CN115768875A - 产生中脑多巴胺神经元的方法、中脑神经元及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供用于产生中脑多巴胺神经元及其前体的方法、通过此类方法产生的中脑多巴胺神经元及其前体以及包含此类细胞的组合物，及其用于预防、建模、和/或治疗神经障碍的用途。

Description

产生中脑多巴胺神经元的方法、中脑神经元及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月2日提交的美国临时申请号63/004,138的优先权，将其全部内容并入本文以供参考，并要求其优先权。
技术领域
本发明提供用于产生中脑多巴胺(mDA)神经元及其前体的方法，由此类方法产生的mDA神经元及其前体，以及包含此类细胞的组合物。本公开还提供mDA神经元及包含其的组合物在预防、建模和/或治疗神经障碍中的用途。
背景技术
帕金森病(PD)的特征在于mDA神经元的缺失，导致众所周知的运动症状，如颤抖、僵硬和运动迟缓(Lees等人，Lancet 373,2055-2066(2009))。尽管其他细胞类型如肠、嗅觉或皮质神经元也受到影响(Del Tredici等人，Neuropathol Appl Neurobiol 42,33-50(2016))，mDA神经元仍然是开发新型基于细胞的治疗(Barker等人，Nature reviewsNeurology 11,492-503(2015)；Tabar等人，Nat Rev Genet 15,82-92(2014))和用于PD疾病建模(Sanchez Danes等人，EMBO Mol Med 4,380-395(2012)；Miller等人，Cell stemcell 13,691-705(2013)；Chung等人，Stem Cell Reports 7,664-677(2016)；Reinhardt等人，Cell stem cell12,354-367(2013)；Chung等人，Science 342,983-987(2013)；Cooper等人，Sci Transl Med 4,141ra190(2012))的关键焦点。包括人ES和iPS细胞的人多能干细胞(hPSC)已成为体外衍生mDA神经元的首选细胞类型。尽管在人mDA衍生方面取得了进展，但仍需要新的方案。对于细胞疗法，对于所使用的mDA神经元的最佳类型和阶段仍没有明确的一致意见，并且已报道了在体外(La Manno等人，Cell 167,566-580e519(2016))和体内(Tiklova等人，Nature communications 10,581(2019))hPSC-衍生相比于(vs)原代胎儿DA神经元行为的相当大的分子和功能差异。此外，没有可靠的细胞纯化策略，并且hPSC-衍生的mDA神经元的细胞存活率仍然很低(移植细胞的约10％)(Sanchez Danes等人，EMBO MolMed 4,380-395(2012))。低mDA存活率可能导致临床细胞剂量的变化，并使该技术用于更广泛PD人群的常规应用变得复杂。这些问题对于细胞疗法和疾病建模应用都很重要。
在人类疾病建模中，hPSC系之间mDA神经元产量和纯度的变化为检测疾病相关表型引入了噪声，并使药物发现的努力复杂化。获得确定的mDA神经元亚型将有助于研究PD中细胞类型特异性脆弱性的机制(Surmeier等人，Cold Spring Harb Perspect Med 2,a009290(2012)；Anderegg等人，FEBS Lett 589,3714-3726(2015)；Chung等人，Hum MolGenet 14,1709-1725(2005)；Brichta和Greengard.Front Neuroanat 8,152(2014))。获得明确的、更强大的mDA神经元培养物，以及驱动mDA神经元亚型的可能性，将大大加快PD疾病建模的努力，并可能为未来的mDA神经细胞疗法提供改善的产品。
因此，仍然需要改进用于产生mDA神经元的方法，这些mDA神经元具有改善的体内存活率，并适合于治疗神经障碍，如帕金森病。
发明内容
本公开提供用于产生mDA神经元及其前体的方法、通过此类方法产生的mDA神经元及其前体、包含此类细胞的组合物以及此类细胞和组合物用于预防和/或治疗神经障碍的用途。
本公开提供用于诱导干细胞分化的体外方法。在某些实施方式中，该方法包括：使干细胞与至少一种Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)信号传导的抑制剂、至少一种音猬因子(SHH)信号传导的激活剂和至少一种wingless(Wnt)信号传导的激活剂接触；以及使该细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的激活剂和至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触，以获得表达至少一种指示中脑多巴胺神经元(mDA)或其前体的标志物的分化细胞的群体。
在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从该干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从该干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起不晚于约15天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从该干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起约10天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从该干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起10天、11天、12天或13天开始。
在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触至少约1天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触至多约30天或至多约25天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触约5天、约15天或约20天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触4天、5天、6天、7天、14天、15天、19天或20天。
在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起至少约10天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起不晚于约20天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起不晚于约18天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂的接触在不晚于大多数中脑多巴胺神经元前体分化为有丝分裂期后的神经元时开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起约10天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起10天、11天、12天或13天开始。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂接触至少约1天和/或至多约20天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂接触至少约3天和/或至多约10天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂接触至少4天和/或至多7天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂接触约5天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种FGF信号传导的激活剂接触4天、5天、6天或7天。
在某些实施方式中，该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂接触约5天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂接触6天或7天。
在某些实施方式中，该细胞与至少一种SHH信号传导的激活剂接触约5天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种SHH信号传导的激活剂接触6天或7天。
在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的激活剂接触约15天。在某些实施方式中，该细胞与至少一种Wnt信号传导的激活剂接触16天或17天。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度从其与干细胞的初始接触起增加约4天。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度从该至少一种Wnt信号传导的激活剂的初始浓度增加约200％至约1000％。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度从该至少一种Wnt信号传导的激活剂的初始浓度增加约500％。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约1μM至约5μM和约10μM之间。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约6μM的浓度。
在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂能够抑制经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂能够抑制非经典Wnt信号传导和经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂选自IWP2、IWR1-endo、XAV939、IWP-O1、IWP12、Wnt-C59、IWP-L6、ICG-001、LGK-974、IWR-1、ETC-159、iCRT3、IWP-4、盐霉素、恩波维铵(Pyrvinium Pamoate)、iCRT14、FH535、CCT251545、KYA1797K、Wogonin、NCB-0846、六氯酚(Hexachrorophene)、PNU-74654、KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)、雷公藤甲素(Triptonide)、BC2059、PKF115-584、槲皮素、NSC668036、G007-LK、MSAB、LF3、JW55、异槲皮苷、WIKI4、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂选自IWP2、IWR1-endo、IWP-O1、IWP12、Wnt-C59、IWP-L6、LGK-974、IWR-1、ETC-159、iCRT3、IWP-4、盐霉素、恩波维铵、iCRT14、FH535、CCT251545、Wogonin、NCB-0846、六氯酚、KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)、BC2059、PKF115-584、槲皮素、NSC668036、G007-LK、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂选自XAV939、ICG-001、PNU-74654、雷公藤甲素、KYA1797K、MSAB、LF3、JW55、异槲皮苷、WIKI4、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂包括IWP2。
在某些实施方式中，至少一种FGF信号传导的激活剂选自FGF18、FGF17、FGF8a、FGF8b、FGF4、FGF2、及其组合。在某些实施方式中，至少一种FGF信号传导的激活剂能够引起中脑的扩增并上调中脑基因表达。在某些实施方式中，至少一种FGF信号传导的激活剂选自FGF18、FGF17、FGF8a、FGF4、FGF2、及其组合。在某些实施方式中，至少一种FGF信号的激活剂包括FGF18。
在某些实施方式中，至少一种SMAD信号传导的抑制剂包括TGFβ/激活素(Activin)-Nodal信号传导的抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的抑制剂、或其组合。在某些实施方式中，至少一种TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂包括ALK5的抑制剂。在某些实施方式中，至少一种TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂选自SB431542、SB431542的衍生物、及其组合。在某些实施方式中，所述SB431542的衍生物包括A83-01。在某些实施方式中，至少一种TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂包括SB431542。在某些实施方式中，至少一种BMP信号传导的抑制剂选自LDN193189、Noggin、多索吗啡(dorsomorphin)、LDN193189的衍生物、Noggin的衍生物、多索吗啡的衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种BMP的抑制剂包括LDN-193189。
在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂包括糖原合酶激酶3β(GSK3β)信号传导的抑制剂。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂选自CHIR99021、CHIR98014、AMBMP盐酸盐、LP 922056、锂、脱氧胆酸、BIO、SB-216763、Wnt3A、Wnt1、Wnt5a、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的激活剂包括CHIR99021。
在某些实施方式中，至少一种SHH信号传导的激活剂选自SHH蛋白、平滑(Smoothened)激动剂(SAG)、及其组合。在某些实施方式中，SHH蛋白选自重组SHH、修饰的N-端SHH、及其组合。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH在N-端包含两个异亮氨酸。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH与未修饰的N-端SHH具有至少约90％的序列同一性。在某些实施方式中，未修饰的N-端SHH是未修饰的小鼠N-端SHH或未修饰的人N-端SHH。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH包括SHH C25II。在某些实施方式中，SAG包括嘌吗啡胺(purmorphamine)。
在某些实施方式中，从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起约15天，至少约80％的分化细胞表达FOXA2和EN1。在某些实施方式中，从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起16天，大于约80％或大于约90％的分化细胞表达FOXA2和EN1。
在某些实施方式中，至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物选自EN1、OTX2、TH、NURR1、FOXA2、PITX3、LMX1A、LMO3、SNCA、ADCAP1、CHRNA4、GIRK2、ALDH1A1、SOX6、WNT1、VMAT2、DAT(SLC6A3)、及其组合。在某些实施方式中，分化细胞不表达选自以下的至少一种标志物：PAX6、EMX2、LHX2、SMA、SIX1、PITX2、SIM1、POU4F1、PHOX2A、BARHL1、BARHL2、GBX2、HOXA1、HOXA2、HOXB1、HOXB2、POU5F1、NANOG、及其组合。
在某些实施方式中，该方法还包括分离表达至少一种阳性表面标志物且不表达至少一种阴性表面标志物的细胞。在某些实施方式中，至少一种阳性表面标志物选自CD171、CD184、及其组合。在某些实施方式中，至少一种阳性表面标志物包括CD184。在某些实施方式中，至少一种阴性表面标志物选自CD49e、CD99、CD340、及其组合。在某些实施方式中，至少一种阴性表面标志物包括CD49e。在某些实施方式中，该方法包括分选表达CD184且不表达CD49e的细胞。
在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，干细胞选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、及其组合。在某些实施方式中，干细胞是人干细胞、非人灵长类干细胞或啮齿动物干细胞。在某些实施方式中，干细胞是人干细胞。
本公开提供体外分化细胞的细胞群体，其中体外分化细胞通过本文公开的分化方法获得。
本公开还提供包含本文公开的细胞群体的组合物。在某些实施方式中，该组合物是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
此外，本公开提供用于诱导干细胞分化为中脑多巴胺神经元或其前体的试剂盒。在某些实施方式中，该试剂盒包括(a)至少一种SMAD信号传导的抑制剂，(b)至少一种SHH信号传导的激活剂；(c)至少一种Wnt信号传导的激活剂；(d)至少一种Wnt信号传导的抑制剂；和(e)至少一种FGF信号传导的激活剂。在某些实施方式中，该试剂盒还包括(f)用于将干细胞诱导分化为表达至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物的分化细胞的群体的说明。
本公开还提供预防、建模和/或治疗受试者的神经障碍的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞群体或本文公开的组合物。本文公开的细胞群体或本文公开的组合物可用于预防、建模和/或治疗受试者的神经障碍。在某些实施方式中，神经障碍的特征在于中脑多巴胺神经元功能的降低。在某些实施方式中，中脑多巴胺神经元功能的降低与年龄相关。在某些实施方式中，神经障碍选自帕金森综合征(Parkinsonism)、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、及其组合。在某些实施方式中，神经障碍选自帕金森综合征、帕金森病、及其组合。在某些实施方式中，神经障碍的症状选自颤抖、运动迟缓、弯曲姿势、姿势不稳、僵硬、吞咽困难和痴呆。
附图说明
图1显示Wnt信号传导对使用不同方案分化的mDA细胞中ALDH1A1诱导的影响。在使用Wnt-boost、Wnt-boost+IWP2(第10天-第16天)或Wnt-boost+IWP2(第12天-第16天)方案(使用或不使用FGF18)产生的第16天分化mDA细胞中，评估FOXA2、LMX1A、EN1、WNT1、OTX2、ALDH1A1和PAX6的mRNA表达水平。SMA mRNA表达水平未检测到。
图2A和2B显示Wnt boost方案与FGF18和IWP2组合产生了最佳A/P和D/V图案化mDA前体。图2A显示对使用不同方案的第16天分化mDA前体的FACS分析。用抗-EN1和抗-FOXA2抗体对细胞进行染色。图2B显示第16天分化的mDA的免疫染色图像。
图3显示IWP2对分化细胞中标志物基因表达的影响。在使用Wnt-boost方案(从第12天至第16天添加或不添加FGF18和/或IWP2)产生的第16天分化细胞中测量FOXA2、LMX1A、OTX2、EN1、ALDH1A1、BARHL2、BARHL1、PAX6、ALDH2和WNT1的mRNA表达水平。
图4显示IWP2对分化细胞中标志物基因表达的影响。在使用Wnt-boost方案(从第12天至第16天添加或不添加FGF18和/或IWP2)产生的第40天分化细胞中，评估FOXA2、LMX1A、OTX2、EN1、ALDH1A1、PAX6和PITX3的mRNA表达水平。
图5显示双重分选策略的门控示例。基于CD49e和CD184标志物蛋白的表达对分化的mDA细胞进行分选。
