JPS61119192A - 高等真核生物細胞における非ｂＧＨポリペプチドの発現用の組換えＤＮＡ分子 - Google Patents

高等真核生物細胞における非ｂＧＨポリペプチドの発現用の組換えＤＮＡ分子

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JPS61119192A JP60186518A JP18651885A JPS61119192A JP S61119192 A JPS61119192 A JP S61119192A JP 60186518 A JP60186518 A JP 60186518A JP 18651885 A JP18651885 A JP 18651885A JP S61119192 A JPS61119192 A JP S61119192A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、高等真核生物細胞における非１）Ｇｌｌポリ
ペプチドの発現におけるｂＧｌ１ｇＤＮＡポリアゾニレ
−ジョン・シグナルの使用に関する。さらに詳しくは１
本発明は新規組換型Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｒυＮＡ）化合物お
よび、これらの新規化合物を細胞および細胞系の発現遺
伝物質に取り込ませる方法を提供するもので、これによ
り、新規細胞および細胞系が生産され、さらに、本発明
のもう１つの要素を構成する。特に、本発明は、予め選
択したポ　　　　　１゛す・ペプチド発現のための、高
等真核生物細胞の発現遺伝物質への組換型ＤＮＡ化合物
の取り込みに関する。
発明の背景 組換型ＤＮＡ化合物の合成方法はよく知られている。さ
らに、これらの技術は広範囲にわたって報告されている
。例えば、米国、ニューヨーク州：ｆｆ　−／ｌｚ　ト
・スフリング・ハーバ−、コールド・スプリング・ラボ
ラトリ−の２テイ・マニアチスら、［モレキュラー・ク
ローニング：ラボラトリ−・マニュア／Ｌ／　Ｊ　（Ｔ
、Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ　ｅｔ　ａｌ　、　、’へｂｌ　
ｅｃｕｌ　ａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　ＬａｂｏｒａＬ
ｏｒｙ　　Ａｌａｎｕａｌ　　　“　Ｃｏ　ｌ　ｄＳｐ
ｒｉｎｇ　ｌ［ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　
にｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌ−１ａｒｌ）ｏｒ、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ）（１９３２）　　参照。また、組換型Ｌ）
Ｎへ化合物、その合成およびその分子生物学における使
用についての一般的検討に関しては、米国ニューヨーク
州、ニューヨーク、サイエンティフィック・アメリカン
・ブックスの、ジエイ・ディ・ワトソンら、　［レコン
ビｔントＩ）　Ｎ　Ａ：　ショート−：Ｉ　−ｘ　Ｊ　
（Ｊ、Ｉ）、Ｗａｔｓｏｎ　ｃｔ　ａｌ、。
’　Ｒｅ　ｃｏｍｂｉ　ｎａｎ　ｔυＮ　Ａ　：　Ａ　
Ｓｌ＋ｏｒｔ　Ｃｏｕｒｓｅ、５Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
Ｎｃｓｖ　Ｙｏｒｋ）　　（１９８３）およびそこに開
示されている種々の参考文献目録参照。
本発明によるＤＮＡ化合物は、糖（デオキシリボース）
とホスフェート基の間の５′３／ホスホジエステルで相
互に結合したデオキシリボースの生物学的：こ臀用なポ
リマー化合物である。該ＤＮＡポリマーはヌクレオチド
単位のくり返しからなり、本明細書に記載のごとく、二
重らせん配置で存在することができ、この配置では対を
なすグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）およびアデニン／チ
ミン（Δ／′ｒ）塩基が水素結合を形成し、二重らせん
を安定化している。
ＤＮＡ化合物は全ての、あるいは実質的に全ての生細胞
中に存在していることが知られている。
これらのＤＮＡ化合物は、細胞の発現遺伝物質に取り込
まれた場合、例えば、遺伝子、プラスミドおよび染色体
の要素として適ＩＦに取り込まれた場合、該ＤＮＡの定
められた塩基対配列を伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ　）上に
転写することかできる。このＲＮＡ上への転写工程が生
細胞内におけるポリペブチドおよび／または蛋白合成を
達成させる工程である。分子生物学的技術は、現在、取
り込み１７ｉ１シこ細胞が合成できるもの、あるいは、
より高次の発現レベルで細胞（こそれが本来産生ずるポ
リペプチドの合成を可能にするもの以外の予め選択した
ポリペプチドをコードする伝令塩基対ＲＮＡ上に転写す
る目的で、組換型１）　Ｎ　Ａ化合物の生細胞の発現遺
伝物質への取り込みを可能にしている。
分子生物学の研究は、しばしば、天然源からの１）　Ｎ
Δ化合物の単離、特徴づけから開始される。
例えば、ＤＮＡ化合物が成熟ウシ脳下垂体から単離され
、これはウシ生長ホルモンもしくはｂＧ）ｌの合成を指
令する塩基対コーディングを伝令ＲＮＡ上に転写する。
このＤＮＡ化合物の単離および特徴づけはヨーロッパ特
許公開出願０１１２０１２号（１９８４年６月２７日公
開）に記載されてい鞍 １１　　　　　　る。このＤＮＡ化合物は、Ｉ）　Ｇ　
ｔ１分泌を司るウシ脳下垂体遺伝子から由来Ｔるので、
一般に、ゲノムＤＮＡもしくはｇ　Ｄ　Ｎ　Ａと称され
る。
一般に、このｇＤＮＡから転写により銹導される伝令Ｒ
ＮＡは逆転写酵素を用いてＤＮＡ中にコピーできる。こ
のＲＮＡ塩基配列のＤＮＡ上へのコピーは通常、コピー
ＤＮＡまたはｃＤＮＡと称されるＤＮＡ化合物を生じる
。＋Ｍｌｉ乳動物の遺伝子について、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの
配列は、しばしば、同じポリペプチドまたは蛋白をコー
ドするｇ　Ｄ　Ｎ　Ａの配列と異なっており、とりわけ
、ｇＬ）ＮＡは、しばしば、コドンに加えてイントロン
もしくは非ポリペプチド・コーディング配列を含む。例
えば、公知のｂ　Ｇ　Ｈｇ　Ｄ　Ｎ　Ａは５′および３
′−末端間に４つのかかるイントロンを含む。それから
転写されたｍＲＮＡｊこ対応する定められた部分を荷す
る定められたｇ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、しばしば、エクソ
ンと称される。
発現能力のある遺伝子は、伝令ＲＮＡをコードしない、
エクソン（伝令ＲＮ　ＡＪ二に転写される１）ＮＡ部分
）を越えるフランキング配列を含むが、これは転写工程
に必須である。伝令ＲＮ　Ａ転写が　　　　　　　６開
始されるサイトから上流（５′一端の上）は、通常、プ
ロモーターと称される転写の促進もしくは開始を司るＤ
ＮＡ配列である。大部分の真核細胞においては、最後の
エクソンから下流（３′一端の下）のＤＮＡ領域は、転
写完了後に加えられるアデニン含有ヌクレオチドの長配
列の伝令ＲＮＡへのイτ１加を司る。この領域、すなわ
ち、［Ｌ）ＮＡポリアデニン尾部」の付加のシグナルは
伝令ＲＮ　Ａのポリアゾニレ−ジョンとしても知られて
いる。
いくつかの蛋白シこついて、このポリアゾニレ−ジョン
・シグナ７１／Ｇこついての要件が知られている。
例えば、アール・ビイ・ウオイチクら、プロシーディン
ゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・ザ・
サイエンス・オブ・ニー・ニス・エイ（Ｒ，Ｐ、Ｗｏｙ
ｃｈｉｋ　ｅｔ　ａ＋　、、　ｌ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ　
、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８１：３９４４−３９４８（１９８４
年７月）「ウシ生長ホルモン遺伝子の３′フランキング
領域の正確なポリアゾニレ−ジョンのための要件」参照
。また、ヌクレオチド配列ＡＡＴＡへへが該遺伝子の３
′−末端から１１〜３０ヌクレオチド上流（５′末端の
万へ）の位置てポリアゾニレ−ジョン・シグナルを特徴
づける。ディ・アー／Ｌ／−ヒッグスら、ネイチ−２−
（１）、Ｒ，ｌ１１ｇｇ５　ｅｔａ４．、Ｎａｔｕｒｅ
）３０６：３９８−４００（１９８３年１１月２４日）
ちよびその参考文献参照。
本明細書は、高等真核生物細胞における予め選択したポ
リペプチドの発現を得る手段としてｂＧＨ以外の予め選
択したポリペプチドをフードする１）　Ｎ　Ａ　、こと
にｃ　ＤＮＡと連結したＩ）Ｇｌｌポリアゾニレ−ジョ
ン・シグナルを利用する方法を開示する。
先行文献 １）Ｇｌｌの同定および特徴づけは公知である。ヨーロ
ッパ特許公開出願０１１２０１２（１９８４年６月２７
日公開）参照。同様に、ウシ生長ホルモンの正確なアゾ
ニレ−ジョンのためのある種の要件も公知である。アー
ル・ビイ・ウォイチクら、プロシーディンゲス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・ザ・サイエンス・
オブ・ニー・ニス−ｘイ（ＲｌＰ、Ｗｏｙｃｈｉｋ　ａ
ｔ　　ａｌｌＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ　。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ）８１　：３９４４〜３
９４８（１９８４年７月）参照。
発明の要約 本発明は、ことｆこ、 （ａ）式 で示される環状組換型ＤＮＡ化合物 〔式中、 ｒＢＪ領域は、その配列がｂ　Ｇ　ＩＩポリアゾニレ−
ジョン・シグナルを含むヌクレオチドからなる。
「１７」領域は、その定められたコドンが、ｂＧＨＱ外
の予め選択したポリペプチドの合成のための遺伝子（そ
