KR20180090395A - 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180090395A KR20180090395A KR1020187022408A KR20187022408A KR20180090395A KR 20180090395 A KR20180090395 A KR 20180090395A KR 1020187022408 A KR1020187022408 A KR 1020187022408A KR 20187022408 A KR20187022408 A KR 20187022408A KR 20180090395 A KR20180090395 A KR 20180090395A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- locus
- transgenic animal
- meganuclease
- artificial
- monoclonal antibody
- Prior art date
Links
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 206
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 106
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 title claims description 83
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 248
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 137
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 133
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 103
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 103
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 65
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 43
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 39
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 28
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 26
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 25
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 claims description 19
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 claims description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 13
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 10
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 241001504654 Mustela nivalis Species 0.000 claims description 5
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000002980 germ line cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 53
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 12
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 12
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 9
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 7
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 7
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 208000024191 minimally invasive lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- -1 lipid polysaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 101100125452 Arabidopsis thaliana ICR1 gene Proteins 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 101710086053 Putative endonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 210000001173 gonocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005132 reproductive cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100291031 Caenorhabditis elegans gly-13 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000222173 Candida parapsilosis Species 0.000 description 1
- 241000222178 Candida tropicalis Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699662 Cricetomys gambianus Species 0.000 description 1
- 201000007336 Cryptococcosis Diseases 0.000 description 1
- 241000221204 Cryptococcus neoformans Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 1
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 101100496572 Rattus norvegicus C6 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 102100027287 Serpin H1 Human genes 0.000 description 1
- 108050008290 Serpin H1 Proteins 0.000 description 1
- 108010029157 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000001613 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 2 Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010077674 Tetraspanin 25 Proteins 0.000 description 1
- 102000010430 Tetraspanin 25 Human genes 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 229940055022 candida parapsilosis Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000006690 co-activation Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- JFINOWIINSTUNY-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-3-ylmethanesulfonamide Chemical compound NS(=O)(=O)CC1CCNC1 JFINOWIINSTUNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8775—Murine embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/0609—Oocytes, oogonia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Abstract
본 발명은 내생적 Ig 가 결핍되어 있고 트랜스제닉 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물, 및 이의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 동물에서 트랜스제닉 항체를 생산하는 방법, 및 이렇게 생산된 트랜스제닉 항체에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 교차 인용
본 출원은 본원에서 그 전체가 참조 인용되고 있는 2007 년 6 월 1 일에 제출된 U.S. 가특허 출원 시리즈 제 60/941,619 호 및 2008 년 4 월 11 일에 제출된 U.S. 가특허 출원 시리즈 제 61/044,324 호의 우선권을 주장한다.
본 발명의 개요
본 발명은 하나 이상의 불활성화된 내생적 면역글로불린 유전자자리 (locus) 를 갖는 트랜스제닉 (transgenic) 동물 및 이의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 트랜스제닉 동물을 이용한 인간화 및 완전한 인간 항체의 생산을 위한 조성물 및 방법, 및 그렇게 생산된 항체에 관한 것이다.
항체는 감염병, 암, 알레르기 질병 및 이식대숙주 병을 포함하는 각종 인간의 질병 및 병태의 치료뿐 아니라 이식 거부의 예방에서도 성공적으로 사용되어졌던 중요한 부류의 약학적 산물이다.
비인간 면역글로불린의 치료학적 적용과 연계되는 한 가지 문제점은, 인간 환자에서 이들의 잠재적인 면역원성이다. 이러한 제제의 면역원성을 감소시키기 위해, 부분 인간 (인간화) 및 완전한 인간 항체의 다양한 생산 전술이 개발되어 왔다. 항원결합 결정인자가 이디오타입 (idiotype) 영역 내에 존재하고, 비인간 이디오타입은 현재 항체 치료학의 면역원성의 원인이 되는 것으로 여겨지므로, 비인간 동물에서 인간 이디오타입을 갖는 트랜스제닉 항체를 생산하는 능력이 특히 요구된다. 다클론 항체 혼합물에 의해 더 낮은 농도로 전달되는 다양한 이디오타입과는 대조적으로 비교적 높은 농도로 전해지는 단일의 이디오타입으로 이루어지는 단일클론 항체 치료학에 있어서, 인간 이디오타입은 매우 중요한 고려 사항이다.
비인간 동물에서 인간화 트랜스제닉 항체 생산에 대한 다수의 접근법이 기술되어져 있으나, 다수의 이러한 접근법에서 부딪치는 한 가지 주요한 문제점은, 우선적으로 내생적 항체를 생산하는 것 또는 숙주 동물 내 트랜스제닉 항체와 조합된 내생적 항체를 생산하는 것이다. 이러한 문제점을 다루기 위해, 숙주 동물에서 내생적 면역글로불린 생산물을 분쇄하는 시도에서 각종 재조합 클로닝 계획을 세웠었다. 그러나, 면역글로불린 유전자의 작용적 불활성화는 척추동물 종에서 많은 문제점을 보였다.
예를 들어, JH-유전자자리가 결손된 동종접합 돌연변이 마우스를 상동 재조합을 이용하여 성공적으로 생산하였으나, ES 또는 기타 지속할 수 있는 다능성 세포는 (이때, 상동 재조합을 내생적 유전자자리를 불활성화하도록 사용할 수 있음) 대부분의 척추동물 종에서 용이하게 입수가능하지 않는다.