图6显示分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的形态。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图7显示分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中多巴胺神经元标志物基因的mRNA表达。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图8显示分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中非多巴胺神经元标志物基因的mRNA表达。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图9A-9C显示分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的代表性免疫染色图像。图9A显示FOXA2、TH和MAP2的表达。图9B显示ALDH1A1、EN1和TH的表达。图9C显示ALDH1A1、EN1和TH的表达。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图10A-10B显示分化细胞在小鼠中移植后的代表性免疫染色图像。使用Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案获得分化细胞，并将其移植到小鼠中。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色。评估hNCAM、TH和ALDH1A1的表达(图10A)。还评估了Ki67的表达(图10B)。
图11A-11C显示分化细胞在小鼠中移植后的代表性免疫染色图像。使用Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案获得分化细胞，并将其移植到小鼠中。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色。图11A显示SC121的表达。图11B显示TH和Nurr1-GFP的表达。图11C显示ALDH1A1和SOX6-RFP的表达。
图12显示IWP2对分化细胞中标志物基因表达的影响。在使用Wnt-boost方案(从第12天至第16天添加或不添加FGF18和/或IWP2)产生的第16天分化细胞中测量标志物基因的mRNA表达水平。
图13显示IWP2对分化细胞中标志物基因表达的影响。在使用Wnt-boost方案(从第12天至第16天添加或不添加FGF18和/或IWP2)产生的第40天分化细胞中评估各种基因的mRNA表达水平。
图14A和14B显示使用Wnt-boost方案(从第12天至第16天添加或不添加FGF18和/或IWP2)产生的第60天分化细胞的免疫荧光染色的代表性图像。图14A显示在每种条件下表达FOXA2、TH和MAP2的第60天分化细胞的免疫学染色图像。图5B显示标记EN1和TH的不同染色板，显示第60天TH+多巴胺神经元中EN1的差异表达。
图15显示分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中标志物基因的mRNA表达。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图16显示分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中标志物基因的mRNA表达。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图17显示分选的第60天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的代表性免疫染色图像。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图18显示分选的第60天分化的CD49弱/CD184强细胞的代表性免疫染色图像。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图19显示使用Wnt-boost方案(从第12天至第16天添加或不添加IWP2和FGF18，以及从第17天至第30天添加或不添加IWP2)产生的第30天分化细胞中标志物基因的mRNA表达。
图20显示Wnt-boost方案(从第12天至第25天或从第12天至第16天添加或不添加IWP2，以及第12天至第16天添加或不添加FGF18)产生的第25天分化细胞的FACS介导的分选。
图21显示分选的第28天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中标志物基因的mRNA表达。从第12天至第25天或从第12天至第16天添加或不添加IWP2以及从第12天至第16天添加或不添加FGF18的Wnt-boost方案的情况下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图22显示分选的第28天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中非多巴胺神经元标志物基因的mRNA表达。从第12天至第25天或从第12天至第16天添加或不添加IWP2以及从第12天至第16天添加或不添加FGF18的Wnt-boost方案的情况下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图23显示分选的第28天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的免疫染色图像。从第12天至第25天或从第12天至第16天添加或不添加IWP2以及从第12天至第16天添加或不添加FGF18的Wnt-boost方案的情况下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。
图24显示分化细胞在小鼠中移植后的代表性免疫染色图像。使用Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案获得分化细胞，并将其移植到小鼠中。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色。评估FOXA2、SC121、ALDH1A1、EN1和Ki67的表达。
图25显示细胞移植到小鼠大脑后分化细胞的代表性免疫染色图像。使用Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案获得分化细胞，并将其移植到小鼠中。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色，并评估由Ki67标记的任何增殖细胞。
图26显示冷冻批次的多巴胺前体(第16天分化)的小鼠纹状体内移植的代表性免疫染色图像。使用Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案获得第16天分化细胞，并使用受控速率冷冻机冷冻。将冷冻的细胞解冻并直接移植到NOD-SCID小鼠的纹状体中。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色。
图27显示分化细胞在小鼠中移植后的代表性免疫染色图像。使用Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案获得分化细胞，并将其移植到小鼠中。移植后4个月对移植细胞进行免疫染色。
图28显示将分选的CD49弱/CD184强细胞移植入小鼠中后分化细胞的代表性免疫染色图像。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选，并将其移植到小鼠中。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色。
图29显示TH阳性细胞中PITX3和NURR1的代表性RNA荧光原位(FISH)图像。mRNA信号以细胞内的点进行测量，并在分化过程中的第35天、第59天和第82天量化点状细胞的数量。使用Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案获得分化细胞。
具体实施方式
本公开提供产生mDA神经元及其前体的方法、通过此类方法产生的mDA神经元及其前体、包含此类细胞的组合物、及其用于预防和/或治疗神经障碍的用途。
Wnt信号传导对mDA神经元的规范至关重要。发明人先前的研究表明，Wnt-增强(boosting)导致EN1的强烈诱导和后脑、丘脑下和前脑命运的抑制。参见例如WO2016/196661中公开的Wnt增强方法，将其全部内容并入以供参考。然而，延长的Wnt信号传导可能干扰mDA神经元的分化和亚型规范。此外，在先前的分化方案中，PITX3和ALDH1A1的表达处于次优水平。本公开基于用Wnt抑制剂处理可以改善mDA神经元衍生的发现。此外，用Wnt抑制剂进行的此类处理不会对EN1和其他mDA神经元标志物的表达产生负面影响，例如，本文公开的包括Wnt抑制剂的分化方法导致EN1和其它mDA神经元标志物的持续表达。此外，用Wnt抑制剂处理不会增加污染标志物(非mDA神经元标志物)的出现。
本公开还基于Wnt抑制剂处理导致A9亚型神经元和A10亚型神经元更好分离的发现。在某些实施方式中，Wnt抑制剂处理影响(例如，增加)指示A9亚型mDA的标志物(例如，ALDH1A1)的mRNA表达。指示A9亚型神经元的标志物的非限制性实例包括LMO3、ALDH1A1、SOX6、VGLUT2和NDNF。在某些实施方式中，Wnt抑制剂处理增加了体外和体内(EN1+细胞中)ALDH1A1+细胞的数量。ALDH1A1在没有EN1共表达的情况下可以高表达，并且ALDH1A1+EN1-细胞不一定是A9亚型神经元，也不是明确定义的细胞。本文公开的包括Wnt抑制剂处理的分化方法导致在移植后在体外和体内高生成表达ALDH1A1和EN1的细胞。在某些实施方式中，Wnt抑制剂处理进一步影响(例如，增加)指示A10亚型mDA的标志物的mRNA表达。指示A10亚型神经元的标志物的非限制性实例包括CALB1、CALB2、OTX2、CCK、VGAT(Slc32a1)和VIP。A9和A10亚型标志物的mRNA表达增加支持A9和A20亚型神经元的正确规范。例如，某些A10亚型神经元标志物(例如，CALB1和CALB2)只有在细胞被正确指定为表现A9或A10身份时才能看到。
此外，Wnt抑制剂处理可减少增殖并增加mDA神经元成熟标志物的表达。mDA神经元成熟标志物的非限制性实例包括DAT、VMAT2、PITX3、CHRNA6和CHRNB3。
此外，Wnt抑制剂处理可以改善分化，并减少剩余的Ki67+增殖细胞，从而改善DA神经元的安全性。
此外，通过本文公开的分化方法(例如，包括Wnt抑制剂处理)从干细胞衍生的移植多巴胺神经元具有改善的纤维生长，特别是ALDH1A1纤维，其有望最有效地触发功能恢复。
此外，本公开基于以下发现：通过本公开方法产生的mDA及其前体提高了体内存活率，例如，可在体内移植后存活数月或甚至数年。
本公开提供从干细胞(例如，人多能干细胞(hPSC))进行神经诱导和mDA神经元分化的改进方案，包括人即将使用的临床级方案。获得改进的mDA神经元分化方案使该领域能够使用更低的细胞数量，实现更完整的mDA神经恢复，并减少潜在的副作用。因此，本公开的方案提高了安全性，因为移植物中污染细胞类型的影响尚不清楚。最后，本公开的方案提高了在培养皿中建模人类疾病时mDA神经元的准确性和再现性。本公开的方案提高了mDA分化的可靠性和鲁棒性。本公开的方案可以被广泛地适配并且可以被广泛使用。
本说明书和实施例描述了本公开的主题的非限制性实施方式。
为了清楚公开而非限制，详细说明分为以下小节：
5.1.定义；
5.2.分化干细胞的方法；
5.3.细胞群体和组合物；
5.4.预防、建模和/或治疗神经障碍的方法；和
5.5.试剂盒。
5.1.定义
本说明书中使用的术语在本领域内、在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有其普通含义。在下文或说明书中的其他地方对某些术语进行讨论，以在描述本发明的组合物和方法以及如何制造和使用它们时为从业者提供额外的指导。
术语“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或测定该值，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以指在3个或3个以上的标准偏差内。或者，“约”可以指给定值的至多20％的范围，例如，至多10％、至多5％、或至多1％。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在一个数量级内，例如，在一个值的5倍或2倍内。
如本文所用，术语“信号传导”在关联“信号转导蛋白”时是指被与膜受体蛋白结合的配体或一些其他刺激因子激活或者受到另外的影响的蛋白。信号转导蛋白的实例包括但不限于SMAD、Wingless(Wnt)复合蛋白(包括β-连环蛋白(catenin))、NOTCH、转化生长因子β(TGFβ)、激活素、Nodal、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白、骨形态发生蛋白(BMP)和成纤维细胞生长因子(FGF)。对于许多细胞表面受体或内部受体蛋白质，配体-受体相互作用与细胞应答无直接联系。在产生配体对细胞行为的最终生理效应之前，配体激活的受体必须首先与细胞内部的其他蛋白相互作用。通常，若干相互作用的细胞蛋白质的链的行为在受体激活或抑制之后发生变化。受体激活引起的整个细胞变化称为信号传导机制或信号传导通路。
如本文所用，术语“信号”指控制细胞结构和功能变化的内部和外部因素。它们的性质可以是化学的或物理的。
如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子和蛋白质，例如转化生长因子β(TFGP)、激活素、Nodal、骨形态发生蛋白(BMP)等。
如本文所用的“抑制剂”指干扰(如降低、减少、抑制、消除或阻断)分子或通路信号传导(例如Wnt信号传导通路、和SMAD信号传导)功能的化合物或分子(如小分子、肽、拟肽、天然化合物、siRNA、反义核酸、适配体或抗体)。抑制剂可以是改变指定蛋白质(信号传导分子、与指定的信号传导分子有关的任何分子、指定相关分子，例如糖原合成酶激酶3β(GSK3β))的任何活性的任何化合物或分子(例如，包括但不限于本文所述的信号传导分子)。例如，SMAD信号传导的抑制剂可以发挥作用，例如通过直接接触SMAD，接触SMAD mRNA，引起SMAD构象变化，降低SMAD蛋白水平，或干扰SMAD与信号传导伙伴的相互作用，以及影响SMAD靶基因的表达。
抑制剂还包括间接调节生物活性(例如SMAD生物活性)的分子，其通过拦截上游信号传导分子(例如，在细胞外结构域内，信号传导分子和影响的示例包括：Noggin，其隔绝骨形态发生蛋白，抑制ALK受体1、2、3和6的激活，从而阻止下游SMAD激活。同样，Chordin、Cerberus、Follistatin，也类似地隔绝SMAD信号传导的细胞外激活剂。Bambi，一种跨膜蛋白，也可以作为一种假受体来隔绝细胞外TGFβ信号传导分子)。阻断上游或下游蛋白质的抗体可考虑用于使蛋白质信号传导的细胞外激活剂等无效。尽管前述实例涉及SMAD信号传导抑制，但相似或类似的机制可用于抑制其他信号传导分子。抑制剂的实例包括但不限于：用于SMAD信号传导抑制的LDN193189(LDN)和SB431542(SB)(LSB)，以及用于Wnt抑制的IWP2。抑制剂描述为竞争抑制(以排除或减少另一已知结合化合物结合的方式结合活性位点)和变构抑制(以干扰化合物与蛋白质活性部位结合的方式与蛋白质结合，从而改变蛋白质构象)以及通过结合并影响指定信号传导分子上游的分子进而导致对指定分子的抑制而引起的抑制。抑制剂可以是通过实际接触信号传导靶标来抑制信号传导靶标或信号传导靶向通路的“直接抑制剂”。
“激活剂”，如本文所用，是指增加、诱导、刺激、激活、促进或增强分子或通路(例如Wnt信号传导、SHH信号传导等)的信号传导功能激活的化合物。
如本文所用，术语“Wnt”或“wingless”在关联配体时是指一组能够与Wnt受体例如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体家族中的受体相互作用的分泌蛋白(即人中的整合蛋白(integration)1)。如本文所用，术语“Wnt或wingless信号传导通路”是指由Wnt家族配体和Wnt家族受体(例如Frizzled和LRPDerailed/RYK受体)组成的由或不由β-连环蛋白介导的信号传导通路。Wnt信号传导通路包括经典Wnt信号传导(例如，由β-连环蛋白介导)和非经典Wnt信号传导(不由β-连环蛋白介导)。
如本文所用，术语“衍生物”指具有类似核心结构的化合物。
如本文所用，术语“细胞的群体”或“细胞群体”指至少两个细胞组成的组。在非限制性实例中，细胞群体可包括至少约10个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个细胞。群体可以是包含一种细胞类型的纯群体，例如中脑DA前体的群体或未分化干细胞群体，例如A9亚型中脑多巴胺神经元的群体。或者，群体可以包括一种以上的细胞类型，例如混合细胞群体，例如A9亚型中脑多巴胺神经元和A10亚型中脑多巴胺神经元混合的细胞群体。
如本文所用，术语“干细胞”是指具有在培养中无限期分裂并产生特化细胞的能力的细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”和“ESC”是指源自植入前阶段胚胎的原始(未分化)细胞，其能够在培养中长时间分裂而不分化，并且已知发育为三个初级胚层的细胞和组织。人胚胎干细胞是指来自人胚胎的胚胎干细胞。如本文所用，术语“人胚胎干细胞”或“hESC”是指从直至并包括胚泡期的早期人胚胎衍生的一种多能干细胞，其能够在培养过程中长时间分裂而不分化，并发育成三个初级胚层的细胞和组织。
如本文所用，术语“胚胎干细胞系”指在体外条件下培养的胚胎干细胞群体，其允许增殖而不分化达数天、数月至数年。
如本文所用，术语“多能(pluripotent)”是指发育为生物体的三个发育胚层(包括内胚层、中胚层和外胚层)的能力。
如本文所用，术语“全能性”指产生身体所有细胞类型以及构成胚胎外组织(如胎盘)的所有细胞类型的能力。
如本文所用，术语“多向分化潜能(multipotent)”是指发育成一种以上身体细胞类型的能力。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指通过引入某些胚胎基因(例如但不限于OCT4、SOX2和KLF4转基因)到体细胞中而形成的一种多能干细胞(例如，参见Takahashi和Yamanaka Cell126,663-676(2006)，将其并入本文以供参考)。
如本文所用，术语“神经元”指神经细胞，即神经系统的主要功能单元。神经元由一个细胞体及其突起(一个轴突和至少一个树突)组成。神经元通过在突触上释放神经递质将信息传递给其他神经元或细胞。
如本文所用，术语“分化”是指未特化的胚胎细胞获得特化细胞(例如神经元、心脏、肝脏或肌肉细胞)特征的过程。分化由细胞基因与细胞外的物理和化学条件之间的相互作用控制，通常通过涉及嵌在细胞表面中的蛋白质的信号传导通路而控制。
如本文所用，术语“定向分化”是指操纵干细胞培养条件以诱导分化为特定(例如，所需的)细胞类型，例如中脑多巴胺神经元或其前体。在干细胞中，“定向分化”指的是利用小分子、生长因子蛋白和其他生长条件，促进干细胞从多能状态过渡到更成熟或更特化的细胞命运。
如本文所用，术语“诱导分化”在关联细胞时是指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变为非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“诱导干细胞分化”是指诱导干细胞(如人干细胞)分裂成具有不同于干细胞特征的子代细胞，例如基因型(例如，通过基因分析(例如微阵列)测定的基因表达变化)和/或表型(例如，mDA神经元或其前体的蛋白质标志物例如EN1、OTX2、TH、NURR1、FOXA2、LMX1A、PITX3、LMO3、SNCA、ADCAP1、CHRNA4、ALDH1A1、SOX6、WNT1、DAT、VMAT2和GIRK2的表达变化)。
如本文所用，术语“细胞培养”指细胞在用于研究或医学处理的人工培养基中体外生长。
如本文所用，术语“培养基”指覆盖培养容器中的细胞的液体，例如Petri板、多孔板等，并包含营养物质以滋养和支持细胞。培养基中还可以添加生长因子，以在细胞中产生所需的变化。
如本文所用，术语用化合物(例如，至少一种抑制剂、激活剂和/或诱导剂)与一个或多个细胞“接触”是指在允许该一个或多个细胞接触该化合物的位置提供该化合物。可使用任何合适的方法完成接触。例如，可通过将浓缩形式的化合物添加到细胞或细胞群体(例如在细胞培养的环境中)以达到所需浓度来实现接触。接触也可以通过将化合物作为配方培养基的成分来实现。
如本文所用，术语“体外”指人工环境以及在人工环境中发生的过程或反应。体外环境包括但不限于试管和细胞培养。
如本文所用，术语“体内”指的是自然环境(例如动物或细胞)以及在自然环境中发生的过程或反应，如本文所用的胚胎发育、细胞分化、神经管形成等。
如本文所用，术语“表达”涉及基因或蛋白质时指制造可以使用如微阵列测定、抗体染色测定等测定来观察的mRNA或蛋白质。
如本文所用，术语“标志物”或“细胞标志物”指识别特定细胞或细胞类型的基因或蛋白质。一种细胞的标志物可以不限于一种标志物，标志物可以指标志物的“模式”，使得指定的标志物组可以区分一种细胞或细胞类型和另一种细胞或细胞类型。
如本文所用，当关联本文所公开的任何细胞时，术语“衍生自”或“建立自”或“分化自”指从细胞系中的(例如，分离的、纯化的等)最终母细胞获得的细胞，组织(例如分离的胚胎)，或使用任何操作的液体，例如，但不限于，单细胞分离、体外培养、(使用例如蛋白质、化学物质、辐射、病毒感染、DNA序列转染，例如使用形态发生素等的)处理和/或诱变、(例如通过连续培养)筛选包含在培养的母细胞中的任何细胞。衍生的细胞可以通过对生长因子、细胞因子的应答，对细胞因子处理的选择进展，粘着性，缺乏粘着性，分选过程等从混合群体中选择。
本文中的“个体”或“主体”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；羊；猪；山羊；牛；马；以及非人灵长类动物，如猿类和猴子。
