mostrar benefícios. Em contraste, considera-se a utilização de células ES humanas como fontes de células de transplante para proporcionarem uma fonte ilimitada de células para se obterem neurônios de dopamina usados para transplante.
[198] Os compostos e os métodos de cultura foram descobertos pela diferenciação direcionada de células de precursor neuronal positivo FOXA2+ e LMX1A+ nos neurônios DA do mesencéfalo (mDA) destas invenções.
[199] Os inventores descobriram durante o desenvolvimento destas invenções que o momento de exposição de CHIR99021 determina a indução dos precursores da placa neural das placas basais do mesencéfalo FOXA2/LMX1A. Portanto, os inventores testaram a análise imunocitoquímica de FOXA2/LMX1A no dia 11 da diferenciação após LSB/S/F8 (ou seja, o tratamento de células com LSB, S, i.e. SHH, e FGF8 (F8) apenas o tratamento ou em combinação com CHIR começando em vários momentos: d(dia)0-dl 1, dl-dl 1, d3-dl 1, d5-dl 1, d7-dl 1 comparado para duplicação de culturas de células sem tratamento CHIR. Depois a quantificação da percentagem de FOXA2+, LMX1A+ e foram determinadas células de marcação dupla, no dia 11 de diferenciação após o início diferencial da exposição de CHIR como se descreve na análise imunocitoquímica.
[200] CHIR99021 (C) é fator A para induzir células FOXA2+/LMX1A+ ao dia 11 a partir de células cultivadas LSB em contato com um ativador de hedgehog e purmorfamina. O exemplo seguinte descreve o uso de métodos de exemplo para testar a eficácia de cada composto na indução de diferenciação neuronal dirigida de neurônios mDA.
[201] Este exemplo descreve a descoberta de pequenas moléculas e tempo de contato para proporcionar uma diferenciação dirigida de neurônios FOXA2+LMX1A+ DA da presente invenção. Segue-se um breve resumo de algumas descobertas experimentais aqui descritas: O tratamento de células com dupla inibição de SMAD com agonistas SHH (purmorfamina + SHH) e FGF8 (S/F8) na ausência de CHIR99021 revelou uma expressão significativamente menor de FOXA2 no dia 11 e uma total ausência de expressão de LMX1A (figura 1a, b). O marcador anterior OTX2 foi induzido com robustez em LSB e culturas tratadas com LSB/S/F8/CHIR, mas não em condições LSB/S/F8 (Figura 1a,c).
[202] Foi selecionada uma população de células contendo células pluripotentes pelos autores da invenção para uma população de início e foram cultivadas em placa no dia 0. As células foram deixadas desenvolver-se quase até à confluência, antes da diferenciação (entre 60 - 100% de confluência). Estas células foram postas em contato com inibidores de efeito duplo em SMAD (isto é exposição a LDN-193189 + SB431542 = "LSB") no dia 0. Os autores da invenção seguiram uma população de células com alimentação regular contendo LSB fresco até ao dia 11 e descobriram que algumas células restantes eram LMX1A+ mas não expressavam FOXA2 (Figura 1a,b). Os autores da invenção cultivaram em placa populações de células de partida e depois testaram os tipos de células (isto é, os padrões de expressão gene/proteína) após estabelecer contato com misturas contendo qualquer um dos seguintes agonistas SHH (purmorfamina + SHH) e FGF8 (S/F8) em contato com as células com diferentes regimes de exposição, isto é em contato com as células no dia 0, dia 1 ou dia 2, etc. para períodos de tempo específicos, isto é 24 horas, 48 horas, etc. Estas três condições de cultura de exemplo principais testadas foram 1) células em contato com LDN/SB (LSB) no dia 0, depois em contato com LSB fresco até ao dia 5, no dia 5 as células foram postas em contato com LDN fresco sem SB até ao dia 11, 2) células em contato com LDN/SB (LSB) no dia 0 foram postas em contato com LSB fresco até ao dia 5, no dia 5 as células foram postas em contato com LDN fresco sem SB até ao dia 11, enquanto, durante este período, as células foram ainda postas em contato até ao dia 7 e 3) células postas em contato com LDN/SB (LSB) no dia 0 e depois com LSB fresco no dia 5, no dia 5 as células foram postas em contato com LDN fresco sem SB até ao dia 11, enquanto durante este período as células foram ainda postas em contato com purmorfamina fresca, SHH e FGF8 até ao dia 7, mantendo ainda contato com CHIR fresco a partir do dia 3 da cultura até ao dia 11, com várias variações destas condições primárias a fim de determinar um rendimento ideal de tipos de células.
[203] B. Caracterização in vitro de FOXA2+/LMX1A+células derivado da região do mesencéfalo na placa inferior em comparação com as células precursoras de DA geradas por outras técnicas. Foram executadas comparações sistemáticas das três condições de cultura (figura Id), utilizando análise do perfil de expressão genética temporal global. A agregação hierárquica de genes expressos diferencialmente distinguiu as três condições de tratamento no dia 11 da diferenciação (figura 8a). FOXA1, FOXA2 e vários outros alvos a jusante SHH, incluindo PTCH1, encontravam-se entre as transcrições mais diferencialmente reguladas em LSB/S/F8/CHIR em comparação com o tratamento LSB (figura 1e). A expressão de LMX1A, NGN2 e DDC indicava o estabelecimento do destino do precursor do neurônio DA do mesencéfalo já por volta do dia 11 (figura 1e, f). Em contraste, as culturas LSB, foram enriquecidas em termos de marcadores do prosencéfalo dorsal, tais como HESS, PAX6, LHX2 e EMX2. A comparação direta de LSB/S/F8/CHIR em comparação com o tratamento LSB/S/F8 (figura 1f) confirmou o enriquecimento seletivo dos mercadores do precursor DA do mesencéfalo no grupo LSB/S/F8/CHIR e sugere identidade precursora hipotalâmica nas culturas tratadas com LSB/S/F8, com base na expressão diferencial de RAX1, SIX3, e SIX6 (ver também expressão POMC, OTP na figura 2d). É apresentada uma lista de exemplo de transcrições expressas diferencialmente, isto é quadros 1, 2 e análise ontológico-genética no dia 11, Figura 8b (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov) confirmam o enriquecimento de sinalização WNT canónica no tratamento CHIR. Ainda não estão disponíveis dados em bruto na FEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ accessionA [TBD]). Análise temporal comparativa da expressão genética de marcadores do precursor DA do mesencéfalo (figura 1g) em comparação com marcadores dos destinos neuronais não-DA anteriores e ventrais (figura 1h) dividiu as três condições de indução em: i) LSB: prosencéfalo dorsal; ii) LSB/S/F8: ventral/hipotalâmico e iii) LSB/S/F8/CHIR: identidade precursora DA do mesencéfalo.
[204] VI. Continuação da diferenciação de células FOXA2+/LMX1A+ do dia 11 em neurônios DA do mesencéfalo ao dia 25 mantendo-se até ao dia 65.
[205] Para continuar a diferenciação, as células precursoras FOXA2+/LMX1A+ foram mantidas em um meio promotor da maturação neuronal (BAGCT, ver exemplo 1). Para comparação, foram empregues duas outras técnicas de geração de células precursoras neuronais de dopamina. Os seguintes tipos de comparações foram realizadas entre as populações de células diferenciadas, resultantes de métodos anteriores e métodos da presente invenção. A) análise imunocitoquímica no dia 50 da diferenciação em TH em combinação com LMX1A, FOXA2 and NURR1, B) Quantificação de células TH+, FOXA2+, LMX1+ e NURR1+ de entre culturas derivadas de roseta de comparação de células totais contra culturas (LSB/S/F8/CHIR) derivadas do placas basais. C) Quantificação das percentagens de subtipos neuronais serotonina+ (5-HT) e GABA+ (contaminantes neuronais não DA) no dia 50 em culturas de neurônios DA derivadas de placas basais e de roseta. E D) análise HPLC para a medição de dopamina e metabolitos: Comparação de níveis de DA, DOPAC e HVA entre culturas derivadas de placas basais contra as derivadas de roseta.
[206] Ao dia 25, três populações de células precursoras renderam neurônios Tujl+ (figura 2a) e células expressoras de TH, na enzima limitadora da taxa na síntese de DA. No entanto, o tratamento com LSB/S/F8/CHIR rendeu células TH+ que co-expressavam LMX1A e FOXA2 e apresentavam uma forte indução do receptor nuclear NURR1 (NR4A2) (Figura 2a,b). A comparação da expressão genética no dia 13 contra as culturas ao dia 25 confirmou uma indução robusta de outros marcadores neuronais DA pós-mitóticos (figura 2c). A caracterização da identidade neuronal DA no dia 25 em comparação com culturas tratadas com LSB e LSB/S/F8 confirmou o enriquecimento de transcrições neuronais DA mesencefálicas conhecidas e identificou múltiplos marcadores candidatos novos (figura 2d, quadros 3-5, figura 8b). Por exemplo, a transcrição mais intensamente enriquecida em LSB/S/F8/CHIR (grupo DA do mesencéfalo) foi TTF3, um gene anteriormente nunca associado ao desenvolvimento neuronal DA do mesencéfalo, mas fortemente expresso na substância negra humana (figura 8c, Allen Brain Atlas: http://human.brain-map.org).
[207] Foram obtidos dados similares para EBF-1, EBF-S (Figura 8c) assim como TTR, um algo transcripcional conhecido de FOXA2 no fígado. Os dados obtidos durante o desenvolvimento das presentes invenções indicaram o enriquecimento de vários genes PITX em células precursoras DA mesencefálicas. PITX3, um marcador clássico dos neurônios DA do mesencéfalo, foi também expresso de forma robusta ao dia 25 da diferenciação (figura 2e). Finalmente, foi fácil reproduzir a indução tanto do placas basais mesencefálico e neurônios DA em linhagens hESC e hiPSC independentes (figura 9). Os dados apresentados, revelam que o protocolo LSB/S/F8/CHIR em oposição a outros protocolos testados, rendem células expressoras de um perfil marcado correspondente ao destino neuronal DA do mesencéfalo.
[208] As propriedades in vitro e in vivo dos neurônios DA derivados do placas basais foram comparados com os neurônios semelhantes a DA, obtidos por via de um intermediários roseta neural (figura 10 e 16). A definição de padrões das rosetas neurais representa a estratégia mais difundida atualmente para derivar neurônios DA de hPSCs. Tanto o protocolo baseado no placas basais como o baseado na roseta foram eficientes na geração de neurônios TH+ capazes de sobrevivência in vitro a longo prazo (dia 50 da diferenciação, figura 3-1a). No entanto, a percentagem de células TH+ foi significativamente superior nas culturas derivadas do placas basais (figura 3-1b). Enquanto as células TH+ em ambos os protocolos revelaram co-expressão de NURR1, os neurônios DA derivados do placas basais co- expressaram FOXA2 e LMX1A (Figura 3-la,b e 3-2).
[209] Observaram-se poucos neurônios GABA e serotonina (5-HT)-positivos (figura 3-1c). DA e respectivos metabolitos DOPAC e HVA encontravam-se em culturas geradas com qualquer um dos protocolos, mas os níveis de DA eram aproximadamente 8 vezes superiores nas culturas do placas basais (figura 3-1d,e). Os neurônios DA do mesencéfalo exibiam um extenso desenvolvimento de fibras e expressão robusta de marcadores neuronais maduros, incluindo sinapsina, transportador dopamina (DAT), e retificadores internos do canal potássio, acoplados à proteína G (neurônios DA Kir3.2, também designado G1RK2, expresso na parte compacta da substância negra (SNpc)) (figura 3-1f, figura 11). Neurônios DA SNpc in vivo exibem um fenótipo eletrofisiológico que os diferencia de outros neurônios no cérebro. Em particular surgem espontaneamente a uma velocidade lenta (1-3 Hz). Além disso, esta velocidade lenta é acompanhada por um potencial oscilatório sub-limiar lento. Ao fim de 2 - 3 semanas in vitro, estas mesmas características fisiológicas são exibidas por neurônios DA Snpc cultivados a partir de ratinhos pós-natal precoces. Os neurônios DA diferenciados de hESCs exibiam de forma consistente (4/4 testes) este fenótipo fisiológico distintivo (figura 3-1g-i).
[210] A manutenção de neurônios mDA in vitro em d65 revelou que os neurônios positivos TX ainda expressam FoxA2 e fibras longas extendidas típicas dos neurônios mDA. Figura 3-lj. A medição da libertação de DA por HPLC revelou que os neurônios TH+ d65 velhos se mantêm funcionais in vitro Figura 3-1k.
[211] Em resumo, encontra-se aqui descrita a conversão neurogênica de precursores do placas basais mesencefálico no desenvolvimento de um protocolo optimizado de diferenciação de neurônios DA do mesencéfalo do placas basais. Os neurônios DA derivados do placas basais foram obtidos a partir de células ES humanas após uma ativação de SHH com base em moléculas pequenas e sinalização WNT canónica durante as fases iniciais da diferenciação (figura 3-2). Estas células hES progrediram a partir da fase do placas basais mesencefálico positivo duplo FOXA2/LMX1A, transformando-se em neurônios imaturos Tujl+ com co-expressão de FOXA2/LMX1A e depois em neurônios DA maduros (figura 3-2a,b) com libertação DA robusta e propriedades eletrofisiológicas características dos neurônios DA mesencefálicos da parte compacta da substância negra (SNpc; tipo A9), incluindo atividade de marcação de passo autónoma (figura 3-2c). Surpreendentemente, este foi um processo extremamente eficiente, com mais de metade das células na placa de cultura a adoptar o perfil marcador do mesencéfalo maduro (ver figura 3-2b).
[212] VII. Caracterização de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos derivados de placas basais in vivo como neurônios enxertados.• exemplo seguinte descreve o uso de métodos exemplares das presentes invenções para utilização na substituição celular terapêutica Um dos principais desafios neste domínio reside na capacidade de gerar neurônios DA do mesencéfalo derivados de hPSC que enxertem funcionalmente in vivo sem o risco de desenvolvimento excessivo neuronal ou diferenciação inapropriada em neurônios não-mesencefálicos ou desenvolver teratomas. Com base nos estudos sobre transplantes de tecido fetal, os autores da presente invenção contemplaram a possibilidade de o tempo da saída do ciclo celular, marcado pela expressão de NURR1, possa ser uma fase adequada para o enxerto (aproximadamente ao dia 25 da diferenciação, figura 2). Estudos iniciais utilizando células com 25 dias em ratinhos adultos sem lesões revelaram uma sobrevivência robusta de neurônios FOXA2+/TH+ derivados de hPSC às 6 semanas após o transplante (figura 12). Foi testada a sobrevivência de células FOXA2+/TH+ a longo prazo em hospedeiros com Parkinson sem resultar em desenvolvimento neuronal excessivo. Com este propósito foram provocadas lesões 6-hidroxi-dopamina (6-OHDA) (Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008), incorporado a título de referência) em ratinhos null NOD- SCID IL2Rgc, uma estirpe que suporta com eficiência sobrevivência de xenoenxertos com particular sensibilidade para a exposição de células tumorgénicas raras (Quintana, et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature 456:593-598 (2008), incorporado a título de referência). Ambas as culturas de neurônios DA derivados de placas basais e de roseta foram enxertadas (150 x 103 células/animal) sem purificação prévia a fim de revelar células potencialmente contaminantes com elevado potencial proliferante. Quatro meses e meio depois do transplante os enxertos neuronais DA derivados de placas basais revelaram um núcleo de enxerto bem definido de células TH+ co- expressador de FOXA2 e do marcador específico humano hNCAM (figura 4a-c). A análise funcional revelou uma recuperação completa do comportamento de rotação induzido por anfetamina. Em contraste, os enxertos neuronais derivados de roseta revelaram poucos neurônios TH+, não produziram uma redução significativa do comportamento de rotação (figura 4d) e exibiram um desenvolvimento excessivo neuronal massivo (volume do enxerto > 20 mm3, figura 13). O extenso desenvolvimento excessivo das células neuronais derivadas de roseta no enxerto, como acabámos de descrever, foi comparável ao trabalho anterior com enxertos DA derivados de roseta do grupo do inventor (Kim, et al. miR-371-3 Expression Predicts Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), incorporado a título de referência) e outros (Hargus, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107:15921-15926 (2010), incorporado a título de referência). O desenvolvimento excessivo ficou provavelmente a dever-se a maiores períodos de sobrevivência (4,5 meses contra 6 semanas), ausência de purificação FACS antes do transplante e seleção de hospedeiro null NOD-SCID IL2Rgc. O número de células Ki67 proliferantes foi mínima em enxertos derivados de placas basais (< 1% do total de células) enquanto os enxertos derivados de roseta retiveram bolsas de precursores neurais proliferantes. Pensa-se que o desenvolvimento excessivo neural seja provocado por células neuroectodérmicas anteriores primitivas no enxerto (Elkabetz, et al. Genes Dev. 22:152-165 (2008); Aubry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA 105:16707-16712 (2008), incorporado a título de referência). Esta hipótese foi suportada pela expressão do marcador mesencefálico FOXG1 na roseta mas não enxertos derivados do placas basais. Uma pequena percentagem de células astrogliais encontrava-se presente nos enxertos derivados de placas basais e de roseta, embora a maioria das células GFAP+ eram negativas quanto a marcadores humanos indicadores da origem do hospedeiro (figura 13.)
[213] Resultados em ratinhos null NOD-SCID IL2Rgc descritos demonstraram uma sobrevivência a longo prazo robusta de neurônios FOXA2+/TH+, reversão completa do comportamento de rotação induzido por anfetamina e ausência de sinais de desenvolvimento excessivo neural. No entanto, alguns destes resultados podem ser atribuídos ao uso específico de ratinhos null NOD-SCID IL2Rgc. Para testar esta hipótese, culturas de neurônios DA derivados de placas basais (250 x 103 células) foram transplantadas em ratinhos lesionados 6-OHDA adultos imunossuprimidos farmacologicamente com ciclosporina A. Cinco meses após o transplante, a sobrevivência do enxerto era robusta (figura 4e-h) com uma média de mais de 15.000 células TH+ co-expressoras de FOXA2 (figura 4g) e antigênico nuclear humano (hNA) (figura 4e); as fibras TH+/hNCAM+ emanadas do núcleo do enxerto no estriado envolvente do hospedeiro (figura 4f). Para além do FOXA2, células TH+ expressaram os marcadores neuronais DA do mesencéfalo PITX3 e NURR1 (figura 4h-j). As análises comportamentais revelaram uma recuperação completa da assimetria rotacional induzida por anfetamina, em contraste com animais com enxerto simulado, que não apresentaram melhorias (figura 4k). Os animais submetidos a enxerto revelaram também melhorias no teste de marcha (figura 4l) que mediu a acinésia dos membros anteriores e no teste do cilindro (figura 4m), experiências que não dependem da estimulação farmacológica do sistema DA. O início tardio da recuperação (aproximadamente 3 a 4 meses após o transplante) está previsto para neurônios DA humanos e depende da taxa de maturação in vivo, tal como os níveis de expressão DAT (figura 4n). A presença de células TH+ expressoras de canais Kir3.2(GIRO) ou calbindina indicam que tanto Snpc (A9) e neurônios DA da área tegmental ventral (A10) encontram-se presentes no enxerto (figura 40,p).
[214] Tal como nos ratinhos (figura 13), as células serotonérgicas e GABAérgicas eram raras (< 1% do total de células) em células de rato, assim como as células gliais GFAP maioritariamente derivadas de hospedeiro (7% do total de células; (figura 14). Embora tenham sido detectados poucos neurônios serotonina+ no enxerto, foram observadas células negativas hNCAM que eram provavelmente fibras serotonérgicas derivadas do hospedeiro (figura 14).• enxerto de neurônios DA derivados do placas basais em ratinhos, ratos e macacos demonstra a surpreendente recuperação da funcionalidade neuronal em roedores e primatas. As análises de sobrevivência a curto prazo (6 semanas) foram prolongadas para uma sobrevivência a longo prazo surpreendente até 5 meses após o transplante no corpo estriado de ratinhos hospedeiros lesionados 60HDA e imunocomprometidos. Efetivamente, uma comparação direta de um método tradicional, à base de roseta de produção de neurônios DA (Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 12543-8 (2004)) comparada com o novo protocolo de diferenciação de neurônios DA à base de placas basais, presentemente descrito, revelou que os neurônios DA derivados do placas basais eram capazes de enxerto neuronal DA a longo prazo enquanto os neurônios à base de rosata não eram capazes do mesmo (figura 4a-c).
[215] Em particular, uma indução robusta de recuperação comportamental em rotações induzidas com anfetamiona em ratinhos lesionados 6-OH, transplantados com neurônios (linha azul) derivados de placas basais(fp) e neurônios DA (linha vermelha) derivados de roseta (figura 4d) revelou que os neurônios derivados de fp apresentavam taxas de recuperação mais elevadas. Os ratinhos enxertados com neurônios DA derivados de placas basais revelaram uma recuperação quase completa nos níveis anfetamina. Os animais enxertados com neurônios DA derivados de roseta revelaram menos melhoria comportamental e alguns inverteram passado algum tempo para os valores de elevada rotação iniciais.
[216] Encontrou-se também uma funcionalidade de enxerto robusta no modelo de ratinho lesionado 60HDA. O rato, ao contrário do rato PF, permite análises comportamentais mais complexas e remete para a sobrevivência de neurônios DA em um contexto de xenoenxerto na sequência de imunossupressão farmacológica (uma terapia que simula melhor os protocolos de enxerto humano). Uma excelente sobrevivência do enxerto, sinais de desenvolvimento de fibras DA e manutenção da expressão do fator de transcrição específico mesencefálico confirmaram a sobrevivência a longo prazo de neurônios derivados de placas basais que expressam marcadores neuronais DA do mesencéfalo autênticos (figura 4e-j). Um conjunto de análises funcionais revelou uma melhoria significativa tanto no arrastar induzido (rotações induzidas por anfetamina) e testes comportamentais espontâneos (teste do cilindro e marcha).
[217] Os resultados demonstrados revelam uma excelente sobrevivência do enxerto e resultado comportamental em dois modelos independentes de roedor. No entanto, o número neurônios DA necessários em um cérebro de rato ou de ratinho representa uma pequena fracção do maior número de células necessárias para um enxerto em primatas e seres humanos. Para testar a facilidade de ampliação deste protocolo, foram realizados estudos de enxerto piloto executados em dois macacos rhesus lesionados MPTP adultos.
[218] Adicionalmente, de início não se sabia se os métodos e células descritos também restaurariam a funcionalidade neuronal em um primata, informação que poderia ser utilizada para apoiar a autorização do uso destes métodos e células em seres humanos. Assim, um conjunto inicial de estudos foi executado em pelo menos 2 macacos para testar a sobrevivência in vivo a longo prazo (4-6 semanas) e manutenção do fenótipo do neurônio DA do mesencéfalo no cérebro de primatas. Estes estudos descritos, revelaram uma robusta sobrevivência de neurônios DA do mesencéfalo positivos TH/FOXA2 e sinais de re-enervação do corpo estriado hospedeiro (figura 4q-t). O enxerto de um número maior de célula, similar aos estimados ao nível do necessário para futuros estudos sobre enxertos em seres humanos, resultou em uma sobrevivência de neurônios DA do mesencéfalo robusta. Para além destes dados a curto-prazo, foram realizados vários estudos a longo prazo com macacos rhesus para avaliar a sobrevivência no espaço de 3 meses de células e um regime de imunossupressão optimizado de CellCept, Prograf e Prednisona diários (utilizado como terapia tripla combinada). Surpreendentemente, constatou-se uma sobrevivência robusta no espaço de 3 meses de neurônios DA do mesencéfalo derivados de ES no cérebro de primatas conjuntamente com uma reação inflamatória do hospedeiro aos enxertos muito menor em comparação com a intensa resposta dos microglia do hospedeiro observada no estudo inicial sobre enxertos (ver, figura 15).
[219] Especificamente, os métodos relacionados com os estudos em macacos incluídos, lotes de 50 x 106precursores neuronais DA transplantáveis forma obtidos no dia 25 da diferenciação utilizando o protocolo baseado no placas basais. Uma dose clássica foi de 3 mg de MPTP-HCL injetados na artéria carótida (entre 0,5-5 mg). Esta foi seguida de injeção sistémica de 0,2 mg/kg IV de MPTP. As células foram injetadas em três locais (núcleo caudado posterior e putâmen précomissural) de cada lado do cérebro (6 tratos no total, 1.25 x 106 células/trato) e os animais foram imunocomprometidos com ciclosporina A. Um lado do cérebro foi injetado com precursores DA de um subclone de H9 expressor de GFP, enquanto o outro lado foi enxertado com células derivadas de células H9 sem marcação. Os resultados que mostram o enxerto de neurônios em macacos rhesus com expressão continuada de FOX2A e produção de TH encontram-se na figura 4q-t. Um mês após o transplante, observou-se a sobrevivência robusta de neurônios DA do mesencéfalo com base na expressão de GFP (figura 15) e do marcador citoplasmático específico do ser humano (SC-121) (figura 4q). Cada núcleo de enxerto foi envolvido por uma auréola de fibras TH+ que se prolonga até 3 mm dentro do hospedeiro (figura 4r). Os núcleos de enxerto foram constituídos por neurônios TH+, co-expressores de SC-121 (figura 4s) e FOXA2 (figura 4t). As áreas SC-121 e GFP negativas no enxerto continham microglia do hospedeiro Ibal+ (figura 15) indicadora de imunossupressão incompleta. Em resumo, o enxerto de uma população de células neuronais DA novas em primatas, isto é macacos rhesus lesionados MPTP adultos (3 mg de MPTP-HCL (l-metil-4-fenil-l,2,3,6- tetrahidropiridina; com uma concentração entre 0,5 e 5 mg de MPTP-HCl) contendo uma perda grave > 95% de neurônios DA do mesencéfalo endógenos. A exposição a MPTP provocou alterações observáveis e sintomas similares à doença de Parkinson em seres humanos.
[220] Em resumo, descobriu-se um novo protocolo de diferenciação hPSC à base de placas basais que recapitula fiavelmente o desenvolvimento de neurônios DA do mesencéfalo. O acesso às células com funcionalidades essenciais dos neurônios DA do mesencéfalo irá permitir uma vasta gama de aplicações biomédicas, tais como estudos sobre desenvolvimento básicos, descoberta de fármacos de elevada produtividade e modelação de doenças baseadas em PD- iPSC. É importante destacar que este estudo estabeleceu finalmente um meio para obter uma fonte passível de ser ampliada de neurônios FOXA2+/TH+ para transplante neural - um passo importante no caminho para se apreciar uma terapia celular para a PD.
[221] Além disso, a derivação de autênticos neurônios DA do mesencéfalo a partir de hESCs revelou um excelente desempenho in vivo (ver figura 4) e o rendimento em termos de neurônios DA, no momento do enxerto (aproximadamente 40% dos neurônios maduros na população no dia 25-30 da diferenciação, que excedeu as percentagem obtida após a dissecção do tecido mesencefálico ventral fetal (tipicamente cerca de 10%) (Sauer, et al., Restor. Neurol. Neurosci. 2:123-135 (1991)).
[222] Segue-se algumas breves descrições de materiais e métodos para utilização na avaliação de dois principais parâmetros após o enxerto: duração da sobrevivência e extensão das avaliações comportamentais. Para estudos de curto prazo, por ex. para confirmar a sobrevivência celular ou composição fenotípica, estão contempladas as avaliações comportamentais e a sobrevivência nos animais será testada cerca de 4 a 8 semanas após enxerto. Os estudos a longo prazo incluem avaliação comportamental pós-enxerto e a sobrevivência do animal durante pelo menos 5 meses após o enxerto. Enquanto se analisam estratégias intensificadoras, tais como modificações PSA-NCAM, contempla-se que a avaliação comportamental inclua parâmetros mais complexos, tais como o teste da escada para verificar o domínio do uso dos membros anteriores.
[223] Os protocolos de exemplo para a avaliação do desempenho in vivo possuem pelo menos quatro componentes principais e inclui os seguintes: i- Indução da lesão, ii-Análise Comportamental Central, iii-enxerto e iv-análise do tecido. Embora estes procedimentos tenham sido utilizados em ratos, em algumas realizações estes procedimentos podem ser utilizados noutras espécies.
[224] i-Indução da Lesão. Injeções unilaterais de 6-hidroxidomapina (6- OHDA) no feixe prosencefálico médio (MFB) constitui uma abordagem convencional para a indução de sintomas semelhantes aos da doença de Parkinson em ratos. A 6-OHDA é uma neurotoxina que é transportada retrogradamente através da via negroestriada no MFB, de volta à substância negra, resultando assim na morte dos neurônio por incapacitação das enzimas respiratórias mitocondriais. Os neurônios alvo incluem neurônios A9 dopaminérgicos dentro da substância negra compacta (SNC), assim como neurônios A10 na área tegmental ventral. Este modelo de lesão encontra-se bem estudado e é aceite como excelente modelo pré- clínico para o estudo das consequências neuroquímicas e comportamentais da PD avançada, dado que resulta em um esgotamento unilateral de dopamina no complexo caudado-putamen (CPU). As consequências comportamentais encontram-se também bem descritas e incluem rotações espontâneas e induzidas farmacologicamente, assim como o enfraquecimento do uso dos membros (ver abaixo). Os modelos bilaterais do parkinsonismo podem simular melhor a doença humana mas resultam em adipsia e afagia em ratos.• procedimento foi executado em animais anestesiados (cetamina/xilazina) através de injeção estereotática em 2 locais ao longo do feixe prosencefálico médio. A eficiência de indução completa da lesão depende em grande parte da experiência do operador e durante o desenvolvimento da presente invenção oscilou entre 60 e 80%. Deixou-se os animais recuperar e depois sujeitou- se estes a uma série de testes comportamentais que tiveram início 2 semanas após a cirurgia.Análise Comportamental Central. A análise comportamental foi iniciada 2 semanas após a cirurgia e continuou após o transplante até o animal ser sacrificado. Tem como objetivo 1) estabelecer que a lesão é estável e completa e que o animal não exibe reversão espontânea dos sintomas, um fenómeno que já ficou demonstrado em animais parcialmente lesionados, 2) demonstrar o impacto do transplante de neurônios dopaminérgicos em parâmetros comportamentais estabelecidos.a- comportamento rotacional. Foram observados ratinho para detectar rotações espontâneas e rotações induzidas com D-anfetamina (ipsilateral) (10 mg/kg). É necessário um limite de >6 rotações por min como indicador de uma lesão significativa. Podem também ser analisadas rotações induzidas por apomorfina, mas os resultados positivos devem ter >80 a 90% de esgotamento de inervação da dopamina no corpo caudado-utamen e são menos consistentes em lesões MFB, em comparação com lesões CPU. Os três conjuntos de dados são obtidos com intervalos de 2 semanas e calcula-se a média. Os ratos com uma pontuação de rotação <6 não são incluídos nos estudos.b- Teste da marcha. Este teste avalia a acinesia dos membros anteriores. Um rato é segurado pelo experimentador com uma mão, fixando os membros posteriores (erguendo ligeiramente o dorso) e fixando com a outra mão o membro anterior que não se pretende monitorizar. Deste modo a pata dianteira tem de aguentar o peso. O rato é deslocado devagar lateralmente nas posições de frente e de trás. Conta-se o número de passos de ajuste em ambas as direções e ambas as patas.c - Teste do cilindro. Este teste avalia a assimetria do uso dos membros anteriores. O rato é colocado em um cilindro transparente. Durante um período de 5 min é avaliado o comportamento de recuo do rato. O comportamento é analisado durante o recúo e pouso. É determinada a percentagem de uso simultâneo e assimétrico das patas durante estes movimentos. Esta avaliação pode ser executada através de um sistema de monitorização vídeos computorizado. Sabe- se que os resultados negativos destes testes estão relacionados com o esgotamento da dopamina e demonstrou-se que os resultados melhoram na sequência dos enxertos de restauração, como descrito.
