TW202144579A - 病毒載體在冠狀病毒疫苗生產的用途 - Google Patents

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韓瑟 斯特德曼
傑佛瑞 塔賓
查爾斯 布里吉斯
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美商4Mvac有限責任公司
賓州大學信託基金會
查爾斯 布里吉斯
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Abstract

本發明提供包括AAV及AAV載體的組合物,該等AAV及AAV載體包括編碼SARS-CoV-2多肽或其片段的序列。本發明也提供用於製造及使用AAV和AAV載體以在個體體內針對冠狀病毒產生免疫力的方法與材料。

Description

病毒載體在冠狀病毒疫苗生產的用途
相關申請案的交叉引用
本申請案主張於2020年4月9日提申的美國臨時專利申請案第63/007,865號的優先權,該件申請案以全文引用的方式併入本文。
本發明大體上是有關腺相關病毒在個體體內針對冠狀病毒產生免疫力的用途。
冠狀病毒(coronavirus, CoV)是被膜RNA病毒,其特徵在於從其表面突出的棒樣刺突、獨特的複製策略,以及一個大型的RNA基因體(Fehr and Perlman, Coronaviruses, 1282:1-23, 2015)。冠狀病毒在哺乳動物和鳥類中引起各種疾病,範圍從牛和豬的腸炎,還有雞的上呼吸道疾病到潛在致命的人類呼吸道感染。
嚴重急性呼吸道症候群(SARS)是一種由冠狀病毒所引起的新近出現的傳染病,包括SARS-冠狀病毒(SARS-CoV)和SARS-冠狀病毒-2 (SARS-CoV-2)。SARS-CoV和SARS-CoV-2各自包括一個刺突(spike, S)蛋白,該刺突蛋白是由兩個次單位組成。S1次單位含有一個與宿主細胞受體血管收縮素轉化酶2接合的受體結合結構域,而S2次單位媒介病毒和宿主細胞膜之間的融合。在SARS-CoV與SARS-CoV-2感染期間,S蛋白於誘發體液性免疫力(例如,中和抗體)和細胞性免疫力(例如,T細胞反應),以及保護性免疫力方面發揮關鍵作用。有鑑於SARS-CoV-2 (COVID-19)的出現,針對冠狀病毒疫苗仍有一個重要卻未獲得滿足的需求。然而,當前的疫苗接種策略並不能提供完全免疫原性反應所需的必要細胞性免疫力。是以,開發出一個會產生強大、持續性細胞性免疫力(T細胞反應)的冠狀病毒疫苗仍有一個重要卻未獲得滿足之需求。
本發明提供製造及使用AAV和載體以在個體體內針對冠狀病毒產生免疫力的方法與材料。例如,本發明提供含有編碼SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段之序列的AAV或載體。在另一個實例中,本發明提供含有編碼SARS-CoV-2核蛋白殼多肽或其片段之序列的AAV或載體。這樣一個AAV可用於產生對抗冠狀病毒(包括SARS-CoV-2)的新穎疫苗。由含有編碼SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段或SARS-CoV-2核蛋白殼多肽或其片段之序列的AAV (或載體)誘發的免疫原性利用了細胞性(例如,T細胞媒介的)和體液性(例如,中和抗體)免疫反應對抗個體體內的SARS-CoV-2多肽,從而針對冠狀病毒創造至少部分免疫力。
在一個態樣中,本發明的特徵在於包括編碼SARS-CoV-2多肽或其片段之序列的腺相關病毒(AAV)載體。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽是SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段。
在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S1結構域或其片段。
在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S2結構域或其片段、基本上由或由S2結構域或其片段組成。在一些具體例中,S2結構域或其片段包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3、基本上由或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3組成。
在一些具體例中,AAV還包括編碼跨膜結構域的序列,其中編碼跨膜結構域的序列可操作地連接至編碼S糖蛋白多肽或其片段之序列。在一些具體例中,跨膜結構域包括SEQ ID NO:4的序列或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是核蛋白殼蛋白或其片段。在一些具體例中,核蛋白殼多肽或其片段包括SEQ ID NO:5的序列或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是被膜多肽或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是膜多肽或其片段。
在一些具體例中,AAV載體還包括編碼訊息序列的序列,其中編碼訊息序列的序列可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段的序列。在一些具體例中,訊息序列包括SEQ ID NO:6的序列。
在一些具體例中,AAV還包括可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段之序列的啟動子。在一些具體例中,啟動子是肌肉特異性啟動子。在一些具體例中,肌肉特異性啟動子選自由以下組成之群組:骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶,SPc-512和合成肌肉啟動子。在一些具體例中,啟動子選自由以下組成之群組:CMV、RSV、SV40、β-肌動蛋白,PGK和EF1啟動子。
在一些具體例中,AAV載體包括AAV血清型6 (AAV6)蛋白殼蛋白。在一些具體例中,AAV載體包括AAV血清型9 (AAV9)蛋白殼蛋白。在一些具體例中,AAV載體包括Anc80、Anc80Lib、ANC 81、Anc82、Anc83、Anc84、Anc110、Anc113、Anc126、Anc127,或另一種系統發生學上相關的AAV蛋白殼蛋白。
在另一個態樣中,本發明的特徵在於包括本文所述任何AAV載體的醫藥組合物。在一些具體例中,醫藥組合物還包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在另一個態樣中,本發明的特徵在於包括本文所述任何AAV載體的疫苗組合物。在一些具體例中,疫苗組合物還包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在另一個態樣中,本發明的特徵在於包括編碼SARS-CoV-2多肽或其片段之序列的載體。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽是SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段。
在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S1結構域或其片段。
在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S2結構域或其片段、基本上由或由S2結構域或其片段組成。在一些具體例中,S2結構域或其片段包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3、基本上由或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3組成。
在一些具體例中,載體還包括編碼跨膜結構域的序列,其中編碼跨膜結構域的序列可操作地連接至編碼S糖蛋白多肽或其片段的序列。在一些具體例中,跨膜結構域包括SEQ ID NO:4的序列或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是核蛋白殼蛋白或其片段。在一些具體例中,核蛋白殼多肽或其片段包括SEQ ID NO:5的序列或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是被膜多肽或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是膜多肽或其片段。
在一些具體例中,載體還包括編碼訊息序列的序列,其中編碼訊息序列的序列可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段的序列。在一些具體例中,訊息序列包括SEQ ID NO:6的序列。
在一些具體例中,載體進一步包括可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段之序列的啟動子。在一些具體例中,啟動子是肌肉特異性啟動子。在一些具體例中,肌肉特異性啟動子選自由以下組成之群組:骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶,SPc-512和合成肌肉啟動子。在一些具體例中,啟動子選自由以下組成之群組:CMV、RSV、SV40、β-肌動蛋白,PGK和EF1啟動子。
在一些具體例中,載體是病毒載體。在一些具體例中,病毒載體是慢病毒載體或皰疹病毒載體。
在一些具體例中,載體是質體。
在另一個態樣中,本發明的特徵在於包括本文所述任何載體的醫藥組合物。在一些具體例中,醫藥組合物還包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在另一個態樣中,本發明的特徵在於包括本文所述任何載體的疫苗組合物。在一些具體例中,疫苗組合物還包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在另一個態樣中,本發明的特徵在於在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分免疫力的方法,該方法包括向個體投予治療有效量的本文所述任何AAV或AAV載體、本文所述任何載體、本文所述任何醫藥組合物,或本文所述任何疫苗組合物。
在一些具體例中,由於針對冠狀病毒的體液性免疫力,投予導致針對冠狀病毒的至少部分免疫力。
在一些具體例中,投予導致針對冠狀病毒的強大T細胞媒介的免疫力。
在一些具體例中,投予導致在個體體內特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段之抗體的效價增加。
在一些具體例中,投予導致在個體體內的冠狀病毒感染率下降。
在一些具體例中,該方法進一步包括向個體投予佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在一些具體例中,個體已被鑑定為先前未曾有過冠狀病毒感染。
在一些具體例中,在投予步驟之前,個體已被鑑定為不具有顯著效價的特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段的抗體。
在一些具體例中,冠狀病毒是SARS-CoV-2。
在一些具體例中,個體先前已被鑑定為患有一或多種選自由以下組成之群組的醫學病況:慢性肺病、中度哮喘、重度哮喘、心臟病況、糖尿病、肥胖症、肝病、慢性腎病和免疫系統衰弱或受抑制。
在一些具體例中,免疫系統衰弱或受抑制的個體是接受癌症治療的個體、吸煙者、移植接受者的個體、患有HIV或AIDS的個體,或接受皮質類固醇或任何其他免疫抑制藥物的個體。
在一些具體例中,免疫系統衰弱或受抑制的個體是年長個體。
術語「一(a和an)」是指一個或超過一個(即,至少一個)該冠詞的文法主體。例如,「一個元件」含括一個元件和超過一個的元件。
術語「個體」是指人類以及非人類哺乳動物,諸如但不限於非人類靈長類動物、貓、狗、綿羊、山羊、馬、牛,豬和囓齒動物(諸如但不限於小鼠與大鼠);以及非哺乳動物,諸如但不限於鳥類、家禽、爬行動物、兩棲動物。
除非另有指明,否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此為簡併形式並因而編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。
術語「內源性」是指任何源自生物體、細胞,或組織的材料。
術語「外源性」是指從生物體、細胞或組織以外引入的任何材料,或源自生物體、細胞或組織以外的任何材料,其在被引入的同一生物體、細胞或組織中並未被生產或並非源自被引入的同一生物體、細胞,或組織。
術語「經分離」表示相對於自然狀態有所改變或由自然狀態脫離。例如,天然存在於活體動物中的核酸或肽不是「經分離的」,但與其天然狀態的共存物質部分或完全分離的相同核酸或肽是「經分離的」。經分離的核酸或蛋白質可以基本上以純化的形式存在,或者可以存在於非原生環境(諸如例如宿主細胞)中。