のゲノムまたは他のイントロン含有形を含む）を含むヌ
クレオチドからなる。
ｒＰＪ領域は、その配列が該遺伝子の転写を開始できる
プロモーターを含有するヌクレオチドかｌ　　　　　　
らなる。
ｒＭＪ領域は、その配列が、選択可能なマーカーを含有
する任意のヌクレオチドからなり、該マーカーは、該Ｄ
ＮＡＩヒ合物が生細胞の発現遺伝物質に取り込まれるこ
とにより、取り込みが起った細胞を選択するために利用
できる。〕 およびその非非環状型合合物 （ｂ）予め選択したポリペプチド発現のための該組換型
ＤＮＡの使用方法、 （Ｃ）その発現遺伝物質が該組換型ＤＮＡ１６合物から
なる高等真核生物細胞または細胞系、および、（ｄ）そ
の発現遺伝物質中に含まれる組換型１）　Ｎ　Ａ化合物
がｔＰＡｃＤＮＡからなるｒＦＪ領截を有するそのよう
な細胞系を培養することからなる【１’Ａの製造法を提
供するものである。
発明の詳説　。
本発明によれば、該新規化合物、生細胞および／または
細胞系ならびにその使用は全て、組換型ＤＮＡ比合吻合
物シ生長ホルモン（ｂｃｕ）ポリアゾニレ−ジョン・シ
グナルを取り込ませる。ウシ生長ホルモン（ｂＣ，Ｈ）
は、はじめに、２６個１：・ のアミノ酸のシグナル・ペプチドを含む０り生長ホルモ
ンとして合成される１９１個のアミノ酸のポリペプチド
である〔エル・ティ・ハントおよびエム・オー・ダイホ
フ、アトラス・オブ・プロチン・シーケンス・アンド・
ストラフチャー、エム・オー・ダイホフ編、ナショナル
・バイオメディカル・リサーチ・ファンデーション、ワ
シントン・ディ・シイ（Ｌ、Ｔ、　Ｈｕｎｔ　ａｎｄ　
Ｍ、Ｏ，Ｄａｙｈｏ［ｆ。
Δｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ
　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ。
ｅｄ、Ｍ、０．Ｄａｙｈｏ［ｆ、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆａｕｎｄａｔ
ｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ０）Ｖｏｌ、５
、補遺２．１１３−１３９頁（１９７６）：ブイ・アー
ル・リンガツバ、エイ・デビクース・シェリーおよびシ
イ・プロベル、プロシーデインダス・オブ・ナショナル
・アカデミ・オブ・サイエン７、　（Ｖ、ＲｏＬｉｎｇ
ａｐｐａ、Ａ、Ｄｅｖｉｌ　Ｉｅｒｓ−Ｔｈｉｅｒｙａ
ｎｄ　Ｇ、Ｂｌｏｂｅｌ　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、）　７４　：２４３２〜２４３６（１
９７７）参照〕。組換ＤＮＡ法を用いた１）Ｑｌｌゲノ
ム・クローンが公知であり、ｐｇＧＩＩ２１Ｌ２と称せ
られるゲノム・クローンが米国イリノイ州、ペオリア（
１’ｅｏｒｉａ、１ｌｌｉｎｏ　ｉ　ｓ　、Ｕ、　Ｓ　
、Ａ、　）の米国農務省、ノーザン・レジョナル°リサ
ーチ・ラボラドリース（Ｎ　ＲＩｔ　Ｌ　）に永久寄託
されている。これは、イー・コリ（Ｅ。
ｃｏｌ　１）Ｉ−Ｉ　Ｂ　１０１宿主中ｆこ入れて寄託
されており、この寄託既関における寄託番号はＮ　ＲＲ
し　１％−１５１５４である。また、イー・コリＩ目Ｓ
　１０１宿主中に入れた、クローンｐ　ｇＧｌｌ　２Ｒ
３を含有するｂＧＨｇＤＮＡも寄託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ
−１５１５５で寄託されている。
ｈ　Ｇ　Ｈｇ　Ｄ　Ｎ　Ａヌクレオチド配列は実質的に
つぎのとおりであることが知られている（ヌクレオチド
は塩基Ａ、Ｔ、ＧまたはＣで示す〕。
；　￥　　６　　　　ｏ　　　　　ｕ　　　ｏ　　（支
）　　１）　　　。
的ヒ　　　　＞（）　　　　　Ｊ（Ｊ　　　　ＪＪ　　
　ｂＯ＋ａ　　　　闇コ＜Ｃｎ＜Ｏ＞←　　コＯ Ｊご　　２＝　胃Ｓ８　３し　　雨ご Ｉ＋Ｉｑ、　　　へ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　８小文字はイントロン
配列に相当する。ｍ　ＲＮ　Ａ転写開始および終止位置
を５′および３′として示しである。制限エンドヌクレ
アーゼＰｓＬ　　１およびＰｖｕ　１１のための認識部
位を下線で示してあり、また、実際の開裂部位も示しで
ある（開裂は二重矢印の間で起る）。ｌ’ｓｔｌ　はヌ
クレオチドを非対称的に開裂し、その末端がｌ）　Ｇ　
ｆｌｇ　Ｄ　Ｎ　ＡのＴＧＣＡ配列に対応する４つの対
をなさない塩基を含むＤＮＡ化合物を生じる。これらの
配列がＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって除去されると（
すなわち、対をなさない、もしくは粘着末端残基の除去
）、平滑末端ＤＮＡ化合物が生じる。生じた有効もしく
はＰｓｔｌ（平滑）開裂部位は下方の矢印で示しである
。ポリアゾニレ−ジョンにとモナうヌクレオチド配列に
下線を付しである。
本発明によれば、Ｉ）Ｇｌｌポリアゾニレ−ジョン・シ
グナルは、その官能中心がゲノムＩ）　Ｇ　ｌｌ遺伝子
のほぼ３′−末端付遅番こ位置し、このｌ）　Ｑ　ｌｌ
遺伝子の伝令ＲＮ　Ａ上への転写に際し、ポリアゾニレ
−ジョン（アデニン含有ヌクレオチドの長鎖または「尾
」の付加）を伝令ＲＮＡ（ｎｓＲＮＡ）にシグナルでき
るヌクレオチド配列のＤＮＡである。
したがって、ｂ　Ｇ　Ｈポリアデニレーンヨン・シグナ
ルは、該ゲノム配列におけると同様（こ、３′−末端と
、そこから約５０〜５００ヌクレオチド下流（丁なわち
、５′−末端から離れる）までの配列のヌクレオチドを
含む。しかし、より好ましくは、該ポリアゾニレ−ジョ
ン・シグナルは、ｌ）Ｇ［ＩゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）
の３′−末端から下流、約７０ヌクレオチド以下を含む
。ポリアゾニレ−ジョン・シグナルの上流（すなわち、
５′−末端に向う方向）は３′−末端と、そこから約５
０ヌクレオチド上流までの間のゲノム配列を含むが、ま
た、それよりも実質的１こ多数のかかる上流ヌクレオチ
ド塩基を、含んでいてもよい。例えば、制限エンドヌク
レアーゼに対する都合よい開裂部位の位置は実質曲番こ
より多数の上流ヌクレオチドの容易ｆＳ使用を可能にす
る。したがって、ポリアゾニレ−ジョン・シグナルは式
： 〔式中、「Ｕ」領域は３′−末端から上流のｂ　Ｇ　Ｈ
ＤＮＡのヌクレオチド配列およびｒＤＪ領域は３′−末
端から下流のヌクレオチド配列を表わＴ〕で示されるＤ
ＮＡ（ヒ合物として表わすことができる。
前記のＬ＋ＧＨポリアゾニレ−ジョン・シグナルの選択
についてのパラメータの中で、該シグナルからなる実際
のＩ）　Ｎ　Ａ化合物は、公知の制限エンドヌクレアー
ゼでの開裂により、ｂＧＨｇＤＮ八から調製できる。つ
いで、得られたＤＮＡ化合物は、実際に制限エンドヌク
レオチドによりｂＧＩＩｇ　Ｄ　Ｎ　Ａから開裂される
ヌクレオチドを越えて。
ざらにいくつかのｂ　Ｇ　Ｈポリアゾニレ−ジョン・ヌ
クレオチドの［刈込み（ｐｒｕｎｉｎｇ　）　Ｊ　　ま
たは１　　　　　　開裂後、シグナルとして用いること
ができる。該１）　Ｎ　Ａ化合物の刈込みを行なうエク
ソヌクレアーゼを用いる技術は公知である。前記文献参
照。
別法として、ｂＧｌｌｇｌ）ＮＡから切り取られたポリ
アゾニレ−ジョン・シグナルにさらｌこヌクレオチドを
付加して、非ゲノム配列を含むより太きなポリアゾニレ
−ジョン・シグナルを作ることができるＯ例えば、得ら
れたゲノムｂＧｌ１ｇｌ）ＮΔ配列が３′−末端から上
流５０個のヌクレオチドおよび下流５０個のスフしオチ
ドからなる場合、本発明の１）ＧＨポリＴデニレーショ
ン・シグナルからなる実質的により大きなりＮＡ比合物
を得るために、非ゲノムＤＮＡ比合物をその上流または
下流（もしくは両方）で結紮することができる。
所望により、総合または部分化学合成を用いて前記のい
ずれのｂ　ｃ　ｔ−ｔポリアゾニレ−ジョン・シグナル
を調製できる。
合成および単離の都令上、本発明の１）Ｇ１１ポリアゾ
ニレ−ジョン・シグナルの好ましい具体例ｊ；ｉＰλＧ
Ｈ２Ｒ２のＰｖｕ　Ｉ　　制限エンドスフレアーゼによ
ってｂ　Ｇ　Ｈｇ　Ｄ　Ｎ　Ａを開裂して得られる主１
．Ｊ８あ、、１１□１−５１．□。、ｂＧｌ、１，１″
アゾニレ−ジョン・シグナル力ＰｓＬＩを用いル消化に
より、都合よく得られる。
式（１）のＤＮＡ化合物のｒＦＪ領域は、遺伝子、好ま
しくは、ＣＤＮＡ遺伝子のアミノ酸コーディング・ヌク
レオチドを示している。さらに詳しくは、「Ｉ′」領域
は、ｂ　Ｇ　Ｉ−１以外の予め選択されたポリペプチド
合成用に定められたコドンであるヌクレオチドからなる
。別法として、ゲノムＤＮＡは「Ｆ」領域のｃＤＮＡな
らびに、イントロンおよびアミノ酸をコードしないヌク
レオチドを含む他の遺伝子の代りに用いることができる
。選択するポリペプチドには、遺伝子コーディングが公
知であるか、公知の技術、すなわち、部分または全化学
合成によって構成できるいずれのポリペプチドも包含さ
れる。したがって、かかるポリペプチドには、ヒト血清
アルブミン、インターフェロン類およびその種々の類似
体、ウシ生長ホルモンＪ２ｔＪの生長ホルモン、ワクチ
ンに有用な免疫原性蛋白、インターロイキン２およびイ
ンシュリンが包含される。本発明による好ましい具体例
は、ｒＦＪ領域において組織プラスミノーゲン活性化物
質（ｔＰＡ）ｃＤＮＡ遺伝子を用いて高等真核生物細胞
中でＬｌ’Ａ発現をすることのできる組・換型ＤＮＮＡ
子を作ることである。イー・コリにおけるヒト組織プラ
スミノーゲン活性化物質ｃ　１．）　ＮＡのクローニン
グおよび発現は公知であり、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）３０１　：２１４”２２１（１９８３年１月２０日）
に記載されている。この公知の方法はｔｌ’ＡｃＤＮＡ
を得るための有用な手段である。
式（１）の「Ｐ」領域は、「Ｉ７」領域を構成する遺伝
子のＲＮＡポリメラーゼによる転写を開始させることの