게다가, 면역글로불린 VDJ 또는 VJ 유전자-분절의 생산적 재배열이 아닌 세포 표면 발현을 방해하는 돌연변이는 내생적 Ig 발현을 완벽하게 불활성화하는데 불충분하다. 이는 μ 경쇄의 막 엑손이 단열된 동종접합 돌연변이 마우스 (소위 μMT 마우스) 가 IgM 또는 IgG 를 생산할 수 없으나, 여전히 충분량의 IgA 를 생산한다는 사실로 예시된다 (Macpehrson et al. Nature Immunol 2(7):625-631 (2001)). 게다가, 이종접합 돌연변이 마우스의 혈청에는, 야생형 대립유전자 및 돌연변이된 μMT 대립유전자인 두 대립유전자로 인코딩된 IgM 및 IgG 이 함유되어 있다 (Kitamura 및 Rajewky, Nature 356:154-156 (1992)). 이는 B-세포 발달의 과정에서 제 1 의 재배열이 두 상동 염색체 상 DH- 및 JH-유전자 분절의 결합이므로 프로 B 세포 (pro-B cell) 을 생산한다는 점에서 기인한다. 만약, μMT/+ 마우스에서, 프로-B 세포가 우선 돌연변이된 IgH 유전자자리 내 VH-DHJH 결합을 후속하여, 결합의 뼈대가 완성된다면 ("생산적"), 생성된 프리-B 세포 (pre-B cell) 는 분비된 형태의 μ사슬을 발현할 수 있으나, 막-결합 μ 를 발현할 수 없다. 막 결합 μ 발현이 대립유전자 배제에 요구되기 때문에, 그러한 세포는 여전히 야생형 IgH 유전자자리에서 VH-DHJH 결합을 행할 수 있고; 이러한 제 2 의 재배열이 또한 생산적인 경우에는, 세포는 두 개의 상이한 μ 사슬을 발현하는데, 그 중 하나가 막-결합된다. 이러한 마우스의 혈청은 두 대립유전자로부터 유도된 IgM 을 포함한다. 또한, 두 대립유전자로부터 유도된 IgG 가 상기 마우스의 혈청에서 발견될 수 있는데, 그 이유는 전환이 B 세포의 두 IgH 유전자자리 상에서 동시에 종종 유도되기 때문이다.
불완전 대립유전자 배제가 또한, 여전히 VDJ 또는 VJ 유전자 분절을 생산적으로 재배열할 수 있는 돌연변이된 내생적 면역글로불린 유전자자리 및 작용적 트랜스제닉 면역글로불린 유전자자리를 갖는 동물에서 발견된다. 하나의 또는 두 돌연변이 내생적 유전자자리에서 VH-DHJH 를 재배열하는 B-세포는 여전히 트랜스제닉 면역글로불린 유전자자리를 생산적으로 재배열할 수 있다. 이러한 B-세포는 막-결합 트랜스제닉 면역글로불린을 발현시켜 성숙한 B-세포로 발달한다. B-세포 발달 동안에, 돌연변이된 내생적 유전자자리 내 아이소타입 전환으로 내생적 면역글로불린을 발현하는 B-세포가 도모된다. 따라서, 이러한 돌연변이는 트랜스제닉 면역글로불린 유전자자리를 갖는 동물에서 내생적 면역글로불린 발현을 완전히 불활성화하는 데 부적당하다.
본 발명의 개요
비인간 동물에서 인간화 트랜스제닉 항체의 생산과 관련된 주요한 문제는, 숙주 내 내생적 항체의 우선적인 생산 또는 공동-생산이었었다. 본 발명은 이러한 문제를, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 정박시켜 내생적 면역글로불린을 생산하는 능력이 결핍된 트랜스제닉 동물을 제공함으로써 해결한다. 이들 동물은 인간화 및 완전한 인간 트랜스제닉 항체를 생산하는데 매우 유용하다. 이러한 트랜스제닉 동물을 생산하는데 사용되는 방법은, ES 세포 또는 지속가능한 다능성 세포가 현재 용이하게 입수가능하지 않고, 상동 재조합 및 유전자 녹아웃 (knockout) 이 용이하게 행해지지 않는 종을 포함하는 다수의 종에서 유효하다.
본 발명은 메가뉴클레아제 (meganuclease) 를 사용하여 내생적 면역글로불린 유전자자리를 작용적으로 제거해 인간화 및 완전한 인간 트랜스제닉 항체를 생산하는데 유용한 트랜스제닉 동물을 생산할 수 있다는 발견에서 일부분 시작한다. 또한, 별개의 게놈 부위에 타겟팅하는 두 개의 별개의 메가뉴클레아제를 사용하여 면역글로불린 유전자자리의 큰 부분 (수 kb 이하) 을 유효하게 결손시켜, 유전자자리의 완전한 불활성화를 확보하고, 생식계열 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 동물이 내생적 면역글로불린을 생산할 수 있는 임의의 B 세포를 생산하지 않는다는 것을 추가로 확보하였다.