術語「經轉染」,「經轉形」或「經轉導」是指藉其將外源性核酸轉移或引入細胞的過程。「經轉染」,「經轉形」或「經轉導」的哺乳動物細胞是已用外源性核酸轉染,轉形或轉導的細胞。
術語「表現」是指編碼蛋白質的特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。
術語「瞬時表現」是指一個非整併的編碼序列表現一段短時間(例如,數小時或數天)。細胞中瞬時表現的編碼序列在細胞分裂數回後丟失。
當治療在個體體內導致針對冠狀病毒的至少部分免疫力時,它就是「治療有效的」。「治療有效的」治療也可以指治療導致個體疾病狀態(例如COVID-19)的一或多個症狀的數目、嚴重程度,和頻率減少。
術語「核酸」或「多核苷酸」是指呈單股或雙股形式的去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其組合。除非特別限定,否則該術語含括含有具有與參考核苷酸相似的結合性質的已知天然核苷酸類似物。除非另有說明,否則特定核酸序列也隱含地含括互補序列以及明確指出的序列。在本文所述任何核酸的一些具體例中,核酸是DNA。在本文所述任何核酸的一些具體例中,核酸是RNA。
除非另有定義,否則本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技藝中具有通常技藝者一般所理解的含義相同。本文說明了用於本發明的方法和材料;也可以使用本技藝中已知的其他合適方法和材料。材料、方法和實例僅是說明性的而不是限制性的。本文提及的所有出版品、專利申請案、專利案、序列、數據庫條目和其他參考文獻均以全文引用的方式併入。如有衝突,以本說明書(包括定義)為準。
本文提供製造及使用AAV和載體以在個體體內針對冠狀病毒產生免疫力的方法和材料。
在一些具體例中,腺相關病毒(AAV)載體包括編碼SARS-CoV-2多肽或其片段的序列。在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽是SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段。在一些具體例中,S糖蛋白或其片段包括SEQ ID NO:1、基本上由或由SEQ ID NO:1組成。在一些具體例中,S糖蛋白或其片段與SEQ ID NO:1至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%、至少99%和至少100%)一致。
例示性S糖蛋白序列SEQ ID NO:1 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S1結構域或其片段。在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S2結構域或其片段、基本上由或由S2結構域或其片段組成。在一些具體例中,S2結構域或其片段包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3、基本上由或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3組成。在一些具體例中,S2結構域或其片段具有與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%、至少99%和至少100%)一致的胺基酸序列。在一些具體例中,S2結構域的片段包含以下,由以下或基本上由以下組成:SEQ ID NO:2的胺基酸編號1至約胺基酸編號580、胺基酸編號1至約胺基酸編號560、胺基酸編號1至約胺基酸編號540、胺基酸編號1至約胺基酸編號520、胺基酸編號1至約胺基酸編號500、胺基酸編號1至約胺基酸編號480、胺基酸編號1至約胺基酸編號460,胺基酸編號1至約胺基酸編號440、胺基酸編號1至約胺基酸編號420、胺基酸編號1至約胺基酸編號400、胺基酸編號1至約胺基酸編號380、胺基酸編號1至約胺基酸編號360、胺基酸編號1至約胺基酸編號340、胺基酸編號1至約胺基酸編號320、胺基酸編號1至約胺基酸編號300、胺基酸編號1至約胺基酸編號280、胺基酸編號1至約胺基酸編號260、胺基酸編號1至約胺基酸編號240、胺基酸編號1至約胺基酸編號220、胺基酸編號1至約胺基酸編號200、胺基酸編號1至約胺基酸編號180、胺基酸編號1至約胺基酸編號160、胺基酸編號1至約胺基酸編號140、胺基酸編號1至約胺基酸編號120、胺基酸編號1至約胺基酸編號100、胺基酸編號1至約胺基酸編號80、胺基酸編號1至約胺基酸編號60、胺基酸編號1至約胺基酸編號40、胺基酸編號1至約胺基酸編號20、約胺基酸編號20至約胺基酸編號588、約胺基酸編號20至約胺基酸編號580、約胺基酸編號20至約胺基酸編號560,約胺基酸編號20至約胺基酸編號540、約胺基酸編號20至約胺基酸編號520,約胺基酸編號20至約胺基酸編號500、約胺基酸編號20至約胺基酸編號480、約胺基酸編號20至約胺基酸編號460、約胺基酸編號20至約胺基酸編號440、約胺基酸編號20至約胺基酸編號420、約胺基酸編號20至約胺基酸編號400、約胺基酸編號20至約胺基酸編號380、約胺基酸編號20至約胺基酸編號360、約胺基酸編號20至約胺基酸編號340、約胺基酸編號20至約胺基酸編號320、約胺基酸編號20至約胺基酸編號300、約胺基酸編號20至約胺基酸編號280、約胺基酸編號20至約胺基酸編號260、約胺基酸編號20至約胺基酸編號240、約胺基酸編號20至約胺基酸編號220、約胺基酸編號20至約胺基酸編號200、約胺基酸編號20至約胺基酸編號180、約胺基酸編號20至約胺基酸編號160、約胺基酸編號20至約胺基酸編號140、約胺基酸編號20至約胺基酸編號120、約胺基酸編號20至約胺基酸編號100、約胺基酸編號20至約胺基酸編號80、約胺基酸編號20至約胺基酸編號60、約胺基酸編號20至約胺基酸編號40、約胺基酸編號40至約胺基酸編號588、約胺基酸編號40至約胺基酸編號580、約胺基酸編號40至約胺基酸編號560、約胺基酸編號40至約胺基酸編號540、約胺基酸編號40至約胺基酸編號520、約胺基酸編號40至約胺基酸編號500、約胺基酸編號40至約胺基酸編號480、約胺基酸編號40至約胺基酸編號460、約胺基酸編號40至約胺基酸編號440、約胺基酸編號40至約胺基酸編號420、約胺基酸編號40至約胺基酸編號400、約胺基酸編號40至約胺基酸編號380、約胺基酸編號40至約胺基酸編號360、約胺基酸編號40至約胺基酸編號340、約胺基酸編號40至約胺基酸編號320、約胺基酸編號40至約胺基酸編號300、約胺基酸編號40至約胺基酸編號280、約胺基酸編號40至約胺基酸編號260、約胺基酸編號40至約胺基酸編號240、約胺基酸編號40至約胺基酸編號220、約胺基酸編號40至約胺基酸編號200、約胺基酸編號40至約胺基酸編號180、約胺基酸編號40至約胺基酸編號160、約胺基酸編號40至約胺基酸編號140、約胺基酸編號40至約胺基酸編號120、約胺基酸編號40至約胺基酸編號100、約胺基酸編號40至約胺基酸編號80、約胺基酸編號40至約胺基酸編號60、約胺基酸編號60至約胺基酸編號588、約胺基酸編號60至約胺基酸編號580、約胺基酸編號60至約胺基酸編號560、約胺基酸編號60至約胺基酸編號540、約胺基酸編號60至約胺基酸編號520、約胺基酸編號60至約胺基酸編號500、約胺基酸編號60至約胺基酸編號480、約胺基酸編號60至約胺基酸編號460、約胺基酸編號60至約胺基酸編號440、約胺基酸編號60至約胺基酸編號420、約胺基酸編號60至約胺基酸編號400、約胺基酸編號60至約胺基酸編號380、約胺基酸編號60至約胺基酸編號360、約胺基酸編號60至約胺基酸編號340、約胺基酸編號60至約胺基酸編號320、約胺基酸編號60至約胺基酸編號300、約胺基酸編號60至約胺基酸編號280、約胺基酸編號60到約胺基酸編號260、約胺基酸編號60至約胺基酸編號240、約胺基酸編號60至約胺基酸編號220、約胺基酸編號60至約胺基酸編號200、約胺基酸編號60至約胺基酸編號180、約胺基酸編號60至約胺基酸編號160、約胺基酸編號60至約胺基酸編號140、約胺基酸編號60至約胺基酸編號120、約胺基酸編號60至約胺基酸編號100、約胺基酸編號60至約胺基酸編號80、約胺基酸編號80至約胺基酸編號588、約胺基酸編號80至約胺基酸編號580、約胺基酸編號80至約胺基酸編號560、約胺基酸編號80至約胺基酸編號540、約胺基酸編號80至約胺基酸編號520、約胺基酸編號80至約胺基酸編號500、約胺基酸編號80至約胺基酸編號480、約胺基酸編號80至約胺基酸編號460、約胺基酸編號80至約胺基酸編號440、約胺基酸編號80至約胺基酸編號420、約胺基酸編號80至約胺基酸編號400、約胺基酸編號80至約胺基酸編號380、約胺基酸編號80至約胺基酸編號360、約胺基酸編號80至約胺基酸編號340、約胺基酸編號80至約胺基酸編號320、約胺基酸編號80至約胺基酸編號300、約胺基酸編號80至約胺基酸編號280、約胺基酸編號80至約胺基酸編號260、約胺基酸編號80至約胺基酸編號240、約胺基酸編號80至約胺基酸編號220、約胺基酸編號80至約胺基酸編號200、約胺基酸編號80至約胺基酸編號180、約胺基酸編號80至約胺基酸編號160、約胺基酸編號80至約胺基酸編號140、約胺基酸編號80至約胺基酸編號120、約胺基酸編號80至約胺基酸編號100、約胺基酸編號100至約胺基酸編號588、約胺基酸編號100至約胺基酸編號580、約胺基酸編號100至約胺基酸編號560、約胺基酸編號100至約胺基酸編號540、約胺基酸編號100至約胺基酸編號520、約胺基酸編號100至約胺基酸編號500、約胺基酸編號100至約胺基酸編號480、約胺基酸編號100至約胺基酸編號460、約胺基酸編號100至約胺基酸編號440、約胺基酸編號100至約胺基酸編號420、約胺基酸編號100至約胺基酸編號400、約胺基酸編號100至約胺基酸編號380、約胺基酸編號100至約胺基酸編號360、約胺基酸編號100至約胺基酸編號340、約胺基酸編號100至約胺基酸編號320、約胺基酸編號100至約胺基酸編號300、約胺基酸編號100至約胺基酸編號280、約胺基酸編號100至約胺基酸編號260、約胺基酸編號100至約胺基酸編號240、約胺基酸編號100至約胺基酸編號220、約胺基酸編號100至約胺基酸編號200、約胺基酸編號100至約胺基酸編號180、約胺基酸編號100至約胺基酸編號160、約胺基酸編號100至約胺基酸編號140、約胺基酸編號100至約胺基酸編號120、約胺基酸編號120至約胺基酸編號588、約胺基酸編號120至約胺基酸編號580、約胺基酸編號120至約胺基酸編號560、約胺基酸編號120至約胺基酸編號540、約胺基酸編號120至約胺基酸編號520、約胺基酸編號120至約胺基酸編號500、約胺基酸編號120至約胺基酸編號480、約胺基酸編號120至約胺基酸編號460、約胺基酸編號120至約胺基酸編號440、約胺基酸編號120至約胺基酸編號420、約胺基酸編號120至約胺基酸編號400、約胺基酸編號120至約胺基酸編號380、約胺基酸編號120至約胺基酸編號360、約胺基酸編號120至約胺基酸編號340、約胺基酸編號120至約胺基酸編號320、約胺基酸編號120至約胺基酸編號300、約胺基酸編號120至約胺基酸編號280、約胺基酸編號120至約胺基酸編號260、約胺基酸編號120至約胺基酸編號240、約胺基酸編號120至約胺基酸編號220、約胺基酸編號120至約胺基酸編號200、約胺基酸編號120至約胺基酸編號180、約胺基酸編號120至約胺基酸編號160、約胺基酸編號120至約胺基酸編號140、約胺基酸編號140至約胺基酸編號588、約胺基酸編號140至約胺基酸編號580、約胺基酸編號140至約胺基酸編號560、約胺基酸編號140至約胺基酸編號540、約胺基酸編號140至約胺基酸編號520、約胺基酸編號140至約胺基酸編號500、約胺基酸編號140至約胺基酸編號480、約胺基酸編號140至約胺基酸編號460、約胺基酸編號140至約胺基酸編號440、約胺基酸編號140至約胺基酸編號420、約胺基酸編號140至約胺基酸編號400、約胺基酸編號140至約胺基酸編號380、約胺基酸編號140至約胺基酸編號360、約胺基酸編號140至約胺基酸編號340、約胺基酸編號140至約胺基酸編號320、約胺基酸編號140至約胺基酸編號300、約胺基酸編號140至約胺基酸編號280、約胺基酸編號140至約胺基酸編號260、約胺基酸編號140至約胺基酸編號240、約胺基酸編號140至約胺基酸編號220、約胺基酸編號140至約胺基酸編號200、約胺基酸編號140至約胺基酸編號180、約胺基酸編號140至約胺基酸編號160、約胺基酸編號160至約胺基酸編號588、約胺基酸編號160至約胺基酸編號580、約胺基酸編號160至約胺基酸編號560、約胺基酸編號160至約胺基酸編號540、約胺基酸編號160至約胺基酸編號520、約胺基酸編號160至約胺基酸