CN116157147A

CN116157147A - 组合猪疫苗

Info

Publication number: CN116157147A
Application number: CN202180060299.8A
Authority: CN
Inventors: E·迪亚兹; G·S·克莱因; J·克罗尔; F·L·L·莱特; M·B·鲁夫; M·A·斯泰伦
Original assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2021-07-22
Publication date: 2023-05-23
Also published as: CA3185751A1; BR112023001324A2; AU2021311726A1; EP4185321A2; CL2023000118A1; WO2022020593A2; CO2023000299A2; JP2023535066A; US20230241198A1; WO2022020593A3; KR20230044474A; MX2023001024A

Abstract

本发明涉及一种疫苗，其包含胞内劳森氏菌的抗原，以及选自猪圆环病毒(PCV)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的至少一种进一步病原体的一种或多种抗原，其中所述胞内劳森氏菌的抗原是活的胞内劳森氏菌。

Description

组合猪疫苗

相关申请的交叉引用

参考PCT公开号WO 96/39629、WO 05/011731、WO 06/012949、WO 06/020730、WO06/099561、WO 07/011993、WO 07/076520、WO 07/140244、WO 08/073464、WO 09/037262、WO09/127684、WO 09/144088、WO 2011/054951、WO 2015/082457、WO 2015/082458、WO 2015/082465、WO 2016/124620、WO 2016/124623、WO 2017/068126、WO 2017/162741、WO 2018/189290、WO 2018/115435和WO 2019/166362，以及于2020年4月6日提交的国际专利申请序列号PCT/US2020/026930。

上述申请，以及其中或在其申请过程中引用的所有文件(“申请引用的文件”)，以及申请引用的文件中引用或提及的所有文件，以及本文引用或提及的所有文件(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用或提及的所有文件，连同本文或本文引入参考的任何文件中提及的任何产品的任何制造商说明书、说明书、产品说明书和产品活页，在此引入本文作为参考，并且可以在本发明的实践中采用。更具体而言，所有提及的文件都引入作为参考，其程度如同每个个别文件被特异性地且个别地指示引入作为参考一样。

技术领域

本文公开的是包含胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)抗原、猪圆环病毒(PCV)抗原、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)(M.hyo.)抗原、以及猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)抗原的组合猪疫苗，其生产方法及其用途。

背景技术

胞内劳森氏菌，猪增生性肠病(“PPE”)的致病因子，影响基本上所有动物，包括人、兔、雪貂、仓鼠、狐狸、马以及其它不同的动物如鸵鸟和鸸鹋，并且是猪群损失的一个特别重要的原因。PPE的一致特征是在受影响的肠部分的肠细胞内出现胞质内、非膜结合的弯曲状杆菌。与PPE相关的细菌已被称为“弯曲杆菌(Campylobacter)样微生物”。S.McOrist等人，Vet.Pathol.，第26卷，260-64(1989)。随后，致病细菌已被鉴定为新型分类学属和种，俗称为细胞内回肠共生体(IS)。C.Gebhart等人，Int'l.J.of Systemic Bacteriology，第43卷，第3期，533-38(1993)。这些新型细菌已被给予分类学名称胞内劳森氏菌(Lawsonia(L.)intracellularis)。S.McOrist等人，Int'l.J.of Systemic Bacteriology，第45卷，第4期，820-25(1995)。这三个名称可互换使用，以指如本文进一步鉴定且描述的同一生物。

猪圆环病毒型(PCV)是一种无包膜的、二十面体单链DNA(ssDNA)病毒，属于圆环病毒科(Circoviridae)中的圆环病毒属(Circovirus)。基因组编码两个主要开放读码框(ORF)，其中ORF1编码复制相关蛋白(rep)，而ORF2编码病毒衣壳(cap)蛋白，其决定了病毒的抗原特性。PCV2与猪圆环病毒1型(PCV1)共享大约80％的序列同一性。然而，与一般非强毒的PCV1形成对比，感染PCV2的猪显示出通常被称为断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的综合征。PCV3在遗传上不同于猪圆环病毒2型(PCV2)；具体而言，在两种病毒之间在rep基因中存在仅48％的氨基酸同一性，并且在cap基因中存在26％的氨基酸同一性。

猪肺炎支原体(M.hyo.)是分类在支原体科(mycoplasmataceae)中的小细菌(400-1200nm)。猪肺炎支原体与地方性肺炎相关，所述地方性肺炎是在生长猪和育肥猪中常见的猪呼吸系统疾病。猪肺炎支原体攻击气管和肺的上皮细胞的纤毛，导致纤毛停止跳动(纤毛停滞)并最终导致肺区域塌陷。猪肺炎支原体被视为促进PRRSV和其它呼吸道病原体进入肺内的主要病原体。分开的菌株232、J和7448已对其基因组进行测序(Minion等人，J.Bacteriol.186:7123-33，2004；Vasconcelos等人，J.Bacteriol.187:5568-77，2005，以及Han等人，Genome Announc.2017年9月；5(38):e01012-17)。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)被许多人视为目前影响全球养猪业的最重要疾病。PRRS病毒(PRRSV)是分类在动脉炎病毒科(Arteriviridae)中的有包膜的单链RNA病毒。在PRRSV的不同分离株的抗原特性中存在很大的变化性，并且预防感染的有效措施是有限的。存在可用于PRRS的主要三组疫苗：减毒的改良活病毒(MLV)、杀死的病毒疫苗或重组疫苗。PRRSV的病毒包膜蛋白一般基于病毒粒子中的蛋白质丰度分类成主要蛋白和次要蛋白。主要的病毒包膜蛋白是gp5(ORF 5)和M(ORF 6)并形成二聚体。次要包膜蛋白是gp2(ORF2)、gp3(ORF3)、gp4(ORF4)和E(ORF2b)，以及很可能新近鉴定的病毒蛋白gp5a(ORF 5a)。活性抗原组分可以包括来自PRRSV病毒的ORF4、ORF5、ORF6或ORF7。

存在关于针对上述病原体对动物进行免疫的新模式的持续需要。

因此，本发明潜在的技术问题是提供用于针对病原体对动物进行免疫的进一步手段和方法。通过提供在权利要求中表征并且如本文下文提供的实施方案，问题得到解决并且上文提到的需要得到满足。

本申请中的任何文件的引用或标识并非承认此类文件可作为本发明的现有技术获得。

发明内容

本发明涉及一种疫苗，其包含胞内劳森氏菌的抗原，以及选自猪圆环病毒(PCV)、猪肺炎支原体(M.hyo.)和猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的至少一种进一步病原体的一种或多种抗原，其中所述胞内劳森氏菌的抗原是活的胞内劳森氏菌。

相应地，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和PCV的抗原。

因此，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白。

疫苗还可以包含活的胞内劳森氏菌和猪肺炎支原体的抗原。

因此，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和猪肺炎支原体菌苗。

疫苗还可以包含活的胞内劳森氏菌和PRRSV的抗原。

因此，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和减毒的PRRSV病毒。

疫苗还可以包含活的胞内劳森氏菌、PCV的抗原和猪肺炎支原体的抗原。

因此，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白和猪肺炎支原体菌苗。

疫苗还可以包含活的胞内劳森氏菌、PCV的抗原和PRRSV的抗原。

因此，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白和减毒的PRRSV病毒。

疫苗还可以包含活的胞内劳森氏菌、PRRSV的抗原和猪肺炎支原体的抗原。

因此，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和减毒的PRRSV病毒和猪肺炎支原体菌苗。

疫苗还可以包含活的胞内劳森氏菌、PCV的抗原、猪肺炎支原体的抗原和PRRS的抗原。

因此，疫苗可以包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白和猪肺炎支原体菌苗和减毒的PRRSV病毒。

优选地，疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV的抗原。

更优选地，疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2抗原。

更优选地，疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2的重组多肽。

在一个特别优选的实施方案中，疫苗包含在Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac

或/>

中包括的PCV抗原。术语“活的胞内劳森氏菌”包括“改良活的胞内劳森氏菌”和“减毒的胞内劳森氏菌”。

本发明的疫苗可以具有约10³至10⁹个细菌/Kg体重，优选约10⁵至10⁷个细菌/Kg体重的胞内劳森氏菌的剂量。本发明的疫苗还可以具有约10⁵至约10⁷个胞内劳森氏菌细菌的胞内劳森氏菌抗原的剂量。

胞内劳森氏菌的抗原可以是冻干的。优选地，胞内劳森氏菌的抗原是

Ileitis中包括的抗原。

本发明的疫苗的PCV抗原可以是PCV1、PCV2或PCV3的抗原。优选地，PCV抗原是PCV2抗原。PCV抗原可以是重组多肽。所述重组多肽可以由PCV ORF基因表达。优选地，PCV ORF基因是PCV ORF2基因。PCV重组多肽可以在杆状病毒细胞中表达。优选地，PCV抗原是在Ingelvac

中包括的抗原，或PCV的抗原包括/>

在本发明的疫苗中，PCV的抗原可以具有约2μg至约400μg的剂量。

本发明的疫苗的猪肺炎支原体的抗原可以是上清液和/或菌苗。本文下文提供了上清液和菌苗的详细描述。优选地，猪肺炎支原体的抗原是在Ingelvac

中包括的猪肺炎支原体的抗原或在/>

中包括的猪肺炎支原体的抗原。

本发明的疫苗的PRRSV抗原可以是活的PRRSV病毒。所述活病毒可以是改良的和/或减毒的病毒。本发明的疫苗可以具有每剂量约10¹至约10⁷个病毒颗粒，优选每剂量约10³至约10⁵个颗粒，更优选每剂量约10⁴至约10⁵个颗粒的PRRSV抗原的剂量。本发明的疫苗可以具有每剂量约10⁴至约10⁷个病毒颗粒的PRRSV抗原的剂量。PRRSV抗原可以是冻干的。优选地，PRRSV抗原是在

PRRSV MLV中包括的PRRSV抗原或在/>

中包括的PRRSV抗原。

PCV的抗原、猪肺炎支原体的抗原和PRRSV的抗原可以是

中包括的抗原。

本发明的疫苗可以是在

中溶解的胞内劳森氏菌的冻干抗原。相应地，本发明的疫苗可以是在/>

中溶解的冻干的活的胞内劳森氏菌。此外，本发明的疫苗可以是在/>

中溶解的/>

Ileitis。

在一个实施方案中，本发明的疫苗可以进一步包含药学或兽医学可接受的载体。在一个实施方案中，本发明的疫苗可以进一步包含一种或多种佐剂。合适的佐剂是本领域已知的并且非限制性实例在本文中进行描述。本发明的疫苗可以包含以下中的一种或多种作为佐剂：丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；马来酸酐和烯基衍生物的共聚物；交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；卡波姆；与多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个且不多于8个羟基，其中至少三个羟基的氢原子任选地被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团替换，其中所述原子团含有2至4个碳原子，如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团，并且不饱和原子团本身可以含有其它取代基，如甲基；

974P；/>

934P；/>

971P；/>

980；/>

941P；/>

氢氧化铝；磷酸铝；皂苷；Quil A；QS-21；GPI-0100；油包水型乳状液；水包油型乳状液；水包油包水型乳状液；基于轻质液体石蜡油或欧洲药典(European Pharmacopea)型佐剂的乳状液；类异戊二烯油；角鲨烷；源自于烯烃或异丁烯或癸烯的低聚反应的角鲨烯油；含有线性烷基的酸或醇的酯；植物油；油酸乙酯；丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)；甘油三(辛酸酯/癸酸酯)；丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯；异硬脂酸酯；非离子型表面活性剂；脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯或乙二醇酯或聚甘油酯或丙二醇酯或油酸酯或异硬脂酸酯或蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯，任选地乙氧基化的无水甘露醇油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，Pluronic产品，RIBI佐剂系统；嵌段共聚物；SAF-M；单磷酰脂质A；阿夫立定脂质-胺佐剂；来自大肠杆菌(E.coli)的不耐热肠毒素(重组或其它方式)；霍乱毒素；IMS 1314，或胞壁酰二肽。

优选地，佐剂是卡波姆。有利地，佐剂可以是

和/或/>

本发明的疫苗可以是用于全身施用的形式。

本发明的疫苗可以配制和/或包装用于单一剂量或一次性施用。

本发明的疫苗可以配制和/或包装用于多剂量方案，优选两剂量方案。

本发明的疫苗可以是剂型，其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送。所述容器可以含有所述疫苗的至少10、至少50、至少100、至少150、至少200或至少250个剂量。

本发明还涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，所述方法包括将所述疫苗施用于动物。

本发明还涵盖了用于在猪中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，所述方法包括将所述疫苗施用于猪。

本发明还涵盖了用于在动物中引发针对胞内劳森氏菌和/或PCV和/或猪肺炎支原体和/或PRRSV的保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法中。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和猪肺炎支原体的保护性免疫应答的方法中。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PRRS的保护性免疫应答的方法中。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV和猪肺炎支原体的保护性免疫应答的方法中。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV和PRRS的保护性免疫应答的方法中。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PRRS和猪肺炎支原体的保护性免疫应答的方法中。

在一个优选的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV和猪肺炎支原体和PRRSV的保护性免疫应答的方法中。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中所述疫苗是全身施用的。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中所述疫苗作为一个剂量进行施用。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中所述疫苗作为至少一个剂量进行施用。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗。

本发明还涵盖了用于针对动物中由至少一种病原体引起的临床疾病对所述动物进行免疫的方法中的本发明的疫苗，其中所述疫苗并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述至少一种病原体的致病形式对动物进行免疫的免疫应答。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于减少动物中的肠损伤。因此，本发明的疫苗用于与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，减少动物中的肠损伤的方法中，所述方法包括将所述疫苗施用于动物。肠损伤可以是回肠损伤。

肠损伤和/或回肠损伤可以是肉眼损伤和/或微观损伤。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于减少动物的粪便脱落。因此，本发明的疫苗用于与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，减少动物的粪便脱落的方法中，所述方法包括将所述疫苗施用于动物。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于增加动物的平均日增重。因此，本发明的疫苗用于与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，增加动物的平均日增重的方法中，所述方法包括将所述疫苗施用于动物。

本发明还涵盖了用于引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，其中所述疫苗针对用8x10⁹个劳森氏菌属(Lawsonia)细菌的攻击是保护性的。

本发明还涵盖了用于在动物中引发针对胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的免疫应答或免疫学应答或者保护性免疫或免疫学应答的方法，其可以包括将本文公开的任何疫苗施用于动物。

本发明还涵盖了针对动物中由至少一种病原体引起的临床疾病对所述动物进行免疫的方法，其中所述方法可以包括向动物施用本文公开的疫苗中的任何一种疫苗的步骤，其中所述疫苗并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述至少一种病原体的致病形式对动物进行免疫的免疫应答。

相应地，本发明涵盖了本发明的疫苗在制备用于诱导针对胞内劳森氏菌和/或PCV和/或猪肺炎支原体和/或PRRSV的保护性免疫应答的组合物中的用途，或者用于诱导针对胞内劳森氏菌和/或PCV和/或猪肺炎支原体和/或PRRSV的保护性免疫应答的方法的用途。

本发明还涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，该方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗。

此外，本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，该方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗，并且其中所述疫苗包含活的胞内劳森氏菌和/或PCV2 ORF2蛋白和/或猪肺炎支原体菌苗和/或减毒的PRRSV病毒。

进一步地，本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，该方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗，并且其中所述疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白和猪肺炎支原体菌苗和减毒的PRRSV病毒。

本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，该方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗，并且其中所述疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白。

本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，该方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗，并且其中所述疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

另外，本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，该方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用

(泰妙菌素)和/或CTC(金霉素)进行治疗，并且其中所述疫苗包含在/>

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

进一步注意到，本发明并不预期在本发明的范围内涵盖并不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)的书面描述和实现要求的任何产品、过程或产品的制备或使用产品的方法，使得申请人保留权利并因此公开了任何先前描述的产品、制备产品的过程或使用产品的方法的免责声明。明确保留了所有权利，即明确放弃本申请系列或任何其它系列或任何第三方的任何先前提交的申请中申请人的任何授权专利的主题的任何实施方案。本文的任何内容均不得解释为承诺。

应注意，在本公开内容中且特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”等等可以具有美国专利法中归于其的含义；例如，它们可以意指“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等等；并且术语例如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有美国专利法中归于其的含义，例如，它们允许未明确叙述的元素，但排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新型特性的元素。

这些和其它实施方案在下述详细描述中公开或者由其显而易见并由其涵盖。

附图说明

作为示例给出，但并不预期将本发明仅仅限于所述具体实施方案的下述详细描述，与附图结合可以得到最好地理解。

图1显示了：平均回肠总体损伤评分。不同的字母指示了统计显著性(p<0.05)，误差条表示了平均值的标准误。

图2显示了：平均回肠总体损伤长度。不同的字母指示了统计显著性(p<0.05)，误差条表示了标准误。

图3显示了：平均回肠损伤严重程度。不同的字母指示了统计显著性(p<0.05)，误差条表示了标准误。

图4显示了：组平均日增重(磅)。不同的字母指示了统计显著性(p<0.05)，误差条表示了标准误。

图5显示了：对于劳森氏菌属具有血清ELISA阳性结果的动物的百分比。

图6显示了：按天计的脱落的胞内劳森氏菌的平均数量。不同的字母指示了统计显著性(p<0.05)，误差条表示了标准误。

图7显示了：在回肠末端测量的平均微观损伤评分。不同的字母指示了统计显著性(p<0.05)，误差条表示了标准误。

图8显示了：关于回肠组织中存在的胞内劳森氏菌抗原的平均免疫组织化学评分。

图9显示了：疫苗共混。

10显示了：研究大纲。在疫苗接种之前和之后一周，泰妙菌素/CTC仅在饲料中给予EIIMATB组。两个组(EIIM和EIIMATB)均在攻击之前4周同时接受疫苗。在感染后21天(dpi)*＝血液和粪便收集时，对所有动物实施安乐死且进行尸检。每天的临床评分0-21。

具体实施方式

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和猪肺炎支原体的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和猪肺炎支原体菌苗。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PRRSV的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和减毒的PRRSV病毒。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌、PCV的抗原和猪肺炎支原体的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白和猪肺炎支原体菌苗。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌、PCV的抗原和PRRSV的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白和减毒的PRRSV病毒。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌、PRRSV的抗原和猪肺炎支原体的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和减毒的PRRSV病毒和猪肺炎支原体菌苗。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌、PCV的抗原、猪肺炎支原体的抗原和PRRSV的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV2 ORF2蛋白和猪肺炎支原体菌苗和减毒的PRRSV病毒。

关于本发明的疫苗的组分，应注意术语“疫苗”和“抗原”在本文中有时同义使用。相应地，“疫苗包含PCV疫苗”可以例如与“疫苗包含PCV抗原”同义使用。

关于本发明的疫苗，术语“疫苗”和“免疫原性组合物”在本文中可以同义使用。

术语“抗原”、“免疫原”和“免疫原性组分”在本文中可以同义使用。

术语“免疫应答”、“免疫学应答”、“保护性免疫应答”和“保护性免疫学应答”在本文中可以同义使用。

此外，应注意，可以组合本说明书中提供的所有公开内容。因此，例如，本文与PCV疫苗或抗原结合提供的具体公开内容也可以与PRRSV疫苗或抗原组合，并且反之亦然，条件是基于本文的教导，此类转移由本领域技术人员视为可行的。换言之，当与例如PCV结合公开了方法、技术、施用途径等时，它可以并不限于PCV，而是也可以与例如PRRSV结合使用。此外，本文对于包含单一抗原的特定所述疫苗提供的所有公开内容也可以应用于包含多于一种抗原的所述疫苗。