따라서, 본 발명은 한 측면에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖는 트랜스제닉 동물을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 동물은 작은 실험실 동물, 특히 조류, 설치류 및 족제비류이다. 본 발명에서 사용되는 인공 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함하며, 이때 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 불활성화된 내생적 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 두 내생적 Ig 중쇄 유전자자리를 불활성화시켜, 그에 따라 작용적인 내생적 Ig 중쇄 유전자자리를 갖지 않는다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 불활성화된 내생적 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 두 내생적 Ig 경쇄 유전자자리를 불활성화시켜, 그에 따라 작용적인 내생적 Ig 경쇄 유전자자리를 갖지 않는다.
바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 내생적 Ig 중쇄 유전자자리 및 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있으며, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 이때 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 갖는 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자를 포함하며, 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 키메라 (chimeric) 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있고, 이때 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역을 포함하며, 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 이때 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물의 자손을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 자손은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진다.
한 측면에서, 본 발명은 불활성화된 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물을 제공한다.
한 구현예에서, 이러한 트랜스제닉 동물은 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하며, 바람직하게 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 발현 조절 영역을 가진 구축물을 포함하는데, 이때 인코딩된 메가뉴클레아제는 트랜스제닉 동물의 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지한다. 트랜스제닉 동물이 성적으로 성숙하고 생존가능한 생식 세포를 포함하며, 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 사용하여, 실험실 내 또는 생체 내에서 이러한 생식 세포 내 타겟팅된 내생적 Ig 유전자자리를, 그의 생존력을 타협하지 않은 채 불활성할 수 있는 경우, Ig 유전자자리에 생식계열 돌연변이를 갖는 F1 동물 확보가 이로부터 유도될 수 있다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 생존가능한 생식 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물을 제공하는데, 이때 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화되어 있다. 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물의 생산 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 본 발명은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물의 생산 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 내생적 Ig 경쇄 및/또는 내생적 Ig 중쇄에 있어서 무접합형 (nullizygous) 이다.
바람직하게도, 내생적 Ig 유전자자리는 모 생식 세포 또는 선조 (predecessor) 의 생식 세포에서 그 안의 메가뉴클레아제의 발현에 의해 불활성화된다. 상기 방법은 생식 세포 내 메가뉴클레아제를 생산하는 것을 포함하는데, 이때 상기 메가뉴클레아제는 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지하고, 생식 세포 내 타겟팅된 Ig 유전자자리를 선택적으로 불활성화시켜, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산한다. 이러한 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생식 세포가, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 동물을 생산하는데 사용된다. 한 구현예에서, 생식 세포, 또는 이것이 조합하고 있는 것은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 생식 세포, 또는 이것이 조합하고 있는 것은 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 생식 세포, 또는 이것이 조합하고 있는 것은 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 생식 세포에 도입하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 생식 세포는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는데, 이는 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 생식 세포는 유도성 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하고, 상기 방법은 생식 세포에 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 생식 세포에 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도하는 단계를 반복하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 유도는 생체 내에서 행해진다. 또 다른 구현예에서, 유도는 실험실 내에서 행해진다. 한 구현예에서, 생식 세포는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하고, 이는 생식 세포-특이 활성을 나타내는 발현 조절 영역을 포함한다.
생성된 생식 세포는 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 F1 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. F1 동물은 하나 이상의 인공 Ig 유전자자리를 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 그러한 동물을 생산하도록 교배될 수 있다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 수정된 난모세포 또는 배아로 도입하고, 수득한 시조 (founder) 동물에 적어도 하나의 불활성화된 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함한다. 시조 동물이 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 F1 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. F1 동물은 하나 이상의 인공 Ig 유전자자리를 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 상기 동물을 생산하도록 교배될 수 있다.
한 구현예에서, 메가뉴클레아제 타겟 서열은 J 유전자 분절에 또는 그 부근에 존재한다.
한 구현예에서, 메가뉴클레아제 타겟 서열은 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절에 또는 그 부근에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 불변 영역 유전자는 면역글로불린 μ 를 인코딩한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 내생적 Ig 유전자자리의 불활성화 및 생존능에 대해서 생식 세포를 스크리닝 (screening) 하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 인공 Ig 유전자자리의 존재에 대해서 생식 세포를 스크리닝하는 것을 포함한다.
본원의 방법에서, 동물의 교배를 불활성화된 내생적 유전자자리를 가진 동물들 간에서 하여, 내생적 Ig 경쇄 및/또는 내생적 Ig 중쇄에 있어서 무접합형인 동물을 생산하는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 제 2 의 메가뉴클레아제의 사용을 추가로 포함한다. 제 2 의 메가뉴클레아제는 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지하여, 제 1 의 메가뉴클레아제와 함께, 그러나 제 1 의 메가뉴클레아제의 부위와는 상이한 부위에서 내생적 Ig 유전자자리를 선택적으로 절단함으로써, 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 불활성화시킨다.