できるプロモーターからなる。ゲノム源からｒＦＪ領賊
が形成される場合、「Ｐ」領域は、すでにそこに含まれ
ているプロモーターからなることができる。別法として
、また、特に。
ｒＦＪ領域がｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａからなる場合、公知の、
丁でに遺伝子工学分野で入手可能な多くの有用なプロモ
ーターから別のｒＰＪ領域を選択し、取り込ませる。こ
れらには、５ｖ４０プロモータ〔ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・アンド・アプライ１’・ジエネティ′ンク
ス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ　
　ＡｐＰＩ　　ｉｅｄ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）１　　　
：　　　３　２　７　〜３　４　１　　およびその参考
文献参照〕およびＬＴＲプロモーター（米国特許第４４
０５７１２号参照）が包含される。本発明による好まし
いプロモーターはＣＭＶ　　１．Ｅ、プロモーター、も
つとも好ましくは、　５ａｕ３Δ制限エンドヌクレアー
ゼから由来するそのフラグメントである。主即時初期遺
伝子（Ｃ：ＭＶｌ、Ｅ、）を含有Ｔるヒト・サイトメガ
ロウィルス（ＣＭＶ）ゲノムの領域の制限エンドヌクレ
アーゼ開裂地図は詳細に記載されている〔スティンスキ
イら、ジャーナル・オブ・パイロロジイ（Ｓｔｉｎｓｋ
ｉ。
ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）４６　：　１〜１
４　（１９８３）：ステンベルグら、ジャーナル・オブ
・バイ′ロロジ４　（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ、ｅｔ　ａｌ　
、、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）　４ｇ　：　ｌ　９０〜１９
９（１９８４）：ｌ−ムセンら、プロシーディンゲス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブン　　　　　　・
サイ１ンス・オブ・ニー・ニス・エイ（’１ｂｏｎｓｅ
ｎ。
ｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ）８１　　：　６５９〜６６３（１９８
４）］。これらの文献は該主即時初期遺伝子用のプロモ
ーターを含有する２゜０キロベース（ｋｂ）のＰＳＬ　
１フラグメントを記載している。この２．Ｏｋｂ　Ｉ’
ｓｔ　１フラグメントを単離し、５ａｕ３ＡＩで消化Ｔ
ると、種々の生成物のうち、７６０塩基対フラグメント
が得られる。こ材 の７６０塩基フラグメントは、その大きさおよび。
＾ フラグメントの中に５ａｃｌ開裂部位およびＢａｌ　ｌ
開裂部位が存在することにより他の生成物と区別できる
。その都合よい同定のため、この５ａｕ３ＡＩフラグメ
ントの利用が本発明における該ＣＭ■１、Ｅ、プロモー
ターの使用の好ましい方法である。
ｒＭ」領域は、所望により、該組換型ＤＮＡ化合物が生
細胞の発現遺伝物中に取り込まれたか否かを判定するた
めに用いることのできる選択可能なマーカーを提供Ｔる
。このようなマーカーの使用およびその選択の原理はよ
く知られている。選択可能なマーカーには抗生物質耐性
遺伝子が包含され、これは、取り込まれないと該抗生物
質が致ン。
死性である生細胞への取り込み判定に有用である。
例えば、＠乳動物細胞において、アミノグリコシド抗生
物質０４１８は蛋白合成を阻害し、細胞を致死させる。
したがって、該Ｇ４１８耐性遺伝子は適当な選択可能マ
ーカーとなる。同様に、ジヒドロ葉酸塩レダクターゼ（
ｄｈｆり遺伝子は、ｄｈｆｒ欠撰を生じる細胞（例えば
、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞）の有用なマーカ
ーを提供する。
式（１）のＤＮＡ化合物上のマーカーの利用を必要とし
ない選択のもう１つの技術は共転移（ｃｏ−ｔｒａｎｓ
［ｅｒｅｎｃｅ）技術の使用で、これにより、マーカー
のない式（りの化合物と、マーカーを含む別のＤＮＡ分
子の両方を１つの細胞に共転移させる（米国特許第４３
９９２１６号（コロンビア大学）参照）。高等真核生物
細胞の発現遺伝子物質への取り込みは公知方法で行なわ
れる。典型的には、取り込みは細胞中の染色体構造中に
Ｉ）　Ｎ　Ａ　１６合物の存在をもたら丁が、例えば、
組換型ウシ乳頭腫ウィルスの利用のような、染色体外取
り込みによっても行なうことができる〔このような取り
込み方法については、エヌ・ヒジウングら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネテ
イクス（Ｎ、Ｉｌｓｉｕｎｇ、ｅＬ　ａｌ、、　Ｊ。
〜１ｏｌｅｃｕｌａｒ　　ａｎｄ　ＡＰＰＩｉｅｄ　Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ）２：４９７〜５０６（１９８４）参照
〕。
式（１）の化合物は環状組換型ＤＮＡ分子として表わし
ているが、例えば、制限エンドヌクレアーゼによる特定
の部位で、また、他のヌクレアーゼ等によるより任意の
開裂の結果としての、その非環状形も存在する。本発明
はこれらの環状および非環状組換型ＤＮＡ化合物の両方
を提供するものである。
また、本発明は、予め選択したポリペプチドの発現のた
めの式（１〕の組換型ＤＮＡ化合物の団用も提供するも
のである。この使用は該組換型ＤＮＡ１６合物を高等真
核生物細胞または細胞系の発現遺伝物質「１月こ挿入す
ることにより行なわれる。
本発明による高等真核生物細胞および細胞系には複細胞
生物から由来する細胞および細胞系、ことに、ｌＩｉ［
ｉ乳動物細胞および細胞系が包含される。
これらの細胞または細胞系を公知の方法で培養すると、
予め選択したポリペプチド、例えば、組織プラスミノー
ゲン活性化物質（Ｌｌ）Ａ）が得られる。
したがって１本発明は、得られる組換型構造物３こおけ
る１）Ｇｌｌポリアゾニレ−ジョン・シグナルの新規な
使用も提供する。
後に示Ｔチャートに本発明の構造および操作をさらに詳
しく示しである。
プラスミドが環状ＤＮＡであるので、便宜上、それらは
、しばしば、円で表わされる。しかし、本明細書におい
ては、チャートおよび式を含め、プラスミドの別の表現
法を用いている。Ｔなわち、基本的に、その水平辺がプ
ラスミドのＤＮＡヌクレオチドを表わし、２つの垂直辺
の各々が、水平辺の各々の上に表わされている架橋ヌク
レオチドを結合する通常のホスホジエステル結合を表わ
丁長方形として示している。ざらに、垂直辺は、該プラ
スミドについての転写方向を示す方向矢印で表わしであ
る。プラスミドのこの長方形表示を円（形表示に翻訳す
るに際しては、もつとも都合よくは、長方形の左側辺を
円の最」二点に対応させる。
Ｔなわち、長方形の右側辺は円の最下点に対応する。長
方形表示の水平辺の上の垂直線は制限エンドヌクレアー
ゼの開裂部位または特定のヌクレオチド配列の開始また
は終止位置に対応する。この特定のヌクレオチド配列は
、さら１こ、水平線上に示すアルファベット文字によっ
て特徴づけることができる。同様に、制限エンドヌクレ
アーゼについての開裂部位の位置は矢印およびそれらの
酵素の標準的略号で示しである。ここで用いるプラスミ
ドの表示法の１つの利点は、長方形の垂直辺の一万また
は両方を除いて、ＤＮＡの線形フラグメントが環状プラ
スミドと同じに正確に示されることである。両方の垂直
を除くと、ＤＮＡは、その複製方向が別々に、適宜水平
方向の矢印で示される一本の水平線で表わされる。
かくして、本明細書において、ＤＮＡ化合物、丁なわち
、その配列ヌクレオチドがアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ
）、シトシン（Ｃ’）およびグアニンＣＧ）から選ばれ
る重合デオキシリポ核酸を水平線で部分的に示す場合、
該線は通常のホスホジエ　　　　　　φステル結合また
は分離したいくつかのＤＮＡ残基を示す。これらの残基
は、例えば、遺伝子、プロモーター、マーカーまたはエ
ンドヌクレアーゼ制限酵素部位を引用してさらに特徴化
または特定化しない限り、それらの非特徴ｌヒ介在配列
の大きさ。
位置および、機能化および／または特徴化配列に対する
近接についての公知の制限を受ける以外、任意に構成す
ることができる。換言すると、これらの介在配列は、得
られたＤｌ’ＪΔ化合物の意図する目的（こ対する適合
性を無効にしてはならない。
しかし２ざらに好ましくは、該介在配列は、意図Ｔる目
的をさらに高める（例えば、予め選択したポリペプチド
の発現レベルを高める〕、あるいは、広範囲の宿主の選
択を可能番こＴる（例えば、抗生物質耐性遺伝子の包含
）、予め選択した有用なヌクレオチド配列を含有する。
したがって、本明細書の式で示すごとく、該ＤＮＡ化合
物は、所望により１発現的に指定される配列に加えて、
構造的および／または機能的特徴を有するヌクレオチド
の配列を含む。
チャートについて、チャートＡは該ＤＮＡＩＬ合物調製
の一般的方法を示す。チャートＡに従い２予め選択した
ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含有するプラ
スミドｐＸを制限エンドヌクレアーゼで消化しくチャー
ト中のＲｅ５ｌおよびＲｃｓｌｌのように任意に消１ヒ
）、該ポリペプチド用に実質的に定められた所望のコド
ンを含む式（■）のＤＮＡ化合物を得る。式（■）は、
例えば、好ましくは、該ポリペプチドをコードするｃｌ
）ＮＡ　　化合物である。ｐＸのようなプラスミドの入
手が都合よくない場合、式（■）の化合物の調製に全ま
たは部分化学合成法を採用してもよい。同様に、都合の
よい制限エンドヌクレアーゼ部位を欠く式（１１）の（
ヒ合物について、公知方法による化学的修飾を用いて式
（■）の化合物を得ることもできる。