在本文描述的本发明的方法的上下文中的公开内容适用于相应的用途，并且反之亦然。

本发明的疫苗包含胞内劳森氏菌的抗原。相应地，提供了用于在猪中引发针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答的免疫原性组合物。

如本文使用的，术语“胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)”或“胞内劳森氏菌(L.intracellularis)”意指细胞内的、弯曲状、革兰氏阴性细菌，其通过C.Gebhart等人，Int'l.J.of Systemic Bacteriology，第43卷，第3期，533-38(1993)，以及S.McOrist等人Int'l.J.of Systemic Bacteriology，第45卷，第4期，820-25(1995)(所述参考文献各自整体引入本文作为参考)详细描述，并且包括但不限于作为ATCC 55672保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Md的细菌；作为NCTC12656和12657保藏于英国国家典型培养物保藏中心(National Collection of TypeCultures)，Colindale，London的细菌；鉴于本领域的知识和本文的教导，可以从世界各地感染PPE的猪或其它动物中获得的致病细菌；以及上述细菌中的任一种的变体或突变体，无论是自发还是人工获得的。

如本文使用的，“活的胞内劳森氏菌”意指胞内劳森氏菌细菌是活细菌。WO 96/39629和WO 05/011731描述了胞内劳森氏菌的非致病性活株或减毒株。然而，由于生产/配制步骤，如本文所述的本发明的疫苗组合物可以包含灭活/杀死的胞内劳森氏菌细菌。如本文使用的，术语“减毒株”意指这样的任何胞内劳森氏菌菌株，其根据本领域已知和/或如本文教导的培养和传代技术进行制备，以实现减少的毒力，优选无毒力，同时在施用于宿主动物时维持免疫原性性质。如下文证实的，各种不同的胞内劳森氏菌菌株已根据本文教导进行培养且减毒，以获得在猪以及对胞内劳森氏菌感染敏感的其它动物中具有作为疫苗的功效的免疫原性减毒株。

如果遗传修饰的病毒和/或细菌或改良活病毒和/或细菌的毒力低于其未修饰的亲本菌株，则它是“减毒的”。如果菌株在决定疾病严重程度的一个或多个参数中显示了统计学显著的降低，则它是“毒力较低的”。此类参数可以包括病毒血症水平、菌血症、发热、呼吸窘迫的严重程度、生殖症状的严重程度、或者器官如肠(特别是回肠)或肺中的损伤数目或严重程度等。

用于本发明的疫苗中的减毒株预计具有作为用于动物的抗微生物疫苗中的免疫原的效用，所述动物包括鸟、鱼、牛、猪、马、哺乳动物和一般而言的灵长类动物、以及人。鉴于本文包含的教导，此类疫苗可以通过本领域技术人员已知的技术进行制备。此类疫苗包含在药学可接受的载体中的免疫学有效量的减毒株。疫苗可以以一个或多个剂量进行施用。鉴于本文包含的教导，免疫学有效量可通过本领域已知的手段确定，而无需过度实验。无毒力细菌的量应该足以刺激疾病易感动物中的免疫应答，同时仍然是无毒力的。这将取决于所涉及的特定动物、细菌和疾病。待施用于易感动物的推荐剂量优选为约10³至10⁹个细菌/Kg体重，且最优选为约10⁵至10⁷个细菌/Kg体重。载体是本领域技术人员已知的并且包括稳定剂和稀释剂。此类疫苗还可以含有适当的佐剂。本发明的疫苗可以与其它疫苗组合使用，例如，作为另一种冻干疫苗的稀释剂，或者在冻干前与另一种疫苗组合或简单地混合在一起。在另一个实施方案中，还考虑了两种或更多种液体疫苗的混合物。疫苗制剂也可以是例如通过冷冻干燥进行干燥的，用于贮存目的或用于后续配制成液体疫苗。

相应地，本发明还包括用于在动物宿主中诱导对强毒的野生型胞内劳森氏菌细菌的免疫应答的方法，用于保护宿主免受此类细菌的目的。该方法包括向宿主施用免疫学有效量的活的、改良活的或减毒的细菌或本文所述的细菌，并且优选地，向宿主施用本发明的疫苗。

如本文使用的，术语“大规模培养”意指胞内劳森氏菌的培养水平大于大约2.0至3.0升，并且包括在100升或更大的规模上的生产。如本文使用的，“培养”意指促进胞内劳森氏菌的生长、繁殖和/或增殖的过程。

在实践用于培养本文所述的细菌培养的方法时，细胞可以首先用包含胞内劳森氏菌细菌的接种物进行接种，以便用细菌感染细胞。众多细胞系可以用于实践本发明，包括但不限于IEC-18(ATCC 1589)--大鼠肠上皮细胞、HEp-2(ATCC 23)--人表皮样癌细胞、McCoy(ATCC 1696))--小鼠(未指定)细胞、MDCK(ATCC 34)--Madin-Darby犬肾细胞、BGMK(Biowhittaker#71-176)--水牛绿猴肾细胞和猪肠上皮细胞。优选的培养细胞是HEp-2、McCoy或IEC-18细胞。可替代地，细菌可以在无细胞系统中进行培养，只要细菌维持在如本文教导的适当的溶解O₂浓度下。

如果使用培养细胞，则在接种之前，细胞优选但无需是单层的形式。为了形成单层，可以将细胞接种到常规烧瓶内。每个烧瓶一般用与生长培养基混合的约1x 10⁵个细胞至约10x 10⁵个细胞/25cm²烧瓶进行接种。生长培养基可以是用于细胞培养的任何培养基，其包括氮源、对于所选培养细胞必需的生长因子和碳源例如葡萄糖或乳糖。优选培养基是具有2-5％胎牛血清的DMEM，尽管也可以使用各种其它商购可得的培养基，伴随良好的结果。

申请人已发现了胞内劳森氏菌的成功培养通过将培养细胞维持在恒定的生长状态下得到增强。因此，培养细胞单层在接种时应该处于约20％至约50％的汇合度下。优选地，细胞在接种时应该处于约30％至约40％的汇合度下，其中约30％的汇合度是最优选的。

接种物可以是胞内劳森氏菌的纯培养物，其例如从ATCC保藏物55672、NCTC保藏物12656或12657获得，或者使用本文讨论的分离和纯化方法从受感染的猪或其它动物中获得。

根据一个实施方案，用于实践本发明的接种物是通过从感染PPE的猪或其它动物的回肠刮下粘膜而制备的肠匀浆。在制备肠匀浆时，选择用于培养的回肠切片应该显示了严重的损伤，具有总体的肠增厚。由于细菌的脆弱性质，样品应该优选在尸检后尽可能快地贮存于-70℃下。胞内劳森氏菌对于其抗性的抗生素，例如万古霉素、两性霉素B或抗生素的氨基糖苷组的成员，包括庆大霉素和新霉素，仅举几例，优选加入接种物中，以压制污染细菌，同时允许胞内劳森氏菌生长。无论接种物是纯培养物还是肠匀浆，都可以鉴于本文的教导，通过本领域已知的各种技术进行培养细胞的接种。

然后，细菌和/或接种的培养细胞在减少的溶解O₂浓度下进行温育。在溶解氧浓度大于18％时，胞内劳森氏菌的生长是小于最佳的，具有在这个范围外的氧浓度下最终发生的生长停止。优选地，接种的培养细胞在约0％至约10％的范围内的溶解氧浓度下进行温育。更优选地，细胞在约0％至约8％的范围内的氧浓度下进行温育，其中约0％至约3.0％的氧浓度是最优选的。

适当浓度的二氧化碳对于胞内劳森氏菌的正常生长也是重要的。在二氧化碳浓度大于10％且小于4％时，发生非最佳生长，具有在这个范围外的二氧化碳浓度下最终发生的生长停止。优选地，二氧化碳浓度在约6％至约9％的范围内，其中约8.8％的二氧化碳浓度是最优选的。

另外，细胞优选在约73％至约94％的范围内的氢浓度下进行温育。可以使用氮代替存在的氢的一些或全部。根据一个特别优选的实施方案，细胞在约0-8.0％ O₂、约8.8％CO₂和约83.2％ H₂中进行温育。

接种的细胞可以在双重气体培养箱或其它气体腔室中进行温育，所述双重气体培养箱或其它气体腔室含有适当的氧和二氧化碳浓度，并且允许细胞在温育过程中是悬浮的。腔室应该包括用于使接种的细胞维持在悬浮中的手段，以及供应且维持适当的气体浓度的气体监测器和供应源。温育温度应该在30℃至45℃的范围内，且更优选在约36℃至约38℃的范围内。最优选地，温度为约37℃。鉴于本文的教导，用于本发明的培养和减毒方法的必要设备对于本领域的普通技术人员是可容易地获得的。适合于进行本发明的设备的一个实例是双重气体培养箱，例如可从Lab-Line，Melrose Park，Ill.获得的型号480，与使细胞维持在悬浮中的旋转瓶结合。目前优选的设备包括发酵罐、生物反应器或旋转振荡器，其含有至少约2升培养基，并且能够经由适当浓度的喷射气体或机械搅动的其它手段使培养细胞维持在悬浮中，并且连续监测培养基中的溶解O₂水平。New Brunswick、Braun和其它公司制备了合适的发酵罐和生物反应器用于此目的。

通过在温育期间使接种的细胞维持在悬浮状态下，通过增加每个个别细胞对生长培养基以及氧和二氧化碳的适当混合物的暴露，来实现细胞以及因此胞内劳森氏菌的最大生长。可以通过本领域已知的各种方法，包括例如培养瓶、滚瓶、膜培养和旋转瓶，来搅动培养细胞并维持在悬浮中。通过在双重气体培养箱或类似仪器内的旋转瓶中温育细胞，细胞可以在温育过程中保持在悬浮中。如本文使用的，术语“旋转瓶”意指这样的烧瓶或其它容器，其采用桨、螺旋桨或其它手段来搅动培养物，并且使其中包含的细胞保持在悬浮中。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，使接种的细胞温育直至细胞达到汇合，然后将细胞置于含有生长培养基的旋转瓶中，并且在使烧瓶旋转的同时，在双重气体培养箱中进行温育。优选地，将接种的细胞刮到旋转瓶内。这可以通过本领域已知的各种方法来实现，例如使用细胞刮刀以使细胞解离。一旦将细胞引入旋转瓶内，旋转瓶的桨通常在约30至约60rpm的范围内旋转，以便使受感染的细胞维持在悬浮中。

然后将一部分培养的胞内劳森氏菌传代到新鲜的培养细胞中，以增加胞内劳森氏菌细菌的生产。本文中的术语“传代”或其变化意指将一部分培养的胞内劳森氏菌转移到新鲜培养细胞中，以便用细菌感染新鲜细胞的过程。如本文使用的，术语“新鲜的”意指尚未被胞内劳森氏菌感染的细胞。优选地，此类细胞平均起来不多于大约一日龄。

胞内劳森氏菌在悬浮培养物中的传代可以通过取出一部分原始培养物，并且将其加入含有新鲜培养细胞的新烧瓶中来完成。如果原始培养物具有很高的细菌数目/ml，例如大于约10⁴个细菌/ml，则优选将约1至10％(体积比)的培养物从受感染的烧瓶加入含有新鲜细胞的新烧瓶中。这优选在50-100％的细胞被感染时完成。如果少于50％的细胞被感染，则传代优选通过将培养物1:2拆分到新烧瓶内，并且通过添加新鲜培养基扩大体积来完成。在任一情况下，都不需要细胞裂解和其它步骤，这与现有技术中的单层培养物的传代形成鲜明对比。

在培养细胞的充分生长，以及如通过IFA、TCID₅₀或其它可比较方法确定的，以大于约70％的细胞感染性被胞内劳森氏菌的后续感染后，然后收获至少一部分培养的胞内劳森氏菌细菌。然而，在使用不同技术用于确定细胞感染性而获得不同结果的情况下，应该使用IFA方法的结果。鉴于本文的教导，可以通过本领域普通技术人员已知的各种技术，从悬浮液中分离细菌来进行收获步骤。优选地，胞内劳森氏菌细菌通过以下进行收获：将全部或一部分悬浮液的内容物离心，以使培养细胞形成团块，使所得到的细胞团块重悬浮，并且裂解受感染的细胞。通常，将至少一部分内容物以约3000x g离心约20分钟，以便使细胞和细菌形成团块。然后可以将团块重悬浮于例如蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐(SPG)溶液中，并且通过25号针大约四次以便裂解细胞。如果需要进一步纯化，则样品可以以约145x g离心约5分钟，以去除细胞核和碎片。然后可以将上清液以约3000x g离心约20分钟，并且将所得到的团块重悬浮于适当的稀释剂中，例如具有胎牛血清的SPG(以制备适合于冷冻或用作接种物的收获细菌)或生长培养基(以制备更适合于传代到新鲜细胞的收获细菌)。

如先前提到的，通过使组织细胞保持活跃生长，用于大规模生产的胞内劳森氏菌的有效生长得到增强。对于单层细胞，当培养物变得汇合时，细胞分裂率基本上降低。使胞内劳森氏菌在单层组织培养物上生长的尝试已具有有限的成功，并且扩大规模已是不可能的。然而，使用悬浮培养物极大地促进了使细胞保持活跃生长并允许连续培养物扩增和扩大规模。如上文解释的，使用发酵罐和约0-3％的溶解O₂，申请人已能够生长高达10⁸个细菌/ml。申请人还已能够使培养的细菌保持活跃生长数月，并且预计能够无限期地这样做。

以前，一般认为细胞必须附着至表面以便被胞内劳森氏菌感染。本文公开的细胞悬浮液是独特的并且与该理论相矛盾。当使用McCoy或IEC-18细胞时，可以添加明胶、琼脂糖、胶原、丙烯酰胺或二氧化硅珠，例如由HyClone Laboratories，Logan，Utah制造的Cultisphere-G多孔微载体，连同生长培养基。在一个实施方案中，未感染的McCoy细胞可以在被胞内劳森氏菌感染的McCoy细胞的细胞培养生长过程中加入培养基中。然而，McCoy细胞以及HEp-2细胞可以无需微载体而用于本发明的培养方法中。这提供了用于大规模培养的尤其有利和经济的途径。

为了培养维持的目的，对于HEp-2培养物，优选以每周一次的间隔去除25-50％的培养物，并且用新鲜培养基替换。对于具有微载体或珠的细胞培养物，优选每周1-2次去除25-50％的培养物，并且用新鲜的微载体或珠和新鲜培养基替换。为了扩大规模的目的，可以将另外25-50％的培养基或具有微载体的培养基加入培养物中。

取决于培养细胞在其下变得被感染的速率，传代至新鲜细胞一般在约每2至约5周之间发生。假定培养细胞在2-3周内变得至少70％被感染，优选地传代在约每3至4周之间发生。

用于本发明的疫苗中的活的胞内劳森氏菌抗原可以按照上文概述的生产方法进行生产。根据一个特别优选的实施方案，在使受感染的细胞维持在悬浮中延长的时间(例如，6-8个月)后，收获至少一部分培养的胞内劳森氏菌细菌并且监测潜在的减毒。此类监测优选通过宿主动物或动物模型攻击以选择减毒株来完成。根据本文教导的方法，此类减毒株用于疫苗中。根据本发明的减毒的胞内劳森氏菌疫苗已在各种动物中显示了针对胞内劳森氏菌感染的功效，并且预计在人中也是有效的。

在悬浮中的培养允许快速培养扩增，100-1000倍的产量增加，以及减少的成本。结果，根据本文公开的培养方法生产的大量供应的胞内劳森氏菌细菌是容易地减毒的，用于疫苗生产目的。由于使用常规的单层生长技术生产的细菌的低产量，减毒在单层培养中是困难的。相比之下，所公开的使胞内劳森氏菌生长的方法极大地增加了可用于此目的的细菌的容易性、速度和数目。出现的细胞和细胞分裂越多，发生的突变水平就越大，其在疫苗开发中是有利的。在悬浮中的生长增加了受环境调控基因及其表达产物控制的重要免疫原的表达。

所得到的减毒株可以如美国专利号5,885,823的实施例1中所述的，在组织培养单层中进行培养，但优选根据本文公开的方法在悬浮培养物中进行培养。其它减毒手段可以包括通过使用例如N-甲基亚硝基胍和本领域已知的其它的化学减毒。无论是通过多重传代还是化学手段，都产生并选择减毒的胞内劳森氏菌用于疫苗制备。

根据本发明的一个疫苗实施方案，通过如上所述的离心或微过滤来收获抗原。然后，基于通过宿主动物物种中的剂量滴定确定的最佳宿主动物免疫应答，将抗原以限定水平进行标准化。

根据使用先前描述的培养方法的一个特别优选的疫苗实施方案，将细菌连续传代，以诱导且选择减毒的、无毒力的活培养物。培养物就减毒迹象在宿主动物中进行测试(优选在悬浮培养物中生长至少6至8个月或更长时间后)。培养物如较早所述进行收获并稀释。例如，猪可以用至少1x 10⁵至1x 10⁶个细菌进行经口疫苗接种。在接种疫苗后的约28天，猪用约1x10⁷个微生物进行经口接种，所述微生物来自胞内劳森氏菌的较少传代(约30至45日龄)的强毒培养物。受感染的动物在攻击后21天进行尸检，并且就总体损伤以及微观损伤观察小肠。还应该进行PCR。使用PCR或FA测试方法，约80％的对照动物显示了总体损伤或微观损伤，并且对于在肠的粘膜细胞中的胞内劳森氏菌存在测试呈阳性。如通过组织学观察所确定的，接种疫苗的动物将具有正常的粘膜表面，并且通过PCR测试将是阴性的。

一般地，减毒的免疫原性胞内劳森氏菌菌株在连续培养至少约150至250天后产生，在此期间培养物传代至少约7至约12次。可以通过改变这些数字来产生其它减毒培养物，只要采用本文教导的监测和选择方法。

然后制备疫苗，其包含在药学可接受的载体中的免疫学有效量的减毒的胞内劳森氏菌。组合的免疫原和载体可以是水溶液、乳状液或悬浮液。鉴于本文包含的教导，免疫学有效量可通过本领域已知的手段确定，而无需过度实验。一般而言，当使用纯化的细菌时，免疫原的数量为50至500微克，且优选为10⁷至10⁹TCID₅₀。

根据本发明的方法生长的胞内劳森氏菌细菌或衍生自此类细菌的组分可以用作ELISA或其它免疫测定例如免疫荧光抗体测试(“IFA”)中的抗原，以检测疑似感染细菌的动物的血清和其它体液中的针对胞内劳森氏菌的抗体。目前优选的免疫测定是如美国专利号5,885,823的实施例1中所述的IFA。可替代地，根据本发明生长的细菌可以用于蛋白质印迹测定中。

WO 96/39629和WO 05/011731描述了胞内劳森氏菌的培养、减毒的胞内劳森氏菌及其施用。

在一个有利的实施方案中，活的胞内劳森氏菌是改良活的胞内劳森氏菌。在另一个有利的实施方案中，活的胞内劳森氏菌是减毒的胞内劳森氏菌。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗具有约10³至10⁹个细菌/Kg体重，优选约10⁵至10⁷个细菌/Kg体重的胞内劳森氏菌的剂量。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗具有约10⁵至约10⁷个胞内劳森氏菌细菌的胞内劳森氏菌抗原的剂量。

在一个有利的实施方案中，胞内劳森氏菌的抗原是冻干的。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗中的胞内劳森氏菌的抗原是在