바람직한 구현예에서, 생식 세포는 제 2 의 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는데, 이는 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 발현 조절 영역은 유도성 발현 조절 영역이고, 방법은 생식 세포 내에 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도하는 것을 추가로 포함하여, 인코딩된 제 2 의 메가뉴클레아제가 생산되어, 제 2 의 메가뉴클레아제와 함께 생식 세포 내 타겟팅된 Ig 유전자자리를 선택적으로 불활성화시킨다. 한 구현예에서, 상기 방법은 생식 세포 내 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도하는 단계를 반복하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 유도는 생체 내에서 행해진다. 한 구현예에서, 유도는 실험실 내에서 행해진다. 한 구현예에서, 제 2 의 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물은 생식 세포-특이 활성을 나타내는 발현 조절 영역을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 제 2 의 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 생식 세포로 도입하는 것을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 상기 방법은 제 2 의 메가뉴클레아제 발현 구축물 또는 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 수정된 난모세포 또는 배아에 도입하고, 수득한 시조 동물에서 적어도 하나의 불활성화된 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함한다. 시조 동물이 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 F1 동물을 생산하는데 사용될 수 있다. F1 동물은 하나 이상의 인공 Ig 유전자자리를 포함할 수 있거나, 또는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 상기 동물을 생산하도록, 교배될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 J 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은, 내생적 Ig 유전자자리 내 하나 이상의 J 유전자 분절의 상류 및 하류에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클레아제가 절단하여 하나 이상의 J 유전자 분절을 포함하는 게놈 DNA 분절을 결손한다.
또 다른 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 불변 영역 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절의 상류 및 하류에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클레아제가 절단하여 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 게놈 DNA 분절을 결손한다. 바람직한 구현예에서, 불변 영역 유전자는 면역글로불린 μ 을 인코딩한다.
본원의 방법에서, 사용되는 인공 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는, (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함하며, 이때 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리가 본 발명의 트랜스제닉 동물의 게놈에 삽입된다. 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리가 본 발명의 트랜스제닉 동물의 게놈에 삽입된다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리가 본 발명의 트랜스제닉 동물의 게놈에 삽입된다.
바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자를 포함하고, 트랜스제닉 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어, 키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 인공 Ig 유전자의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전자를 포함하고, 트랜스제닉 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법은, 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물을 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 가진 제 2 의 트랜스제닉 동물과 교배하여 (이때 상기 유전자자리는 (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함함), F1 트랜스제닉 동물을 생산하는 것을 포함하는데, 이때 F1 트랜스제닉 동물은 제 2 의 트랜스제닉 동물의 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 제 2 의 트랜스제닉 동물 유래의 인공 Ig 유전자자리는 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 교배는 동물 번식 (breeding) 에 의해 또는 그 밖에 실험실 내 조작을 포함하는 배우자 조합에 의해서 행할 수 있다.
한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 동물들은 교배되어 작용적인 Ig 경쇄 유전자자가 결핍되고 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함하는 F1 을 생산할 수 있다.
한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함해, 적어도 2 개의 인공 Ig 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물의 인공 Ig 유전자자리는 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물의 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자를 포함하며, F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물의 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전자를 포함하며, F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는데, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린을 포함한다.
마찬가지로, 한 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 가진 제 2 의 트랜스제닉 동물을, 불활성화된 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산할 수 있는 본 발명의 트랜스제닉 동물과 교배하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 제 2 의 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함해, 적어도 2 개의 인공 Ig 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 메가뉴클레아제의 활성에 의해 불활성화되어 있거나, 또는 불활성화될 수 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생식 세포로, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 도입하는 것을 포함하는데, 이때 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함하고, 여기서 인공 Ig 유전자자리는 생식 세포에서 유도된 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 인공 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 상기 방법은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화된 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 F1 트랜스제닉 동물을 그렇게 생산된 생식 세포로부터 유도하는 것을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 생식 세포는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있으며, 생식 세포에 도입된 인공 Ig 유전자자리는 Ig 중쇄 유전자자리이다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함해, 적어도 2 개의 인공 유전자자리가 생식 세포에 도입된다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 유도된 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자를 포함하며, 유도된 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전자를 포함하며, 유도된 F1 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 상기 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 내생적 Ig 유전자자리의 불활성화 및 생존능에 대해서 생식 세포를 스크리닝하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 인공 Ig 유전자자리의 존재에 대해서 생식 세포를 스크리닝하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화되었거나 또는 불활성화될 수 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생식 세포로부터 유도된 수정된 난모세포 또는 배아에 도입하는 것을 포함하는데, 이때, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함하며, 여기서 인공 Ig 유전자자리는 상기 수정된 난모세포 또는 배아에서부터 유도된 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 인공 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 상기 방법은 수정된 난모세포 또는 배아로부터 시조 트랜스제닉 동물, 및 임의로는 그의 자손을 유도하여, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화된 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물을 수득하는 것을 추가로 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 수정된 난모세포 또는 배아는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고, 수정된 난모세포 또는 배아에 도입된 인공 Ig 유전자자리는 Ig 중쇄 유전자자리이다.