[225] - enxerto. Os animais receberam injeções estereotáticas de neurônios dopaminérgicos no corpo estriado, 3 semanas após as lesões indutoras de parkinson e dependente da confirmação por testes da presença de uma lesão adequada. As coordenadas para a injeção são bem conhecidas. Na sequência do enxerto, o mesmo conjunto de testes comportamentais é executado a cada dois meses por períodos variáveis (em média 5 meses são necessários para alcançar uma recuperação comportamental estável).
[226] - Análise dos tecidos- Os animais são eutanasiados e perfundidos. Os cérebros são seccionados e processados para análise imuno-histoquímica e estereológica. Os anticorpos incluem TH, FoxA2, Pitx3, Nurrl, Lmxla, Girk2, DAT para a identidade e funcionalidade do neurônio dopaminérgico; 5-HT para identificar os neurônios serotonérgicos; NCAM humano ou antígeno nuclear humano para a identidade humana; Nestin, Sox2 para precursores neurais; Ki-67 para proliferação; Oct4, Nanog para marcadores pluripotentes; alfa-fetoproteína; miosina; citoqueratina para marcadores multi-linhagem para excluir a formação de teratomas. Os parâmetros quantitativos incluem, volumes de enxerto (estimador Cavalieri), contagens de células totais e contagens de células dopaminérgicas (utilizando neurônios TH/FoxA2 com dupla marcação) e índice proliferante (% Ki67+). Os anticorpos indicados estão à venda e são utilizados durante o desenvolvimento das presentes invenções.
[227] Em algumas realizações, são contemplados ratos Sprague-Dawley (SD) para uso a fim de melhor modelar a situação humana. Os ratos SD irão receber injeções diárias intraperitoneais de ciclosporina (15 mg/kg) a começar no dia antes do enxerto até ao sacrifício. Com injeções a longo prazo da forma aquosa de ciclosporina (Neoralm uma solução oral utilizada em seres humanos) verificou-se uma morbidade negligenciável.
[228] Em algumas realizações, são apresentados métodos de exemplo para ampliar as culturas de neurônios mDA, ver quadro 9. Em realizações particulares, estes métodos são contemplados para uso na produção de culturas de nível GMP para uso clínico.
[229] Parâmetros de avaliação Os testes in vivo foram contemplados para uso em métodos a curto prazo e a longo prazo da eficácia dos enxertos. Os resultados obtidos durante o desenvolvimento da presente invenção revelaram caracterização do tecido idêntica em ambos os casos, com uma expectativa de maior proporção de células TH+ em sobreviventes a longo prazo devido à diferenciação dos precursores enxertados.
[230] Em média, com o transplante de 15.000 neurônios TH+/FoxA2+ por 250.000 células, os animais sobreviveram 5 meses pós-enxerto. Houve um número significativamente menor de células com marcação dupla que sobreviveu, tendo sido incluído nas sobrevivências curtas. Assim, os rendimentos in vivo, como se mostra no quadro 9, são estimativas conservadoras. Os parâmetros de exemplo utilizados para avaliar um estado êxito/falha para os resultados da composição de enxerto encontram-se apresentados no quadro 10.
[231] Em enxertos a longo prazo, a avaliação comportamental é um componente essencial do desempenho dos produtos da linhagem hES. As diretrizes que definem a perda de funcionalidade e recuperação encontram-se melhor descritas para as rotações provocadas por anfetaminas, em que um enxerto robusto deveria normalizar o comportamento e resultar ocasionalmente em movimentos contralaterais devido ao desequilíbrio DA. Os limites indicados no quadro 11 constituem linhas orientadoras de exemplo, como determinado durante o desenvolvimento da presente invenção.
[232] Em algumas realizações, as fontes de células destinadas a serem utilizadas nos métodos de diferenciação das presentes invenções incluem, sem constituir limitação, as linhagens de células WA09, ACT (M09), Bio-Time e Roslin. Em algumas realizações, as fontes de células destinadas a serem utilizadas nos métodos de diferenciação das presentes invenções incluem, sem constituir limitação, as linhagens de nível GMP. Em algumas realizações, as fontes de células destinadas a serem utilizadas nos métodos de diferenciação das presentes invenções incluem, sem constituir limitação, a produção de neurônios DA maduros para utilização na análise da sobrevivência ao enxerto de curto prazo. Em algumas realizações, as fontes de células destinadas a serem utilizadas nos métodos de diferenciação das presentes invenções incluem, sem constituir limitação, a produção de neurônios DA maduros para utilização em experiências que incluem avaliações comportamentais. Os controlos consistem em WA09 de nível de pesquisa e um grupo de controlo com soro fisiológico. Análises estatísticas com base em ANOVA, com o teste Dunnett post-hoc.
[233] Análises comportamentais complexas para avaliação do grau de re- enervação do corpo estriado. Testes comportamentais padrão (como presentemente descritos) exibiram uma correlação direta com o número de neurônios dopaminérgicos sobreviventes no enxerto. Em ratos tratados com células neuronais DA maduras das presentes invenções, os testes comportamentais revelam uma recuperação máxima com uma recuperação estimada de cerca de 30% dos neurônios DA, o que é o necessário para reduzir as rotações induzidas por anfetamina. Assim, uma vez atingido o limiar de sobrevivência de neurônios DA no hospedeiro (um número estimado de 800 a 1200 neurônios DA no modelo de rato), poderá ser difícil distinguir as diferenças comportamentais que refletem as estratégias de aperfeiçoamento. Uma abordagem com microtransplante foi descrita, a qual resulta na aplicação de múltiplos pequenos enxertos ao longo do corpo estriado, em oposição a grandes enxertos. Com o controlo do número total de células DA transplantadas, foram observadas diferenças nos resultados comportamentais em comparação com 2 grupos: Os ratos com múltiplos enxertos pequenos exibiram uma recuperação comportamental mais precoce e mais extensa em rotações induzidas por fármacos e nos testes de marcha em comparação com os animais com um único enxerto grande e o mesmo número de neurônios DA e a mesma quantidade de libertação de dopamina. Surpreendentemente, verificou-se uma distinta diferença na capacidade de uso competente dos membros anteriores, tendo os animais com enxertos pequenos com distribuição ampla exibido melhorias enquanto os ratos com enxertos padrão não. O uso competente dos membros anteriores é considerado uma tarefa que exige controlo espacial e temporal em relação à libertação de DA, e consequentemente exige uma adequada ligação entre os neurônios enxertados e o corpo estriado do hospedeiro. Assim, em algumas realizações, o uso de neurônios DA maduros da presente invenção em procedimentos de enxerto resultou na recuperação do uso dos membros anteriores. Assim, em algumas realizações, neurônios DA maduros das presentes invenções são administrados em uma única localização do corpo estriado. Noutras realizações, neurônios DA maduros das presentes invenções são administrados em pelo menos 2 ou mais localizações do corpo estriado. B. Teste do uso competente dos membros anteriores (ou da escada). O teste dos membros anteriores analisa a capacidade destes membros para alcançar e agarrar e foi executado pré-lesão e pós-lesão e pós-transplante. Os animais jejuaram durante 48 horas antes do teste e os testes foram executados diariamente, ao longo de 5 dias pré-lesão, depois duas vezes após a lesão com intervalo de 3 semanas. Após o enxerto, o teste foi repetido mais 2 vezes, nos meses 3 e 5. Os animais foram colocados em uma câmara de plexiglas, equipada com uma escada dupla. Foram colocados grãos de ração em 5 degraus bilateralmente para o teste pré-enxerto e unilateralmente (do lado do membro afetado, contralateral em relação à rotação) após o enxerto. Os animais foram testados por um período determinado (por ex. 10 minutos) e calculou-se os números e proporção de grãos de ração que foram ingeridos (alcance com sucesso) e dos grãos de ração que foram apanhados e estabeleceu-se uma comparação com o desempenho individual do animal pré- lesão. Houve várias variações deste teste envolvendo o número de iterações e o tempo do teste.
[234] VIII. As Células Diferenciadas Através da Aplicação dos Métodos Descritos Revelaram Respostas Eletrofisiológicas Similares às Células DA In Situ.• exemplo seguinte descreve o uso de métodos exemplares das presentes invenções para determinação da capacidade funcional dos neurônios DA do mesencéfalo resultante da diferenciação através dos métodos descritos. Neurônios DA (SNpc) da parte compacta da substância negra in vivo exibem um fenótipo eletrofisiológico que os diferencia de outros neurônios no cérebro. Em particular surgem espontaneamente a uma velocidade lenta (1-3 Hz). Além disso, esta velocidade lenta é acompanhada por um potencial oscilatório sub-limiar lento. Ao fim de 2 - 3 semanas in vitro, estas mesmas características fisiológicas são exibidas por neurônios DA Snpc cultivados a partir de ratinhos pós-natal precoces. A fim de determinar se os neurônios mDA das presentes invenções revelam um fenótipo eletrofisiológico comparável, os neurônios mDA das presentes invenções foram testados quanto à sua assinatura eléctrica de resposta. Os neurônios DA do mesencéfalo das presentes invenções foram testados aos dias 80-100 da cultura mediante registo de célula única. Estes neurônios mDA diferenciados de hESCs exibiam de forma consistente (4/4 testes) este fenótipo fisiológico distintivo, revelando um comportamento de pico autónomo específico e alterações oscilatórias do potencial da membrana (figura 3g-i). Este comportamento é conhecido por atividade marca-passo autónoma e é uma propriedade específica dos neurônios DA do mesencéfalo e particularmente dos neurônios dopaminérgicos mesencefálicos mais relevantes para a doença de Parkinson (neurônios DA do mesencéfalo do tipo substância negra).
[235] São contempladas medições eletrofisiológicas para uso em preparações de corte agodo, isto é, de biópsias das áreas enxertadas. Em uma realização, neurônios DA derivados de enxerto tipo A9 contra tipo A10 serão identificados in vivo com base nos testes para a atividade marcapasso autónoma que é específica dos neurônios dopaminérgicos tipo A9, que são os mais afetados na PD. Por outras palavras, os neurônios tipo A10 não têm atividade marcapasso.
[236] Foram estabelecidas as condições para o registo in vivo de neurônios DA derivados de células tronco pluripotentes humanas em preparações de corte agudo, ver figura 26. Especificamente, os neurônios DA humanos enxertados, derivados de células estaminais pluripotentes, foram medidos e descobriu-se que tinham funcionalidades eletrofisiológicas típicas daquelas observadas na parte compacta da substância negra de ratos (SNpc), figura 26A, em que a vista superior revela a reconstrução de um neurônio marcapasso na região do enxerto. Em baixo encontra-se uma fotomicrografia de exemplo de uma fatia de cérebro retirada do rato no qual foram injetados neurônios derivados de hES 9 meses antes; o enxerto está delineado, encontra-se incluída uma imagem com maior ampliação abaixo. A fatia foi processada com tirosina hidroxilase que se pode ver a branco, figura 26B. Além disso, a vista superior apresenta um registo da área ligada à célula de um neurônio DA putativo no enxerto; Abaixo encontra-se um registo de célula inteira de exemplo da mesma célula. Os registos foram realizados na presença de antagonistas do receptor glutamato e GABA (50 μM AP5, 10 μM CNQX e 10 μM GABAzina) para eliminar sinais sinápticos. Estes registos demonstram que os neurônios derivados de PS eram marcapasso autónomos com trajetórias de tensão intrassomáticas normais. Outro neurônio registado em uma amostra de enxerto apresentava propriedades similares, figura 26C. Para comparação, são apresentados registos de ligado à célula e célula inteira de um neurônio dopaminérgico em Snpc de um ratinho adulto. As abreviaturas (CTx= córtex STr= corpo estriado, SNpc= parte compacta da substância negra, DA= dopaminérgico). Estes dados mostram estudos funcionais in vivo no corpo estriado de ratos enxertados após o transplante. Assim, em algumas realizações, estudos funcionais in vivo em tecido enxertado demonstram a recuperação da parte compacta da substância negra (SNpc). IX. Diferenciação Dirigida de PD-iPS ceUs genético mutante PINK1 (mutação PINK1) em Neurônios DA Revelou anomalias semelhantes a Parkinson nos neurônios DA maduros.
[237] Este exemplo descreve a descoberta de que grandes populações de neurônios DA do mesencéfalo se desenvolveram com características dos neurônios de um doente com PD, quando a linhagem celular deste doente, isto é, célula PD- iPSC mutante PINK1, obtida de modo que não resultou na destruição de um embrião, foi utilizada como população de células para se obter neurônios DA FOXA2/LIM1XA/TH+ das presentes invenções.
[238] Em uma realização, os autores da invenção contemplam o isolamento de uma população de células de partida a partir de um doente, para aplicação nos métodos de preparação de neurônios DA autênticos in vitro, em que o doente apresenta um sintoma da doença de Parkinson (PD), com a potencial vantagem de utilizar as células tratadas em ensaios in vitro para 1) observar a diferenciação ou anomalias funcionais em comparação com neurônios DA autênticos para seres humanos que não têm sintoma neurológico, depois 2) utilizando uma anomalia observada para desenvolver um tratamento terapêutico para inverter essa anomalia e 3) tratamento do doente com o tratamento terapêutico para reduzir, isto é inverter, um sintoma da doença de Parkinson.
[239] Em uma realização, os inventores contemplam o isolamento de uma população de células de partida do mesmo doente para derivação de neurônios DA autênticos para uso no tratamento por transplante, em que o doente apresenta um sintoma da doença de Parkinson (PD) com a potencial vantagem de reduzir a rejeição imunológica, isto é a rejeição do transplante. Noutras realizações, a redução da rejeição do transplante é contemplada utilizando uma fonte celular inicial. isolada de um ser humano com Antígenos do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) correspondem (isto é são gémeos) ou de um ser humano com correspondência de tecido MHC aceitável para transplante (tal como um parente do doente ou um ser humano sem parentesco, que expressa moléculas MHC sobrepostas.A. A diferenciação dirigida revelou que as células genéticas PD-iPS células PINK1 continham a capacidade de desenvolver em neurônios DA semelhantes aos mesencefálicos. Ver figuras 20 - 25. Uma linhagem PD-iPSC mutante de PINK1 Q456X foi diferenciada com o novo protocolo de neurônios DA do mesencéfalo (método) presentemente descrito, que rendeu neurônios DA do mesencéfalo que expressaram perfis de diferenciação comparáveis aos obtidos da linhagem H9 diferenciada com o novo protocolo de neurônios DA do mesencéfalo à base de placa basal. (figura 20). Este exemplo descreve a descoberta de que grandes populações de neurônios DA do mesencéfalo se desenvolveram com características dos neurônios de um doente com PD, quando a linhagem celular deste doente, isto é, célula PD-iPSC mutante PINK1, obtida de modo que não resultou na destruição de um embrião, foi utilizada como população de células para se obter neurônios DA FOXA2/LIM1XA/TH+ das presentes invenções.
[240] Uma linhagem PD-iPSC mutante de PINK1 Q456X foi diferenciada com o novo protocolo de neurônios DA do mesencéfalo (método) da presente invenção, que rendeu perfis de diferenciação comparáveis aos obtidos da linhagem H9 iPSC. A-C) análise imunocitoquímica da linhagem PD-iPSC do mutante PINK1 no dia 11 da diferenciação (fase do precursor mesencefálico) para diferenciação FOXA2 (vermelho), LMX1A (verde) e DAPI (azul) (A), dia 25 da diferenciação (fase neuronal DA pós-mitótica precoce) para FOXA2 (vermelho) e TH (verde) (B) e para NURR1 (vermelho) e TH (verde) (C). D-f) O mesmo conjunto de análises imunocitoquímicas executadas com as células derivadas de H9 no dia 11 da diferenciação para diferenciação FOXA2 (vermelho), LMX1A (verde) e DAPI (azul) (D), dia 25 da diferenciação para FOXA2 (vermelho) e TH (verde) (E) e para NURR1 (vermelho) e TH (verde) (F).B. PD-iPSC genético expressou um fenótipo semelhante a PD da agregação das proteínas. Figuras 21-24. Os autores da invenção descobriram que PD-iPSC do mutante PINK1 mostra evidências de expressão de a-sincucleína (componente principal dos corpos de Lewis em doentes com PD) no citosol de neurônios DA TH+ no dia 55 da diferenciação, utilizando o novo protocolo de indução de neurônios DA do mesencéfalo baseados em placa basal, (figura 21a-b). A, B) análise imunocitoquímica da linhagem PF-iPSC mutante PINK1 no dia 55 da diferenciação para α-sinucleina (LB509, vermelho), TH (verde) e imagem incluída (A) e α- sinucleina (vermelho) e ubiquitina (verde) (B). Estas células positivas para α- sinucleina apresentam também uma elevada expressão de ubiquitina (marcador clássico de corpos de Lewis). Em contraste, os neurônios DA derivados da linhagem iPS de controlo revelaram a expressão de α-sinucleina sináptica (em contraste com citosólica) normal e níveis muito baixos de ubiquitina (figura 21c-d). C, D) análise imunocitoquímica da linhagem iPSC de controlo no dia 55 da diferenciação para α-sinucleina (vermelho) e TH (verde) (C) e α-sinucleina (vermelho) e ubiquitina (verde) (D).
[241] C. Expressão da forma agregada de α-sinucleina. No cérebro de um doente com PD, uma forma dimerizada insolúvel de a-sinucleína conduz à agregação nos corpos de Lewis. A forma dimerizada de uma α-sinucleina revela a fosforilação de serina 129 de a-sinucleína. No mesmo dia da diferenciação, células derivadas de PD-iPSC mutante PINK1 revelaram uma forte expressão de α- sinucleína fosforilada Ser129 em contraste com células derivadas de iPSC de controlo que revelaram níveis muito baixos de expressão (figura 22).
[242] Células derivadas de PD-iPSC mutante PINK1 revelaram uma forte expressão de a-sinucleína fosforilada Ser129 em contraste com células derivadas de iPSC de controlo que revelaram níveis muito baixos de expressão. A, B) Análise imunocitoquímica de a-sinucleina fosforilada Ser129 (verde) e DAPI (azul) em células derivadas de PD-iPSC mutante PINK1 no dia 55 da diferenciação (A) e células derivadas de iPSC de controlo correspondentes (B).
[243] D. Sã observadas diferenças nos padrões de expressão de a-sinucleina dependentes do protocolo de diferenciação. Os inventores contemplaram que os neurônios DA do mesencéfalo “autênticos” derivados de placa basal revelaram uma vulnerabilidade específica de PD e fenótipos in vitro específicos correspondentes. Os neurônios DA obtidos utilizando o protocolo de diferenciação à base de alimentadoras estromais MS5 clássicas (Perrier et al., PNAS 2004, incorporado a título de referência) produziram um grande número de neurônios TH+. No entanto, com base nos dados obtidos durante o desenvolvimento das presentes invenções, os inventores revelaram que as células TH+ baseadas em MS5 não eram verdadeiros neurônios DA do mesencéfalo derivados da placa basal. Em culturas diferenciadas através do protocolo MS5, existiam muitas células positivas para a- sinucleina. No entanto, estas células não co-expressaram TH. Além disso, não se verificou qualquer diferença nos padrões de expressão entre PD-iPSC e iPSC de controlo com o uso da estratégia de diferenciação MS5 (figura 23a-b). Estes dados indicam que é também expressa uma a-sinucleina em outros tipos de células não DA e que esta a-sinucleina não DA permanece inalterada em células doentes comparativamente com células derivadas de iPSC de controlo, em particular quando utilizando protocolos de diferenciação MS5 padrão. Estes são os neurônios derivados de roseta semelhantes a DA, registados nas publicações (por ex. Perrier PNAS 2004). Estas células (=semelhantes a DA) TH+ à base de MS5 são utilizadas para comparação com a figura 3, 10, 13 e 16. Estes dados indicam que é também expressa uma α-sinucleina em outros tipos de células não DA e que esta α- sinucleina não DA permanece inalterada em células doentes comparativamente com células derivadas de iPSC de controlo, em particular quando utilizando protocolos de diferenciação MS5 padrão. Por fim, o novo protocolo de diferenciação à base da placa basal descrito rende um grande número de células TH+ co- expressoras de α-sinucleina. Estas células TH+ expressam α-sinucleina em um padrão de expressão citosólico. A figura 24A, B) análise imunocitoquímica da linhagem PD-iPSC mutante PINK1 nos dias 60 da diferenciação à base de MS5 para α-sinucleina (LB509, vermelho), TH (verde) (A) e iPSC de controlo (B). C) análise imunocitoquímica da linhagem PF-iPSC mutante PINK1 no dia 55 da diferenciação à base da placa basal para α-sinucleina (vermelho), TH (verde).
[244] E. Neurônios DA derivados de células PD-iPS são mais vulneráveis à estimulação tóxica. Figuras 24-25. Os neurônios DA TH+ derivados de PD-iPSC através do protocolo à base da placa basal eram mais vulneráveis ao desafio com toxina (valinomicina: ionoforo mitocondrial, 5 μM (com uma concentração entre 1.10 μM), 48 h) do que as células derivadas de iPSC de controlo. Em contraste, os neurônios TH+ derivados através do protocolo à base de MS5 clássico não revelaram vulnerabilidade diferencial entre células derivadas de PD e células derivadas de controlo (figura 24). Uma análise da viabilidade da célula inteira com azul de alamar, ao fim de 48 horas de tratamento com valinomicina também revelou uma sobrevivência celular diferencial em um intervalo de dosagem para o desafio com toxina (5 a 10 μM) em comparação com PD-iPSC e iPSC de controlo (figura 25). Uma condição normal de ambas as culturas derivadas de PD-iPSC e iPSC de controlo obtidas através do protocolo com base em MS5 (D, apresentadas células derivadas de PD-iPSC), neurônios TH+ na sequência do desafio da toxina em PD- iPSC (E) e culturas derivadas de iPSC de controlo (F) obtidas através do protocolo MS5. G-H) imagens de baixa potência de imunocitoquimica para o protocolo para Tujl (vermelho) e TH (verde) com base em placas basais no dia 60 da diferenciação. PD-iPSC de condições normais (G), contra desafio com toxina (H) e iPSC de controlo em condições normais (I), contra condições de desafio com toxina (J). KN) imagens de baixa potência de imunocitoquimica para o protocolo para Tujl (vermelho) e TH (verde) com base em MS5 no dia 60 da diferenciação. PD-iPSC de condições normais (K), contra desafio com toxina (L) e iPSC de controlo em condições normais (M), contra condições de desafio com toxina (N). F
[245] Quantificação de exemplo da viabilidade de células - análise de resposta à dose para o desavio com toxinas. Uma análise da viabilidade da célula com azul de alamar, ao fim de 48 horas de tratamento com valinomicina também revelou uma sobrevivência celular diferencial em um intervalo de dosagem para o desafio com toxina (5 a 10 μM) em comparação com PD-iPSC e iPSC de controlo (dia 60 da diferenciação com base em placas basais). Nota: esta análise testa a morte celular geral, tendo-se observado os efeitos mais dramáticos especificamente em neurônios DA (ver figura 14). Por conseguinte, quantificações com base em azul de alamar apresentaram muito provavelmente uma estimativa por baixo da extensão do efeito diferencial observado nas linhagens de neurônios DA. X.Contempladas Composições que Utilizam Cultura em Grande Escala e Métodos das Presentes Invenções para Proporcionar neurônios mDA de Exemplo.
[246] As descrições apresentadas revelam métodos de exemplo e usos para a produção em grande escala de células neuronais mDA resultantes da diferenciação por composições e métodos presentemente descritos. Ficou provado que a geração ampliável (isto é métodos contemplados para ter êxito na geração de células neuronais mDA a partir de culturas contendo um número relativamente pequeno de células) rende populações de células capazes de apresentar neurônios mDA transplantáveis no dia 25. Em particular células PINK iPSC. Ver quadro 9). XI. Métodos de enriquecimento de neurônios DA do mesencéfalo.
[247] Foram desenvolvidos e testados vários métodos antes e durante o desenvolvimento das presentes invenções, tendo por objetivo o enriquecimento de populações de células para precursores de neurônios DA do mesencéfalo, ultrapassando problemas tais como esgotamento de populações de células contaminantes, incluindo, sem constituir limitação, células estaminais pluripotentes contaminantes. Foram realizados estudos iniciais utilizando neurônios de ratinho embriónicos primários, neurônios de rato embriónicos e populações derivadas de ESC. Para além do objetivo de aumentar as populações neurais para aplicação no enriquecimento de neurônios DA, os estudos com ESC de ratinho incluíram procedimentos de desenvolvimento para a prevenção da formação de teratomas, que se revelou problemático nos procedimentos prévios. Estas estratégias incluíram a seleção negativa de marcadores superficiais celulares expressos em células pluripotentes (tais como SSEA1) conjuntamente com uma seleção positiva de células que expressam o marcador neural (NCAM). Utilizando células de ratinho, foram propostas várias estratégias relatoras genéticas para utilização na identificação do enriquecimento para células neurais em paradigmas de transplante de neurônios DA (por exemplo, identificação de células com expressão SOX1, Corin/Lmxla, Ngn2, TH, Pitx ou DAT). Foram executados testes funcionais em células primárias relatoras Ngn2 de ratinho (Thomposon et al., Exp Neurol. 198(l):183-98 (2006)) e relatoras Lmxl Ade ratinho também ordenadas para Corin (Jonsson, Exp Neurol. 219(1):341- 54 (2009). Para populações derivadas de ESC de ratinho, foram realizados estudos com linhagens relatoras ESC de ratinho SOX1 (Barraud et al., Eur J Neurosci. 2005 22(7): 1555-69), TH (Kelly et al., Minerva Endocrinol. 1991 16(4):203-6), Pitx3 (Hedlund et al., Stem Cells. 2008 26(6): 152636) e DAT (Zhou et al., Stem Cells. 2009 27(12):2952-61). Adicionalmente, durante o desenvolvimento das presentes invenções, os inventores executaram um estudo abrangente sobre transplante, comparando diretamente o desempenho in vivo de três populações derivadas de ESC de ratinho purificadas, representando fases sequenciais do desenvolvimento de neurônios DA: Precursores mesencefálicos (Hes5::GFP), células pós-mitóticas precoces {Nurrl::GFP), e neurônios DA maduros (Pitx3::YFP). Estes estudos identificaram DA expressor de Nurr1 de desenvolvimento como sendo particularmente adequado para enxertos e demonstrou que os neurônios DA purificados são capazes de enxertos eficientes in vivo. Além disso, estes resultados foram utilizados para a seleção de células no dia 25 da diferenciação (início da expressão Nurr1) para uso no enxerto de neurônios hESC-DA em modelos de ratinho, rato e macaco rhesus de PD.
[248] Durante o desenvolvimento da produção da presente invenção de autênticos neurônios DA do mesencéfalo a partir de hESCs revelou um excelente desempenho in vivo (ver figura 4) e o uso dos protocolos descritos resultaram em um rendimento em termos de neurônios DA, no momento do enxerto de aproximadamente 40%. Esta percentagem excedeu as percentagens de neurônios DA obtidas a seguir à dissecação do tecido mesencefálico ventral fetal humano (tipicamente cerca de 10%T). Contempla-se assim o uso de uma fonte baseada em hESC de neurônios DA, como descrito, para aperfeiçoamentos mais avançados em termos de pureza com a utilização de estratégias de purificação celular. Adicionalmente, as linhagens relatoras genéticas foram desenvolvidas para uso com hESC similar às usadas em estudos com ratinhos, incluindo uma linhagem celular humana como uma linhagem Nurr1::GFP. No entanto, o uso de relatores genéticos pode ser problemático para uso tradicional em seres humanos devido à imunogenicidade de GFP em seres humanos, não sendo assim adequados para uso em seres humanos. Além disso, a seleção de FACS pode ser problemática para estabelecer bancos mestre de células de neurônios DA de nível clínico (isto é, desenvolver lotes congelados de neurônios DA humanos para aplicação em transplantes) dado o período de tempo que seria necessário para selecionar os lotes de aproximadamente 109 células necessárias para cada transplante, para além dos potenciais custos elevados e baixo rendimento celular após a recuperação da armazenagem.
[249] Em contraste com os sistemas relatores genéticos e isolamento celular baseado em FACS, os inventores contemplaram o isolamento de neurônios DA com base na expressão de marcadores de superfície utilizando estratégias alternativas para as técnicas de separação celular contempladas para uso em doentes PD. Por exemplo, a seleção com microesferas magnéticas (por exemplo, sistema CliniMACS®) foi muito utilizado em aplicações à base de células, aprovadas pela FDA, e permitiu um isolamento rápido e económico de até 1010 células em condições em conformidade com GMP, isto é condições aprovadas para o isolamento de célula para uso em seres humanos. Deste modo, em algumas realizações, a seleção por microesferas magnéticas é contemplado para o enriquecimento de neurônios DA maduros, por exemplo, utilizando CD142 ligado a microesferas magnéticas para o enriquecimento de neurônios Nurr1 para uso em enxerto. XII, Identificação de Marcadores da Superfície Celular Para Uso em Métodos de Preparação de Neurônios DA Maduros.