Ileitis中包括的抗原。

在一个有利的实施方案中，胞内劳森氏菌疫苗是

Ileitis疫苗。

优选的免疫或疫苗接种方法在于通过全身施用例如肌内途径施用根据本发明的疫苗。

在一个方面，本发明的疫苗可以包含PCV的抗原。相应地，在本发明的一个方面，提供了用于在猪中引发针对PCV的保护性免疫应答的免疫原性组合物。在本发明的上下文中，可以使用编码且表达PCV免疫原(抗原)的质粒构建体。此外，本文描述了疫苗接种方法和DNA疫苗。另外，本发明涉及生产或配制这些疫苗的方法。还考虑了灭活的PCV疫苗(参见例如美国专利号6,517,843)。

根据Meehan 1998，PCV ORF1和ORF2分别编码预测分子量为37.7kD和27.8kD的蛋白质。ORF3和ORF4(根据Meehan等人1998，分别对应于WO9918214中的ORF7和ORF10)分别编码预测分子量为11.9和6.5kD的蛋白质。这些ORF的序列也可在Genbank AF055392中获得。它们也可以掺入质粒中，并且按照本发明单独使用，或者例如与ORF1和/或ORF2和/或ORF3组合使用。

公开于美国专利号6,391,314中的其它PCV ORF 1-3和5、6、8-9、11-12(WO-A-9918214中的COL 1-3和5、6、8-9、11-12)，可以在此处描述的条件下，与彼此或如此处定义的ORF1和2组合或以其它方式使用。

这还涵盖了在上文给出的知识中的等价序列的使用，特别是来自本文引用的各种PCV毒株的那些ORF。如本文使用的，术语“等价序列”可以指来自具有ORF2和/或ORF1的PCV毒株的那些序列，其与毒株Imp 1010的相应ORF具有如下文进一步定义的同源性或同一性。对于根据Meehan的ORF3，也可以说与毒株Imp1010的ORF3的同源性或同一性必须例如等于或大于80％，特别是大于85％，优选大于90％或95％。对于根据Meehan 1998的ORF4，它可以与毒株Imp1010的ORF4等于或大于86％，特别是大于90％，优选大于95％。

根据基因组核苷酸序列，例如WO-A-99 18214中公开的那些序列，使用标准软件例如MacVector^TM来确定ORF是常规技术。另外，基因组与毒株1010的基因组的比对以及与毒株1010ORF的比较，允许本领域技术人员容易地确定在另一种毒株(例如WO-A-99 18214中公开的那些毒株)的基因组上的ORF。使用软件或进行比对对于技术人员是常规的，并且可以直接访问等价的ORF。

PCV3 ORF2和PCV3基因组序列衍生自KT869077(GenBank)。

优选地，本发明的疫苗的PCV抗原是PCV1、PCV2和/或PCV3抗原。优选地，本发明的疫苗的PCV抗原是重组多肽。

在一个优选方面，本公开内容的多肽是重组PCV1、PCV2或PCV3 ORF2蛋白，例如重组杆状病毒表达的PCV3 ORF2蛋白，或优选地，重组杆状病毒表达的PCV2 ORF2蛋白。如本文使用的，术语“重组ORF2蛋白”特别指由重组DNA分子表达的蛋白质分子，例如通过重组DNA技术产生的多肽。此类技术的实例包括当将编码表达蛋白质的DNA插入合适的表达载体，优选杆状病毒表达载体内时的情况，所述载体依次又用于转染宿主细胞，或在杆状病毒表达载体的情况下，感染宿主细胞，以产生由DNA编码的蛋白质或多肽。如本文使用的，术语“重组ORF2蛋白”因此特别指由重组DNA分子表达的蛋白质分子。

换言之，本发明的疫苗的PCV抗原优选为由PCV ORF基因，优选PCV ORF2基因，最优选PCV2 ORF2基因表达(编码)的重组多肽。

本发明的疫苗的PCV抗原优选为由杆状病毒细胞表达(编码)的重组多肽。

本发明的疫苗的PCV抗原优选为由PCV ORF基因，优选PCV ORF2基因，最优选PCV2ORF2基因表达(编码)，并且在杆状病毒细胞中表达的重组多肽。

本发明的疫苗的PCV抗原优选为在Ingelvac

或/>

中包括的PCV的抗原。

根据一个特定实例，重组PCV1、PCV2或PCV3 ORF2蛋白通过具有下述步骤的方法产生：将关于PCV1、PCV2或PCV3 ORF2的基因克隆到杆状病毒转移载体内；转移载体用于在昆虫细胞中通过同源重组制备含有所述基因的重组杆状病毒；然后，PCV1、PCV2或PCV3 ORF2蛋白在由重组杆状病毒的感染期间在昆虫细胞中表达。

进一步应理解，术语“由序列组成的重组PCV蛋白”特别地还涉及任何共翻译和/或翻译后修饰或受多肽在其中表达的细胞影响的序列的修饰。因此，如本文所述，术语“由序列组成的重组PCV ORF2蛋白”还涉及具有由多肽在其中表达的细胞实现的一种或多种修饰的序列，所述修饰特别是在蛋白质生物合成和/或蛋白质加工中实现的氨基酸残基的修饰，优选选自糖基化、磷酸化和乙酰化。

优选地，根据本公开内容的重组PCV1、PCV2或PCV3 ORF2蛋白通过杆状病毒表达系统，特别是在培养的昆虫细胞中产生或可获得。

词语“质粒”在此处预期涵盖以多核苷酸序列的形式的任何DNA转录单位，所述多核苷酸序列包含待表达的PCV序列以及对于其在体内的表达所必需的元件。环状质粒形式、超螺旋或其它形式是优选的。线性形式也包括在本发明的范围内。

在本发明的上下文中，特别地可以使用美国专利号6,943,152的质粒。每个质粒包含能够确保在宿主细胞中表达在其控制下的插入基因的启动子。它一般而言是具有人或鼠起源，或者任选地具有其它起源例如大鼠或豚鼠的强真核启动子，且特别是巨细胞病毒早期启动子CMV-IE。更一般而言，启动子具有病毒起源或细胞起源。作为除CMV-IE外的病毒启动子，还可以提到SV40病毒早期或晚期启动子或者劳斯肉瘤病毒LTR启动子。它也可以是来自基因衍生自其的病毒的启动子，例如对基因特异性的启动子。作为细胞启动子，可以提到细胞骨架基因的启动子，例如结蛋白启动子，或可替代地肌动蛋白启动子。当几种基因存在于同一质粒中时，它们可以在同一转录单位或两个不同的单位中提供。

质粒还可以包含其它转录调控元件，例如内含子类型的稳定序列，优选兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人Science，1979，206:337-344)，由组织型纤溶酶原激活物基因(tPA；Montgomery等人Cell.Mol.Biol.1997，43:285-292)编码的蛋白质的信号序列，以及特别是牛生长激素(bGH)基因(US-A-5,122,458)或兔β-珠蛋白基因的多聚腺苷酸化信号(多聚A)。

如本领域已知的，“序列同一性”指两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，即参考序列以及待与参考序列进行比较的给定序列。如通过此类序列的串之间的匹配所确定的，在序列已进行最佳比对以产生最高程度的序列相似性后，通过将给定序列与参考序列进行比较来确定序列同一性。在此类比对后，序列同一性在逐个位置的基础上进行确定，例如，如果在特定位置处，核苷酸或氨基酸残基是等同的，则序列在该位置处是“等同的”。然后将此类位置同一性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数，以给出％序列同一性。序列同一性可以通过已知方法容易地进行计算，所述方法包括但不限于以下中描述的那些方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.N.编辑Oxford University Press，New York(1988)，Biocomputing:Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York(1993)；Computer Analysis ofSequence Data，Part I，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑，Humana Press，New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinge，G.，Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M.StocktonPress，New York(1991)；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)，所述参考文献的教导引入本文作为参考。确定序列同一性的优选方法设计为给出测试序列之间的最大匹配。确定序列同一性的方法被编入可公开获得的计算机程序中，所述计算机程序确定给定序列之间的序列同一性。此类程序的实例包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等人，Nucleic Acids Research，12(1):387(1984))，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215:403-410(1990)。BLASTX程序可从NCBI和其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda，Md.20894，Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.，215:403-410(1990)，其教导引入本文作为参考)公开获得。这些程序使用默认空位权重最佳地比对序列，以便产生在给定序列和参考序列之间的最高水平的序列同一性。作为例示，通过具有与参考核苷酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％的“序列同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，预期给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列等同，除了给定的多核苷酸序列可以包括最多15个、优选最多10个、甚至更优选最多5个点突变/参考核苷酸序列的每100个核苷酸之外。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中的最多15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸可以被缺失或用另一个核苷酸取代，或者参考序列中的总核苷酸的最多15％、优选10％、甚至更优选5％的核苷酸数目可以插入参考序列内。参考序列的这些突变可以在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处或者在这些末端位置之间的任何地方发生，个别地散布在参考序列中的核苷酸中或者以一个或多个邻接组散布在参考序列内。类似地，通过具有与参考氨基酸序列具有至少例如85％、优选90％、甚至更优选95％的序列同一性的给定氨基酸序列的多肽，预期多肽的给定氨基酸序列与参考序列等同，除了给定的多肽序列可以包括最多15个、优选最多10个、甚至更优选最多5个氨基酸改变/参考氨基酸序列的每100个氨基酸之外。换言之，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％、优选90％、甚至更优选95％序列同一性的给定多肽序列，参考序列中的最多15％、优选最多10％、甚至更优选最多5％的氨基酸残基可以被缺失或由另一个氨基酸取代，或者参考序列中的氨基酸残基总数的最多15％、优选最多10％、甚至更优选最多5％的氨基酸数目可以插入参考序列内。参考序列的这些改变可以在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置处或者在这些末端位置之间的任何地方发生，个别地散布在参考序列中的残基中或者以一个或多个邻接组散布在参考序列内。优选地，并不等同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在确定序列同一性时，保守取代并不作为匹配包括。

如本文使用的，“序列同源性”指确定两个序列的相关性的方法。为了确定序列同源性，将两个或更多个序列进行最佳比对，并且在必要时引入空位。然而，与“序列同一性”形成对比，在确定序列同源性时，保守氨基酸取代被计数为匹配。换言之，为了获得与参考序列具有95％序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中85％、优选90％、甚至更优选95％的氨基酸残基或核苷酸必须匹配或者包含由另一种氨基酸或核苷酸的保守取代，或者参考序列中的总氨基酸残基或核苷酸的最多15％、优选最多10％、甚至更优选最多5％的氨基酸或核苷酸数目，不包括保守取代，可以插入参考序列内。优选地，同源序列包含至少50个、甚至更优选100个、甚至更优选250个、甚至更优选500个核苷酸的段。

可以在待比较的两个序列的整个长度或两个序列的片段上进行序列比较。序列同一性可以在例如二十个、五十个、一百个或更多个邻接氨基酸残基的区域上进行，然而，通常，比较将在待比较的两个序列的全长上进行。

“保守取代”指氨基酸残基或核苷酸由具有相似特性或性质(包括大小、疏水性等)的另一种氨基酸残基或核苷酸的取代，使得整体功能并不显著改变。

在本发明的上下文中，还可以使用具有突变的PCV1或PCV2或PCV3蛋白，例如但不限于衣壳蛋白的突变。尽管PCV2和喙羽病病毒(BFDV)之间的衣壳氨基酸序列的趋异性，但晶体结构非常相似，尽管其序列趋异性。有利地，PCV3的突变是为了稳定病毒样颗粒(VLP)。PCV3衣壳蛋白应该自组装成VLP，然而，与PCV2衣壳蛋白相比，PCV3蛋白的表达水平明显更低。具体而言，仅约20％的蛋白质组装成VLP，而剩余80％的蛋白质聚集成不溶性级分。国际专利申请序列号PCT/US2020/026930中公开的PCV3衣壳蛋白的突变可以用于本发明的上下文中。

适用于本发明的上下文中的测定和技术包括已用于跟踪或定量猪圆环病毒衣壳(ORF2)蛋白组装和分解成病毒样颗粒(VLP)的那些测定和技术，并且这些包括：酶联免疫吸附测定(ELISA)、SDS/PAGE任选地伴随银染色或考马斯染色、蛋白质印迹或免疫印迹、尺寸排阻层析(SEC)、动态光散射(DLS)或多角度光散射(MALS)、透射电子显微镜检查(TEM)、分析超速离心、以及荧光光谱分析(FSA)任选地加上高效液相层析(HPLC)。另外的合适技术还可以包括：蛋白质-核酸复合物的琼脂糖凝胶阻滞测试、免疫扩散测试例如单向免疫扩散(SRID)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、基于代谢标记和化学发光酶的测定。这些测定各自是本领域众所周知的，并且在例如以下中进行描述：Fang，Mingli等人“Detection of theAssembly and Disassembly of PCV2bVirus-Like Particles Using FluorescenceSpectroscopy Analysis”Intervirology第58卷，2015，第318-323页；Thompson，Christine等人“Analytical technologies for influenza virus-like particle candidatevaccines:challenges and emerging approaches”Virology Journal第10卷，2013，第141页；Steppert，Petra等人“Quantification and characterization of virus-likeparticles by size-exclusion chromatography and nanoparticle trackinganalysis”Journal of Chromatography A第1487卷，2017，第89-99页；Yadav，Shalini等人“A facile quantitative assay for viral particle genesis reveals cooperativityin virion assembly and saturation of an antiviral protein”Virology，第429卷，第2期，2012，第155-162页；以及Zeltins，Andris“Construction and Characterization ofVirus-Like Particles:A Review”Molecular Biotechnology第53卷，2013，第92-107页，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。

含有在杆状病毒多角体蛋白启动子的控制下的PCV3 ORF2基因的重组杆状病毒的开发(BaculoG/PCV3 ORF2克隆4B4-2E12 Pre-MSV p8；批号3624-039)在国际专利申请序列号PCT/US2020/026930的实施例1中进行描述。在一些实施方案中，所述实施例1中描述的此类重组杆状病毒表达的蛋白质在疫苗中的使用可以涵盖重组病毒的杀死和/或灭活形式。可替代地，在一些疫苗中，重组病毒，例如类似于国际专利申请序列号PCT/US2020/026930的实施例1中所示的病毒，可以作为活的修饰病毒使用。

在一些实施方案中，扩增的PCV ORF2编码序列可以利用侧翼限制性位点亚克隆到杆状病毒转移载体内，以生成所需的转移载体。例如，扩增的PCV ORF2编码序列可以利用侧翼限制性位点亚克隆到杆状病毒转移载体内，以生成转移载体。可以通过用转移载体和杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，来生成重组杆状病毒。所使用的杆状病毒DNA可以包括线性化和/或环状杆状病毒DNA。例如，在一个实施方案中，可以通过用转移载体和线性化的BaculoGold^TM杆状病毒DNA共转染Sf9(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))昆虫细胞，来生成重组杆状病毒。线性化的杆状病毒DNA可能衍生自苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)，并且可能在多角体蛋白基因座中含有致死性缺失，因此，在与转移载体共转染后，可以生成活杆状病毒的拯救。所得到的重组杆状病毒可以包括在杆状病毒多角体蛋白启动子的控制下的PCV ORF2编码序列。重组杆状病毒可以在Sf9昆虫细胞上进行扩增，并且随后通过在Sf9昆虫细胞上的有限稀释克隆进行纯化。在一些实施方案中，可以使用全长环状杆状病毒DNA例如Bac-to-Bac。例如，Bac-to-Bac可以使用转座子介导的重组，以将目的基因插入多角体蛋白基因座内。也可以使用本领域已知的其它方法。在一些实施方案中，可以基于方法在商业化期间的潜在稳定性来选择方法。例如，可以选择赋予疫苗中增加的稳定性的杆状病毒。

在一些实施方案中，在用主细胞培养物接种烧瓶后，烧瓶可以在预定温度下温育特定时帧。例如，培养物可以在27℃下温育4小时。然后每个烧瓶可以用含有PCV ORF2基因的重组杆状病毒进行接种。例如，含有ORF2基因的质粒可以与

(BDBiosciences Pharmingen)杆状病毒DNA共转染到Sf+昆虫细胞(Protein Sciences，Meriden，CT)内，以生成含有ORF2基因的重组杆状病毒。含有ORF2基因的重组杆状病毒可以是噬菌斑纯化的，并且主种子病毒(MSV)在SF+细胞系上进行增殖，等分并贮存于-70℃下。通过使用杆状病毒特异性引物的PCR-RFLP，MSV可以被阳性鉴定为ORF2杆状病毒。用ORF2杆状病毒感染以生成MSV或工作种子病毒的昆虫细胞可能表达ORF2抗原，如在间接荧光抗体测定中通过多克隆血清或单克隆抗体检测到的。另外，ORF2杆状病毒的身份可以通过N末端氨基酸测序来确认。ORF2杆状病毒MSV也可以按照9C.F.R.第113.27(c)、113.28和113.55节就纯度进行测试。接种到旋转瓶内的每种重组杆状病毒可能具有不同的感染复数(MOI)。

在用杆状病毒接种后，烧瓶可以在27±2℃下温育7天，并且在此期间也可以以100rpm进行搅动。烧瓶可以使用通风帽，以允许空气流动。对于接下来的7天，可以每24小时从每个烧瓶中获取样品。在提取后，每个样品可以进行离心，并且将团块和上清液分开，然后通过0.45-1.0μm孔径的膜进行微过滤。

然后可以经由ELISA测定来定量所得到的样品中的ORF2量。可以用在0.05M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)中稀释至1:6000的抗PCV抗体进行ELISA测定。然后可以将100μL抗体置于微量滴定板的孔中，密封并在37℃下温育过夜。然后用包含0.5mL Tween20(Sigma，St.Louis，MO)、100mL 1OX D-PBS(Gibco Invitrogen，Carlsbad，CA)和899.5mL蒸馏水的洗涤溶液，将板洗涤3次。随后，将250μL封闭溶液(在10mL D-PBS中的5g Carnation脱脂奶粉(Nestle，Glendale，CA)用蒸馏水QS至100mL)加入每个孔中。下一步是洗涤测试板，然后加入预稀释的抗原。通过向稀释板上的每个孔中添加200μL稀释液(999.5mL D-PBS中的0.5mLTween20)，来产生预稀释的抗原。样品然后以1:240的比率和1:480的比率进行稀释，然后将100μL的这些稀释样品各自加入稀释板上的顶部孔之一中(即一个顶部孔接收100μL的1:240稀释物，而另一个接受100μL的1:480稀释物)。然后可以通过从每个相继孔中取出100μL，并且将其转移到板上的下一个孔中，对于板的剩余部分完成系列稀释。在进行下一次转移之前，将每个孔混合。测试板洗涤包括用洗涤缓冲液将板洗涤3次。然后将板密封并在37℃下温育1小时，然后用洗涤缓冲液再洗涤3次。使用的检测抗体是针对PCV ORF2的抗体。它在稀释液中稀释至1/300，然后将100μL稀释的检测抗体加入孔中。然后将板密封并在37℃下温育1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。然后通过将正常兔血清(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA)加入稀释液中至1％的浓度，来制备缀合稀释剂。

缀合抗体山羊抗小鼠(H+1)-HRP(Jackson Immunoresearch)在缀合稀释剂中稀释至1:10,000。然后将100μL稀释的缀合抗体加入每个孔中。然后将板密封并在37℃下温育45分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。将与等体积的过氧化物酶底物B(KPL)混合的100μL底物(TMB过氧化物酶底物，Kirkgaard and Perry Laboratories(KPL)，Gaithersburg，MD)加入每个孔中。使板在室温下温育15分钟。然后将100μL的IN HCL溶液加入所有孔中，以终止反应。然后使板运行通过ELISA阅读器。