チャート八によるつぎの工程は適当なマーカーを含む式
（ロリ　のＤＮＡ化合物の調製である。　　　　　　′
すなわち、Ｒｃｓ　　ｌおよび艮ｅｓ　１１のように任
意に指定した制限エンドヌクレアーゼ部位でプラスミド
ｐｔを消化して、選択可能なマーカーを含有する式（ｌ
■〕　の化合物を得る。
式（ｌりおよび式（ＩＩりのＤＮＡ化合物の組換えによ
り１式（Ｖ）のＤＮＡ化合物を得る。
１）Ｇｉｇポリアデニレーソヨン・シグナルを式（Ｖ）
の化合物に取り込ませるため＝ｂＧｌ−１ｇＤＮＡを含
むプラスミドｐｂＧＩＩを、Ｒｅｓ臘およびＲｅ５ｌＶ
として任意に示す制限エンドヌクレアーゼで消（ヒする
。これにより、ｂ　ｃ　ｔ−ｉポリアゾニレ−ジョン・
シグナルを含ＷＴる式（ＩＶ）のＤＮＡ化合物を得る。
選択する実際の艮ｅｓｌＶに応じて、式（ＩＶ）ノＤ　
Ｎ　Ａ比合物はｂＧＩＩｇＤＮＡからのイントロンを含
む。所望により、プラスミドｐｂＧＨの制限エンドヌク
レアーゼによる消化生成物は、さらに、他のヌクレアー
ゼで消化して修飾でき、式（ＩＶ）　　のポリアゾニレ
−ジョン・シグナ′ルを得る。別法として、もちろん、
式（ＩＶ）　　の生成物は公知の方法による全または部
分化学合成により、簡単に誘導できる。
ト １、　　　　　　　ついで、式（ＩＶ）および式（Ｖ）
の（ヒ合物を結紮して、式（■りのプラスミドを得、こ
れは、適当な制限エンドヌクレアーゼ、ここではＲｅ５
ｌｌ　　で消化し、プロモーターに結紮すると、式（１
）のＤＮＡ化合物が得られるっ式（【）の化合物の成分
を示す１ＤＮＡ化合物の組立の順序は一般に臨界的では
なく、入手しつる出発物質により、もつとも都合よい順
序とすることができる。したがって、チャートＡおよび
それ以降のチャートは組立順序の変動に応じて修飾して
よい。
チャートＢは、式（１）のＤＮＡ化合物調製に用いるｂ
ＧＨポリアゾニレ−ジョン・シグナルを得るのに有用な
プラスミド調製用の都合よい方法を示Ｔ０ チャートＢに従って、プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ　２　ｄ　
ｌＩＫをチャートＢに示すような適当なエンドヌクレア
ーゼで消化し、アンピシリン耐性遺伝子（チャートＢで
Ｎ叩で示す）、５Ｖ４Ｑ複製開始点および付随するプロ
モーター、ならびに、マウス・ジヒドロ葉酸塩レダクタ
ーゼ（ｄｈ［り遺伝子を含む式（Ｖｔ）のＤＮＡ化合物
を得る。このプラスミド；） の調製および使用は一ニス・スブラマニら、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジイ（Ｓ、Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ　、ｅｔ　ａｔ、　、Ｍｏｌ　ｅｃｕｌａｒ　
ａｎｄ　（＞１ｌｕｌａｒＢｉｏ置Ｏｇｙ）２　装８５
４〜８６４（１９８１年９月）４ｒシミアン・ウィルス
４０におけるマウス・ジヒドロ葉酸塩レグクターゼ補助
デオキシリボ核酸の発現」に記載されている。同様に、
チャートＢに関し、プラスミドｐ　ＡＧ　Ｉ−ｉ　２　
Ｒ２を同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｂ　Ｇ　
ｔｌ　ｇ　Ｄ　Ｎ　Ａを含有Ｔる式（Ｖｌｌ）のＤＮＡ
化合物を得る。プラスミドｐλＧ　Ｈ２Ｒ２はイー・コ
リＩＩ　Ｂ　Ｉ　Ｑ　ｌ宿主、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５１
５４から由来する。このプラスミドは公知であり、公知
の方法により容易に製造される（ヨーロッパ公１ｙｎ出
願８３３０６６５５゜８　（１９８４年６月２７日発行
）参照〕。
ツイテ、式（ｖｌ）オヨヒ式（Ｖｌｌ）　（ｙ）　Ｄ　
Ｎ　Ａ比合物を結紮して式（ＸＩ）のｐｓＶｃＱＷ７が
得られる。
チャートＣはＤＮＡ化合物、すなわち、式（Ｘｌｌ）〜
式（ＸＩＶ）の化合物調製におけるプラスミドｐＳｖ（
：ＱＷ７の使用を記載しており、これらの化合物はチャ
ー１−Ｅの式（Ｘ）　　および式（ＸＩりの合成に有用
である。すなわち、チャートＣはそこに示す制ｆｕｌｌ
エンドヌクレアーゼを用いる消化による腫々）式（ｘｔ
ｉ）、式（ｘｌｌｌ）オヨヒ式（ＸｔＶ）　（１）　（
Ｂ　合物（１）　ｍ製を示している。
式（ＸＩＶ）　の化合物について、ＥｃｏＲｌおよびＰ
ｓＬｌ　　エンドヌクレアーゼの消化の後＋　ｌ’ｓｔ
１部位においてＤＮＡポリメラーゼを作用させ、平滑末
端もしくは塩基が完全に対合した式（ＸＩＶ）の化合物
を得る〇 また、チャートＣには、プラスミドｐｉ”５Ａ１８から
ｔ　１”Ａ　ｃ　Ｄ、Ｎ　Ａの調製も示されている。こ
の式（ＸＶ）プラスミドの調製は、好ましい具体例で、
Ｂａｍ１１１部位における末端アミノ酸をコードＴる領
域におけるＢａｎ１Ｈ１およびＢａ１ｌ　　制限ヌクレ
アーゼによる修飾の詳細を含んでいる。
本発明により、式（Ｘｔｔりおよび式（刈■）の化合物
は有用ｆｌ　Ｉ３　Ｇ　ＩＩポリアデニレーソヨン・シ
グナルを表わす。これらの式（Ｘｌｌｌ）および式（Ｘ
ＩＶ）の化合物のヌクレオチド配列は、各々、ｌ”　ｖ
　ｕ　ＩＩ開裂部位またはｌ’５ｔｌ（平滑末端）開裂
部位から、１）Ｇ−１１ｇ　Ｄ　Ｎ　Ａについて前記し
た塩基の末端まで、前記のｌ）Ｇ　Ｉ−１ｇ　Ｄ　Ｎ　
Ａについて定められた配列からなる。
チャートＤは、ｐＴＰＡ　−Ｉ　ＰＡ　−ｄ　Ｉｎ　Ｅ
　ｒ　　およびｐ’ｌ−Ｉ’Ａ−１’Ａ−ｄｉＩＥ　ｒ
の２つのプラスミドを調製する方法を示す。これらのプ
ラスミドは、各々、式（ＸＩＶ）または式（ＸＩ　）の
ポリアゾニレ−ジョン・シグナルのいずれかを含む。チ
ャー）Ｄの方法により、チャートＣで得られた式（ＸＩ
りの化合物がチャートＣの式（ＸＶＩ）の化合物に結紮
されてｌ）　Ｎ　Ａ　１１゜合物を生じ、これは、つい
で、式（ＸＩＶ）のポリアゾニレ−ジョン・シグナルか
、式（Ｘｌｌ）のポリアゾニレ−ジョン・シグナルと結
紮される。得られた生成物は式（ＸＶＵ）のイントロン
含有ｂＧＨポリアゾニレ−ジョン・シグナルおよび、そ
のｂＧ１１ポリアゾニレ−ジョン・シグナルがこのイン
トロンを含まない式（ｘｖｍ）の化合物で表わされる。
ン　　　　　　　チャートＥは、有用なプロモーターを
含有Ｔる式（Ｘ）および式（刈りの化合物の製法を示す
。チャートＥに従い、ＣＭＶ　　１．Ｅ、　　）ｃｓモ
モ−−（エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａｌの消化で得ら
れた７６０塩基対フラグメント）を、式（ＸＶｔりの化
合物を制限エンドヌクレアーゼＢａｍ１ｌｌで消化して
得られるＤＮＡ化合物と結紮し、ついで、細菌性アルカ
リ・ホスファターゼで処理する。得られた式（Ｘ）の化
合物は本発明の式（１）のＩ）　Ｎ　Ａ化合物の１つで
ある。同様に、チャートＥは、出発物質として式（ＸＶ
Ｉりの化合物の代りに式（ｘｖｍ）の化合物を用いる場
合の式（ＸＩりの化合物の製法も示している。
前記した一般的および特定の方法に従い、分子生物学に
おいて公知の標準的技術により、種々の式（１）の環状
組換型ＤＮＡ化合物が製造される。
これらの式（１）の化合物の全てが、公知のヌクレアー
ゼの１つを用いて行なうことのできるホスホジエステル
結合の開裂で非環状形に調製できる。
これらの式（１）の組換型ＤＮＡ化合物は、高等真核生
物細胞または細胞系の発現遺伝子質喜こ取り込ま６゜＆
＋４より、予ゎ選択。えポ１，４アや　　　　　　ｊｌ
・ドの合成に有−効に用いることができる。前記のごと
く、この高等真核生物細胞または細胞系の発現遺伝物質
への取り込みは、例えば、式（１）の化合物のトランス
フェクションを含む公知の方法で行なうことができる。
一旦、高等真核生物細胞または細胞系の発現遺伝子物質
が式（Ｉ）の化合物を取り込めば、そのような細胞系を
培養する公知の技術を用いて予め選択したポリペプチド
の発現を生じさせることができる。
発現された予め選択したポリペプチドを、ついで、常法
により細胞培養から回収Ｔる。予め選択した各ポリペプ
チドは、ついで、公知の方法により、公知・の医薬用途
に使用することができる。あるいは、ポリペプチドは栄
養的にも仔用である。
好ましい具体例 つぎに調製例および実施例を挙げて、本発明をさらに詳
しく説明する。プラスミドの調製を含め、本明Ｊｌｌｌ
　４！’で用いるＤＮＡ化合物合成の全ての方法は分子
生物学の研究分野でよく知られた標準的技術である。こ
れらの技術は、例えば、前記ティ・マニアチスらの「モ
レキュラー・クローニング：ラボラトリ−・マニュアル
」に収集されている。
調製例１ プラスミドｐｓＶ（：ＯＷ７の合成 チャートＢ参照 プラミドｐｓＶ２ｄｈ［ｒ（：ニス・スブラマニ、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ（Ｓ＋５ｕ
ｂｒａｔｎａｎｉ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　にｅ
ｌｌｕｌａｒＢｉｏ層ｏｇｙ）２　　：　ｓ　ｓ　４〜
８６４（１９８１年９月〕り方法に従って調製〕をＢ＠
ｎｔＨＩおよびｌｉ　ｃ　ｏ　Ｒ１で消化し、アンピシ
リン耐性遺伝子、５ｖ４０複製開始点およびｄｌｘｆｒ
遺伝子を含むフラグメントを得る。プラスミド　ＰＡＧ
Ｈ２Ｒ２からのもう１つの７ラグメントを同じ制限エン
ドヌクレアーゼで消化してゲノム・ウシ生長ホルモン遺
伝子を含有ＴるＤＮＡ、Ｔなゎち、ｂＧｌｌｇＤＮＡを
得る。ｐλｃ　ｔｔ　２　ｒｔ　２はイー・コリＩＩ　
Ｂ　１０１宿主、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１５１５４から得ら
れる。得られり式（ｖｕ）　（１）ｂＧｌｌ　ｇ　ＤＮ
Ａ７５りＪ　７　トラ式（”）の化合物と結紮して式（
ＸりのプラスミドｐｓＶｃｏｗ７を得る。
調製例２ プラスミドｐＰｓＡ１ｇの合成 チャートＣ参照 ヒト組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔ　ＰＡ　）の