[250] Os dados da expressão de marcadores da superfície celular recolhidos durante o desenvolvimento das presentes invenções revelaram identificação de vários novos marcadores da superfície celular expressos nos neurônios DA do mesencéfalo. Especificamente, foram encontrados os marcadores para identificar mais detalhadamente as células, tais como células específicas que se tornariam em neurônios DA com o amadurecimento, neurônios DA das presentes invenções e células A9. Foram utilizadas duas estratégias principais para identificar estes marcadores de superfície: primeiro um ecrã de expressão genética em linhagens relatoras genéticas (figura 27a) revelaram vários marcadores candidatos, incluindo CD142 e um marcador designado DCSM1, que foi expresso seletivamente nos neurônios DA do mesencéfalo e aparentemente marcou especificamente neurônios DA tipo A9 (figura 27b. Uma segunda estratégia consistia no uso de um ecrã marcador da superfície celular CD em neurônios DA derivados de hESC, que foi testado quanto a 242 anticorpos à venda em formato 96 poços (figura 27c,d). O resultado de um ecrã de exemplo destes (figura 27e) conduziu à identificação de pelo menos 5 marcadores validados, enriquecidos em neurônios DA do mesencéfalo, incluindo CD142, um marcador que marcou seletivamente um estádio dos neurônios DA Nurr1+ (figura 27f) para além de CD63, CD99 e CDSM1.
[251] Especificamente, como ilustrado na figura 27, um ecrã marcador da superfície CD para neurônios DA derivados de WA09 no dia 25 da diferenciação, foi testado para até 242 anticorpos individuais. Estes resultados foram comparados com ecrãs duplicados de uma larga gama de outros tipos de células neurais derivadas de WA09 (por ex. motoneurônios HB9::GFP+ derivados de hESC, neurônios corticais derivados de hESC, precursores prosencefálicos ventrais Nkx2.1::GFP+ derivados de hESC e vários outros tipos de neurônios derivados de hESC. A base de dados do perfil de expressão de marcadores de superfície resultante foi depois empregue para selecionar marcadores CD candidatos seletivamente enriquecidos em qualquer subtipo dado, tal como neurônios DA do mesencéfalo (figura 27). Um dos marcadores descobertos, associado à diferenciação de neurônios DA hESC foi o CD142. A seleção de CD142 de células enriqueceu especificamente neurônios DA derivados de hESC no estádio Nurr1+, esgotando simultaneamente outros subtipos de neurônios. Em algumas realizações, CD142 é expresso antes de Nurr1+. Em algumas realizações, uma população de células neuronais DA mesencefálicas selecionadas por CD142 possui células Nurr1+ e Nuxr1. Em algumas realizações, uma população de células neuronais DA mesencefálicas selecionadas por CD142 possui células Nurr1+. Em algumas realizações, uma população de células neuronais DA mesencefálicas selecionadas por Nurr1 - CD142 cultivadas iniciam a expressão de Nurr1 (isto é tornam-se Nurr1+) no espaço de tempo até dois dias depois da seleção.
[252] Além disso, para CD142, CD63 e CD99, foram enriquecidos marcadores em neurônios DA derivados de hESC. Assim, em algumas realizações, culturas de neurônios DA são enriquecidos para neurônios DA mediante seleção de entre marcadores, incluindo, sem constituir limitação CD142, CD63, CD99, DCSM1, Nurrl+, etc. CD142 marca tipicamente cerca de 30% da população de células total no dia 25 da diferenciação (figura 28a). A seletividade de CD142 para a fase de neurônios DA Nurr1+ foi confirmada em múltiplas linhagens independentes hESC e hiPSC (figura 28b). Para além do enriquecimento para neurônios DA, é importante que CD142 esgote seletivamente outros subtipos de neurônios, tais como neurônios GABA e serotonérgicos. (figura 28c-f). Foram executados estudos in vivo que demonstraram a capacidade de CD142 para dar origem a enxertos neuronais DA de elevado grau de pureza sem neurônios contaminantes GABA e serotonérgicos detectáveis. Os neurônios serotonérgicos são um tipo de células que estão implicadas em enxertos de tecido fetal humano como fonte potencial de disquinésias induzidas por enxertos. Embora os métodos de enxerto descritos, utilizando células não purificadas já deram como resultado alguns neurônios serotonérgicos, o uso de Cd142 deve reduzir ainda mais este risco.
[253] Marcadores para identificar neurônios mDA maduros de tipo A9. Constatou-se que os neurônios DA derivados de A9 contra os derivados A10 possuem propriedades funcionais in vivo e padrões de inervação específicos para o seu papel na função mesoestriada contra a função mesolímbica. Durante o desenvolvimento das presentes invenções, os inventores descobriram que os neurônios mDA autênticos produzidos através dos métodos das presentes invenções (figura 4) deram origem a neurônios com mais características A9 do que A10. Em particular, neurônios mDA autênticos que eram TH+ pelo menos em parte, expressaram Girk2, um marcador utilizado para definir neurônios DA tipo A9. Adicionalmente, muitos neurônios DA maduros exibiam atividade marcapasso autónoma que é uma característica funcional presente nos neurônios DA tipo A9 mas não nos tipo A10. No entanto, algumas células TH+ geradas in vitro não apresentavam a densidade A9. Deste modo os inventores contemplaram procedimentos de enriquecimento, tais como os descritos presentemente, para fornecer populações purificadas de neurônios mDA autêntico tipo A9 humanos (contra A10). Como presentemente descrito, os inventores descobriram pelo menos dois marcadores únicos para neurônios tipo A9 e pelo menos dois marcadores únicos para pelo menos neurônios tipo A10. Assim, em algumas realizações, os neurônios tipo A9 estão identificados por marcadores (Girk2, Aldhl) contra A10 (Calbindin, Otx2).
[254] Definição de um conjunto marcador que intensificou o rendimento de neurônios DA do mesencéfalo com um subtipo A9. Foram contempladas pelo menos duas estratégias para definir marcadores de superfície A9: Foram obtidos marcadores candidatos a partir de um ecrã de expressão genética, tal como descrito, e anticorpos CD candidatos de um ecrã marcador de superfície, como presentemente descrito. Populações noutro método, análise de transcriptoma global em populações purificadas de neurônios mDA derivados de ESC de rato em fases distintas de diferenciação (utilizando tecnologia transgénica BAC, ver figura 27a,b). Foram descobertos marcadores de superfície em um perfil de marcador de superfície em neurônios DA derivados de WA09 RCB com os seguintes métodos de exemplo. Neurônios DA derivados de RCB WA09 no dia 25 da diferenciação foram dissociados e re-semeados em placas de 96 poços, seguido de exposição aos anticorpos CD242 e análise de dados utilizando o scanner Operetta de elevado conteúdo. Foi testada a quantidade de enriquecimento DA para pelo menos 5 anticorpos adicionais que se ligaram aos marcadores CD identificados nestes ecrãs (por exemplo, CD142, CD63 e CD99). Células candidatas CD-positivas contra CD- negativas foram avaliadas utilizando as experiências DA QC, incluindo a expressão de FOXA2/TH e TH/Nurr1 (ver, quadro 7). Em algumas realizações, os perfis de expressão genética globais estão contemplados para comparação de células sem seleção para CD142+. Em algumas realizações, as células selecionaram/separaram a expressão de um marcador desejado em estudos a curto prazo e a longo prazo como presentemente descrito. Entre os marcadores específicos dos neurônios DA, identificados nestes estudos, encontrava-se um gene marcador de superfície que foi designado DCSM1 (marcador de superfície celular DA 1). Com base nos dados de expressão in situ, constatou-se que a expressão no mesencéfalo ventral era surpreendentemente pelo menos parcialmente selectiva de A9, tanto no cérebro de rato em desenvolvimento como adulto (figura 27) e no cérebro adulto humano. Foram observadas em umerosas células a expressar a expressão de DCSM1 em neurônios DA derivados de hESC. Análises in vitro de identidade A9 contra A10 incluíam diferenciação a longo prazo de células marcadoras+ (dia 50 e dia 75 da diferenciação) e análise de i) expressão de marcadores A9 (Girk2, Aldhl) contra A10 (Calbindin, Otx2) em neurônios maduros, (ii) respostas diferenciais de orientação do axónio para Netrin-1 e Sema3 e (iii) neurônios enriquecidos A9 foram avaliados por meio de ensaios eletrofisiológicos. Os neurônios DA A9 exibiram características funcionais específicas como presentemente descrito para neurônios A9 derivados de hESC. Foram executados estudos in vivo para células expressoras de DCSM1 e outros marcadores a fim de confirmar i) a expressão do marcador A9 (Girk2, Aldhl) contra A10 (Calbindin, Otx2), ii) desenvolvimento de fibras DA do enxerto e iii) propriedades A9 eletrofisiológicas em preparação em fatias das células enxertadas (ver figura 26).
[255] XIII. Uso de ácido policiálico (PSA) enzima e polissialiltransferase (PST).
[256] A integração do enxerto e a extensão do desenvolvimento das fibras DA constituem desafios nos métodos de enxerto, incluindo os estudos de enxertos fetais em doentes com PD. Um problema levantado com tecidos de enxerto e células reside no limitado desenvolvimento de fibras a partir destes enxertos durante o tratamento dos doentes. Este problema é particularmente crítico em seres humanos dado que a recuperação do doente exige re-enervação do corpo estriado extensiva. Em métodos anteriores, alcançar uma re-enervação adequada após um enxerto de tecido exigia múltiplas injeções de depósitos de células em todo o corpo estriado. Cada injeção pode provocar danos no corpo estriado e inflamação para além de outros riscos cirúrgicos. Estes riscos incluem a lesão de um vaso sanguíneo durante a injeção de células que possa potencialmente induzir um AVC ou convulsões no doente. PSA é um homopolímero natural de ácido siálico da superfície das células (isto é ácido siálico ligado alfa-2,8) que foi identificado como modificação pós-tradução (através da ação da enzima polissialiltransferase (PST)) de outras moléculas da superfície celular, tal como molécula de adesão de células neurais (polissialilada) (NCAM), NCAM (CD56) e semelhantes. O PSA aparentemente regula a plasticidade de alguns comportamentos celulares que implicam alterações nas interacções célula-célula, incluindo migração celular e desenvolvimento do axónio. Embora fortemente expressas nos embriões, o PSA foi subrregulado em tecidos adultos, com exceção de regiões localizadas do SNC, que mantêm plasticidade estrutural e fisiológica (tal como o hipocampo, núcleo supraquiasmático, SVZ). Assim, em algumas realizações, o ácido polissiálico (PSA) foi contemplado para uso na promoção do desenvolvimento de fibras de células enxertadas. Exemplos do uso de PSA noutros tipos de células encontram-se descritos na WO 2006/042105, presentemente incorporados na íntegra a título de referência. Em algumas realizações, os inventores contemplam o uso de neurônios DA autênticos em combinação com PSA, como descrito.
[257] PSA Aumentado em Neurônios DA Para Utilização em Doentes PD. Ainda subsistem grandes desafios para proporcionar métodos e células com base nos resultados anteriores, para uso de modelos animais pequenos, incluindo sobrevivência limitada de células transplantadas e fraca inervação das fibras do tecido hospedeiro. Pensa-se que o impacto destas limitações é mais grave no corpo estriado humano de maiores dimensões, sendo assim necessária sobrevivência e inervação maiores para uma aplicação clínica eficaz dos neurônios DA derivados de ES. Prevê-se que um melhor desenvolvimento do desenvolvimento de fibras e integração do enxerto em modelos animais, incluindo o uso de pelo menos uma, até várias injeções represente reduções nos riscos associados a múltiplas injeções ou fraca distribuição dos neurônios DA in vivo.
[258] A regulação das interacções celulares com ácido polissiálico (PSA) é um dos fatores que promoveram a distribuição celular, desenvolvimento do axónio e inervação alvo durante o desenvolvimento dos vertebrados, cf, por exemplo, Rutishauser, Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat Rev Neurosci 9, 26-35 (2008). O PSA é um polímero hidrato de carbono ligado à molécula de adesão celular neuronal (NCAM) que atenua as interacções célula-célula, promovendo assim a plasticidade dos tecidos. Em uma cicatriz glial, a expressão intensificada de PSA no cérebro adulto promoveu a migração de precursores neuronais desde a zona subventricular até ao córtex e melhorou o crescimento axonal (El et al. Use of polysialic acid in repair of the central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 16989-16994 (2006). Como descrito, a expressão de PSA aumentada artificialmente em neurônios DA derivados de ES de ratinhos purificados resultou em melhores contagens de células de enxerto, extenso desenvolvimento de fibras neuronais DA no corpo estriado do hospedeiro e, surpreendentemente, maior recuperação comportamental em ratinhos com Parkinson. Além disso, a engenharia genética de neurônios DA derivados de ESC, para apresentarem níveis de PSA na superfície celular aumentados, aumentou ainda a sobrevivência in vivo e desenvolvimento de fibras no corpo estriado hospedeiro. Uma realização de exemplo encontra-se apresentada na figura 29, destinada a aplicação em genes PST de mamíferos, isto é de ratinho ou de ser humano. Outra realização de exemplo, apresentada na figura 29, mostra o uso de PST bacteriano, isto é PSTnm. Especificamente, como presentemente descrito, um maior PSA em células, utilizado em terapia celular à base de neurônios DA maduros encontram-se previsto no tratamento da PD.
[259] Utilização De PST de Rato Para Maior Expressão de PSA. Os resultados in vivo demonstraram maiores extensões neuríticas e uma inversão significativa das rotações induzidas por anfetamina em ratinhos 6-OHDA que receberam enxertos modificados por células-PST de ratinho, enquanto números iguais de células que não tinham modificação PST não conseguiram os mesmos resultados (figura 33). Além disso, observou-se que a melhoria da inervação de fibras DA está correlacionada com um melhor resultado comportamental em um modelo de ratinho PD, tal como quando são feitos pequenos (injeção de aproximadamente 50.000 células) enxertos de células positivos para PSA, proporcionaram integração do enxerto e desenvolvimento de fibras que eram aproximadamente 70% das áreas cobertas em comparação com o uso de enxertos comparativamente maiores (100.000 ou mais células). Uma comparação lado-a-lado de enxertos de neurônios DA derivados de ES com PSA aumentado com neurônios DA derivados de ES tratados com controlo revelou recuperação comportamental no grupo PSA (quando os enxertos se basearam no transplante de 55.000 células cada) mas não foi observada recuperação no grupo das células de controlo. O transplante de 100.000 neurônios DA derivados de ES no cérebro de ratinho revelaram uma recuperação comportamental tanto em neurônios DA derivados de ES tratados com PSA como nos tratados com controlo, sugerindo que os enxertos derivados de 100.000 células são suficientes para re-inervar o cérebro do ratinho sem reforço com PSA. Assim, noutra realização, a expressão modificada da expressão de PSA na superfície de neurônios DA autênticos está prevista para uso em procedimentos de tratamento de doentes com DP. Quando PSA foi induzido nas células neuronais das presentes invenções, foi idêntico ao polímero PSA que ocorre naturalmente nas células encefálicas, assim sendo, ao contrário do uso de moléculas de superfície celular para modificação de tipos de células terapêuticas, prevê-se que as células modificadas para expressão de PSA possuem fraca antigenicidade in vivo quando utilizadas em células para procedimentos de enxerto em seres humanos. Além disso, níveis elevados de PSA em células enxertadas, seja precursores neuronais endógenos (Battista et al., J Neurosci. 30(11):3995-4003 (2010)), células de Schwann (Ghosh et al., Glia. 60(6);979-92(2012)) e neurônios DA derivados de ES das presentes invenções não causam efeitos secundários detectáveis quando utilizadas em uma variedade de modelos de roedores adultos. A expressão modificada de PSA para níveis efetivos envolveu a ação de uma única enzima polissialiltransferase (PST), cujo único produto é este glicopolímero isolado. Surpreendentemente, a quantidade de proteína expressa e a natureza do produto enzimático foi notavelmente constante e muito semelhante ao PSA encontrado naturalmente em tecidos embrionários.
[260] Como presentemente descrito, a expressão de PSA modificada encontra-se contemplada em células neuronais para uso em procedimentos de enxerto. Em particular, PSA está contemplado para uso na preparação de células para uso terapêutico mediante resolução de problemas encontrados durante o uso de outros tipos de expressão de marcadores de superfície celular induzidos. Além disso, o uso da expressão de PSA foi reproduzível em protocolos que cruzam espécies de vertebrados (tais como utilizando genes PST de ratinho expressos em células humanas) porque os respectivos aceitadores têm também uma estrutura consistente entre espécies e encontram-se na maioria das superfícies celulares. A modificação por engenharia de genes PST em hESC para aumentar PSA em neurônios DA. Foi introduzido um gene codificador da polissialiltransferase humana (hPST) em uma linhagem hESC (WA01) utilizando um vector lentiviral (pLenty, Invitrogen) e como presentemente descrito. Foram expandidos vinte clones selecionados e foram analisados quanto à expressão de PST. Os clones hESC expressores de PST foram diferenciados para assegurar que PST não é silenciado nos neurônios DA. A quantificação de PSA-NCAM em estádios diferentes da diferenciação (dia 0, 11, 25 e 50) foi realizada utilizando a análise FACS e imunofluorescência (Operetta). Clones positivos foram sujeitos ao conjunto de parâmetros QC dos neurônios DA esbolados no quadro 7. Pelo menos 3 clones que retêm níveis elevados e uniformes de PSA-NCAM durante a diferenciação e têm boa execução em termos dos parâmetros QC (quadro 7) avançam para a avaliação do desenvolvimento de neurites em neurônios DA derivados de hESC com sobreexpressão de PST. O controlo selecionado e clones hESC sobre-expressores de PST foram diferenciados em neurônios DA, utilizando o protocolo standard descrito presentemente, seguido de fixação celular e análise no dia 25 e 50. O número e comprimento de fibras TH positivas nestas culturas foi quantificado com Microscópio Operetta High Content. O módulo de Análise de Neurites em software Harmony 3.0, quantificou o número de neurites e o comprimento com e sem PST, e os dados foram analisados estatisticamente através de ANOVA com dois fatores. A sobreexpressão PST e clones hESC de controlo derivados de estudos in vitro acima foram diferenciados novamente em neurônios DA e transplantados para um modelo de rato de DP. Foram realizados enxertos de curto prazo (4-6 semanas) para determinar a sobrevivência, expressão PSA-NCAM e desenvolvimento de neurites. Cada clone que passou nos parâmetros in vivo a curto prazo foi sujeito a estudos de enxerto a longo prazo. Nestes estudos, os animais receberam metade ou um quarto da dose padrão (200 x 103) de células. Estes estudos debruçavam- se sobre a possibilidade de mais PSA conduzir a uma maior sobrevivência a longo prazo após o transplante (5 meses) e se um número menor de neurônios DA é capaz de corresponder ou ultrapassar a capacidade funcional de enxertos não PST transplantados a doses de células padrão (figura 27).
[261] Além disso, exames comportamentais complexos, sensíveis à extensão da re-inervação do corpo estriado, foram monitorizados para distinguir o potencial funcional de PST contra enxertos de neurônios DA de controlo. Os animais foram sacrificados após a conclusão dos exames comportamentais e o desenvolvimento de fibras foi quantificado utilizando anticorpos específicos humanos NCAM e SC121 e anticorpos contra TH (ver também a figura 29). A intensidade e disseminação de enxertos hNCAM+, SC121+ e TH+ foi medida, assim como a percentagem de células humanas co-expressoras de marcadores de neurônios DA (TH, FOXA2) e PSA. A densidade da auréola NCAM/TH+ de neurites que emanavam do enxerto foi quantificada a diferentes distâncias. Os dados foram comparados entre grupos, utilizando ANOVA com dois fatores com um teste post-hoc de Bonferroni. Além disso, alguns enxertos foram examinados quanto a alterações qualitativas (por ex. ramificações, espessura, distribuição do enxerto e forma). Além disso, alguns enxertos serão processados para serem submetidos a avaliação eletrofisiológica em fatias (ver figura 26) em termos do fenótipo A9, formação de sinapses com o corpo estriado do hospedeiro, assim como a inervação por aferentes endógenos.• exemplo seguinte mostra a ampliação da expressão com ácido polissiálico que melhorou a função dos enxertos neuronais dopaminérgicos derivados de ES em ratinhos com Parkinson.
[262] As células ES expressoras de GFP sob o controlo do promotor Nurr1 (células Nurr1::GFP ES) foram transduzida com estabilidade, com um vector lentiviral omnipresente expressor de polissialiltransferase (PST). As células transduzidas revelaram um aumento dramático em mARN PST em comparação com os controlos (fig. 30A). Observou-se que a expressão de PST era suficiente para a síntese de PSA em NCAM. Assim, a expressão PSA-NCAM aumentou muito em células modificadas com PST no dia 14 da diferenciação de neurônios DA (fig. 30B-E). Tanto o PSA da superfície celular endógeno como induzido em neurônios DA derivados de ES pode ser removido (fig. 30E) com uma endoneuraminidase fágica (endoN) que cliva especificamente os polímeros de ácido siálico com ligação alfa-2,8 única do PSA. Surpreendentemente, não se observou que a transdução PST afetasse a expressão de marcadores neuronais ou mesencefálicos nos neurônios DA purificados com GFP (fig. 3OF).
[263] Outros estudos em ratinhos hemiparkinsonianos lesionados com 60HDA revelaram que o transplante de aproximadamente 100.000 precursores de neurônios DA derivados de ES é necessário para produzir uma recuperação funcional robusta, como foi medido através do teste de rotação intensificado com anfetamina. Nos presentes estudos, procura-se enxertar um número de células abaixo do ideal a fim de se conseguir atingir o aumento através de expressão PSA ampliada. A fim de transplantar populações de neurônios DA muito enriquecidas, isentas de células pluripotentes contaminantes, culturas purificadas FACS no dia 14 da diferenciação para expressão de GFP estimulado por Nurr1 e ausência de expressão de SSEA-1 (figura 31). Sem sobreexpressão PST, uma redução do tamanho do enxerto minimamente eficiente para metade (55.000 células DA Nurr1+) não foi capaz de produzir uma recuperação comportamental detectável. Em contraste, com uma expressão PSA ampliada, o mesmo número de neurônios DA Nurr1/PST teve como resultado uma correção significativa da incapacidade comportamental PD (p < 0,01, ANOVA com dois fatores) com recuperação completa aproximadamente 5 semanas após a cirurgia (figura 32A). A remoção PSA antes do transplante por meio de incubação com endoN indicou a especificidade da ampliação com PSA, na medida que o tratamento endoN inverteu parcialmente a restituição funcional obtida com Nurr1/PST (figura 32A).
[264] Para examinar as características das células enxertadas, a imuno- histoquímica dos animais foi processada dois meses após o transplante. Verificou- se uma diferença quanto ao número de neurônios Nurr1+ sobreviventes, na medida em que os animais enxertados com a linhagem transduzida com PST apresentavam em média o dobro das células GFP do que os animais enxertados com células de controlo (9.300 +/- 1.400 vs. 4.230 +/- 1010 células GFP+ por enxerto em amostras de controlo contra PST respectivamente; a figura 32B, p < 0,05, teste t de Student). Além disso, os enxertos Nurr1/PST apresentam também níveis mais elevados de expressão PSA in vivo (figura 32C,D). No entanto, as proporções de células expressoras dos marcadores DA do mesencéfalo TH e Foxa2, no núcleo do enxerto, foram comparáveis às células Nurr1 e Nurr1/PST (TH: 62,0% +/- 8,0 vs. 51,3%+/- 7,0 p = 0,33; FoxA2: 63,2% +/- 8,6 vs. 55,4% +/- 2,0, p = 0,3, respectivamente; Figura 32E).
[265] Os processos neuronais que emergiram das células Nurr1 e Nurr1/PST revelaram níveis comparáveis de TH, Girk2 (acoplado a proteína G, canal de potássio com retificação interna) e sinapsina (figura 33 A). Ao contrário de outros estudos com células de Schwann transplantadas (Ghosh, et al. Glia 60, 979-992 (2012)), a expressão PSA ampliada pouco afetou a migração de células DA a partir do local do enxerto. No entanto, verificaram-se alterações evidentes no desenvolvimento dos neurites. Como se mostra na figura 33B, houve mais processos neuronais DA que emergiram das células Nurr1/PST comparativamente com os controlos Nurr1. Quando a intensidade da imunofluorescência GFP e TH foi quantificada em cinco zonas de 100 μm sucessivas afastadas do transplante, os enxertos Nurr1&PST apresentavam uma densidade de processos relativa muito superior (figura 33C,D, p< 0,01 tanto para GFP como TH, ANOVA com dois fatores). Na quantificação deste efeito, normalizou-se a densidade relativa dos processos com a densidade observada na zona mais proximal imediatamente junto ao núcleo do enxerto. Esta normalização foi necessária para compensar o maior número de células sobreviventes nos enxertos Nurr1/PST e confirmar um efeito específico do PSA no desenvolvimento de neurites. Ficou também demonstrada especificidade com a remoção do PSA da superfície celular por meio de tratamento com endoN antes do enxerto.
[266] Assim, o pré-tratamento com endoN reduziu o desenvolvimento de fibras distais até aos níveis do controlo (figura 33E).
[267] Estas descobertas revelaram que pelo menos alguns dos efeitos do PSA na funcionalidade do enxerto resultaram de uma inervação maior das fibras no corpo estriado. Assim, verificou-se uma forte correlação entre a funcionalidade do enxerto e a extensão relativa do desenvolvimento de fibras positivo para GFP, por exemplo na zona IV (figura 33F; p < 0,001, r2 = 0,65, n = 17). Surpreendentemente, a relação desenvolvimento de fibras/comportamento foi consistente para os grupos experimentais (controlo, PSA aumentado e tratado com endoN), indicando que a inervação enxerto-hospedeiro constituiu um parâmetro da recuperação comportamental no modelo de ratinho com Parkinson. Em termo mecânicos, vários fatores contribuíram para aumentar o desenvolvimento de fibras, tais como a maior penetração da zona de células glia reativas encapsuladoras do núcleo do enxerto, maior capacidade de desenvolver novas ramificações, melhor desenvolvimento nos tecidos do hospedeiro vizinhos (por enxerto, translocação do cone de crescimento mais fácil) e prevenção de ligações prematuras com o tecido do hospedeiro na proximidade do núcleo do enxerto. Os mecanismos de exemplo são consistentes com a função do PSA na facilitação do desenvolvimento do processo durante o desenvolvimento normal e no sistema nervoso do adulto.
[268] As experiências descritas demonstraram o uso de PSA modificado no enxerto de neurônios DA, que proporcionou resultados superiores em comparação com os enxertos de outros tipos de células. Os dados indicam claramente que a ampliação com PSA proporcionou um significativo aumento da capacidade de inervação dos neurônios DA enxertados no corpo estriado do hospedeiro e atenuam as deficiências funcionais PD. Por conseguinte, a tradução clínica está contemplada, compreendendo os neurônios DA das presentes invenções para proporcionar células antes do transplante. Em algumas realizações, as células serão geneticamente manipuladas para expressarem PSA. Em algumas realizações, PST pode ser apresentado diretamente nas células através da exposição à enzima purificada e substrato, in vitro, antes do transplante. Em algumas realizações, a estratégia PSA para a tradução humana em enxertos PD está prevista para minimizar a necessidade de múltiplas injeções e reduzir assim os riscos cirúrgicos resultantes destas múltiplas injeções.
[269] Noutras realizações, esta tecnologia está contemplada para uso noutros tipos de células e espécies, por exemplo, no aumento da migração de células de Schwann enxertadas na criação de uma ponte (por exemplo, comunicação célula- célula) para o crescimento de novo de axónios no local da lesão da medula espinal.
[270] Seguem-se exemplos de materiais e métodos utilizados neste exemplo.
[271] Animais: Ratinhos 129S3/SvImJ de seis semanas de idade (Jackson Laboratory) foram mantidos sob temperatura controlada, com alimento e água disponíveis ad libitum. Foram executados procedimentos experimentais de acordo com as diretrizes NIH e de uso de animais institucionais, aprovadas pela Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) local e pelo Institutional Biosafety Committee (IBC).
[272] Teste induzido por injeção de 60HDA e anfetaminas: Os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio (10 mg/kg) e foram injetados no corpo estriado direito com 2 μl de 60HDA (4 μg/μl em soro fisiológico, 0,5% de ácido ascórbico). As injeções foram executadas com uma seringa de Hamilton nas seguintes coordenadas: 0,5 mm posterior, 1,8 mm lateral relativamente ao bregma e 2,5 mm ventral em relação à superfície do cérebro. Antes da cirurgia os animais receberam uma única injeção i.p. de desipramina (25 mg/kg, Sigma). Duas semanas após a cirurgia os animais foram classificados com o teste da rotação induzida por anfetamina. Foram colocados em cilindros de plástico transparentes, de 30 cm de diâmetro durante meia hora, após o que receberam uma única injeção i.p. de anfetamina (10 mg/kg, Sigma). Ao fim de 20 min, o número de rotações ipsilaterais/contralaterias foram pontuadas durante mais 20 min. Os animais foram pontuados uma vez por semana durante sete semanas, depois foram profundamente anestesiados e perfundidos através do coração com PBS e 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4). Foram removidos os cérebros e foram afixo de um dia para outro a 4 °C em 4% de paraformaldeído, depois o vibrátomo cortou fatias (Pelco-101, Ted Pella) em secções digitais de 40 μm de espessura.