有利地，昆虫细胞可以在无血清条件下进行培养，并且产生PCV ORF2蛋白；如USP6,103,526的无血清昆虫细胞(expressSF+细胞系)。其它昆虫细胞系包括但不限于草地贪夜蛾(Sf)细胞系，例如Sf21、Sf9和expressSF+1(SF+)，来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)卷心菜尺蠖(cabbage looper)的BTI-TN5B1(High Five)细胞，以及来自家蚕(Bombyx mori)蚕的BmN细胞广泛用于杆状病毒研究和重组蛋白生产。

考虑了美国专利号9610345和9669087中公开的佐剂、细胞培养上清液、防腐剂、稳定剂、病毒载体、免疫调节剂和剂量，所述两个美国专利均引入本文作为参考。

在本发明的上下文中，还可以使用免疫原性制剂和DNA疫苗，其包含本文公开的至少一种质粒，所述质粒编码且表达PCV1或PCV2或PCV3免疫原之一，优选上文提到的ORF之一，加上兽医学可接受的媒介物或稀释剂，伴随任选地，另外的兽医学可接受的佐剂。在一个实施方案中，佐剂可以包括CARBOPOL^TM或

在一个实施方案中，免疫原性组合物可以指在1ml剂量中包括以下的组合物：i)至少一些PCV ORF2蛋白，ii)表达所述PCV ORF2蛋白的杆状病毒，iii)细胞培养物，iv)浓度在约2至约8mM的范围内的灭活剂(例如，BEI)，v)与灭活剂相等量的中和剂(例如，硫代硫酸钠)；以及vi)预定量的佐剂(例如，

971或/>

)，以及vii)以生理学可接受浓度的磷酸盐。

最优选地，随同提供的组合物含有从体外培养细胞的上清液中回收的PCV ORF2蛋白，其中所述细胞用含有PCV ORF2 DNA并表达PCV ORF2蛋白的重组病毒载体进行感染，并且其中所述细胞培养物用灭活病毒载体的约2至约8mM BEI，优选约5mM BEI，以及相等浓度的中和剂，优选最终浓度为约2至约8mM，优选约5mM的硫代硫酸钠溶液进行处理。

在根据本发明的疫苗中使用的PCV抗原编码DNA的数量为约10μg至约2000μg，且优选约50μg至1000μg。本领域技术人员将具有精确限定待用于每种免疫或疫苗接种方案的DNA有效剂量所必需的能力。

剂量体积可以为0.5至5ml，优选为2至3ml。

在另一个实施方案中，本发明涵盖了用于引发尤其针对猪圆环病毒(PCV)的免疫应答或免疫学应答或者保护性免疫或免疫学应答的方法，其包括向猪肠胃外或皮下施用以下的单次注射、单次施用或单次剂量：(i)至少2μg至约400μg的由杆状病毒系统的PCV ORF2重组蛋白，以及(ii)兽医学可接受的载体，其包含溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗微生物剂、抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、细胞培养上清液、稳定剂、病毒或表达载体、免疫调节剂和/或其任何组合。

在一个有利的实施方案中，PCV疫苗是Ingelvac

(参见例如，WO2006/072065)。

WO2006/072065和WO2008/076915描述了PCV疫苗的生成、其制剂及其施用。

在一个有利的实施方案中，疫苗具有约2μg至约400μg的PCV抗原的剂量。因此，疫苗具有约2μg至约400μg的PCV2 ORF2蛋白的剂量。

在另一个有利的实施方案中，疫苗具有约4μg至约200μg的PCV抗原的剂量。因此，疫苗具有约4μg至约200μg的PCV2 ORF2蛋白的剂量。

在又一个有利的实施方案中，疫苗具有约10μg至约100μg的PCV抗原的剂量。因此，疫苗具有约10μg至约100μg的PCV2 ORF2蛋白的剂量。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含胞内劳森氏菌的抗原和PCV的一种或多种抗原，其中所述胞内劳森氏菌的抗原是活的胞内劳森氏菌，优选减毒的胞内劳森氏菌或改良活的胞内劳森氏菌。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac

或/>

中包括的PCV的抗原，其中所述胞内劳森氏菌的抗原是活的胞内劳森氏菌，优选减毒的胞内劳森氏菌或改良活的胞内劳森氏菌。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗具有约10³至10⁹个细菌/Kg体重、优选约10⁵至10⁷个细菌/Kg体重的胞内劳森氏菌抗原的剂量，并且包含在Ingelvac

或/>

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗具有约10⁵至约10⁷个胞内劳森氏菌细菌的胞内劳森氏菌抗原的剂量，并且包含在Ingelvac

或/>

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原和PCV的一种或多种抗原。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原和PCV的一种或多种抗原，其中所述PCV是PCV1、PCV2或PCV3。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原和PCV的一种或多种抗原，其中所述PCV的抗原是优选在杆状病毒细胞中表达的重组多肽。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原和PCV的一种或多种抗原，其中所述PCV的抗原是通过PCV ORF基因表达的重组多肽，优选在杆状病毒细胞中表达。

在一个有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原和PCV的一种或多种抗原，其中所述PCV的抗原是通过PCV ORF2基因表达的重组多肽，优选在杆状病毒细胞中表达。

在一个非常有利的实施方案中，根据本发明的疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

优选的免疫或疫苗接种方法在于根据本发明并且如上文直接描述的疫苗的全身施用。全身施用在本文中进行描述，并且包括但不限于肌内和皮内施用。

相应地，优选的免疫或疫苗接种方法在于通过肌内途径施用根据本发明的疫苗。

在一个方面，本发明的疫苗可以包含猪肺炎支原体的抗原。相应地，在本发明的一个方面，提供了用于在猪中引发针对猪肺炎支原体的保护性免疫应答的免疫原性组合物。甚至更优选地，每个剂量中的猪肺炎支原体抗原的量具有至少1.22的相对效力(RP)值，其中1.22的相对效力值意味着至少95％且优选100％的接受猪肺炎支原体抗原的此类量的四十分之一(1/40)施用的小鼠，在治疗后的21天内或治疗后的21天时，在猪肺炎支原体特异性抗体检测测定中发展可检测量的抗体。因此，在治疗后的21天内或治疗后的21天时，在至少95％且优选100％的小鼠中诱导可检测的猪肺炎支原体特异性抗体应答所需的猪肺炎支原体抗原的40倍量，足以赋予针对猪肺炎支原体感染的保护性免疫应答，减少其发生率，和/或减轻其严重程度或预防与其相关的临床体征。换言之，当混合且作为组合疫苗施用时，如上所述的猪肺炎支原体抗原的量已显示能够克服关于PCV抗原的任何负面干扰。在一些优选的形式中，组合物进一步包括或包含佐剂。各种佐剂与本发明结合将是有用的，并且可以由本领域技术人员加以选择，但特别优选卡波姆，且甚至更优选

(高分子量交联聚丙烯酸聚合物)或/>

有利地，优选当作为单一剂量施用向猪施用时，本发明的免疫原性组合物赋予针对猪肺炎支原体感染的保护性免疫应答，减少其发生率，和/或减轻其严重程度和/或预防与其相关的临床体征。当施用于猪时，此类单一剂量引发至少100、更优选至少110、甚至更优选至少120、还更优选至少130、甚至更优选至少140、还更优选至少150、甚至更优选至少160、还更优选至少170、甚至更优选至少180、且最优选至少184天的免疫持续时间。换言之，本发明的免疫原性组合物的一个剂量，不含加强剂或后续剂量，为动物或动物组提供了来自猪肺炎支原体的感染的临床体征的发生率减少或严重程度减轻，共至少100(110、120、130、140、150、160、170、180等)，且最优选至少184天。关于抗体检测测定，本领域技术人员将能够鉴定且利用适当的产品。ELISA测定且尤其是IDEXX Herdchek M.hyo.Test Kit^TM(IDEXX Laboratories，Inc.，Westbrook，Me.)是优选的。特别地，IDEXX Herdchek M.hyo.Test Kit^TM(IDEXX Laboratories，Inc.，Westbrook，Me.)可以用作本发明的上下文中的参考测定。

如本文使用的，“保护性免疫应答”指猪肺炎支原体感染的临床、病理学或组织病理学体征的发生率减少或严重程度减轻，直至并包括此类体征的完全预防。“保护性免疫应答”可以由免疫学有效量的抗原或疫苗触发。

术语“猪肺炎支原体抗原”指包含至少一种抗原的任何物质组合物，当施用于动物优选猪时，其可以诱导、刺激或增强针对猪肺炎支原体感染的免疫应答。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是完整的猪肺炎支原体菌苗，优选为灭活形式、活改良或减毒的猪肺炎支原体细菌、包含猪肺炎支原体的至少免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒、或者包含猪肺炎支原体的至少免疫原性氨基酸序列的任何其它多肽或组分。优选地，猪肺炎支原体抗原是灭活的猪肺炎支原体菌苗。更优选地，猪肺炎支原体抗原衍生自猪肺炎支原体J-菌株。最优选地，猪肺炎支原体菌苗是在

MYCOFLEX疫苗(Boehringer Ingelheim VetmedicaInc，St Joseph，Mo.，USA)中包括的灭活的猪肺炎支原体菌苗，或者是/>

MYCOFLEX。然而，可以根据本发明使用的猪肺炎支原体抗原也可以选自在下述疫苗组合物中包括的任何一种：PORCILIS M.HYO、MYCO/>

BPM、MYCO/>

BPME、MYCO

ME、MYCO/>

M、MYCO/>

ONCE、MYCO/>

MEH(全部是Intervet Inc.，Millsboro，Del.，USA)STELLAMUNE MYCOPLASMA^TM(Pfizer Inc.，NewYork，N.Y.，USA)、SUVAXYN MYCOPLASMA^TM、SUVAXYN M.HYO^TM、SUVAXYN MH-ONE^TM(全部是FortDodge Animal Health，Overland Park，Kans.，USA(Wyeth)。有利地，考虑了2ml的猪肺炎支原体上清液和/或菌苗的剂量。

可用的猪肺炎支原体疫苗由杀死的全细胞支原体制剂(菌苗)制成。相应地，如本文使用的，“菌苗”指细菌特别是猪肺炎支原体的全细胞制剂，其优选为杀死的全细胞制剂。当疫苗或抗原在本文中描述为“上清液”时，所述上清液可以是(杀死的)全细胞制剂的可溶性级分/部分。本发明还考虑了猪肺炎支原体全细胞制剂的可溶性部分的使用，其中所述猪肺炎支原体制剂的可溶性部分基本上不含(i)IgG和(ii)由与免疫球蛋白结合的抗原构成的免疫复合物(参见例如，美国专利号10,206,991)。在一些实施方案中，猪肺炎支原体制剂的可溶性部分包括至少一种猪肺炎支原体蛋白质抗原。在其它实施方案中，猪肺炎支原体制剂的可溶性部分包括两种或更多种猪肺炎支原体蛋白质抗原。在一个实施方案中，猪肺炎支原体上清液级分包括下述猪肺炎支原体特异性蛋白质抗原中的一种或多种：大约46kD(p46)、64kD(p64)和97kD(p97)分子量的猪肺炎支原体蛋白质。在另一个实施方案中，上清液级分至少包括p46、p64和p97猪肺炎支原体蛋白质抗原。大约64kD(p64)的猪肺炎支原体蛋白质在本文中可以可替代地被称为来自猪肺炎支原体的p65表面抗原，其由Kim等人(Infect.Immun.58(8):2637-2643(1990))，以及在美国专利号5,788,962中进行描述。

任何猪肺炎支原体菌株都可以用作原材料，以产生猪肺炎支原体制剂的可溶性部分。合适的猪肺炎支原体菌株可以从商业或学术来源获得，包括保藏机构如美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，Va.)和NRRL培养物保藏中心(NRRL Culture Collection)(农业研究服务中心(Agricultural Research Service)，美国农业部(U.S.Department ofAgriculture)，Peoria，Ill.)。仅ATCC就列出了下述六种猪肺炎支原体菌株用于出售：猪肺炎支原体ATCC 25095、猪肺炎支原体ATCC 25617、猪肺炎支原体ATCC 25934、猪肺炎支原体ATCC 27714、猪肺炎支原体ATCC 27715和猪肺炎支原体ATCC 25934D。用于本发明的实施方案中的优选猪肺炎支原体菌株，鉴定为根据由美国专利商标局(U.S.Patent andTrademark Office)要求的可访问性规则，于1990年5月30日保藏的菌株P-5722-3，ATCC#55052。鉴于该疾病的广泛传播，还可以通过从来自猪的肺分泌物或组织中回收猪肺炎支原体来获得菌株，所述猪感染了引起猪中的支原体肺炎的已知菌株。

注射时间是灵活的。如本文所述的组合物可以早在三周龄直到猪离开保育舍时使用，目的是在暴露于猪肺炎支原体之前至少2周进行疫苗接种。根据本发明的疫苗可以以任何常规方式应用，包括皮内、气管内或阴道内。根据本发明的疫苗也可以通过全身施用来应用。组合物优选可以是肌内或皮内应用的。

WO2009/126356、US8444989、US 8852613和US 8940309描述了猪肺炎支原体菌苗的生成、其制剂及其施用。

在一个有利的实施方案中，每个剂量中的猪肺炎支原体抗原的量具有至少1.22的相对效力(RP)值，

在另一个有利的实施方案中，猪肺炎支原体菌苗在灭活前具有5log₁₀至8log₁₀/ml的抗原量。

在一个有利的实施方案中，猪肺炎支原体疫苗是Ingelvac

相应地，在一个有利的实施方案中，猪肺炎支原体的抗原是在Ingelvac/>

中包括的猪肺炎支原体的抗原。

在一个方面，本发明的疫苗包含PRRSV的抗原。相应地，在本发明的一个方面，提供了用于在猪中引发针对PRRSV的保护性免疫应答的免疫原性组合物。PRRSV的病毒包膜蛋白一般基于病毒粒子中的蛋白质丰度分类成主要蛋白和次要蛋白。主要的病毒包膜蛋白是gp5(ORF 5)和M(ORF 6)并形成二聚体。次要包膜蛋白是gp2(ORF2)、gp3(ORF3)、gp4(ORF4)和E(ORF2b)，以及很可能新近鉴定的病毒蛋白gp5a(ORF 5a)。活性抗原组分可以包括来自PRRSV病毒的ORF4、ORF5、ORF6或ORF7。

重组PRRSV抗原可以在载体化PRRSV疫苗或组合物中表达，所述疫苗或组合物包含容纳并表达某些PRRSV抗原的一种或多种改造的重组腺病毒载体，以及任选地药学或兽医学可接受的载体、佐剂、赋形剂或媒介物。有利的是，载体是腺病毒载体，尽管也考虑了其它载体例如杆状病毒。

PRRSV可以是任何毒株，因为本文公开的新型和创造性的组合物和方法普遍适用于所有已知以及仍有待发现的PRRSV毒株。PRRSV病毒作为被称为“US”和“EU”型的两种基因型存在，所述两种基因型共享约50％的序列同源性(Dea S等人(2000).Arch Virol 145:659-88)。这两种基因型也可以通过其免疫学性质加以区分。关于各种分离株的大多数测序信息都基于结构蛋白，即包膜蛋白GP5，其仅占病毒基因组的约4％，而关于非结构蛋白(nsp)知之甚少。PRRSV的分离和疫苗的制造已在许多公开(WO 92/21375、WO 93/06211、WO93/03760、WO 93/07898、WO 96/36356、EP 0 676 467、EP 0 732 340、EP 0 835 930、US10,039,821)中进行描述。PRRSV抗原包括以任何组合的PRRSV次要蛋白(例如gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E)，并且任选地包括另外的PRRSV主要蛋白(例如gp5或M)。例如，PRRSV抗原可以在病毒样颗粒(VLP)的表面上展示。在其它实施方案中，可以将可溶形式的抗原施用于宿主动物，其中蛋白质与彼此，或者另外与VSV-G的组分、或其它病毒蛋白、或任何寡聚化(包括三聚化基序)(例如来自细菌GCN4的基序等等)寡聚化(包括三聚化)。此外，I型病毒表面糖蛋白的TM/CT结构域设想为实现与来自VSV-G的相应结构域相同的目的，并且因此可与之互换。

在一些实施方案中，PRRSV疫苗是重组疫苗。在这种情况下，一种或多种载体包含：编码PRRSV E抗原、多肽、细胞外结构域或其变体的核苷酸序列；或者，编码修饰的PRRSVgp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或M抗原、多肽、细胞外结构域或其变体的核苷酸序列，其中gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或M的现有细胞定位序列已替换为来自异源基因的细胞表面表达决定簇序列。在一些实施方案中，一种或多种载体包含两种载体的混合物，第一种载体表达重新靶向的PRRSV次要蛋白，而第二种载体表达重新靶向的PRRSV主要蛋白。

在本发明的上下文中，方法可以用于生产活的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，其用于疫苗和其它组合物的生产中。在典型的生产方法中，病毒在允许PRRSV感染的细胞系上生长。然而，在此类一般方法中，细胞系在感染PRRSV之前生长至汇合或接近汇合。

在有利的方法中，细胞系无需在感染PRRSV之前种植且生长，而是可以将PRRSV和细胞系同时加入细胞培养过程中。因此，当病毒在商业规模下大量生产时，所述方法提供了节省时间、成本和材料的显著优点。术语商业规模指超过10L的细胞培养体积。例如，商业规模指用于活PRRSV的10L至3000L生产规模的范围。在更具体的实施方案中，体积是30L至约300L。

本文描述的方法可以用于生产任何PRRSV毒株，包括但不限于作为ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474和VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108保藏的PRRSV毒株。在特别优选的实施方案中，本发明的方法用于生产在登录号ECACC 11012501(亲本毒株)和ECACC 11012502(高传代减毒MSV)下，由欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)保藏的PRRSV毒株94881，所述毒株各自按照布达佩斯条约的条款，于2011年1月25日保藏，或者上述毒株之一的任何子代或后代。生长的病毒可以是以其减毒形式的上述病毒中的任一种。可替代地，病毒可以进行遗传修饰，以包含一种或多种异源核酸，其编码一种或多种猪疾病的进一步抗原决定簇。

本领域技术人员将理解存在允许被PRRSV感染的许多细胞系。示例性细胞是猪肺泡巨噬细胞，例如衍生自MARC-145细胞的细胞。可以感染PRRSV的其它细胞包括被转染的MA-104细胞；幼仓鼠肾(BHK)细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；以及除MA-104细胞或MARC-145细胞外的非洲绿猴肾细胞，例如VERO细胞。另外，细胞可以是来自猪动物的原代细胞，其已适应培养中的长期生长。特别合适的宿主细胞是猿猴细胞系MA-104、Vero细胞或猪肺泡巨噬细胞。PRRSV优先在肺泡肺巨噬细胞中生长(Wensvoort等人，1991)。一些细胞系，例如CL2621以及从猴肾细胞系MA-104克隆的其它细胞系(Benfield等人，1992；Collins等人，1992；Kim等人，1993)也对该病毒敏感，并且可以用于本文所述的大规模生产方法中。

在美国专利号9,944,902的实施例1中所示的示例性方法中，提供了用于生产PRRSV 94881MLV的并行过程。虽然该程序对于PRRSV 94881MLV显示，但技术人员将理解该程序可以容易地用于对于其需要大规模生产的任何PRRSV。