如本文所用，术语“疾病”指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何症状或病症。
如本文所用，术语“治疗”或“医治”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗性效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态、和缓和或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止由于受影响或所诊断的受试者或疑似患有该病症的受试者的病症导致的恶化，而且治疗也可以预防处于病症或疑似患有病症风险的受试者中病症或者病症症状的发作。
5.2.分化干细胞的方法
本发明提供诱导干细胞分化的方法，包括将干细胞与至少一种Small MothersAgainst Decapentaplegic(SMAD)信号传导的抑制剂(称为“SMAD抑制剂”)、至少一种音猬因子(SHH)信号传导的激活剂(称为“SHH激活剂”)、以及至少一种wingless(Wnt)信号传导的激活剂(称为“Wnt激活剂”)接触；以及将该细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的激活剂(称为“FGF激活剂”)和至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触，以获得包含表达至少一种指示mDA神经元或其前体的标志物的分化细胞的细胞群体。
使用Wnt信号传导抑制剂可以改善mDA神经元衍生，例如，允许衍生更广泛的mDA神经元。延长的Wnt信号传导可干扰mDA神经元分化和亚型规范(Andersson等人，Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America(2013)；110,E602-610)。例如，通过使用Wnt信号传导的抑制剂来抑制Wnt信号传导，导致mDA神经元标志物(包括A9亚型mDA神经元标志物(例如ALDH1A1)和A10亚型mDA神经元标志物(例如CALB1)以及mDA神经元成熟标志物(包括但不限于DAT、VMAT2、PITX3、CHRNA6和CHRNB3)的表达增加。Wnt信号传导的抑制剂可以影响A9亚型mDA神经元标志物的表达。指示A9亚型中脑多巴胺神经元的标志物的非限制性实例包括LMO3、ALDH1A1、SOX6、VGLUT2和NDNF。在某些实施方式中，Wnt信号传导的抑制剂增加A9亚型mDA神经元标志物的表达。在某些实施方式中，Wnt信号传导的抑制剂增加ALDH1A1的表达。在某些实施方式中，Wnt信号传导的抑制剂增加A10亚型mDA神经元标志物的表达。在某些实施方式中，Wnt信号传导的抑制剂增加CALB1的表达。
此外，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体具有改善的纤维生长，减少剩余的Ki67+增殖细胞，并提高体内存活率，这使得这些细胞更适合于治疗性用途。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后可以存活至少约2周、至少约3周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至多约6个月、至多约1年、至多约2年、至多约3年、至多约4年，或至多约5年。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元在体内移植后可以存活至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月、至多约6个月、至多约1年、至多约2年、至多约3年、至多约4年或至多约5年。
5.2.1.干细胞
本公开主题提供体外诱导干细胞分化以产生mDA神经元及其前体的方法。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，多能干细胞选自胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、及其组合。在某些实施方式中，干细胞是多向分化潜能干细胞。可与本公开方法一起使用的干细胞的非限制性实例包括非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导的非胚胎多能细胞和工程化多能细胞。在某些实施方式中，干细胞是人干细胞。人干细胞的非限制性实例包括人胚胎干细胞(hESC)、人多能干细胞(hPSC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)、人孤雌生殖干细胞、原始生殖细胞样多能干细胞、外胚层干细胞、F-class多能干细胞、体细胞干细胞、癌症干细胞、或任何其他能够进行谱系特异性分化的细胞。在某些实施方式中，干细胞是人胚胎干细胞(hESC)。在某些实施方式中，干细胞是人诱导多能干细胞(hiPSC)。在某些实施方式中，干细胞是非人干细胞。在某些实施方式中，干细胞是非人灵长类干细胞。在某些实施方式中，干细胞是啮齿动物干细胞。
在某些实施方式中，干细胞或其子代细胞包含引入的异源核酸，其中所述核酸可编码所需的核酸或蛋白质产物或具有信息价值(例如，参见美国专利第6,312,911号，将其全部内容并入以供参考)。蛋白质产物的非限制性实例包括可通过体内影像研究检测的标志物，例如受体或其他细胞膜蛋白。标志物的非限制性实例包括荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(EBFP、EBFP2、Azurite、mKalama1)、青色荧光蛋白(ECFP、Cerulean、CyPet、mTurquoise2)和黄色荧光蛋白衍生物(YFP、Citrine、Venus、YPet、EYFP))、β-半乳糖苷酶(LacZ)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、新霉素磷酸转移酶(neo)、酶(如氧化酶和过氧化物酶)和抗原分子。如本文所用，术语“报告基因”或“报告构建体”是指包含编码易于检测或易于分析的蛋白质(例如有色蛋白质、荧光蛋白质(例如GFP)或酶(例如β-半乳糖苷酶(lacZ基因)))的核酸的遗传构建体。在某些实施方式中，报告子可由早熟有丝分裂后mDA神经元标志物基因(例如NURR1)的重组启动子驱动。
5.2.2.SMAD抑制剂
SMAD抑制剂的非限制性实例包括转化生长因子β(TGFβ)/激活素-Nodal信号传导的抑制剂(称为“TGFβ/激活素-Nodal抑制剂”)和骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的抑制剂。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂可使配体(包括TGFβ、BMP、Nodal和激活素)失效，和/或通过阻断受体和下游效应器阻断其信号传导通路。TGFβ/激活素-Nodal抑制剂的非限制性实例包括在WO/2010/096496、WO/2011/149762、WO/2013/067362、WO/2014/176606、WO/2015/077648、Chambers等人,Nat Biotechnol.2009Mar；27(3):275-80、Kriks等人,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51和Chambers等人,Nat Biotechnol.2012Jul1；30(7):715-20(2012)中公开的那些，所有这些均出于所有目的将其全部内容并入本文以供参考。在某些实施方式中，至少一种TGFβ/激活素-Nodal抑制剂选自ALK5抑制剂、ALK4抑制剂、ALK7抑制剂、及其组合。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂包括ALK5的抑制剂。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂是选自SB431542、其衍生物、及其混合物的小分子。“SB431542”是指编号为CAS 301836-41-9、分子式为C22H18N4O3、名称为4-[4-(l,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺的分子，例如，见以下结构：
Figure BDA0003961488660000211
在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂包括SB431542。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂包括SB431542的衍生物。在某些实施方式中，SB431542的衍生物为A83-01。
在某些实施方式中，至少一种SMAD抑制剂包括BMP信号传导的抑制剂(称为“BMP抑制剂”)。BMP抑制剂的非限制性实例包括WO2011/149762、Chambers等人,NatBiotechnol.2009Mar；27(3):275-80、Kriks等人,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51、和Chambers等人,Nat Biotechnol.2012Jul l；30(7):715-20中公开的那些，将所有这些的全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，BMP抑制剂是选自LDN193189、Noggin、多索吗啡、其衍生物、及其混合物的小分子。“LDN193189”指小分子DM-3189，IUPAC名称为4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉，化学式为C25H22N6，如下式。
Figure BDA0003961488660000221
LDN193189能够作为SMAD信号传导的抑制剂发挥作用。LDN193189也是ALK2、ALK3和ALK6蛋白酪氨酸激酶(PTK)的高效小分子抑制剂，抑制I型TGFβ受体ALK1和ALK3家族成员的信号传导，从而抑制多种生物信号的传递，包括骨形态发生蛋白(BMP)BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和激活素细胞因子信号，以及随后Smad1、Smad5和Smad8的SMAD磷酸化(Yu等人.(2008)Nat Med14:1363-1369；Cuny等人.(2008)Bioorg.Med.Chem.Lett.18:4388-4392，将其并入本文以供参考)。
在某些实施方式中，BMP抑制剂包括LDN193189。在某些实施方式中，BMP抑制剂包括Noggin。
在某些实施方式中，干细胞暴露于一种SMAD抑制剂，例如一种TGFβ/激活素抑制剂。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂为SB431542。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂是SB431542的衍生物。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂是A83-01。
在某些实施方式中，干细胞暴露于两种SMAD抑制剂。在某些实施方式中，两种SMAD抑制剂是TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂。在某些实施方式中，干细胞暴露于SB431542或A83-01、和LDN193189或Noggin。在某些实施方式中，干细胞暴露于SB431542和LDN193189。在某些实施方式中，干细胞暴露于A83-01和LDN193189。在某些实施方式中，干细胞暴露于SB431542和Noggin。在某些实施方式中，干细胞暴露于A83-01和Noggin。
在某些实施方式中，将干细胞接触或暴露于至少一种SMAD抑制剂至少约5天，或至少约10天。在某些实施方式中，将干细胞接触或暴露于至少一种SMAD抑制剂至多约5天、或至多约10天。在某些实施方式中，将干细胞接触或暴露于至少一种SMAD抑制剂约5天至约10天。在某些实施方式中，将干细胞接触或暴露于至少一种SMAD抑制剂约5天。在某些实施方式中，将干细胞接触或暴露于至少一种SMAD抑制剂6天。在某些实施方式中，将干细胞接触或暴露于至少一种SMAD抑制剂7天。在某些实施方式中，从第0天至第6天，将细胞接触或暴露于至少一种SMAD抑制剂。在某些实施方式中，从第0天至第6天，每天或每隔一天将至少一种SMAD抑制剂添加到包含干细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第0天至第6天，每天(每日)将至少一种SMAD抑制剂添加到包含干细胞的细胞培养基中。
在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于TGFβ/激活素-Nodal抑制剂。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的TGFβ/激活素-Nodal抑制剂的浓度在约1μM至约20μM之间、约1μM至约10μM之间、约1μM至约15μM之间、约10μM至约15μM之间、约5μM至约10μM之间、约5μM至约15μM之间、约5μM至约20μM之间、或约15μM至约20μM之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的TGFβ/激活素-Nodal抑制剂的浓度在约1μM至约10μM之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的TGFβ/激活素-Nodal抑制剂的浓度为约5μM或约10μM。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的TGFβ/激活素-Nodal抑制剂的浓度为约10μM。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂包括SB431542或其衍生物(例如A83-01)。在某些实施方式中，TGFβ/激活素-Nodal抑制剂包括SB431542。
在某些实施方式中，将细胞与BMP抑制剂接触或暴露于BMP抑制剂。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的BMP抑制剂的浓度在约50nM至约500nM之间，或在约100nM至约500nM之间，或在约200nM至约500nM之间，或在约200nM至约300nM之间，或在约200nM至约400nM之间，或在约100nM至约250nM之间，或在约100nM至约250nM之间，或在约200nM至约250nM之间，或在约250nM至约300nM之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的BMP抑制剂的浓度在约200nM至约300mM之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的BMP抑制剂的浓度为约150nM、约200nM、约250nM、约300nM、或约350nM。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的BMP抑制剂的浓度为约250nM。在某些实施方式中，BMP抑制剂包括LDN193189或其衍生物。在某些实施方式中，BMP抑制剂包括LDN193189。
在某些实施方式中，细胞同时接触或暴露于TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂。在某些实施方式中，干细胞接触或暴露于TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂约5天。在某些实施方式中，干细胞接触或暴露于TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂6天。在某些实施方式中，干细胞接触或暴露于TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂7天。在某些实施方式中，从第0天至第6天，将细胞接触或暴露于TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂。在某些实施方式中，从第0天至第6天，每天或每隔一天将TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂添加到包含干细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第0天至第6天，每天(每日)将TGFβ/激活素-Nodal抑制剂和BMP抑制剂添加到包含干细胞的细胞培养基中。
5.2.3.Wnt激活剂
在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂降低GSK3β以激活Wnt信号传导。因此，在某些实施方式中，Wnt激活剂是GSK3β抑制剂。GSK3β抑制剂能够激活WNT信号传导通路，参见，例如，Cadigan等,J Cell Sci 2006；119:395-402；Kikuchi等人,CellSignaling.2007；19:659-671，将其全部内容并入本文以供参考。如本文所用，术语“糖原合成酶激酶3β抑制剂”或“GSK3β抑制剂”指抑制糖原合成酶激酶3β酶的化合物，例如，参见Doble等人,J Cell Sci.2003；116:1175-1186，将其全部内容并入本文以供参考。GSK3β抑制剂的非限制性实例包括CHIR99021、BIO((3E)-6-溴-3-[3-(羟胺基)吲哚-2-亚基]-1H-吲哚-2-酮)、AMBMP盐酸盐、LP 922056、SB-216763、CHIR98014、锂、3F8、脱氧胆酸、以及在WO2011/149762、WO13/067362、Chambers等人,Nat Biotechnol.2012Jul 1；30(7):715-20、Kriks等人,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51、和Calder等人,JNeurosci.2015Aug19；35(33):11462-81中所公开的那些，将所有这些的全部内容并入以供参考。
Wnt激活剂的非限制性实例包括CHIR99021、Wnt3A、Wnt1、Wnt5a、BIO((3E)-6-溴-3-[3-(羟胺基)吲哚-2-亚基]-1H-吲哚-2-酮)、AMBMP盐酸盐、LP 922056、SB-216763、CHIR98014、锂、3F8、脱氧胆酸，以及在WO2011/149762、WO13/067362、Chambers等人,NatBiotechnol.2012Jul 1；30(7):715-20、Kriks等人,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51、和Calder等人,J Neurosci.2015Aug 19；35(33):11462-81中所公开的那些，将所有这些的全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂是选自CHIR99021、Wnt3A、Wnt1、Wnt5a、BIO、CHIR98014、锂、3F8、脱氧胆酸、其衍生物、及其混合物的小分子。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂包括CHIR99021或其衍生物。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂包括CHIR99021。“CHIR99021”(也称为“氨基嘧啶”或“3-[3-(2-羧乙基)-4-甲基吡咯-2-亚甲基(methylidenyl)]-2-吲哚酮”)指IUPAC名称6-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基)乙胺基)烟腈，其式如下。
Figure BDA0003961488660000251
CHIR99021具有高度选择性，对一组相关和不相关的激酶表现出近千倍的选择性，对人GSK3β的IC50＝6.7nM，对啮齿类GSK3β同系物为纳摩尔级IC50值。
在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt激活剂至少约5天、至少约10天、至少约15天或至少约20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt激活剂至多约5天、至多约10天、至多约15天或至多约20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt激活剂约5天至约20天、约5天至约15天、约10天至约20天、约5天至约15天、或约10天至约15天。在某些实施方式中，将细胞与至少一种Wnt激活剂接触约10天至约20天。在某些实施方式中，将细胞与至少一种Wnt激活剂接触约15天。在某些实施方式中，将干细胞与至少一种Wnt信号传导的激活剂接触16天。在某些实施方式中，将干细胞与至少一种Wnt信号传导的激活剂接触17天。在某些实施方式中，从第0天至第16天，将细胞与至少一种Wnt激活剂接触。在某些实施方式中，从第0天至第16天，每天或每隔一天将至少一种Wnt激活剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第0天至第16天，每天(每日)将至少一种Wnt激活剂添加到包含细胞的细胞培养基中。