[273] Diferenciação e transplante celular: Uma linhagem celular relatora ES de ratinho BAC transgénico ANurrl::GFP BAC (isto é, expressão GFP é impulsionada pelo promotor Nurr1) 5 foi transduzida com um lentivírus (pLenti, Invitrogen) contendo o gene PST de ratinho sob o controlo do promotor CMV. As células foram propagadas em MEFs tratados com mitomicina C (StemCell Technologies) em DMEM (Invitrogen), 10% FBS (HyClone) suplementado com 1.400 unidades /ml de LIF (ESGRO; Invitrogen), 2 mM L -glutamina, 1 mM p- mercaptoetanol, 100 U/ml penicilina e 100 μg/ml streptomicina (Invitrogen). A diferenciação DA foi induzida de acordo com Barberi et al., Nat Biotechnol 21, 1200- 1207 (2003), com modificações. Em resumo, as células foram diferenciadas em células alimentadoras MS5, em placas cobertas de gelatina (10.000 células/prato de 10 cm) e cultivadas durante quatro dias em meio com substituição de soro (SRM). No dia 4, adicionou-se Sonic hedghog (SHH, 200 ng/ml) e FGF8 (100 ng/ml). No dia 7 da diferenciação, os meios foram alterados para N2 suplementado com SHH, FGF8 e bFGF (10 ng/ml). No dia 11, foi induzida a diferenciação terminal com remoção de SHH, FGF8 e bFGF e a adição de ácido ascórbico (AA, 200 nM) e BDNF (20 ng/ml).
[274] As células foram colhidas no dia 14-15 com tratamento com acutase durante 45 minutos, lavadas uma vez com N2 e incubadas com anticorpo anti- SSEA-1 conjugado AlexaFluor-647 (BD Pharmingen) durante 25 min. As células foram lavadas uma vez com N2, ressuspensas em tampão HEPES com 0,1% BSA. Adicionou-se DAPI para avaliar a viabilidade. Foi executado FACS com um classificador de células MoFlo e a população de interesse foi classificada por fluorescência com GFP (Murr1). A população positiva para AlexaFluor-647 (SSEA- 1) foi negativamente classificada. Para controlo negativo com GFP, foram utilizados células ES de ratinho J1 na mesma fase de diferenciação.
[275] Células classificadas com Nurrl: :GFP foram analisadas quanto à viabilidade e ressuspensas em N2 com BDN e AA até atingir uma concentração final de 55.000 células/pl. Uma foi injetada no corpo estriado do ratinho lesionado com um capilar de vidro fino de ponta de 50 μm nas coordenadas: 0,3 mm posterior, 1,5 mm lateral relativamente ao bregma e 2,2 mm ventral em relação à superfície do cérebro. Re-semeou-se uma alíquota da suspensão de células em placas de 6 mm revestidas com matrigel para caracterização mais aprofundada.
[276] Quanto à análise por imunoluminescência, as células foram fixadas com paraformaldeído durante 10 min a 4 0 C, lavadas por duas vezes com PBS, bloqueadas com 5% BSA (0,1% de Triton X-100 em PBS) e incubadas com anticorpos primários durante 2 h à temperatura ambiente: coelho anti-GFP coelho (1:1000, Invitrogen), IgM de ratinho anti-PSA (1:2000, 5A5), ratinho anti-NeuN (1:800, Chemicon), ratinho anti-TH (1:1000, Sigma), cabra anti-FoxA2 (1:800, Santa Cruz), cabra anti-Engrailed (1:800, Santa Cruz). As células foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com Cy (1:1000, Jackson).
[277] Tratamento com endoN: Para remover PSA de NCAM, na noite anterior à colheita as células foram tratadas com 20 unidades de endoN, uma enzima fágica que remove especificamente PSA 7-9. As células foram depois colhidas e injetadas como descrito anteriormente, mas foram ressuspensas me N2 com BDNF e AA e 5 unidades de endoN. Avaliámos anteriormente que a injeção da mesma quantidade de endoN apenas nos ratinhos lesionados não melhorava o comportamento do animal. Análise PST mARN e PSA-NCAM in vitro: Para a análise com mancha de Western, as células foram tratadas com tampão WB (PBS com 1% NP40, NaCl 150 mM , EDTA 1 mM e 1x inibidores protease/fosfatase adicionados imediatamente antes da extração, a pH de 7,4) e sonicados por duas vezes durante 5 seg., centrifugados e ressuspensos em tampão Laemli (LB). Foram guardadas alíquotas sem LB para determinação das proteínas. Foram carregadas quantidades iguais de proteína em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida de eletroforese (BioRad). As proteínas foram transferidas por eletroforese para membranas de polivinilideno (Milipore). As membranas foram bloqueadas durante 1 - 6 horas em 0,1 % de Triton X-100 TBS (TBS-T) com 5% de leite em pó desnatado e incubadas de um dia para outro com anticorpo NCAM (1:10.000, Santa Cruz) em TBS-T com 5% de leite. As manchas foram depois incubadas com anticorpo secundário conjugado a peroxidase (1:10.000 Jackson) e detectadas pelo método de detecção ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Os níveis de proteína foram quantificados recorrendo ao software ImajeJ.
[278] Para análise qRT-PCR, foi extraído o ARN total com Trizol (Sigma), submetido a transcrição inversa (Qiagen) e amplificado com 10 μl de 2 x a mistura reacional SYBR e 0,2 μM de iniciadores diretos e inversos até atingir um volume final de 20 μl. Para análise PSA-NCAM FACS, as células foram colhidas com tratamento acutase durante 45 min, foram lavadas uma vez e incubadas com IgM de ratinho anti-PSA (1:250. 5A5) durante 25 min em gelo, foram lavadas uma vez com meio N2 e incubados com conjugado Cy3 anti-IgM de ratinho (1:250, Jackson) durante mais 25 min em gelo. As células foram lavadas uma vez com N2 e ressuspensas com 0,1% BSA com 7AAD e foram analisadas em um separador de células Calibur FACS.. Como controlo não foi adicionado anticorpo primário.
[279] Procedimentos imuno-histológicos e estereológicos: Secções coronais soltas foram bloqueadas em 0,1% de Triton X-100, 5% de soro de burro em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente e foram incubadas durante 48 horas a 4 °C com diferentes anticorpos: coelho anti-GFP (1:300), galinha anti-GFP (1:200, Chemicon), ratinho anti-TH (1:200), IgM ratinho anti-PSA (1:1000), anti-NeuN (1_400), cabra anti-FoxA2 (1:300), coelho anti-Girk (1:300, Alomone Labs), ratinho anti-sinapsina (1:200, BD Transduction Laboratories). Secções foram depois lavadas e incubadas com anticorpos secundários: Anticorpos de burro conjugados a Cy2, Cy3 e Cy5 (1:400, Jackson). Para PSA foi utilizado um burro anti IgM conjugado a Cy5 (1:500 Jackson). As incubações foram executadas durante 2 horas à temperatura ambiente. As secções foram lavadas por duas vezes em PBS e montadas em Mowiol (Calbiochem). Uma em cada três secções coronais do cérebro foram analisadas por cada imunomarcação. Foram recolhidas imagens digitais com um microscópio confocal laser Zeiss LSM 510, com três lasers (Argon 488, HeNe 543 e HeNe 633), com uma objetiva c-Apochromat 40 x (imersão em água). Foi contado o número de células GFP+ e TH+ em secções uma-em-três, englobando a totalidade do cérebro sob uma objetiva 40x e foi estimado o número total de célula/enxerto. Células com dupla marcação foram analisadas em planos ópticos simples, através de todo o eixo Z.
[280] Para a análise da percentagem de células mercadas com GFP/TH+ e GFP/FoxA2+, 100 células GFP+ foram analisadas por cada marcador. Para a análise do processo de desenvolvimento, foram executados varrimentos confocais z com intervalos de 0,8 μm ao longo de todo o eixo Z (20-40 μm) com uma abertura de 1 μm, com uma objetiva de 40x. As secções foram analisadas a partir do ponto da injeção, lateralmente até já não serem observados quaisquer processos. Projeções 3D englobando a totalidade da área analisada foram sequencialmente comparadas. Para a análise de intensidade GFP e TH, dividiu-se a totalidade da área analisada em cinco zonas de 100 μm sucessivas a partir do transplante e as intensidades foram medidas com software ImageJ. Os dados foram normalizados quanto à intensidade na zona mais próxima do enxerto (zona I) até ao controlo, para detectar quaisquer potenciais diferenças no tamanho do enxerto.
[281] Análise Estatística: Os dados são apresentados como o erro padrão médio ± da média (SEM). Foram executadas comparações segundo o teste de Student ou análise ANOVA com dois fatores, seguido do teste post-hoc de Bonferroni. Foi executada uma regressão linear e foi quantificada com a correlação de Pearson.
[282] C. Sobre-Expressão do Gene PST Humano (Polissialil Transferase).
[283] Grupos de animais lesionados receberam uma de 3 doses de células de tipo selvagem ou células
[284] expressoras de PST ou pré-tratadas com enzima PST. Estes foram submetidos a testes comportamentais, segundo os paradigmas discutidos no quadro 11 (rotações induzidas por anfetaminas, teste do cilindro, teste de marcha). As doses escolhidas (por exemplo 20.000, 100.000, 50.000 células) foram utilizadas com êxito em ratinhos, de forma que os neurônios resultantes revelaram os resultados presentemente descritos para os genes PST de ratinho.
[285] D. Administração Direta da Enzima PST Purificada em Células. Por outras palavras, um método não-transgénico da indução PSA. O pré-tratamento de células com a enzima PST, que resulta na polissialilação e maior expressão de PSA à superfície. Embora PST de mamífero sejam proteínas de membrana pouco abundantes, que funcionam no aparelho de Golgi, a α-2,8-polissialiltransferase de Neisseria meningitides (PSTnm) funcionou em um ambiente extracelular, com a aplicação de um substrato não-tóxico à venda (isto é, ácido CMP-iálico) e produziu um polímero quimicamente idêntico ao PSA de mamífero. A título de exemplo, um fragmento ativo desta enzima foi eficaz para adicionar PSA a proteínas terapêuticas in vitro, para aumentar a farmacocinética in vivo. Na presença de ácido CMP siálico, o PSA foi sintetizado diretamente por PST nas superfícies de uma grande variedade de tipos de células in vitro, incluindo de ratinho e ESCs humanas (figura 35A-E). A injeção direta de PSTnm e substrato in vivo desencadeia uma maior acumulação de PSA nas superfície das células nas regiões do cérebro de um adulto, incluindo o córtex cerebral, corpo estriado e medula espinal (figura 35GH). O PSA produzido por PSTnm degradou com endoN (figura 35B), o que removeu o PSA induzido, demonstrando que o PSA produzido por PSTn possui propriedades comparáveis ao PSA endógeno (figura 35A, C, D). A expressão de PSA através de PSTnm ocorrem em menos de uma hora, o que ultrapassou a indução transgénica PST lenta. A expressão persistiu por várias semanas in vivo, após o que os marcadores PSA foram reduzidos, ultrapassando assim os efeitos secundários da indução prolongada de um transgene PST. Por conseguinte, o uso da exposição celular in vitro ao substrato PSTnm+ está contemplado como simples estratégia alternativa para desencadear níveis de PSA aumentados em neurônios DA derivados de hESC e outros tipos de células para uso em procedimentos de enxerto. Em parte, esta abordagem alternativa à tradução, isto é, uso de procedimentos de enxerto humano, tem a vantagem de ser de natureza não-invasiva, isto é evitar o uso de métodos transgénicos, são empregues nestes procedimentos reagentes de nível GMP para corresponder aos protocolos de uso clínico, e ter uma natureza transitória da expressão de PSA gerada bioquimicamente, que corresponda ao intervalo de tempo previsto para que as fibras DA partam do núcleo do enxerto e penetrem no cérebro do hospedeiro, o que é necessário para evitar efeitos secundários perigosos do uso de células modificadas para enxertos.• exemplo seguinte mostra a modificação enzimática de PSA em neurônios DA derivados de hESC, utilizando a polissialil transferase bacteriana purificada, PSTnm, para aumentar a eficácia do transplante.
[286] Embora a transfecção eficiente do gene PST necessitasse de modificações genéticas de hESC com controlo limitado da duração da polissialilação. Este exemplo descreve a descoberta de PSA induzido por PSTnm externo, em vez da aplicação do gene (ver, figura 35). Na figura 35A, células de Schwann (SC) tratadas com PST (linha verde-linha média) apresentavam um tempo de aderência maior, enquanto o PSA produzido por PSTnm induziu a aderência. Em particular, (A) PSA produzido por PSTnm inibiu a adesão de células de Schwann em suspensão à monocamada de células de Schwann com uma eficácia ainda maior (linha vermelha-linha inferior) do que o PSA produzido por expressão forçada de PST (linha verde-linha média). (B) Imunocoloração de PSA em mononeurônios HB9 derivados de ESC, mostra que as amostras de controlo tratadas só com PSTnm apresentavam níveis indetectáveis de PSA. A incubação com substrato PSTnm+ ácido CMP-sialico produz uma banda PSA larga, que é removida com tratamento endoN. (C, D) Similar aos efeitos obtidos com o gene PSTm a polissialilação destas células por PSTnm e substrato durante a diferenciação aumenta o desenvolvimento de neurites e a migração celular (setas). (E) imunocoloração PSA dos neurônios DA derivados de hESC no dia 30. (F) Esta coloração é significativamente aumentada após o tratamento com PSTnm e substrato. (G) Injeção in vivo só de PSTnm não produz efeito, enquanto a co- administração deste com substrato (H) produz grandes quantidades de expressão de PSA no corpo estriado de ratinho.
[287] Deste modo, neurônios DA maduros, tratados externamente com PSA estão contemplados para udo na produção de células para enxerto. Tanto PST de mamífero como PSTnm produziram cadeias quimicamente idênticas a PSA. Maior PSA em neurônios DA derivados de hESC (figura 35F) devem persistir por várias semanas, o suficiente para as fibras DA partirem do núcleo do enxerto. Porque PSTnm é removido antes do enxerto, a imunogenicidade relativamente a estas enzima contaminadora das células enxertadas não deverá ser um fator interveniente.
[288] PSTnm foi produzido a partir de um fragmento modificado com características de maior solubilidade e atividade (Willis et al., Characterization of the alpha-2,8- polysialyltransferase from Neisseria meningitidis with synthetic acceptors, and the development of a self-priming polysialyltransferase fusion enzyme. Glycobiology 18, 177-186 (2008)). As culturas de hESC foram induzidas para se diferenciarem em neurônios DA antes da exposição a PSTnm, exposição ao substrato ou ambos. As culturas foram examinadas em momentos diferentes da exposição (10 min a 6 h) por meio de imunofluorescência quantitativa (Operetta) e coloração de Western, para determinar a velocidade e níveis de polissialilação. Assim, neurônios DA derivados de hESC diferenciados no dia 25 serão incubados com as concentrações ideais de PSTnm e substrato, utilizando as condições descritas presentemente. Neurônios PSA+ mDA serão transplantados em análises a curto e longo prazo, como descrito presentemente e figura 29.
[289] E. Aplicações Para Lesões Na Medula Espinal Vários estudos orientados para um eventual uso em doentes humanos e estratégias descritas nestes revelaram um vasto potencial destes procedimentos, incluindo administração de genes PST por meio de injeção de vectores lentivirais expressores de PST diretamente no SNC para promover a regeneração do axónio e migração endógena de progenitores. Uma estratégia destas para aplicação em procedimentos em seres humanos está orientada para lesões da medula espinal. Em um tipo de procedimento de regeneração da medula espinal, foram utilizados enxertos de células de Schwann como parte da terapia para reconstituição das pontes celulares, para utilização na regeneração in vivo de axónios. No entanto, a recuperação da função locomotora por parte do doente, incluindo controlo muscular fino, resistiu a qualquer intervenção terapêutica. Como se mostra, aumentar a expressão PSA de células de Schwann utilizadas para enxerto teve como resultado um aumento da migração de células de Schwann e desenvolvimento axonal e ainda em efeitos dramáticos no aumento da função locomotora (figura 30A-D). Assim, em algumas realizações, aumentar a expressão PSA em células de Schwann in vitro está previsto para uso em procedimentos de enxerto em seres humanos com lesões na medula espinal. Outra estratégia para uso da expressão modificada de PSA por meio de expressão intensificada de genes PST em procedimentos com seres humanos envolveu motoneurônios derivados de HB9 ESC, em que a introdução do gene PST nestes neurônios através de expressão do gene baseado no vector lentiviral resultou em um aumento dramático no desenvolvimento de axónios tanto na cultura e após o enxerto em ratinhos para reparar uma lesão induzida mecanicamente no nervo ciático. Este último caso resultou em uma melhor orientação específica do tecido muscular (figura 30E-H). Assim, noutra realização, a expressão modificada da expressão de PSA na superfície de motoneurônios derivados de ESC está prevista para uso na restauração da função do nervo ciático. IVX. Maior Segurança dos Enxertos de Neurônios DA.
[290] As realizações contempladas para reduzir ainda mais os riscos em doentes, destinadas a utilização em métodos de produção de células da presente invenção encontram-se descritas abaixo.
[291] Embora as células produzidas através dos métodos presentemente descritos tenham demonstrado como característica apresentarem riscos reduzidos em doentes quando utilizadas em enxertos, estão previstos os anticorpos adicionais para reduzir ainda mais a possibilidade de risco para a saúde dos doentes receptores das células enxertadas. Uma das várias preocupações para os procedimentos terapêuticos com células à base de hESC reside na possibilidade de introduzir células indiferenciadas contaminadoras que resistem à diferenciação e que, em condições pós-enxerto, se desenvolvem em células prejudiciais para o doente. No caso de uma célula pluripotente, um resultado prejudicial será a formação de teratomas que põem em risco a vida do doente. A formação de teratomas utilizando, células derivadas de hESC foi registada na sequência de protocolos de diferenciação neural a curto prazo. No entanto, o uso dado pelos autores da presente invenção dos tipos de células neuronais derivadas de ES humano, ao contrário dos equivalentes derivados de ESC de ratinho, raramente resultaram na formação de teratomas na sequência de estratégias de diferenciação neuronais inadequadas, como descrito na presente invenção (isto é cultura em monocamada, protocolo de inibição SMAD duplo e desenvolvimento em citoquinas que não promovem a proliferação). Efetivamente, após a análise de várias centenas de animais com enxertos de células humanas, recorrendo a uma variedade de estratégias de diferenciação neuronal ao longo dos últimos 10 anos, não foi observada a formação de teratomas. Além disso, os teratomas não foram observados em procedimentos de transplante PD das presentes invenções, utilizando enxertos de células humanas. Prevê-se que a diferença entre o uso de células humanas contra células de ratinho para procedimentos de enxerto, para uso em seres humanos esteja relacionada com os diferentes estádios da pluripotência capturada em ESC humanos contra os de ratinho, pensando-se que as células humanas correspondam às propriedades de um estádio pluripotente descrito como Epi-SC, ao contrário das ESC de ratinho que se podem encontrar em um estádio de desenvolvimento diferente.
[292] No entanto, pelo menos um dos problemas utilizando células de estudos de transplantes anteriores residiu no risco continuado de sobredesenvolvimento neural que é substancial em Perrier et al., PNAS 2004 e protocolos similares que estão surpreendentemente ausentes quando se utilizam neurônios DA maduros e métodos de transplante das presentes invenções. Além disso, outros problema detectado nos testes com enxertos em estudos anteriores residiu na formação de estruturas neuroepiteliais derivadas de hESC (isto é tipo roseta neural) que continuam a proliferar in vivo. Esta expansão in vivo de células neuroepiteliais enxertadas foi observada em vários paradigmas de transplante neuronal, incluindo estudos sobre o transplante de neurônios DA derivados de hESC em modelos de roedores com Doença de Parkinson e de Huntington. Estas células proliferantes “tipo rosata neuronal” representam célula primárias não-transformadas com um potencial de crescimento intrínseco elevado, que resultaram e grandes enxertos constituídos por tecido ectópico, na sua maior parte de tipo cortical em animais enxertados. Como presentemente descrito, foram utilizados várias estratégias para eliminar as células pluripotentes ou neuroepiteliais contaminantes no momento do enxerto (por exemplo, a seleção de SSEA-4 (marcador pluripotente) ou Forse-1 (marcador neuroepitelial). Estas estratégias tiveram êxito parcial com o uso de estratégias de diferenciação à base de rosetas e foi ainda observado sobredesenvolvimento neuronal em um subconjunto de enxertos selecionados por Forsel ou selecionados negativamente por SSEA-4. Surpreendentemente, com o desenvolvimento destes procedimentos de diferenciação de neurônios DA mais à base de placa basal do que à base de roseta, foi ultrapassada a questão do desenvolvimento neuroepitelial. Foram raramente observadas células proliferantes derivadas do enxerto com enxertos de neurônios DA derivados de placa basal hESC funcionais.
[293] Com base nos resultados adversos de outros procedimentos de enxerto, outras preocupação de segurança para uso de enxertos neuronais DA em seres humanos são os efeitos secundários da terapia, tais como a ocorrência de disquinésia induzida pelo enxerto (graft-induced dyskinesia - GID) observado em cerca de 15% dos doentes que receberam tecido fetal em experiências com transplantes. No entanto, como discutido aqui, uma ausência quase total de células serotonérgicas derivadas do enxerto, em conjunto com o uso de uma fonte de células mais consistente com a possibilidade de esgotar ainda mais tipos de células indesejados (ver, texto associado com a figura 28) e a possibilidade de controlar a distribuição de fibras DA in vivo (ver figura 29, isto é, prevenção de “hot spots” de aglomerações neuronais que segregam L-Dopa e outros compostos) constituem vantagem essenciais no uso dos métodos das presentes invenções em relação a outros métodos para proporcionar células para uso em procedimentos de enxerto. Assim, está previsto o uso dos métodos da presente invenção para minimizar o risco em doentes.
[294] VX. Uso de ESCs Humanos para Tradução Clínica.
[295] Em realizações preferidas, está previsto o uso de ESC humanas em métodos de produção e utilização de células destinadas a procedimentos de enxerto em seres humanos, por outras palavras, a terapia celular para o tratamento de PD. Em particular, as ESCs humanas têm em umerosas vantagens em relação ao uso de iPSCs humanas em métodos das presentes invenções, tais como, por exemplo, para uso na apresentação de neurônios DA do mesencéfalo enxertáveis para uso como terapia celular para PD. Em particular, o uso de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) como fonte de células para derivação de neurônios DA tem várias vantagens, tais como proporcionar uma fonte de células com geneticamente coincidentes para cada doente. No entanto, um número de estudos recentes criaram incertezas relativamente à segurança e plena compatibilidade genética de iPSCs. Ficou demonstrado que as células reprogramadas contêm anomalias genéticas e epigenéticas potencialmente perigosas, que são indesejáveis para utilidade clínica. Além disso, trabalhos com iPSC de ratinho demonstraram que as células derivadas de iPSC não são totalmente imunocompatíveis, o que constitui o principal argumento de apoio do uso destas no transplante humano. Além disso, não existem procedimentos aprovados pela FDA que utilizem iPSCs para enxertos. Finalmente, seria impraticável e proibitivo em termos de custos prever a geração de bancos de células compatíveis com GMP e totalmente controladas por QC para cada doente individual. Em comparação, a estabilidade genética de hiPSCs em comparação com hESC foi intensamente estudada. Embora se tenha observado que as hESC adquiriram mutações ao longo do tempo em cultura, o tempo e a taxa destas mutações diferia aparentemente de hiPSCs, sendo as hESC consideradas em geral mais estáveis em termos genéticos do que as iPSCs, por exemplo, ver, Hussein, et al., Nature 471, 58-62 (2011); Mayshar, et al. Cell Stem Cell 7, 521-531 (2010); Lister, et al. Nature 471, 68-73 (2011); Laurent, et al. Cell Stem Cell 8,106-118 (2011). Adicionalmente, foram concebidos procedimentos cirúrgicos padrão para várias linhagens hESC que satisfaziam testes rigorosos de segurança exigidos pela FDA para produtos para terapias celulares e genéticas. A FDA aprovou dois grupos nos Estados Unidos para avançarem com terapias celulares à base de hESC para uso clínico. Por exemplo a Geron Corporation iniciou um estudo de fase I com células precursoras oligodendrócitas derivadas de hESC (GRNOPC1) e a Advanced Cell Technology (ACT), Inc. tem atualmente dois estudos de fase I/II com células epiteliais pigmentadas da retina, derivadas de hEC, para o tratamento da distrofia macular de Stargardt (estudo NCT01345006) e degenerescência macular senil seca avançada (estudo NCT01344993).
[296] Finalmente, o facto de ambos os estudos clínicos à base de hESC, aprovados pela FDA, estarem orientados para distúrbios do sistema nervoso demonstra as vantagens do uso de métodos à base de hESC para se obter material de enxerto para o tratamento de doenças e lesões do sistema nervoso. O sistema nervoso é considerado como um local privilegiado do ponto de vista imunológicos, dado que os tecidos exógenos (aloenxertos) desencadeiam fracas respostas imunitárias em comparação com o mesmo enxerto colocado na periferia. Efetivamente, ao fim de vinte e cinco anos de transplantes de células fetais em cérebros humanos, constatou-se que alguns neurônios alogénicos sobreviveram durante mais de 16 anos no cérebro humano com imunossupressão transitória. Por conseguinte, aparentemente não é essencial a coincidência antigénica idêntica entre uma fonte celular e os receptores do enxerto. Assim, hESCs estão contemplados como fonte universal alogénica de neurônios DA para o tratamento de Pd, para além de outras doenças, distúrbios e lesões do sistema nervoso. Está previsto que os doentes que receberam células das presentes invenções apresentem um diagnóstico clínico de PD. Prevê-se o uso de enxertos de neurônios DA autênticos na intervenção em PD precoce e moderada-a-grave, incluindo doentes com um controlo sintomático insuficiente com as medicações disponíveis, tais como levodopa, medicação concomitante, etc. Em algumas realizações, os doentes destinados a receber enxertos de neurônios apresentam sinais subtis de PD precoce( por ex. através do uso de neuroimagiologia para detectar deficiências dopaminérgicas, FDG-PET e sinais de disquinésia, etc. Disquinésia conforme uma medição segundo a escala de classificação de disquinésia unificada (UDysRS) (Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2398-2403 (2008)) está contemplada para uso na monitorização de doentes antes e depois do enxerto. Os doentes podem ainda apresentar “exames sem evidências de deficiências dopaminérgicas” (SWEDDS), podendo alguns apresentar distonia ou tremor essencial. Deve ser realizada uma IRM ao cérebro para identificar os doentes com outros fatores (não-dopa) que contribuem para o parkinsonismo. Em algumas realizações, os doentes devem ter uma resposta positiva ao levodopa. Determinação dos parâmetros pré e pós- transplantes e resultados para a monitorização do sujeito, tais como avaliação motora, avaliação não-motora, qualidade de vida e ainda uso de neuroimagiologia e outros biomarcadores. Função motora: São frequentemente aplicados UPDRS e MDS-UPDRS recém-validado (Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2129-2170 (2008)) para a medição de sintomas motores de PD. No entanto, outros testes, incluindo testes de marcha durante 10 m ou 6 m, tempo para levantar e andar, avaliação da postura funcional, alcançar funcional e outros estão contemplados para medições adicionais de resultados orientados para o doente. Os doentes devem ser testados em estado “off” e “on”, e as escalas devem ser incluídas para o tempo “off” (por exemplo segundo as recomendações da Movement Disorder Society, baseadas nas propriedades clinimétricas de escalas de desgaste validadas (Antonini, et al. Mov Disord. 26, 2169-2175 (2011)) e escalas de classificação da disquinésia (por exemplo, UdysRS (Goetz, et al., Mov Disord. 23, 2398-2403 (2008)). Está previsto o registo vídeo de exames padrão dos doentes, tanto em estado “on” como “off”. Função neuro-motora: As medições estão orientadas principalmente para os resultados cognitivos, psiquiátricos e disautonomia para além de sintomas cognitivos, depressão, ansiedade, apatia, sono, fadiga, psicose e outros sintomas não-motores antes e depois do enxerto. Qualidade de vida: Estão previstos questionários específicos para PD (PD-QUALIF) e/ou escalas de medição do nível de qualidade de vida devidamente validados, tais como o SF-36, para monitorizar os resultados dos doentes.
[297] Neuroimagiologia e outros biomarcadores: A imagiologia funcional tem sido muito utilizada em experiências clínicas em PD. Enquanto a imagiologia à base de dopamina (tal como FDOPA-PET) está prevista para utilização no exame da manutenção de enxertos, as técnicas de neuroimagiologia empregando outros ligandos estão contempladas para uso incluindo marcadores à base de imagiologia, por exemplo, orientadas para a inflamação, e marcadores sistémicos não- imagiológicos como recolha exploratória de dados. A imagiologia encontraria uso no planeamento pré-operatório por ex. a extensão e localização do esgotamento de DA nos gânglios basais e incorporação de dados PET na personalização do planeamento cirúrgico para cada doente. Localização do posicionamento do enxerto e número de depósitos de células. Em algumas realizações, o putâmen (Freed, et al. N. Engl. J. Med. 344, 710-719 (2001); Lindvall, et al. Prog. Brain Res. 82, 729-734 (1990) e putamên pós-comissural (Olanow, et al. Ann. Neurol. 54, 403414 (2003)) são locais de enxerto celular (administração). Em algumas realizações, estão previstas aplicações múltiplas através de diferentes vias cirúrgicas. Está prevista a utilização de IRM com um sistema Clearpoint, que proporciona imagiologia em tempo real e visualização da trajetória e precisão para a monitorização das células enxertadas. Este sistema é utilizado no posicionamento de eléctrodos Deep Brain Stimulation em doentes com PD. Número de Células e Composição do Enxerto. Foram executadas experiências com tecid fetal, com um número desconhecido de neurônios DA dado que utilizavam material de enxerto fetal com em umeroso tipos de células. Com base nos dados apresentados, estão contemplados 100.000-200.000 neurônios TH+ sobreviventes para a recuperação da função neuronal DA.
[298] Imunossupressão. Em algumas realizações, está prevista a imunossupressão em doentes com enxertos no mínimo 6 meses até toda a vida de um doente. Em algumas realizações, os doentes não serão submetidos a imunossupressão para receberem os enxertos de tecido.
[299] Quadro 1: Dados da série de expressão genética de genes significativamente supra-regulados e sub-regulados no dia 11 da diferenciação em população com base em placa basal tratada com SHH/FGF8/Chir em comparação com a população tratada com LSB de controlo.
Figure img0005
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
Figure img0009
Figure img0010
[300] Quadro 2: Dados da série de expressão genética de genes significativamente supra-regulados e sub-regulados no dia 11 da diferenciação em população com base em placa basal tratada com SHH/FGF8/Chir em comparação com a população tratada com LSB de controlo.