通过所述生产方法生产的病毒可以用于提供用于本发明的疫苗中的PRRSV抗原，特别是MLV PRRSV。

根据所述方法生长的病毒株可以是强毒的PRRS病毒、减毒的PRRS病毒、或实际上已进行修饰以赋予其进一步期望性质的PRRS病毒。这可以通过经典的繁殖和选择技术来实现，如在合适的宿主细胞中的继续增殖以扩展减毒表型。可替代地，可以通过合适的遗传改造技术，通过这些毒株的基因组核酸序列的定向突变，对毒株进行遗传修饰。PRRSV的基因组已完全或部分进行测序(Conzelmann等人，1993；Meulenberg等人，1993a，Murthaugh等人，1995)，并且除了RNA依赖性RNA聚合酶(ORF 1a和1b)外，还编码六种结构蛋白，其中四种包膜糖蛋白命名为GP2(ORF2)、GP3(ORF3)、GP4(ORF4)和GP5(ORF5)，非糖基化膜蛋白M(ORF6)和核衣壳蛋白N(ORF7)(Meulenberg等人1995，1996；van Nieuwstadt等人，1996)。欧洲和美国PRRSV毒株的免疫学表征和核苷酸测序已鉴定了在PRRSV的毒株内，定位于结构病毒蛋白中的微小抗原差异(Nelson等人，1993；Wensvoort等人，1992；Murtaugh等人，1995)。

事实上，示例性病毒是PRRSV 94881病毒。虽然减毒株使用本文所述的方法进行生长，但病毒可以容易地是制备成嵌合病毒的PRRSV 94881病毒，其中在ECACC登录号11012502下的PRRSV 94881病毒的主链、或者实际上在ECACC登录号11012501下保藏的亲本毒株进行修饰，以用来自PRRS病毒的不同毒株的相应ORF替换ORF 1a、ORF 1b、ORF 2、ORF3、ORF 4、ORF 5、ORF 6或ORF 7中的一种或多种的内源序列。例如，PRRS病毒的不同毒株可以是不同的欧洲毒株，例如Lelystad病毒株(Lelystad Agent(CDI-NL-2.91)，或者其它毒株例如在登录号ECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR2474和VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACCV93070108下保藏的那些毒株，或者实际上可能是美国毒株，例如北美PRRS病毒，pT7P129A；ATCC保藏VR-2332、ATCC保藏VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCCVR 2429、ATCC VR 2474和ATCC VR 2402。

用于制备修饰序列的重组技术是本领域技术人员众所周知的，并且通常采用病毒基因组的全长互补DNA拷贝(感染性克隆)的构建，其然后可以通过DNA重组和操作方法(如定点诱变等)进行修饰。这样，例如可以修饰病毒蛋白的抗原位点或酶促性质。欧洲和北美基因型的PRRS病毒株的感染性克隆已在文献中得到报道，并且可以使用本发明的方法进行生长。

优选地，根据本发明的疫苗包含改良活PRRSV，其包含在合适载体中存活的这些毒株中的一种或多种，但灭活病毒也可以用于制备杀死疫苗(KV)。MLV通常配制为允许施用10¹至10⁷个病毒颗粒/剂量，优选10³至10⁵个颗粒/剂量，更优选10⁴至10⁵个颗粒/剂量(4.0-5.0log₁₀ TCID₅₀)。本发明的疫苗可以具有每剂量约10⁴至约10⁷个病毒颗粒的PRRSV抗原的剂量。KV可以基于10³至10¹⁰个病毒颗粒/剂量的灭活前滴度进行配制。疫苗可以包含药学可接受的载体，例如生理盐溶液。疫苗可以包含或可以不包含佐剂。合适佐剂的实例是α-生育酚乙酸酯，其可以在商品名Diluvac

下获得。可替代地，例如可以使用基于铝的佐剂。

猪可以经由口鼻途径被PRRSV感染。肺中的病毒被肺泡巨噬细胞吸收，并且PRRSV在这些细胞中的复制在9小时内完成。PRRSV在12小时内从肺行进到肺淋巴结，并且在3天内行进到外周淋巴结、骨髓和脾。在这些部位处，仅少数细胞对于病毒抗原呈染色阳性。病毒在血液中存在至少21天，并且经常长得多。在7天后，在血液中发现了针对PRRSV的抗体。感染PRRS的猪中病毒和抗体的组合存在显示了，尽管抗体的存在，病毒感染仍可以持续很长时间，尽管处于低水平。在至少7周过程中，肺中的肺泡细胞群体与正常SPF肺不同。

疫苗可以以活病毒的冷冻干燥制剂的形式存在，待用溶剂重构，以导致注射用溶液。因此，在所述方法的收获步骤后，病毒可以被组合并冷冻干燥。溶剂可以例如是水、生理盐水或缓冲液，或佐剂溶剂。溶剂可以含有佐剂，例如α-生育酚乙酸酯。然后可以将重构的疫苗注射到猪内，例如作为在颈部内的肌内或皮内注射。对于肌内注射，可以应用2ml的体积，对于皮内注射，它通常为0.2ml。在一个进一步的方面，本发明因此涉及一种疫苗产品，其包含在分开的容器中的病毒的冷冻干燥组合物和用于重构的溶剂，并且任选地进一步含有包含使用说明书的传单或标签。

由通过上述方法产生的病毒制备的疫苗可能不仅包含上述毒株中的一种或多种，而且可能包括针对PRRS或者其它猪病毒或细菌疾病(例如胞内劳森氏菌、PCV和/或猪肺炎支原体)活性的进一步组分。因此，本发明进一步涉及如所述的疫苗，其特征在于它含有针对并非PRRS的猪疾病活性的至少一种进一步抗原。另外，疫苗可以包含某些药学或兽医学可接受的佐剂。一种此类佐剂是α-生育酚。因此，新的疫苗组合物，特别是包含PRRSV 94881的PRRS病毒疫苗可以通过添加佐剂得到进一步改善。此类改善包含与佐剂组合的疫苗制剂，，所述佐剂增强疫苗的功效，使得与单独的疫苗施用相比，对于佐剂和疫苗的组合施用可见更好的临床应答/结果。例如，本发明的疫苗组合物可以包含PRRSV 94881病毒疫苗，以及选自MCP-1、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus sonmus)级分、

及其组合的佐剂。在一些实施方案中，病毒疫苗包含PRRSV 94881病毒疫苗，其可以是重组亚单位疫苗或者可替代地可以是活减毒的病毒疫苗。存在的示例性活疫苗是/>

PRRS MLV，并且PRRSV94881可以以类似于/>

PRRS MLV的方式进行配制。

除上述之外，疫苗组合物可能含有其它成分，只要其它成分并不干扰MCP-1、睡眠嗜血杆菌级分、

或其它卡波姆的佐剂性质或基础病毒疫苗。此类其它成分包括例如粘合剂、着色剂、干燥剂、防腐药、润湿剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、增塑剂、增粘剂、增稠剂、贴片材料、软膏基质、角蛋白去除剂、碱性物质、吸收促进剂、脂肪酸、脂肪酸酯、高级醇、表面活性剂、水和缓冲剂。优选的其它成分包括缓冲剂、软膏基质、脂肪酸、防腐药、碱性物质或表面活性剂。

用于本发明中的佐剂的含量或量可以变化，并且可以通过考虑例如待使用的PRRS病毒疫苗的性质和剂型来确定。

本发明的疫苗组合物可以通过配制领域已知的任何方法配制成例如液体制剂、悬浮液、软膏、粉末、洗剂、W/O乳状液、O/W乳状液、乳状液、乳膏、糊剂、贴片和凝胶，并且优选用作药剂。因此，根据本发明的另一个方面，提供了包含上述疫苗组合物的药物组合物。当皮肤施用时，根据本发明的疫苗组合物可以显著诱导抗体产生。相应地，在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物可以作为经皮制剂提供。

当将佐剂和PRRS病毒疫苗施用于生物时，动物的临床结果得到增强。佐剂的有效量和PRRS病毒疫苗的免疫学有效量可以由本领域普通技术人员通过考虑以下，并且进一步使用生物中针对抗原物质产生的抗体量作为指标适当地确定：例如抗原物质的类型和性质，生物的物种、年龄、体重、疾病的严重程度，疾病的类型，施用时间和施用方法。

PRRS病毒疫苗、佐剂或其组合可以通过任何合适的方法施用于生物，所述方法取决于例如患者的状况和疾病的性质加以选择。此类方法的实例包括腹膜内施用、皮肤施用(例如，皮下注射、肌内注射、皮内注射和贴片)、经鼻施用、经口施用、粘膜施用(例如，直肠施用、阴道施用和角膜施用)。在其中，优选肌内施用。

PRRSV MLV的示例性治疗剂量为约两毫升(2mL)。技术人员将认识到，剂量的量可以基于个别对象的品种、大小和其它身体因素，以及PRRSV MLV的具体制剂和施用途径而变。优选地，PRRSV MLV以单一剂量进行施用；然而，另外的剂量可能是有用的。再次，技术人员通过本发明将认识到，剂量和剂量次数受对象猪的年龄和身体状况以及本行业常见的其它考虑因素和在其下施用PRRSV MLV的具体条件的影响。

在某些其它实施方案中，疫苗可以是包含两种或更多种PRRS病毒的多价疫苗，其中PRRS病毒中的至少一种是在ECACC登录号11012502下保藏的减毒的94881病毒。其它PRRS病毒可以是选自以下的一种或多种：在登录号Lelystad病毒株(Lelystad Agent(CDI-NL-2.91))下保藏的PRRSV毒株，或者其它毒株例如在登录号ECACC 04102703、ECACC04102702、ECACC 04102704、CNCM登录号I-1140、CNCM登录号I-1387、CNCM登录号I-1388、ATCC VR 2332、VR 2385、VR 2386、VR 2429、VR 2474和VR 2402；CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388或ECACC V93070108下保藏的那些毒株，或者实际上可能是美国毒株，例如北美PRRS病毒，pT7P129A；ATCC保藏VR-2332、ATCC保藏VR-2368；ATCC VR-2495；ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474和ATCC VR 2402。

基于PRRS病毒的疫苗可以用于对仔猪和母猪两者进行疫苗接种。在本发明的一个方面，基于猪的年龄和选择用于施用的抗原来选择特定的剂量方案。这将允许任何年龄的猪基于本发明的下述发现接受最有效的剂量：PRRSV感染(来自野生型暴露和疫苗接种两者)在年长的动物中更快得多被清除。因此，在一些方面，较年长的动物的疫苗接种是优选的，但较年幼的猪(包括三周龄和更年幼的那些猪)的疫苗接种帮助诱导主动免疫，并且仍是非常有益的。动物年龄可能是PRRS控制中的重要因素，并且可能是影响疫苗接种和有效免疫应答发展的因素。因此，年龄、疾病管理、畜牧业、先天免疫和主动免疫是重要的，并且需要在控制策略中加以考虑。

PRRSV疫苗可以任何常规方式进行施用，并且在一些优选的方法中，施用是经鼻的。优选的是，与Ingelvac

一样，所施用的PRRSV疫苗在单一剂量后提供了其治疗或减少PRRSV感染的严重程度或发生率的益处，然而，如果选择其它抗原或组合或多价疫苗，则应该理解它们可以以其常规方式进行施用，所述常规方式可以包括在初始施用后的一个或多个加强剂量。本领域技术人员将能够基于所选的PRRSV疫苗和抗原将施用于其的动物的年龄范围来确定适当的给药水平。

在一个有利的实施方案中，PRRSV疫苗是Ingelvac

MLV。相应地，在一个有利的实施方案中，PRRSV的抗原是在Ingelvac/>

MLV中包括的PRRSV的抗原。优选的免疫或疫苗接种方法在于通过全身施用例如肌内途径施用根据本发明的疫苗。

在一个特别有利的实施方案中，PCV的抗原、猪肺炎支原体的抗原和PRRSV的抗原是PCV的抗原、猪肺炎支原体的抗原以及在

中包括的PRRSV的抗原。

在一个特别有利的实施方案中，胞内劳森氏菌的抗原是冻干的并溶解于

疫苗中。在另一个特别有利的实施方案中，在/>

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原溶解于/>

疫苗中。在一个甚至更特别有利的实施方案中，在/>

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原溶解于Ingelvac/>

中。疫苗的体积可以是2ml。

本发明进一步考虑了可以进一步包含一种或多种抗微生物剂的疫苗。抗微生物剂包括但不限于泰妙菌素和/或金霉素。在这种情况下，泰妙菌素的剂量可以是约35g/吨或约35ppm，并且金霉素的剂量可以是约400g/吨或约400ppm。

本发明的组合疫苗有利地肌内施用，尽管也考虑了经口施用。

本发明还涵盖了与来自猪中的另一种致病生物的抗原的组合。优选地，猪中的其它致病生物选自：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumonia)；腺病毒；甲病毒如东方马脑脊髓炎病毒；支气管败血博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；短螺旋体属(Brachyspira)物种，优选猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae)；大肠毛状短螺旋体(B.piosicoli)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)，优选生物变型1、2和3；古典猪瘟病毒；梭菌属(Clostridium)物种，优选艰难梭菌(Cl.difficile)，产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)A、B和C型，诺魏氏梭菌(Cl.novyi)，败毒梭菌(Cl.septicum)，破伤风梭菌(Cl.tetani)；冠状病毒，优选猪呼吸道冠状病毒；猪附红体(Eperythrozoonosis suis)；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；大肠杆菌(Escherichia coli)；副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)，优选亚型1、7和14；血凝性脑脊髓炎病毒；日本脑炎病毒；钩端螺旋体属(Leptospira)物种，优选澳大利亚钩端螺旋体(Leptospira australis)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、流感伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohaemorrhagicae)、和问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)、波蒙那钩端螺旋体(Leptospira pomona)、塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)；分枝杆菌属(Mycobacterium)物种，优选鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)和牛分枝杆菌(M.bovis)；多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；伪狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属(Salmonella)物种，优选鼠伤寒沙门氏菌(S.thyphimurium)和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)；猪葡萄球菌(Staph.hyicus)；葡萄球菌属(Staphylococcus)物种，优选链球菌属(Streptococcus)物种，优选猪链球菌(Strep.suis)；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒，水泡性口炎病毒；猪水疱疹病毒；哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjo)和/或猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)。

本发明的免疫原性制剂还可以与至少一种常规疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗)或重组疫苗(病毒载体)组合，所述疫苗针对至少一种不同或相同的猪病原体。本发明特别提供了与含佐剂的常规疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗)的组合。对于灭活疫苗或亚单位疫苗，可以提到特别是含有单独的或与作为佐剂的皂苷混合的氧化铝凝胶的那些疫苗、或者以水包油型乳状液的形式配制的那些疫苗。

另外，组合物可以包括一种或多种兽医学可接受的载体。如本文使用的，“兽医学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等等。在一个优选的实施方案中，免疫原性组合物包含如随同提供的PCV3 ORF2蛋白或PCV2 ORF2，优选以上述浓度，其与佐剂，优选

和生理盐水混合。

本领域的技术人员将理解本文使用的组合物可以掺入已知的可注射的、生理学可接受的无菌溶液。为了制备用于肠胃外注射或输注的即用型溶液，等渗水溶液例如盐水或相应的血浆蛋白溶液是可容易获得的。另外，本公开内容的免疫原性组合物和疫苗组合物可以包括稀释剂、等渗剂、稳定剂或佐剂。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等渗剂可以尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱盐。

如本文使用的，“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge Mass.)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，Ala.)，油包水乳剂，水包油乳剂，水包油包水乳剂。乳剂可以特别地基于轻质液态石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，例如角鲨烷或角鲨烯；源自于烯烃，特别是异丁烯或癸烯的低聚反应的油；含有线性烷基的酸或醇的酯，更特别为植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。该油与乳化剂结合使用，以形成乳剂。乳化剂优选为非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨醇、二缩甘露醇(例如脱水甘露醇油酸酯)、二醇、聚甘油、丙二醇以及油酸、异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其任选地是乙氧基化的，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是Pluronic产品，尤其是L121。参见Hunter等人，The Theoryand Practical Application of Adjuvants(编辑Stewart-Tull，D.E.S.)，John Wileyand Sons，NY，第51-94页(1995)，以及Todd等人，Vaccine 15:564-570(1997)。

例如，使用由M.Powell和M.Newman编辑的“Vaccine Design，The Subunit andAdjuvant Approach”，Plenum Press，1995的第147页上描述的SPT乳剂，以及在同一本书的第183页上描述的乳剂MF59是可能的。

佐剂的进一步实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其与糖或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物由术语卡波姆(Phameuropa，第8卷，第2期，1996年6月)已知。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其描述了与多羟基化化合物交联的此类丙烯酸类聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个羟基，优选不多于8个，至少三个羟基的氢原子被替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团。优选的原子团是含有2至4个碳原子的原子团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和原子团本身可以含有其它取代基，例如甲基。以名称

(BF Goodrich，Ohio，USA)销售的产品是特别适当的。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。在其中，可以提到CARBOPOL^TM974P、941P、934P和971P。最优选的是/>

的使用，特别是/>

971P的使用，优选为每剂量约500μg至约5mg的量，甚至更优选为每剂量约750μg至约2.5mg的量，并且最优选为每剂量约1mg的量。特别地，最终组合物的剂量可以包括在约750μg至约2.5mg/>

的范围内的/>

或/>

971。例如，在一些实施方案中，最终组合物的剂量可以包括约1mg的/>

971。

进一步合适的佐剂尤其包括但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)，嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)，SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)，单磷酰脂质A，阿夫立定脂质-胺佐剂，来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或其它方式)，霍乱毒素，IMS 1314或胞壁酰二肽。

换言之，本发明的疫苗可以包含一种或多种佐剂。在说明书自始至终提供了佐剂的非限制性实例。

此外，本发明的疫苗可以包含以下中的一种或多种作为佐剂：丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；马来酸酐和烯基衍生物的共聚物；交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；卡波姆；与多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个且不多于8个羟基，其中至少三个羟基的氢原子任选地被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团替换，其中所述原子团含有2至4个碳原子，如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团，并且不饱和原子团本身可以含有其它取代基，如甲基；

974P；/>

934P；/>

971P；/>

980；/>

941P；/>

氢氧化铝；磷酸铝；皂苷；Quil A；QS-21；GPI-0100；油包水型乳状液；水包油型乳状液；水包油包水型乳状液；基于轻质液体石蜡油或欧洲药典型佐剂的乳状液；类异戊二烯油；角鲨烷；源自于烯烃或异丁烯或癸烯的低聚反应的角鲨烯油；含有线性烷基的酸或醇的酯；植物油；油酸乙酯；丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)；甘油三(辛酸酯/癸酸酯)；丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯；异硬脂酸酯；非离子型表面活性剂；脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯或乙二醇酯或聚甘油酯或丙二醇酯或油酸酯或异硬脂酸酯或蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯，任选地乙氧基化的无水甘露醇油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，Pluronic产品，RIBI佐剂系统；嵌段共聚物；SAF-M；单磷酰脂质A；阿夫立定脂质-胺佐剂；来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或其它方式)；霍乱毒素；IMS 1314，或胞壁酰二肽。

在一个优选和有利的实施方案中，本发明的疫苗包含一种或多种卡波姆。

在一个优选和有利的实施方案中，本发明的疫苗包含

和/或

的具体实例在本文中提供。

在一个进一步的实施方案中，本发明的疫苗可以包含药学或兽医学可接受的载体。

优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg的量加入。甚至更优选地，佐剂以每剂量约100μg至约10mg的量加入。甚至更优选地，佐剂以每剂量约500μg至约5mg的量加入。甚至更优选地，佐剂以每剂量约750μg至约2.5mg的量加入。最优选地，佐剂以每剂量约1mg的量加入。

另外，组合物可以包括一种或多种药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等等。

根据一个进一步的方面，该免疫原性组合物进一步包含药学可接受的盐，优选以生理学可接受的浓度的磷酸盐。优选地，将所述免疫原性组合物的pH调整至生理pH，意味着约6.5至7.5。