完全長ｃＤＮＡクローンを入手または調製Ｔる。
ｔＰＡ（ＤＮＡ調製には公知の方法、例えば、ぺ二力ら
、ネーチ−２−（Ｐｅｎｎｉｃａ、ｅｔ　ａｌｌＮａｔ
ｕｒｅ）３０１　：２１４〜２２１（１９８３年１月２
０日）が利用できる。ついで、ｔＰＡｃＤＮＡ　　を制
限エンドヌクレアーゼｌ１ｇａｌで切断し、末端をＤＮ
Ａ、ｉ！リメラーゼｌクレノー・フラグメントで処理Ｔ
る。
ついで、　ｊｓａｍ　ＩＩ　ｌ　　リンカ−をＩｌｇａ
　Ｉ末端に結紮する。得られたｃ　ＤＮＡを制限エンド
ヌクレアーセＮａｒｌで開裂し、４９０塩基対フラグメ
ントを単離する。これはｔｉ’ＡのＮ−末端アミノ酸に
関Ｔるコーディング配列を含む。このＤＮＡ化合物は１
つのＮａｒｌ末端および、予めＩｓ　ａ　ｍｌｌ　１リ
ンカン　　　　　　−と結合させた１つのｌｌｇａ　Ｉ
末端を有する。別の反応で、ｔ　ｌ’　Ａ　ｃ　ＤＮＡ
をＮａｒ　ｌおよびＢｇｌ　１１の両方で消化する。１
６５０塩基対Ｎａｒ　１／１３ｇ１■フラグメントを単
離Ｔる。これはＬＰＡのＣ−末端アミノ酸に関するコー
ディング配列を含む。前記で得られたＮ−末端およびＣ
−末端フラグメントを、ついで、プラスミドｐＫに７［
：ラオら、ジーン（Ｒａｏ、ｅｔ　ａｌ−、Ｇｅｎｅ）
７　ニア９”８２（１９８２）の方法により調製〕に結
紮して表記のプラスミドｐＰ５Ａ１８　を得る。このグ
ラスミドはｔ　ＰＡについての全コーディング領域を示
し、また、コーディング領域の５′−非翻訳領域中に特
有のＪＳａｍｌ−■■開裂部位を有Ｔる〇 実施例１ プラスミドｐＴＰＡ−ＰＡ−ｄｈ［ｒ、ｐＴｌ’Ａ−ｔ
ＰＡ−ｄｈ［ｒ、ｐｌＥ−ＴＰＡ−ＰＡ−ｄｂ［ｒおよ
びｐ　Ｉ　Ｅ−ＴＰＡ−Ｉ　ＰＡ−ｄｌｌｆｒ　（１）
製造ｔＰＡ発現プラスミドの組立を以下のごとく２工程
で行なう。
Ａ工程１（チャートＣおよびＤ参照） っぎのＤＮＡ片を一体に結紮する。
（ｌｌｐ　Ｓ　Ｖ　Ｃ０Ｗ７　（式ＸＩ　）　カラ（１
）ＥｃｏＲ１／　　　　　　　！’ＢａｍＨ１フラグメ
ント（式■）。これは、ベテスダ・リサーチ・ラボラド
リース（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅりから入手できる親プラスミドｐｓＶ２
ｄｂ［ｒからのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントと
しても２導される。この式（ＸＵ）のフラグメントはＰ
ＢＲ３２２からの複製開始点およびイー・コリで発現す
るアンピシリン耐性遺伝子を含有し、イー・コリ中での
プラスミドの複製を可能にする。該７ラグメントはその
構造中にマウス・ジヒドロ葉酸塩レダクターゼｃＤＮＡ
も含み、哺乳動物細胞における発現を可能にＴる（スブ
ラマニら、モレキュラー・アンド・バイオａシイ（Ｓｕ
ｂｒａ＋ｏ；ｔｎｉ　、ａｔ　　ａｌ　＋、八へｏ１　
、Ｃｅｌ　Ｉ　、Ｂｉｏｌ　、）１　：８５４−８６４
（１９８１）参照〕。
（２）プラスミドｐｉ″Ｓへ１８（式Ｖ）から（７）Ｉ
Ｓａｍｔｌ　Ｉ　／Ｂａｌ　１　　フラグメント（式Ｖ
りっ　これはｔｌ″ＡｃＤＮ八からの完全コーディング
領域を含有する。
Ｂａｍ１−１１切断はｍ　ＲＮ　Ａ　（７）　５’−非
翻訳配列ヲコードＴるｃ、ＤＮＡ［１月ζあり、Ｂａｌ
　Ｉ切断はＣＤＮＮｆ）３′−非翻訳配列をコードする
ｃＤＮＡ中にある。
（３）各々ｂＧＨポリアゾニレージョン部位を含む２つ
のフラグメントをつぎのようにして得る。
（ａ）ｐｓＶｃ：ＯＷ７からのＰｖｕ　ＩＩ　／　Ｅｃ
　ｏ　ＲＩフラグメント（式１１［）。これは、ｂ　Ｇ
　Ｈ遺伝子の３′最大エクンン中のｐｖｕ　ｎ部位から
、３′−末端から下流のＥｃｏＲＩ部位まで伸長する全
ウシＤＮＡである。
（ｂ）　ｐ　Ｓ　Ｖ　ＣＯＷ　７かうｔｙ）　Ｐｓｔ　
１／Ｅｃｏ　Ｒ１７５グメント（弐■）。これは、ｂ　
Ｇ　Ｉｆ遺伝子の第４エクソン中のＰｓＬ　１部位から
、３′−末端から下流のＥｃｏ　Ｒ１部位まで伸長する
全ウシＤＮＡである。
前記フラグメント（１）　−（２）　−（３１（ａ）お
よび（１）　−１２１−（３１（１））　ノ結紮結果は
、各々、つぎの２つのプラスミドである。
（ａ）　ＰＴＰＡ−ＰＡ−ｄ　ｈ　ｆ　ｒ　（式ＸＶＩ
Ｉ　）ｏ　　これは、その３’末端に結紮したｂＧ［Ｉ
ポリアゾニレ−ジョン領域を有するＬ　ＰＡ　ｃＤＮＡ
を含有する。
（ｂ）　ｐＴＰＡ　−Ｉ　ＰＡ　−ｄ　ｈ　Ｅ　ｒ　（
式ｘｖｕｔ）。コレは、その３′末端に結紮した、イン
トロンを含む、ｂｃｕ遺伝子の３′−末端からのより長
いセグメントを有するｔＰＡｃＤＮＡを含む。
式（ｘｖｎ）および式（ｘｖｍ）両方のプラスミド共に
ＬＰＡｃＤＮＡ　　の５′−末端に特符のＢａｍＨＩ開
裂部位を含む。
Ｂ、工程２（チャートＥ参照） 工程１で調製した両方のプラスミドをＢａｍｔｌｌで開
裂し、ＣＭＶ即者切者初期プロモーター有する５ａｕ３
ＡＩ　　フラグメントをＢ　ａ　ｍ　ｔｌ　１部位に結
紮する。プロモーターからの転写がＬＰＡに対するＩｎ
　ＲＮ　Ａを合成Ｔるような方向で挿入フラグメントを
含有するプラスミドをＳａｃ　Ｉ　　による開裂で同定
する。得られるプラスミドはつぎのとおりである。
（ａ）　ＣＭ　Ｖプロモーターを５′−末端に、ｂ　Ｇ
　Ｈポリアゾニレ−ジョン・シグナルをその３’　−末
端１ｃ有するｔ　ＰＡｃＤＮＡを含有するｐｌＥＴＩ’
Ａ−ＰＡ−ｄｈｆｒ（式刈り。
（ｂ）　ｂ　Ｇ　Ｈ遺伝子の３′−末端からのより長い
片をン　　　　　　含み、イントロンを含む以外はＬａ
）と同じｐｌＥＴＰＡ−Ｉ　ＰＡ−ｄｈ　Ｅ　ｒ　（式
ｘＩ）。
実施例２ 細胞へのトランスフェクション 前記実施例１、工程２から誘導された両方のプラスミド
を、通常のトランスフェクション技術を用いてジヒドロ
葉酸塩レダクターゼ（ｄｈｒｒ）欠損チャイニーズ・ハ
ムスター卵巣（Ｃ１［０）＆Ｉ［ｌ胞にＤＮＡ感染させ
る。この細胞系はエル・カシン、コロンビア大学（Ｌ、
（：１１ａｓｉｎ、Ｌ：ｏｌｕｍｌ）ｉａ　Ｕｎｉｖ、
）プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエｉ−オブ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）７７　
：　４２１６−４２２０（１９８０）からのｇＪ％ＤＸ
Ｂ−１１である。
このトランスフェクション法は、グラハムら、イントロ
ダクション・オブ・マクロモレキュール・インツウ・バ
イアプル・マンマリアン・セルズ、Ｔラン・アール・リ
ス・インコーホレーテッド、ニューヨーク（Ｇｒａｈａ
ｍ　ｅｔ　ａｌ　、　、　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔ　１ｏｎ
ｏ［Ｎ（ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１ｎｔｏ　Ｖｉ
ａｌ）ｌｅ　Ｍａｒｓ＋ｒｕｌｉａｎＣｅｌｌｓ、Ａｌ
ａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、１ｎｃ、、Ｎ、Ｙ、）　　１９８
０　、　　　　　　　。
ＰＰ３〜２５に詳細に記ａされている、Ｉ）　Ｎ　Ａの
細胞中への、リン酸カルシウム−トランスフェクション
を用いる。ＤＮＡ感染プラスミド？取り込んだ細胞を、
プロリン加ダルベツコ修飾イーグル培地中での増殖番こ
よりｄｂｆｒ欠損に基いて選択する。
チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞は前記で得られた式
（Ｘ）および式（刈りの化合物のようなプラスミドに用
いるのに特に適しているが、該ＬＰ八へ伝子発現中の（
：ＭＶ　　１．Ｅ、プロモーターおよびＬ＋ＧＩＩボリ
アデ二レーショし部位の使用はこれらのプラスミド上の
ｄｌｘ［ｒマーカーの使用に依存するものではない。ｃ
ＤＮΔ遺伝子の発現は、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性
を与える遺伝子〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・ア
ンド・Ｔブライド・ジエネテイツク７．　（Ｊ　、Ｍｏ
ｌ　、Ａｐｐｌ　、Ｇｅｎｅｔ　、）１：３２７〜３４
１（１９８２）’）のような別の選択可能マーカーを用
い、引ｔａｒマーカーの代りに他のマーカーを有する他
の細胞系でも得られる。
したがって、そのような置換は訪プラスミドに対Ｔる宿
主として多くの別の細胞系の使用を可能番こＴる。
実施［５’ｌＪ　３ ｔＰＡ発現 ｐ　Ｉ　ＥＴＰＡ−ＰＡｄ　ｈ　ｆ　ｒ　でＤＮＡ感染
させた細胞からクローンを単離し、単層で２日間増殖さ
せ、少なくとも１６　ｇ　ｎｙ　　ｔ　ＰＡ／１００万
則胞を合成する。ｐ　ｌ　ＥＴＰＡ　−１ｉ’ａ　−ｄ
　Ｉｉ　ｆ　ｒを用いた細胞から、クローンを単離し、
少なくとも１０　ＹＬ’Ｊ　　ｔ　ＰＡＡＯＯ万細胞を
合成する。
したがって、本発明は伝令ＲＮＡの必要なポリアゾニレ
−ジョンを得る方法、ことに、予め選択したポリペプチ
ドをコードするｃＤＮＡ遺伝子からの転写方法を提供Ｔ
る。これにより、高等真核生物細胞における発現にその
ようなＣυＮＡの使用が可能となり、ことに、驚くべき
ことに、また、意外にも、高収率が得られることが川明
した。
前記の好ましい具体例に加え、もつとも好ましくは、ｂ
ｃｔｔポリアゾニレ−ジョン・シグナルはっぎのヌクレ
オチド配列： ５’　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　、（。
に’　Ｉ　ＣＣｒ　１　’　Ｉ　ｕ：ｌ　’へへ’ｌ−
Ａへへへ’　ｌ　Ｇ　Ａ（Ｊ（ＪへへＡ　Ｉ　’　ｌ　
’ＧにＡ’　ｌ　シＧ（：Ａ’　Ｉ　’　ｌ　（ｐ’　
ｌ　ｃ田へ（Ｊ　ｌ　’Ａ（λｓＩ　Ｕ　ｌ　’に（＋
−フ およびその機能的均等物からなる。「機能的均等物」な
る語は該ヌクレオチド配列；こよって示される化合物と
実質的に同じ生物学的役割を果丁が、その１つ以上のヌ
クレオチドが、例えば、１つのヌクレオチドが他のもの
で置換されること（こよって修飾されているヌクレオチ