Figure img0011
Figure img0012
Figure img0013
Figure img0014
Figure img0015
Figure img0016
[301] Quadro 3: Dados da série de expressão genética de genes significativamente supra-regulados e sub-regulados no dia 25 em comparação com o dia 13 da diferenciação em população com base em placas basais tratada com SHH/FGF8/Chir.
Figure img0017
Figure img0018
Figure img0019
Figure img0020
Figure img0021
Figure img0022
Figure img0023
Figure img0024
Figure img0025
Figure img0026
Figure img0027
Figure img0028
[304] Quadro 4: Dados da série de expressão genética de genes significativamente supra-regulados e sub-regulados no dia 25 da diferenciação em população com base em placa basal tratada com SHH/FGF8/Chir em comparação com a população tratada com LSB de control
Figure img0029
Figure img0030
Figure img0031
Figure img0032
Figure img0033
Figure img0034
[305] Quadro 5: Dados da série de expressão genética de genes significativamente supra-regulados e sub-regulados no dia 25 da diferenciação em população com base em placa basal tratada com SHH/FGF8/Chir em comparação com a população tratada só com SHH/FGF8
Figure img0035
Figure img0036
Figure img0037
Figure img0038
Figure img0039
[306] Quadro 6: Mostra uma lista de anticorpos de exemplo utilizados como marcadores, incluindo a concentração (isto é a diluição) de anticorpos utilizados e fontes de anticorpos de exemplo. Em algumas realizações os anticorpos ligados foram identificados com anticorpos secundários conjugados a Alexa488, 5 Alexa555 e Alexa647 (Molecular Probes, Carlsbad, California). Em algumas realizações, foram utilizados anticorpos secundários biotinilados para identificar os anticorpos primários ligados seguido de visualização com cromogênio DAB (3,3'- Diaminobenzidina).
Figure img0040
Figure img0041
Figure img0042
[307] Quadro 7: Diferenciação contemplada de exemplo em neurônios DA por limites do tipo de células
Figure img0043
[308] Quadro 8. Experiências de exemplo para determinar o papel de determinados fatores na produção de neurônios DA.
Figure img0044
[309] Quadro 9: Métodos de exemplo para ampliação de cultura de neurônios mDA, em particular para uso na introdução de culturas de nível GMP para uso clinic
Figure img0045
Figure img0046
[310] Tabela 10. Avaliação in vivo de exemplo de produtos da linhagem hES - composição do enxerto
Figure img0047
[311] Quadro 11. Avaliação in vivo de exemplo de produtos da linhagem hES - análise comportamental
Figure img0048
[312] (*) Em algumas realizações, ratos com >6 /min receberam estavelmente enxertos.
PARTE EXPERIMENTAL
[313] Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar determinadas realizações e aspectos da presente invenção mas não devem ser encarados como limitadores em qualquer sentido do âmbito desta. Na apresentação das experiências que se seguem aplicam-se as seguintes abreviaturas: N (normal); M 5 (molar); mM (milimolar); [μM (micromolar); mol (moles); mmol (milimoles); μmol (micromoles); nmol (nanomoles); pmol (picomoles); g (gramas); mg (miligramas); μg (microgramas); ng (nanogramas); pg (picogramas); L and (litros); ml (mililitros); |il (microlitros); cm centímetros mm (milímetros) μm (micrometros); nm (nanometros); U (unidades); min (minuto); s e seg (segundo); gr (grau); pen (penicilina), strep 10 (streptomicina) e °C (graus centigrados/Celsius).
EXEMPLO I.
[314] Materiais e métodos. Resumo dos Métodos> Linhagens ESC (H9, HI) e iPSC humanas (2C6 e SeV6) foram sujeitas a um protocolo de indução da placa basal (Fasano, et al., Cell Stem Cell 6:336-347 (2010), incorporado a título de referência, à base de inibição SMAD dupla (Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 15 27:275-280 (2009), incorporado a título de referência). A exposição a SHH C25II, purmorfamina, FGF8 e CHIR99021 foram optimizados para placas basais mesencefálicas e rendimento de novas populações de neurônios DA (ver figura 1d). Na sequência da indução da placa basal, foram executadas maturações adicionais (dias 11-25 ou para além dos 25 dias em 20 culturas, até pelo menos 100 dias em cultura) em meio de diferenciação à base de Neurobasal/B27 na presença de fatores de sobrevivência e maturação de neurônios DA (Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci USA 101:12543-8 (2004), incorporado a título de referência), tais como AA, BDNF, GDNF, TGF(33 e dbcAMP (ver métodos na íntegra para mais detalhes). A população de neurônios DA resultante foi sujeita a extensa caracterização fenotípica por meio de imunocitoquímica, levantamento do perfil de expressão genética global qRT-PCR, análise HPLC para a detecção de dopamina e registos eletrofisiológicos in vitro. Os estudos in vivo foram executados em roedores hemiparkinsonianos (ratinhos ou ratos injetados com toxina 60HDA de um lado do cérebro dos animais. Os estudos foram executados em ratinhos NOD-SCID IL2Rgc adultos (Jackson labs) e em ratos Sprague Dawley Taconic Farms, que receberam lesões induzidas por 6-hidroxidopamina por meio de injeções estereotácticas da toxina, como anteriormente descrito, assim como em dois macacos rhesus adultos, que foram submetidos a tratamento com injeções unilaterais de MPTP na carótida.• Os neurônios DA foram injetados estereotaticamente no corpo estriado dos animais (150 x 103 células em ratinhos, 25 0 x 103 células em ratos) e um total de 7,5 x 106 células (distribuídas por 6 tratos, 3 de cada lado do cérebro) em macacos. Foram realizadas análises comportamentais com intervalos de um mês pós-enxerto, incluindo análise rotacional mediada por anfetamina, assim como um teste de aquinésia focal (“teste de marcha”) e uso dos membros (teste do cilindro). Os ratos e ratinhos foram sacrificados nas 18-20 semanas e os primatas 1 mês pós-enxerto. A caracterização dos enxertos foi executada por meio de análises estereológicas do número de células e volumes de enxerto, assim como caracterização fenotípica abrangente através de imuno-histoquímica. Cultura de células ES humanas indiferenciadas.
[315] Linhagens hESC H9 (WA-09, XX, passagens 27-55 adequando 10/2009), HI (WA-01, XY, passagens 30-40, de quando 6/2010) e linhagens celulares iPS 2C6 (Kim, et al. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), incorporado a título de referência) (XY, passagens 20-30) e SeV6 (XY, passagens 20-30, derivadas de fibroblastos embriónicos MRC-5 utilizando sistema vector Sendai de 4 fatores não- integrante (Ban, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A (2011) 15 108(34): 14234- 14239:10.1073/pnas. 1103509108, incorporado a título de referência) foram mantidas em fibroblastos embriónicos de ratinho a concentrações de aplicação em placa estimadas entre 0,5 xlO3 por cm2 a 100 xlO3 por cm2 com base nas células ES humanas que têm tendência a formar aglomerados de células (MEF, Global Stem, Rockville, MD) em soro de substituição knockout a 20% óptimo (KSR, Invitrogen, Carlsbad, California) contendo meio celular ES humano (como anteriormente descrito (Kim, et al Cell Stem Cell 8:695-706 (2011) incorporado a título de referência). O uso de substituição com soro knockout pode oscilar entre 0% e 40%.
[316] Indução neuronal. Para indução de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos com base em placas basais, foi empregue uma versão modificada da inibição SMAD dupla (Chambers, et al, Nat. Biotechnol. 27:275-280 25 (2009) incorporado a título de referência) e protocolo de indução da placa basal com exposição temporizada a LDN-193189 (100 nM (concentração entre 0,5-50 μM Stemgent, Cambridge, Massachusetts), SB431542 (100 μM (concentração entre 0,5-50 μM, Tocris, Ellisville, MI), SHH C25II(100 ng/ml (concentração entre 10-2000 ng/ml, R&D, Minneapolis, MN), Purmorfamina (2 μM (concentração entre 10-500 ng/ml, Stemgent), FGF8 (100 ng/ml (concentração entre 10-500 ng/ml, R&D) e CHIR99021 (CHIR; 3 μM (concentração entre 0,1-10 μM, Stemgent)
[317] Nota: para o protocolo de indução da placa basal, tratamento “SHH” refere-se à exposição, isto é ao contato das células com uma combinação de SHH C25II 100 ng/ml + purmorfamina (2 μM). As células foram semeadas (35-40 x 103 células/cm2) e cultivadas durante 11 dias em matrigel ou geltrex (utilizado como adquirido) (BD, Franklin Lakes, New Jersey) em meio substituto de soro knockout (KSR) contendo DMEM, substituto de soro knockout a 15%, L-glutamina 2 mM e 10 μM (concentração entre 1-25 μM -mercaptoetanol. O meio KSR foi gradualmente deslocado para meio N2 a partir do dia 5 da diferenciação, por meio de mistura em proporções de 75% (KSR) no dia 5-6, 50% (KSR): 50% (N2 dia 7-8 e 25% (KSR): 75% (N2) no dia 9-10, como anteriormente descrito (Chambers, et al. Nat. Biotechnol. 27:275-280 (2009), incorporado a título de referência). No dia 11, trocaram-se os meios por meio contendo meio Neurobasal/meio B27 (1:50 de diluição)/L-Glut (intervalo efetivo 0,2-2 mM) (NB/B27; Invitrogen) suplementado com CHIR (até ao dia 13) e com BDNF (fator neurotrófico derivado de cérebro, 20 ng/ml entre 5 a 100; R&D), ácido ascórbico (AA; 0,2 mM (concentração entre 0,011 mM), Sigma, St Louis, MI), GDNF (fator neurotrófico derivado da linhagem celular das glia 20 ng/ml (concentração entre 1-200 ng/ml), R&D), TGFp3 (fator de crescimento transformante tipo β3, 1 ng/ml (concentração entre 0,1-25 ng/ml); R&D), cAMP dibutirilo (0,5 mM (concentração entre 0,005-2 mM); Sigma) e DAPT 10 mM (concentração entre 0,5-50 nM); Tocris) durante 9 dias. No dia 20, as células foram dissociadas com Accutase® (Innovative Cell Technology, San Diego, California) e semeadas de novo em condições de alta densidade (por exemplo enrte 300.000 - 400.000 células/cm2), em placas pré-revestidas com poliornitina (PO); )15 μg/ml (concentração entre 1-50 μg/ml)/Laminina (1 μg/ml) (concentração entre 0,110 μg/ml)/Fibronectina (2 μg/ml (concentração entre 0,1-20 μg/ml) em meio de diferenciação (NB/B27 + BDNF, AA, GDNF, dbcAMP (concentração como anteriormente descrito), TGF03 e DAPT (concentração como anteriormente descrito) até ao estádio de maturação desejado para uma dada experiência.
[318] Os protocolos anteriormente descritos de indução de neurônios DA com base em roseta foram seguidos em parte (Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 101:12543-8 (2004), incorporado a título de referência) com pelo menos uma exceção relativamente ao uso da inibição SMAD dupla para acelerar a fase de indução neuronal inicial. Em resumo, hESCs foram induzidos para o seu destino neuronal mediante cultura com células MS5 irrigadas em KSP suplementado com SB431542 e Noggin (250 ng/ml (concentração entre 10-1000 ng/ml); R&D) do dia 2 ao dia 8 e SHH+FGF8 do dia 6 ao dia 11 da diferenciação. Ao fim de 11 dias em KSR, isolaram-se manualmente 5 rosetas neuronais e estas foram cultivadas (fase PI) em meio N2 suplementado com SHH, FGF8, BDNF e AA, como anteriormente descrito (Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci U SA 101:12543-8 (2004), incorporado a título de referência). Ao fim de 5-7 dias em fase PI, as rosetas foram novamente colhidas mecanicamente e trituradas após a incubação em solução salina equilibrada de Hank, isenta de Ca2/Mg2 (HBSS) durante 1 horas e recolocadas em placas revestidas com poliornitina (PO)/Laminina/Fibronectina. A definição de padrões com SHH/FGF8 prosseguiu durante 7 dias na fase P2, seguida de diferenciação final na presença de BDNF, AA, GDNF, TGFb3 e dbcAMP, como anteriormente descrito, até ao estádio de maturação desejado para uma dada experiência (tipicamente 5 a 7 dias para estudos com transplantes ou 32 dias para estudos funcionais in vitro).
[319] Análises de expressão genética. Foi extraído o ARN total durante a diferenciação nos dias: 0,1, 3, 5, 7, 9, 11,13 e 25 por cada condição de controlo LSB, LSB/SHH/FGF8 e LSB/SHH/FGF8/CHIR utilizando o RNeasy kit (Qiagen, Valencia, CA). Para análises com micro-séries, o ARN total foi processado na unidade nuclear MSKCC Genomic e hibridado em séries Illumina Human ref-12 bead de acordo com as especificações do fabricante. Foram executadas comparações entre cada um dos dias e condições utilizando o conjunto LIMMA da Bioconductor (worldwideweb.bioconductor.org). Os genes que apresentavam um valor P ajustado < 0,05 e uma razão de expressão maior que dois foram considerados significativos. Foram executadas algumas das análises de dados micro-série descritivas e apresentações com um conjunto de aplicações de software à venda (Partelc Genomics Suite 25 versão 6.10.0915)). Para as análises qRT-PCR, o ARN total no dia 25 de cada condição foi submetido a transcrição inversa (Quantitech, Qiagen) e o material amplificado foi detectado com análises de expressão genética Taqman, à venda (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) com os dados normalizados para HPRT. Cada ponto dos dados representa 9 replicações técnicas de 3 amostras biológicas independentes. Os dados em bruto dos estudos micro-série ainda não se encontram disponíveis na GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo). Cirurgia animal. As intervenções em roedores e macacos foram executadas segundo as diretrizes NIH e foram aprovadas pelo Institutional Animal Care and Use Committee local (IACUC), pelo Institutional Biosafety Committee (IBC) e pelo Embryonic Stem Cell Research Committee (ESCRO). Ratinhos. Ratinhos null NOD-SCID IL2Rgc (20-35 g de peso, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) foram anestesiados com cetamina (90 mg/kg; Akorn, Decatur, IL) e 5 Xilazina (4 mg/kg Fort Dodge, IA). Injetou-se 6-hidroxidopamina (10 μg) (concentração entre 0,1-20 μg 6-OHDA (Sigma-Aldrich) estereotaticamente no corpo estriado nas seguintes coordenadas (em milímetros): AP, 0,5 (desde o bregmaM uma sutura do crânio utilizada como referência para cirurgia estereotáctica); ML -2,0; DV, -3,0 (desde a dura, uma membrana que cobre o cérebro e utilizada como referência). Os ratinhos com lesões com êxito (uma média de >6 rotações/minuto) foram selecionados para o transplante.
[320] No total foram injetadas 150 x 10 células em um volume de 1,5 μl, no corpo estriado nas seguintes coordenadas (em mm): AP, 0,5; ML, -1,8; DV, 3,2. Os ratinhos foram sacrificados 18 semanas pós-enxerto. Ratos. Ratos Sprague- Dawley (Taconic, Hudson, NI) fêmeas adultas (180-230 g) foram anestesiados com cetamina (90 mg/kg) e silazina (4 mg/kg) durante as intervenções cirúrgicas. Foram estabelecidas lesões unilaterais do feixe prosencefálico médio na via nigro estriada por meio de injeção estereotáctica de 6-OHDA (3,6 mg7ml em 0,2% de ácido ascórbico e 0,9% de soro fisiológico, Sigma) em dois pontos (Studer, et al. Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), incorporado a título de referência). Os ratos foram selecionados para transplante caos a rotação induzida por anfetamina exceder 6 rotações/min às 6-8 semanas pós-injeção. 250 x 103 células foram transplantadas para o corpo estriado em cada animal (coordenadas: AP +1,0 mm, ML - 2,5 mm e V-4,7 mm; barra dentada em -2,5). Os ratos de controlo receberam PBS. As intervenções cirúrgicas encontram-se anteriormente descritas (Studer, et al Nature Neurosci. 1:290-295 (1998), incorporado a título de referência). Foram iniciadas injeções intraperitoneais diárias de 15 mg/kg ciclosporina (Bedford Labs, Bedford, OH) antes dos enxertos de células e prosseguiu-se até o animal ser sacrificado, 20 semanas após o enxerto de células.
[321] Primatas. Dois macacos rhesus adultos (17-18 anos de idade; 10-12 kg, fêmeas) foram tornados hemiparkinsonianos através de administração de MPTP na carótida, seguido de administração de MPTP I.V. semanal para criar o síndroma de Parkinson bilateral (Kordower, et al. Science 290:767-773 (2000), incorporado a título de referência). Ambos os animais apresentavam sintomas de Parkinson consistentes com uma lesão moderada a grave na análise comportamental, incluindo postura curvada, arrastar das pernas e sintomas de rigidez (inflexibilidade dos movimentos), negligência (consciência motora de estímulos lateralizados) e bradiquinésia (lentidão do início dos movimentos). Estes parâmetros podem ser avaliados em macacos, utilizando uma escala de classificação clínica de Parkinson modificada (CRS). No dia da cirurgia de transplante, os animais foram tranquilizados com cetamina (3,0 mg/kg, IM) e dexdomitor (0,02-0,04 mg/kg IM), intubados para manter as vias aéreas estáveis e foram anestesiados com isoflurano. Foram depois colocados em uma estrutura estereotáctica para a cirurgia. Ambos os macacos rhesus foram submetidos a uma única cirurgia com três injeções intracranianas de culturas DA derivadas de placa basal humanas com base nas coordenadas estereotácticas (Paxinos, et al. The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press, 2000), incorporado a título de referência). Injeções bilaterais de células (10 μl/injeção; 125.000 células/ul) foram executadas nos três pontos (1-núcleo caudado posterior, 2-putâmen précomissural e matéria branca sobrejacente) perfazendo um volume total de 30 μl por hemisfério. Foi utilizada uma bomba de perfusão ligada a um micromanipulador estereotáctico para administrar as células a uma taxa de 1 μl/min através de uma seringa de Hamilton de 50 μl com uma agulha de calibre 28. Depois de concluídas as injeções, a agulha foi deixada permanecer no mesmo sítio durante mais 2 a 5 minutos para permitir a difusão do perfundido da ponta da agulha antes de se retirar lentamente a seringa. Imediatamente após a cirurgia, os animais receberam analgésicos buprenex, 0,01 mg/kg IM, BID durante 72 horas pós-cirurgia; meloxicam, 0,1 mg/kg, SID durante 72 horas pós-cirurgia) assim como um antibiótico (cefazolina, 25 mg/kg IM, BID), até 72 horas pós-cirurgia. Os animais receberam ciclosporina A (Neoral, Sandimmune) por via oral (30 mg/kg com redução até 15 mg/kg) uma vez por dia, com início nas 48 horas antes da cirurgia até ao sacrifício, um mês após o transplante. Análises comportamentais: O teste da rotações induzidas por anfetamina (ratinhos e ratos) e o teste de marcha (rato) foram executados antes do transplante e 4, 8, 12, 18 semanas após o transplante. O comportamento de rotação em ratinhos foi registado 10 min após injeção i.p. de d-anfetamina (25 mg/kg, Sigma) e registado durante 30 minutos. O comportamento de rotação em ratos foi registado 40 min após injeção i.p. de d-anfetamina (5 mg/kg, Sigma) e avaliado automaticamente com um sistema TSE VideoMot2 (Alemanha). Os dados foram apresentados como média de rotações por minuto. O teste de marcha foi modificado a partir de Blume, et al. Exp. Neurol. 219:208-211 (2009) e Crawley, et al. O Que Há De Errado Com O Meu Rato: Behavioral 30 Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice (Wiley-Liss, 2000), todos incorporados a título de referência.
[322] Em resumo, cada rato foi colocado em uma superfície plana, as patas traseiras foram erguidas segurando suavemente a cauda para deixar apenas as patas dianteiras tocar na mesa. O condutor da experiência puxou o rato para trás 1 metro a um ritmo constante. Foram contados os passos de ajuste das patas dianteiras tanto contralateral como ipsilateral. Os dados encontram-se apresentados como percentagem de passos de ajuste contralaterais/(contralaterais + ipsilaterais).• teste do cilindro foi executado, colocando-se cada animal em um cilindro de vidro e contando o número de toques da pata ipsilaterais comparativamente com o toques contralaterais (de entre 20 toques) na parede do cilindro como descrito anteriormente (Tabar, el al. Nature Med. 14:379-381 (2008), incorporado a título de referência). Processamento dos tecidos. Ratinhos e Ratos: Os animais (ratinhos e ratos) receberam doses excessivas de pentobarbital por via intraperitoneal (50 mg/kg) para induzir anestesia profunda e receberam por perfusão 4 % de paraformaldeído (PFA). Foram extraídos os cérebros que foram pós-fixos em 4% PFA, depois impregnados em soluções de 30% de sacarose durante 2-5 dias. Foram seccionados em criostato após impregnação em composto O.C.T. (Sakura-Finetek, Torrance, California).
[323] Primatas: Os animais foram sacrificados sob anestesia profunda com cetamina (10 mg/kg, intramuscular (IM)) e pentobarbital (25 mg/kg, intravenoso (IV)) através de perfusão cardíaca com soro fisiológico heparinizado 0,9%, seguido de fixador 4% PFA fresco frio (pH 7,4). Imediatamente após a fixação primária, os cérebros foram removidos do crânio e pós-fixos em 4% PFA, livres, durante 24-36 horas. Foram depois enxaguados e ressuspensos em 10% de sacarose em um agitador lento a 4 °C e deixados “afundar”. O processo foi depois repetido em 20% de sacarose, seguido de 30% de sacarose. Os cérebros inteiros foram cortados coronalmente em secções em série de 40 μm, em um microtomo de trenó congelado e guardados a flutuar em meio de criopreservação, a -20 °Celcius.
[324] Imuno-histoquímica: As células foram fixadas em 4% PFA e bloqueadas com 1% de albumina de soro bovino (BSA) com 0,3% de Triton. As secções de tecido cerebral foram lavadas em PBS frio e processadas de forma similar. Os anticorpos primários foram diluídos em 1 -5% BSA Cabra Normal.• soro foi incubado de acordo com as recomendações do fabricante. No quadro 6 é apresentada uma lista exaustiva dos anticorpos e fontes. Foram utilizados anticorpos secundários conjugados a Alexa488, Alexa555 e Alexa647 apropriados (Molecular Probes, Carlsbad, California) com contracoloração nuclear de 4”,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Thermo 30 Fisher, Rockford, Illinois). Para algumas análises foram utilizados anticorpos secundários biotinilados, seguido de visualização através do cromogênio DAB (3,3”-diaminobenzidina).
Análise HPLC
[325] Executou-se HPLC em fase inversa, com detecção eletroquímica para a medição dos níveis de dopamina, ácido homovanílico (HVA) e DOPAC (ácido 3,4- di-hidroxi-fenilacético) como anteriormente descrito (Roy, et al. Nature Med. 12:1259-1268 (2006); Studer, et al. Brain Res. Bull. 41:143-150 (1996), todos incorporados a título de referência). Foram recolhidas amostras da cultura em ácido perclórico no dia 65 da diferenciação. Em algumas experiências, foi medido DA diretamente no meio, utilizando o mesmo sistema de detecção mas após a extração de alumínio da dopamina e respectivos metabolitos, utilizando um conjunto à venda como anteriormente descrito (Studer, et al. Brain Res. Bull. 41:143- 150 (1996), incorporado a título de referência. Registos eletrofisiológicos: As culturas foram transferidas para uma câmara de registo em um microscópio vertical equipado com uma objetiva de imersão em água de 40X (Eclipse E600FN; Nikon); as culturas foram perfundidas com soro fisiológico contendo em mM: 125 NaCl, 2,5 KC1, 25 NaHCO3, 1,25 NaH2P04, 2 CaCl, 1 MgCl2, e 25 glicose (34 °C; saturado com 95% O2-5% CO2; pH 7,4; 298 mOsm/L). O caudal de soro fisiológico foi de 2-3 ml/min através de um aquecedor em linha (SH-27B com controlador TC-324B 15; Warner Instruments). Os neurônios foram visualizados por microscopia vídeo, com câmara digital CCD refrigerada (CoolSNAP ES2, Photometries, Roper Scientific, Tucson, Arizona). As células selecionadas para os registos eletrofisiológicos tinham formas semelhantes a neurônios, com finas ramificações de neurites. Foram realizados registos da voltagem controlada de células inteiras somáticas em configuração atual da voltagem com um amplificador MultiClamp 700B (Molecular Devices). Os sinais foram filtrados a 1-4 kHz e digitalizados a -20 kHz, com Digidata 1440A (Molecular Devices). Os eléctrodos de registo foram fabricados com vidro de borossilicato filamentoso (Sutter Instruments) com um puller Flaming-Brown (P-97, Sutter Instruments) e apresentavam resistências de 4-6 MQ no banho. Os eléctrodos foram preenchidos com solução interna, contendo, em mM: 135 K- MeS04, 5 KC1, 5 HEPES, 0,25 EGTA, 10 25 fosfocroeatina-di(tris), 2 ATP-Mg, e 0,5 GTP-Na (pH 7.3, osmolalidade ajustada a 290-300 mOsm/L). O circuito de ponte amplificado foi ajustado para compensar a resistência dos eléctrodos e foi monitorizado. A capacitância dos eléctrodos foi compensada. Quando a resistência da série aumenta >20% durante o registo, os dados são ignorados porque uma resistência maior sugere uma falha técnica parcial durante os registos. Contagem de Células e Análises Estereológicas. Foram determinadas as percentagens de células positivas para o marcador na placa basal (Dia 11) figura 1, precursor neuronal dopaminérgico mesencefálico (dia 25, figura 2 e estádios neuronais DA maduros (dia 50 ou posterior) figura 3 e 11, em amostras derivadas cada uma de 3 experiências independentes. As imagens de quantificação foram selecionadas de forma aleatória uniformizada e cada imagem foi classificada primeiro pelo número de núcleos DAPI positivos, seguido da contagem do número de células expressoras do marcador de interesse. Os dados encontram-se apresentados como média ± SEM. A quantificação das células humanas (identificada com anti-hNA) e neurônios TH+ nos enxertos foi executada em cada décimo da secção em que era identificável um enxerto. As contagens de células e volume do enxerto foram determinados com uma sonda fraccionadora óptica e o estimador de Cavalieri, com um software Stereo Investigator (MBF bioscience, Vermont) como anteriormente descrito Tabar, et al. Nat. 10 Biotechnol. 23:601 -606 (2005), incorporado a título de referência. Os dados são apresentados como número de células total estimado e volume total do enxerto +/- erro padrão das médias (SEM).
[326] As seguintes formulações descrevem meio de cultura celular de exemplo para aplicação nas realizações em desenvolvimento da presente invenção.
[327] Meio hESC para manutenção (1 litro): 800 mL de DMEM/F12, 200 mL Substituto de Soro Knockout, 5 mL de 200 mM L- Glutamina, 5 mL de Pen/Strep, 10 mL de 10 mM solução de amino 15 ácidos não-essenciais mínima MEM, 55 μM de 13- mercaptoetanol e bFGF (concentração final de 4 ng/mL).
[328] Meio KSR de diferenciação hESC (1 litro): 820 mL de DMEM Knockout, 150 mL de Substituto de Soro Knockout, 10 mL de 200 mM L- Glutamina, 10 mL de Pen/Strep, 10 20 mL de 10 mM MEM, 55 μM de 13- mercaptoetanol.
[329] Meio N2 de diferenciação hESC (1 litro): 985 ml de H2O dist. com DMEM/F12 em pó, 1,55 g de glicose (Sigma, cat. no. G7021), 2,00 g de bicarbonato de sódio (Sigma, cat. no. S5761), putrescina (alíquota de 100 μL de 1,61 g dissolvida em 100 mL de água destilada; Sigma, cat. no. P5780), progesterona (aliquota de 20 μL de 0,032 g dissolvidos em 100 mL 100% 25 etanol; Sigma, cat. no. P8783), selenite de sódio (aliquota de 60 μL de 0,5 mM solução em água destilada; Bioshop Canada, cat. no. SEL888), e 100 mg de transferrina (Celliance/Millipore, cat. no. 4452-01) e 25 mg de insulina (Sigma, cat. no. 16634) em 10 mL de 5 mM NaOH.
[330] Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), com 10% de FBS para preparar 30 PMEF (células alimentadoras de fibroblasto de embriões de ratinho primários (PMEF)) (1 litro): 885 mL de DMEM, 100 mL de FBS, 10 mL de Pen/Strep e 5 mL de L-Glutamina.
[331] Meio Essencial Mínimo Alfa (MEM com 10% de FBS para a preparação do meio de células alimentadoras MS-5 (1 litro): 890 mL de MEM alfa, 100 mL de FBS, 10 mL de solução de gelatina Pen/Strep (500 ml): Dissolver 0,5 g de gelatina em 500 ml de água Milli Q quente (50-60 °C). Deixar arrefecer à temperatura ambiente.
EXEMPLO II.
[332] Este exemplo descreve a descoberta de pequenas moléculas e tempo de contato para proporcionar uma diferenciação dirigida de neurônios FOXA2+LMX1A+ DA da presente invenção.
[333] Segue-se um breve resumo de algumas descobertas experimentais aqui descritas: O tratamento de células com dupla inibição de SMAD com agonistas SHH (purmorfamina + SHH) e FGF8 (S/F8) na ausência de CHIR99021 revelou uma expressão significativamente menor de FOXA2 no dia 11 e uma total ausência de expressão de LMX1A (figura 1a, b). O marcador anterior OTX2 foi induzido com robustez em LSB e culturas tratadas com LSB/S/F8/CHIR, mas não em condições LSB/S/F8 (Figura 1a,c). Os autores da presente invenção utilizaram vários outros métodos de diferenciação dirigida que resultaram em populações de células contendo neurônios semelhantes a DA. Estes neurônios semelhantes a DA foram utilizados em estudos de transplantes levantaram preocupações quanto à continuação do uso destas células em aplicações terapêuticas. Por exemplo, os procedimentos descritos por Perrier et al., 2004 e Fasano et al., 2010, incluindo indução neuronal MS5, resultaram na formação de rosetas e foram utilizados para fazer os precursores do dia 11, ver exemplos nas figs. 2, 16 e 17, que foram adicionalmente utilizados para derivar neurônios semelhantes a DA. Estes neurônios resultaram de uma baixa percentagem das células precursoras nas populações de células dia 11 resultantes. Os estudos de transplantes que utilizaram estes neurônios revelaram fraca viabilidade pós-transplante e perda do fenótipo neuronal semelhante a DA para além das observações do desenvolvimento pós transplante de tipos neuronais inapropriados conjuntamente com perda do controlo do desenvolvimento, o que conduziu ao desenvolvimento de teratomas. Ver figs. 16 e 17.