바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함해, 적어도 2 개의 인공 유전자자리는 수정된 난모세포 또는 배아에 도입된다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불린의 레퍼토리를 만들수 있는데, 이때 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 비인간 불변 영역 유전자를 포함하며, 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 키메라 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 이때 상기 키메라 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 키메라 면역글로불린을 포함한다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리의 하나 이상의 불변 영역 유전자는 적어도 하나의 인간 불변 영역 유전자를 포함하며, 시조 트랜스제닉 동물 또는 그의 자손에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어, 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 이때 면역글로불린의 레퍼토리는 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 면역글로불린을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화된 생존가능한 생식 세포를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 발현 구축물이 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함하는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 가진 트랜스제닉 동물을 생산하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 구축물은 생식 세포 내 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 발현하도록 유도될 수 있는 유도성 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물이다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화된 생존가능한 생식 세포를 가진 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생식 세포, 또는 모 생식 세포 또는 이로부터 유도된 수정된 난모세포 또는 배아에서 그 안의 메가뉴클레아제의 발현으로 내생적 Ig 유전자자리를 불활성화시키는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화될 수 있는 생존가능한 생식 세포를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 생식 세포는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는데, 이때 발현 구축물은 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 발현 조절 영역을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 구축물은 생식 세포에서 메가뉴클레아제-인코딩 핵산을 발현하도록 유도될 수 있는 유도성 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물이다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리가 불활성화된 생존가능한 생식 세포를 제공한다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 적어도 하나의 메가뉴클레아제를 발현시켜, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함한다. 상기와 같이 발현된 메가뉴클레아제는 상기 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지한다.
메가뉴클레아제가 생식 세포에서 발현되는 한 구현예에서, 메가뉴클레아제가 발현하는 생식 세포는 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 제공한다. 대안으로, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능 생식 세포는 메가뉴클레아제가 발현된 생식 세포로부터 유도된 동물에서 수득가능하다.
메가뉴클레아제가 수정된 난모세포 또는 배아에서 발현된 한 구현예에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포는, 메가뉴클레아제가 발현된 수정된 난모세포 또는 배아로부터 유도된 동물로부터 수득될 수 있다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리는 실험실 내에서 불활성화된다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리는 생체 내에서 불활성화된다.
한 구현예에서, 생식 세포는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 추가로 포함한다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 포함해, 적어도 2 개의 인공 Ig 유전자자리는 생식 세포에 도입된다.
본 발명은 또한 다클론 항체, 단일클론 항체, 하이브리도마, 및 상기의 이용 및 생산 방법을 제공하는데, 이는 하나 이상의 인공 유전자자리를 포함하고, 메가뉴클레아제 활성에 의해 불활성화된 하나 이상의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 현재 개시된 트랜스제닉 동물 내 항체의 생산에서 출발한다.
한 구현예에서, 항체는 본원에서 기술된 방법에 의해 성취된, 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고 인공 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용해 생산된, 중쇄 독존의 (heavy chain-only) 항체이다.
한 측면에서, 본 발명은 본원에서 제공된 트랜스제닉 동물을 이용해 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것을 포함하는데, 상기 동물은 본원에서 기술된 바와 같이 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가지며, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 내생적 Ig 중쇄 및/또는 내생적 Ig 경쇄에 있어서 무접합형이므로, 내생적 면역글로불린을 생산할 수 없다. 한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있으며, 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 다클론 항혈청 조성물을 제공한다. 본 발명의 다클론 항혈청은 인간 이디오타입을 가진 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 다클론 항혈청은 본질적으로는 인간 이디오타입을 가진 항체로 이루어진 항체를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 방법은 (i) 본 발명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것으로 이때 상기 동물은 본원에서 기술된 바와 같이 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가지며, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 보유함; (ii) 단일클론 항체 생산 세포를 트랜스제닉 동물에서부터 단리시키는 것으로, 이때 상기 단일클론 항체 생산 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; 및 (iii) 단일클론 항체 생산 세포를 이용해, 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산, 또는 단일클론 항체 생산 세포를 이용해, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 생산, 및 하이브리도마 세포를 이용해 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 (i) 본 발명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것으로, 이때 상기 동물은 본원에서 기술된 바와 같이 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖고, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 보유함; (ii) 단일클론 항체 생산 세포를 트랜스제닉 동물로부터 단리시키는 것으로, 이때 단일클론 항체 생산 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; (iii) 단일클론 항체 생산 세포로부터, 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단리시키는 것; 및 (iv) 단일클론 항체 핵산을 이용해 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 인간 이디오타입을 가진다.
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 단일클론 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기의 단일클론 항체를 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 완전한 인간 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, (i) 본 발명의 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것으로, 이때 상기 동물은 본원에서 기술된 바와 같이 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가지며, 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 보유함; (ii) 단일클론 항체 생산 세포를 트랜스제닉 동물로부터 단리시키는 것으로, 이때 단일클론 항체 생산 세포는 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; (iii) 단일클론 항체 생산 세포로부터, 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단리하는 것; (iv) 단일클론 항체 핵산을 개질하여 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 재조합 핵산을 생산하는 것; 및 (v) 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 재조합 핵산을 이용해 인코딩된 완전한 인간 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 완전한 인간 단일클론 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 재조합 핵산 및 이의 생산 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 본원에서의 방법에 사용되는 면역원은 질병을 유발하는 유기체 또는 그의 항원성 부분을 포함한다.
한 구현예에서, 본원에서의 방법에 사용되는 면역원은 인간에 대해 내생적인 항원이다. 대안적인 구현예에서, 본원 방법에서 사용된 면역원은 인간에 대해 외인성인 항원이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 신체 성분에서 항원체 (antigenic entity) 의 활성을 중화 또는 조절하는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 방법은 신체 성분을 본 발명의 다클론 항혈청 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는데, 이때 다클론 항혈청 조성물은 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 포함하며 항원체의 활성을 중화 또는 조절한다.