在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度在其暴露于细胞期间增加(也称为“Wnt Boost”)。在某些实施方式中，从细胞初始暴露于至少一种Wnt激活剂起至少约2天、至少约4天或至少约5天增加或Wnt Boost。在某些实施方式中，从细胞初始暴露于至少一种Wnt激活剂起约4天增加或Wnt Boost。
在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂至少约5天或至少约10天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂至少约5天。在某些实施方式中，将细胞与增加后浓度的至少一种Wnt激活剂接触至多约5天、至多约10天或至多约15天。在某些实施方式中，将细胞与增加后浓度的至少一种Wnt激活剂接触至多约10天。
在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂约5天至约15天之间，或约5天至约10天之间，或约10天至约15天之间。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂约5天至约10天之间。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂约5天、约10天或约15天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂约5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂6天。在某些实施方式中，从第4天至第9天，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂约10天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂12天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂13天。在某些实施方式中，从第4天至第16天，将细胞接触或暴露于增加后浓度的至少一种Wnt激活剂。
在某些实施方式中，在Wnt Boost之前与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt激活剂的初始浓度小于约5μM、小于约3μM或小于约1.5μM、或小于约1.5μM，包括但不限于约0.01μM至约5μM之间、约0.01μM至约3μM之间、约0.05μM至约3μM之间、约0.1μM至约3μM之间、约0.5μM至约3μM之间、约0.5μM至约2μM之间、约0.5μM至约1μM之间，或约0.5μM至约1.5μM之间。在某些实施方式中，在Wnt Boost之前与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt激活剂的初始浓度为约1μM。在某些实施方式中，在Wnt Boost之前与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt激活剂的初始浓度小于约1.5μM，例如，约1μM、约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM或约0.9μM。在某些实施方式中，在Wnt Boost之前与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt激活剂的初始浓度为约1μM。在某些实施方式中，在Wnt Boost之前与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt激活剂的初始浓度为约0.5μM。在某些实施方式中，在Wnt Boost之前与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt激活剂的初始浓度为约0.7μM。
在某些实施方式中，Wnt Boost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度为约3μM或更大、约5μM或更大、约10μM或更大、约15μM或更大、或约20μM或更大。在某些实施方式中，WntBoost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度在约3μM至约15μM之间、约3μM至约10μM之间或约5μM至约10μM之间。在某些实施方式中，Wnt Boost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度在约5μM至约10μM之间。在某些实施方式中，Wnt Boost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度为约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约7.5μM、约8μM、约8.5μM、约9μM、约9.5μM、或约10μM。在某些实施方式中，Wnt Boost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度为约3μM。在某些实施方式中，Wnt Boost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度为约6μM。在某些实施方式中，Wnt Boost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度为约7μM。在某些实施方式中，Wnt Boost后至少一种Wnt激活剂的增加后浓度为约7.5μM。
在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约50％至约2000％之间、或约100％至约1500％之间、或约150％至约1500％之间、或约200％至约1500％之间、或约250％至约1500％之间、或约300％至约1500％之间、或约300％至约1000％之间、或约300％至约400％之间、或约500％至约1000％之间、或约800％至约1000％之间、或约900％至约1000％之间、或约950％至约1000％之间。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约300％至约1000％之间。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约300％至约500％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约900％至约1000％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％、约500％、约550％、约600％、约650％、约700％、约750％、约800％、约850％、约900％、约950％、约1000％、约1050％、或约1100％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约200％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约300％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约350％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约500％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约950％。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度比与细胞接触或暴露于细胞的初始浓度增加约1000％。
在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度从约1μM增加至约5μM和约10μM之间。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度从约1μM增加至约6μM。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度从约1μM增加至约3μM和约5μM之间。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂的浓度从约1μM增加至约3μM。
在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂包括GSK3β抑制剂。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂包括CHIR99021或其衍生物。在某些实施方式中，至少一种Wnt激活剂包括CHIR99021。
5.2.4.SHH激活剂
如本文所用，术语“音猬因子”、“SHH”或“Shh”指哺乳动物信号传导通路家族中称为刺猬因子的至少三种蛋白质之一的蛋白质，另一种是沙漠刺猬因子(DHH)，第三种是印度刺猬因子(IHH)。SHH通过与跨膜分子Patched(PTC)和Smoothened(SMO)相互作用，与至少两种跨膜蛋白相互作用。SHH通常与PTC结合，然后允许SMO作为信号传感器激活。在缺乏SHH的情况下，PTC通常抑制SMO，继而激活转录抑制因子，因此某些基因不会转录。当SHH存在并与PTC结合时，PTC不能干扰SMO的功能。在SMO不受抑制的情况下，某些蛋白质能够进入细胞核并充当转录因子，从而激活某些基因(参见Gilbert,2000Developmental Biology(Sunderland,Mass.,Sinauer Associates,Inc.,Publishers)。在某些实施方式中，SHH激活剂指能够激活SHH信号传导通路的任何分子或化合物，包括能够结合PTC或SMO的分子或化合物。在某些实施方式中，至少一种SHH激活剂选自结合PCT的分子、结合SMO的分子、及其组合。SHH激活剂的非限制性实例包括WO10/096496、WO13/067362、Chambers等人,NatBiotechnol.2009Mar；27(3):275-80、和Kriks等人,Nature.2011Nov 6；480(7378):547-51中公开的那些。在某些实施方式中，至少一种SHH激活剂选自SHH蛋白、SMO激动剂、或其组合。在某些实施方式中，SHH蛋白质选自重组SHH、修饰的N-端SHH、或其组合。在某些实施方式中，重组SHH包含N-端片段和C-端片段。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH在N-端包含两个异亮氨酸。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH与未修饰的N-端SHH具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的序列同一性。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH与未修饰的人N-端SHH具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的序列同一性。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH与未修饰的小鼠N-端SHH具有至少约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的序列同一性。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH包括SHH C25II。在某些实施方式中，修饰的N-端SHH包括SHH C24II。
SMO激动剂(SAG)的非限制性实例包括嘌吗啡胺、GSA10和20(S)-羟基胆固醇。在某些实施方式中，SAG包括嘌吗啡胺。
在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种SHH激活剂至少约5天或至少约10天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种SHH激活剂至多约5天或至多约10天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种SHH激活剂约5天至约10天之间。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种SHH激活剂约5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种SHH激活剂6天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种SHH激活剂7天。在某些实施方式中，从第0天至第6天，将细胞接触或暴露于至少一种SHH激活剂。在某些实施方式中，从第0天至第6天，每天或每隔一天将至少一种SHH激活剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第0天至第6天，每天(每日)将至少一种SHH激活剂添加到包含细胞的细胞培养基中。
在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种SHH激活剂的浓度在约50ng/mL至约1000ng/mL之间、约100ng/mL至约1000ng/mL之间、约20ng/mL至约1000ng/mL之间、约300ng/mL至约1000ng/mL之间、约400ng/mL至约1000ng/mL之间、约500ng/mL至约1000ng/mL之间、约400ng/mL至约800ng/mL之间、约400ng/mL至约700ng/mL之间、约400ng/mL至约600ng/mL之间、或约500ng/mL至约600ng/mL之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种SHH激活剂的浓度在约400ng/mL至约600ng/mL之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种SHH激活剂的浓度为约400ng/mL、约450ng/mL、约500ng/mL、约550ng/mL，或约600ng/mL。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种SHH激活剂的浓度为约500ng/mL。
在某些实施方式中，至少一种SHH信号传导的激活剂包括SHH C25II。
5.2.5.FGF激活剂
FGF家族包括向受体酪氨酸激酶发出信号的分泌信号传导蛋白(分泌FGF)。系统发育分析表明，22个Fgf基因可分为七个亚家族，每个亚家族包含两到四个成员。分支长度与每个基因之间的进化距离成正比。
在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂选自FGF8a、FGF17、FGF18、FGF8b、FGF2、FGF4、及其衍生物。在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂选自FGF8a、FGF17、FGF18、FGF2、FGF4、及其衍生物。在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂选自FGF8a、FGF17、和FGF18。
FGF8亚家族由FGF8a、FGF8b、FGF17和FGF18组成。脊椎动物中脑和小脑的早期模式由产生FGF8a、FGF8b、FGF17和FGF18的中脑/后脑组织器调节。研究表明，FGF8b的功能不同于FGF8a、FGF17和FGF18(Liu等人,Development.2003Dec；130(25):6175-85)。FGF8b是唯一能够诱导rl基因Gbx2并强烈激活通路抑制剂Spry 1/2，以及抑制中脑基因Otx2的蛋白质(Liu 2003)。此外，FGF8b沿着中脑中诱导的Gbx2结构域和剩余的Otx2区之间的连接(junction)延伸组织器，与小脑发育相关(Liu 2003)。相比之下，FGF8a、FGF17和FGF18导致中脑扩张并上调中脑基因表达(Liu 2003)。
在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂能够引起中脑扩张并上调中脑基因表达。在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂能够促进中脑发育。在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂选自FGF8a、FGF17、FGF18、FGF2、FGF4、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂选自FGF8a、FGF17、FGF18、及其组合。在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂包括或为FGF18。
在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂至少约1天、至少约3天、至少约5天、至少约8天、或至少约10天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂至少约5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂至少4天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂至多约5天(例如至多5天、至多6天、或至多7天)，或至多约10天(例如至多8天、至多9天、至多10天、至多11天、至多12天)，或至多约15天，或至多约20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂至少4天和/或至多7天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂约1天至约20天、约1天至约15天、约1天至约5天、约5天至约20天、约5天至约15天、或约5天至约10天、约10天至约20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂约1天至约10天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂约3天、约5天、或约8天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂约1天至约5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂约5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂约4天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂5天。
在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起至少约5天、或至少约10天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起不晚于约15天、或不晚于约20天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起不晚于约18天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约5天至约20天之间、约5天至约20天之间、约10天至约15天之间、约10天至约18天之间、约5天至约15天之间、或约10天至约20天之间开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约5天至约10天之间开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约10天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起12天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起13天开始。
在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约10天开始，且细胞与至少一种FGF激活剂接触约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种FGF激活剂的接触或细胞暴露于至少一种FGF激活剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起12天或13天开始，且细胞与至少一种FGF激活剂接触4天或5天。在某些实施方式中，从第12天至第16天，将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂。在某些实施方式中，从第12天至第16天，每天或每隔一天将至少一种FGF激活剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第12天至第16天，每天(每日)将至少一种FGF激活剂添加到包含细胞的细胞培养基中。