[334] Especificamente em PO, hESC foram postas em contato com moléculas para iniciar a indução neuronal de células Oct4+ em células de rosata, utilizando células alimentadoras MS5 (Perrier et al., 2004). No estádio Pi, as células de roseta foram expandidas estabelecendo contato com células com moléculas adicionais para a diferenciação de células em células no estádio P2, com padrões de expressão específicos, incluindo células progenitoras Pax2+/Enl+ DA e foram diferenciadas adicionalmente em neurônios TH+/Enl+ DA.
[335] Estas células foram utilizadas para o enxerto em ratos lesionados com 60 HDA, imunossuprimidos com ciclosporina A. Estes estudos de transplantes revelam uma fraca viabilidade in vivo, perda do fenótipo TH+, preocupações acerca do desenvolvimento em célula indesejadas, potencialmente letais, isto é teratomas, e desenvolvimento das células em tipos neuronais inapropriados que iriam provocar problemas médicos adicionais para o doente.
[336] Houve um número muito baixo de neurônios TH+ sobreviventes ao fim de 4,5 meses após o transplante (células < 50 TH+/animal) em enxertos de precursores de neurônios DA derivados de roseta Fig. 16A. No entanto, em contraste com as células TH+, as células marcadas com GFP (GFP foi impulsionado por um promotor ubíquo) sobreviveram bem após o transplante. Sugere-se assim que a maioria das células sobreviventes na sequência do transplante eram células neuronais de identidade neuronal não DA (16B). Poucas células derivadas do enxerto (hNA+ (verde) co-expressam TH (vermelho), sugerindo novamente que a maioria das células humanas enxertadas adoptam um fenótipo neuronal não DA Fig. 16C. Os painéis 16 D-E revelam que D-E, apesar da sobrevivência in vivo muito fraca, houve alguma melhoria (fraca e muito variável) nalguns testes comportamentais, tais como a rotação induzida por anfetamina (D), teste do cilindro e rotações espontâneas (E). A indução neuronal isenta de alimentador foi executada como anteriormente descrito (Chambers et al., 2009) mas foi ainda modificada para render células do placas basais (Fasano et al., 2010). No método de inibição SMAD duplo modificado para a diferenciação de células pluripotentes em células de placas basais, os inventores descobriram anteriormente que elevadas concentrações de SHH foram necessárias para a indução de FP no dia 11. Por exemplo, em algumas realizações, foi adicionado Sonic C25II a 200 ng/ml. Em algumas experiências foram adicionados DKK-1 (R&D; 100 ng/ml) FGF8 (R&D; 50 ng/ml), Wnt-1 (Peprotech; 50 ng/ml) e ácido retinóico (R&D; 1 mM), ver figura 17. No entanto, nenhuma das populações de células resultantes no dia 11, utilizando os métodos anteriores, continham uma elevada percentagem das células progenitoras de placas basais mesencefálicas FOXA2+/LMX1A+ utilizando os métodos das presentes invenções.
[337] Como se mostra, foi selecionada uma população de células contendo células pluripotentes pelos autores da invenção para uma população de início e foram cultivadas em placa no dia 0. As células foram deixadas desenvolver-se quase até à confluência, antes da diferenciação (entre 60 - 100% de confluência). Estas células foram postas em contato com inibidores de efeito duplo em SMAD (isto é exposição a LDN-193189 + SB431542 = "LSB") no dia 0. Os autores da invenção seguiram uma população de células com alimentação regular contendo LSB fresco até ao dia 11 e descobriram que algumas células restantes eram LMX1A+ mas não expressavam FOXA2 (Figura 1a,b).• Os autores da invenção cultivaram em placa populações de células de partida e depois testaram os tipos de células (isto é, os padrões de expressão gene/proteína) após estabelecer contato com misturas contendo qualquer um dos seguintes agonistas SHH (purmorfamina + SHH) e FGF8 (S/F8) em contato com as células com diferentes regimes de exposição, isto é em contato com as células no dia 0, dia 1 ou dia 2, etc. para períodos de tempo específicos, isto é 24 horas, 48 horas, etc. Estas três condições de cultura de exemplo principais testadas foram 1) células em contato com LDN/SB (LSB) no dia 0, depois em contato com LSB fresco até ao dia 5, no dia 5 as células foram postas em contato com LDN fresco sem SB até ao dia 11, 2) células em contato com LDN/SB (LSB) no dia 0 foram postas em contato com LSB fresco até ao dia 5, no dia 5 as células foram postas em contato com LDN fresco sem SB até ao dia 11, enquanto, durante este período, as células foram ainda postas em contato até ao dia 7 e 3) células postas em contato com LDN/SB (LSB) no dia 0 e depois com LSB fresco no dia 5, no dia 5 as células foram postas em contato com LDN fresco sem SB até ao dia 11, enquanto durante este período as células foram ainda postas em contato com purmorfamina fresca, SHH e FGF8 até ao dia 7, mantendo ainda contato com CHIR fresco a partir do dia 3 da cultura até ao dia 11, com várias variações destas condições primárias a fim de determinar um rendimento ideal de tipos de células. Foram executadas comparações sistemáticas das três condições de cultura (figura Id), utilizando análise do perfil de expressão genética temporal global. Ver figura de exemplo 8 e quadros 1-6. A agregação hierárquica de genes expressos diferencialmente distinguiu as três condições de tratamento no dia 11 da diferenciação (figura 8a). FOXA1, FOXA2 e vários outros alvos a jusante SHH, incluindo PTCH1, encontravam-se entre as transcrições mais diferencialmente reguladas em LSB/S/F8/CHIR em comparação com o tratamento LSB (figura 1e). A expressão de LMX1A, NGN2 e DDC indicava o estabelecimento do destino do precursor do neurônio DA do mesencéfalo já por volta do dia 11 (figura 1e, f). Em contraste, as culturas LSB nos dias 11, foram enriquecidas em termos de marcadores do prosencéfalo dorsal, tais como HESS, PAX6, LHX2 e EMX2. A comparação direta de LSB/S/F8/CHIR em comparação com o tratamento LSB/S/F8 (figura 1f) confirmou o enriquecimento seletivo dos mercadores do precursor DA do mesencéfalo no grupo LSB/S/F8/CHIR e sugere identidade precursora hipotalâmica nas culturas tratadas com LSB/S/F8, com base na expressão diferencial de RAX1, SIX3, e SIX6 (ver também expressão POMC, OTP na figura 2d).
[338] É apresentada uma lista de exemplo de transcrições expressas diferencialmente, isto é quadros 1, 2 e análise ontológico-genética no dia 25, nos quadro 3-5 e Figura 8b (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov) confirmam o enriquecimento de sinalização WNT canónica no tratamento CHIR. Ainda não estão disponíveis dados em bruto na GEO worldwideweb.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ accession#: [TBD]). Análise temporal comparativa da expressão genética de marcadores do precursor DA do mesencéfalo (figura 1g) em comparação com marcadores dos destinos neuronais não-DA anteriores e ventrais (figura 1h) dividiu as três condições de indução em: i) LSB: prosencéfalo dorsal; ii) LSB/S/F8: ventral/hipotalâmico e iii) LSB/S/F8/CHIR: identidade precursora DA do mesencéfalo.
EXEMPLO III.
[339] Diferenciação de Neurônios DA. Para continuar a diferenciação, as células precursoras foram mantidas em um meio promotor da maturação neuronal (BAGCT, ver materiais e métodos). Os seguintes tipos de comparações foram realizadas entre as populações de células diferenciadas, resultantes de métodos anteriores e métodos da presente invenção.A) análise imunocitoquímica no dia 50 da diferenciação em TH em combinação com LMX1A, FOXA2 and NURR1, B) Quantificação de células TH+, FOXA2+, LMX1+ e NURR1+ de entre culturas derivadas de roseta de comparação de células totais contra culturas (LSB/S/F8/CHIR) derivadas do placas basais. C) Quantificação das percentagens de subtipos neuronais serotonina+ (5-HT) e GABA+ (contaminantes neuronais não DA) no dia 20 em culturas de neurônios DA derivadas de placas basais e de roseta.
[340] E D) análise HPLC para a medição de dopamina e metabolitos: Comparação de níveis de DA, DOPAC e HVA entre culturas derivadas de placas basais contra as derivadas de roseta. Ao dia 25, três populações de células precursoras renderam neurônios Tujl+ (figura 2a) e células expressoras de TH, na enzima limitadora da taxa na síntese de DA. No entanto, o tratamento com LSB/S/F8/CHIR rendeu células TH+ que co-expressavam LMX1A e FOXA2 e apresentavam uma forte indução do receptor nuclear NURR1 (NR4A2) (Figura 2a,b). A comparação da expressão genética no dia 13 contra as culturas ao dia 25 confirmou uma indução robusta de outros marcadores neuronais DA pós-mitóticos (figura 2c). A caracterização da identidade neuronal DA no dia 25 em comparação com culturas tratadas com LSB e LSB/S/F8 confirmou o enriquecimento de transcrições neuronais DA mesencefálicas conhecidas e identificou múltiplos marcadores candidatos novos (figura 2d, quadros 3-5, figura 8b).
[341] Por exemplo, a transcrição mais intensamente enriquecida em LSB/S/F8/CHIR (grupo DA do mesencéfalo) foi TTF3, um gene anteriormente nunca associado ao desenvolvimento neuronal DA do mesencéfalo, mas fortemente expresso na substância negra humana (figura 8c, Allen Brain Atlas: http://human.brain-map.org).
[342] Foram obtidos dados similares para EBF-1, EBF-3 (Figura 8c) assim como TTR, um algo transcripcional conhecido de FOXA2 no fígado. Os dados obtidos durante o desenvolvimento das presentes invenções indicaram o enriquecimento de vários genes PITX em células precursoras DA mesencefálicas. PITX3, um marcador clássico dos neurônios DA do mesencéfalo, foi também expresso de forma robusta ao dia 25 da diferenciação (figura 2e). Finalmente, foi fácil reproduzir a indução tanto do placas basais mesencefálico e neurônios DA em linhagens hESC e hiPSC independentes (figura 9). Os dados apresentados, revelam que o protocolo LSB/S/F8/CHIR em oposição a outros protocolos testados, rendem células expressoras de um perfil marcado correspondente ao destino neuronal DA do mesencéfalo.
[343] As propriedades in vitro e in vivo dos neurônios DA derivados do placas basais foram comparados com os neurônios semelhantes a DA, obtidos por via de um intermediários roseta neural (figura 10 e 16). A definição de padrões das rosetas neurais representa a estratégia mais difundida atualmente para derivar neurônios DA de hPSCs. Tanto o protocolo baseado no placas basais como o baseado na roseta foram eficientes na geração de neurônios TH+ capazes de sobrevivência in vitro a longo prazo (dia 50 da diferenciação, figura 3 a). No entanto, a percentagem de células TH+ foi significativamente superior nas culturas derivadas do placas basais (figura 3b). Enquanto as células TH+ em ambos os protocolos revelaram co- expressão de NURR1, os neurônios DA derivados do placas basais co- expressaram FOXA2 e LMX1A (Figura 3-la,b).• Observaram-se poucos neurônios GABA e serotonina (5-HT)- positivos (figura 3-c). DA e respectivos metabolitos DOPAC e HVA encontravam-se em culturas geradas com qualquer um dos protocolos, mas os níveis de DA eram aproximadamente 8 vezes superiores nas culturas do placas basais (figura 3d,e). Os neurônios DA do mesencéfalo exibiam um extenso desenvolvimento de fibras e expressão robusta de marcadores neuronais maduros, incluindo sinapsina, transportador dopamina (DAT), e retificadores internos do canal potássio, acoplados à proteína G (neurônios DA Kir3.2, também designado GIRK2, expresso na parte compacta da substância negra (SNpc)) (figura 3f, figura 11). Neurônios DA SNpc in vivo exibem um fenótipo eletrofisiológico que os diferencia de outros neurônios no cérebro. Em particular surgem espontaneamente a uma velocidade lenta (1-3 Hz). Além disso, esta velocidade lenta é acompanhada por um potencial oscilatório sub-limiar lento. Ao fim de 2 - 3 semanas in vitro, estas mesmas características fisiológicas são exibidas por neurônios DA Snpc cultivados a partir de ratinhos pós-natal precoces. Os neurônios DA diferenciados de hESCs exibiam de forma consistente (4/4 testes) este fenótipo fisiológico distintivo (figura 3-1g-i).
[344] A manutenção de neurônios mDA in vitro em d65 revelou que os neurônios positivos TX ainda expressam FoxA2 e fibras longas extendidas típicas dos neurônios mDA. Figura 3A. A medição da libertação de DA por HPLC revelou que os neurônios TH+ d65 velhos se mantêm funcionais in vitro Figura 3B.
[345] EXEMPLO IV: • enxerto de população de células neuronais DA novas em roedores, isto é ratinhos e ratos contendo neurônios danificados.
[346] Um dos principais desafios neste domínio reside na capacidade de gerar neurônios DA do mesencéfalo derivados de hPSC que enxertem funcionalmente in vivo sem o risco de desenvolvimento excessivo neuronal ou diferenciação inapropriada em neurônios não-mesencefálicos ou desenvolver teratomas. Com base nos estudos sobre transplantes de tecido fetal, os autores da presente invenção contemplaram a possibilidade de o tempo da saída do ciclo celular, marcado pela expressão de NURR1, possa ser uma fase adequada para o enxerto (aproximadamente ao dia 25 da diferenciação, figura 2).
[347] Estudos iniciais utilizando células com 25 dias em ratinhos adultos sem lesões revelaram uma sobrevivência robusta de neurônios FOXA2+/TH+ derivados de hPSC às 6 semanas após o transplante (figura 12). Foi testada a sobrevivência de células FOXA2+/TH+ a longo prazo em hospedeiros com Parkinson sem resultar em desenvolvimento neuronal excessivo. Com este propósito foram provocadas lesões 6-hidroxi-dopamina (6-OHDA) (Tabar, et al. Nature Med. 14:379-381 (2008), incorporado a título de referência) em ratinhos null NOD- SCID IL2Rgc, uma estirpe que suporta com eficiência sobrevivência de xenoenxertos com particular sensibilidade para a exposição de células tumorgénicas raras (Quintana, et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature 456:593-598 (2008), incorporado a título de referência). Ambas as culturas de neurônios DA derivados de placas basais e de roseta foram enxertadas (150 x 103 células/animal) sem purificação prévia a fim de revelar células potencialmente contaminantes com elevado potencial proliferante. Quatro meses e meio depois do transplante os enxertos neuronais DA derivados de placas basais revelaram um núcleo de enxerto bem definido de células TH+ co-expressador de FOXA2 e do marcador específico humano hNCAM (figura 4a-c). A análise funcional revelou uma recuperação completa do comportamento de rotação induzido por anfetamina.
[348] Em contraste, os enxertos neuronais derivados de roseta revelaram poucos neurônios TH+, não produziram uma redução significativa do comportamento de rotação (figura 4d) e exibiram um desenvolvimento excessivo neuronal massivo (volume do enxerto > 20 mm3, figura 13). O extenso desenvolvimento excessivo das células neuronais derivadas de roseta no enxerto, como acabámos de descrever, foi comparável ao trabalho anterior com enxertos DA derivados de roseta do grupo do inventor (Kim, et al. miR-371-3 Expression Predicts Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8:695-706 (2011), incorporado a título ode referência) e outros (Hargus, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107:15921-15926 (2010), incorporado a título de referência). O desenvolvimento excessivo ficou provavelmente a dever-se a maiores períodos de sobrevivência (4,5 meses contra 6 semanas), ausência de purificação FACS antes do transplante e seleção de hospedeiro null NOD-SCID IL2Rgc. Número de Designs
[349] Pensa-se que o desenvolvimento excessivo neural seja provocado por células neuroectodérmicas anteriores primitivas no enxerto (Elkabetz, et al. Genes Dev. 22:152-165 (2008); Aubry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA 105:16707-16712 (2008), incorporado a título de referência). Natl. Acad. Sci. Esta hipótese foi suportada pela expressão do marcador mesencefálico FOXG1 na roseta mas não enxertos derivados do placas basais. Uma pequena percentagem de células astrogliais encontrava-se presente nos enxertos derivados de placas basais e de roseta, embora a maioria das células GFAP+ eram negativas quanto a marcadores humanos indicadores da origem do hospedeiro (figura 13.)
[350] Resultados em ratinhos null NOD-SCID IL2Rgc descritos demonstraram uma sobrevivência a longo prazo robusta de neurônios FOXA2+/TH+, reversão completa do comportamento de rotação induzido por anfetamina e ausência de sinais de desenvolvimento excessivo neural. No entanto, alguns destes resultados podem ser atribuídos ao uso específico de ratinhos null NOD-SCID IL2Rgc. Para testar esta hipótese, culturas de neurônios DA derivados de placas basais (250 x 103 células) foram transplantadas em ratinhos lesionados 6-OHDA adultos imunossuprimidos farmacologicamente com ciclosporina A. Cinco meses após o transplante, a sobrevivência do enxerto era robusta (figura 4e-h) com uma média de mais de 15.000 células TH+ co-expressoras de FOXA2 (figura 4g) e antígeno nuclear humano (hNA) (figura 4e); as fibras TH+/hNCAM+ emanadas do núcleo do enxerto no estriado envolvente do hospedeiro (figura 4f). Para além do FOXA2, células TH+ expressaram os marcadores neuronais DA do mesencéfalo PITX3 e NURR1 (figura 4h-j).
[351] As análises comportamentais revelaram uma recuperação completa da assimetria rotacional induzida por anfetamina, em contraste com animais com enxerto simulado, que não apresentaram melhorias (figura 4k). Os animais submetidos a enxerto revelaram também melhorias no teste de marcha (figura 4l) que mediu a acinésia dos membros anteriores e no teste do cilindro (figura 4m), experiências que não dependem da estimulação farmacológica do sistema DA. O início tardio da recuperação (aproximadamente 3 a 4 meses após o transplante) está previsto para neurônios DA humanos e depende da taxa de maturação in vivo, tal como os níveis de expressão DAT (figura 4n). A presença de células TH+ expressoras de canais Kir3.2(GIRK2) ou calbindina indicam que tanto Snpc (A9) e neurônios DA da área tegmental ventral (A10) encontram-se presentes no enxerto (figura 40,p).
[352] Tal como nos ratinhos (figura 13), as células serotonérgicas e GABAérgicas eram raras (< 1% do total de células) em células de rato, assim como as células gliais GFAP maioritariamente derivadas de hospedeiro (7% do total de células; (figura 14). Embora tenham sido detectados poucos neurônios serotonina+ no enxerto, foram observadas células negativas hNCAM que eram provavelmente fibras serotonérgicas derivadas do hospedeiro (figura 14).
[353] EXEMPLO V: • enxerto de população de células neuronais DA novas em primatas contendo neurônios danificados.
[354] Os resultados demonstrados revelam uma excelente sobrevivência do enxerto e resultado comportamental em dois modelos independentes de roedor. No entanto, o número neurônios DA necessários em um cérebro de rato ou de ratinho representa uma pequena fracção do maior número de células necessárias para um enxerto em primatas e seres humanos. Para testar a facilidade de ampliação deste protocolo, foram realizados estudos de enxerto piloto executados em dois macacos rhesus lesionados MPTP adultos.
[355] Lotes de 50 x 106 precursores neuronais DA transplantáveis forma obtidos no dia 25 da diferenciação utilizando o protocolo baseado no placas basais. Uma dose clássica para a indução de uma condição semelhante a Parkinson foi de 3 mg de MPTP-HCL injetados na artéria carótida (entre 0,5-5 mg). Esta foi seguida de injeção sistémica de 0,2 mg/kg IV de MPTP. As células foram injetadas em três locais (núcleo caudado posterior e putâmen précomissural) de cada lado do cérebro (6 tratos no total, 1.25 x 106 células/trato) e os animais foram imunocomprometidos com ciclosporina A. Um lado do cérebro foi injetado com precursores DA de um subclone de H9 expressor de GFP, enquanto o outro lado foi enxertado com células derivadas de células H9 sem marcação. Os resultados que mostram o enxerto de neurônios em macacos rhesus com expressão continuada de FOX2A e produção de TH encontram-se na figura 4q-t.
[356] Um mês após o transplante, observou-se a sobrevivência robusta de neurônios DA do mesencéfalo com base na expressão de GFP (figura 15) e do marcador citoplasmático específico do ser humano (SC-121) (figura 4q). Cada núcleo de enxerto foi envolvido por uma auréola de fibras TH+ que se prolonga até 3 mm dentro do hospedeiro (figura 4r). Os núcleos de enxerto foram constituídos por neurônios TH+, co-expressores de SC-121 (figura 4s) e FOXA2 (figura 4t).
[357] As áreas SC-121 e GFP negativas no enxerto continham microglia do hospedeiro Ibal+ (figura 15) indicadora de imunossupressão incompleta. Em resumo, o enxerto de uma população de células neuronais DA novas em primatas, isto é macacos rhesus lesionados MPTP adultos (3 mg de MPTP-HCL (l-metil-4- fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridina; com uma concentração entre 0,5 e 5 mg de MPTP- HCl) contendo uma perda grave > 95% de neurônios DA do mesencéfalo endógenos. A exposição a MPTP provocou alterações observáveis e sintomas similares à doença de Parkinson em seres humanos.
EXEMPLO VI.
[358] Diferenciação comparável potencial em relação ao destino dos neurônios DA do mesencéfalo das células PINK1 mutantes PD-iPSC comparativamente com células hES (ou iPSC). Este exemplo descreve a descoberta de que grandes populações de neurônios DA do mesencéfalo se desenvolveram com características dos neurônios de um doente com PD, quando a linhagem celular deste doente, isto é, célula PD-iPSC mutante PINK1, obtida de modo que não resultou na destruição de um embrião, foi utilizada como população de células para se obter neurônios DA FOXA2/LIM1XA/TH+ das presentes invenções. Uma linhagem PD-iPSC mutante de PINK1 Q456X foi diferenciada com o novo protocolo de neurônios DA do mesencéfalo (método) da presente invenção, que rendeu perfis de diferenciação comparáveis aos obtidos da linhagem H9 iPSC. (figura 20). A-C) análise imunocitoquímica da linhagem PD-iPSC do mutante PINK1 no dia 11 da diferenciação (fase do precursor mesencefálico) para diferenciação FOXA2 (vermelho), LMX1A (verde) e DAPI (azul) (A), dia 25 da diferenciação (fase neuronal DA pós-mitótica precoce) para FOXA2 (vermelho) e TH (verde) (B) e para NURR1 (vermelho) e TH (verde) (C).• D-f) O mesmo conjunto de análises imunocitoquímicas executadas com as células derivadas de H9 no dia 11 da diferenciação para diferenciação FOXA2 (vermelho), LMX1A (verde) e DAPI (azul) (D), dia 25 da diferenciação para FOXA2 (vermelho) e TH (verde) (E) e para NURR1 (vermelho) e TH (verde) (F).
[359] PD-iPSC PINK1 mutante revelou um fenótipo semelhante a PD da agregação de proteínas, seguido de diferenciação a longo prazo e maturação in vitro. Os autores da invenção descobriram que PD-iPSC do mutante PINK1 mostra evidências de expressão de a-sincucleína (componente principal dos corpos de Lewis em doentes com PD) no citosol de neurônios DA TH+ no dia 55 da diferenciação, utilizando o novo protocolo de indução de neurônios DA do mesencéfalo baseados em placa basal, (figura 21a-b). A, B) análise imunocitoquímica da linhagem PF-iPSC mutante PINK1 no dia 55 da diferenciação para α-sinucleina (LB509, vermelho), TH (verde) e imagem incluída (A) e α- sinucleina (vermelho) e ubiquitina (verde) (B). Estas células positivas para α- sinucleina apresentam também uma elevada expressão de ubiquitina (marcador clássico de corpos de Lewis). Em contraste, os neurônios DA derivados da linhagem iPS de controlo revelaram a expressão de α-sinucleina sináptica (em contraste com citosólica) normal e níveis muito baixos de ubiquitina (figura 21c-d). C, D) análise imunocitoquímica da linhagem iPSC de controlo no dia 55 da diferenciação para α-sinucleina (vermelho) e TH (verde) (C) e α-sinucleina (vermelho) e ubiquitina (verde) (D).
[360] Expressão da forma agregada de α-sinucleina. No cérebro de um doente com PD, uma forma dimerizada insolúvel de α-sinucleina conduz à agregação nos corpos de Lewis. A forma dimerizada de uma α-sinucleina revela a fosforilação de serina 129 de a-sinucleína.
[361] No mesmo dia da diferenciação, células derivadas de PD-iPSC mutante PINK1 revelaram uma forte expressão de a-sinucleína fosforilada Ser129 em contraste com células derivadas de iPSC de controlo que revelaram níveis muito baixos de expressão (figura 22). Células derivadas de PD-iPSC mutante PINK1 revelaram uma forte expressão de a-sinucleína fosforilada Ser129 em contraste com células derivadas de iPSC de controlo que revelaram níveis muito baixos de expressão. A, B) Análise imunocitoquímica de α-sinucleina fosforilada Ser129 (verde) e DAPI (azul) em células derivadas de PD-iPSC mutante PINK1 no dia 55 da diferenciação (A) e células derivadas de iPSC de controlo correspondentes (B).
[362] Diferenças observadas nos padrões de expressão de α-sinucleina dependentes do protocolo de diferenciação. Os inventores contemplaram que os neurônios DA do mesencéfalo “autênticos” derivados de placa basal revelaram uma vulnerabilidade específica de PD e fenótipos in vitro específicos correspondentes. Os neurônios DA obtidos utilizando o protocolo de diferenciação à base de alimentadoras estromais MS5 clássicas (Perrier et al., PNAS 2004, incorporado a título de referência) produziram um grande número de neurônios TH+.
[363] No entanto, com base nos dados obtidos durante o desenvolvimento das presentes invenções, os inventores revelaram que as células TH+ baseadas em MS5 não eram verdadeiros neurônios DA do mesencéfalo derivados da placa basal. Em culturas diferenciadas através do protocolo MS5, existiam muitas células positivas para α-sinucleina. No entanto, estas células não co-expressaram TH. Além disso, não se verificou qualquer diferença nos padrões de expressão entre PD-iPSC e iPSC de controlo com o uso da estratégia de diferenciação MS5 (figura 23a-b).
[364] Estes dados indicam que é também expressa uma α-sinucleina em outros tipos de células não DA e que esta α-sinucleina não DA permanece inalterada em células doentes comparativamente com células derivadas de iPSC de controlo, em particular quando utilizando protocolos de diferenciação MS5 padrão. Estes são os neurônios derivados de roseta semelhantes a DA, registados nas publicações (por ex. Perrier PNAS 2004). Estas células (=semelhantes a DA) TH+ à base de MS5 são utilizadas para comparação com a figura 3, 10, 13 e 16. Estes dados indicam que é também expressa uma α-sinucleina em outros tipos de células não DA e que esta α-sinucleina não DA permanece inalterada em células doentes comparativamente com células derivadas de iPSC de controlo, em particular quando utilizando protocolos de diferenciação MS5 padrão. Por fim, o novo protocolo de diferenciação à base da placa basal descrito rende um grande número de células TH+ co-expressoras de α-sinucleina. Estas células TH+ expressam a-sinucleína em um padrão de expressão citosólico. A figura 24A, B) análise imunocitoquímica da linhagem PD-iPSC mutante PINK1 nos dias 60 da diferenciação à base de MS5 para α-sinucleina (LB509, vermelho), TH (verde) (A) e iPSC de controlo (B). C) análise imunocitoquímica da linhagem PF-iPSC mutante PINK1 no dia 55 da diferenciação à base da placa basal para α-sinucleina (vermelho), TH (verde).
[365] Exemplos de neurônios DA derivados de células PD-iPS PINK1 mutante são mais vulneráveis à estimulação tóxica.
[366] Os neurônios DA TH+ derivados de PD-iPSC através do protocolo à base da placa basal eram mais vulneráveis ao desafio com toxina (valinomicina: ionoforo mitocondrial, 5 μM (com uma concentração entre 1.10 μM), 48 h) do que as células derivadas de iPSC de controlo. Em contraste, os neurônios TH+ derivados através do protocolo à base de MS5 clássico não revelaram vulnerabilidade diferencial entre células derivadas de PD e células derivadas de controlo (figura 24). 25 A-F) Imunocitoquímica TH representativa no dia 60 da diferenciação: Normal
[367] Condição (sem tratamento com toxina) tanto para as células derivadas de PD-iPSC como de controlo, obtidas pelo protocolo baseado nas placas basais (A, células derivadas de PD-iPSC), degeneração quase completa dos neurônios DA TH+ em PD-iPSC na sequência do tratamento com toxina (B), parcialmente neurônios DA HT+ parcialmente degenerados do iPSC de controlo (C). Uma análise da viabilidade da célula inteira com azul de alamar, ao fim de 48 horas de tratamento com valinomicina também revelou uma sobrevivência celular diferencial em um intervalo de dosagem para o desafio com toxina (5 a 10 μM) em comparação com PD-iPSC e iPSC de controlo (figura 25).
[368] Uma condição normal de ambas as culturas derivadas de PD-iPSC e iPSC de controlo obtidas através do protocolo com base em MS5 (D, apresentadas células derivadas de PD-iPSC), neurônios TH+ na sequência do desafio da toxina em PD-iPSC (E) e culturas derivadas de iPSC de controlo (F) obtidas através do protocolo MS5. G-H) imagens de baixa potência de imunocitoquimica para o protocolo para Tujl (vermelho) e TH (verde) com base em placas basais no dia 60 da diferenciação. PD-iPSC de condições normais (G), contra desafio com toxina (H) e iPSC de controlo em condições normais (I), contra condições de desafio com toxina (J). K-N) imagens de baixa potência de imunocitoquimica para o protocolo para Tujl (vermelho) e TH (verde) com base em MS5 no dia 60 da diferenciação.