ド配列を意味する。
このもつとも好ましい具体例は前記した一般的な方法、
すなわち、ｂ　Ｇ　Ｈｇ　Ｄ　Ｎ　Ａの消化および／ま
たは化学的合成により調製できる。
式（Ｌ）のｂ　Ｇ　Ｈホリアデニレーション・シグナル
はつぎのようにして得られる。その３′−フランキング
配列の４００１）Ｌ’　と共に、全ウシ生長ホルモン遺
伝子を含む２，２　Ｋｂ　　ｌ５ａｎｔｌｌｌ／Ｅｃｏ
Ｒ１制限フラグメントを含有するプラスミドＩ）ＳＶＢ
３／鳳Ｓａをピー・ニスーｚイ・ニス（ＰＮＡＳ）８に
、。
３９４４〜３９４８（１９８４年７月〕り記載に１　　
　　　　従′１製す６・６囲０配列０一連０欠失を作り
・野生型ｂ　Ｇ　１１３’−末端の正確な、効率よい生
産を可能とする最少の光分なポリアゾニレ−ジョン配列
を得る。この欠失は２工程で生じさせる。一連のＢａｌ
　−３１欠失が、ｂ　ｃ　ｔｔをコードするヌクレオチ
ドとｐＢＲ３２２配列の接合点におけるＥｃ。
Ｒ１部位からポリアゾニレ−ジョン部位の３′−末端方
向の上流に向って伸長している。該ポリアゾニレ−ジョ
ン・シグナルの５’−境ＷはＰＳＶＢ３　／Ｂａクロー
ン中の５…ａ１部位を利用して同様に規定できる。野生
型３′−末端を生じる欠失は３　’−１３Ｇ　Ｈ−特定
配列の５２ヌクレオチドを含有し、ヘキサヌクレオチド
ＡＡＴＡＡＡから１０ヌクレオチド上流まで伸長してい
る。チャートＦはこれらの欠失の実験的詳細を示す。一
般的操作は公知の方法で行なわれる。前記、マニアチス
らの「モレキュラー・クローニング：ラボラトリ−・マ
ニュアル」参照。
欠失の大きさはサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシ塩
基配列決定で行なわれる。各欠失変異体のポリアゾニレ
−ジョンの正確さは、リン酸カルシウム沈澱によるにａ
ｓ−１細胞のトランスフェクション。
ついで、一時的番こ発現されたＡ＋ＲＮＡの５４ｔｌｋ
図作成により決定される。各欠失の野生型（ｐｓＶＢ３
／１ｓａ）と比較したポリアゾニレ−ジョン効率を同じ
Δ十ＲＮＳのノーザン・プロット分析で概略決定する。
式（Ｌ）で示すように、ポリアゾニレ−ジョン・シグナ
ルは５２ヌクレオチドからなるポリアゾニレ−ジョンを
正確に、効率よく指令し、ヘキサヌクレオチドＡ　Ａ　
Ｔ　Ａ　Ａへの１０ヌクレオチド上流から、ポリアゾニ
レ−ジョン部位の１８ヌクレオチド下流までを含む。式
（Ｌ）において。
ヘキサヌクレオチドおよびポリ・アゾニレ−ジョン部位
に下線を付している。
実施例４ 実施例ＩＡの操作において、フラグメント（１）および
（２；を式（Ｌ）のヌクレオチド配列で結紮すると、Ｌ
Ｉ’Ａｃ１）ＮＡ　を含有するｐＴＩ’Ａ−５２１’八
−ｄｌｌ［ｒ　（，４〆Ｌ〕と定義されるプラスミドが
得られ、これは、その３′末端に結紮された式（Ｌ）の
５２ヌクレオチド塩基対ポリアゾニレ−ジョン領域を有
Ｔる。
実施例ＩＢの操作において、前記で得られたプラスミド
を式（ＸＶｌりおよび（ＸＶｌｌりのプラスミドの代り
に用いて、プラスミドｐ　ｌ　ＥＴＩ’Δ−５２ＰＡ−
ｄｈ［ｒ（式ＸＬＩ）が得られる。これは、５′−末端
にＣＭＶプロモーターおよび３′−末端に式（■−）の
５２塩基ヌクレオチドｂＧ１１ポリアゾニレ−ジョン・
シグナルを有するｔＰＡｃＪ）ＮＡを含有Ｔる。
実施例２および３の操作において、式（Ｘｌ）および（
ＸＩＩ　）のプラスミドの代りに式（ＸＬ　１　）　　
のプラスミドを用い、一般的方法を行なうと、ＬＰＡの
発現が達成される。
工 ρ α 用いた記号 １３１３１３ＢＢ＝　ｌバ２１１ポリアデニレート・ン
グナル、関連ヌクレオチド含イｉ　ｉ’Ｕ。
１１°ＦＦ　ＩＩ″Ｆ：予め選択したポリベプナドｔコ
ードするヌクレオナト。
■晶ＷＭ＝所蹟により選択できるマーカー。
（ｉ（３０００＝ゲノムｂ　（１ｔｔヌクレオナト、た
た゛し、もしあれば、ｂ　（３Ｈポリアゾニレ−ジョン
・ングナルおよび［１３Ｊ領域のような関連ヌクレオナ
ト金除く。
注〕：ｐλ（、ｌ−１２１Ｌｚはイー・コリー１８１υ
１宿主、ＮＫＩ山Ｂ−１５１５４から由来てるデヲスミ
ド。
１）８ＶｚｄＨ１（、ｆｌ、ニス・サブヲマニラ、モレ
キュツー・アンド・セ／Ｖヲー・バイオロジー（８＋８
ｕｂｒａｒｎａｎｉ、　　ｅＬ　　　ａｌ　＋、６１ｏ
１ｃｃｕｌａｒ　　　ａｎｉ１Ｃｃ目ｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）　２：８５４−８６４（１９８１年９月ンの
方法で調製したデヲスミド。
用いた記号 ＩＪＩＪＢ１３Ｂ　＝＝　ＩＪ（ＪｕボリアデニＶ−ト
・シグナル、関　　　　。
連ヌクレオナト含イＪ−’Ｕｏ　　　　　　　　　　　
　　　４１／ｌ＋’　ｌ’　Ｆｌｊ’　＝予め選択した
ポリペプナド金コードする　　　　七番 ヌクレオチド。
Ｍ姉昂臥＝所望により選択できるマーカー。
（３（］（ＩＧＧ　＝ゲノム１ン（ｌ　Ｉｔヌクレオナ
ト、ただし、もしあれば、ｌ）　（１１１ポリアゾニレ
−ジョン・シグナｌしおよび「Ｌ３Ｊ領域のような関連
ヌクレオチド金除く。
（ＸＸ）００　＝　ｄｌ＋　［ｒ　＋Ｑ仏子乙記号 二ＩＧＧＧＧ−イントロン（ｍ〕含有ゲノムｌ＋（］］
１１遺区子ＴｈＧＧ−ケノム１ＪＯ１１ｉ１１伝子イン
トロンなしノボＴ　　雷しＰＡ　　遺伝子 ’ＰＰ　　　　−ＣＭＶ　１．Ｅ、）１０モーター〕０
０　　−ｄｈｆ”ｒ遺伝モ 用いる記号 ＧＧＧＩ　Ｉ　Ｉ　ＧＧＣＧ−イツトａ：ｙ（ｍ）含有
ゲノムｌ＋（Ｈ１遺ｗ＝ｒ−ＧＧＧＧＧＧＧ　　　−ゲ
ノムｂ　ＯＨ遺伝子（イントロンなしＪＴＴＴＴＴＴＴ
　　　　−ｔ、ＰＡ　　遺区子ＰＰＰＰＰＰＰ　　　　
−ＣＭＶ　　１．Ｅ、　　プロモーター０００００００
　　　−ｄｈｆｒ遺１ム子シく ωｙ 用いる記号 ＧＧＧＩ　Ｉ　Ｉ　ＧＧＣＧ−イントロン（ｉｎ７含有
ゲノムｂ（１１１遺云子ＧＧＧＧＧＧＧ　　　−ゲノム
ｂ（用遺伝子（イントロンないＴＴＴＴＴＴＴ　　　　
　　−ｕＰＡ　　ｉｉｔ［ｚ：子ＰＰＰＰＰＰＰ　　　
−ＣＭＶ　１．Ｅ、ブロモ−ター０００００００　　−
ｄｈｆ’ｒ遺伝子ζ η −〉 」 イ　　　　　　　　　　　　　　　　Ｘｎ　　　　　　
　　　　　試 田 ｎｔ　　４　　−１ チャートＦ（つづき］ 式ＸＬＶ ↑ Ｓｍａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＢａｍＨＩＬＶＩＩＩ 式ＸＬＶＩＩ　　　　　　　式ＸＬＶＩＩＩＶＩ１０ ０ｒｉ　　　　　　　　　　ＢａｍＨＩＳｍａ　　　　
　　　　３に、　ＸＬ”−−−Ｂａｌ　３１欠失を示す 手続補正書（自１ 昭和６０年１１月８瓢

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、アルファベットのくり返し配列はつぎの意味を
    有し、式中におけるそのくり返しの数は任意に示してあ
    る。 「Ｂ」領域は、その配列がｂＧＨポリアデニレーション
    ・シグナルを含むヌクレオチドからなる。 「Ｆ」領域は、その定められたコドンがゲノムおよび他
    のイントロン含有形を含め、ｂＧＨ以外の予め選択した
    ポリペプチド合成用の遺伝子を含むヌクレオチドからな
    る。 「Ｐ」領域は、その配列が該遺伝子の転写を開始する能
    力を有するプロモーターを含むヌクレオチドからなる。 「Ｍ」領域は、その配列が、選択可能なマーカーを含有
    する所望のヌクレオチドからなり、該マーカーは、ＤＮ
    Ａ化合物が生細胞の発現遺伝物質に取り込まれることに
    より、取り込みが起つた細胞を選択するために利用でき
    る。〕 で示される環状組換型ＤＮＡ化合物およびその非環状型
    。
  2. （２）「Ｐ」領域がＣＭＶ　Ｉ．Ｅ．プロモーターから
    なる前記第（１）項の化合物。
  3. （３）「Ｂ」領域が、第４イントロンから上流のコドン
    中のＰｓｔＩ（平滑末端）開裂部位から、下流のもつと
    も近いＥｃｏＲＩ開裂部位までのｂＧＨｇｌ）ＮＡヌク
    レオチド配列からなる前記第（２）項の化合物。
  4. （４）「Ｂ」領域が、第４イントロンから下流のコドン
    中のＰｖｕＨ開裂部位から、下流のもつとも近いＥｃｏ
    ＲＩ開裂部位までのｂＧＨｇＤＮＡヌクレオチド配列か
    らなる前記第（２）項の化合物。
  5. （５）「Ｂ」領域がつぎのｂＧＨｇＤＮＡヌクレオチド
    配列： 【遺伝子配列があります】（Ｌ） からなる前記第（２）項の化合物。
  6. （６）「Ｆ」領域がｔＰＡｃＤＮＡ遺伝子からなる前記
    第（５）項の化合物。
  7. （７）（ａ）前記第（１）項の化合物をその発現遺伝物
    質中に取り込ませた高等真核生物細胞または細胞系を培
    養し、 （ｂ）予め選択したポリペプチドを回収する、ことを特
    徴とする予め選択したポリペプチド発現のための前記第
    （１）項の化合物の使用方法。
  8. （８）予め選択したポリペプチドがｔＰＡである前記第
    （７）項の方法。
  9. （９）該化合物の「Ｂ」領域がつぎのｂＧＨｇＤＮＡヌ
    クレオチド配列： 【遺伝子配列があります】（Ｌ） からなる前記第（７）項の方法。
  10. （１０）その発現遺伝物質が前記第（１）項のＤＮＡ化
    合物からなる高等真核生物細胞または細胞系。
  11. （１１）前記第（１）項のＤＮＡ化合物がｔＰＡを発現
    する前記第（９）項の細胞または細胞系。
  12. （１２）前記第（１１）項の細胞系を培養することを特
    徴とするｔＰＡの製法。
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Families Citing this family (187)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3676604D1 (de) * 1985-03-22 1991-02-07 Chiron Corp Expression von epa in saeugetierzellen.