한 구현예에서, 상기 방법은 신체 성분을 본 발명의 단일클론 항체와 접촉하는 것을 포함하는데, 이때 단일클론 항체가 특이적으로 결합하고 항원체의 활성을 중화 또는 조절한다.
바람직한 구현예에서, 단일클론 항체는 완전한 인간 단일클론 항체이다.
한 구현예에서, 항원체는 감염병을 야기하는 유기체의 것이다.
한 구현예에서, 항원체는 세포 표면 분자이다.
한 구현예에서, 항원체는 인간 사이토카인 또는 인간 케모카인이다.
한 구현예에서, 항원체는 악성 암 세포 상 세포 표면 분자이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 세포를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물의 비장으로부터 유도된 세포를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 B 세포를 제공하는데, 상기 B 세포는 인간 이디오타입을 가진 항체를 생산할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 생식 세포를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 이디오타입을 가진 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유도된 세포를 이용하는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 상기대로 생산된 하이브리도마를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 이디오타입을 가진 항체를 제공하는데, 상기 항체는 본 발명의 하이브리도마에 의해 생산된다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 이때 상기 항체는 인간 이디오타입을 가진다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 상기 환자의 치료 방법을 제공한다.
도 1 은 인간 V-, D, 및 J-영역, 래트의 인트론 인핸서 (enhancer) 및 몇몇 인공 불변 영역 유전자로 이루어진 인공 중쇄를 개략적으로 나타낸다. 인공 불변 영역 유전자는 인간 CH1 도메인 및 래트 CH2, 3 및 4 도메인을 인코딩하는 엑손을 포함한다. 막 횡단 (Membrane spanning) 및 세포질 폴리펩티드 서열이 래트 엑손에 의해 인코딩된다.
도 2. 인지 서열의 3'말단에서 DNA 및 I-Scel 의 상호작용의 개략도.
도 3. I-Scel 인지 서열의 5'말단의 I-Scel 과의 상호작용의 개략도.
도 4. I-Crel 의 서열 인지 메카니즘의 개략도 (출처: Nucleic Acids Res., 34, 4791-4800).
도 5. I-Crel 의 인지 서열 변경 전략의 개략적인 도식.
도 6. 래트 IgM 을 인코딩하는 서열에 대해 고안된 징크-핑거 단백질 (Zinc-finger proteins; ZFP) 을 세포에서 발현하고, 염색체 DNA 를 준비하고, IgM 유전자자리의 적절한 영역을 PCR 증폭했다. 반응 생산물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석했다. 이 도는 절단 활성을 입증하는 전형적인 예를 나타낸다.
도 2. 인지 서열의 3'말단에서 DNA 및 I-Scel 의 상호작용의 개략도.
도 3. I-Scel 인지 서열의 5'말단의 I-Scel 과의 상호작용의 개략도.
도 4. I-Crel 의 서열 인지 메카니즘의 개략도 (출처: Nucleic Acids Res., 34, 4791-4800).
도 5. I-Crel 의 인지 서열 변경 전략의 개략적인 도식.
도 6. 래트 IgM 을 인코딩하는 서열에 대해 고안된 징크-핑거 단백질 (Zinc-finger proteins; ZFP) 을 세포에서 발현하고, 염색체 DNA 를 준비하고, IgM 유전자자리의 적절한 영역을 PCR 증폭했다. 반응 생산물을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석했다. 이 도는 절단 활성을 입증하는 전형적인 예를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
"인공 면역글로불린 유전자자리" 란, 적어도 하나의 가변 영역 (V) 유전자 분절, 하나 이상의 J 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절 (중쇄 유전자자리의 경우임), 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 다수의 면역글로불린 유전자 분절을 포함해, 인간 및 비인간 면역글로불린 유전자자리 단편을 포함하는 면역글로불린 유전자자리를 의미한다. 본 발명에서, V 유전자 분절 중 적어도 하나는 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 인공 면역글로불린 유전자자리는 작용적이고 재배열이 가능하여 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 D 유전자 분절은 인간 D 유전자 분절이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "인공 Ig 유전자자리" 는 재배열되지 않은 유전자자리, 부분적으로 재배열된 유전자자리 및 재배열된 유전자자리를 지칭할 수 있다. 인공 Ig 유전자자리는 인공 Ig 경쇄 유전자자리 및 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 비인간 C 영역 유전자를 포함하고, 비인간 C 영역을 가진 키메라 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 인간 C 영역 유전자를 포함하고, 인간 C 영역을 가진 면역글로불린을 포함하는 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있다. 한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리는 "인공 불변 영역 유전자" 를 포함하는데, 이는 인간 및 비인간 불변 영역 유전자로부터 유도된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 불변 영역 유전자를 의미한다. 예를 들어, 예시적인 인공 C 불변 영역 유전자는, 인간 IgG CH1 도메인 및 래트 IgG CH2 및 CH3 도메인을 인코딩하는 불변 영역 유전자이다.