在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种FGF激活剂的浓度在约10ng/mL至约500ng/mL之间、约50ng/mL至约500ng/mL之间、约100ng/mL至约500ng/mL之间、约100ng/mL至约400ng/mL之间、约100ng/mL至约300ng/mL之间、约100ng/mL至约200ng/mL之间、或约100ng/mL至约250ng/mL之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种FGF激活剂的浓度在约100ng/mL至约200ng/mL之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种FGF激活剂的浓度为约100ng/mL。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种FGF激活剂的浓度为约200ng/mL。
在某些实施方式中，至少一种FGF激活剂包括FGF18。
5.2.6.Wnt抑制剂
Wnt信号传导包括经典Wnt信号传导和非经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，至少一种Wnt抑制剂能够抑制经典Wnt信号传导。在某些实施方式中，至少一种Wnt抑制剂能够抑制经典Wnt信号传导和非经典Wnt信号传导两者。能够抑制经典Wnt信号和非经典Wnt信号两者的Wnt抑制剂的非限制性实例包括IWP2、IWR1-endo、IWP-O1、Wnt-C59、IWP-L6、IWP12、LGK-974、IWR-1、ETC-159、iCRT3、IWP-4、盐霉素、恩波维铵、iCRT14、FH535、CCT251545、Wogonin、NCB-0846、六氯酚、KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)、BC2059、PKF115-584、槲皮素、NSC668036、G007-LK、及其衍生物。在某些实施方式中，至少一种Wnt抑制剂选自IWP2、IWR1-endo、XAV939、IWP-O1、Wnt-C59、IWP-L6、LGK-974、IWR-1、Wnt-C59、ETC-159、iCRT3、IWP-4、ICG-001、盐霉素、恩波维铵、iCRT14、FH535、CCT251545、KYA1797K、Wogonin、NCB-0846、六氯酚、PNU-74654、KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)、雷公藤甲素、IWP12、BC2059、PKF115-584、槲皮素、NSC668036、G007-LK、MSAB、LF3、JW55、异槲皮苷、WIKI4(Wnt抑制剂激酶抑制剂4)、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂选自IWP2、IWR1-endo、IWP-O1、IWP12、Wnt-C59、IWP-L6、LGK-974、IWR-1、ETC-159、iCRT3、IWP-4、盐霉素、恩波维铵、iCRT14、FH535、CCT251545、Wogonin、NCB-0846、六氯酚、KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)、BC2059、PKF115-584、槲皮素、NSC668036、G007-LK、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt信号传导的抑制剂选自XAV939、ICG-001、PNU-74654、雷公藤甲素、KYA1797K、MSAB、LF3、JW55、异槲皮苷、WIKI4、其衍生物、及其组合。在某些实施方式中，至少一种Wnt抑制剂包括IWP2或其衍生物。
在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂至少约1天、至少约3天、至少约5天、至少约8天、至少约10天、至少约15天或至少约20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂至多约5天、或至多约10天、或至多约15天、至多约20天、至多约25天、或至多约30天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂约1天至约20天、约1天至约15天、约1天至约5天、约5天至约20天、约5天至约15天、或约5天至约10天、约10天至约20天、约10天至约15天、或约15天至约20天、约10天至约30天、约10天约25天、约15天至约30天、约15天至约25天、约20天至约30天、约20天至约25天、或约25天至约30天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂约1天至约10天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂约10天至约15天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂约15天至约20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂约5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂约15天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂约20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂4天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂5天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂6天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂7天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂14天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂15天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂19天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂20天。在某些实施方式中，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂16天、17天、18天、21天、22天或23天。
在某些实施方式中，与至少一种Wnt抑制剂接触的细胞包括mDA神经元前体和mDA神经元。
在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起至少约5天、或至少约10天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起不晚于约15天、或不晚于约20天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约5天至约20天、约5天至约20天、约10天至约15天、约5天至约15天或约10天至约20天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约5天至约10天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约10天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起10天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起11天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起12天开始。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起13天开始。
在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起约10天开始，且细胞与至少一种Wnt抑制剂接触约5天。在某些实施方式中，细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触或细胞暴露于至少一种Wnt抑制剂是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触或细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始暴露起12天或13天开始，且细胞与至少一种Wnt抑制剂接触4天或5天。在某些实施方式中，从第12天至第16天，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂。在某些实施方式中，从第12天至第16天，每天或每隔一天将至少一种Wnt抑制剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第12天至第16天，每天(每日)将至少一种Wnt抑制剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第12天至第25天，细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂。在某些实施方式中，从第12天至第25天，每天或每隔一天将至少一种Wnt抑制剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第12天至第25天，每天(每日)将至少一种Wnt抑制剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第12天至第30天，将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂。在某些实施方式中，从第12天至第30天，每天或每隔一天将至少一种Wnt抑制剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，从第12天至第30天，每天(每日)将至少一种Wnt抑制剂添加到包含细胞的细胞培养基中。在某些实施方式中，将细胞同时接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂和至少一种FGF激活剂。在某些实施方式中，将至少一种Wnt抑制剂和至少一种FGF激活剂一起添加到包含细胞的细胞培养基中。
在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt抑制剂的浓度在约0.5μM至约20μM之间、在约0.5μM至约10μM之间、在约0.5μM至约5μM之间、约0.5μM至约1μM、约0.5μM至约2μM之间、在约5μM至约10μM之间、在约10μM至约20μM之间、在约1μM至约2μM之间、或在约1μM至约5μM之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt抑制剂的浓度在约0.5μM和约2μM之间。在某些实施方式中，与细胞接触或暴露于细胞的至少一种Wnt抑制剂的浓度为约1μM。
在某些实施方式中，至少一种Wnt抑制剂包括IWP2。
5.2.7.示例性方法
在某些实施方式中，将干细胞接触或暴露于至少一种TGFβ/激活素-Nodal抑制剂(例如SB431542，例如浓度为约10μM)、至少一种BMP抑制剂(例如LDN193189，例如浓度为约250nM)、以及至少一种SHH激活剂(例如SHH C25II，例如浓度为约500ng/mL)约5天(例如7天，例如从第0天至第6天)，并且将细胞与至少一种Wnt激活剂(例如，CHIR99021，例如，以约1μM的浓度接触约5天(例如4天，例如从第0天至第3天)、以及以约6μM的浓度接触约5天(例如，6天，例如，从第4天至第9天)、以及以约3μM的浓度接触约5天(例如7天，例如从第10天至第16天))。将细胞接触或暴露于至少一种FGF激活剂(例如FGF18，例如浓度为约100ng/ml)，其中细胞与至少一种FGF激活剂的接触是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触起约10天(例如，10天或12天)开始，并且细胞与至少一种FGF激活剂接触约5天(例如，5天(从第12天至第16天)或7天(例如，从第10天至第16天)。将细胞接触或暴露于至少一种Wnt抑制剂(例如，IWP2，例如，浓度为约1μM)，其中细胞与至少一种Wnt抑制剂的接触是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触起约10天(例如，10天或12天)开始，并且细胞与至少一种Wnt抑制剂接触约5天(例如，5天(从第12天至第16天)、7天(例如从第10天至第16天)、约15天(例如14天(从12天至25天)或约20天(例如19天(从第12天至第30天)。
5.2.8.细胞培养基
在某些实施方式中，将上述抑制剂和激活剂添加到包含细胞的细胞培养基中。合适的细胞培养基包括但不限于
Figure BDA0003961488660000381
Serum Replacement(“KSR”)培养基、
Figure BDA0003961488660000382
培养基(NB)、N2培养基、B-27培养基和
Figure BDA0003961488660000383
(“E8/E6”)培养基、及其组合。KSR培养基、NB培养基、N2培养基、B-27培养基和E8/E6培养基均是可市售的。KSR培养基是优化的用于在培养基中生长和保持未分化的hESC的一种定义确定的无血清配方。
在某些实施方式中，细胞培养基是KSR培养基。KSR培养基的成分在WO2011/149762中公开。在某些实施方式中，KSR培养基包含Knockout DMEM、Knockout SerumReplacement、L-谷氨酰胺、Pen/Strep、MEM和13-巯基乙醇。在某些实施方式中，1升KSR培养基包含820mL Knockout DMEM、150mL Knockout Serum Replacement、10mL 200mM L-谷氨酰胺、10mL Pen/Strep、10mL 10mM MEM、和55μM 13-巯基乙醇。
在某些实施方式中，细胞培养基是E8/E6培养基。E8/E6培养基是一种无饲养层(feeder-free)和无外源物质(xeno-free)的培养基，支持人多能干细胞的生长和扩增。E8/E6培养基已被证明支持体细胞重编程。此外，E8/E6培养基可作为PSC培养自定义培养基配方的基础。一个实例E8/E6培养基在Chen等人,Nat Methods 2011May；8(5):424-9中描述，将其全部内容并入以供参考。一个实例E8/E6培养基在WO15/077648中公开，将其全部内容并入以供参考。在某些实施方式中，E8/E6细胞培养基包含DMEM/F12、抗坏血酸、硒、胰岛素、NaHCO3、转铁蛋白、FGF2和TGFβ。E8/E6培养基与KSR培养基的不同之处在于，E8/E6培养基不包含活性BMP成分。因此，在某些实施方式中，当使用E8/E6培养基培养本公开的干细胞以分化为mDA神经元或其前体时，不需要向E8/E6培养基中添加至少一种BMP抑制剂。在某些实施方式中，当使用E8/E6培养基培养本公开的干细胞以分化为mDA神经元或其前体时，将至少一种BMP抑制剂添加到E8/E6培养基中。
5.2.9.分化细胞
在某些实施方式中，该方法包括获得分化细胞的细胞群体，其中至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的分化细胞表达至少一种指示mDA神经元或其前体的标志物。指示mDA神经元或其前体的标志物的非限制性实例包括engrailed-1(EN1)、orthodenticle同源框2(OTX2)、酪氨酸羟化酶(TH)、核受体相关-1蛋白(NURR1)、叉头框蛋白A2(FOXA2)、和LIM同源框转录因子1α(LMX1A)、PITX3、LMO3、SNCA、ADCAP1、CHRNA4、ALDH1A1、DAT、VMAT1、SOX6、WNT1和GIRK2。
在某些实施方式中，分化细胞表达至少一种指示mDA神经元或其前体的标志物是从细胞与至少一种SMAD抑制剂的初始接触起至少约10天(例如，约15天、约20天、约30天、约40天、或约50天)。在某些实施方式中，分化细胞在细胞与至少一种SMAD抑制剂初始接触后约15天(例如，15天、16天或17天)表达至少一种指示mDA神经元或其前体的标志物。
用至少Wnt抑制剂处理细胞可以改善mDA神经元的衍生。在某些实施方式中，用至少Wnt抑制剂处理细胞增加A9亚型mDA神经元标志物、A10亚型mDA神经元标志物和mDA神经元成熟标志物中的至少一种的表达。在某些实施方式中，用至少Wnt抑制剂处理细胞增加ALDH1A1的表达。在某些实施方式中，用至少Wnt抑制剂处理细胞增加CALB1的表达。在某些实施方式中，用至少Wnt抑制剂处理细胞增加DAT的表达。在某些实施方式中，用至少Wnt抑制剂处理细胞增加VMAT2的表达。在某些实施方式中，用至少Wnt抑制剂处理细胞增加DAT和VMAT2的表达。
在某些实施方式中，至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％)的分化细胞从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂初始接触起约15天表达ALDH1A1。在某些实施方式中，至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％)的分化细胞从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂初始接触起16天表达ALDH1A1。在某些实施方式中，至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％)的分化细胞从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂初始接触起约25天表达ALDH1A1。在某些实施方式中，至少约50％(例如，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％)的分化细胞从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂初始接触起约30天表达ALDH1A1。
此外，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体具有改善的纤维生长，减少剩余的Ki67+增殖细胞，并提高体内存活率，这使得这些细胞更适合于治疗用途。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后至少约2周、至少约3周、至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约1年、至少约2年、至少约3年、至少约4年或至少约5年具有可检测表达水平的至少一种mDA神经元标志物。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后至少约2周具有可检测表达水平的至少一种mDA神经元标志物。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后至多约1个月、至多约2个月、至多约3个月、至多约4个月、至多约5个月、至多约6个月、至多约1年、至多约2年、至多约3年、至多约4年、或至多约5年具有可检测表达水平的至少一种mDA神经元标志物。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后约1个月具有可检测表达水平的至少一种mDA神经元标志物。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后约2个月具有可检测表达水平的至少一种mDA神经元标志物。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后至少约1个月具有可检测表达水平的至少一种选自TH、EN1、NURR1和ALDH1A1的标志物。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后约2个月具有可检测表达水平的至少一种选自TH、EN1、NURR1和ALDH1A1的标志物。在某些实施方式中，通过本文公开的方法产生的mDA神经元或其前体在体内移植后至少约2个月具有可检测表达水平的至少一种选自TH、EN1、NURR1和ALDH1A1的标志物。
在某些实施方式中，衍生自本公开方法的分化细胞不表达或低表达至少一种选自PAX6、EMX2、LHX2、SMA、SIX1、PITX2、SIM1、POU4F1、PHOX2A、BARHL1、BARHL2、GBX2、HOXA1、HOXA2、HOXB1、HOXB2、POU5F1、NANOG、及其组合的标志物。
在某些实施方式中，将细胞与本文所述的激活剂和抑制剂以有效降低SMA、SIX1、PITX2、SIM1、POU4F1和/或PHOX2A表达的浓度和时间接触。在某些实施方式中，将细胞与本文所述的激活剂和抑制剂以有效降低PAX6、BARHL1和/或BARHL2表达的浓度和时间接触。