編號500、約胺基酸編號160至約胺基酸編號480、約胺基酸編號160至約胺基酸編號460、約胺基酸編號160至約胺基酸編號440、約胺基酸編號160至約胺基酸編號420、約胺基酸編號160至約胺基酸編號400、約胺基酸編號160至約胺基酸編號380、約胺基酸編號160至約胺基酸編號360、約胺基酸編號160至約胺基酸編號340、約胺基酸編號160至約胺基酸編號320、約胺基酸編號160至約胺基酸編號300、約胺基酸編號160至約胺基酸編號280、約胺基酸編號160至約胺基酸編號260、約胺基酸編號160至約胺基酸編號240、約胺基酸編號160至約胺基酸編號220、約胺基酸編號160至約胺基酸編號200、約胺基酸編號160至約胺基酸編號180、約胺基酸編號180至約胺基酸編號588、約胺基酸編號180至約胺基酸編號580、約胺基酸編號180至約胺基酸編號560、約胺基酸編號180至約胺基酸編號540、約胺基酸編號180至約胺基酸編號520、約胺基酸編號180至約胺基酸編號500、約胺基酸編號180至約胺基酸編號480、約胺基酸編號180至約胺基酸編號460、約胺基酸編號180至約胺基酸編號440、約胺基酸編號180至約胺基酸編號420、約胺基酸編號180至約胺基酸編號400、約胺基酸編號180至約胺基酸編號380、約胺基酸編號180至約胺基酸編號360、約胺基酸編號180至約胺基酸編號340、約胺基酸編號180至約胺基酸編號320、約胺基酸編號180至約胺基酸編號300、約胺基酸編號180至約胺基酸編號280、約胺基酸編號180至約胺基酸編號260、約胺基酸編號180至約胺基酸編號240、約胺基酸編號180至約胺基酸編號220、約胺基酸編號180至約胺基酸編號200、約胺基酸編號200至約胺基酸編號588、約胺基酸編號200至約胺基酸編號580、約胺基酸編號200至約胺基酸編號560、約胺基酸編號200至約胺基酸編號540、約胺基酸編號200至約胺基酸編號520、約胺基酸編號200至約胺基酸編號500、約胺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在一些具體例中,S2結構域的片段包含以下,由以下或基本上由以下組成:SEQ ID NO:3的胺基酸編號1至約胺基酸編號458、胺基酸編號1至約胺基酸編號440、胺基酸編號1至約胺基酸編號420、胺基酸編號1至約胺基酸編號400、胺基酸編號1至約胺基酸編號380、胺基酸編號1至約胺基酸編號360、胺基酸編號1至約胺基酸編號340、胺基酸編號1至約胺基酸編號320、胺基酸編號1至約胺基酸編號300、胺基酸編號1至約胺基酸編號280、胺基酸編號1至約胺基酸編號260、胺基酸編號1至約胺基酸編號240、胺基酸編號1至約胺基酸編號220、胺基酸編號1至約胺基酸編號200、胺基酸編號1至約胺基酸編號180、胺基酸編號1至約胺基酸編號160、胺基酸編號1至約胺基酸編號140、胺基酸編號1至約胺基酸編號120、胺基酸編號1至約胺基酸編號100、胺基酸編號1至約胺基酸編號80、胺基酸編號1至約胺基酸編號60、胺基酸編號1至約胺基酸編號40、胺基酸編號1至約胺基酸編號20、約胺基酸編號20至約胺基酸編號458、約胺基酸編號20至約胺基酸編號440、約胺基酸編號20至約胺基酸編號420、約胺基酸編號20至約胺基酸編號400、約胺基酸編號20至約胺基酸編號380、約胺基酸編號20至約胺基酸編號360、約胺基酸編號20至胺基酸編號340、約胺基酸編號20至約胺基酸編號320、約胺基酸編號20至約胺基酸編號300、約胺基酸編號20至約胺基酸編號280、約胺基酸編號20至約胺基酸編號260、約胺基酸編號20至約胺基酸編號240、約胺基酸編號20至約胺基酸編號220、約胺基酸編號20至約胺基酸編號200、約胺基酸編號20至約胺基酸編號180、約胺基酸編號20至約胺基酸編號160、約胺基酸編號20至約胺基酸編號140、約胺基酸編號20至約胺基酸編號120、約胺基酸編號20至約胺基酸編號100、約胺基酸編號20至約胺基酸編號80、約胺基酸編號20至約胺基酸編號60、約胺基酸編號20至約胺基酸編號40、約胺基酸編號40至約胺基酸編號458、約胺基酸編號40至約胺基酸編號440、約胺基酸編號40至約胺基酸編號420、約胺基酸編號40至約胺基酸編號400、約胺基酸編號40至約胺基酸編號380、約胺基酸編號40至約胺基酸編號360、約胺基酸編號40至約胺基酸編號340、約胺基酸編號40至約胺基酸編號320、約胺基酸編號40至約胺基酸編號300、約胺基酸編號40至約胺基酸編號280、約胺基酸編號40至約胺基酸編號260、約胺基酸編號40至約胺基酸編號240、約胺基酸編號40至約胺基酸編號220、約胺基酸編號40至約胺基酸編號200、約胺基酸編號40至約胺基酸編號180、約胺基酸編號40至約胺基酸編號160、約胺基酸編號40至胺基酸編號140、約胺基酸編號40至約胺基酸編號120、約胺基酸編號40至約胺基酸編號100、約胺基酸編號40至約胺基酸編號80、約胺基酸編號40至約胺基酸編號60、約胺基酸編號60至約胺基酸編號458、約胺基酸編號60至約胺基酸編號440、約胺基酸編號60至約胺基酸編號420、約胺基酸編號60至約胺基酸編號400、約胺基酸編號60至約胺基酸編號380、約胺基酸編號60至約胺基酸編號360、約胺基酸編號60至約胺基酸編號340、約胺基酸編號60至約胺基酸編號320、約胺基酸編號60至約胺基酸編號300、約胺基酸編號60至約胺基酸編號280、約胺基酸編號60至約胺基酸編號260、約胺基酸編號60至約胺基酸編號240、約胺基酸編號60至約胺基酸編號220、約胺基酸編號60至約胺基酸編號200、約胺基酸編號60至約胺基酸編號180、約胺基酸編號60至約胺基酸編號160、約胺基酸編號60至約胺基酸編號140、約胺基酸編號60至約胺基酸編號120、約胺基酸編號60至約胺基酸編號100、約胺基酸編號60至約胺基酸編號80、約胺基酸編號80至約胺基酸編號458、約胺基酸編號80至約胺基酸編號440、約胺基酸編號80至約胺基酸編號420、約胺基酸編號80至約胺基酸編號400、約胺基酸編號80至約胺基酸編號380、約胺基酸編號80至約胺基酸編號360、約胺基酸編號80至約胺基酸編號340、約胺基酸編號80至約胺基酸編號320、約胺基酸編號80至約胺基酸編號300、約胺基酸編號80至約胺基酸編號280、約胺基酸編號80至約胺基酸編號260、約胺基酸編號80至約胺基酸編號240、約胺基酸編號80至約胺基酸編號220、約胺基酸編號80至約胺基酸編號200、約胺基酸編號80至約胺基酸編號180、約胺基酸編號80至約胺基酸編號160、約胺基酸編號80至約胺基酸編號140、約胺基酸編號80至約胺基酸編號120、約胺基酸編號80至約胺基酸編號100、約胺基酸編號100至約胺基酸編號458、約胺基酸編號100至約胺基酸編號440、約胺基酸編號100至約胺基酸編號420、約胺基酸編號100至約胺基酸編號400、約胺基酸編號100至約胺基酸編號380、約胺基酸編號100至約胺基酸編號360、約胺基酸編號100至約胺基酸編號340、約胺基酸編號100至約胺基酸編號320、約胺基酸編號100至約胺基酸編號300、約胺基酸編號100至約胺基酸編號280、約胺基酸編號100至約胺基酸編號260、約胺基酸編號100至約胺基酸編號240、約胺基酸編號100至約胺基酸編號220、約胺基酸編號100至約胺基酸編號200、約胺基酸編號100至約胺基酸編號180、約胺基酸編號100至約胺基酸編號160、約胺基酸編號100至約胺基酸編號140、約胺基酸編號100至約胺基酸編號120、約胺基酸編號120至約胺基酸編號458、約胺基酸編號120至約胺基酸編號440、約胺基酸編號120至約胺基酸編號420、約胺基酸編號120至約胺基酸編號400、約胺基酸編號120至約胺基酸編號380、約胺基酸編號120至約胺基酸編號360、約胺基酸編號120至約胺基酸編號340、約胺基酸編號120至約胺基酸編號320、約胺基酸編號120至約胺基酸編號300、約胺基酸編號120至約胺基酸編號280、約胺基酸編號120至約胺基酸編號260、約胺基酸編號120至約胺基酸編號240、約胺基酸編號120至約胺基酸編號220、約胺基酸編號120至約胺基酸編號200、約胺基酸編號120至約胺基酸編號180、約胺基酸編號120至約胺基酸編號160、約胺基酸編號120至約胺基酸編號140、約胺基酸編號140至約胺基酸編號458、約胺基酸編號140至約胺基酸編號440、約胺基酸編號140至約胺基酸編號420、約胺基酸編號140至約胺基酸編號400、約胺基酸編號140至約胺基酸編號380、約胺基酸編號140至約胺基酸編號360、約胺基酸編號140至約胺基酸編號340、約胺基酸編號140至約胺基酸編號320、約胺基酸編號140至約胺基酸編號300、約胺基酸編號140至約胺基酸編號280、約胺基酸編號140至約胺基酸編號260、約胺基酸編號140至約胺基酸編號240、約胺基酸編號140至約胺基酸編號220、約胺基酸編號140至約胺基酸編號200、約胺基酸編號140至約胺基酸編號180、約胺基酸編號140至約胺基酸編號160、約胺基酸編號160至約胺基酸編號458、約胺基酸編號160至約胺基酸編號440、約胺基酸編號160至約胺基酸編號420、約胺基酸編號160至約胺基酸編號400、約胺基酸編號160至約胺基酸編號380、約胺基酸編號160至約胺基酸編號360、約胺基酸編號160至約胺基酸編號340、約胺基酸編號160至約胺基酸編號320、約胺基酸編號160至約胺基酸編號300、約胺基酸編號160至約胺基酸編號280、約胺基酸編號160至約胺基酸編號260、約胺基酸編號160至約胺基酸編號240、約胺基酸編號160至約胺基酸編號220、約胺基酸編號160至約胺基酸編號200、約胺基酸編號160至約胺基酸編號180、約胺基酸編號180至約胺基酸編號458、約胺基酸編號180至約胺基酸編號440、約胺基酸編號180至約胺基酸編號420、約胺基酸編號180至約胺基酸編號400、約胺基酸編號180至約胺基酸編號380、約胺基酸編號180至約胺基酸編號360、約胺基酸編號180至約胺基酸編號340、約胺基酸編號180至約胺基酸編號320、約胺基酸編號180至約胺基酸編號300、約胺基酸編號180至約胺基酸編號280、約胺基酸編號180至約胺基酸編號260、約胺基酸編號180至約胺基酸編號240、約胺基酸編號180至約胺基酸編號220、約胺基酸編號180至約胺基酸編號200、約胺基酸編號200至約胺基酸編號458、約胺基酸編號200至約胺基酸編號440、約胺基酸編號200至約胺基酸編號420、約胺基酸編號200至約胺基酸編號400、約胺基酸編號200至約胺基酸編號380、約胺基酸編號200至約胺基酸編號360、約胺基酸編號200至約胺基酸編號340、約胺基酸編號200至約胺基酸編號320、約胺基酸編號200至約胺基酸編號300、約胺基酸編號200至約胺基酸編號280、約胺基酸編號200至約胺基酸編號260、約胺基酸編號200至約胺基酸編號240、約胺基酸編號200至約胺基酸編號220、約胺基酸編號220至約胺基酸編號458、約胺基酸編號220至約胺基酸編號440、約胺基酸編號220至約胺基酸編號420、約胺基酸編號220至約胺基酸編號400、約胺基酸編號220至約胺基酸編號380、約胺基酸編號220至約胺基酸編號360、約胺基酸編號220至約胺基酸編號340、約胺基酸編號220至約胺基酸編號320、約胺基酸編號220至約胺基酸編號300、約胺基酸編號220至約胺基酸編號280、約胺基酸編號220至約胺基酸編號260、約胺基酸編號220至約胺基酸編號240、約胺基酸編號240至約胺基酸編號458、約胺基酸編號240至約胺基酸編號440、約胺基酸編號240至約胺基酸編號420、約胺基酸編號240至約胺基酸編號400、約胺基酸編號240至約胺基酸編號380、約胺基酸編號240至約胺基酸編號360、約胺基酸編號240至約胺基酸編號340、約胺基酸編號240至約胺基酸編號320、約胺基酸編號240至約胺基酸編號300、約胺基酸編號240至約胺基酸編號280、約胺基酸編號240至約胺基酸編號260、約胺基酸編號260至約胺基酸編號458、約胺基酸編號260至約胺基酸編號440、約胺基酸編號260至約胺基酸編號420、約胺基酸編號260至約胺基酸編號400、約胺基酸編號260至約胺基酸編號380、約胺基酸編號260至約胺基酸編號360、約胺基酸編號260至約胺基酸編號340、約胺基酸編號260至約胺基酸編號320、約胺基酸編號260至約胺基酸編號300、約胺基酸編號260至約胺基酸編號280、約胺基酸編號280至約胺基酸編號458、約胺基酸編號280至約胺基酸編號440、約胺基酸編號280至約胺基酸編號420、約胺基酸編號280至約胺基酸編號400、約胺基酸編號280至約胺基酸編號380、約胺基酸編號280至約胺基酸編號360、約胺基酸編號280至約胺基酸編號340、約胺基酸編號280至約胺基酸編號320、約胺基酸編號280至約胺基酸編號300、約胺基酸編號300至約胺基酸編號458、約胺基酸編號300至約胺基酸編號440、約胺基酸編號300至約胺基酸編號420、約胺基酸編號300至約胺基酸編號400、約胺基酸編號300至約胺基酸編號380、約胺基酸編號300至約胺基酸編號360、約胺基酸編號300至約胺基酸編號340、約胺基酸編號300至約胺基酸編號320、約胺基酸編號320至約胺基酸編號458、約胺基酸編號320至約胺基酸編號440、約胺基酸編號320至約胺基酸編號420、約胺基酸編號320至約胺基酸編號400、約胺基酸編號320至約胺基酸編號380、約胺基酸編號320至約胺基酸編號360、約胺基酸編號320至約胺基酸編號340、約胺基酸編號340至約胺基酸編號458、約胺基酸編號340至約胺基酸編號440、約胺基酸編號340至約胺基酸編號420、約胺基酸編號340至約胺基酸編號400、約胺基酸編號340至約胺基酸編號380、約胺基酸編號340至約胺基酸編號360、約胺基酸編號360至約胺基酸編號458、約胺基酸編號360至約胺基酸編號440、約胺基酸編號360至約胺基酸編號420、約胺基酸編號360至約胺基酸編號400、約胺基酸編號360至約胺基酸編號380、約胺基酸編號380至約胺基酸編號458、約胺基酸編號380至約胺基酸編號440、約胺基酸編號380至約胺基酸編號420、約胺基酸編號380至約胺基酸編號400、約胺基酸編號400至約胺基酸編號458、約胺基酸編號400至約胺基酸編號440、約胺基酸編號400至約胺基酸編號420、約胺基酸編號420至約胺基酸編號458、約胺基酸編號420至約胺基酸編號440、約胺基酸編號440至約胺基酸編號458。