일부 구현예에서, 인공 Ig 중쇄 유전자자리는 CH1, 또는 결과로서 생기는 면역글로불린이 전형적인 면역글로불린 : 샤페론 (chaperone) 연합을 우회시키는 상기와 동등한 서열이 결핍되어 있다. 이러한 인공 유전자자리는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 작용적인 Ig 경쇄를 발현하지 않는 트랜스제닉 동물에서 중쇄 독존의 항체의 생산에 대비한다. 이러한 인공 Ig 중쇄 유전자자리는 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생산하는 데 본원의 방법 중에서 사용되며, 이때 상기 동물은 중쇄 독존의 항체를 도출할 수 있다. 대안적으로, 인공 Ig 유전자자리는 제자리에서 (in situ) 조작되어 CH1 또는 이와 동등한 영역을 붕괴할 수 있어, 중쇄 독존의 항체의 생산에 대비하는 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 생산할 수 있다. 중쇄 독존의 항체를 경쇄-결핍 마우스에서 생산하는 것에 관해서는, 예를 들어 문헌 [Zou et al., JEM, 204:3271-3283, 2007] 을 참조한다.
"인간 이디오타입" 이란, 면역글로불린 V-유전자 분절에 의해 인코딩된 인간 항체 상에 존재하는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 이디오타입" 은, 인간 항체의 천연발생 서열과 천연발생 인간 항체에서 발견되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 합성 서열 모두를 포함한다. "실질적으로" 란, 아미노산 서열 상동성 정도가 적어도 약 85%-95% 임을 의미한다. 바람직하게는, 아미노산 서열 상동성 정도가 90% 초과, 더욱 바람직하게는 95% 초과이다.
"키메라 항체" 또는 "키메라 면역글로불린" 은, 인간 면역글로불린 폴리펩티드 서열 (또는 인간 Ig 유전자 분절에 의해 인코딩된 폴리펩티드 서열) 의 부분 및 비인간 면역글로불린 폴리펩티드 서열의 부분을 포함하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본 발명의 키메라 면역글로불린 분자는 비인간 Fc-영역 또는 인공 Fc-영역, 및 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린이다. 이러한 면역글로불린은 키메라 면역글로불린 분자를 생산하도록 조작되어진 본 발명의 동물로부터 단리될 수 있다.
"인공 Fc-영역" 은, 인공 불변 영역 유전자에 의해 인코딩된 Fc-영역을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "Ig 유전자 분절" 이란, Ig 분자의 다양한 부분을 인코딩하는 DNA 분절을 지칭하는데, 이는 비인간 동물 및 인간의 생식 계열에 존재하며, B 세포에서 함께 취해져 재배열된 Ig 유전자를 형성한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 Ig 유전자 분절은 V 유전자 분절, D 유전자 분절, J 유전자 분절 및 C 영역 유전자 분절을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "인간 Ig 유전자 분절" 은, 인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열, 인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열의 변성형뿐 아니라 인간 Ig 유전자 분절의 천연 발생 서열로 인코딩된 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 합성 서열 모두를 포함한다. "실질적으로" 란, 아미노산 서열 상동성 정도가 적어도 약 85%-95% 인 것을 의미한다. 바람직하게는, 아미노산 서열 상동성 정도는 90% 초과이고, 더욱 바람직하게는 95% 초과이다.
"메가뉴클레아제" 란, DNA 에서 장 (long) 인지 부위, 길이가 바람직하게는 적어도 12 개, 더욱 바람직하게는 적어도 13 개, 더욱 바람직하게는 적어도 14 개, 더욱 바람직하게는 적어도 15 개, 더욱 바람직하게는 적어도 16 개, 더욱 바람직하게는 적어도 17 개, 및 가장 바람직하게는 적어도 18 개 뉴클레오티드를 인지하는 엔도데옥시리보뉴클레아제를 의미한다. 메가뉴클레아제는 징크-핑거 뉴클레아제, 천연 발생 귀소 (homing) 엔도뉴클레아제 및 맞춤 조작된 징크-핑거 뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함한다. 본 발명에서 사용되도록 요구하는 것은, 작용적인 돌연변이가 메가뉴클레아제의 작용에 의해 Ig 유전자자리에 도입될 수 있도록, 대상체 동물에서 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 메가뉴클레아제가 인지하는 것이다. 메가뉴클레아제의 더 자세한 논의를 위해서는, 예를 들어 하기 문헌을 참조한다: U.S. 특허 출원 공보 제 20060206949 호, 제 20060153826 호, 제 20040002092 호, 제 20060078552 호, 및 제 20050064474 호.
특이성이 변경된 징크-핑거 뉴클레아제는 각각의 징크 핑거들을 상이한 삼중자 타겟과 조합함으로써 생산할 수 있다. 천연 발생 귀소 엔도뉴클레아제의 특이성은 구조를 바탕으로 하는 단백질 공법으로 변경할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Proteus and Carroll, nature biotechnology 23(8):967-97, 2005] 을 참조한다.