在某些实施方式中，至少约80％的分化细胞从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂初始接触起约15天表达FOXA2和EN1。在某些实施方式中，大于约80％(例如，大于约85％或大于约90％)的分化细胞从干细胞与至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起16天表达FOXA2和EN1。
5.2.10.分选方法
在某些实施方式中，本文公开的分化方法还包括基于至少一种或至少两种表面标志物分离mDA神经元及其前体。在某些实施方式中，表面标志物是阴性表面标志物，其中细胞不表达可检测水平的阴性表面标志物。在某些实施方式中，表面标志物是阳性表面标志物，其中细胞表达可检测水平的阳性表面标志物。
在某些实施方式中，本文公开的分化方法还包括分离不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物的细胞。在某些实施方式中，本文公开的分化方法还包括分离表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物的细胞。在某些实施方式中，本文公开的分化方法还包括分离不表达可检测水平的至少一种阴性表面标志物且表达可检测水平的至少一种阳性表面标志物的细胞。
在某些实施方式中，至少一种阴性表面标志物选自CD49e、CD99、CD340、及其组合。在某些实施方式中，至少一种阴性表面标志物包括CD49e。在某些实施方式中，至少一种阳性表面标志物选自CD171、CD184、及其组合。在某些实施方式中，至少一种阳性表面标志物包括CD184。
在某些实施方式中，本文公开的分化方法还包括分离不表达可检测水平的CD49e且表达可检测水平的CD184的细胞。
本领域已知的任何基于表面标志物的细胞分离技术都可以用于本公开的方法中。在某些实施方式中，流式细胞术用于本公开的分离方法。
5.2.11.mDA前体分化为mDA神经元
在某些实施方式中，细胞(例如mDA前体)进一步与DA神经元谱系特异性激活剂和抑制剂例如L-谷氨酰胺、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、环磷酸腺苷(cAMP)、转化生长因子β(TGFβ，例如TGFβ3)、抗坏血酸(AA)，和DAPT(也称为N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸-l,l-二甲基乙酯、LY-374973、N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯甘氨酸叔丁酯；或N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯甘氨酸叔丁酯)接触。在某些实施方式中，细胞与前述DA神经元谱系特异性激活剂和抑制剂接触至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、或至少约10天或更长时间，例如，在约2天至约20天之间、在约3天至约19天之间、在约4天至约18天之间、在约5天至约17天之间、在约6天至约16天之间、在约7天至约15天之间、在约8天至约15天之间、在约9天至约14天之间、或约10天至约13天之间。在某些实施方式中，细胞与前述DA神经元谱系特异性激活剂和抑制剂接触至多约2天、至多约3天、至多约4天、至多约5天、至多约6天、至多约7天、至多约8天、至多约9天、或至多约10天或更长时间。在某些实施方式中，细胞与前述DA神经元谱系特异性激活剂和抑制剂接触约4天、约5天、约6天、约7天或约8天。
在某些实施方式中，细胞与浓度在约0.5mM至约5mM之间、或约1mM至约5mM之间、或约1.5mM至约2.5mM之间、或约1mM至约2mM之间的L-谷氨酰胺接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约2mM的L-谷氨酰胺接触。
在某些实施方式中，细胞与浓度在约5ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约40ng/ml之间、或约20ng/ml至约50ng/ml之间、或约20ng/ml至约40ng/ml、或约10ng/ml至约30ng/ml之间、或约10ng/ml至约20ng/ml之间、或约20ng/ml至约30ng/ml之间的BDNF接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约20ng/ml的BDNF接触。
在某些实施方式中，细胞与浓度在约50nM至约500nM之间、或约100nM至约500nM之间、或约100nM至约400nM之间、或约200nM至约400nM之间、或约200nM至约300nM之间、或约100nM至约300nM之间的抗坏血酸(AA)接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约200nM的AA接触。
在某些实施方式中，细胞与浓度在约5ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约50ng/ml之间、或约10ng/ml至约40ng/ml之间、或约20ng/ml至约50ng/ml之间、或约20ng/ml至约40ng/ml之间、或约10ng/ml至约30ng/ml之间、或约10ng/ml至约20ng/ml之间、或约20ng/ml至约30ng/ml之间的GDNF接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约20ng/ml的GDNF接触。
在某些实施方式中，细胞与浓度在约200nM至约800nM之间、或约200nM至约700nM之间、或约300nM至约700nM之间、或约300nM至约600nM之间、或约400nM至约600nM之间、或约450nM至约550nM之间的cAMP接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约500nM的cAMP接触。
在某些实施方式中，细胞与浓度在约0.01ng/ml至约5ng/ml之间、或约0.1ng/ml至约4ng/ml之间、或约0.5ng/ml至约5ng/ml之间、或约1ng/ml至约3ng/ml之间、或约1ng/ml至约2ng/ml之间的TGFβ3接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约1ng/mL的TGFβ3接触。
在某些实施方式中，细胞与浓度在约1nM至约50nM之间、或约5nM至约50nM之间、或约1nM至约20nM之间、或约5nM至约20nM之间、或约1nM至约10nM之间、或约5nM至约10nM之间、或约5nM至约15nM之间、或约10nM至约20nM之间、或约10nM至约30nM之间、或约30nM至约50nM之间的DAPT接触。在某些实施方式中，细胞与浓度为约10nM的DAPT接触。
在某些实施方式中，如美国公开第2015/0010514号(将其全部内容并入以供参考)所述，进一步培养分化的中脑DA前体。
5.3.细胞群体和组合物
本公开提供通过本文公开的方法(例如第5.2节)获得的体外分化细胞的细胞群体。
本发明提供体外分化细胞的细胞群体，其中至少约50％(例如，至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％)的细胞表达至少一种指示mDA神经元或其前体的标志物。指示mDA神经元或其前体的标志物的非限制性实例包括EN1、OTX2、TH、NURR1、FOXA2、LMX1A、PITX3、LMO3、SNCA、ADCAP1、CHRNA4、SOX6、ALDH1A1、WNT1、DAT、VMAT1和GIRK2。本发明还提供包含此类细胞群体的组合物。在某些实施方式中，体外分化细胞通过本文(例如，在第5.2节中)所述的分化方法获得。
在某些实施方式中，小于约50％(例如，小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％、小于约1％、小于约0.5％、或小于约0.1％)的分化细胞表达至少一种选自PAX6、EMX2、LHX2、SMA、SIX1、PITX2、SIM1、POU4F1、PHOX2A、BARHL1、BARHL2、GBX2、HOXA1、HOXA2、HOXB1、HOXB2、POU5F1、NANOG、及其组合的标志物。
此外，本公开提供包含本文公开的任何细胞群体的组合物。
在某些实施方式中，细胞包含在组合物中，组合物还包含生物相容性支架或基质，例如，当细胞被植入或移植到受试者中时促进组织再生的生物相容性三维支架。在某些实施方式中，生物相容性支架包括细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、胶原蛋白、多肽或蛋白质、多糖，包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶和/或水凝胶(参见例如美国公开第2015/0159135、2011/0296542、2009/0123433和2008/0268019号，将其中每一个的全部内容并入以供参考)。在某些实施方式中，组合物还包含用于促进植入/移植细胞成熟为中脑DA细胞的生长因子。
在某些实施方式中，向受试者施用的组合物包含约1×104至约1×1010、约1×104至约1×105、约1×105至约1×109、约1×105至约1×106、约1×105至约1×107、约1×106至约1×107、约1×106至约1×108、约1×107至约1×108、约1×108至约1×109、约1×108至约1×1010、或约1×109至约1×1010细胞的细胞群体。在某些实施方式中，向受试者施用约1×105至约1×107个其细胞。
在某些实施方式中，所述组合物是冷冻的。在某些实施方式中，所述组合物还包含至少一种冷冻保护剂，例如但不限于二甲基亚砜(DMSO)、甘油、聚乙二醇、蔗糖、海藻糖、右旋糖、或其组合。
在某些实施方式中，组合物还包含生物相容性支架或基质，例如，当细胞被植入或移植到受试者时促进组织再生的生物相容性三维支架。在某些实施方式中，生物相容性支架包括细胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、胶原蛋白、多肽或蛋白质、多糖，包括纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、角蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、透明质酸、硫酸肝素、硫酸软骨素、琼脂糖或明胶、和/或水凝胶(参见例如美国公开第2015/0159135、2011/0296542、2009/0123433和2008/0268019号，将其中每一个的全部内容并入以供参考)。
在某些实施方式中，组合物是包含药学上可接受载体的药物组合物。组合物可用于预防和/或治疗神经退行性疾病，包括帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默症和多发性硬化症。
本公开主题还提供一种包含分化细胞的装置或包含分化细胞的组合物，如本文所公开。装置的非限制性实例包括注射器、细玻璃管、立体定向针和套管。
5.4.预防、建模和/或治疗神经障碍的方法
本文公开的细胞群体和组合物(例如，第5.3节中公开的那些)可用于预防、建模和/或治疗患有神经障碍的受试者中的至少一种症状。本公开的主题提供预防、建模和/或治疗患有神经障碍的受试者中的至少一种症状的方法。在某些实施方式中，该方法包括将有效量的本公开的干细胞衍生的mDA神经元或包含其的组合物施用到患有神经障碍的受试者中。在某些实施方式中，组合物是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
在某些实施方式中，神经障碍的特征在于中脑多巴胺神经元功能的降低。中脑多巴胺神经元功能的降低可以与年龄有关。
在某些实施方式中，神经障碍的症状选自颤抖、运动迟缓、弯曲姿势、姿势不稳、僵硬、吞咽困难和痴呆。
神经障碍的非限制性实例包括帕金森综合征、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病和多发性硬化症。在某些实施方式中，神经障碍是帕金森综合征或帕金森病。
在某些实施方式中，神经障碍是帕金森病。帕金森病的主要运动症状包括但不限于手、臂、腿、下巴和脸的震颤、运动迟缓或缓慢、四肢和躯干僵硬或酸痛、姿势不稳或平衡与协调受损。
在某些实施方式中，神经障碍是帕金森综合征病，其指与基底神经节多巴胺不足相关的疾病，基底神经节是大脑控制运动的一部分。症状包括震颤、运动迟缓(运动极度缓慢)、弯曲姿势、姿势不稳和僵硬。帕金森综合征病的非限制性实例包括皮质基底节变性、路易体痴呆、多系统性萎缩、和进行性核上性麻痹。
可以系统地或直接地向受试者施用或提供细胞或组合物以预防、建模、和/或治疗神经障碍。在某些实施方式中，将细胞或组合物直接注射到目标器官(例如，中枢神经系统(CNS))。在某些实施方式中，将细胞或组合物直接注入纹状体。
细胞或组合物可在任何生理上可接受的载体(vehicle)中施用。细胞或组合物可通过局部注射、原位(OT)注射、全身注射、静脉注射或肠外给药进行施用。在某些实施方式中，通过原位(OT)注射将细胞或组合物施用于患有神经退行性疾病的受试者。
细胞或组合物可方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘性组合物，其可缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物更便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可为包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，及其适当混合物。根据需要，可通过将本公开主题的组合物(例如，包含本公开的干细胞衍生前体的组合物)加入所需量的含有不同量其他成分的适当溶剂来制备无菌可注射溶液。此类组合物可与合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以冻干。组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、凝胶或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，具体取决于给药途径和所需制剂。可参考标准文本，如1985年第17版“REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCE”(将其并入本文以供参考)，以制备合适的制剂，而无需过度实验。
可以添加增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)确保对微生物作用的预防。可注射药物形式的延长吸收可通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸明矾和明胶)来实现。
如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定水平。可以使用甲基纤维素，因为它容易获得且经济，并且易于使用。其他合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度取决于所选的药剂。重要的一点是，使用能达到选定粘度的量。合适载体和其他添加剂的选择将取决于具体的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，组合物是否将被配制成溶液、悬浮液、凝胶或其他液体形式，例如时间释放形式或充液形式)。
本领域技术人员将认识到，组合物的组分应选择为化学惰性，且不会影响本公开的干细胞衍生前体的生活力或功效。这不会给化学和药学原理方面的技术人员带来任何问题，或者可以通过参考标准文本或通过简单实验(不涉及过度实验)从本公开和本文引用的文件中轻松避免问题。
关于细胞治疗用途的一个考虑因素是达到最佳效果所需的细胞数量。最佳效果包括但不限于患有神经退行性疾病的受试者的CNS区的再增殖，和/或受试者的CNS功能的改善。
“有效量”(或“治疗有效量”)是指足以影响治疗后有益或预期临床结果的量。有效量可以一次或多次剂量施用于受试者。就治疗而言，有效量是指足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓神经退行性疾病的进展，或以其他方式减少神经退行性疾病的病理后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的技能范围内。在确定达到有效量的适当剂量时，通常会考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用细胞的形式和有效浓度。
在某些实施方式中，细胞的有效量是足以再增殖患有神经退行性疾病的受试者的CNS区的量。在某些实施方式中，细胞的有效量是足以改善患有神经退行性疾病的受试者的CNS的功能的量，例如，所述改善的功能可以是正常人CNS功能的约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、或约100％。
待施用的细胞的量因所治疗的受试者而异。在某些实施方式中，向受试者施用约1×104至约1×1010、约1×104至约1×105、约1×105至约1×109、约1×105至约1×106、约1×105至约1×107、约1×106至约1×107、约1×106至约1×108、约1×107至约1×108、约1×108至约1×109、约1×108至约1×1010、或约1×109至约1×1010个细胞。在某些实施方式中，将约1×105至约1×107个细胞施用于患有神经障碍的受试者。在某些实施方式中，将约1×106至约1×107个细胞施用于患有神经障碍的受试者。在某些实施方式中，将约1×106至约4×106个细胞施用于患有神经障碍的受试者。有效剂量的精确确定可基于每个受试者的个体因素，包括他们的大小、年龄、性别、体重和特定受试者的状况。本领域技术人员可以根据本公开和本领域知识轻松确定剂量。
5.5.试剂盒
本公开的主题提供用于诱导干细胞分化为mDA神经元或其前体的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含(a)至少一种SMAD信号传导的抑制剂，(b)至少一种Wnt信号传导的激活剂，(c)至少一种SHH信号传导的激活剂，(d)至少一种FGF信号传导的激活剂，以及(e)至少一种Wnt信号传导的抑制剂。在某些实施方式中，试剂盒还包含(f)用于将干细胞诱导分化为表达至少一种指示mDA神经元或其前体的标志物的分化细胞群体的说明。
在某些实施方式中，说明包括将干细胞与抑制剂(一种或多种)、和激活剂(一种或多种)以特定顺序接触。通过用于培养干细胞的细胞培养基可确定接触抑制剂和激活剂的顺序。
在某些实施方式中，说明包括如本公开的方法所述(参见第5.2节)，将干细胞与抑制剂和激活剂接触。
在某些实施方式中，本公开提供包含有效量的单位剂型的本文公开的细胞群体或组合物的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含含有治疗组合物的无菌容器；这些容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、包、袋、泡罩包装、或本领域已知的其他合适的容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合盛放药物的材料制成。
在某些实施方式中，试剂盒包含用于向患有神经障碍的受试者施用细胞群体或组合物的说明。说明可以包括关于使用细胞或组合物预防、建模、和/或治疗神经障碍的信息。在某些实施方式中，说明包括以下至少一项：治疗剂的描述；用于预防、建模、和/或治疗患有神经障碍或其症状的患者中至少一种症状的剂量表和给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考资料。说明可以直接打印在容器上(如果有)，或作为标签应用于容器，或作为单独的纸张、小册子、卡片或纸夹提供在容器中或随容器提供。
实施例
通过参考下文实施例将更好地理解本公开主题，实施例作为本公开主题的示例提供，而并非作为限制。
实施例1：示例性中脑DA神经元分化方案
以下是根据某些实施方式的本公开方法的示例性方案。
第0天：来自hPSC/hiPSC的细胞用Accutase喂养为单细胞，并将其以400,000个细胞/cm2的密度在置于含有Y药物的培养基1中的涂覆Geltrex上铺板。
第1天-第2天：细胞应达到100％汇合。用培养基1对细胞进行双重喂养。
第3天：用培养基1喂养细胞。
第4天：用培养基2喂养细胞。对于CHIR-Boost方案，对于WA-09 hESC细胞系介导的分化，CHIR浓度从1μM至6μM改变(这可能因hPSC/hiPSC细胞系而变化)。
第5天-第6天：用培养基2对细胞进行双重喂养。
第7天：用培养基3喂养细胞。
第8天-第9天：每天用培养基3喂养细胞。
第10天：用培养基4喂养细胞。
第11天：在37℃，将细胞用Accutase孵育30分钟；将细胞以密度为800,000个细胞/cm2在培养基4中铺板。
第12天：细胞应达到100％汇合。用培养基5喂养细胞。
第12-16天：每天用培养基5喂养细胞；在第16天，通过FACS分析测量，超过90％的细胞是FOXA2+/EN+。
第16天-第100天：每天用培养基6喂养细胞。
培养基1组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10μM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C5II和1μM CHIR。