例示性S2結構域序列SEQ ID NO:2 SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
例示性S2結構域序列SEQ ID NO:3 SFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
在一些具體例中,AAV還包括編碼跨膜結構域的序列,其中編碼跨膜結構域的序列可操作地連接至編碼S糖蛋白多肽或其片段的序列。在一些具體例中,跨膜結構域包括SEQ ID NO:4的序列或其片段。在一些具體例中,跨膜結構域或其片段包括與SEQ ID NO:4至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%,至少99%和至少100%)一致的胺基酸序列。
例示性跨膜結構域序列SEQ ID NO:4 WPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIML
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是核蛋白殼蛋白或其片段。在一些具體例中,核蛋白殼多肽或其片段包括SEQ ID NO:5的序列或其片段。在一些具體例中,核蛋白殼多肽或其片段包括與SEQ ID NO:5至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%、至少99%和至少100%)一致的胺基酸序列。
例示性核蛋白殼多肽序列SEQ ID NO:5 MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是被膜多肽或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是膜多肽或其片段。
在一些具體例中,AAV還包括編碼訊息序列的序列,其中編碼訊息序列的序列可操作地連接至編碼SARS-CoV-2多肽或其片段的序列。在一些具體例中,訊息序列包括SEQ ID NO:6的序列。在一些具體例中,訊息序列包括與SEQ ID NO:6至少80% (例如至少85%、至少90%、至少95%,至少99%和至少100%)一致的胺基酸序列。
例示性訊息序列SEQ ID NO:6 MFVFLVLLPLVSSQC
在一些具體例中,AAV還包括可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段之序列的啟動子。在一些具體例中,啟動子是肌肉特異性啟動子。在一些具體例中,肌肉特異性啟動子選自由以下組成之群組:骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶,SPc-512和合成肌肉啟動子。在一些具體例中,啟動子選自由以下組成之群組:CMV、RSV、SV40、β-肌動蛋白,PGK和EF1啟動子。
在一些具體例中,AAV載體包括AAV血清型6 (AAV6)蛋白殼蛋白。在一些具體例中,AAV載體包括AAV血清型9 (AAV9)蛋白殼蛋白。在一些具體例中,AAV載體包括Anc80、Anc80Lib、ANC 81、Anc82、Anc83、Anc84、Anc110、Anc113、Anc126,Anc127或另一個祖AAV蛋白殼蛋白。
本文還提供醫藥組合物,其包括本文所述任何AAV或AAV載體。在一些具體例中,醫藥組合物還包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
本文還提供疫苗組合物,其包括本文所述任何AAV或AAV載體。在一些具體例中,疫苗組合物還包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在另一個態樣中,本發明提供一種載體,其包括編碼SARS-CoV-2多肽或其片段的序列。在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽是SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段。在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S1結構域或其片段。在一些具體例中,S糖蛋白多肽或其片段包括S2結構域或其片段、基本上由或由S2結構域或其片段組成。在一些具體例中,S2結構域或其片段包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3、基本上由或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3組成。
在一些具體例中,載體還包括編碼跨膜結構域的序列,其中編碼跨膜結構域的序列可操作地連結至編碼S糖蛋白多肽或其片段的序列。在一些具體例中,跨膜結構域包括SEQ ID NO:4的序列或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是核蛋白殼蛋白或其片段。在一些具體例中,核蛋白殼多肽或其片段包括SEQ ID NO:5的序列或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是被膜多肽或其片段。
在一些具體例中,SARS-CoV-2多肽或其片段是膜多肽或其片段。
在一些具體例中,載體還包括編碼訊息序列的序列,其中編碼訊息序列的序列可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段的序列。在一些具體例中,訊息序列包括SEQ ID NO:6的序列。
在一些具體例中,AAV包括可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段之序列的啟動子。在一些具體例中,啟動子是肌肉特異性啟動子。在一些具體例中,肌肉特異性啟動子選自由以下組成之群組:骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶,SPc-512和合成肌肉啟動子。在一些具體例中,啟動子選自由以下組成之群組:CMV、RSV、SV40、β-肌動蛋白,PGK和EF1啟動子。
在一些具體例中,載體是病毒載體。在一些具體例中,病毒載體是慢病毒載體或皰疹病毒載體。在一些具體例中,載體是質體。
本文還提供醫藥組合物,其包括本文所述的任何載體。在一些具體例中,醫藥組合物包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
本文還提供疫苗組合物,其包括本文所述的任何載體。在一些具體例中,疫苗組合物還包括佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在另一個態樣中,本發明提供一種在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分免疫力的方法,該方法包括向個體投予治療有效量的本文所述任何AAV或AAV載體、本文所述任何載體、本文所述任何醫藥組合物,或本文所述任何疫苗組合物。在一些具體例中,由於針對冠狀病毒的體液性免疫力,投予導致針對冠狀病毒的至少部分免疫力。在一些具體例中,投予導致針對冠狀病毒的強大T細胞媒介的免疫力。在一些具體例中,針對冠狀病毒的至少部分免疫力是針對冠狀病毒的體液性免疫力。在一些具體例中,針對冠狀病毒的至少部分免疫力是針對冠狀病毒的T細胞媒介的免疫力。在一些具體例中,投予導致在個體體內特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段之抗體的效價增加。在一些具體例中,投予導致在個體體內的冠狀病毒感染率下降。在一些具體例中,該方法還包括向個體投予佐劑。在一些具體例中,佐劑是CpG佐劑。
在一些具體例中,個體已被鑑定為先前未曾有過冠狀病毒感染。
在一些具體例中,在投予步驟之前,個體已被鑑定為不具有顯著效價的特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段的抗體。
在一些具體例中,冠狀病毒是SARS-CoV-2 (COVID-19)。
在一些具體例中,個體先前已被鑑定為患有一或多種選自由以下組成之群組的醫學病況:慢性肺病、中度哮喘、重度哮喘、心臟病況、糖尿病、肥胖症、肝病,慢性腎病和免疫系統衰弱或受抑制。在一些具體例中,免疫系統衰弱或受抑制的個體是接受癌症治療的個體、吸煙者、移植接受者的個體、患有HIV或AIDS的個體,或接受皮質類固醇或任何其他免疫抑制藥物的個體。在一些具體例中,免疫系統衰弱或受抑制的個體是年長個體。
如圖2中所示,此圖中的蛋白質大致按比例顯示,當S1結構域被切斷時,S2結構域重新折疊以創造出一個暫時性結構,這個結構在病毒試圖與宿主細胞融合之時出現。S2殘基比S1殘基還要保守得多。本發明一部分是基於發現到:最外層的S1殘基及其糖基化狀態創造出一個廣闊的表面以供中和抗體與非中和抗體結合,其任何組合在一部份宿主中具有產生抗體依賴性增強(ADE)的能力。在有或沒有訊息序列的情況下,使用S2和S2*子片段來驅動ER/高基氏體中的蛋白質合成以轉移到細胞表面,不僅可以將ADE風險降至最低,還可以使免疫持久性最大化,因為S2殘基比S1表面的殘基保守得多。在如圖2中所示S2及/或S2*殘基的穩定構形以及S2及/或S2*殘基在感染過程期間的穩定性表明針對這些表位形成的抗體將有機會阻止融合和生產性感染。
載體
本文還提供編碼本文所述任何SARS-CoV-2多肽的核酸序列。例如,包括編碼S糖蛋白多肽、S糖蛋白多肽的S1結構域、S糖蛋白多肽的S2結構域、核蛋白殼多肽,膜多肽或被膜多肽的核酸序列。本文還提供包括編碼本文所述任何多肽的任何核酸序列的載體。例如,多肽包括但不限於S糖蛋白多肽、S糖蛋白多肽的S1結構域、S糖蛋白多肽的S2結構域、核蛋白殼多肽,膜多肽或被膜多肽。
如本文所用,術語「載體」表示包括能夠攜帶至少一個外源性核酸片段的多核苷酸的組合物,例如質體載體、轉位子、黏接質體、人工染色體(例如人類人工染色體(HAC)、酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生人工染色體(PAC))或病毒載體(例如任何腺病毒載體(例如pSV或pCMV載體)、如本文所述的任何逆轉錄病毒載體),和任何Gateway®載體。載體可以例如包括足夠的順式作用元件以供表現;其他表現用元件可以由宿主細胞或在活體外表現系統中提供。術語「載體」包括任何遺傳元件(例如質體、轉位子、黏接質體、人工染色體,或病毒載體等),當與合適的控制元件締合時能夠複製。因此,該術語包括選殖和表現載體,以及病毒載體(例如,腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體,慢病毒載體或逆轉錄病毒載體)。
載體包括本技藝中所有已知者,包括併入重組多核苷酸的黏接質體、質體(例如,裸露的或包含在脂質體中)和病毒(例如慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。習於技藝者將能夠選擇合適的載體和哺乳動物細胞來製造本文所述的任何核酸。在一些具體例中,載體是質體(即可以在細胞內自主複製的環狀DNA分子)。在一些具體例中,載體可以是黏接質體(例如,pWE和sCos系列(Wahl et al. (1987),Evans et al. (1989)))。