[369] PD-iPSC de condições normais (K), contra desafio com toxina (L) e iPSC de controlo em condições normais (M), contra condições de desafio com toxina (N).F
[370] Quantificação de exemplo da viabilidade de células - análise de resposta à dose para o desavio com toxinas. Uma análise da viabilidade da célula com azul de alamar, ao fim de 48 horas de tratamento com valinomicina também revelou uma sobrevivência celular diferencial em um intervalo de dosagem para o desafio com toxina (5 a 10 μM) em comparação com PD-iPSC e iPSC de controlo (dia 60 da diferenciação com base em placas basais). Nota: esta análise testa a morte celular geral, tendo-se observado os efeitos mais dramáticos especificamente em neurônios DA (ver figura 14). Por conseguinte, quantificações com base em azul de alamar apresentaram muito provavelmente uma estimativa por baixo da extensão do efeito diferencial observado nas linhagens de neurônios DA.
[371] Referências incorporadas por referência. Li, et al. Nat. Biotechnol. 23, 215- 221 (2005); Perrier, et al. Proc Natl Acad Sci US 101, 12543-8 (2004); Perrier, etal. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004); Tabar, etal. Nature Med. 14, 379-381 (2008); Perrier, etal. Proc Natl Acad Sci USA 101, 12543-8 (2004); Wernig, etal. Proc. 25 Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 5856-5861 (2008); Lindvall, et al. J. Clin. Invest 120, 29-40 (2010); Roy, etal. Nature Med. 12, 1259-1268 (2006); Elkabetz, etal. Genes Dev. 22, 152-165 (2008); Kittappa, et al. PLoS. Biol. 5, e325 (2007; Ferri, et al. Development 134, 2761-2769 (2007); Roelink, et al. Cell 16, 761-775 (1994); Liem, et al. Cell 82, 969- 979 (1995); Fasano, et al. Cell Stem Cell 6, 336347 (2010); Chambers, et al. Nat. 30 Biotechnol. 27, 275-280 (2009); Muroyama, et al. Genes Dev. 16, 548-553 (2002); Joksimovic et al. Nat Neurosci 12, 125-131 (2009); Lyashenko, et al. Nat. Cell Biol. 13, 753-761 (2011); VanDunk, et al. J. Neurosci. 31, 6457-6467 (2011); Huang, etal. Nat. Protoc. 4, 44-57 (2009); Costa, et al. Mol. Cell Biol. 9, 1415-1425 (1989); Elkabetz, et al. Genes Dev. 22, 152-165 (2008); Soldner, etal. Cell 136, 964-977 (2009); Guzman, et al. J. Neurosci. 29, 11011-11019 (2009); Nedergaard, et al. J. Physiol 466, 727-747 5 (1993); Ferrari, et al. Eur. J. Neurosci. 24, 1885-1896 (2006); Olanow, et al. Trends Neurosci. 19, 102-109 (1996); Zetterstrom, etal Science 276, 248-250 (1997); Quintana, et al. Nature 456, 593-598 (2008); Kim, et al. diets Neural Differentiation Propensity in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell 8, 695-706 (2011); Hargu, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 10 107, 15921-15926 (2010); Aubry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA 105, 1670716712 (2008); Blume, et al., Exp. Neurol. 219, 208-211 (2009); Ban, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A(2011); Studer, et al., Nature Neurosci. 1, 290-295 (1998); ICordower, et al., Science 290, 767-773 (2000); Paxinos, et al., The Rhesus Monkey Brain in Stereotaxic CoordinatesAAcademic Press, 2000); Crawley, What's Wrong With My Mouse: 15 Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mz'ce(Wiley-Liss, 2000); Studer, et al., Brain Res. Bull. 41, 143-150 (1996); Tabar, et al., Nat. Biotechnol. 23, 601-606 (2005); and Placantonakis, et al., Stem Cells 27, 521-532 (2009).
EXEMPLO VII:
[372] Foram estabelecidas as condições de exemplo para o registo in vivo de neurônios DA derivados de células tronco pluripotentes humanas em preparações de corte agudo, ver figura 26.
[373] São contempladas medições eletrofisiológicas para uso em preparações de corte agodo, isto é, de biópsias das áreas enxertadas. Em uma realização, neurônios DA derivados de enxerto tipo A9 contra tipo A10 serão identificados in vivo com base nos testes para a atividade marcapasso autónoma que é específica dos neurônios dopaminérgicos tipo A9, que são os mais afetados na PD. Por outras palavras, os neurônios tipo A10 não têm atividade marcapasso.
[374] Foram estabelecidas as condições para o registo in vivo de neurônios DA derivados de células tronco pluripotentes humanas em preparações de corte agudo, ver figura 26. Especificamente, os neurônios DA humanos enxertados, derivados de células estaminais pluripotentes, foram medidos e descobriu-se que tinham funcionalidades eletrofisiológicas típicas daquelas observadas na parte compacta da substância negra de ratos (SNpc), figura 26A, em que a vista superior revela a reconstrução de um neurônio marcapasso na região do enxerto. Em baixo encontra-se uma fotomicrografia de exemplo de uma fatia de cérebro retirada do rato no qual foram injetados neurônios derivados de hES 9 meses antes; o enxerto está delineado, encontra-se incluída uma imagem com maior ampliação abaixo. A fatia foi processada com tirosina hidroxilase que se pode ver a branco, figura 26B. Além disso, a vista superior apresenta um registo da área ligada à célula de um neurônio DA putativo no enxerto; Abaixo encontra-se um registo de célula inteira de exemplo da mesma célula. Os registos foram realizados na presença de antagonistas do receptor glutamato e GABA (50 μM AP5, 10 μM CNQX e 10 μM GABAzina) para eliminar sinais sinápticos.
[375] Estes registos demonstram que os neurônios derivados de PS eram marcapasso autónomos com trajetórias de tensão intrassomáticas normais. Outro neurônio registado em uma amostra de enxerto apresentava propriedades similares, figura 26C. Para comparação, são apresentados registos de ligado à célula e célula inteira de um neurônio dopaminérgico em Snpc de um ratinho adulto. As abreviaturas (CTx= córtex STr= corpo estriado, SNpc= parte compacta da substância negra, DA= dopaminérgico). Estes dados mostram estudos funcionais in vivo no corpo estriado de ratos enxertados após o transplante. Assim, em algumas realizações, estudos funcionais in vivo em tecido enxertado demonstram a recuperação da parte compacta da substância negra (SNpc).
EXEMPLO VIII:
[376] Métodos de exemplo para identificação de marcadores da superfície celular para uso em métodos das presentes invenções. Em particular, foi identificado cd142 com estes métodos.
[377] Duas principais estratégias para identificar os marcadores de superfície candidatos: um ecrã de expressão genética em linhagens relatoras genéticas (figura 27a) revelaram vários marcadores candidatos, incluindo CD142 e um marcador designado DCSM1, que foi expresso seletivamente nos neurônios DA do mesencéfalo e aparentemente marcou especificamente neurônios DA tipo A9 (figura 27b). Uma segunda estratégia consistia no uso de um ecrã marcador da superfície celular CD em neurônios DA derivados de hESC, que foi testado quanto a 242 anticorpos à venda em formato 96 poços (figura 27c,d). O resultado de um ecrã de exemplo destes (figura 27e) conduziu à identificação de pelo menos 5 marcadores validados, enriquecidos em neurônios DA do mesencéfalo, incluindo CD142, um marcador que marcou seletivamente um estádio dos neurônios DA Nurr1+ (figura 27f).
[378] Com o uso do procedimento com células neuronais DA presentemente descrito, CD142 marcou tipicamente aproximadamente 30% da população total de células no dia 25 da diferenciação (figura 28a). Selectividade de CD142 para uma fase de neurônios DA Nurr1 foi confirmada em múltiplas linhagens hESC e hiPSC independentes (figura 28b). Além de enriquecimento dos neurônios DA, o enriquecimento das células positivas por CD142 resultou no esgotamento seletivo de subtipos indesejados de neurônios, tais como GABA e neurônios serotonérgicos. (Figura 28c-f). Estudos in vivo confirmaram a capacidade da população de células positiva CD142 para dar origem a enxertos de neurônios DA de elevado grau de pureza, que ultrapassaram os problemas de contaminação GABA e neurônios serotonérgicos. Como o procedimento de enxerto que empregou células sem purificação já resultou em muito poucos neurônios serotonérgicos, o uso de seleção com base em CD142 das células precursoras está previsto para reduzir ainda mais o risco de introdução de neurônios serotonérgicos, um tipo de células contaminante que tem sido implicado nas falhas de enxertos com tecido fetal humano com fonte potencial de disquinésias induzidas por enxertos de tecido fetal indesejado. EXEMPLO IX:
[379] Este exemplo descreve os métodos de transformação das células com genes PST 15 humanos para aumentar a expressão de superfície celular de PSA. Este exemplo também mostra métodos de exemplo de uso de células com uma expressão aumentada de PSA na superfície da célula.
[380] Especificamente, este exemplo mostra genes PST modificados em hESC para aumentar a expressão de PSA em neurônios DA. Foi introduzido um gene codificador da polissialiltransferase humana (hPST) em uma linhagem hESC (WA01) utilizando um vector lentiviral (pLenty, Invitrogen). Foram expandidos vinte clones selecionados e foram analisados quanto à expressão de PST. Os clones hESC expressores de PST foram diferenciados para assegurar que PST não é silenciado nos neurônios DA. A quantificação de PSA-NCAM em estádios diferentes da diferenciação (dia 0, 11, 25 e 50) foi realizada utilizando a análise FACS e imunofluorescência (Operetta). Os clones positivos foram sujeitos ao conjunto de parâmetros QC dos neurônios DA esbolados no quadro 7. Pelo menos 3 clones que retêm níveis elevados e uniformes de PSA-NCAM durante a diferenciação e têm boa execução em termos dos parâmetros QC (quadro 7) avançam para a avaliação do desenvolvimento de neurites em neurônios DA derivados de hESC com sobreexpressão de PST. O controlo selecionado e clones hESC sobre-expressores de PST foram diferenciados em neurônios DA, utilizando o protocolo standard descrito presentemente, seguido de fixação celular e análise no dia 25 e 50. O número e comprimento de fibras TH positivas nestas culturas foi quantificado com Microscópio Operetta High Content.• módulo de Análise de Neurites em software Harmony 3.0, quantificou o número de neurites e o comprimento com e sem PST, e os dados foram analisados estatisticamente através de ANOVA com dois fatores. A sobreexpressão PST e clones hESC de controlo derivados de estudos in vitro acima foram diferenciados novamente em neurônios DA e transplantados para um modelo de rato de DP. Foram realizados enxertos de curto prazo (4-6 semanas) para determinar a sobrevivência, expressão PSA-NCAM e desenvolvimento de neurites. Cada clone que passou nos parâmetros in vivo a curto prazo foi sujeito a estudos de enxerto a longo prazo. Nestes estudos, os animais receberam metade ou um quarto da dose padrão (200 x 103) de células. Estes estudos debruçavam-se sobre a possibilidade de mais PSA conduzir a uma maior sobrevivência a longo prazo após o transplante (5 meses) e se um número menor de neurônios DA é capaz de corresponder ou ultrapassar a capacidade funcional de enxertos não PST transplantados a doses de células padrão (não figura 27). Além disso, exames comportamentais complexos, sensíveis à extensão da re-inervação do corpo estriado, foram monitorizados para distinguir o potencial funcional de PST contra enxertos de neurônios DA de controlo. Os animais foram sacrificados após a conclusão dos exames comportamentais e o desenvolvimento de fibras foi quantificado utilizando anticorpos específicos humanis NCAM e SC121 e anticorpos contra TH (ver também a figura 29). A intensidade e disseminação de enxertos hNCAM+, SC121+ e TH+ foi medida, assim como a percentagem de células humanas co-expressoras de marcadores de neurônios DA (TH, FOXA2) e PSA. A densidade da auréola NCAM/TH+ de neurites que emanavam do enxerto foi quantificada a diferentes distâncias.
[381] Os dados foram comparados entre grupos, utilizando ANOVA com dois fatores com um teste post-hoc de Bonferroni. Além disso, alguns enxertos foram examinados quanto a alterações qualitativas (por ex. ramificações, espessura, distribuição do enxerto e forma). Além disso, alguns enxertos serão processados para serem submetidos a avaliação eletrofisiológica em fatias em termos do fenótipo A9, formação de sinapses com o corpo estriado do hospedeiro, assim como a inervação por aferentes endógenos. Exemplo X: • exemplo seguinte mostra a ampliação da expressão com ácido polissiálico que melhorou a função dos enxertos neuronais dopaminérgicos derivados de ES em ratinhos com Parkinson.
[382] As células ES expressoras de GFP sob o controlo do promotor Nurr1 (células Nurr1::GFP ES) foram transduzida com estabilidade, com um vector lentiviral omnipresente expressor de polissialiltransferase (PST). As células transduzidas revelaram um aumento dramático em mARN PST em comparação com os controlos (fig. 30A).
[383] Observou-se que a expressão de PST era suficiente para a síntese de PSA em NCAM. Assim, a expressão PSA-NCAM aumentou muito em células modificadas com PST no dia 14 da diferenciação de neurônios DA (fig. 30B-E). Tanto o PSA da superfície celular endógeno como induzido em neurônios DA derivados de ES pode ser removido (fig. 30E) com uma endoneuraminidase fágica (endoN) que cliva especificamente os polímeros de ácido siálico com ligação alfa- 2,8 única do PSA. Surpreendentemente, não se observou que a transdução PST afetasse a expressão de marcadores neuronais ou mesencefálicos nos neurônios DA purificados com GFP (fig. 3OF).
[384] Outros estudos em ratinhos hemiparkinsonianos lesionados com 60HDA revelaram que o transplante de aproximadamente 100.000 precursores de neurônios DA derivados de ES é necessário para produzir uma recuperação funcional robusta, como foi medido através do teste de rotação intensificado com anfetamina. Nos presentes estudos, procura-se enxertar um número de células abaixo do ideal a fim de se conseguir atingir o aumento através de expressão PSA ampliada. A fim de transplantar populações de neurônios DA muito enriquecidas, isentas de células pluripotentes contaminantes, culturas purificadas FACS no dia 14 da diferenciação para expressão de GFP estimulado por Nurr1 e ausência de expressão de SSEA-1 (figura 31). Sem sobreexpressão PST, uma redução do tamanho do enxerto minimamente eficiente para metade (55.000 células DA Nurr1+) não foi capaz de produzir uma recuperação comportamental detectável. Em contraste, com uma expressão PSA ampliada, o mesmo número de neurônios DA Nurr1/PST teve como resultado uma correção significativa da incapacidade comportamental PD (p < 0,01, ANOVA com dois fatores) com recuperação completa aproximadamente 5 semanas após a cirurgia (figura 32A). A remoção PSA antes do transplante por meio de incubação com endoN indicou a especificidade da ampliação com PSA, na medida que o tratamento endoN inverteu parcialmente a restituição funcional obtida com Nurr1/PST (figura 32A).
[385] Para examinar as características das células enxertadas, a imuno- histoquímica dos animais foi processada dois meses após o transplante. Verificou- se uma diferença quanto ao número de neurônios Nurr1+ sobreviventes, na medida em que os animais enxertados com a linhagem transduzida com PST apresentavam em média o dobro das células GFP do que os animais enxertados com células de controlo (9.300 +/- 1.400 vs. 4.230 +/- 1010 células GFP+ por enxerto em amostras de controlo contra PST respectivamente; a figura 32B, p < 0,05, teste t de Student). Além disso, os enxertos Nurr1/PST apresentam também níveis mais elevados de expressão PSA in vivo (figura 32C,D).
[386] No entanto, as proporções de células expressoras dos marcadores DA do mesencéfalo TH e Foxa2, no núcleo do enxerto, foram comparáveis às células Nurr1 e Nurr1/PST (TH: 62,0% +/- 8,0 vs. 51,3%+/- 7,0 p = 0,33; FoxA2: 63,2% +/8,6 vs. 55,4% +/- 2,0, p = 0,3, respectivamente; Figura 32E).
[387] Os processos neuronais que emergiram das células Nurr1 e Nurr1/PST revelaram níveis comparáveis de TH, Girk2 (acoplado a proteína G, canal de potássio com retificação interna) e sinapsina (figura 33 A). Ao contrário de outros estudos com células de Schwann transplantadas (Ghosh, et al. Extensive cell migration, axon regeneration, and improved cells after spinal cord injury. Glia 60, 979-992 (2012)), a expressão PSA ampliada pouco afetou a migração de células DA a partir do local do enxerto. No entanto, verificaram-se alterações evidentes no desenvolvimento dos neurites. Como se mostra na figura 33B, houve mais processos neuronais DA que emergiram das células Nurr1/PST comparativamente com os controlos Nurr1. Quando a intensidade da imunofluorescência GFP e TH foi quantificada em cinco zonas de 100 μm sucessivas afastadas do transplante, os enxertos Nurr1&PST apresentavam uma densidade de processos relativa muito superior (figura 33C,D, p< 0,01 tanto para GFP como TH, ANOVA com dois fatores). Na quantificação deste efeito, normalizou-se a densidade relativa dos processos com a densidade observada na zona mais proximal imediatamente junto ao núcleo do enxerto.
[388] Esta normalização foi necessária para compensar o maior número de células sobreviventes nos enxertos Nurr1/PST e confirmar um efeito específico do PSA no desenvolvimento de neurites. Ficou também demonstrada especificidade com a remoção do PSA da superfície celular por meio de tratamento com endoN antes do enxerto. Assim, o pré-tratamento com endoN reduziu o desenvolvimento de fibras distais até aos níveis do controlo (figura 33E).
[389] Estas descobertas revelaram que pelo menos alguns dos efeitos do PSA na funcionalidade do enxerto resultaram de uma inervação maior das fibras no corpo estriado. Assim, verificou-se uma forte correlação entre a funcionalidade do enxerto e a extensão relativa do desenvolvimento de fibras positivo para GFP, por exemplo na zona IV (figura 33F; p < 0,001, r2 = 0,65, n = 17).
[390] Surpreendentemente, a relação desenvolvimento de fibras/comportamento foi consistente para os grupos experimentais (controlo, PSA aumentado e tratado com endoN), indicando que a inervação enxerto-hospedeiro constituiu um parâmetro da recuperação comportamental no modelo de ratinho com Parkinson.
[391] Em termo mecânicos, vários fatores contribuíram para aumentar o desenvolvimento de fibras, tais como a maior penetração da zona de células glia reativas encapsuladoras do núcleo do enxerto, maior capacidade de desenvolver novas ramificações, melhor desenvolvimento nos tecidos do hospedeiro vizinhos (por enxerto, translocação do cone de crescimento mais fácil) e prevenção de ligações prematuras com o tecido do hospedeiro na proximidade do núcleo do enxerto. Os mecanismos de exemplo são consistentes com a função do PSA na facilitação do desenvolvimento do processo durante o desenvolvimento normal e no sistema nervoso do adulto.
[392] As experiências descritas demonstraram o uso de PSA modificado no enxerto de neurônios DA, que proporcionou resultados superiores em comparação com os enxertos de outros tipos de células. Os dados indicam claramente que a ampliação com PSA proporcionou um significativo aumento da capacidade de inervação dos neurônios DA enxertados no corpo estriado do hospedeiro e atenuam as deficiências funcionais PD. Por conseguinte, a tradução clínica está contemplada, compreendendo os neurônios DA das presentes invenções para proporcionar células antes do transplante.
[393] Em algumas realizações, as células serão geneticamente manipuladas para expressarem PSA. Em algumas realizações, PST pode ser apresentado diretamente nas células através da exposição à enzima purificada e substrato, in vitro, antes do transplante. Em algumas realizações, a estratégia PSA para a tradução humana em enxertos PD está prevista para minimizar a necessidade de múltiplas injeções e reduzir assim os riscos cirúrgicos resultantes destas múltiplas injeções.
[394] Em outras realizações, esta tecnologia está contemplada para uso noutros tipos de células e espécies, por exemplo, no aumento da migração de células de Schwann enxertadas na criação de uma ponte (por exemplo, comunicação célula-célula) para o crescimento de novo de axónios no local da lesão da medula espinal.
[395] Seguem-se exemplos de materiais e métodos utilizados neste exemplo.
[396] Animais: Ratinhos 129S3/SvImJ de seis semanas de idade (Jackson Laboratory) foram mantidos sob temperatura controlada, com alimento e água disponíveis ad libitum. Foram executados procedimentos experimentais de acordo com as diretrizes NIH e de uso de animais institucionais, aprovadas pela Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) local e pelo Institutional Biosafety Committee (IBC).
[397] Teste induzido por injeção de 60HDA e anfetaminas: Os animais foram anestesiados com pentobarbital de sódio (10 mg/kg) e foram injetados no corpo estriado direito com 2 μl de 60HDA (4 μg/μl em soro fisiológico, 0,5% de ácido ascórbico). As injeções foram executadas com uma seringa de Hamilton nas seguintes coordenadas: 0,5 mm posterior, 1,8 mm lateral relativamente ao bregma e 2,5 mm ventral em relação à superfície do cérebro.
[398] Antes da cirurgia os animais receberam uma única injeção i.p. de desipramina (25 mg/kg, Sigma). Duas semanas após a cirurgia os animais foram classificados com o teste da rotação induzida por anfetamina. Foram colocados em cilindros de plástico transparentes, de 30 cm de diâmetro durante meia hora, após o que receberam uma única injeção i.p. de anfetamina (10 mg/kg, Sigma). Ao fim de 20 min, o número de rotações ipsilaterais/contralaterias foram pontuadas durante mais 20 min. Os animais foram pontuados uma vez por semana durante sete semanas, depois foram profundamente anestesiados e perfundidos através do coração com PBS e 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4). Foram removidos os cérebros e foram afixo de um dia para outro a 4 °C em 4% de paraformaldeído, depois o vibrátomo cortou fatias (Pelco-101, Ted Pella) em secções digitais de 40 μm de espessura.
Diferenciação e transplante celular:
[399] Uma linhagem celular relatora ES de ratinho BAC transgénico ANurrl::GFP BAC (isto é, expressão GFP é impulsionada pelo promotor Nurr1) 5 foi transduzida com um lentivírus (pLenti, Invitrogen) contendo o gene PST de ratinho sob o controlo do promotor CMV. As células foram propagadas em MEFs tratados com mitomicina C (StemCell Technologies) em DMEM (Invitrogen), 10% FBS (HyClone) suplementado com 1.400 unidades /ml de LIF (ESGRO; Invitrogen), 2 mM L -glutamina, 1 mM p- mercaptoetanol, 100 U/ml penicilina e 100 μg/ml streptomicina (Invitrogen).
[400] A diferenciação DA foi induzida de acordo com Barberi et al., Nat Biotechnol 21, 1200- 1207 (2003), com modificações. Em resumo, as células foram diferenciadas em células alimentadoras MS5, em placas cobertas de gelatina (10.000 células/prato de 10 cm) e cultivadas durante quatro dias em meio com substituição de soro (SRM). No dia 4, adicionou-se Sonic hedghog (SHH, 200 ng/ml) e FGF8 (100 ng/ml). No dia 7 da diferenciação, os meios foram alterados para N2 suplementado com SHH, FGF8 e bFGF (10 ng/ml). No dia 11, foi induzida a diferenciação terminal com remoção de SHH, FGF8 e bFGF e a adição de ácido ascórbico (AA, 200 nM) e BDNF (20 ng/ml). As células foram colhidas no dia 14-15 com tratamento com acutase durante 45 minutos, lavadas uma vez com N2 e incubadas com anticorpo anti-SSEA-1 conjugado As células foram lavadas uma vez com N2, ressuspensas em tampão HEPES com 0,1% BSA.AlexaFluor-647 (BD Pharmingen) durante 25 min. Adicionou-se DAPI para avaliar a viabilidade. Foi executado FACS com um classificador de células MoFlo e a população de interesse foi classificada por fluorescência com GFP (Murr1). A população positiva para AlexaFluor-647 (SSEA-1) foi negativamente classificada. Para controlo negativo com GFP, foram utilizados células ES de ratinho J1 naive na mesma fase de diferenciação.
[401] Células classificadas com Nurrl::GFP foram analisadas quanto à viabilidade e ressuspensas em N2 com BDN e AA até atingir uma concentração final de 55.000 células/pl. Uma foi injetada no corpo estriado do ratinho lesionado com um capilar de vidro fino de ponta de 50 μm nas coordenadas: 0,3 mm posterior, 1,5 mm lateral relativamente ao bregma e 2,2 mm ventral em relação à superfície do cérebro. Re-semeou-se uma alíquota da suspensão de células em placas de 6 mm revestidas com matrigel para caracterização mais aprofundada.
[402] Quanto à análise por imunoluminescência, as células foram fixas com paraformaldeído durante 10 min a 4 0 C, lavadas por duas vezes com PBS, bloqueadas com 5% BSA (0,1% de Triton X-100 em PBS) e incubadas com anticorpos primários durante 2 h à temperatura ambiente: coelho anti-GFP coelho (1:1000, Invitrogen), IgM de ratinho anti-PSA (1:2000, 5A5), ratinho anti-NeuN (1:800, Chemicon), ratinho anti-TH (1:1000, Sigma), cabra anti-FoxA2 (1:800, Santa Cruz), cabra anti-Engrailed (1:800, Santa Cruz). As células foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com Cy (1:1000, Jackson).
[403] Tratamento com endoN: Para remover PSA de NCAM, na noite anterior à colheita as células foram tratadas com 20 unidades de endoN, uma enzima fágica que remove especificamente PSA 7-9. As células foram depois colhidas e injetadas como descrito anteriormente, mas foram ressuspensas me N2 com BDNF e AA e 5 unidades de endoN. Avaliámos anteriormente que a injeção da mesma quantidade de endoN apenas nos ratinhos lesionados não melhorava o comportamento do animal.
[404] Análise PST mARN e PSA-NCAM in vitro: Para a análise com mancha de Western, as células foram tratadas com tampão WB (PBS com 1% NP40, NaCl 150 mM , EDTA 1 mM e 1x inibidores protease/fosfatase adicionados imediatamente antes da extração, a pH de 7,4) e sonicados por duas vezes durante 5 seg., centrifugados e ressuspensos em tampão Laemli (LB). Foram guardadas alíquotas sem LB para determinação das proteínas. Foram carregadas quantidades iguais de proteína em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida de eletroforese (BioRad). As proteínas foram transferidas por eletroforese para membranas de polivinilideno (Milipore). As membranas foram bloqueadas durante 1 - 6 horas em 0,1 % de Triton X-100 TBS (TBS-T) com 5% de leite em pó desnatado e incubadas de um dia para outro com anticorpo NCAM (1:10.000, Santa Cruz) em TBS-T com 5% de leite. As manchas foram depois incubadas com anticorpo secundário conjugado a peroxidase (1:10.000 Jackson) e detectadas pelo método de detecção ECL (Amersham Pharmacia Biotech). Os níveis de proteína foram quantificados recorrendo ao software ImajeJ.
[405] Para análise qRT-PCR, foi extraído o ARN total com Trizol (Sigma), submetido a transcrição inversa (Qiagen) e amplificado com 10 μl de 2 x a mistura reacional SYBR e 0,2 μM de iniciadores diretos e inversos até atingir um volume final de 20 μl. Para análise PSA-NCAM FACS, as células foram colhidas com tratamento acutase durante 45 min, foram lavadas uma vez e incubadas com IgM de ratinho anti-PSA (1:250. 5A5) durante 25 min em gelo, foram lavadas uma vez com meio N2 e incubados com conjugado Cy3 anti-IgM de ratinho (1:250, Jackson) durante mais 25 min em gelo. As células foram lavadas uma vez com N2 e ressuspensas com 0,1% BSA com 7AAD e foram analisadas em um separador de células Calibur FACS.. Como controlo não foi adicionado anticorpo primário.
[406] Procedimentos imuno-histológicos e estereológicos: Secções coronais soltas foram bloqueadas em 0,1% de Triton X-100, 5% de soro de burro em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente e foram incubadas durante 48 horas a 4 °C com diferentes anticorpos: coelho anti-GFP (1:300), galinha anti-GFP (1:200, Chemicon), ratinho anti-TH (1:200), IgM ratinho anti-PSA (1:1000), anti-NeuN (1_400), cabra anti-FoxA2 (1:300), coelho anti-Girk (1:300, Alomone Labs), ratinho anti-sinapsina (1:200, BD Transduction Laboratories).
[407] Seções foram depois lavadas e incubadas com anticorpos secundários: Anticorpos de burro conjugados a Cy2, Cy3 e Cy5 (1:400, Jackson). Para PSA foi utilizado um burro anti IgM conjugado a Cy5 (1:500 Jackson). As incubações foram executadas durante 2 horas à temperatura ambiente. As secções foram lavadas por duas vezes em PBS e montadas em Mowiol (Calbiochem). Uma em cada três secções coronais do cérebro foram analisadas por cada imunomarcação.
[408] Foram recolhidas imagens digitais com um microscópio confocal laser Zeiss LSM 510, com três lasers (Argon 488, HeNe 543 e HeNe 633), com uma objetiva c-Apochromat 40 x (imersão em água). Foi contado o número de células GFP+ e TH+ em secções uma-em-três, englobando a totalidade do cérebro sob uma objetiva 40x e foi estimado o número total de célula/enxerto. Células com dupla marcação foram analisadas em planos ópticos simples, através de todo o eixo Z.
[409] Para a análise da percentagem de células mercadas com GFP/TH+ e GFP/FoxA2+, 100 células GFP+ foram analisadas por cada marcador. Para a análise do processo de desenvolvimento, foram executados varrimentos confocais z com intervalos de 0,8 μm ao longo de todo o eixo Z (20-40 μm) com uma abertura de 1 μm, com uma objetiva de 40x. As secções foram analisadas a partir do ponto da injeção, lateralmente até já não serem observados quaisquer processos. Projeções 3D englobando a totalidade da área analisada foram sequencialmente comparadas. Para a análise de intensidade GFP e TH, dividiu-se a totalidade da área analisada em cinco zonas de 100 μm sucessivas a partir do transplante e as intensidades foram medidas com software ImageJ. Os dados foram normalizados quanto à intensidade na zona mais próxima do enxerto (zona I) até ao controlo, para detectar quaisquer potenciais diferenças no tamanho do enxerto.