培养基2组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10mM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C5II和6μM CHIR。
培养基3组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺和6μM CHIR。
培养基4组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、3μM CHIR、20ng/ml BDNF、0.2μM抗坏血酸(AA)、20ng/ml GSNF、0.5mM dcAMP和1ng/ml TGF-β3。
培养基5组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、3μM CHIR、20ng/ml BDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3、1μM IWP2和100ng/ml FGF18。
培养基6组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3和10nM DAPT。
本实施例中描述的方案在实施例3中称为“Wnt-boost+FGF18(第12天-第16天)+IWP2(第12天-第16天)”。
实施例2：示例性中脑DA神经元分化方案
以下是根据某些实施方式的本公开方法的示例性方案。
第0天：来自hPSC/hiPSC的细胞用Accutase喂养为单细胞，并将其以400,000个细胞/cm2的密度在置于含有Y药物的培养基1中的涂覆Geltrex上铺板。
第1天-第2天：细胞应达到100％汇合。用培养基1对细胞进行双重喂养。
第3天：用培养基1喂养细胞。
第4天：用培养基2喂养细胞。对于CHIR-Boost方案，对于WA-09 hESC细胞系介导的分化，CHIR浓度从1μM至6μM改变(这可能因hPSC/hiPSC细胞系而变化)。
第5天-第6天：用培养基2对细胞进行双重喂养。
第7天：用培养基3喂养细胞。
第8天-第9天：每天用培养基3喂养细胞。
第10天：用培养基4喂养细胞。
第11天：在37℃，将细胞用Accutase孵育30分钟；将细胞以密度为800,000个细胞/cm2在培养基4中铺板。
第12天：细胞应达到100％汇合。用培养基5喂养细胞。
第12-16天：每天用培养基5喂养细胞；在第16天，通过FACS分析测量，超过90％的细胞是FOXA2+/EN+。
第16天-第100天：每天用培养基6喂养细胞。
培养基1组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10μM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和1μM CHIR。
培养基2组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10mM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和6μM CHIR。
培养基3组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺和6μM CHIR。
培养基4组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、1μM IWP2、20ng/ml BDNF、0.2μM抗坏血酸(AA)、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP和1ng/ml TGF-β3。
培养基5组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3、1μM IWP2和100ng/mlFGF18。
培养基6组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3和DAPT(10nM)。
本实施例中描述的方案在实施例3中称为“Wnt-boost+FGF18(第12天-第16天)+IWP2(第10天-第16天)”。
实施例3：mDA神经元分化期间的Wnt抑制剂处理
不同的WNT信号传导基因与多巴胺神经元亚型有关。醛脱氢酶1家族成员A1(ALDH1A1)是小鼠和人mDA神经元发育过程中hDA2亚型(A9型)的标志物(La Manno等人，Cell 167,566-580e519(2016)；Toledo等人，Br J Pharmacol 174(24),4716-4724(2017))。ALDH1A1属于蛋白质的醛脱氢酶家族，是醇代谢主要氧化通路的第二种酶。
hPSC和hiPSC用于分化方法。首先，评估了Wnt信号传导对不同方案分化的mDA细胞中ALDH1A1诱导的影响。在使用Wnt-boost、Wnt-boost+IWP2(第10天-第16天)和Wnt-boost+IWP2(第12天-第16天)方案(使用或不使用FGF18(第12-16天))产生的第16天分化的mDA细胞中，评估FOXA2、LMX1A、EN1、WNT1、OTX2、ALDH1A1和PAX6的mRNA表达水平(图1)。
实施例1中描述了“Wnt-boost+FGF18(第12-16天)+IWP2(第12天-第16天)”方案。
实施例2中描述了“Wnt-boost+FGF18(第12-16天)+IWP2(第10天-第16天)”方案。
本实施例中提到的“Wnt-boost”方案提供如下。
第0天：来自hPSC/hiPSC的细胞用Accutase喂养为单细胞，并将其以400,000个细胞/cm2的密度在置于含有Y药物的培养基1中的涂覆Geltrex上铺板。
第1天-第2天：细胞应达到100％汇合。用培养基1对细胞进行双重喂养。
第3天：用培养基1喂养细胞。
第4天：用培养基2喂养细胞。对于CHIR-Boost方案，对于WA-09 hESC细胞系介导的分化，CHIR浓度从1μM至6μM改变(这可能因hPSC/hiPSC细胞系而变化)。
第5天-第6天：用培养基2对细胞进行双重喂养。
第7天：用培养基3喂养细胞。
第8天-第9天：每天用培养基3喂养细胞。
第10天：用培养基4喂养细胞。
第11天：在37℃，将细胞用Accutase孵育30分钟；将细胞以密度为800,000个细胞/cm2在培养基4中铺板。
第12天：细胞应达到100％汇合。用培养基5喂养细胞。
第12-16天：每天用培养基5喂养细胞；在第16天，通过FACS分析测量，超过90％的细胞是FOXA2+。
第16天-第100天：每天用培养基6喂养细胞。
培养基1组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10μM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和1μM CHIR。
培养基2组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10mM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和6μM CHIR。
培养基3组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺和6μM CHIR。
培养基4组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、3μM CHIR、20ng/ml BDNF、0.2μM抗坏血酸(AA)、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP和1ng/ml TGF-β3。
培养基5组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3。
培养基6组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3和10nM DAPT。
未检测到SMA mRNA表达水平。Wnt-boost方案与FGF18和IWP2组合产生了最佳A/P和D/V图案化前体，其中大于90％的细胞为FOXA2/EN1双阳性(图2A)。图2A显示使用不同方案的第16天分化的mDA前体的FACS分析。图2B显示使用不同方案的第16天分化的mDA的免疫染色图像。此外，在使用Wnt-boost、Wnt-boost+IWP2(第12-16天)方案(使用或不使用FGF18)产生的分化mDA细胞中，在第16天评估FOXA2、LMX1A、OTX2、EN1、ALDH1A1、BARHL2、BARHL1、PAX6、ALDH2和WNT1的mRNA表达水平(图3)。测定了IWP2对分化细胞中标志物基因表达的影响。如图4所示，使用Wnt-boost方案(在第12天至第16天添加或不添加FGF18和/或IWP2)的第40天分化细胞中，评估FOXA2、LMX1A、OTX2、EN1、ALDH1A1、PAX6和PITX3的mRNA表达水平。本公开在第16天观察到存在非常高的四极阳性细胞(FOXA2/LMX1A，OTX2/EN1)。此外，EN1的高表达由FGF18驱动。此外，通过添加IWP2和FGF18，ALDH1A1、WNT1、PITX3、DAT、DDC、VMTA2的表达增加，而IWP2降低Ki67、SMA和SIX1的表达。收集第60天分化细胞的免疫染色图像，显示FOXA2、TH和MAP2(图14A)，以及EN1和TH(图14B)的表达。
对使用Wnt-boost方案(添加或不添加FGF18和IWP2)的第25天分化细胞进行FACS介导的分选(图5)。根据CD49e和CD184蛋白标志物的表达对分化的mDA细胞进行分选。分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的形态如图6所示。在分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞中评估FOXA2、LMX1A、EN1、NURR1、ALDH1A1、PITX3、DAT、VMAT2、CALB1、CALB2、PITX2、BARHL1、SIM1、PHOX2A、POU4F1的mRNA表达水平，并分析CD49弱/CD184强细胞(图7和8)。收集分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的免疫染色图像，显示FOXA2、TH和MAP2(图9A)以及ALDHA1A1、EN1和TH(图9B-9C)的表达。此外，收集分选的第60天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的免疫染色图像，显示TH和EN1(图17)以及ALDHA1A1、EN1和TH(图18)的表达。
接下来，使用“Wnt-boost”方案或“Wnt-boost+FGF18(第12-16天)+IWP2(第12天-第16天)”方案分化细胞，并将其移植到小鼠中。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色。评估hNCAM、TH、ALDH1A1、FOXA2、SC121、EN1、Ki67的表达(图10A、10B和24)。此外，移植后两个月，对移植细胞进行免疫染色。测定SC121、TH、Nurr1、ALDH1A1和SOX6的表达水平(图11A-11C)。
实施例4：优化WNT抑制
本实施例设计旨在优化WNT处理的时间窗口和浓度，并测试非经典信号传导的重新激活对于mDA神经元分化或成熟的最优水平是否是必需的。初步数据(未显示)表明，单独抑制经典信号传导(例如，通过使用经典信号传导的选择性抑制剂(例如，XAV939；稳定AXIN的端锚聚合酶抑制剂))可能不足以获得与IWP2处理相当的结果。IWP2抑制非经典信号传导和经典信号传导。通过qRT-PCR和免疫细胞化学(ICC)定量PITX3、DAT和VMAT2的表达。已证实IWP2(或其他候选WNT抑制剂)不会对EN1的表达或污染标志物(SIX1和SMA)的出现产生负面影响。优化条件在包括雄性和雌性系的hPSC细胞系(3个hESC和3个iPSC系；≥每个3个独立的分化)(Zimmer等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 115,E8775-E8782(2018))之间得到验证。
实施例5：生成的mDA神经元的体外详细分子和功能评估
验证了由本公开的分化方法生成的mDA神经元特性。该验证包括i)通过ICC和原位表达对标志物表达(包括ALDH1A1和PITX3)的深入时间表征；ii)分析时程批量RNAseq(第0天、第11天、第16天、第25天、第40天、第60天)；iii)使用为优化临床级mDA神经元分化而开发的一组42阵列qRT-PCR标志物，以评估本公开的分化方法是否匹配或超过先前建立的临床级mDA神经元的QC(“释放标准”)；iv)如前所述(Kriks等人，Nature 480,547-551(2011))，在分化第30、50和70天通过HPLC(电化学检测)测量DA释放来评估mDA神经元的生化成熟度；和v)通过体外电生理研究确定成熟度水平(例如静息膜电位、输入电阻)的差异，以及mDA神经元特异性参数(包括自主起搏或Sag电流的存在)的差异。预期通过本公开的分化方法开发的mDA神经元中释放的KCL诱发的DA比现有方法更早发生，并且在每个细胞的基础上处于更高水平。使用高密度微电极阵列系统(MEA)验证自发体外网络活动的出现。
实施例6：生成的mDA神经元的体内功能评估
为了评估体内存活率和功能，在第16天移植细胞。在开始功能研究之前(n＝5/组)，在未受损NSG小鼠的纹状体中进行短期移植(1个月)，以确认每个处理组的强大的短期存活率。对于功能研究，在6OHDA损伤的大鼠宿主(nu/nu大鼠)中进行6个月的移植研究。各组为i)生理盐水对照，ii)Wnt-Boost，iii)Wnt-Boost+FGF18，iv)Wnt-Boost+FGF18/IWP2(n＝10/组)。如前所述(Kriks等人，Nature 480,547-551(2011))，在移植前对大鼠进行靶向内侧前脑束(MFB)的单侧6OHDA损伤。仅包括旋转行为稳定的动物(>6转/分钟；每周间隔2次连续测试)。除了苯丙胺诱导的旋转(每月一次)外，还监测了几种非药物诱导的测定，包括步进和圆筒测试(Kriks等人，Nature 480,547-551(2011))(移植前以及移植后3个月和6个月)。如前所述(Kriks等人，Nature 480,547-551(2011))，通过立体定向手术和将200x103细胞(2μl体积)注射到宿主纹状体中进行移植。预计所有条件都会触发苯丙胺诱导行为的显著恢复(与生理盐水对照相比)，而FGF18和FGF18/IWP2方案会触发更快速的恢复，并可能在后期时间点显示出旋转试验中的过度补偿(负分数)。此外，由本公开的分化方法产生的mDA神经元的移植物在步进和圆筒测试中显增强的恢复，这通常比苯丙胺旋转更难恢复。
实施例7：组织学分析
进行组织学分析以确定是否存在以下差异：i)存活的mDA神经元总数(移植物中TH+细胞的体视学计数)；ii)通过与人核抗原(hNA)共表达确认的TH+细胞的人特性；iii)mDA神经元特性、亚型和生化成熟的标志物(TH/EN1/FOXA2、TH/DAT/VMAT2、TH/GIRK2/CALB)；iv)纤维生长物的程度(TH/hNCAM和/或TH/SC121对纹状体神经移植的百分比)；v)非多巴胺神经元(GABA、血清素、谷氨酸)11的百分比和vi)胶质细胞(GFAP、Olig2)和其他增殖(Ki67)细胞的百分比。
实施例8：mDA神经元分化期间的Wnt抑制剂处理
本实施例显示实施例3的更新实验。在使用Wnt-boost、Wnt-boost+IWP2(第12天-第16天)方案(使用或不使用FGF18)产生的分化mDA细胞中，在第16天评估FOXA2、LMX1A、OTX2、EN1、ALDH1A1、WNT1、BARHL1、PAX6、OTX2和NKX2-2的mRNA表达水平。本公开发现，在WntBoost和Wnt Boost+FGF18条件下，IWP2暴露导致第16天ALDH1A1增加以及内源性WNT1高表达。此外，IWP2暴露降低了PAX6和NKX2-2的表达(图12)。在第40天分化的细胞中观察到类似的变化(图13)。使用Wnt-boost方案(第12天至第16天添加或不添加FGF18和/或IWP2)产生的第60天分化细胞的免疫染色证实，FGF18与IWP2暴露维持FOXA2和TH表达的高比例(图14A)，并增加细胞中EN1和TH的表达(图14B)。
对使用Wnt-boost方案(添加或不添加FGF18和IWP2)的第25天分化细胞进行FACS介导的分选。根据CD49e和CD184蛋白标志物的表达对分化的mDA细胞进行分选。在分选的第40天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中评估FOXA2、LMX1A、EN1、NURR1、ALDH1A1、PITX3、DAT、VMAT2、CALB1、PITX2、BARHL1、SIM1和PHOX2A的mRNA表达水平(图15和16)。分选的第60天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞的免疫染色图像显示ALDH1A1、EN1和TH的表达(图17和18)。
实施例9：Wnt抑制剂暴露增加
测试Wnt抑制剂暴露的增加。从第12天至第25天暴露于Wnt抑制剂的示例性中脑DA神经元分化方案如下：
第0天：来自hPSC/hiPSC的细胞用Accutase喂养为单细胞，并将其以400,000个细胞/cm2的密度在置于含有Y药物的培养基1中的涂覆Geltrex上铺板。
第1天-第2天：细胞应达到100％汇合。用培养基1对细胞进行双重喂养。
第3天：用培养基1喂养细胞。
第4天：用培养基2喂养细胞。对于CHIR-Boost方案，对于WA-09 hESC细胞系介导的分化，CHIR浓度从1μM至6μM改变(这可能因hPSC/hiPSC细胞系而变化)。
第5天-第6天：用培养基2对细胞进行双重喂养。
第7天：用培养基3喂养细胞。
第8天-第9天：每天用培养基3喂养细胞。
第10天：用培养基4喂养细胞。
第11天：在37℃，将细胞用Accutase孵育30分钟；将细胞以密度为800,000个细胞/cm2在培养基4中铺板。
第12天：细胞应达到100％汇合。用培养基5喂养细胞。
第12-16天：每天用培养基5喂养细胞；在第16天，通过FACS分析测量，超过90％的细胞是FOXA2+/EN+。
第16天-第25天：每天用培养基6喂养细胞。
第25天-第100天：每天用培养基7喂养细胞。
培养基1组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10μM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和1μM CHIR。
培养基2组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10mM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和6μM CHIR。
培养基3组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺和6μM CHIR。
培养基4组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、1μM IWP2、20ng/ml BDNF、0.2μM抗坏血酸(AA)、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP和1ng/ml TGF-β3。
培养基5组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3、1μM IWP2和100ng/mlFGF18。
培养基6组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3、1μM IWP2和DAPT(10nM)。
培养基7组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3和DAPT(10nM)。
从第12天至第30天暴露于Wnt抑制剂的示例性中脑DA神经元分化方案如下：
第0天：来自hPSC/hiPSC的细胞用Accutase喂养为单细胞，并将其以400,000个细胞/cm2的密度在置于含有Y药物的培养基1中的涂覆Geltrex上铺板。
第1天-第2天：细胞应达到100％汇合。用培养基1对细胞进行双重喂养。
第3天：用培养基1喂养细胞。
第4天：用培养基2喂养细胞。对于CHIR-Boost方案，对于WA-09 hESC细胞系介导的分化，CHIR浓度从1μM至6μM改变(这可能因hPSC/hiPSC细胞系而变化)。
第5天-第6天：用培养基2对细胞进行双重喂养。
第7天：用培养基3喂养细胞。
第8天-第9天：每天用培养基3喂养细胞。
第10天：用培养基4喂养细胞。
第11天：在37℃，将细胞用Accutase孵育30分钟；将细胞以密度为800,000个细胞/cm2在培养基4中铺板。
第12天：细胞应达到100％汇合。用培养基5喂养细胞。
第12-16天：每天用培养基5喂养细胞；在第16天，通过FACS分析测量，超过90％的细胞是FOXA2+/EN+。
第16天-第30天：每天用培养基6喂养细胞。
第30天-第100天：每天用培养基7喂养细胞。