在一些具體例中,載體是病毒載體(例如腺相關病毒、腺病毒、慢病毒、皰疹病毒載體和逆轉錄病毒)。本文描述了病毒載體的非限制性實例。在一些具體例中,載體(等)是腺相關病毒載體(AAV) (參見例如Asokan et al.,Mol. Ther. 20: 699-7080, 2012)。「重組AAV載體」或「rAAV」通常至少由轉基因或其一部分和調節序列,以及視情況選用的5'和3' AAV反向末端重複序列(ITR)組成。這種重組AAV載體被包裝到蛋白殼中並被遞送至選定的靶細胞(例如,外毛細胞)。
載體的AAV序列通常包括順式作用的5'和3' ITR序列(參見例如,B. J. Carter, in "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168, 1990)。典型的AAV ITR序列的長度為約145個核苷酸。在一些具體例中,至少75%的典型ITR序列(例如,至少80%、至少85%、至少90%,或至少95%)被併入至AAV載體中。修飾這些ITR序列的能力在技術範圍內。(參見例如,諸如Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989;以及K. Fisher et al.,J Virol. 70:520 532, 1996的文本)。在一些具體例中,本文所述任何編碼序列在AAV載體中側接5'和3' AAV ITR序列。AAV ITR序列可以從任何已知的AAV獲得,包括目前已鑑定的AAV類型。
如本文所述的AAV載體可以包括本文所述的任何調節元件(例如,一或多個啟動子、一或多個強化子、一或多個抑制元件、聚A序列、自切割2A多肽,以及IRES)。
在一些具體例中,載體是質體,並且可以包括至多約1 kb、至多約2 kb、至多約3 kb、至多約4 kb、至多約5 kb、至多約6 kb、至多約7 kb、至多約8 kb、至多約9 kb、至多約10 kb、至多約11 kb、至多約12 kb、至多約13 kb、至多約14 kb,或最多約15 kb的總長度。在一些具體例中,載體是質體,並且可以具有範圍約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb、約1 kb至約7 kb、約1 kb至約8 kb、約1 kb到約9 kb、約1 kb至約10 kb、約1 kb到約11 kb、約1 kb到約12 kb、約1 kb至約13 kb、約1 kb至約14 kb,或約1 kb至約15 kb的總長度。
在一些具體例中,載體是病毒載體,並且可以具有至多10 kb的核苷酸總數。在一些具體例中,病毒載體可具有範圍約1 kb至約2 kb、1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約1 kb至約6 kb,約1 kb至約7 kb,約1 kb至約8 kb、約1 kb至約9 kb、約1 kb至約10 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約2 kb至約6 kb、約2 kb至約7 kb、約2 kb至約8 kb、約2 kb至約9 kb、約2 kb至約10 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb、約3 kb至約6 kb、約3 kb至約7 kb、約3 kb至約8 kb、約3 kb至約9 kb、約3 kb至約10 kb、約4 kb至約 5kb、約4 kb至約6 kb、約4 kb至約7 kb、約4 kb至約8 kb、約4 kb至約9kb、約4 kb至約10 kb、約5 kb至約6 kb、約5 kb至約7 kb、約5 kb至約8 kb、約5 kb至約9 kb、約5 kb至約10 kb、約6 kb至約7 kb、約6 kb至約8 kb、約6 kb至約9 kb、約6 kb至約10 kb、約7 kb至約8 kb、約7 kb至約9 kb、約7 kb至約10 kb、約8 kb至約9 kb、約8 kb至約10 kb,或約9 kb至約10 kb的核苷酸總數。
在一些具體例中,載體是腺相關病毒(AAV載體),並且可以包括至多5 kb的核苷酸總數。在一些具體例中,AAV載體可包括範圍約1 kb至約2 kb、約1 kb至約3 kb、約1 kb至約4 kb、約1 kb至約5 kb、約2 kb至約3 kb、約2 kb至約4 kb、約2 kb至約5 kb、約3 kb至約4 kb、約3 kb至約5 kb,或約4 kb至約5 kb的核苷酸總數。
可以使用技藝中已知的各種不同方法將本文揭示的任何載體引入哺乳動物細胞(例如,肌肉細胞)中。將核酸引入哺乳動物細胞的方法的非限制性實例包括:脂質轉染、轉染(例如磷酸鈣轉染、使用高度分支有機化合物的轉染、使用陽離子聚合物的轉染、基於樹枝狀聚合物的轉染、光學轉染、基於顆粒的轉染(例如,奈米顆粒轉染),或使用脂質體(例如,陽離子脂質體)的轉染)、顯微注射、電穿孔、細胞擠壓、音波穿孔、原生質體融合、穿刺轉染、流體動力傳遞、基因槍、磁轉染、病毒轉染與核轉染。
習於技藝者將理解到,本文所述的任何載體可以(例如藉由脂質轉染)被引入至哺乳動物細胞中,並且可以穩定地併入到一個內源性基因座。
本文所述任何載體可以進一步包括控制序列,例如選自由以下組成之群組的控制序列:轉錄起始序列、轉錄終止序列、啟動子序列、強化子序列、RNA剪接序列、聚腺苷酸化(聚A)序列,以及Kozak共有序列。本文描述了這些控制序列的非限制性實例。在一些具體例中,啟動子可以是天然啟動子、組成型啟動子、誘發型啟動子,及/或組織特異性啟動子。
本文所述任何組合物和套組的一些具體例可以包括本文所述AAV載體的任何組合。本文所述任何方法的一些具體例可以包括使用本文所述AAV載體的任何組合。
啟動子
術語「啟動子」表示需要受到哺乳動物細胞中的酶/蛋白質辨識來啟動特定基因(例如,SARS CoV-2多肽或其片段)轉錄的DNA序列。啟動子通常是指例如核苷酸序列,RNA聚合酶及/或任何相關因子結合至其並在該處開始轉錄。啟動子的非限制性實例描述於本文中。啟動子的其他實例是本技藝周知的。
在一些具體例中,啟動子是組成型啟動子、肌肉特異性啟動子、誘發型啟動子、病毒啟動子、嵌合啟動子、經工程改造的啟動子,或本技藝中已知任何其他類型的啟動子。在一些具體例中,啟動子是RNA聚合酶II啟動子。在一些具體例中,啟動子是RNA聚合酶III啟動子,包括但不限於H1啟動子、人類U6啟動子、小鼠U6啟動子,或豬U6啟動子。啟動子通常將會是能夠在肌肉細胞中促進轉錄者。
可以在本文中使用的各種啟動子是本技藝中已知的。可用於本文的啟動子的非限制性實例包括:人類EF1a、人類巨細胞病毒(CMV) (美國專利第5,168,062號)、人類泛素C (UBC)、小鼠磷酸甘油酯激酶1、多瘤腺病毒、猿猴病毒40 (SV40)、β-球蛋白、β-肌動蛋白、α-胎蛋白、γ-球蛋白、β-干擾素、γ-麩胺醯基轉移酶、小鼠乳房瘤病毒(MMTV)、勞斯肉瘤病毒、大鼠胰島素、甘油醛-3-磷酸去氫酶、金屬硫蛋白II (MT II)、澱粉酶、組織蛋白酶、MI蕈毒鹼受體、逆轉錄病毒LTR (例如人類T細胞白血病病毒 HTLV)、AAV ITR、介白素2、膠原酶、血小板衍生生長因子、腺病毒5 E2、基質溶素、鼠類MX基因、葡萄糖調節蛋白(GRP78和GRP94)、α-2-巨球蛋白、波形蛋白、MHC第I類基因H-2κ b、HSP70、增殖蛋白、腫瘤壞死因子、促甲狀腺素α基因、免疫球蛋白輕鏈、T細胞受體、HLA DQα和DQβ、介白素2受體、MHC第II類、MHC第II類HLA-DRα、肌肉肌酸激酶、前白蛋白(轉甲狀腺素蛋白)、彈性蛋白酶I、白蛋白基因、c-fos、c-HA-ras、神經細胞黏附分子(NCAM)、H2B (TH2B)組蛋白、大鼠生長激素、人類血清類澱粉蛋白(SAA)、肌鈣蛋白I (TN I)、杜興氏肌肉失養症、人類免疫缺陷病毒和長臂猿白血病病毒(GALV)啟動子。啟動子的其他實例是本技藝中已知的。參見,例如Lodish, Molecular Cell Biology, Freeman and Company, New York 2007。在一些具體例中,啟動子是CMV立即早期啟動子。在一些具體例中,啟動子是CAG啟動子或CAG/CBA啟動子。
術語「組成型」啟動子是指一個核苷酸序列,其當與一個編碼蛋白質(例如SARS-COV2多肽或其片段))的核酸可操作地連接時,在大多數或所有生理條件下於哺乳動物細胞中使得RNA從核酸被轉錄出來。
組成型啟動子的實例包括,但不限於逆轉錄病毒勞斯肉瘤病毒(RSV) LTR啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子(參見例如Boshart et al,Cell 41:521-530, 1985)、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EF1-α啟動子(Invitrogen)。
術語「組織特異性」或「肌肉特異性」啟動子是指僅在某些特定細胞類型及/或組織中具有活性的啟動子(例如,特定基因的轉錄僅發生在表現結合至組織特異性啟動子之轉錄調節蛋白的細胞中)。在一些具體例中,調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況下,組織特異性調節序列以組織特異性方式結合誘發轉錄的組織特異性轉錄因子。在一些具體例中,啟動子經優化以供在肌肉中表現。在一些具體例中,啟動子是肌肉特異性啟動子。例如,肌肉特異性啟動子包括,但不限於骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶,SPc-512和活性比天然啟動子更高的合成肌肉啟動子(參見Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999))。
誘發型啟動子允許調節基因表現並且可以透過外源提供的化合物、環境因子(諸如溫度),或出現特定生理狀態(例如急性期、細胞的特定分化狀態或僅在複製中細胞)進行調節。誘發型啟動子和誘發型系統可得自多種商業來源,包括但不限於Invitrogen,Clontech和Ariad。誘發型啟動子的其他實例是本技藝中已知的。
受到外源提供的化合物所調節的誘發型啟動子實例包括鋅誘發型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)-誘發型小鼠乳房瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088);蛻皮激素昆蟲啟動子(No et al,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:3346-3351, 1996)、四環素-抑制型系統(Gossen et al,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551, 1992)、四環素-誘發型系統(Gossen et al,Science 268:1766-1769, 1995,亦參見Harvey et al,Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518, 1998)、RU486誘發型系統(Wang et al,Nat. Biotech. 15:239-243, 1997)與Wang et al,Gene Ther. 4:432-441, 1997),以及雷帕黴素誘發型系統(Magari et al.J. Clin. Invest. 100:2865-2872, 1997 )。
強化子及5’帽
在一些情況下,載體可包括啟動子序列及/或強化子序列。術語「強化子」是指可以增加編碼感興趣蛋白質之核酸的轉錄程度的核苷酸序列。強化子序列(長度為50-1500個鹼基對)通常藉由為轉錄相關蛋白(例如轉錄因子)提供額外結合位點來增加轉錄程度。在一些具體例中,在內含子序列內發現強化子序列。與啟動子序列不同,強化子序列可以(例如,相較於啟動子)在離轉錄起始位點遠得多的距離處發揮作用。強化子的非限制性實例包括RSV強化子、CMV強化子,和SV40強化子。
聚(A)序列
在一些具體例中,本文提供的任何載體可以包括聚(A)序列。大多數新生真核mRNA在其3'端處具有聚(A)尾,其在包括初級轉錄本裂解和偶聯聚腺苷酸化反應的複雜過程期間被添加(參見例如Proudfoot et al.,Cell 108:501-512, 2002)。聚(A)尾賦予mRNA穩定性和可轉移性(Molecular Biology of the Cell, Third Edition by B. Alberts et al., Garland Publishing, 1994)。在一些具體例中,聚(A)序列位於編碼SARS-CoV2多肽C端之核酸序列的3'。
