CN103739699A - 重组梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。所述方法包括鹿茸胸腺素β₄基因的克隆、原核表达载体pET-28a-Tβ₄的构建、在宿主菌E.coli BL21中的诱导表达、重组蛋白的分离纯化等步骤。本发明利用基因工程技术首次尝试了对梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的原核表达，成功构建了其原核表达载体，并诱导重组蛋白高效表达，纯化后的重组蛋白含量可达0.916mg/mL。经体外活性研究发现，重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄对成骨细胞M3T3和软骨细胞C5.18有明显的促增殖作用。

Description

重组梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β4及其制备方法和用途。

背景技术

胸腺素（Thymosins）是由胸腺产生的一种淋巴生长因子，1966年Goldstein等首次从小牛胸腺中提取发现，是一类小分子多肽。根据等电点的不同胸腺素可分为α、β、γ三个亚型，其中β族胸腺素其结构高度保守，含有40～44个氨基酸，广泛存在于哺乳动物和其它脊椎动物中。而在大多数哺乳动物中，胸腺素β₄是β族胸腺素的主要存在形式，可占其总含量的70%～80%。近年来，胸腺素β₄的生物学功能倍受人们关注，已有研究表明，胸腺素β₄在促进创伤愈合、组织再生、角膜损伤修复、心肌修复、血管生成、抗细胞凋亡和抗炎等方面起着重要作用。可以说胸腺素β₄具有非常广泛的应用领域。而现阶段，临床应用的胸腺素β₄绝大部分为化学合成产品，不仅原料价格高、工艺复杂、收率较低，而且合成过程中用到很多有毒物质，对环境污染较大。随着现代生物技术的发展，利用基因工程手段生产胸腺素β₄将成为一个新的途径。

梅花鹿鹿茸作为我国传统名贵动物药，具有极高的药用价值，已有2000多年的入药历史。鹿茸与其他哺乳动物的角有着明显的区别，每年都可以循环再生，且具有无可比拟的生长速度，最快时每天可达2cm。其独特的生长过程令许多生物学家对其痴迷，并将其视为理想的研究组织器官再生的生物模型。目前，尚未见制备梅花鹿鹿茸胸腺素β4的相关报道。

发明内容

本发明提供一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄及其制备方法和用途。

一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，包括如下步骤：

（1）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄基因的克隆：采用改良的Trizol法提取鹿茸总RNA。设计及合成梅花鹿鹿茸胸腺素β₄特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGCCTCTGACAAGCCCGATAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGCGACTCGCCTGCTTGCT—3′，通过RT-PCR方法扩增得到胸腺素β4基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，全长为135bp，与载体pMD18-T连接，获得重组载体pMD18-T-Tβ₄，将其转化至E.coli DH5α感受态细胞中，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定并进行测序验证；

（2）梅花鹿鹿茸胸腺素β4原核表达载体的构建：用Ncol I和Xhol I将测序正确的重组载体pMD18-T-Tβ₄和表达载体pET-28a分别进行双酶切，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞中，双酶切鉴定并进行测序验证；

（3）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的表达和纯化：将构建成功的表达载体pET-28a-Tβ₄转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达，采用镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G-25凝胶层析除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。

所述的IPTG诱导表达，IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，诱导时间为4h。

所述的镍离子亲和层析分离纯化时，结合液为含有500mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.4，洗脱液为含有500mmol/L NaCl、200mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液，pH7.4。

所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄在制备对成骨细胞M3T3或软骨细胞C5.18具有促增殖作用的药物中的应用。

本发明利用基因工程技术首次成功构建了梅花鹿鹿茸胸腺素β₄原核表达载体，并诱导重组蛋白高效表达，纯化后的重组蛋白含量可达0.916mg/mL。经体外活性研究发现，其对成骨细胞M3T3和软骨细胞C5.18有明显的促增殖作用。获取梅花鹿鹿茸胸腺素β₄对鹿茸快速生长机制的研究、鹿茸药材有效成分的研究以及开发高科技含量的鹿茸产品都具有重大意义，且具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为梅花鹿鹿茸胸腺素β₄基因PCR扩增产物电泳图，1.胸腺素β₄基因；M.Maker自上而下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；

图2为原核表达载体pET-28a-Tβ₄双酶切鉴定电泳图，1.表达载体片段和目的基因；M.Maker自上而下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；

图3为不同浓度IPTG诱导表达梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的SDS-PAGE电泳图，1-4.IPTG诱导浓度依次为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L；5.Maker；6-10.IPTG诱导浓度依次为0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L；

图4为重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄纯化后SDS-PAGE电泳图，1.未纯化样品；2.流穿；3.纯化后样品；4.Maker。

具体实施方式

以下实施例所用主要材料表

实施例1：梅花鹿鹿茸胸腺素β₄基因的克隆

1.提取鹿茸总RNA：称取鹿茸样品1.2g，在液氮中快速研磨成均匀细末，按1:10比例加入Trizol试剂，静置30min，继续研磨2min，然后将其转移至EP管中，每管1mL，各加入200μL的5M NaCl，充分震荡，再加入200μL的CHCl₃，剧烈震荡，静置2min，离心，取上层，重复加CHCl₃萃取、离心，直至中间层没有杂质，转移上清至去RNase的EP管中，按1:1比例加入预冷的异丙醇，-20℃沉淀30min，离心，弃去上清，沉淀用1mL的75%乙醇洗涤，再用100%无水乙醇洗涤，挥干乙醇。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰明亮，无降解；

2.特异引物的设计：应用软件Primer5设计胸腺素β₄特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGCCTCTGACAAGCCCGATAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGCGACTCGCCTGCTTGCT—3′；