给药方案可以用于改善养猪业的经济。例如，可以在保护母猪、仔猪或两者的努力中，将免疫原性组合物如疫苗施用于母猪和/或仔猪。

进一步声明了在妊娠的114天期间的所有或两个或至少一个三月期中，用胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体或PRRSV进行攻击时，本发明的疫苗能够保护育种小母猪和母猪。

还声明了在妊娠的114天期间的所有或两个或至少一个三月期中，用胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体或PRRSV进行攻击时，疫苗能够显著减少接种疫苗的小母猪和接种疫苗的母猪中的木乃伊胎、死胎和胎儿的发生率。

给药方案可以包括在育种之前，用如本文所述的免疫原性组合物的至少一个剂量，给年幼母猪(即，小于或等于5月龄)接种疫苗。如本文所述的免疫原性组合物的剂量可以在育种之前作为一(1)mL剂量进行肌内施用。在一些实施方案中，疫苗的一个剂量或多个剂量可以给予母猪。例如，可以给予第一次疫苗，并且随后为在21天后和在育种之前的加强疫苗。在一些实施方案中，母猪可以在加强疫苗接种后的14天至21天的范围内进行育种。该时帧可以允许母猪产生免疫应答。利用此类给药方案可以减少和/或抑制分娩时的木乃伊胎数目。

进一步地，包括施用免疫原性组合物(其包括胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体或PRRSV)的给药方案的使用，可能减少、减轻和/或抑制感染胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体或PRRSV的猪中的淋巴结病、淋巴样耗竭和/或多核/巨组织细胞。有利地，剂量为约2ml。

还描述的是使得能够在猪中诱导针对圆环病毒的免疫应答的免疫方法。特别地，描述了在猪中有效的疫苗接种方法。这些免疫和疫苗接种方法包括施用如上文所述的制剂之一或者单价或多价疫苗之一。这些免疫和疫苗接种方法包括施用这些制剂或疫苗的一个或多个连续剂量。在这种免疫或疫苗接种方法的背景下，制剂和疫苗可以通过以下进行施用：现有技术中提议用于多核苷酸疫苗接种的各种施用途径，特别是肌内和皮内途径，并且借助于已知的施用技术，特别是用具有针的注射器的注射，通过液体射流(Furth等人Analytical Bioch.，1992，205:365-368)，或通过喷射用DNA包被的金颗粒(Tang等人Nature，1992，356:152-154)。

这种方法不仅允许对成年猪的施用，还允许对年幼母猪和妊娠母猪的施用；在后一种情况下，这特别使得能够对新生儿赋予被动免疫(母体抗体)。优选地，母猪在育种之前；和/或在配种(serving)之前，和/或在妊娠期间进行接种。有利地，在配种前完成至少一次接种，并且优选随后为在妊娠过程中，例如在约妊娠中期(在妊娠约6-8周时)和/或在妊娠末期(在妊娠约11-13周时)进行的接种。因此，有利的方案是配种前的接种和在妊娠过程中的加强接种。其后，可以存在在每次配种前和/或在妊娠过程中在约妊娠中期和/或妊娠末期的再接种。优选地，再接种是在妊娠过程中。

在一个进一步方面，本发明涉及本文所述的本发明的疫苗的用途。此外，本发明涉及方法，其中所述方法包括使用本文所述的本发明的疫苗。

相应地，在一个实施方案中，本发明的疫苗用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中，所述方法包括将所述疫苗施用于动物。

相应地，在一个实施方案中，本发明的疫苗用于在猪中引发保护性免疫应答的方法中，所述方法包括将所述疫苗施用于猪。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中，其中所述疫苗是全身施用的，优选肌内或皮内施用的。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中，其中所述疫苗作为一个剂量或至少一个剂量进行施用。

本发明还涵盖了本发明的疫苗用于在动物中引发针对胞内劳森氏菌和/或PCV和/或猪肺炎支原体和/或PRRSV的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和猪肺炎支原体的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PRRS的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV和猪肺炎支原体的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV和PRRS的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PRRS和猪肺炎支原体的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV和猪肺炎支原体和PRRSV的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法中。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法中，其中所述疫苗包含活的胞内劳森氏菌，优选减毒的胞内劳森氏菌或改良活的胞内劳森氏菌，以及PCV的抗原。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法中，其中所述疫苗包含活的胞内劳森氏菌，优选减毒的胞内劳森氏菌或改良活的胞内劳森氏菌，以及PCV的重组多肽。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法中，其中所述疫苗包含活的胞内劳森氏菌，优选减毒的胞内劳森氏菌或改良活的胞内劳森氏菌，以及由PCV ORF2基因表达的PCV的重组多肽。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法中，其中所述疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原和PCV的抗原。

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法中，其中所述疫苗包含胞内劳森氏菌的抗原和PCV的抗原，并且其中所述疫苗是全身施用的，优选肌内或皮内施用的。

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原，并且其中所述疫苗是全身施用的，优选肌内或皮内施用的。

在一个实施方案中，本发明的疫苗用于针对动物中由至少一种病原体引起的临床疾病对所述动物进行免疫的方法中，其中所述疫苗并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述至少一种病原体的致病形式对动物进行免疫的免疫应答。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于针对动物中由胞内劳森氏菌和PCV引起的临床疾病对所述动物进行免疫的方法中，其中所述疫苗并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述病原体的致病形式对动物进行免疫的免疫应答。

在一个实施方案中，本发明的疫苗用于引发保护性免疫应答的方法中，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于减少动物中的肠损伤。

相应地，在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发保护性免疫应答的方法中，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于减少动物中的肠损伤，其中所述疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

肠损伤可以是回肠损伤。肠损伤和/或回肠损伤可以是肉眼损伤和/或微观损伤。

在一个实施方案中，本发明的疫苗用于引发保护性免疫应答的方法中，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于减少动物的粪便脱落。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发保护性免疫应答的方法中，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于减少动物中的粪便脱落，其中所述疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

在一个实施方案中，本发明的疫苗用于引发保护性免疫应答的方法中，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于增加动物的平均日增重。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于引发保护性免疫应答的方法中，其中与同一物种的未免疫的对照组的动物相比，针对胞内劳森氏菌的保护性免疫应答用于增加动物的平均日增重，其中所述疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

本发明进一步涵盖了用于在动物中引发针对胞内劳森氏菌和/或PCV和/或猪肺炎支原体和/或PRRSV的保护性免疫应答的方法，其包括将本发明的疫苗施用于动物。

本发明还涵盖了用于在动物中引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法，其包括将本发明的疫苗施用于动物。

本发明还涵盖了用于在猪中引发针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法，其包括将本发明的疫苗施用于猪。

本发明还涵盖了针对动物中由至少一种病原体引起的临床疾病对所述动物进行免疫的方法，所述方法包括将本发明的疫苗施用于动物的步骤，其中所述疫苗并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述至少一种病原体的致病形式对动物进行免疫的免疫应答。

本发明还涵盖了针对动物中由胞内劳森氏菌和PCV引起的临床疾病对所述动物进行免疫的方法，所述方法包括将本发明的疫苗施用于动物的步骤，其中所述疫苗并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述病原体的致病形式对动物进行免疫的免疫应答。

本发明还涵盖了针对猪中由胞内劳森氏菌和PCV引起的临床疾病对所述猪进行免疫的方法，所述方法包括将本发明的疫苗施用于动物的步骤，其中所述疫苗并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述病原体的致病形式对猪进行免疫的免疫应答。

本发明进一步涵盖了本发明的疫苗在制备组合物中的用途，所述组合物用于诱导针对胞内劳森氏菌和/或PCV和/或猪肺炎支原体和/或PRRSV的保护性免疫应答。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗在制备组合物中的用途，所述组合物用于诱导针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗在制备组合物中的用途，所述组合物用于诱导针对胞内劳森氏菌和PCV和猪肺炎支原体和PRRSV的保护性免疫应答。

本发明进一步涵盖了本发明的疫苗用于诱导针对胞内劳森氏菌和/或PCV和/或猪肺炎支原体和/或PRRSV的保护性免疫应答的方法的用途。

在一个有利的实施方案中，本疫苗的用途是用于诱导针对胞内劳森氏菌和PCV的保护性免疫应答的方法。

在一个有利的实施方案中，本疫苗的用途是用于诱导针对胞内劳森氏菌和PCV和猪肺炎支原体和PRRSV的保护性免疫应答的方法。

本发明的疫苗可以优选作为单一剂量进行施用，即一次性施用。

相应地，在一个实施方案中，本发明的疫苗配制和/或包装用于单一剂量或一次性施用。

在一个实施方案中，本发明的疫苗配制和/或包装用于多剂量方案，优选两剂量方案。

在一个实施方案中，本发明的疫苗处于剂型中，其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送。所述容器可以含有所述疫苗的至少10、至少50、至少100、至少150、至少200或至少250个剂量。

通常，由胞内劳森氏菌引起的疾病猪增生性肠病(PPE)可以使用商业活疫苗(

Ileitis)进行控制，所述疫苗通过灌服或在饮用水中经口给予。要求在疫苗接种前三天、在疫苗接种当天和在疫苗接种后三天，用/>

Ileitis接种疫苗的动物并未接受有效针对胞内劳森氏菌的任何抗生素治疗。

本发明人惊讶地和意外地发现，当肌内施用时，尽管动物的同时/伴随抗生素治疗，活的胞内劳森氏菌疫苗仍是有效的。

相应地，本文设想了尽管动物的同时/伴随抗生素治疗，本发明的疫苗仍可以施用于动物。当施用本发明的疫苗时，尽管动物的同时/伴随抗生素治疗，施用途径优选全身施用。

相应地，本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，所述方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗。

此外，本发明涵盖了用于在猪中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，所述方法包括将所述疫苗施用于猪，其中所述猪同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗。

如本文使用的，短语“同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗”意指在疫苗接种前三天、在疫苗接种前两天和/或在疫苗接种前一天，动物/猪接受抗生素治疗(即，将一种或多种抗生素施用于动物/猪)。所述短语还可以意指动物/猪在同一天时接受抗生素治疗和疫苗接种。所述短语还可以意指动物/猪将在疫苗接种后一天、两天和/或三天接受抗生素治疗。

术语“抗生素”是本领域众所周知的，并且在本文中以最广泛的含义使用。如本文使用的，术语“抗生素”可以指对细菌具有不利作用的化合物。抗生素的非限制性实例包括β-内酰胺类(例如青霉素VK、青霉素G、阿莫西林三水合物)、硝基咪唑类、大环内酯类(例如，酒石酸泰乐菌素、红霉素、阿奇霉素和克拉霉素)、四环素类、糖肽类(例如万古霉素)、截短侧耳素和氟喹诺酮类。

优选地，抗生素

(泰妙菌素)或CTC(金霉素)或其组合用于抗生素治疗。

优选地，抗生素以35g/吨的

(泰妙菌素)和400g/吨的CTC(金霉素)的剂量施用总共两周的时期。

相应地，本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，该方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗，并且其中所述疫苗包含胞内劳森氏菌的抗原和PCV的抗原。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中，所述方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗，其中所述疫苗包含活的胞内劳森氏菌和PCV的抗原，并且其中所述疫苗是全身施用的，优选肌内施用的。

此外，本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，所述方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用一种或多种抗生素进行治疗，并且其中所述疫苗包含在

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

此外，本发明涵盖了用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中的本发明的疫苗，所述方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原。

在一个有利的实施方案中，本发明的疫苗用于在动物中引发保护性免疫应答的方法中，所述方法包括将所述疫苗施用于动物，其中所述动物同时/伴随地用

(泰妙菌素)和/或CTC(金霉素)进行治疗，其中所述疫苗包含在/>

Ileitis中包括的胞内劳森氏菌的抗原、以及在Ingelvac/>

或/>

中包括的PCV的抗原，并且其中所述疫苗是全身施用的，优选肌内施用的。

尽管本发明及其优点已得到详细描述，但应当理解，可以在本文中进行各种变化、取代和改变，而不脱离如所附权利要求中限定的本发明的精神和范围。

现在将通过编号的方案来描述本发明的某些方面。

1.一种适合用作猪疫苗的疫苗，其包含免疫原性胞内劳森氏菌组分、免疫原性猪圆环病毒(PCV)组分、免疫原性猪肺炎支原体(M.hyo.)组分、以及免疫原性猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)组分。

2.方案1的疫苗，其中所述疫苗包含一种或多种佐剂。

3.方案2的疫苗，其中所述一种或多种佐剂包含丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；马来酸酐和烯基衍生物的共聚物；交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；卡波姆；与多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个且不多于8个羟基，其中至少三个羟基的氢原子任选地被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团替换，其中所述原子团含有2至4个碳原子，如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团，并且不饱和原子团本身可以含有其它取代基，如甲基；卡波普；卡波普974P；卡波普934P；卡波普971P；氢氧化铝；磷酸铝；皂苷；QuilA；QS-21；GPI-0100；油包水型乳状液；水包油型乳状液；水包油包水型乳状液；基于轻质液体石蜡油或欧洲药典型佐剂的乳状液；类异戊二烯油；角鲨烷；源自于烯烃或异丁烯或癸烯的低聚反应的角鲨烯油；含有线性烷基的酸或醇的酯；植物油；油酸乙酯；丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)；甘油三(辛酸酯/癸酸酯)；丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯；异硬脂酸酯；非离子型表面活性剂；脱水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯或乙二醇酯或聚甘油酯或丙二醇酯或油酸酯或异硬脂酸酯或蓖麻油酸酯或羟基硬脂酸酯，任选地乙氧基化的无水甘露醇油酸酯；聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，Pluronic产品，RIBI佐剂系统；嵌段共聚物；SAF-M；单磷酰脂质A；阿夫立定脂质-胺佐剂；来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或其它方式)；霍乱毒素；IMS 1314，或胞壁酰二肽。

4.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述免疫原性胞内劳森氏菌组分是胞内劳森氏菌疫苗。

5.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述免疫原性胞内劳森氏菌组分是活疫苗。

6.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌组分是减毒疫苗。

7.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌组分具有10³至10⁹个细菌/Kg体重或约10⁵至10⁷个细菌/Kg体重的剂量。

8.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌组分具有1x 10⁵至1x 10⁷个胞内劳森氏菌细菌的剂量。

9.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌组分是冻干的。

10.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌疫苗进一步包含佐剂。

11.前述方案的疫苗，其中所述佐剂是

12.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌组分是

Ileitis疫苗。

13.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述免疫原性猪圆环病毒(PCV)组分是猪圆环病毒(PCV)疫苗。

14.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV是PCV1。

15.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV是PCV2。

16.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV是PCV3。

17.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV是PCV2和PCV3。

18.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分是重组PCV疫苗。

19.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述重组PCV组分是PCV ORF基因或包含PCVORF基因或由PCV ORF基因表达，例如由PCV ORF基因表达的蛋白质。

20.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述重组PCV组分是PCV ORF基因或包含PCVORF基因或由PCV ORF基因表达，例如由PCV ORF基因表达的蛋白质，并且其中所述PCV ORF基因编码PCV ORF2基因。

21.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述重组PCV组分是PCV ORF基因或包含PCVORF基因或由PCV ORF基因表达，例如由PCV ORF基因表达的蛋白质，其中所述PCV ORF基因编码PCV ORF2基因，并且其中所述PCV ORF2基因是PCV2 ORF2基因。

22.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分是或包含重组PCV ORF2蛋白。

23.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分是或包含重组PCV ORF2蛋白，并且其中所述疫苗具有约2μg至约400μg重组PCV ORF2蛋白的剂量。

24.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分是或包含DNA。

25.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分是或包含DNA，并且其中所述DNA为约10μg至约2000μg，并且优选约50μg至约1000μg的量。

26.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分在杆状病毒细胞中或已在杆状病毒细胞中表达。

27.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分进一步包含佐剂。

28.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗或疫苗组分之一包含佐剂，并且其中所述佐剂是CARBOPOL^TM。

29.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分是Ingelvac

30.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述免疫原性猪肺炎支原体组分是猪肺炎支原体疫苗。

31.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述猪肺炎支原体组分是上清液和/或菌苗。

32.前述方案的疫苗，其中所述猪肺炎支原体组分是菌苗。

33.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述猪肺炎支原体组分的剂量是约2ml的上清液和/或菌苗。

34.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述猪肺炎支原体组分是Ingelvac

35.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述免疫原性猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)组分是猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)疫苗。

36.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PRRSV组分是活疫苗。

37.前述方案的疫苗，其中所述PRRSV组分是减毒疫苗。

38.两个前述方案的疫苗，其中所述PRRSV组分是改良活疫苗。

39.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PRRSV组分具有每剂量约10¹至约10⁷个病毒颗粒，优选每剂量约10³至约10⁵个颗粒，更优选每剂量约10⁴至约10⁵个颗粒的剂量。

40.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PRRSV组分是冻干的。

41.前述方案的疫苗，其中所述冻干的PRRSV组分在或已在2ml溶剂中重构用于施用。

42.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PRRSV组分是

PRRS MLV。

43.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分、猪肺炎支原体组分和PRRSV组分是或衍生自

疫苗。

44.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述PCV组分、猪肺炎支原体组分和PRRSV组分是或衍生自

疫苗，并且其中所述胞内劳森氏菌组分是冻干的并且溶解于/>

疫苗中。

45.两个前述方案的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌组分是

Ileitis。

46.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗的体积为约0.5ml至约4ml。

47.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗的体积为约2ml。

48.前述方案中任何一个的疫苗，其进一步包含药学或兽医学可接受的载体。

49.前述方案中任何一个的疫苗，其进一步包含佐剂。

50.前述方案的疫苗，其中所述佐剂是

51.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗是用于经口施用的形式。

52.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗是经由饮用水或经口灌服用于经口施用的形式。

53.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗是用于肌内施用的形式。

54.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗配制和/或包装用于单一剂量或一次性施用。

55.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗配制和/或包装用于多剂量方案。

56.根据前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗配制和/或包装用于两剂量方案。

57.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗处于剂型中；并且其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送。

58.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗处于剂型中；并且其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送；并且其中所述容器包含所述组合物的至少10个剂量。

59.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗处于剂型中；并且其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送；并且其中所述容器包含所述组合物的至少50个剂量。

60.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗处于剂型中；并且其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送；并且其中所述容器包含所述组合物的至少100个剂量。

61.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗处于剂型中；并且其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送；并且其中所述容器包含所述组合物的至少150个剂量。

62.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗处于剂型中；并且其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送；并且其中所述容器包含所述组合物的至少200个剂量。

63.前述方案中任何一个的疫苗，其中所述疫苗处于剂型中；并且其中所述剂型从含有更大量的所述疫苗的容器中递送，并且其中所述疫苗的剂型能够从所述容器中递送；并且其中所述容器包含所述组合物的至少250个剂量。

64.前述方案中任何一个的疫苗，其用于在动物中引发免疫应答或免疫学应答或保护性免疫应答或保护性免疫学应答。

65.前述方案中任何一个的疫苗，其用于在动物中引发免疫应答或免疫学应答或保护性免疫应答或保护性免疫学应答，其中所述动物是猪动物。

66.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前两个方案中任何一个的用途，其中所述用途是用于在动物中引发针对胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的免疫应答或免疫学应答或保护性免疫应答或保护性免疫学应答。

67.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前三个方案中任何一个的用途，其中所述疫苗是经口施用的。

68.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前四个方案中任何一个的用途，其中所述疫苗是经由饮用水或经口灌服经口施用的。

69.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前五个方案中任何一个的用途，其中所述疫苗是肌内施用的。

70.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前六个方案中任何一个的用途，其中疫苗作为一个剂量进行施用。

71.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前七个方案中任何一个的用途，其中所述疫苗作为一个剂量进行施用，并且其中所述一个剂量在动物中引发针对胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的免疫应答或免疫学应答或保护性免疫应答或保护性免疫学应答。