如本文所用,「聚腺苷酸化」是指聚腺苷酸部分或其修飾變體與信使RNA分子的共價鍵聯。在真核生物中,大多數信使RNA (mRNA)分子在其3'端處被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾是透過一種酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用被添加到前mRNA的一段腺嘌呤核苷酸長序列(例如50、60、70、100、200、500、1000、2000、3000、4000或5000)。在高等真核生物中,聚(A)尾被添加到含有特定序列、聚腺苷酸化訊息或「聚(A)序列」的轉錄本上。聚(A)尾和與其結合的蛋白質有助於保護mRNA免於外切核酸酶的降解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、從細胞核輸出mRNA和轉譯也很重要。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA後立即在細胞核中發生,但也可以稍後在細胞質中發生。轉錄已經終止後,mRNA鏈在與RNA聚合酶締合的核酸內切酶複合物的作用下被切割。切割位點的特徵通常是在切割位點附近存在鹼基序列AAUAAA。mRNA已被切割後,腺苷殘基被添加到切割位點的游離3'端。
如本文所用,「聚(A)序列」是觸發mRNA的核酸內切酶切割和對受切割的mRNA的3'端添加額外一連串腺苷的序列。
有幾種可用的聚(A)序列,包括那些衍生自牛生長激素(bgh) (Woychik et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81(13):3944-3948, 1984;美國專利第5,122,458號)、小鼠-β-球蛋白、小鼠-α-球蛋白(Orkin et al.,EMBO J. 4(2):453-456, 1985;Thein et al.,Blood 71(2):313-319, 1988)、人類膠原蛋白,多瘤病毒(Batt et al.,Mol. Cell Biol. 15(9):4783-4790, 1995)、單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV TK)、IgG重鏈基因聚腺苷酸化訊息(US 2006/0040354)、人類生長激素(hGH) (Szymanski et al.,Mol. Therapy 15(7):1340-1347, 2007)、SV40聚(A)位點之群,諸如SV40晚期和早期聚(A)位點(Schek et al.,Mol. Cell Biol. 12(12):5386-5393, 1992)。
聚(A)序列可以是AATAAA的序列。AATAAA序列可以被與AATAAA同源的其他六核苷酸序列取代,這些序列能夠發出聚腺苷酸化訊息,包括ATTAAA、AGTAAA、CATAAA、TATAAA、GATAAA、ACTAAA、AATATA、AAGAAA、AATAAT、AAAAAA、AATGAA、AATCAA、AACAAA、AATCAA、AATAAC、AATAGA、AATTAA,或AATAAG (參見,例如WO 06/12414)。
在一些具體例中,聚(A)序列可以是一個合成的聚腺苷酸化位點(參見例如,Promega的Cl-neo表現載體,其是基於Levitt el al,Genes Dev. 3(7):1019-1025, 1989)。在一些具體例中,聚(A)序列是可溶性神經纖毛蛋白-1 (sNRP)的聚腺苷酸化訊息(AAATAAAATACGAAATG) (參見,例如WO 05/073384)。聚(A)序列的其他實例是本技藝中已知的。
內部核醣體進入位點(IRES)
在一些具體例中,編碼SARS-CoV-2多肽或其片段的載體可包括多核苷酸內部核醣體進入位點(IRES)。IRES序列用於從單個基因轉錄本產生超過一個多肽。IRES形成複雜的二級結構,允許從任何位置起始轉譯,其中mRNA緊鄰IRES所在位置處的下游(參見,例如Pelletier and Sonenberg,Mol. Cell. Biol. 8(3):1103-1112, 1988)。
有幾種習於技藝者熟知的IRES序列,包括那些來自例如口蹄疫病毒(FMDV)、腦心肌炎病毒(EMCV)、人類鼻病毒(HRV)、蟋蟀麻痺病毒、人類免疫缺乏病毒(HIV)、A型肝炎病毒(HAV)、C型肝炎病毒(HCV),和脊髓灰白質炎病毒(PV)。參見例如Alberts, Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 2002;與Hellen et al.,Genes Dev. 15(13):1593-612, 2001。
在一些具體例中,被併入編碼SARS-CoV-2多肽或其片段之載體的IRES序列為口蹄疫病毒(FMDV)。口蹄疫病毒2A序列是已被證明會媒介聚蛋白裂解的小型肽(長度為約18個胺基酸) (Ryan, M D et al.,EMBO 4:928-933, 1994;Mattion et al.,J. Virology 70:8124-8127, 1996;Furler et al.,Gene Therapy 8:864-873, 2001;與Halpin et al.,Plant Journal 4:453-459, 1999)。2A序列的切割活性先前已在人工系統中獲得證實,人工系統包括質體和基因治療載體(AAV和逆轉錄病毒) (Ryan et al.,EMBO 4:928-933, 1994;Mattion et al.,J. Virology 70:8124-8127, 1996;Furler et al.,Gene Therapy 8:864-873, 2001;與Halpin et al.,Plant Journal 4:453-459, 1999;de Felipe et al.,Gene Therapy 6:198-208, 1999;de Felipe et al.,Human Gene Therapy 11:1921-1931, 2000;和Klump et al.,Gene Therapy 8:811-817, 2001)。
報導子序列
本文提供的任何載體視情況可包括編碼報導子蛋白的序列(「報導子序列」)。報導子序列的非限制性實例包括編碼以下的DNA序列:β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、鹼性磷酸酶、胸苷激酶、綠色螢光蛋白(GFP)、紅色螢光蛋白、mCherry螢光蛋白、黃色螢光蛋白、氯黴素乙醯轉移酶(CAT),和螢光素酶。報導子序列的其他實例是本技藝中周知的。當與驅動其表現的調節元件相締合時,報導子序列可以提供能夠被常規方法所偵測到的訊息,包括酶促、放射照相、比色、螢光,或其他光譜分析;螢光活化細胞分選(FACS)分析;免疫學分析(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和免疫組織化學)。
在一些具體例中,報導子序列是LacZ基因,而在哺乳動物細胞中一個攜帶LacZ基因的載體的存在是藉由針對β-半乳糖苷酶活性的分析來進行偵測。在其他具體例中,報導子是螢光蛋白(例如,綠色螢光蛋白)或螢光素酶,在哺乳動物細胞中一個攜帶螢光蛋白或螢光素酶的載體的存在是藉由螢光技術(例如螢光顯微術或FACS)或在光度計中的產光(例如分光光度計或IVIS成像儀器)來進行測量。在一些具體例中,報導子序列可以用來驗證本文所述任何載體的組織特異性靶向能力和組織特異性啟動子調節活性。
側接區未轉譯區(UTR)
在一些具體例中,本文所述任何載體可包括未轉譯區。在一些具體例中,載體可包括5' UTR或3' UTR。基因的未轉譯區(UTR)被轉錄但未被轉譯。5' UTR始於轉錄起始位點並延續至起始密碼子,但不包括起始密碼子。3' UTR緊接在終止密碼子之後開始並延續直到轉錄終止訊息。越來越多的證據表明,UTR在核酸分子的穩定性和轉譯方面發揮了調節作用。UTR的調節特徵可以併入到本文所述的任何載體、組合物、套組,或方法,以提高SARS-CoV-2多肽的穩定性。
天然的5' UTR包括一個在轉譯起始時發揮作用的序列。它們具有像Kozak序列的特徵,眾所周知Kozak序列涉入核醣體藉其啟動許多基因轉譯的過程。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG,其中R是起始密碼子(AUG)上游三個鹼基的嘌呤(A或G),其後是另一個「G」。5' UTR也已經是眾所周知的,例如形成涉及延長因子結合的二級結構。
例如,在一些具體例中,5' UTR被納入本文所述的任何載體中。包括下列基因之5' UTR的5' UTR的非限制性實例可用來提高核酸分子(諸如mRNA)的表現:白蛋白、血清類澱粉蛋白A、脂蛋白元A/B/E、轉鐵蛋白、α胎蛋白、紅血球生成素,和因子VIII。
在一些具體例中,來自由肌肉細胞中的細胞所轉錄的mRNA的5' UTR可以被納入本文所述的任何載體、組合物,套組和方法中。
已知3' UTR具有數段腺苷和尿苷嵌入其中。這些富含AU的特徵在周轉率高的基因中尤為普遍。基於它們的序列特徵和功能特性,富含AU的元件(ARES)可以分成三類(Chen et al.,Mol. Cell. Biol. 15:5777-5788, 1995;Chen et al.,Mol. Cell Biol. 15:2010-2018, 1995):第I類ARE在富含U的區域內含有AUUUA模體的幾個分散複本。例如,c-Myc和MyoD mRNA含有第I類ARE。第II類ARE具有兩個或更多個重疊的UUAUUUA(U/A) (U/A)九聚體。GM-CSF和TNF-α mRNA是含有第II類ARE的實例。第III類ARE的定義不明。這些富含U的區域不含AUUUA模體。這類的兩個充分研究的實例是c-Jun和肌生成素mRNA。
已知大多數與ARE結合的蛋白質會令信使不穩定,而ELAV家族的成員(尤其是HuR)已被證明可以增加mRNA的穩定性。HuR結合至所有三類ARE。將HuR特異性結合位點改造至核酸分子的3' UTR將導致HuR結合並且因此在活體內令信使穩定。
在一些具體例中,引入,移除或修飾3' UTR ARE可以用於調控編碼SARS-CoV-2多肽之mRNA的穩定性。在其他具體例中,ARE可以被移除或被突變以增加細胞內穩定性,並因此增加本文所述任何多肽的轉譯和生產。
在其他具體例中,非UTR序列可併入5'或3' UTR。在一些具體例中,內含子或內含子序列的部分可以併入本文提供的任何載體、組合物、套組和方法中的多核苷酸的側接區域。併入內含子序列可能會增加蛋白質產量以及mRNA含量。
方法
本文還提供在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分免疫力的方法,該方法包括向個體投予治療有效量的本文所述任何AAV、本文所述任何載體,本文所述任何醫藥組合物以及本文所述任何疫苗組合物。在一些具體例中,在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分免疫力的方法包括投予佐劑(例如,CpG佐劑)。
本文還提供在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分體液性免疫力的方法,其包括向個體投予治療有效量的本文所述任何AAV、本文所述任何載體,本文所述任何醫藥組合物以及本文所述任何疫苗組合物。在一些具體例中,在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分體液性免疫力的方法進一步包括投予佐劑(例如,CpG佐劑)。
本文還提供在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分細胞性免疫力的方法,其包括向個體投予治療有效量的本文所述任何AAV、本文所述任何載體,本文所述任何醫藥組合物以及本文所述任何疫苗組合物。在一些具體例中,在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分細胞性免疫力的方法進一步包括投予佐劑(例如,CpG佐劑)。
本文還提供在個體體內增加特異性結合至SARS-CoV2多肽或其片段之抗體的效價的方法,其包括向個體投予治療有效量的本文所述任何AAV、本文所述任何載體,本文所述任何醫藥組合物以及本文所述任何疫苗組合物。在一些具體例中,在個體體內增加特異性結合至SARS-CoV2多肽之抗體的效價的方法進一步包括投予佐劑(例如,CpG佐劑)。
本文還提供在個體體內降低冠狀病毒感染率的方法,其包括向個體投予治療有效量的本文所述任何AAV、本文所述任何載體,本文所述任何醫藥組合物以及本文所述任何疫苗組合物。在一些具體例中,在個體體內降低冠狀病毒感染率的方法進一步包括投予佐劑(例如,CpG佐劑)。
在本文所述此等方法中任一者的一些具體例中,個體已被鑑定為先前未曾具有冠狀病毒感染。在本文所述此等方法中任一者的一些具體例中,在投予任何AAV、載體,醫藥組合物或疫苗組合物之前,個體已被鑑定為不具有顯著效價之特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段的抗體。
在本文所述方法中任一者的一些具體例中,冠狀病毒是229E (α冠狀病毒)、NL63 (α冠狀病毒)、OC43 (β冠狀病毒)、HKU1 (β冠狀病毒)、MERS-CoV (引起中東呼吸道症候群(MERS)的β冠狀病毒),SARS-CoV (引起嚴重急性呼吸道症候群(SARS)的β冠狀病毒),或SARS-CoV-2 (引起冠狀病毒病2019 (COVID-19)的新型冠狀病毒)。在一些具體例中,冠狀病毒是SARS-CoV-2。