3.目的基因RT-PCR扩增：按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0说明书操作，扩增目的基因。PCR参数为95℃2min，95℃30s、60℃30s、72℃300s循环30次。用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。经琼脂糖凝胶电泳检测，在135bp处得到单一清晰条带，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，atgtctgaca agcccgatat ggcggagattgagaagttcg ataagtcgaa attgaagaaa acggaaacgc aagagaaaaa cccactgcct tcgaaagaaa cgattgaacaggagaagcaa gcaggcgagt cgtaa，与预测的碱基数相吻合（图1）。

4.目的基因与载体pMD18-T连接及鉴定：将目的基因克隆到载体pMD18-T上，获得重组载体pMD18-T-Tβ₄，并转化至E.coli DH5α感受态细胞中，取适当浓度的菌液均匀涂在37℃预热的LB固体培养基（含有50μg/mL Amp+）上，37℃平板倒置培养12h。筛选阳性单菌落接种于LB培养基（含有50μg/mL Amp+）中，37℃振荡培养12h。按照第三版《分子克隆》小剂量法提取质粒，通过EcoR I和Sal I双酶切鉴定，目的基因与载体pMD18-T连接成功，进一步测序结果正确。

实施例2：梅花鹿鹿茸胸腺素β₄原核表达载体的构建

用Ncol I和Xhol I将测序正确的重组载体pMD18-T-Tβ₄和表达载体pET-28a分别进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离，按照胶回收方法回收目的基因和载体pET-28a，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞中，涂板并于37℃培养，筛选阳性单菌落，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定后，经琼脂糖凝胶电泳检测，表达载体片段和目的基因两条电泳条带清晰可见，且表达载体片段和目的基因的分子量均和理论值相符，初步鉴定原核表达载体pET-28a-Tβ₄构建成功（图2）。进一步测序后，比对测序结果证实序列完全匹配，即原核表达载体构建成功。

实施例3：梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的表达和纯化

1.梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的表达：将构建成功的原核表达载体pET-28a-Tβ₄转化到宿主菌E.coli BL21中，以37℃恒温，200r/min震荡培养12h后，按1:100的比例将菌液接种到新的LB（含有30μg/mL Kan+）培养基里，37℃震荡培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀，在培养3.5h时达到其对数生长期。此时进行IPTG诱导表达，通过比较不同IPTG诱导浓度和不同诱导时间的SDS-PAGE电泳结果，优化出最佳IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，最佳诱导时间为4h（图3）。将表达菌进行破壁处理后分别将上清和沉淀做SDS-PAGE电泳检测，显示重组胸腺素β₄蛋白为可溶性，没有形成包涵体。

2.梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的纯化：由于在构建重组基因表达载体时，在目的基因末端添加了组氨酸标签（His-tag），所以采用镍离子亲和层析进行分离纯化。结合液为含有500mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液（pH7.4），洗脱液为含有500mmol/L NaCl、200mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液（pH7.4）。由于亲和层析的流动相中含有高盐，因此经亲和层析纯化后的重组胸腺素β₄蛋白再用Sephadex G-25凝胶层析进行除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。经SDS-PAGE电泳检测，纯化后的重组胸腺素β4蛋白呈现单一条带（图4），其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，Met Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu IleGlu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro SerLys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser，用Bradford法检测其蛋白含量可达0.916mg/mL。

实施例4：重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的体外活性检测

用含有10%小牛血清的DMEM培养基培养复苏后的成骨细胞M3T3，待细胞生长状态良好，以1.0×10⁴/mL的细胞浓度接种于96孔板中，培养24h。再用含有0.4%小牛血清的DMEM培养基继续培养24h后，加入重组胸腺素β₄蛋白，使其终浓度分别为0μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。继续培养48h后，用MTT法检测细胞的增殖情况。检测重组胸腺素β₄蛋白对软骨细胞C5.18作用的方法同上。分析结果显示，重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄对成骨细胞M3T3和软骨细胞C5.18具有明显的促增殖作用，见表1和表2。

表1  重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄对成骨细胞M3T3的影响

注：*P﹤0.01，**P﹤0.001

表2  重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄对软骨细胞C5.18的影响

注：*P﹤0.01，**P﹤0.001

Claims (6)

1.一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

2.一种重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

3.一种如权利要求1所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄基因的克隆：采用改良的Trizol法提取鹿茸总RNA。设计及合成梅花鹿鹿茸胸腺素β₄特异引物，上游引物为5′—CATGCCATGGCCTCTGACAAGCCCGATAT—3′，下游引物为5′—CCCTCGAGCGACTCGCCTGCTTGCT—3′，通过RT-PCR方法扩增得到胸腺素β₄基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，全长为135bp，与载体pMD18-T连接，获得重组载体pMD18-T-Tβ₄，将其转化至E.coli DH5α感受态细胞中，用EcoR I和Sal I双酶切鉴定并进行测序验证；

（2）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄原核表达载体的构建：用Ncol I和Xhol I将测序正确的重组载体pMD18-T-Tβ₄和表达载体pET-28a分别进行双酶切，连接后转化至E.coli BL21感受态细胞中，双酶切鉴定并进行测序验证；

（3）梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的表达和纯化：将构建成功的表达载体pET-28a-Tβ₄转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达，采用镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G-25凝胶层析除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。

4.如权利要求3所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，其特征在于：所述的IPTG诱导表达，IPTG诱导浓度为0.5mmol/L，诱导时间为4h。

5.如权利要求3所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄的制备方法，其特征在于：所述的镍离子亲和层析分离纯化时，结合液为含有500mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.4，洗脱液为含有500mmol/L NaCl、200mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液，pH7.4。

6.如权利要求1所述的重组梅花鹿鹿茸胸腺素β₄在制备对成骨细胞M3T3或软骨细胞C5.18具有促增殖作用的药物中的应用。

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