US5108909A (en) * 1985-03-22 1992-04-28 Chiron Corporation Expression of TPA in mammalian cells
US4935352A (en) * 1985-10-21 1990-06-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Expression vector for animal cell line and use thereof
CA1297435C (en) * 1986-09-12 1992-03-17 Stephen D. Gillies Messenger rna stabilization in animal cells
AU613876B2 (en) * 1986-10-01 1991-08-15 Merck & Co., Inc. Synthetic genes encoding proteins from plasmid containing eucaryotic secretory signal peptides and process for secreting encoded proteins
PT86162B (pt) * 1986-11-21 1990-11-20 Smithkline Beecham Corp Expressao de proteina recombinante
ZA879286B (en) 1986-12-16 1988-10-26 Smith Kline Rit New plasminogen activators
GB8717430D0 (en) * 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
CA2196991A1 (en) * 1994-10-06 1996-04-18 Warner-Lambert Company Method of using a scavenger receptor in the treatment of atherosclerosis
US5641665A (en) * 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
WO1997046589A2 (en) * 1996-06-07 1997-12-11 Neorx Corporation Humanized antibodies that bind to the same antigen as bound by antibody nr-lu-13, and their use in pretargeting methods
US5846946A (en) * 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
US6156567A (en) * 1996-07-03 2000-12-05 Merial Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters
US20060235209A9 (en) * 1997-03-10 2006-10-19 Jin-An Jiao Use of anti-tissue factor antibodies for treating thromboses
US20030109680A1 (en) * 2001-11-21 2003-06-12 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US5986065A (en) * 1997-03-10 1999-11-16 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US7749498B2 (en) * 1997-03-10 2010-07-06 Genentech, Inc. Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
KR100382720B1 (ko) * 2000-08-30 2003-05-09 삼성전자주식회사 반도체 식각 장치 및 이를 이용한 반도체 소자의 식각 방법
FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2004-02-06 Merial Sas Vaccin contre le virus de la fievre du nil
WO2003031588A2 (en) 2001-10-11 2003-04-17 Merck & Co., Inc. Hepatitis c virus vaccine
DE60236364D1 (en) 2001-10-11 2010-06-24 Angeletti P Ist Richerche Bio Hepatitis-c-virus-impfstoff
US20030190705A1 (en) * 2001-10-29 2003-10-09 Sunol Molecular Corporation Method of humanizing immune system molecules
CA2469491A1 (en) 2001-12-12 2003-06-19 Kerrie Setiawan Composition for viral preservation
CA2470579C (en) * 2001-12-17 2012-03-06 Crucell Holland B.V. Production of f(ab')2 fragments in mammalian cells
MXPA05003049A (es) 2002-09-19 2005-11-17 Us Gov Health & Human Serv Polipeptidos de phlebotomus ariasi, polipeptidos de phlebotomus perniciosus y metodos de uso.
ES2447843T3 (es) 2002-10-29 2014-03-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Polip�ptidos de Lutzomyia longipalpis y m�todos de uso
US7384744B2 (en) * 2002-11-29 2008-06-10 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products
DE10256083A1 (de) 2002-11-29 2004-08-12 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen
US7468273B2 (en) 2003-05-01 2008-12-23 Meial Limited Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use
JP5114055B2 (ja) * 2003-06-19 2013-01-09 ジェネンテック， インク． 障害に関連する凝固の治療用組成物および方法
DE10338531A1 (de) 2003-08-19 2005-04-07 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Reklonierung von Produktionszellen
US20050064547A1 (en) * 2003-09-24 2005-03-24 Brown Arthur M. Vectors and transfected cells
GB0324044D0 (en) * 2003-10-14 2003-11-19 Astrazeneca Ab Protein
GB0330079D0 (en) * 2003-12-20 2004-02-04 Bioinvent Int Ab Vaccine
WO2005073384A2 (en) * 2004-01-28 2005-08-11 Research Development Foundation Human soluble neuropilin-1 primary polyadenylation signal and uses thereof
US20060040354A1 (en) * 2004-07-20 2006-02-23 O'keefe Theresa L Novel polyadenylation signal for use in expression vectors
MX2007012704A (es) * 2005-04-13 2008-01-14 Astrazeneca Ab Celula huesped que comprende vector para la produccion de proteinas que requieren carboxilacion-gamma.
ES2343270T3 (es) 2005-04-25 2010-07-27 Merial Ltd. Vacunas contra el virus nipah.
EP1893636A2 (en) 2005-06-17 2008-03-05 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Hepatitis c virus nucleic acid vaccine
US20080241184A1 (en) 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
US7771995B2 (en) 2005-11-14 2010-08-10 Merial Limited Plasmid encoding human BMP-7
US7598364B2 (en) 2005-11-14 2009-10-06 Merial Limited Plasmid encoding canine BMP-7
EP1996705B1 (en) * 2006-03-20 2011-08-31 ChromaGenics B.V. Expression augmenting dna fragments, use thereof, and methods for finding thereof
GB0606190D0 (en) 2006-03-28 2006-05-10 Isis Innovation Construct
EP2019687B1 (en) 2006-03-29 2014-03-19 Merial Limited Vaccine against streptococci
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
US20080124760A1 (en) 2006-07-26 2008-05-29 Barbara Enenkel Regulatory Nucleic Acid Elements
DE102006039003A1 (de) 2006-08-19 2008-02-21 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Verbindungen
JP2010525812A (ja) 2007-05-02 2010-07-29 メリアル リミテッド 発現及び安定性が改善されたｄｎａプラスミド
US8206967B2 (en) * 2007-07-06 2012-06-26 Medimmune Limited Method for production of recombinant human thrombin
EP2025675A1 (de) 2007-08-14 2009-02-18 Boehringer Ingelheim International GmbH Arylsulfonamide mit analgetischer Wirkung
AU2008288431A1 (en) 2007-08-14 2009-02-19 Boehringer Ingelheim International Gmbh New compounds
FR2920158B1 (fr) * 2007-08-24 2010-03-12 Centre Nat Rech Scient Production de plasmides et expression de proteines recombinantes dans des cellules cultivees sans antibiotiques
US8389238B2 (en) * 2007-09-12 2013-03-05 Copernicus Therapeutics, Inc. Long-term in vivo transgene expression
MX2010012069A (es) 2008-05-08 2010-12-14 Merial Ltd Vacuna de la leishmaniasis con el uso del inmunogeno salival de la mosca de la arena.
MY156855A (en) 2008-07-23 2016-04-15 Boehringer Ingelheim Pharma Novel regulatory elements
KR101715415B1 (ko) 2008-11-28 2017-03-10 메리얼 인코포레이티드 재조합 조류 인플루엔자 백신 및 그의 용도
CN102428099B (zh) 2009-04-03 2016-03-16 梅里亚有限公司 运载新城疫病毒的禽疫苗
WO2010135742A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 Merial Limited Antibiotic-free plasmid
KR20120101572A (ko) 2009-12-28 2012-09-13 메리얼 리미티드 재조합 ｎｄｖ 항원 및 이의 용도
US20130197612A1 (en) 2010-02-26 2013-08-01 Jack W. Lasersohn Electromagnetic Radiation Therapy
WO2011112945A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 Merial Limited Foot and mouth disease virus recombinant vaccines and uses thereof
EP2611460B1 (en) 2010-08-31 2016-10-05 Merial, Inc. Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines
CN103118702A (zh) 2010-09-20 2013-05-22 克鲁塞尔荷兰公司 活动性结核病的治疗性接种
WO2012041669A1 (en) 2010-09-27 2012-04-05 Crucell Holland B.V. Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria
CA2864394C (en) 2011-03-02 2021-10-19 Jack Roth A method of predicting a response to a tusc2 therapy
WO2012145577A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Merial Limited Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile
US20120301479A1 (en) 2011-05-27 2012-11-29 Jean-Christophe Audonnet Hendra virus recombinant compositions and uses thereof
ES2674439T3 (es) 2011-06-01 2018-06-29 Merial, Inc. Administración sin aguja de vacunas contra el VSRRP
CN103957932B (zh) 2011-07-20 2017-06-23 梅里亚有限公司 包含最优化的猫白血病病毒包膜基因的重组猫白血病病毒疫苗
BR112014013597A2 (pt) * 2011-12-07 2020-08-18 Glenmark Pharmaceuticals S.A. cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, método in vitro para expressão de um polipeptídeo e uso de um cassete de expressão ou vetor de expressão
RU2639519C2 (ru) 2011-12-22 2017-12-21 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Комбинации элементов экспрессионного вектора, новые способы получения клеток-продуцентов и их применение для рекомбинантного получения полипептидов
KR102280111B1 (ko) 2011-12-22 2021-07-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 발현 벡터 구성, 신규한 생산 세포 생성 방법 및 폴리펩티드의 재조합 생산을 위한 그의 용도
WO2013123242A1 (en) 2012-02-14 2013-08-22 Merial Limited Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and ox40 proteins, and vaccines made therefrom
EA034564B1 (ru) 2012-02-14 2020-02-20 Мериал, Инк. Ротавирусная субъединичная вакцина, способ ее получения и применение
US8932607B2 (en) 2012-03-12 2015-01-13 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
CA2864956C (en) 2012-03-12 2021-11-09 Crucell Holland B.V. Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends
WO2013142371A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Merial Limited Recombinant equine herpesvirus-1 vaccine containing mutated glycoprotein c and uses thereof
CN104334188B (zh) 2012-03-22 2016-08-24 克鲁塞尔荷兰公司 抗rsv疫苗
US9119813B2 (en) 2012-03-22 2015-09-01 Crucell Holland B.V. Vaccine against RSV
MX364875B (es) 2012-06-13 2019-05-09 Univ Glasgow Court Vacunas para btv y ashv reclasificantes.
WO2014102103A2 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Heterologous intron within a signal peptide
WO2014102101A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Novel intron sequences
JP6809789B2 (ja) 2013-01-17 2021-01-06 メディツィーニシェ・ホーホシューレ・ハノーファーＭｅｄｉｚｉｎｉｓｃｈｅ Ｈｏｃｈｓｃｈｕｌｅ Ｈａｎｎｏｖｅｒ 疾患の治療または予防に用いるためのファクター１およびファクター２タンパク質、およびその阻害剤
AU2014259474B2 (en) 2013-04-25 2018-09-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides
US9989540B2 (en) 2013-05-10 2018-06-05 The Regents Of The University Of California Diagnostic and monitoring system for Huntington's disease
MY171210A (en) 2013-06-17 2019-10-02 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
EP3068783B1 (en) 2013-11-15 2020-09-23 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Agonists of hypocretin receptor 2 for use for treating heart failure
US10010499B2 (en) 2014-11-03 2018-07-03 Merial Inc. Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
MA40902B1 (fr) 2014-11-04 2018-12-31 Janssen Vaccines & Prevention Bv Vaccins hpv16 thérapeutiques
KR102527180B1 (ko) 2014-12-10 2023-04-27 옵코 바이오로직스 리미티드 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법
EP3283634B1 (en) 2015-04-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
MX2017016895A (es) 2015-06-23 2018-04-10 Merial Inc Vectores virales recombinantes que contienen la proteina menor del virus del sindrome reproductor y respiratorio porcino (prrsv) y sus metodos de elaboracion y uso.