在本文所述方法中任一者的一些具體例中,個體先前已被鑑定為具有一或多個選自由以下組成之群組的醫學病況:慢性肺病、中度哮喘、重度哮喘、心臟病況、糖尿病、肥胖症、肝病,慢性腎病和免疫系統衰弱或受抑制。在一些具體例中,其中免疫系統衰弱或受抑制的個體是接受癌症治療的個體、吸煙者、移植接受者的個體、患有HIV或AIDS的個體,或接受皮質類固醇或任何其他免疫抑制藥物的個體。在一些具體例中,免疫系統衰弱或受抑制的個體是年長個體。
在個體體內偵測抗體(例如,特異性結合至SARS-CoV-2多肽的抗體)存在的方法是本技藝中已知的。在一些具體例中,可以直接偵測抗體存在(例如,偵測mRNA)。可用於抗體(例如,特異性結合至SARS-CoV-2多肽的抗體)存在的技術的非限制性實例包括:ELISA、qRT-PCR、次世代定序、抗體剖析、即時PCR、西方墨點、免疫沉澱、免疫組織化學或免疫螢光。
在一些具體例中,在個體體內偵測冠狀病毒(例如,SARS-CoV-2)存在的方法包括從個體獲得樣本(例如,本文所述的或本技藝中已知的任何例示性樣本)。取自個體的樣本類型的非限制性實例可包括鼻咽(NP)樣本、口咽(OP)樣本、鼻中鼻甲拭子、前鼻孔(鼻拭子)樣本、鼻咽洗液/抽吸物或鼻洗液/抽吸物(NW)樣本、血液樣本,唾液樣本和糞便樣本。
在個體體內偵測冠狀病毒(例如,SARS-CoV-2)存在的方法是本技藝中已知的。在一些具體例中,冠狀病毒的存在可以藉由病毒RNA來進行偵測(例如,使用本文所述或技藝中已知的任何例示性技術偵測病毒RNA)。可以被用來檢測冠狀病毒(例如,SARS-CoV-2冠狀病毒)存在之技術的非限制性實例包括:ELISA、qRT-PCR、次世代定序、抗體剖析、即時PCR、西方墨點、免疫沉澱、免疫組織化學、使用Cas13的核酸偵測(參見例如,Ackerman et al.,Nat. , 582: 277-282 (2020))、使用CRISPR-Cas12的核酸偵測(參見,例如Broughton et al.,Nat. Biotech. , 38: 870-874 (2020))、使用環媒介的等溫擴增(LAMP)、RT-LAMP和LAMP定序的核酸偵測(參見例如Thi et al.,Sci, Transl. Med. , 12: (2020)),任何使用重組酶聚合酶擴增(RPA)的核酸套組或免疫螢光。在一些具體例中,偵測冠狀病毒存在的方法包括偵測病毒脫落(例如,藉由RT-qPCR測量)。在一些具體例中,冠狀病毒的存在可以透過特異性結合至SARS-CoV-2糖蛋白多肽的抗體來進行偵測。偵測抗體的方法是技藝中眾所周知的,包括但不限於酶聯免疫吸附分析(ELISA)、螢光活化細胞分選(FACS)、西方墨點、免疫沉澱、免疫螢光、質譜(LC-MS、電感耦合電漿質譜(ICP-MS)),基於MS的方法(LC-MS/MS)和電化學發光免疫分析。
醫藥組合物與套組
在一些具體例中,本文所述任何醫藥組合物或疫苗組合物可以進一步包括促進核酸或本文所述任何載體進入哺乳動物細胞的試劑(例如,脂質體或陽離子脂質)。
在一些具體例中,本文所述任何AAV或載體可以用天然及/或合成聚合物來進行調配。可納入本文所述任何組合物中之聚合物的非限制性實例可以包括,但不限於DYNAMIC POLYCONJUGATE® (Arrowhead Research Corp., Pasadena, Calif.)、來自Mirus Bio(Madison, Wis.)與Roche Madison (Madison, Wis.)的調配物、PhaseRX聚合物調配物(諸如,但不限於SMARTT POLYMER TECHNOLOGY® (PhaseRX, Seattle, Wash.))、DMRI/DOPE、帕洛沙姆(poloxamer)、Vical的VAXFECTIN®佐劑(San Diego, Calif.)、幾丁聚醣、Calando Pharmaceuticals的環糊精(Pasadena, Calif.)、樹枝狀聚合物與聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)聚合物、RONDELTM (RNAi/Oligonucleotide Nanoparticle Delivery)聚合物(Arrowhead Research Corporation, Pasadena, Calif.),以及pH反應性共嵌段聚合物,諸如但不限於由PhaseRX所製造者(Seattle, Wash.)。這些許多聚合物已被證明在活體內將寡核苷酸遞送至哺乳動物細胞的功效(參見,例如deFougerolles,Human Gene Ther. 19:125-132, 2008;Rozema et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007;Rozema et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:12982-12887, 2007;Hu-Lieskovan et al.,Cancer Res. 65:8984-8982, 2005;Heidel et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:5715-5721, 2007)。
在一些具體例中,本文所述組合物可以是例如一種醫藥組合物。醫藥組合物可以包括本文所述任何組合物以及一或多種醫藥上或生理學上可接受的載劑、稀釋劑,或賦形劑。此類組合物可包含一或多種緩衝劑,諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水與類似物;一或多種碳水化合物,諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖,和聚葡萄糖;甘露醇;一或多種蛋白質、多肽,或胺基酸,諸如甘胺酸;一或多種抗氧化劑;一或多種螯合劑,諸如EDTA或麩胱甘肽;及/或一或多種防腐劑。
在一些具體例中,本文所述組合物可以是例如一種疫苗組合物。疫苗組合物可包括本文所述任何組合物以及一或多種佐劑、載劑,稀釋劑或賦形劑。在一些具體例中,疫苗組合物包括含有下列的調配物:一或多種緩衝劑,諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水與類似物;一或多種碳水化合物,諸如葡萄糖、甘露糖,蔗糖和聚葡萄糖;甘露醇;一或多種蛋白質,多肽或胺基酸,諸如甘胺酸;一或多種抗氧化劑;一或多種螯合劑,諸如EDTA或麩胱甘肽;及/或一或多種防腐劑。
在一些具體例中,組合物(例如,醫藥組合物及/或疫苗組合物)包括醫藥上可接受的載劑(例如,磷酸鹽緩衝鹽水、鹽水或抑菌水)。在調配時,溶液將以與劑量調配物相容的方式並且呈治療有效量投予。調配物易於以各種劑型投予,劑型為諸如可注射溶液、可注射凝膠,藥物釋放膠囊與類似者。
如本文所用,術語「醫藥上可接受的載劑」包括與醫藥投予相容的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑,抗真菌劑與類似物。補充活性化合物也可併入本文所述任何組合物中。
在一些具體例中,本文所述任何組合物(例如醫藥組合物及/或疫苗組合物)的單一劑量例如在緩衝溶液中可以包括總量如下的AAV或載體:至少1 ng、至少2 ng、至少4 ng、約6 ng、約8 ng、至少10 ng、至少20 ng、至少30 ng、至少40 ng、至少50 ng、至少60 ng、至少70 ng、至少80 ng、至少90 ng、至少100 ng、至少200 ng、至少300 ng、至少400 ng、至少500 ng、至少1 μg、至少2 μg、至少4 μg、至少6 μg、至少8 μg、至少10 μg、至少12 μg、至少14 μg、至少16 μg、至少18 μg、至少20 μg、至少22 μg、至少24 μg、至少26 μg、至少28 μg、至少30 μg、至少32 μg、至少34 μg、至少36 μg、至少38 μg、至少40 μg、至少42 μg、至少44 μg、至少46 μg、至少48 μg、至少50 µg、至少52 µg、至少54 µg、至少56 µg、至少58 µg、至少60 µg、至少62 μg、至少64 μg、至少66 μg、至少68 μg、至少70 μg、至少72 μg、至少74 μg、至少76 μg、至少78 μg、至少80 μg、至少82 μg、至少84 μg、至少86 μg、至少88 μg、至少90 μg、至少92 μg、至少94 μg、至少96 μg、至少98 μg、至少100 μg、至少102 μg、至少104 μg、至少106 μg、至少108 μg、至少110 μg、至少112 μg、至少114 μg、至少116 μg、至少118 μg、至少120 μg、至少122 μg、至少124 μg、至少126 μg、至少128 μg、至少130 μg、至少132 μg、至少134 μg、至少136 μg、至少138 μg、至少140 μg、至少142 μg、至少144 μg、至少146 μg、至少148 μg、至少150 μg、至少152 μg、至少154 μg、至少156 μg、至少158 μg、至少160 μg、至少162 μg、至少164 μg、至少166 μg、至少168 μg、至少170 μg、至少172 μg、至少174 μg、至少176 μg、至少178 μg、至少180 μg、至少182 μg、至少184 μg、至少186 μg、至少188 μg、至少190 μg、至少192 μg、至少194 μg、至少196 μg、至少198 μg,或至少200 μg。
本文所提供的組合物(例如,醫藥組合物及/或疫苗組合物)可以例如被調配成與其預期的投予路徑相容。期望投予路徑的非限制性實例為局部投予(靜脈內或注射(例如,肌肉內注射))。
在一些具體例中,治療組合物被調配成包括脂質奈米顆粒。在一些具體例中,治療組合物被調配成包括聚合物奈米顆粒。在一些具體例中,治療組合物被調配成包括微環DNA。在一些具體例中,治療組合物被調配成包括CELiD DNA。在一些具體例中,治療組合物被調配成包括合成外淋巴溶液。例示性合成外淋巴溶液包括 20-200 mM NaCl;1-5 mM KCl;0.1-10 mM CaCl2 ;1-10 mM葡萄糖;2-50 mM HEPES,具有約6和約9之間的pH值。
還提供了套組,其包括本文所述任何AAV,載體或組合物(例如,醫藥組合物及/或疫苗組合物)。在一些具體例中,套組可包括固體組合物(例如,凍乾組合物,其包括本文所述AAV、載體,或醫藥組合物及/或疫苗組合物),以及用於溶解該凍乾組合物的液體。在一些具體例中,套組可包括預裝填注射器,其包括本文所述任何組合物AAV、載體,或醫藥組合物及/或疫苗組合物。
在一些具體例中,套組包括一個小瓶,其包括本文所述任何組合物(例如,調配為水性組合物,例如水性醫藥組合物或疫苗組合物)。
在一些具體例中,套組可包括用於執行本文所述任何方法的說明書。
實施例
實施例1. 構建含有SARS-CoV-2 S2結構域多肽或SARS-CoV-2核蛋白殼多肽的AAV載體
藉由將編碼SARS-CoV-2 S2結構域的核酸序列(SEQ ID NO:2或3)或編碼SARS-CoV-2核蛋白殼多肽的核酸序列(SEQ ID NO:5)次選殖至AAV載體來構建AAV載體。參見圖1-6。
實施例2. 投予治療有效量的AAV以在人類個體體內治療冠狀病毒感染或預防未來的冠狀病毒感染
經鑑定為具有冠狀病毒感染或罹患冠狀病毒感染風險增加的人類個體被投予治療有效量的醫藥組合物(其包含AAV載體),以治療冠狀病毒感染或預防未來的冠狀病毒感染。
在至少一些情況下,將一個劑量的醫藥組合物(其包含包括編碼SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽(SEQ ID NO:1)的核酸序列的AAV載體)是經由肌肉內注射被投予給人類個體。在至少一些情況下,投予醫藥組合物可在個體體內導致特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段的抗體的效價增加。在至少一些情況下,投予醫藥組合物可在個體體內導致冠狀病毒感染率下降。在至少一些情況下,由於針對冠狀病毒的體液性免疫力,投予醫藥組合物可導致針對冠狀病毒的至少部分免疫力。至少在一些情況下,投予醫藥組合物可導致針對冠狀病毒的強大T細胞媒介的免疫力。
在至少一些情況下,於投予醫藥組合物之前或之後,從人類個體取得的樣本(例如血液樣本、體液樣本,或組織樣本)評估冠狀病毒感染(例如,測定病毒效價)或特異性結合至SARS-CoV-2糖蛋白多肽的抗體的存在。使用定量RT-PCR偵測病毒RNA及/或ELISA分析偵測特異性結合至SARS-CoV-2糖蛋白多肽的抗體,來確定冠狀病毒(例如,SARS-CoV-2)存在或過去曾暴露於冠狀病毒。若存在SARS-CoV-2及/或特異性結合SARS-CoV-2糖蛋白多肽的抗體高出給定閾值(例如,針對qRT-PCR,鑑定為高出某個閾值循環(Ct),或針對特異性結合SARS-CoV-2糖蛋白多肽的抗體,鑑定為具有顯著效價之特異性結合至SARS-CoV-2多肽的抗體),則患者被鑑定為具有,或先前已具有SARS-CoV-2感染。在至少一些情況下,經由肌肉內注射向人類個體投予第二劑量之包含AAV載體的醫藥組合物,該AAV載體包括編碼SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽(SEQ ID NO:1)的核酸序列。在至少一些情況下,第二劑量是基於在投予第一劑量之後,不存在顯著效價之特異性結合至SARS-CoV-2糖蛋白多肽之抗體而被投予給人類個體。