72.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前八个方案中任何一个使用的，其中所述疫苗作为至少一个剂量进行施用。

73.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前九个方案中任何一个使用的，其中所述疫苗作为至少一个剂量进行施用，并且其中所述一个剂量在动物中引发针对胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的免疫应答或免疫学应答或保护性免疫应答或保护性免疫学应答。

74.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前十个方案中任何一个使用的，其中所述疫苗以一个剂量施用于猪动物。

75.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前十一个方案中任何一个使用的，其中所述疫苗以仅一个剂量施用于猪动物。

76.前述方案中任何一个的疫苗，用于根据先前十二个方案中任何一个使用的，其中所述疫苗以至少一个剂量施用于猪动物。

77.一种用于在动物中引发针对胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的免疫应答或免疫学应答或者保护性免疫或免疫学应答的方法，其包括将前述方案中任何一个的疫苗施用于动物。

78.一种针对动物中由至少一种病原体引起的临床疾病对所述动物进行免疫的方法，所述方法包括将前述方案中任何一个的疫苗施用于动物的步骤，其中所述免疫原性组合物并未引起感染的临床体征，而是能够诱导针对所述至少一种病原体的致病形式对动物进行免疫的免疫应答。

79.前述方案中任何一个的疫苗用于制备用于诱导针对胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的免疫学或免疫应答或者保护性免疫或免疫学应答的组合物的用途，或者用于诱导针对胞内劳森氏菌、PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的免疫学或免疫应答或者保护性免疫或免疫学应答的方法中的用途。

***

因此已详细描述了本发明的优选实施方案，应理解，由上文段落定义的本发明并不限于上文描述中阐述的特定细节，因为其许多显而易见的变化是可能的，而不脱离本发明的精神或范围。

本发明将在下述实施例中进行进一步说明，所述实施例仅给出用于说明目的而不预期以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：肌内给予并且伴随抗微生物剂研究设计存在的

Ileitis的功效目的：

该实施例的主要目的是评估当肌内注射到用强毒胞内劳森氏菌(PPE的致病因子)的肠匀浆攻击的猪内时，与

疫苗组合的/>

Ileitis的功效。次要目的是评估当施用于给予伴随抗微生物治疗的猪时，这种疫苗组合的功效。

理由：

PPE可以使用商业活疫苗(

Ileitis)进行控制，所述疫苗通过灌服或在饮用水中经口给予。要求在疫苗接种前三天、在疫苗接种当天和在疫苗接种后三天，用

Ileitis接种疫苗的动物并未接受有效针对劳森氏菌属的任何抗生素治疗。虽然存在减少抗生素使用的趋势，但这仍是许多农场需要克服的重大障碍。使用不同的应用途径可能允许在抗生素治疗的存在下的疫苗功效，其将促成疫苗使用。同时，该行业希望减少由猪接受的注射次数，当与/>

疫苗组合注射时/>

Ileitis功效的更好理解将提供开发针对劳森氏菌属、PCV2、猪肺炎支原体和PRRSV的组合疫苗的可行性的了解。在这项研究中，猪通过肌内途径的疫苗接种对于与/>

组合的/>

Ileitis进行调查，随后为在三周后用含有强毒胞内劳森氏菌的肠匀浆的攻击。

整体设计的描述：

从已知没有回肠炎临床史的来源获得一百一十二头断奶的21日(+/-2日)龄的猪。另外，该试验中使用的猪对于胞内劳森氏菌将是粪便qPCR阴性以及血清抗体阴性的。猪被随机分配到四组，三组具有24只动物/组，一组具有16只；按重量、窝和性别分区组(blocking)。治疗组是：阳性攻击对照(PC)；与

FLEX疫苗一起IM给予的/>

Ileitis(EIIM)，以及具有伴随的抗微生物剂施用，与/>

FLEX疫苗一起IM给予的/>

Ileitis(EIIMATB)。16头猪的阴性对照组未受攻击，但与PC组进行比较，以评估单独的劳森氏菌属攻击。该阴性对照组在研究终止时连同其它治疗组一起实施安乐死。治疗组EIIMATB是接受抗微生物剂的唯一组，并且给予35g/吨的/>

(泰妙菌素)和400g/吨的CTC(金霉素)的标签剂量，总共两周的时期。抗微生物治疗在五天的适应期后开始(D-7)，以允许猪从由于断奶的饲料摄取损失中恢复。在饲料中的/>

CTC一周后，EIIMATB组用2ml剂量的与3FLEX疫苗组合的/>

Ileitis进行IM疫苗接种。冻干形式的/>

Ileitis疫苗使用3FLEX疫苗进行再水合，其方式导致在每个2ml剂量的3FLEX中的一个2ml剂量的/>

Ileitis。这意味着2ml剂量的所得到的实验性"4FLEX"疫苗含有适当量的所有四种抗原。所有治疗组同时(DO)进行疫苗接种。在疫苗接种后剩下的疫苗的保留样品将贮存于-80℃下。在疫苗接种之后，观察动物的注射部位损伤和任何其它不良反应。记录观察。阳性和阴性攻击对照组仅用3FLEX进行疫苗接种，并且未给予任何劳森氏菌属抗原。在允许免疫发展的28天(4周)时期后，所有动物都用含有胞内劳森氏菌、含有10^8-9个微生物的靶/猪的粘膜匀浆进行经口攻击。这种粘膜匀浆将通过下一代测序进行测序，以调查其完整内容物，并且用于定量PCR以定量胞内劳森氏菌。肠匀浆材料应该不含其它病原体，包括沙门氏菌属(Salmonella)、PRRSV和短螺旋体属物种。在攻击时，对所有猪进行称重，以允许测量在攻击前和攻击后的重量增加。在攻击之后，每天评估所有动物的粪便改变、身体状况和行为改变的临床体征，直至研究终止。

研究在攻击后21天时终止，此时所有动物都被实施安乐死并再次称重。在尸检时，在肠道的所有部分中测量且评估肉眼损伤，回肠末端样品以及任何另外受影响的组织将收集到福尔马林中，以测量微观损伤。

通过免疫组织化学(IHC)以及苏木精和伊红(H&E)染色评估微观损伤，以测量增生性病变。在接种疫苗时、攻击时以及其后每周一次直到尸检，从所有动物中收集血液和粪便样品，分别用于胞内劳森氏菌血清学和qPCR。粪便样品通过在动物之间更换手套的数字插入或粪便环进行收集。如果粪便样品通过粪便环进行收集，则这些不得重复使用，并且必须对于每只动物使用不同的粪便环。所有血液和粪便样品都应该进行等分，并且仅一个等分试样提交用于劳森氏菌属的血清学和粪便PCR。具有样品的所有管都标有收集日期、研究日和猪ID号。

实验单位：每头个别的猪。

关于重复次数的理由：

功效计算：假定攻击对照组中至少75％的发生率，对于使用a＝0.05的双侧检验，21只动物/治疗组预计提供大约80％的功效来检测治疗和对照之间40个百分点的差异。使用24只动物的总数/治疗组，以允许潜在的错检(fallout)以及接受略高于80％的功效水平。

用于随机化的方法：

动物按照重量、性别和窝进行分区组；随机数生成器用于分配猪/治疗。

设盲的水平和描述：

治疗对于损伤、粪便脱落和血清学的评估进行设盲。还对于统计分析进行设盲。

诊断细节和要求：

在疫苗接种和攻击的时间点之后，所有研究动物具有每周收集一次的血液和粪便样品。这等于大约560个血液和粪便样品(112只动物x5个取样)。提交所有样品用于诊断。每个样品的至少一个等分试样贮存于-80℃下，直到研究终止。

生产阶段：生产的保育阶段。

动物性别：阉猪和小母猪在治疗组之间尽可能相等地分配。

纳入/排除和纳入后去除标准：

在研究开始时的纳入标准：在D(-7)时健康状况正常的商业化生产的猪群。在研究开始时的排除标准：在D(-7)时临床上生病或生长受阻(unthrifty)的猪。

在研究期间的排除去除标准：

如果出现福利或疾病关注，则主要研究者和现场兽医和/或指定人员将评估并确定最佳行动方案，其可能包括安乐死。

实施例2：肌内给予并且伴随抗微生物剂最终研究报告存在的

Ileitis的功效

本研究评估了

Ileitis的肌内施用途径以及与/>

3FLEX疫苗组合时在保护免于胞内劳森氏菌(猪增生性肠病(PPE)的致病因子)方面的功效。还评估了抗微生物剂对疫苗功效的潜在干扰。

PPE在本研究中成功地再现，如通过特征性肉眼损伤、微观损伤、胞内劳森氏菌的粪便脱落、胞内劳森氏菌的血清转换、临床体征以及对生产表现的影响所测量的。

Ileitis与/>

的肌内组合“4FLEX”导致肉眼损伤严重程度、微观损伤严重程度、临床腹泻评分和胞内劳森氏菌的粪便脱落的有意义和显著的减少。与未接种疫苗的对照相比，在该治疗组中还观察到平均日增重的增加。这些结果指示了，/>

Ileitis与/>

疫苗的肌内途径和混合是用于预防PPE的合适且有效的选项。还观察到这种疫苗组合是安全的，并且没有观察到不良事件或注射部位反应。

当在疫苗接种期间施用抗微生物剂时，注意到本研究中评估的一些参数的变化。虽然相对于未接种疫苗的受攻击的对照，在接受抗微生物剂(EIIMATB)的组中观察到肉眼损伤和微观损伤的减少，但这些水平并未达到统计显著性，并且与不含抗微生物剂的相同治疗(EIIM)相比是数目上增加的。然而，在接受抗微生物剂的同时接种疫苗的组(EIIMATB)是在攻击之后具有最大重量增加的疫苗接种组，所述重量增加与未接种疫苗的对照相比是显著增加的。还观察到临床腹泻评分改变的发生率的显著减少。这些结果指示了，抗微生物剂可能潜在地干扰疫苗功效，但在测试的抗微生物剂的存在下接种疫苗时，仍赋予相当的保护水平。

该研究的主要目的是评估与

疫苗组合的/>

Ileitis的肌内施用途径在保护猪免于胞内劳森氏菌(猪增生性肠病(PPE)的致病因子)方面的功效。

次要目的是评估当施用于接受伴随的抗微生物治疗的猪时，这种疫苗组合的功效。

疫苗功效通过总体和微观肠损伤的减少进行确定。还评估了其它目的变量，包括生长表现、临床体征和粪便脱落。

PPE可以使用商业活疫苗(

疫苗组合注射时/>

组合的/>

Ileitis进行调查，随后为在四周后用含有强毒胞内劳森氏菌的肠匀浆的攻击。

设计考虑因素：

从已知没有回肠炎临床史的来源获得21日(+/-2日)龄的猪。猪被随机分配到四组，三组具有24只动物/组，一组具有16只。治疗组是：阳性攻击对照(PC)；与

FLEX疫苗一起IM给予的/>

Ileitis(EIIM)，以及具有伴随的抗微生物剂施用，与/>

FLEX疫苗一起IM给予的/>

Ileitis(EIIMATB)。16头猪的阴性对照(NC)组未受攻击，并且发挥评估PC组中的攻击严重程度的目的。治疗组EIIMATB是接受抗微生物剂的唯一组，并且给予35g/吨的/>

(泰妙菌素)和400g/吨的CTC(金霉素)的标签剂量，总共两周的时期。抗微生物治疗在13天的适应期后开始(D-7)，以允许猪从由于断奶的饲料摄取损失中恢复。在饲料中的/>

CTC一周后，EIIMATB组用2ml剂量的与/>

FLEX疫苗组合的/>

Ileitis进行IM疫苗接种。所有治疗组同时(D0)进行疫苗接种。在允许免疫发展的28天(4周)时期后，所有动物都用含有胞内劳森氏菌的粘膜匀浆进行经口攻击。研究在攻击后21天时终止，此时所有动物都被实施安乐死，对损伤进行评分并收集样品。进一步的设计细节在下表中。

研究设计

事件时间表

按组的治疗：

治疗组是：阳性攻击对照(PC)；与

3FLEX疫苗一起IM给予的/>

Ileitis(EIIM)，以及具有伴随的抗微生物剂施用，与/>

3FLEX疫苗一起IM给予的

Ileitis(EIIMATB)。16头猪的阴性对照(NC)组未受攻击，并且发挥评估PC组中的攻击严重程度的目的。治疗组EIIMATB是接受抗微生物剂的唯一组，并且给予35g/吨的

(泰妙菌素)和400g/吨的CTC(金霉素)的标签剂量，总共两周的时期。在饲料中的Denagard CTC一周后，EIIMATB组用2ml剂量的与/>

3FLEX疫苗组合的/>

Ileitis进行IM疫苗接种。冻干形式的/>

Ileitis疫苗使用/>

3FLEX疫苗进行再水合，其方式导致在每个2ml剂量的/>

3FLEX中的一个2ml剂量的/>

Ileitis。这意味着2ml剂量的所得到的实验性"4FLEX"疫苗含有适当量的所有四种抗原。

治疗给药：

疫苗经由下表中指示的途径在D0时施用于第1-5组。使用适当大小的无菌针和注射器，在颈部的右侧、在耳根和肩点之间的中间位置进行IM注射的施用。

治疗

攻击

动物纳入/排除标准：

在研究开始之前，对每只动物的健康进行评价，并且完成了动物健康检查表。该试验中仅包括了对于劳森氏菌属呈qPCR和血清学阴性、具有正常健康状况的动物。如果在研究期间出现福利或疾病关注，则主要研究者和现场兽医和/或指定人员确定包括安乐死的最佳行动方案，记录这些事件。

实验单位：猪为实验单位。

随机化：

通过由GBI使用SAS统计软件提供的统计服务，进行猪对于围栏和治疗的随机化。在研究起始之前，向GBI统计员提供可用的猪、窝信息、性别、年龄、重量和畜舍设施设置。动物按照重量、性别和窝进行分区组，随机数生成器用于分配猪/治疗。

设盲标准：

在研究自始至终，涉及对损伤进行评分和进行实验室测定的人员对猪到组的分配进行设盲。涉及收集用于研究的数据的所有研究现场人员都完成了在签名记录上的输入用于存档目的。

兽医护理和伴随治疗：

在到达研究场所之后，未经监督员或指定人员的事先同意，不得施用任何药物。这些动物在到达设施后一直处于兽医监督下，直到研究结束。显示出与攻击施用无关的损害或疾病的任何动物都已给予适当的兽医护理。由研究者提供的文档将包括观察到的临床体征的描述、任何诊断检查的结果以及任何施用治疗的结果。所有治疗已在生物制品和药物治疗记录上进行记录，这些包括给予EIIMATB组的抗微生物剂。已对实施安乐死或死亡的动物进行尸检，并根据需要收集样品以确定诊断，如果发生这种情况，则将完成兽医报告记录。任何意外疾病或垂死的动物已由现场研究者、现场兽医与监督员和PI一起适当地进行处理，以确定通过治疗或安乐死减轻疼痛/痛苦的最佳计划。

一般观察：

从到达开始且持续直到D28，每天观察所有猪的一般健康，并且观察结果在一般健康观察记录上进行记录。

注射反应：

在疫苗接种后4-8小时，通过观察注射部位以及任何不良事件来监测猪在注射部位处的反应性。在疫苗接种后的第1、2和3天时，对猪进行重新评估。具有在注射部位处注意到的异常的任何动物已每天进行监测，直到损伤消退。确定待注意的异常，并且按照大小(cm)、发红、肿胀、发热和疼痛进行描述。注射部位观察在注射部位观察记录上进行记录。

临床观察：

从D28直到D49，每天观察所有猪的与胞内劳森氏菌攻击相关的临床体征。使用下表中显示的观察评价，发现在临床观察记录上进行记录。

临床观察评价

体重：

如事件时间表中指示的，对每头猪进行称重(磅)，并且结果在体重记录上进行记录。计算关于所有测试动物的平均日增重用于组比较。

尸检：

在D49时，根据现场程序对所有剩余的猪实施安乐死。遵循下表中发现的评分方案，检查回肠、空肠、盲肠和结肠的总体损伤，其中评分在脱离测试的尸检记录上进行记录。

肉眼损伤评分量表

评分	描述
		0	正常
1	轻度增厚
		2	中度增厚/炎症
3	重度增厚/炎症
		4	重度增厚/炎症/带血内容物/凝块
5	坏死

微观损伤评分量表

评分	关于劳森氏菌属的IHC	组织学(苏木精和伊红染剂)
			0	生物无病灶	无损伤发展
1	生物的一个病灶	轻度损伤发展的少数区域
			2	生物的多重病灶	中度损伤发展的中度多病灶区域
3	生物的弥散病灶	重度损伤发展的弥散区域

血液样品收集：

血液收集在样品收集记录上进行记录。根据事件时间表将静脉全血收集到血清分离管(SST)中。使用无菌18-20g x 1-1.5”

针、/>

持针器和9或13mlSST管，经由前腔静脉，通过研究者或指定人员，从每只猪中收集静脉全血。每个样品都标有动物的ID号、研究编号、收集日期、研究日和样品类型。在以大约2000xg离心5-10分钟之前，允许SST在室温下凝固。一旦离心完成，就制备血清等分试样用于测试以及在-80C下的长期贮存。将贮存于-80C下的血清等分试样置于干冰上，以标准化所有样品的处理，所述样品送至诊断实验室(ISU-VDL)用于劳森氏菌属ELISA测试。

粪便样品收集：

粪便样品根据事件时间表通过数字插入直肠内进行收集，以在ISU-VDL处通过qPCR测试劳森氏菌属脱落。粪便收集在样品收集记录上进行记录。将粪便样品收集到标有研究编号、收集日期、研究日和猪ID号的管内。将所有样品等分到两个管内并贮存于-80℃下。一个等分试样在具有干冰的隔热容器中运送，以使样品在运送过程中维持冷冻，并确保所有样品在ISU-VDL处同等地处理。

收集的样品在样品收集记录上进行记录。通过苏木精和伊红染剂(H&E)以及劳森氏菌属免疫组织化学(IHC)来进行微观损伤评估。测试程序和结果包括在此最终报告中；使用组织学和免疫组织化学记录来记录原始数据。将回肠样品收集并进行福尔马林固定用于微观组织学检查，其中使用组织学和免疫组织化学记录通过先前建立的方法完成评分。

统计分析：

统计检验遵循具有相似数据的同行评审出版物中使用的那些检验，并且允许成对比较。用卡方检验评价定性数据。当p<0.05时确定显著性，并且当0.05≤p<0.10时确定趋势。

一般观察/不良事件：

在研究期间发生了三个不良事件。没有涉及疫苗接种的不良事件，并且一个事件与胞内劳森氏菌攻击有关。这些事件在下表中进行描述。

一般观察/不良事件

不良事件	受影响的猪/组	受影响的研究日
			跛足/实施安乐死	PC	D11
直肠脱垂/实施安乐死	EIIMATB	D36
			严重回肠炎/发现死亡	PC	D45

注射反应：

接种疫苗的动物无一在它们在接种疫苗之后进行评估的3天内发展任何发红、肿胀、发热或疼痛。在接受单独的或与

Ileitis组合且注射时的/>

3FLEX疫苗IM的组中，并未注意到注射部位反应中的差异。

临床观察：

临床腹泻评分在攻击时在所有动物中为零或正常，并且在感染后6天(dpi)时开始在不同组中改变。与NC组相比，腹泻评分改变的发生率在PC组中明显(p<0.0001)更大(参见下表)，指示了胞内劳森氏菌攻击导致特征性临床体征。与未接种疫苗的PC组相比，接受