WO2017005844A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
CN107847581B (zh) 2015-07-07 2022-03-22 扬森疫苗与预防公司 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽
WO2017029360A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv18 vaccines
NZ740551A (en) 2015-08-20 2019-10-25 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Fcv recombinant vaccines and uses thereof
AU2016316723B2 (en) 2015-09-02 2021-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized viral class I fusion proteins
CN108348594B (zh) 2015-09-29 2022-09-09 勃林格殷格翰动物保健美国公司 犬科动物细小病毒(cpv)病毒样颗粒(vlp)疫苗及其用途
KR102153303B1 (ko) 2015-11-23 2020-09-09 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드 Fmdv 및 e2 융합 단백질 및 이의 용도
US10612005B2 (en) 2016-01-08 2020-04-07 Replimune Limited Modified oncolytic virus
TWI760322B (zh) 2016-01-29 2022-04-11 美商百靈佳殷格翰動物保健美國有限公司 重組腺病毒載體裝載之fmdv疫苗及其用途
IL262108B2 (en) 2016-04-05 2023-04-01 Janssen Vaccines Prevention B V Soluble pre-fusion rsv f proteins are stabilized
WO2017174564A1 (en) 2016-04-05 2017-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
US10517944B2 (en) 2016-05-02 2019-12-31 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic HPV vaccine combinations
KR102573534B1 (ko) 2016-05-12 2023-08-31 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터
WO2017207477A1 (en) 2016-05-30 2017-12-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv f proteins
WO2017207480A1 (en) 2016-05-30 2017-12-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv f proteins
US11001858B2 (en) 2016-06-20 2021-05-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
CA3030533A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 Oren HERSHKOVITZ Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same
WO2018035411A1 (en) 2016-08-18 2018-02-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Production and use of phosphoethanolamine cellulose and derivatives
CN110225975A (zh) 2016-08-23 2019-09-10 阿库斯股份有限公司 用于治疗人受试者中非年龄相关的听力损害的组合物和方法
BR112019005516A2 (pt) 2016-09-20 2019-06-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh novo sítio de inserção do ehv orf70
JP6951429B2 (ja) 2016-09-20 2021-10-20 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハーＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ ＧｍｂＨ 新規のブタインフルエンザワクチン
US10329586B2 (en) 2016-09-20 2019-06-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Canine adenovirus vectors
CA3036293A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh New promoters
GB201700350D0 (en) 2017-01-09 2017-02-22 Replimune Ltd Altered virus
WO2018146205A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
JOP20180027A1 (ar) 2017-03-28 2019-01-30 Cell Design Labs Inc بوليبيبتيدات مخلطة و طرق لتغيير موضع الغشاء فيها
JP2020519663A (ja) 2017-05-17 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． Ｒｓｖ感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物
MA49565A (fr) 2017-07-11 2020-05-20 Compass Therapeutics Llc Anticorps agonistes qui lient cd137 humain et leurs utilisations
MX2020002876A (es) 2017-09-15 2020-07-22 Janssen Vaccines & Prevention Bv Metodo para la induccion segura de inmunidad contra el vsr.
BR112020005767A2 (pt) 2017-09-23 2020-10-13 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh sistema de expressão de paramyxoviridae
EP3694536A4 (en) 2017-10-12 2021-08-18 The Regents of The University of California CELL-BASED IMPFASSAY FOR THE HUNTINGTON AGGREGATION
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
CN112041486A (zh) 2017-12-11 2020-12-04 鲍鱼生物股份有限公司 周质空间中蛋白质的酵母展示
BR112020012336A2 (pt) 2017-12-19 2021-03-30 Akouos, Inc. Administração de anticorpos terapêuticos mediada por aav para o ouvido interno
US20190194617A1 (en) 2017-12-22 2019-06-27 Cell Design Labs, Inc. Single- and multi-chain chimeric antigen receptors
MX2020008779A (es) 2018-02-23 2020-10-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sistemas de vectores virales recombinantes que expresan genes de paramixovirus felino exogenos y vacunas elaboradas a partir de estos.
CN111867625B (zh) 2018-03-19 2024-09-17 勃林格殷格翰动物保健有限公司 具有失活ul18和/或ul8的新ehv
CN111867637B (zh) 2018-03-19 2024-05-03 勃林格殷格翰动物保健有限公司 新ehv插入位点ul43
SG11202011751WA (en) 2018-06-22 2021-01-28 Kite Pharma Inc Chimeric transmembrane proteins and uses thereof
US10905758B2 (en) 2018-09-20 2021-02-02 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Intranasal vector vaccine against porcine epidemic diarrhea
JP2022520139A (ja) 2018-10-12 2022-03-29 セラダプティブ インク β－リン酸三カルシウム結合配列を含むポリペプチドとその使用
MX2021005594A (es) 2018-11-13 2021-10-22 Compass Therapeutics Llc Constructos multiespecificos de union contra moleculas de puntos de control y usos de los mismos.
EA202191355A1 (ru) 2018-11-13 2021-09-20 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Стабилизированные f-белки rsv до слияния
WO2021021674A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Akouos, Inc. Methods of treating hearing loss using a secreted target protein
GB201913974D0 (en) 2019-09-27 2019-11-13 King S College London Vector
BR112022014272A2 (pt) 2020-01-21 2022-09-20 Boehringer Ingelheim Int Fator de crescimento derivado de mieloide para uso no tratamento ou prevenção de fibrose, hipertrofia ou insuficiência cardíaca
AU2021225035A1 (en) 2020-02-21 2022-10-13 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating non-age-associated hearing impairment in a human subject
TW202144579A (zh) 2020-04-09 2021-12-01 美商４Ｍｖａｃ有限責任公司 病毒載體在冠狀病毒疫苗生產的用途
CN116096409A (zh) 2020-05-11 2023-05-09 杨森制药公司 编码稳定化的冠状病毒刺突蛋白的rna复制子
AU2021272741A1 (en) 2020-05-11 2023-02-02 Janssen Pharmaceuticals, Inc. SARS-CoV-2 vaccines
MX2022014162A (es) 2020-05-11 2023-02-23 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteínas de fusión de la proteína de la espícula del coronavirus estabilizadas.
US20230212606A1 (en) 2020-05-13 2023-07-06 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating kcnq4-associated hearing loss
US20230201372A1 (en) 2020-05-13 2023-06-29 Akouos, Inc. Compositions and methods for treating slc26a4-associated hearing loss
GB202009039D0 (en) * 2020-06-15 2020-07-29 Univ Bristol Therapy
BR112022026408A2 (pt) 2020-06-29 2023-01-17 Janssen Vaccines & Prevention Bv Combinação vacinal contra infecção pelo vírus sincicial respiratório
MX2023000373A (es) 2020-07-06 2023-02-13 Janssen Pharmaceuticals Inc Proteinas de fusion de proteinas de la espicula de coronavirus estabilizadas.
JP2023533528A (ja) 2020-07-08 2023-08-03 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・アンリミテッド・カンパニー Ｈｂｖに対するｒｎａレプリコンワクチン
CN116157147A (zh) 2020-07-24 2023-05-23 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 组合猪疫苗
WO2022101679A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh New feline herpes virus vaccine
MX2023006451A (es) 2020-12-01 2023-06-15 Akouos Inc Construcciones de anticuerpos anti-vegf y metodos relacionados para el tratamiento de los sintomas asociados al schwannoma vestibular.
TW202245809A (zh) 2020-12-18 2022-12-01 美商詹森藥物公司 用於治療b型肝炎病毒感染之組合療法
TW202241935A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 美商世紀治療股份有限公司 具有可調適受體專一性之嵌合抗原受體系統
EP4267740A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Arcturus Therapeutics, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
MX2023007800A (es) 2020-12-29 2023-07-11 Akouos Inc Composiciones y metodos para tratar la perdida de audicion y/o la perdida de vision asociada a clrn1.
JP2024509756A (ja) 2021-02-19 2024-03-05 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 安定化された融合前ｒｓｖ ｆｂ抗原
WO2022175479A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine combinations against respiratory syncytial virus strain a and b infections
US20240197859A1 (en) 2021-04-01 2024-06-20 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized Pre-Fusion PIV3 F Proteins
WO2023047348A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized corona virus spike protein fusion proteins
WO2023047349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Stabilized coronavirus spike protein fusion proteins
MX2024003778A (es) 2021-09-30 2024-04-10 Akouos Inc Composiciones y metodos para el tratamiento de la perdida de audicion asociada a kcnq4.
WO2023070072A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Retroelement-generated transcription factor decoys
WO2023081756A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
WO2023110618A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
AR128422A1 (es) 2022-02-02 2024-05-08 Akouos Inc Construcciones de anticuerpos anti-vegf y métodos relacionados para el tratamiento de los síntomas asociados al schwannoma vestibular
WO2023183588A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Methods of assessing engineered retron activity, and uses thereof
WO2023183589A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Rt-dna fidelity and retron genome editing
WO2023183627A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Production of reverse transcribed dna (rt-dna) using a retron reverse transcriptase from exogenous rna
WO2023217988A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion hmpv fusion proteins
WO2024009280A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Baylor College Of Medicine Integrated stress response inhibitors and methods of using the same
WO2024020346A2 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Renagade Therapeutics Management Inc. Gene editing components, systems, and methods of use
WO2024044673A1 (en) 2022-08-24 2024-02-29 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Dual cut retron editors for genomic insertions and deletions
WO2024044723A1 (en) 2022-08-25 2024-02-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
TW202421648A (zh) 2022-09-08 2024-06-01 德商百靈佳殷格翰國際有限公司 用於治療心因性休克的骨髓衍生性生長因子(一)
WO2024061757A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Pre-fusion human piv1 f proteins
WO2024061759A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized coronavirus s proteins
WO2024061753A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized trimeric class i fusion proteins
WO2024074584A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion piv3 f proteins
WO2024102838A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Century Therapeutics, Inc. Engineered interleukin-7 receptors and uses thereof
WO2024175579A1 (en) 2023-02-21 2024-08-29 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized trimeric rsv fusion proteins without a heterologous trimerzation domain
WO2024197242A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Carbon Biosciences, Inc. Protoparvovirus compositions comprising a protoparvovirus variant vp1 capsid polypeptide and related methods
WO2024196965A1 (en) 2023-03-23 2024-09-26 Carbon Biosciences, Inc. Parvovirus compositions and related methods for gene therapy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0112012A2 (en) * 1982-11-08 1984-06-27 Case Western Reserve University Recombinant DNA molecules

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) * 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4405712A (en) * 1981-07-01 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services LTR-Vectors
IL68561A (en) * 1982-05-05 1991-01-31 Genentech Inc Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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