其他實施例
應當理解,儘管已經結合詳細說明來說明本發明,但前述說明旨在說明而非限制本發明範疇,本發明範疇由隨附申請專利範圍所囿限。其他態樣、優點和修改在以下申請專利範圍的範疇內。
本文提及的所有出版品、專利申請案、專利案和其他參考文獻均以全文引用的方式併入本文。如有衝突,以本說明書(包括定義)為準。此外,章節標題、材料,方法和實施例僅是說明性的而不希望是限制性的。
圖1A是對應於SEQ ID NO:1的SARS-CoV-2 S糖蛋白的胺基酸序列。下面提供了對應於例示性結構域的胺基酸序列。訊息序列(SS)用一個圍繞著胺基酸序列的框與「SS」表示。S1的N-端結構域(NTD)用劃底線文字表示。受體結合結構域(RBD)用斜體文字表示。S1/S2蛋白酶切割位點(S1/S2)用一個圍繞著胺基酸序列的框與「S1/S2」表示。S2'蛋白酶切割位點(S2)用雙括號括起來的劃底線文字表示。融合肽(FP)用粗體文字表示。七肽重複序列1 (HR1)用雙括號括起來的斜體文字表示。中央螺旋(CH)用雙括號括起來的粗體文字表示。連接子結構域(CD)用雙括號括起來的劃底線和斜體文字表示。跨膜結構域(TM)用雙括號括起來的劃底線和粗體文字表示。
圖1B是一個例示性示意圖,顯示SARS-CoV-2 S糖蛋白的結構域(胺基酸1至1273)。SS - 訊息序列。NTD - S1的N端結構域。RBD - 受體結合結構域。SD1 - 子域1。SD2 - 子域2。S1/S2蛋白酶切割位點(用箭頭和文字表示)。S2'蛋白酶切割位點(用箭頭和文字表示)。(FP)融合肽。HR1 - 七肽重複序列1。CH - 中央螺旋。CD - 連接子結構域。HR2 -七肽重複序列2。TM- 跨膜結構域。CT - 細胞質尾部。殘基1208表示SARS-CoV-2 S糖蛋白外層結構域的末端。
圖2是編碼全長SARS-CoV-2 S糖蛋白的rAAV質體,和S1結構域與S2結構域多肽之對應結構的一個示意圖。插圖框顯示了位於CMV啟動子序列中的轉錄因子結合位點的示意圖。SRE - 血清反應元件。NFkB - 轉錄因子核因子-κB家族的結合位點。Sp1 - Sp1轉錄因子的結合位點。STAT - 訊息轉導因子和轉錄活化因子(STAT)轉錄因子家族的結合位點。AP-1 - 活化因子蛋白1 (AP-1)轉錄因子的結合位點。CREB - 是cAMP反應元件結合蛋白(CREB)轉錄因子的結合位點。TATA - TATA盒。TS - 轉錄起始位點。
圖3是編碼全長SARS-CoV-2 S糖蛋白的rAAV質體,和S1結構域與S2結構域多肽之對應結構的第二個示意圖,該S1結構域與S2結構域多肽之對應結構呈現不同於圖2的位向。插圖框包括與圖2中相同的示意圖和說明。
圖4是編碼全長SARS-CoV-2 S糖蛋白的rAAV質體,和S1結構域與S2結構域多肽之對應結構的第三個示意圖。插圖框包括與圖2中相同的示意圖和說明。
圖5是編碼全長SARS-CoV-2 S糖蛋白的rAAV質體的第四個示意圖。
圖6是顯示選殖策略的示意圖,該選殖策略是用於將一個編碼全長SARS-CoV 2 S糖蛋白的序列插入rAAV質體。
 
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
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Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012

Claims (65)

  1. 一種腺相關病毒(AAV)載體,其包含編碼SARS-CoV-2多肽或其片段的序列。
  2. 如請求項1之AAV載體,其中該SARS-CoV-2多肽是SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段。
  3. 如請求項2之AAV載體,其中該S糖蛋白多肽或其片段包含S1結構域或其片段。
  4. 如請求項2之AAV載體,其中該S糖蛋白多肽或其片段包含S2結構域或其片段,基本上由或由S2結構域或其片段組成。
  5. 如請求項4之AAV載體,其中該S2結構域或其片段包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3、基本上由或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3組成。
  6. 如請求項2至5中任一項之AAV載體,其進一步包含編碼跨膜結構域的序列,其中該編碼跨膜結構域的序列可操作地連接至編碼S糖蛋白多肽或其片段之序列。
  7. 如請求項6之AAV載體,其中該跨膜結構域包括SEQ ID NO:4的序列或其片段。
  8. 如請求項1之AAV載體,其中該SARS-CoV-2多肽或其片段是核蛋白殼蛋白或其片段。
  9. 如請求項8之AAV載體,其中該核蛋白殼多肽或其片段包含SEQ ID NO:5的序列或其片段。
  10. 如請求項1之AAV載體,其中該SARS-CoV-2多肽或其片段是被膜多肽或其片段。
  11. 如請求項1之AAV載體,其中該SARS-CoV-2多肽或其片段是膜多肽或其片段。
  12. 如請求項1至11中任一項之AAV載體,其進一步包含編碼訊息序列的序列,其中編碼訊息序列的序列可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段的序列。
  13. 如請求項12之AAV載體,其中該訊息序列包含SEQ ID NO:6的序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之AAV載體,其進一步包含可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段之序列的啟動子。
  15. 如請求項14之AAV載體,其中該啟動子是肌肉特異性啟動子。
  16. 如請求項15之AAV載體,其中該肌肉特異性啟動子選自由以下組成之群組組:骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶、SPc-512,和合成肌肉啟動子。
  17. 如請求項14之AAV載體,其中該啟動子選自由以下組成之群組組:CMV、RSV、SV40、β-肌動蛋白、PGK,和EF1啟動子。
  18. 如請求項1至17中任一項之AAV載體,其中該AAV載體包含AAV血清型6 (AAV6)蛋白殼蛋白。
  19. 如請求項1至17中任一項之AAV載體,其中該AAV載體包含AAV血清型9 (AAV9)蛋白殼蛋白。
  20. 如請求項1至17中任一項之AAV載體,其中該AAV載體包含Anc80、Anc80Lib、ANC 81、Anc82、Anc83、Anc84、Anc110、Anc113、Anc126、Anc127,或另一種系統發生學上相關的AAV蛋白殼蛋白。
  21. 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至20中任一項之AAV載體。
  22. 如請求項21之醫藥組合物,其進一步包含佐劑。
  23. 如請求項22之醫藥組合物,其中佐劑是CpG佐劑。
  24. 一種疫苗組合物,其包含如請求項1至20中任一項之AAV載體。
  25. 如請求項24之疫苗組合物,其進一步包含佐劑。
  26. 如請求項25之疫苗組合物,其中該佐劑是CpG佐劑。
  27. 一種載體,其包含編碼SARS-CoV-2多肽或其片段的序列。
  28. 如請求項27之載體,其中該SARS-CoV-2多肽是SARS-CoV-2 S糖蛋白多肽或其片段。
  29. 如請求項28之載體,其中該S糖蛋白多肽或其片段包括S1結構域或其片段。
  30. 如請求項28之載體,其中該S糖蛋白多肽或其片段包含S2結構域或其片段、基本上由或由S2結構域或其片段組成。
  31. 如請求項30之載體,其中該S2結構域或其片段包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3、基本上由或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3組成。
  32. 如請求項28至31中任一項之載體,其進一步包含編碼跨膜結構域的序列,其中該編碼跨膜結構域的序列可操作地連接至編碼S糖蛋白多肽或其片段的序列。
  33. 如請求項32之載體,其中該跨膜結構域包含SEQ ID NO:4的序列或其片段。
  34. 如請求項27之載體,其中該SARS-CoV-2多肽或其片段是核蛋白殼蛋白或其片段。
  35. 如請求項34之載體,其中該核蛋白殼多肽或其片段包含SEQ ID NO:5的序列或其片段。
  36. 如請求項27之載體,其中該SARS-CoV-2多肽或其片段是被膜多肽或其片段。
  37. 如請求項27之載體,其中該SARS-CoV-2多肽或其片段是膜多肽或其片段。
  38. 如請求項27至37中任一項之載體,其進一步包含編碼訊息序列的序列,其中該編碼訊息序列的序列可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段的序列。
  39. 如請求項38之載體,其中該訊息序列包含SEQ ID NO:6的序列。
  40. 如請求項27至39中任一項之載體,其進一步包含可操作地連接至編碼SARS CoV-2多肽或其片段之序列的啟動子。
  41. 如請求項40之載體,其中該啟動子是肌肉特異性啟動子。
  42. 如請求項41之載體,其中該肌肉特異性啟動子選自由以下組成之群組:骨骼β-肌動蛋白、肌凝蛋白輕鏈2A、肌肉萎縮蛋白、肌肉肌酸激酶、SPc-512,和合成肌肉啟動子。
  43. 如請求項40之載體,其中該啟動子選自由以下組成之群組:CMV、RSV、SV40、β-肌動蛋白、PGK,和EF1啟動子。
  44. 如請求項27至43中任一項之載體,其中該載體是病毒載體。
  45. 如請求項44之載體,其中該病毒載體是慢病毒載體或皰疹病毒載體。
  46. 如請求項27至43中任一項之載體,其中該載體是質體。
  47. 一種醫藥組合物,其包含如請求項27至46中任一項之載體。
  48. 如請求項47之醫藥組合物,其進一步包含佐劑。
  49. 如請求項48之醫藥組合物,其中該佐劑為CpG佐劑。
  50. 一種疫苗組合物,其包含如請求項27至46中任一項之載體。
  51. 如請求項50之疫苗組合物,其進一步包含佐劑。
  52. 如請求項51之疫苗組合物,其中該佐劑為CpG佐劑。
  53. 一種在個體體內針對冠狀病毒誘發至少部分免疫力的方法,該方法包含向個體投予治療有效量之如請求項1至20中任一項的AAV或AAV載體、如請求項27至46中任一項之載體、如請求項21至23與47至49中任一項之醫藥組合物,或如請求項24至26與50至52中任一項之疫苗組合物。
  54. 如請求項53之方法,其中由於針對冠狀病毒的體液性免疫力,該投予導致針對冠狀病毒的至少部分免疫力。
  55. 如請求項53之方法,其中該投予導致針對冠狀病毒的強大T細胞媒介的免疫力。
  56. 如請求項53之方法,其中該投予導致在個體體內特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段之抗體的效價增加。
  57. 如請求項53至56中任一項之方法,其中該投予導致在個體體內的冠狀病毒感染率下降。
  58. 如請求項53至57中任一項之方法,其中該方法進一步包含向個體投予佐劑。
  59. 如請求項58之方法,其中該佐劑是CpG佐劑。
  60. 如請求項53至59中任一項之方法,其中該個體已被鑑定為先前未曾有過冠狀病毒感染。
  61. 如請求項53至59中任一項之方法,其中在該投予步驟之前,該個體已被鑑定為不具有顯著效價的特異性結合至SARS-CoV-2多肽或其片段的抗體。
  62. 如請求項53至61中任一項之方法,其中該冠狀病毒是SARS-CoV-2。
  63. 如請求項53至62中任一項之方法,其中該個體先前已被鑑定為患有一或多種選自由以下組成之群組的醫學病況:慢性肺病、中度哮喘、重度哮喘、心臟病況、糖尿病、肥胖症、肝病、慢性腎病和免疫系統衰弱或受抑制。
  64. 如請求項63之方法,其中該免疫系統衰弱或受抑制的個體是接受癌症治療的個體、吸煙者、移植接受者的個體、患有HIV或AIDS的個體,或接受皮質類固醇或任何其他免疫抑制藥物的個體。
  65. 如請求項63之方法,其中該免疫系統衰弱或受抑制的個體是年長個體。
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