培养基1组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10μM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和1μM CHIR。
培养基2组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、10mM SB、250nM LDN、500ng/ml SHH C25II和6μM CHIR。
培养基3组成：神经基础培养基、N2补充物、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺和6μM CHIR。
培养基4组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、1μM IWP2、20ng/ml BDNF、0.2μM抗坏血酸(AA)、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP和1ng/ml TGF-β3。
培养基5组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3、1μM IWP2和100ng/mlFGF18。
培养基6组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3、1μM IWP2和DAPT(10nM)。
培养基7组成：神经基础培养基、B27补充物、Pen/Strep、L-谷氨酰胺、20ng/mlBDNF、0.2μM AA、20ng/ml GDNF、0.5mM dcAMP、1ng/ml TGF-β3和DAPT(10nM)。
本公开发现，持续暴露于IWP2直到第30天进一步诱导ALDH1A1的表达(图19)。图20显示Wnt-boost方案(从第12天至第25天或从第12天至第16天添加或不添加IWP2，或从第12天至第16天添加或不添加FGF18)产生的第25天分化细胞的FACS介导的分选策略。测量分选的第28天分化的CD49弱/CD184弱细胞和CD49弱/CD184强细胞中标志物基因的mRNA表达(图21和22)。与图19的结果一致，从第12天至第25天暴露于IWP2进一步诱导了ALDH1A1的表达。这一结果使用免疫荧光染色得到证实(图23)。
实施例10：分化细胞的体内移植
重复实施例3的体内移植实验。根据Wnt boost与IWP2和FGF18方案产生的分化细胞具有许多移植优势，例如改善纹状体神经支配、维持EN1表达、增加A9型ALDH1A1+细胞以及减少增殖细胞(Ki67+细胞)的数量(图24和25)。
移植后4个月，根据Wnt boost与IWP2和FGF18方案产生的移植细胞具有A9型DA神经元外显投射，几乎只覆盖整个纹状体区域(图27)。
接下来，将分选的CD49弱/CD184强细胞移植到小鼠中。在Wnt-boost或Wnt-boost+FGF18/IWP2(第12天-第16天)方案下，在体外分化的第25天对细胞进行分选。移植后一个月对移植细胞进行免疫染色。移植的细胞显示良好的存活率，并且在两种条件下均具有表达TH和FOXA2的同质DA群体(图28)。使用RNA原位分析，在Wnt Boost(有/无IWP2和FGF18(第12天-第16天))下的体外分化细胞中也测量了PITX3的表达(图29)。
实施例11：分化细胞的体内移植
检查已冷冻(现成细胞源)的分化细胞的移植，以测试由本公开的方案产生的细胞的临床相关性。移植两个冷冻批次细胞，并在移植后1个月通过TH和HNA进行免疫染色和评估(图26)。通过在两个不同批次中表达mDA标志物如TH和FOXA2，移植细胞显示优异的移植存活率，这表明本公开的方法具有临床相关性(图26)。
尽管已经详细描述了本公开的主题及其优点，但是应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以在本文中进行各种改变、替换和修改。此外，本申请的范围旨在不限于说明书中描述的工艺、机器、制造、和物质组成、手段、方法和步骤的特定实施方式。本领域的普通技术人员将容易从本公开的主题的公开中了解到，根据本公开的主题，可以利用(本存在的或之后要开发的与本文描述的相应实施方式执行基本相同的功能或实现基本相同的结果的)工艺、机器、制造、物质组成、手段、方法、或步骤。因此，所附权利要求旨在在其范围内包括这些工艺、机器、制造、物质组成、手段、方法或步骤。
在本申请中引用了各种专利、专利申请、出版物、产品描述、方案和序列登录号，出于所有目的，本公开将其全部内容并入本文以供参考。

Claims (82)

1.一种用于诱导干细胞分化的体外方法，其包括：
使所述干细胞与至少一种Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)信号传导的抑制剂、至少一种音猬因子(SHH)信号传导的激活剂和至少一种wingless(Wnt)信号传导的激活剂接触；和
使所述细胞与至少一种成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的激活剂和至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触，以获得表达至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物的分化细胞的群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从所述干细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天开始。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从所述干细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起不晚于约15天开始。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从所述干细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起约10天开始。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂的接触是从所述干细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起10天、11天、12天或13天开始。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触至少约1天。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触至多约30天、或至多约25天。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触约5天、约15天或约20天。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂接触4天、5天、6天、7天、14天、15天、19天或20天。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从所述细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起至少约5天或至少约10天开始。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从所述细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起不晚于约20天或不晚于18天开始。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从所述细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起约10天开始。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种FGF信号传导的激活剂的接触是从所述细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起10天、11天、12天或13天开始。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种FGF信号传导的激活剂接触至少约1天和/或至多约20天；至少约3天和/或至多约10天；或至少4天和/或至多7天。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种FGF信号传导的激活剂接触约5天。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种FGF信号传导的激活剂接触4天、5天、6天或7天。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂接触约5天。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂接触6天或7天。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种SHH信号传导的激活剂接触约5天。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种SHH信号传导的激活剂接触6天或7天。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的激活剂接触约15天。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种Wnt信号传导的激活剂接触16天或17天。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度从其与所述干细胞的初始接触起增加约4天。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度从所述至少一种Wnt信号传导的激活剂的初始浓度增加约200％至约1000％。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度从所述至少一种Wnt信号传导的激活剂的初始浓度增加约500％。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约1μM至约5μM和约10μM之间。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂的浓度增加至约6μM的浓度。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂能够抑制非经典Wnt信号传导和经典Wnt信号传导。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂选自IWP2、IWR1-endo、XAV939、IWP-O1、Wnt-C59、IWP-L6、和ICG-001、及其组合。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的抑制剂包括IWP2。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述至少一种FGF信号传导的激活剂选自FGF18、FGF17、FGF8a、FGF8b、FGF4、FGF2、及其组合。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述至少一种FGF信号传导的激活剂能够引起中脑的扩增并上调中脑基因表达。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述至少一种FGF信号传导的激活剂选自FGF18、FGF17、FGF8a、FGF4、FGF2、及其组合。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述至少一种FGF信号传导的激活剂包括FGF18。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂包括TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂、骨形态发生蛋白(BMP)信号传导的抑制剂、或其组合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂包括ALK5的抑制剂。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述至少一种TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂选自SB431542、SB431542的衍生物、及其组合。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述SB431542的衍生物包括A83-01。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述至少一种TGFβ/激活素-Nodal信号传导的抑制剂包括SB431542。
40.根据权利要求35所述的方法，其中所述至少一种BMP信号传导的抑制剂选自LDN193189、Noggin、多索吗啡、LDN193189的衍生物、Noggin的衍生物、多索吗啡的衍生物、及其组合。
41.根据权利要求35或40所述的方法，其中所述至少一种BMP的抑制剂包括LDN-193189。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂包括糖原合酶激酶3β(GSK3β)信号传导的抑制剂。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂选自CHIR99021、CHIR98014、AMBMP盐酸盐、LP 922056、锂、脱氧胆酸、BIO、SB-216763、Wnt3A、Wnt1、Wnt5a、其衍生物、及其组合。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述至少一种Wnt信号传导的激活剂包括CHIR99021。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述至少一种SHH信号传导的激活剂选自SHH蛋白、平滑激动剂(SAG)、及其组合。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述SHH蛋白选自重组SHH、修饰的N-端SHH、及其组合。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述修饰的N-端SHH在N-端包含两个异亮氨酸。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述修饰的N-端SHH与未修饰的N-端SHH具有至少约90％的序列同一性。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述未修饰的N-端SHH是未修饰的小鼠N-端SHH或未修饰的人N-端SHH。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述修饰的N-端SHH包括SHHC25II。
51.根据权利要求45所述的方法，其中所述SAG包括嘌吗啡胺。
52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中从所述干细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起约15天，至少约80％的所述分化细胞表达FOXA2和EN1。
53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中从所述干细胞与所述至少一种SMAD信号传导的抑制剂的初始接触起16天，大于约80％或大于约90％的所述分化细胞表达FOXA2和EN1。
54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物选自EN1、OTX2、TH、NURR1、FOXA2、PITX3、LMX1A、LMO3、SNCA、ADCAP1、CHRNA4、SOX6、DAT、VMAT2、WNT1、GIRK2、及其组合。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中所述分化细胞不表达选自以下的至少一种标志物：PAX6、EMX2、LHX2、SMA、SIX1、PITX2、SIM1、POU4F1、PHOX2A、BARHL1、BARHL2、GBX2、HOXA1、HOXA2、HOXB1、HOXB2、POU5F1、NANOG、及其组合。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其还包括分离表达至少一种阳性表面标志物且不表达至少一种阴性表面标志物的细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述至少一种阳性表面标志物选自CD171、CD184、及其组合。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述至少一种阳性表面标志物包括CD184。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中所述至少一种阴性表面标志物选自CD49e、CD99、CD340、及其组合。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的方法，其中所述至少一种阴性表面标志物包括CD49e。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的方法，其包括分选表达CD184且不表达CD49e的细胞。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述干细胞是多能干细胞。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述干细胞选自非胚胎干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、及其组合。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中所述干细胞是人干细胞、非人灵长类干细胞、或啮齿动物干细胞。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述干细胞是人干细胞。
66.一种体外分化细胞的细胞群体，其中所述体外分化细胞通过权利要求1-65中任一项所述的方法获得。
67.一种组合物，其包含权利要求66所述的细胞群体。
68.根据权利要求67所述的组合物，其是还包含药学上可接受的载体的药物组合物。
69.一种用于诱导干细胞分化为中脑多巴胺神经元或其前体的试剂盒，其包括：
(a)至少一种SMAD信号传导的抑制剂；
(b)至少一种SHH信号传导的激活剂；
(c)至少一种Wnt信号传导的激活剂；
(d)至少一种Wnt信号传导的抑制剂；和
(e)至少一种FGF信号传导的激活剂。
70.根据权利要求69所述的试剂盒，其还包括(f)用于将所述干细胞诱导分化为表达至少一种指示中脑多巴胺神经元或其前体的标志物的分化细胞的群体的说明。
71.一种用于预防、建模、和/或治疗患有神经障碍的受试者中的至少一种症状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的以下之一：
(a)权利要求66所述的细胞群体；或
(b)权利要求67或68所述的组合物。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述神经障碍的特征在于中脑多巴胺神经元功能的降低。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述中脑多巴胺神经元功能的降低与年龄相关。
74.根据权利要求71-73中任一项所述的方法，其中所述神经障碍选自帕金森综合征、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、及其组合。
75.根据权利要求71-74中任一项所述的方法，其中所述神经障碍选自帕金森综合征、帕金森病、及其组合。
76.根据权利要求71-75中任一项所述的方法，其中所述神经障碍的症状选自颤抖、运动迟缓、弯曲姿势、姿势不稳、僵硬、吞咽困难和痴呆。
77.权利要求66所述的细胞群体或权利要求67或68所述的组合物，其用于在预防、建模和/或治疗患有神经障碍的受试者中的至少一种症状中的用途。
78.根据权利要求77所述用途的细胞群体或组合物，其中所述神经障碍的特征在于中脑多巴胺神经元功能的降低。
79.根据权利要求78所述用途的细胞群体或组合物，其中所述中脑多巴胺神经元功能的降低与年龄相关。
80.根据权利要求77-79中任一项所述用途的细胞群体或组合物，其中所述神经障碍选自帕金森综合征、帕金森病、亨廷顿病、阿尔茨海默病、多发性硬化症、及其组合。
81.根据权利要求77-80中任一项所述用途的细胞群体或组合物，其中所述神经障碍选自帕金森综合征、帕金森病、及其组合。
82.根据权利要求77-81中任一项所述用途的细胞群体或组合物，其中所述神经障碍的症状选自颤抖、运动迟缓、弯曲姿势、姿势不稳、僵硬、吞咽困难和痴呆。
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