Ileitis的所有组具有关于临床腹泻评分改变的发生率的显著减少(参见下表)。行为在攻击之后并未太大改变，在PC组中的501次评估中仅注意到行为改变的一次事件。发现身体状况评分由于攻击而改变。与阴性对照组相比，所有治疗组具有明显更高的身体状况改变的发生率(参见下表)。EIIM治疗组是具有身体状况改变的最低发生率的一组，与未接种疫苗的PC组相比，具有朝向身体状况降低的趋势(p＝0.054)。

在治疗组中的临床评分的评估。

	腹泻评分	行为评分	身体状况评分
				EIIM	172/528^c	0/528	6/528^b
EIIMATB	172/514^c	0/514	10/514^bc
				NC	5/352^b	0/352	0/352^a
PC	229/501^a	1/501	14/501^bc

总体损伤评分：

回肠(胞内劳森氏菌定殖的优先部位)的总体损伤评分在PC组中最高，具有1.55的平均评分(图1)。该评分显著高于未攻击的对照组(NC)，验证了该攻击模型(图1，p<0.05)。在疫苗接种的组中，EIIM组具有最低的损伤评分，具有0.67的平均评分，其显著(p<0.05)低于未接种疫苗的PC组(图1)。EIIMATB组发展了相似的损伤水平，其严重程度低于PC组，但并未达到统计显著性。还测量了总体损伤的长度，并且遵循与损伤评分相似的模式。EIIM组具有的平均回肠损伤长度为PC组的约一半(p＝0.097)(图2)。通过将损伤评分乘以损伤长度来分配严重程度评分。平均损伤严重程度评分可以在图3中找到。严重程度评分遵循与损伤评分和长度相似的趋势。EIIM组具有15.63的平均严重程度评分，而PC组具有40.68的平均评分(p＝0.053；图3)。接种疫苗的组还导致肠道的其它部分中的损伤减少。这并未进行进一步调查，因为在PC和NC组之间的损伤中不存在显著差异，其很可能由具有在回肠外的损伤的较少动物数目引起。

体重：

在攻击前研究时期，平均日增重(ADG)在治疗组中是非常相似的，并且各组之间并未发现显著差异。在攻击后时期，与并未接受攻击的NC组相比，接受攻击的所有组具有ADG的显著减少(图4)。EIIMATB组是在攻击后时期表现最佳的疫苗接种组，具有1.71磅/天的ADG，其显著高于平均ADG为1.43的未接种疫苗的受攻击的PC组(p<0.05)。EIIM组是具有第二高的攻击后ADG(其为1.65)的疫苗接种组，所述ADG也显著高于PC组(p<0.05)；(图4)。

劳森氏菌属血清ELISA：

如在ISU-VDL处通过ELISA测量的，具有针对劳森氏菌属的血清抗体的动物数目显示于图5中。在研究第0天(在攻击之前的28天，-28dpi)接种疫苗时，所有动物都是血清反应阴性的。仅两只动物在攻击时(研究第28天)是血清反应阳性的，一只动物在EIIM组中，而另一只动物在EIIMATB组中。这指示了与

3FLEX疫苗组合的/>

Ileitis的IM疫苗接种并不导致非常多的血清转换。如预计的，大多数动物在21dpi时进行血清转换并呈阳性，也确认了遵循该攻击模型预期的劳森氏菌属攻击的有效性。PC组在21dpi时具有含有抗劳森氏菌属抗体的最高数目的动物，其中95％的猪呈阳性。在14dpi时，EIIM和PC组分别有67％和65％的血清反应阳性猪。

劳森氏菌属粪便qPCR：

在研究第0天(在攻击之前的28天，-28dpi)接种疫苗时，所有动物对于劳森氏菌属都是粪便qPCR阴性的。在攻击时，EIIMATB组中的两只动物在其粪便中具有通过qPCR的可检测水平的劳森氏菌属。PC组中的动物之一在攻击时具有34.1或252/生物/克粪便的Ct值。劳森氏菌属的脱落在14dpi时达到峰值，此时PC组脱落了6.88log₁₀个微生物/克粪便的平均值。在这个时间点，与PC组相比，EIIM组导致粪便脱落的显著(p<0.05)减少，分别具有5.96log₁₀个微生物/克粪便的脱落水平。在21dpi时，EIIM组是受攻击动物中脱落最少劳森氏菌属的组，具有3.20log₁₀个微生物/克粪便的平均值。这显著低于未接种疫苗的PC组，其脱落了4.64log₁₀个微生物/克粪便的平均值(图6)。与PC相比，EIIMATB组也降低了脱落，尽管程度较低，分别具有4.05log₁₀个微生物/克粪便的平均值(图6)。

微观损伤和劳森氏菌属IHC：

通过在尸检时收集的回肠末端组织的苏木精和伊红(H&E)染色来测量微观损伤。发展最严重损伤的组是平均损伤评分为2.05的PC组，NC组中的动物并未发展损伤，再次验证了该感染模型(图7)。发生最不严重损伤的疫苗接种组是EIIM组，具有1.29的平均评分，明显低于PC组(图7，p<0.05)。与EIIM组相比，EIIMATB组具有相似但更高的平均损伤评分，具有1.57的平均损伤评分。

在尸检时进行收集并在福尔马林中固定的回肠末端组织也被提交用于胞内劳森氏菌抗原的免疫组织化学(IHC)染色。与HE染色相似，具有最高评分的组是PC组，具有2.23的平均评分，与NC组相比显著(p<0.05)增加，再次验证了本研究中疾病的感染和再现(图8)。与HE评分相似，再次EIIM组是具有最低严重程度评分的疫苗接种组，具有1.63的评分，与PC组相比显著降低(p<0.05)。

讨论：

本研究调查了当在通过肌内途径施用的一个2ml剂量中与

疫苗组合时，

Ileitis的冻干制剂的功效。另外，还评估了在疫苗接种期间在饲料中提供时的泰妙菌素和金霉素的干扰。

由胞内劳森氏菌引起的猪增生性肠病(PPE)在本研究中成功地再现，如通过特征性肉眼损伤、微观损伤、胞内劳森氏菌的粪便脱落、胞内劳森氏菌的血清转换、临床体征以及对生产表现的影响所测量的。

Ileitis与/>

的肌内组合“4FLEX”导致肉眼损伤严重程度、微观损伤严重程度、临床腹泻评分和胞内劳森氏菌的粪便脱落的有意义和显著的减少。与未接种疫苗的对照(PC)相比，在该治疗组(EIIM)中还观察到平均日增重的不显著但数目上的增加。这些结果指示了，/>

Ileitis与/>

当在疫苗接种期间施用抗微生物剂时，注意到本研究中评估的参数的变化。虽然相对于未接种疫苗的受攻击的对照，在EIIMATB组中观察到肉眼损伤和微观损伤的减少，但这些水平并未达到统计显著性，并且与不含抗微生物剂的相同治疗(EIIM)相比是数目上增加的。然而，EIIMATB组是在攻击之后具有最大数目的重量增加的疫苗接种组(图4)，并且具有腹泻临床评分改变的发生率中的显著减少(在治疗组中的临床评分评估表)。这些结果指示了，抗微生物剂可能干扰疫苗功效，但在有效针对劳森氏菌属的测试抗微生物剂的存在下接种疫苗时，仍赋予一定的保护水平。

Nogueira M.G.等人(Immunological responses to vaccination followingexperimental Lawsonia intracellularis virulent challenge in pigs.VetMicrobiol.2013)，还发现了当与未接种疫苗且受攻击的动物相比时，

Ileitis的肌内施用导致微观损伤和胞内劳森氏菌的粪便脱落的减少。在该研究中，/>

Ileitis中存在的活的胞内劳森氏菌抗原是单独施用的，不含任何佐剂。由于/>

佐剂的包括，/>

Ileitis与/>

的混合可以帮助改善对疫苗的免疫应答。

本研究提供了与Ingelvac

组合的/>

Ileitis的肌内施用提供了针对胞内劳森氏菌的显著保护的强有力证据。

在疫苗接种期间施用的抗微生物剂的潜在干扰尚不明确，并且需要进一步调查。然而，伴随抗微生物剂施用的肌内疫苗接种的确提供了在疾病的几个相关参数方面的有意义的保护水平。

实施例3：肌内给予并且伴随饲料级抗微生物剂存在的

Ileitis的调查

引言：

Ileitis疫苗是待经由饮用水或经由经口灌服施用的高度有效的、成功的产品，其批准用于健康的断奶后的猪中，用于预防由于胞内劳森氏菌的猪增生性肠病。不存在关于当与/>

组合时以及当与伴随抗微生物疗法结合施用时，经由肌内注射施用的本产品的功效的数据。

本实施例的目的是1.评估当与

疫苗接种组合时并且经由肌内注射施用时，/>

Ileitis疫苗的功效，以及2.评估当施用于接受伴随的饲料中抗微生物治疗的猪时，该疫苗组合的功效。

图9说明了疫苗共混。

图10提供了研究大纲。

主要测量的参数包括肉眼损伤评分、微观损伤评分和粪便脱落。次要测量的参数包括平均日增重、临床评分和血清转换。

材料和方法：

猪在断奶后的17-21日龄时获得，并且随机分成各自具有24只动物的3个治疗组。治疗组是：未接种疫苗的阳性攻击对照(PC)；与

FLEX疫苗一起IM给予的/>

Ileitis(EIIM)，具有伴随的抗微生物剂施用，与/>

FLEX疫苗一起IM给予的/>

Ileitis(EIIMATB)。通过用/>

疫苗重构冻干形式的/>

Ileitis来完成疫苗制备。这导致含有改良活的胞内劳森氏菌抗原连同PCV2、猪肺炎支原体和PRRSV MLV疫苗级分的最终2ml剂量。为了调查饲料中的抗微生物治疗是否抑制用活改良的/>

Ileitis疫苗的疫苗接种的功效，EIIMATB组在疫苗接种前一周开始接受饲料中的泰妙菌素(35ppm)和金霉素(400ppm)，并且继续直到疫苗接种后一周。在疫苗接种后28天，所有动物用含有强毒胞内劳森氏菌的肠匀浆进行攻击，并且在21天后进行尸检。在尸检时评估临床体征、平均日增重(ADG)、粪便脱落以及肉眼损伤和微观损伤。

结果：

两个接种疫苗的治疗组均导致腹泻临床评分的显著减少(P<0.05)。两个疫苗接种组也均导致在攻击之后的ADG增加。攻击对照组具有1.43磅的攻击后ADG，而EIIM和EIIATB组分别具有1.65和1.71磅的ADG(P<0.05)。与平均评分为1.55的未接种疫苗的组相比，肉眼损伤评分在两个疫苗接种组中均降低，具有0.67和1.04的值。类似地，微观损伤也因接种疫苗而降低，与EIIM和EIIMATB组中分别为1.29和1.57的平均值相比，在PC组具有2.05的平均评分。并未注意到不良反应，因为发现IM疫苗组合是安全的。

结论：

与未接种疫苗的组相比，两个可注射疫苗组在劳森氏菌属攻击之后改善了ADG，导致肉眼损伤和微观损伤评分的减少，减少了劳森氏菌属的粪便脱落且减轻了临床体征。对于

Ileitis和/>

肌内疫苗的组合，并未观察到抗微生物干扰的证据。这项研究对于养猪生产者展示了值得进一步调查的新工具。

实施例4：与肌内施用的劳森氏菌属ALC疫苗组合的猪圆环病毒2a型(PCV2a)ORF2VLP疫苗的功效

该研究的目的是证实针对4周后的猪圆环病毒2a型攻击，在三周龄的猪中，与肌内施用的劳森氏菌属ALC(无毒力的活培养物)疫苗(

Ileitis，冻干的)组合的，猪圆环病毒2a型(PCV2a)ORF2 VLP疫苗(Ingelvac/>

)的功效。

猪在本研究中入选后进行随机化。在疫苗接种阶段过程中，猪与同窝幼畜一起关入栏中。参考下表，在第0天时，猪在接种疫苗时为21±3日龄。PCV2a ORF2 VLP疫苗(Ingelvac

)与胞内劳森氏菌ALC(无毒力的活培养物；/>

Ileitis，冻干的)组合，所述Enterisol Ileitis冻干物用Ingelvac CircoFLEX进行重构(第1组)。第2组(劳森氏菌属无毒力的活培养物，单价)包含无毒力的劳森氏菌属以及盐水和佐剂卡波普，因为卡波普和盐水存在于Ingelvac/>

中，并且因此，卡波普和盐水也存在于第1组和第3组中。第3组(PCV2 VLP，单价)包含PCV2a ORF2 VLP。NTX组由六头猪组成，以充当非治疗对照。

观察猪对接种的任何不良反应，包括注射部位反应和过敏反应。

劳森氏菌属ALC(无毒力的活培养物；

Ileitis，冻干的)和PCV2aORF2VLP(Ingelvac/>

)是注册且众所周知的兽用疫苗。然而，WO2006/072065和WO2008/076915描述了PCV疫苗的生成、其制剂及其施用。WO 96/39629和WO 05/011731描述了胞内劳森氏菌的培养、减毒的胞内劳森氏菌及其施用。

在攻击之前(D27)，将猪混合。NTX组在D20时进行尸检，以确认猪在疫苗接种阶段过程中并未暴露于野生型PCV2。在第28天时，借助于肌内注射和鼻内施用，用强毒的PCV2a(4.77log₁₀TCID₅₀/2mL剂量)攻击猪。对于研究的其余部分，基于粪便稠度、身体状况和行为的观察结果，从第27天开始分配临床评分。

尸检

在攻击后的二十二天，对第1-3组中的动物实施安乐死并进行尸检。对淋巴结和回肠进行评价，评分且收集用于组织病理学和免疫组织化学。

实验设计

在尸检过程期间完成所有器官和注射部位区域关于异常的一般检查。收集扁桃体、气管支气管淋巴结(TBLN)、肠系膜淋巴结(MLN)、髂外淋巴结(ILN)和回肠的样品，并且在10％中性缓冲福尔马林中固定。样品按照标准程序进行加工，并且通过苏木精和伊红染色(H&E)就组织病理学进行评估，并且通过免疫组织化学(IHC)就PCV2抗原进行评估。组织的评分遵循下文的评分系统来进行。

组织评分

淋巴样耗竭

如果四种淋巴样组织样品(扁桃体、TBLN、MLN、ILN)或回肠中的一种或多种对于淋巴样耗竭是组织学阳性的(评分>0)，则猪被视为阳性的。

淋巴样定殖

如果四种淋巴样组织样品(扁桃体、TBLN、MLN、ILN)或回肠中的一种或多种通过IHC对于PCV2淋巴样定殖是阳性的(评分>0)，则猪被视为阳性的。

组织结果(组织病理学和免疫组织化学)

下表中呈现的结果代表如组织评分表中描述的，具有阳性评分的任何组织(评分1、2、3)。百分比反映了组中的猪总数中具有阳性评分的猪数目。

第2组中的结果显示了攻击是成功的，因为仅用无毒力的活劳森氏菌属疫苗接种疫苗的动物显示了PCV2感染的高发生率。进一步地，结果显示了PCV2疫苗与无毒力的活劳森氏菌属疫苗组合是有效的，因为第1组并未显示PCV2感染的任何临床体征。第1组(活劳森氏菌属无毒力的活培养物+PCV2 VLP；二价疫苗)表现与仅用PCV2疫苗接种疫苗的第3组(PCV2 VLP，单价疫苗)一样。因此，当将PCV2疫苗与无毒力的活劳森氏菌属疫苗组合时，并未观察到干扰。

Claims

1.一种疫苗，其包含胞内劳森氏菌的抗原，以及选自猪圆环病毒(PCV)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)和猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的至少一种进一步病原体的一种或多种抗原，其中所述胞内劳森氏菌的抗原是活的胞内劳森氏菌。

2.权利要求1的疫苗，其中所述进一步的病原体是PCV。

3.权利要求1的疫苗，其中所述进一步的病原体是猪肺炎支原体。

4.权利要求1的疫苗，其中所述进一步的病原体是PRRSV。

5.权利要求1的疫苗，其中所述进一步的病原体是PCV和猪肺炎支原体。

6.权利要求1的疫苗，其中所述进一步的病原体是PCV和PRRSV。

7.权利要求1的疫苗，其中所述进一步的病原体是PRRSV和猪肺炎支原体。

8.权利要求1的疫苗，其中所述进一步的病原体是PCV、猪肺炎支原体和PRRS。

9.权利要求1、2、5、6和8中任一项的疫苗，其中所述PCV的抗原是重组多肽。

10.权利要求9的疫苗，其中所述重组多肽由PCV ORF基因表达。

11.权利要求10的疫苗，其中所述PCV ORF基因是PCV ORF2基因。

12.权利要求9至11中任一项的疫苗，其中所述抗原在杆状病毒细胞中表达。

13.权利要求1、2、5和6中任一项的疫苗，其中所述PCV的抗原是在Ingelvac

中包括的抗原。

14.权利要求1、2、5、6和8至13中任一项的疫苗，其中所述疫苗具有约2μg至约400μg的PCV抗原的剂量，或约2μg至约400μg的PCV2 ORF2蛋白的剂量。

15.权利要求1、3、5和7中任一项的疫苗，其中所述猪肺炎支原体的抗原是上清液和/或菌苗。

16.权利要求1、3、5、7和15中任一项的疫苗，其中所述猪肺炎支原体的抗原是在Ingelvac

中包括的抗原。

17.权利要求1、4、6和7中任一项的疫苗，其中所述PRRSV的抗原是活的PRRSV病毒。

18.权利要求17的疫苗，其中所述活的PRRSV病毒是改良活病毒。

19.权利要求17的疫苗，其中所述活的PRRSV病毒是减毒病毒。

20.权利要求17至19中任一项的疫苗，其中所述疫苗具有每剂量约10¹至约10⁷个病毒颗粒或每剂量约10⁴至约10⁷个颗粒的PRRSV抗原的剂量。

21.权利要求1、4、6、7和17至20中任一项的疫苗，其中所述PRRSV的抗原是冻干的。

22.权利要求1、4、6、7和17至21中任一项的疫苗，其中所述PRRSV的抗原是在

PRRSV MLV中包括的抗原。

23.权利要求1的疫苗，其中所述PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的抗原是在

中包括的PCV、猪肺炎支原体和PRRSV的抗原。

24.权利要求1至23中任一项的疫苗，其中所述活的胞内劳森氏菌是改良活的胞内劳森氏菌。

25.权利要求1至23中任一项的疫苗，其中所述活的胞内劳森氏菌是减毒的胞内劳森氏菌。

26.权利要求1至25中任一项的疫苗，其中所述疫苗具有约10³至10⁹个细菌/Kg体重，优选约10⁵至10⁷个细菌/Kg体重的胞内劳森氏菌抗原的剂量。

27.权利要求1至26中任一项的疫苗，其中所述疫苗具有约10⁵至约10⁷个胞内劳森氏菌细菌的胞内劳森氏菌抗原的剂量。

28.权利要求1至27中任一项的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌的抗原是冻干的。

29.权利要求1至28中任一项的疫苗，其中所述胞内劳森氏菌的抗原是在

Ileitis中包括的抗原。

30.权利要求1至29中任一项的疫苗，其中所述疫苗进一步包含一种或多种佐剂。

31.权利要求30的疫苗，其中所述一种或多种佐剂包含丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；马来酸酐和烯基衍生物的共聚物；交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；卡波姆；与多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，所述多羟基化化合物具有至少3个且不多于8个羟基，其中至少三个羟基的氢原子任选地被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团替换，其中所述原子团含有2至4个碳原子，如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团，并且不饱和原子团本身可以含有其它取代基，如甲基；