[410] Análise Estatística: Os dados são apresentados como o erro padrão médio ± da média (SEM). Foram executadas comparações segundo o teste de Student ou análise ANOVA com dois fatores, seguido do teste post-hoc de Bonferroni. Foi executada uma regressão linear e foi quantificada com a correlação de Pearson.EXEMPLO XI. • exemplo seguinte mostra a modificação enzimática de PSA em neurônios DA derivados de hESC, utilizando a polissialil transferase bacteriana purificada, PSTnm, para aumentar a eficácia do transplante.
[411] Embora a transfecção eficiente do gene PST necessitasse de modificações genéticas de hESC com controlo limitado da duração da polissialilação. Este exemplo descreve a descoberta de PSA induzido por PSTnm externo, em vez da aplicação do gene (ver, figura 35). Na figura 35A, células de Schwann (SC) tratadas com PST (linha verde-linha média) apresentavam um tempo de aderência maior, enquanto o PSA produzido por PSTnm induziu a aderência. Em particular, (A) PSA produzido por PSTnm inibiu a adesão de células de Schwann em suspensão à monocamada de células de Schwann com uma eficácia ainda maior (linha vermelha-linha inferior) do que o PSA produzido por expressão forçada de PST (linha verde-linha média). (B) Imunocoloração de PSA em mononeurônios HB9 derivados de ESC, mostra que as amostras de controlo tratadas só com PSTnm apresentavam níveis indetectáveis de PSA. A incubação com substrato PSTnm+ ácido CMP-sialico produz uma banda PSA larga, que é removida com tratamento endoN. (C, D) Similar aos efeitos obtidos com o gene PSTm a polissialilação destas células por PSTnm e substrato durante a diferenciação aumenta o desenvolvimento de neurites e a migração celular (setas). (E) imunocoloração PSA dos neurônios DA derivados de hESC no dia 30. (F) Esta coloração é significativamente aumentada após o tratamento com PSTnm e substrato. (G) Injeção in vivo só de PSTnm não produz efeito, enquanto a co- administração deste com substrato (H) produz grandes quantidades de expressão de PSA no corpo estriado de ratinho.
[412] Deste modo, neurônios DA maduros, tratados externamente com PSA estão contemplados para udo na produção de células para enxerto. Tanto PST de mamífero como PSTnm produziram cadeias quimicamente idênticas a PSA. Maior PSA em neurônios DA derivados de hESC (figura 35F) devem persistir por várias semanas, o suficiente para as fibras DA partirem do núcleo do enxerto. Porque PSTnm é removido antes do enxerto, a imunogenicidade relativamente a estas enzima contaminadora das células enxertadas não deverá ser um fator interveniente.
[413] PSTnm foi produzido a partir de um fragmento modificado com características de maior solubilidade e atividade (Willis et al., Characterization of the alpha-2,8- polysialyltransferase from Neisseria meningitidis with synthetic acceptors, and the development of a self-priming polysialyltransferase fusion enzyme. Glycobiology 18, 177-186 (2008)). 177-186, 2008. As culturas de hESC foram induzidas para se diferenciarem em neurônios DA antes da exposição a PSTnm, exposição ao substrato ou ambos. As culturas foram examinadas em momentos diferentes da exposição (10 min a 6 h) por meio de imunofluorescência quantitativa (Operetta) e coloração de Western, para determinar a velocidade e níveis de polissialilação.
[414] Assim, neurônios DA derivados de hESC diferenciados no dia 25 serão incubados com as concentrações ideais de PSTnm e substrato, utilizando as condições descritas presentemente. Neurônios PSA+ mDA serão transplantados em análises a curto e longo prazo, como descrito presentemente e figura 29.
[415] Todas as publicações e patentes referidas na especificação apresentada são incorporadas a título de referência. Várias modificações e variações do método e sistema da invenção descritos irão tornar-se evidentes para os especialistas na técnica sem que se afastem do âmbito da presente invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com realizações específicas preferidas, subentende-se que a invenção, tal como reivindicada não deve ser indevidamente limitada a estas realizações específicas. Efetivamente, várias modificações dos modos descritos para executar a invenção, que são evidentes para os especialistas em biologia celular, neurobiologia, biologia das células cancerosa, biologia molecular, bioquímica, química, síntese orgânica ou campos relacionados destinam-se a permanecer no âmbito das seguintes reivindicações.

Claims (17)

1. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes caracterizado por compreender: expor células tronco pluripotentes a, ao menos, um inibidor de sinalização de Small Mothers Against Decapentaplegic (SMAD), e expor as células a, ao menos, um ativador de sinalização de Sonic hedgehog (SHH) e, ao menos, um ativador de sinalização de wingless (Wnt) para produzir células diferenciadas expressando ambas proteína forkhead box A2 (FOXA2) e fator de transcrição alfa 1 LIM homeobox (LMX1A), em que o primeiro ativador, ao menos, de sinalização Wnt estar presente no terceiro (3o) dia até o décimo primeiro (11o) dia a partir da exposição inicial das células a, ao menos um inibidor de sinalização SMAD.
2. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita célula tronco pluripontente ser selecionada do grupo consistindo de células tronco não embrionárias de humanos, primatas não humanos e roedores, células tronco embrionárias, células pluripotentes não embrionárias induzidas e células pluripotentes engenheiradas.
3. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por as ditas células diferenciadas expressando FOXA2 e LMX1A ainda expressarem, ao menos, um marcador adicional selecionado do grupo consistindo de tirosina hidroxilase (TH), a proteína orthodenticle homeobox 2 (OTX2), proteína do receptor nuclear relacionada 1 (NURR1), beta tubulina classe III neurônio específica (Tuj1), família 3 do fator Trefoil (TTF3), homeodomínio 3 pareado semelhante (PITX3), complexo achaete-scute (ASCL), fator de célula B inicial 1 (EBF-1), fator de célula B inicial 3 (EBF-3), transthyretin (TTR), sinapsina, transportador de dopamina (DAT), e retificador interno de canal de potássio acoplado à proteína G (Kir3.2/GIRK2), CD142, DCSM1, CD63 e CD99.
4. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por as células tronco pluripotentes serem diferenciadas em células neuronais que expressam ambas proteína forkhead box A2 (FOXA2) e fator de transcrição alfa 1 LIM homeobox (LMX1A) dentro de 11 dias a partir da exposição inicial das células tronco pluripotentes a, ao menos um inibidor de sinalização SMAD.
5. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por as ditas células tronco pluripotentes serem diferenciadas nos ditos neurônios dopaminérgicos em não mais que 25 dias a partir da exposição inicial das células tronco pluripotentes a, ao menos, um inibidor de sinalização SMAD.
6. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por, ao menos, 20% dos ditos neurônios dopaminérgicos expressarem FOXA2 e LMX1A e ainda expressarem, ao menos, um marcador para neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo subtipo A9 humano selecionados do grupo consistindo de Girk2, CD142 e DCSM1.
7. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ainda compreender selecionar uma população de neurônios dopaminérgicos expressando CD142 ou DCM1 ou ambos.
8. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por um ou mais dos seguintes pertencer: a) ao menos a um dito inibidor de sinalização de SMAD ser selecionado do grupo consistindo de LDN-193189, SB431542, Noggin, dorsomorfina e combinações de dois ou mais acima expostos; b) ao menos, a um dito ativador de sinalização de SHH ser selecionado do grupo consistindo de purmorfamina, SHH recombinante, SHH purificado, agonistas Smoothened (SAG), e combinações de dois ou mais dos acima expostos, c) ao menos, a um dito ativador de sinalização Wnt ser selecionado do grupo consistindo de CHIR99021, Wnt3A, e Wnt1 e combinações de dois ou mais dos acima elencados.
9. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por as ditas células diferenciadas expressando FOXA2 e LMX1A não expressarem ao menos um marcador selecionado do grupo consistindo de PAX6, EMX2 e LHX2.
10. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por ao menos um inibidor de sinalização SMAD compreender ao menos um inibidor de sinalização TGFβ/Activina-Nodal e ao menos um inibidor de sinalização de proteína morfogenética (BMP).
11. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ao menos um inibidor de sinalização TGFβ/Activina-Nodal ser SB431542.
12. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por ao menos um inibidor de sinalização de BMP ser LDN193189.
13. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por ao menos um ativador de sinalização wingless (Wnt) compreender um inibidor de sinalização de quinase sintase de glicogênio 3β (GSK3β).
14. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o inibidor de sinalização de GSK3β ser CHIR99021.
15. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por as células diferenciadas in vitro serem precursores de mesencéfalo em placa basal.
16. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender ainda a conversão das células diferenciadas em neurônios dopaminérgicos.
17. Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes, de acordo coma reivindicação 16, caracterizado por a conversão compreender contatar as células diferenciadas com fator neurotrópico cérebro derivado (BDNF), ácido ascórbico (AA), fator neurotrópico derivado de linhagem celular glial (GDNF), AMPc dibutirila (dbcAMP), fator de crescimento de transformação tipo β3 (TGFβ3), ou combinações dos mesmos.
BR112014010776-9A 2011-11-04 2012-11-02 Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes BR112014010776B1 (pt)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR122020000182A BR122020000182B8 (pt) 2011-11-04 2012-11-02 Neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo para enxerto

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161555828P 2011-11-04 2011-11-04
US61/555,828 2011-11-04
PCT/US2012/063339 WO2013067362A1 (en) 2011-11-04 2012-11-02 Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BR112014010776A2 BR112014010776A2 (pt) 2017-04-25
BR112014010776A8 BR112014010776A8 (pt) 2020-03-17
BR112014010776B1 true BR112014010776B1 (pt) 2021-11-30

Family

ID=48192829

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122020000182A BR122020000182B8 (pt) 2011-11-04 2012-11-02 Neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo para enxerto
BR112014010776-9A BR112014010776B1 (pt) 2011-11-04 2012-11-02 Método in vitro para diferenciação de células tronco pluripotentes

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR122020000182A BR122020000182B8 (pt) 2011-11-04 2012-11-02 Neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo para enxerto

Country Status (16)

Country Link
US (3) US10280398B2 (pt)
EP (2) EP3693455A1 (pt)
JP (6) JP6461602B2 (pt)
KR (4) KR102581669B1 (pt)
CN (5) CN110684734A (pt)
AU (3) AU2012332269B2 (pt)
BR (2) BR122020000182B8 (pt)
CA (2) CA3177246A1 (pt)
DK (1) DK2773748T3 (pt)
EA (1) EA201490796A1 (pt)
ES (1) ES2779453T3 (pt)
HK (1) HK1201879A1 (pt)
IL (4) IL286793B (pt)
PL (1) PL2773748T3 (pt)
PT (1) PT2773748T (pt)
WO (1) WO2013067362A1 (pt)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010096496A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
CA2831609C (en) 2011-03-30 2019-06-11 Cellular Dynamics International, Inc. Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
WO2013067362A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
EP3498824A1 (en) 2013-04-26 2019-06-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
EP3031908B1 (en) 2013-08-06 2018-12-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for producing dopaminergic neurons
WO2015069736A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-14 The Mclean Hospital Corporation METHODS FOR EFFICIENT GENERATION OF GABAergic INTERNEURONS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
ES2939807T3 (es) * 2014-03-21 2023-04-27 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Producción de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo y métodos para su utilización
WO2015143622A1 (zh) * 2014-03-25 2015-10-01 云南中科灵长类生物医学重点实验室 一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用
WO2016028880A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Cellular Dynamics International, Inc. Neural networks formed from cells derived from pluripotent stem cells
US9730975B2 (en) * 2014-11-25 2017-08-15 The Penn State Research Foundation Chemical reprogramming of human glial cells into neurons for brain and spinal cord repair
EP3061809B1 (en) 2015-02-27 2019-01-30 Miltenyi Biotec GmbH Method for generation of a cell composition of mesencephalic dopaminergic progenitor cells
EP3281151B1 (en) * 2015-04-10 2023-03-29 President and Fellows of Harvard College Methods and devices for live cell imaging analysis
US10081791B2 (en) 2015-05-07 2018-09-25 William J. Freed Modeling connections between dopaminergic neurons and the cerebral cortex
EP4070803A1 (en) 2015-06-01 2022-10-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
CN108368486B (zh) 2015-10-07 2023-06-27 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 鉴定神经肌肉接头活动的调节剂的体外方法
CN105567642B (zh) * 2016-02-01 2019-07-12 中国科学院生物物理研究所 一种着色性干皮病人多能干细胞的制备方法
KR20180105236A (ko) 2016-02-05 2018-09-27 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 줄기 세포-유래 외배엽 계통 전구체의 분화 방법
WO2017176779A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-12 The Regents Of The University Of California Cellularized hydrogels and methods of using the same
CN105861532A (zh) * 2016-04-08 2016-08-17 北京大学深圳医院 一种基于miRNA491调节DAT基因表达的方法
KR101870240B1 (ko) * 2016-04-12 2018-06-22 서울대학교산학협력단 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법
CN109072198B (zh) * 2016-04-22 2022-08-26 国立大学法人京都大学 产多巴胺神经祖细胞的制备方法
AU2017313065B2 (en) * 2016-08-16 2021-06-24 Fujifilm Cellular Dynamics Inc. Methods for differentiating pluripotent cells
FR3058892B1 (fr) * 2016-11-23 2021-04-09 Univ Bordeaux Unite de tissu neural et utilisation d'une telle unite pour l'implantation dans le systeme nerveux d'un mammifere
EP3600360A4 (en) * 2017-03-21 2021-04-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center ASTROCYTES FROM STEM CELLS, MANUFACTURING METHODS AND METHODS OF USE
AU2018272068A1 (en) * 2017-05-25 2020-01-16 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Method and composition for generating basal forebrain cholinergic neurons (BFCNs)
CN107828728A (zh) * 2017-10-26 2018-03-23 中山大学 一种制备中脑多巴胺神经元的方法
KR102201417B1 (ko) * 2018-05-02 2021-01-11 (주) 에스바이오메딕스 도파민 신경세포의 분리방법 및 이를 이용하여 분리된 도파민 신경세포를 포함하는 파킨슨병 치료용 약제학적 조성물
KR102111030B1 (ko) * 2018-05-10 2020-05-14 한국과학기술원 Jab1을 포함하는 신경세포 분화 탐지용 바이오마커 또는 신경세포 분화 촉진용 조성물
JP2022511568A (ja) * 2018-12-11 2022-01-31 ユニバーシティー オブ ロチェスター 統合失調症及び他の神経精神障害の治療方法
CN112011510B (zh) * 2019-05-30 2023-01-03 中国科学院上海有机化学研究所 一种由人多能干细胞制备多巴胺神经元的方法
US20220254448A1 (en) 2019-07-25 2022-08-11 The Scripps Research Institute Methods of identifying dopaminergic neurons and progenitor cells
KR102183208B1 (ko) * 2019-07-25 2020-11-25 한국과학기술연구원 Ngn2(neurogenin-2)를 이용하여 척수 손상 모델에서 반응성 성상세포를 신경세포로 리프로그래밍하는 방법
US20220389378A1 (en) * 2019-11-22 2022-12-08 Novo Nordisk A/S Spin-aggregated neural microspheres and the application thereof
MX2022011831A (es) 2020-03-25 2023-01-04 Sana Biotechnology Inc Células neurales hipoinmunogénicas para el tratamiento de trastornos y afecciones neurológicas.
CN115768875A (zh) * 2020-04-02 2023-03-07 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 产生中脑多巴胺神经元的方法、中脑神经元及其用途
WO2021216623A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
WO2021216622A1 (en) 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
CN114292814A (zh) * 2020-09-22 2022-04-08 上海跃赛生物科技有限公司 一种多能干细胞分化为中脑黒质多巴胺能神经细胞的方法
AU2022256048A1 (en) 2021-04-07 2023-10-05 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Dopaminergic precursor cells and methods of use
CN117500916A (zh) 2021-04-16 2024-02-02 博恩赛尔公司 制备、扩增和纯化中脑多巴胺能祖细胞的方法
CN117202914A (zh) * 2021-04-21 2023-12-08 上海跃赛生物科技有限公司 一种质控和富集人多巴胺能神经前体细胞的方法
CN113388580B (zh) * 2021-06-16 2022-02-18 中国医学科学院医学实验动物研究所 一种诱导脂肪干细胞分化为功能性多巴胺能神经元的方法及用途
EP4355864A1 (en) * 2021-06-18 2024-04-24 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of generating sacral neural crest lineages and uses thereof
EP4370164A1 (en) * 2021-07-14 2024-05-22 Innopeutics Corporation Composition for inhibiting alpha-synuclein aggregation and method for inhibiting alpha-synuclein aggregation
WO2023004370A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Aspen Neuroscience, Inc. Aav-based modulation of gba1 and related compositions and uses thereof
WO2023004371A1 (en) * 2021-07-21 2023-01-26 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of differentiating neural cells and predicting engraftment thereof and related compositions
US20230081881A1 (en) 2021-07-21 2023-03-16 Aspen Neuroscience, Inc. Transposon-based modulation of gba1 and related compositions and uses thereof
CN113481160B (zh) * 2021-08-20 2022-04-29 北京太东生物科技有限公司 视网膜色素上皮细胞诱导培养基及其应用
KR20240055838A (ko) 2021-09-10 2024-04-29 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 유도된 만능 줄기 세포 유래된 세포의 조성물 및 이의 사용 방법
CN117089520A (zh) * 2021-10-28 2023-11-21 中国科学院动物研究所 一种中脑多巴胺细胞群、其制造方法以及用途
CA3235390A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Deepika Rajesh Dopaminergic neurons comprising mutations and methods of use thereof
WO2023104792A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Vib Vzw Enhancers of neuronal maturation
WO2023177919A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods and compositions for improving in vivo survival of midbrain dopamine neurons
US20230377685A1 (en) 2022-04-15 2023-11-23 Aspen Neuroscience, Inc. Methods of classifying the differentiation state of cells and related compositions of differentiated cells
CN115521903B (zh) * 2022-09-30 2024-05-17 中国科学院生态环境研究中心 体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341469C (en) 1988-08-04 2004-12-28 Robert Lindsay Williams In vitro propagation of embryonic stem cells
US5340740A (en) 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
US5589376A (en) 1992-07-27 1996-12-31 California Institute Of Technology Mammalian neural crest stem cells
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US6787356B1 (en) 1998-07-24 2004-09-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cell expansion system for use in neural transplantation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US20050042749A1 (en) 2001-05-16 2005-02-24 Carpenter Melissa K. Dopaminergic neurons and proliferation-competent precursor cells for treating Parkinson's disease
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7011828B2 (en) 2000-03-14 2006-03-14 Es Cell International Pte. Ltd. Implanting neural progenitor cells derived for human embryonic stem cells
EP1263932A4 (en) 2000-03-14 2004-06-23 Es Cell Int Pte Ltd EMBRYONIC CELLS AND NEURONAL STEM CELLS DERIVED THEREFROM
WO2001088104A2 (en) 2000-05-17 2001-11-22 Geron Corporation Neural progenitor cell populations
US7250294B2 (en) * 2000-05-17 2007-07-31 Geron Corporation Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells
EP1294855A4 (en) 2000-06-20 2004-09-15 Es Cell Int Pte Ltd METHOD FOR CONTROLLING THE DIFFERENTIATION OF EMBRYONIC STEM CELLS (ES CELLS) BY CULTURE OF ES CELLS IN THE PRESENCE OF BMP-2 TRACK ANTAGONISTS
DE10037759A1 (de) 2000-08-03 2002-07-04 Gruenenthal Gmbh Screeningverfahren
CA2424062A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Derek Van Der Kooy Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells
JP3660601B2 (ja) 2001-03-30 2005-06-15 独立行政法人科学技術振興機構 胚性幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びｇａｂａ作動性ニューロンの製造法
WO2002086073A2 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Generation of differentiated tissue from nuclear transfer embryonic stem cells and methods of use
US20030211605A1 (en) 2001-05-01 2003-11-13 Lee Sang-Hun Derivation of midbrain dopaminergic neurons from embryonic stem cells
US6887706B2 (en) 2001-10-03 2005-05-03 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of in vitro differentiation of transplantable neural precursor cells from primate embryonic stem cells
US20040224302A1 (en) 2002-07-16 2004-11-11 Thomas Jessel Systems and methods for screening for modulators of neural differentiation
CA2492442A1 (en) 2002-07-31 2004-02-05 Stem Cell Therapeutics Inc. Method of enhancing neural stem cell proliferation, differentiation, and survival using pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (pacap)
US7445931B2 (en) 2002-09-25 2008-11-04 Bresagen, Inc. Compositions and methods for enrichment of neural stem cells using ceramide analogs
US20040214324A1 (en) 2002-12-09 2004-10-28 Ole Isacson Dopaminergic neurons differentiated from embryonic cells for treating neurodegenerative diseases
US7252995B2 (en) 2002-12-13 2007-08-07 Yu-Show Fu Method of generating neurons from stem cells and medium for culturing stem cells
ZA200401646B (en) * 2003-03-12 2004-06-07 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Derivation of terminally differentiated dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.
CN1774265A (zh) 2003-04-18 2006-05-17 协和发酵工业株式会社 神经再生药
CA2457296A1 (en) 2003-08-19 2005-02-19 Takahiro Ochiya Methods for inducing differentiation of pluripotent cells
AU2005294173A1 (en) 2004-10-05 2006-04-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Promotion of cell migration and axon regeneration in the CNS
CA2626728A1 (en) * 2005-11-10 2007-05-24 Genervon Biopharmaceuticals L.L.C. Mntf differentiation and growth of stem cells
US9074180B2 (en) 2006-03-30 2015-07-07 The University Court Of The University Of Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors, and uses thereof
WO2008018190A1 (fr) 2006-08-09 2008-02-14 Biomaster, Inc. Cellules de la crête neurale dérivées de tissu adipeux
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
GB0622394D0 (en) 2006-11-09 2006-12-20 Univ Cambridge Tech Differentiation of pluripotent cells
WO2008063603A2 (en) 2006-11-20 2008-05-29 President And Fellows Of Harvard College Methods, compositions, and kits for treating pain and pruritis
GB2458863B (en) 2007-01-17 2011-10-12 Wisconsin Alumni Res Found Improved culture of stem cells
KR20130030309A (ko) 2008-02-06 2013-03-26 가부시키가이샤 구라레 세포 배양 방법 및 스크리닝 방법
CN101550406B (zh) 2008-04-03 2016-02-10 北京大学 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途
WO2009155301A2 (en) 2008-06-17 2009-12-23 The Mclean Hospital Corporation Multipotent neural cells
WO2010042669A2 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 Ipierian, Inc. Co-culture compositions and methods
EP2356218B1 (en) 2008-12-05 2017-05-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
WO2010096496A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
US9487751B2 (en) 2009-06-02 2016-11-08 Cornell University Method to isolate, identify, and use embryonic stem cells directed to forebrain interneuron fate
EP2464723B1 (en) 2009-08-12 2016-06-22 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells
CN102762718B (zh) * 2009-10-13 2015-06-17 干细胞技术公司 用于分化干细胞的重量克分子渗透压浓度控制
AU2010315166B2 (en) 2009-11-04 2015-01-22 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Episomal reprogramming with chemicals
KR101168053B1 (ko) 2009-11-06 2012-07-24 연세대학교 산학협력단 효율적이고 보편적인 전분화능 줄기세포의 신경세포 분화 유도방법
WO2011108766A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 Kyoto University METHOD FOR DIAGNOSING A PROTEIN MISFOLDING DISEASE USING NERVE CELLS DERIVED FROM iPS CELLS
CN102191221B (zh) 2010-03-17 2014-11-19 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 一种能无限自我更新的神经干细胞、其制备方法及其用途
WO2011130675A2 (en) 2010-04-16 2011-10-20 The Mclean Hospital Corporation Dopaminergic neurons differentiated from pluripotent stem cells and uses of thereof
DK2577318T3 (da) 2010-05-25 2019-10-07 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Fremgangsmåde til nociceptor-differentiering af humane embryoniske stamceller og anvendelser deraf
ES2685171T3 (es) 2010-06-14 2018-10-05 The Scripps Research Institute Reprogramación de células a un nuevo destino
US8932857B2 (en) 2010-06-15 2015-01-13 Kyoto University Method for selecting reduced differentiation resistance human induced pluripotent stem cells
CN101935635A (zh) * 2010-07-30 2011-01-05 中国人民解放军第二军医大学 人骨髓多能干细胞的体外扩增和向多巴胺能神经元定向分化的方法
WO2012034101A2 (en) 2010-09-09 2012-03-15 The Regents Of The University Of California Expandable cell source of neuronal stem cell populations and methods for obtaining and using them
CA2836483C (en) 2011-05-20 2020-08-18 The Mclean Hospital Corporation Neuronal progenitor cells and uses
KR101331034B1 (ko) 2011-06-09 2013-11-19 연세대학교 산학협력단 미분화 줄기세포로부터 중뇌특이적 도파민 신경세포의 제조 방법
WO2013016662A1 (en) 2011-07-28 2013-01-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Diagnosis and treatment of parkinson's disease
WO2013067362A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
US10472607B2 (en) 2011-12-14 2019-11-12 National Chung Hsing University Culture medium and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neuroepithelial cells
EP2614829A1 (en) 2012-01-11 2013-07-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Mammalian neural plate border stem cells capable of forming neural tube and neural crest cell lineages including central and peripheral neurons
CN102604894B (zh) 2012-02-29 2014-07-30 中国科学院广州生物医药与健康研究院 用于制备神经干细胞的培养基及其用途
SG11201406825WA (en) 2012-04-24 2014-11-27 Int Stem Cell Corp Derivation of neural stem cells and dopaminergic neurons from human pluripotent stem cells
US9796959B2 (en) 2012-12-28 2017-10-24 Kyoto University Method for inducing astrocytes
US10039794B2 (en) 2013-02-15 2018-08-07 International Stem Cell Corporation Use of neural cells derived from human pluripotent stem cells for the treatment of neurodegenerative diseases
US20140248696A1 (en) 2013-03-01 2014-09-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods of maintaining, expanding, and diffrentiating neuronal subtype specific progenitors
EP2986710A4 (en) 2013-04-16 2016-11-09 Sloan Kettering Inst Cancer AGE-MODIFIED CELLS AND METHOD FOR PRODUCING AGED-MODIFIED CELLS
EP3498824A1 (en) 2013-04-26 2019-06-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
CA2923592A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Kyoto University Method for inducing dopamine-producing neural precursor cells from pluripotent stem cells
CN105814192A (zh) 2013-10-09 2016-07-27 加利福尼亚大学董事会 哺乳动物视网膜干细胞产生方法和应用
KR20230008892A (ko) 2013-11-21 2023-01-16 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 인간 다능성 줄기 세포로부터 기능적 두개 기원판 유도체의 전문화
ES2939807T3 (es) 2014-03-21 2023-04-27 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Producción de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo y métodos para su utilización
WO2015143622A1 (zh) 2014-03-25 2015-10-01 云南中科灵长类生物医学重点实验室 一种建立神经上皮干细胞的培养基、方法及其应用
MY191740A (en) 2014-10-24 2022-07-13 Sumitomo Chemical Co Production method for nerve tissue
WO2016162747A2 (en) 2015-04-09 2016-10-13 Biolamina Ab Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases

Also Published As

Publication number Publication date
US10280398B2 (en) 2019-05-07
BR112014010776A8 (pt) 2020-03-17
IL273910A (en) 2020-05-31
AU2021218116A1 (en) 2021-09-09
ES2779453T3 (es) 2020-08-17
AU2018222997B2 (en) 2021-05-20
IL295556A (en) 2022-10-01
WO2013067362A1 (en) 2013-05-10
AU2012332269B2 (en) 2018-05-31
IL232450A0 (en) 2014-06-30
EP3693455A1 (en) 2020-08-12
JP2020178695A (ja) 2020-11-05
JP6461602B2 (ja) 2019-01-30
KR20200061414A (ko) 2020-06-02
PL2773748T3 (pl) 2020-06-15
DK2773748T3 (da) 2020-03-16
EP2773748A1 (en) 2014-09-10
CN110684734A (zh) 2020-01-14
BR122020000182B8 (pt) 2022-05-24
JP2017212989A (ja) 2017-12-07
AU2018222997A1 (en) 2018-09-20
KR20220108208A (ko) 2022-08-02
EA201490796A1 (ru) 2014-10-30
JP7225163B2 (ja) 2023-02-20
CN110684733A (zh) 2020-01-14
JP6756786B2 (ja) 2020-09-16
BR112014010776A2 (pt) 2017-04-25
IL286793A (en) 2021-10-31
JP6588500B2 (ja) 2019-10-09
AU2012332269A1 (en) 2014-05-22
US20190211306A1 (en) 2019-07-11
US11970712B2 (en) 2024-04-30
CA3177246A1 (en) 2013-05-10
IL232450B (en) 2020-04-30
EP2773748B1 (en) 2019-12-25
CN113481159A (zh) 2021-10-08
KR102426327B1 (ko) 2022-08-01
BR122020000182B1 (pt) 2022-04-19
PT2773748T (pt) 2020-03-26
JP2019010104A (ja) 2019-01-24
US20150010514A1 (en) 2015-01-08
JP2023027064A (ja) 2023-03-01
CA2854578A1 (en) 2013-05-10
KR20140116063A (ko) 2014-10-01
CN104379731A (zh) 2015-02-25
CN113528442A (zh) 2021-10-22
IL286793B (en) 2022-09-01
HK1201879A1 (en) 2015-09-11
JP2014532440A (ja) 2014-12-08
JP2021000104A (ja) 2021-01-07
US20200407680A1 (en) 2020-12-31
KR20230136702A (ko) 2023-09-26
CA2854578C (en) 2023-01-03
KR102581669B1 (ko) 2023-09-22
KR102115273B1 (ko) 2020-05-28
EP2773748A4 (en) 2015-04-08
US10711243B2 (en) 2020-07-14
IL273910B (en) 2021-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7225163B2 (ja) 移植用中脳ドーパミン（ｄａ）ニューロン
KR102468360B1 (ko) 삼차원 뇌 오가노이드 유래 신경 줄기세포 및 그의 용도
US20230233617A1 (en) Methods for differentiating stem cells into dopaminergic progenitor cells
WO2018175574A1 (en) Stem cell-derived astrocytes, methods of making and methods of use
EA041083B1 (ru) Способ индукции дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток in vitro

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 02/11/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.