"생식계열의 불활성화된 Ig 유전자자리", 또는 "생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리", 또는 "내생적 Ig 유전자자리 내 생식계열 돌연변이" 를 가진 동물은 모든 세포에서, 즉 모든 체세포 및 생식 세포에서 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진다. 본 발명에서, 생식계열의 불활성화된 유전자자리를 가진 동물은, 수득되는 동물 또는 그의 선조의 근원이 되는 생식 세포에서 메가뉴클레아제의 작용에 의해 초래되는 바와 같이 돌연변이에 의해 생산된다.
불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포 및 트랜스제닉 동물의 생산
본 발명에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖는 생존가능한 생식 세포를 생산하도록, 메가뉴클레아제가 내생적 Ig 유전자자리를 불활성화하는데 사용된다. 그 방법은 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 적어도 하나의 메가뉴클레아제를 발현시켜 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함한다. 그렇게 발현된 메가뉴클레아제는 대상체 동물에서 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지한다.
메가뉴클레아제가 생식 세포에서 발현되는 한 구현예에서, 메가뉴클레아제가 발현되어진 생식 세포는 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 양산한다. 대안적으로, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포는 메가뉴클레아제가 발현되어진 생식 세포로부터 유도되는 동물로부터 수득할 수 있다.
메가뉴클레아제가 수정된 난모세포 또는 배아에서 발현되는 한 구현예에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포는 메가뉴클레아제가 발현되어진 수정된 난모세포 또는 배아에서 유도되는 동물로부터 수득할 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물을 생산하는 방법도 제공한다. 상기 방법은 본원의 방법에 따라 생산된 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포로부터 트랜스제닉 동물을 유도하는 것을 포함한다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖는 생존가능한 생식 세포는 인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 그렇게 생산된 트랜스제닉 동물은 인공 Ig 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 인공 Ig 유전자자리를 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포, 또는 그의 생식 세포 자손 또는 그로부터 유도된 수정된 난모세포 또는 배아에 도입하는 것을 추가로 포함하며, 그렇게 생산된 트랜스제닉 동물은 인공 Ig 유전자자리를 포함한다.
한 구현예에서, 방법은 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포, 또는 그의 생식 세포 자손을 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 배우자와 조합하는 것을 포함하며, 그렇게 생산된 트랜스제닉 동물은 인공 Ig 유전자자리를 포함한다.
내생적 Ig 유전자자리의 불활성화
내생적 Ig 유전자자리의 불활성화는, 대상체 동물에서 내생적인 중쇄 및/또는 경쇄 유전자자리에서 면역글로불린 유전자 단편에 대해 특이적인 메가뉴클레아제를 이용하여 수행된다. 한 구현예에서, 이중 가닥 끊김은 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에 메가뉴클레아제를 주입함으로써 유도될 수 있다. 대안으로, 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 발현될 수 있고 메가뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 또는 발현 벡터를 상기에 주입할 수 있다.
한 구현예에서, 방법은 생식 세포 (이의 전구체, 예컨대 정조 (spermatagonial) 줄기 세포 등을 포함할 수 있음) 를 시험관 내 또는 생체 내에서 핵산을 인코딩하는 메가뉴클레아제 또는 발현 구축물로 트랜스펙션 (transfection) 하는 것을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Ryu et al., J. Androl., 28:353-360, 2007; Orwig et al., Biol. Report, 67:874-879, 2002] 을 참조한다.
바람직한 구현예에서, 메가뉴클레아제 발현 구축물은 대상체 동물의 게놈에 혼입된다. 생식 세포에서 메가뉴클레아제를 인코딩하는 도입유전자 (transgene) 의 발현으로 내생적 Ig 유전자자리에서 이중 가닥 끊김이 야기되고, 이어서 제한 부위에서 돌연변이가 일어날 것이다. 이러한 트랜스제닉 동물의 짝짓기로 돌연변이된/불활성화된 면역글로불린 유전자자리를 갖는 자손이 생긴다.
본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 조절가능한 메가뉴클레아제 발현 구축물이 대상체 동물의 게놈에 혼입되는데, 상기 조절가능한 구축물은 생식 세포에서 유도가능하다. 이러한 구축물은 유도성 프로모터, 예를 들어 열-유도성 프로모터, 방사선-유도성 프로모터, 테트라사이클린 오페론, 호르몬 유도성 프로모터, 및 트랜스활성자 (transactivator) 의 이합체화에 의해 유도가능한 프로모터 등을 매개로 조절되는 발현을 통해, 특정 메가뉴클레아제의 발현과 관련된 세포독성 효과의 최소화를 준비한다. 예를 들어, 문헌 [Vilaboa et al., Current Gene Therapy, 6:421-438, 2006] 을 참조한다.
대안적으로, 메가뉴클레아제 발현은 생식 세포에서 유도된 배아에서 유도될 수 있다.
한 구현예에서, 단일 메가뉴클레아제가 생식 세포에서 발현되는데, 이때 메가뉴클레아제는 대상체 동물의 생식 세포에 내생적인 면역글로불린 유전자자리에 또는 그 부근의 타겟 서열을 인지한다. 바람직한 구현예에서, 메가뉴클레아제 타겟 서열은 J 유전자 분절에 또는 그 부근에 존재한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 메가뉴클레아제 타겟 서열은 면역글로불린 불변 영역 유전자에 또는 그 부근에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역 유전자는 면역글로불린 μ 를 인코딩한다.
바람직한 구현예에서, 별개의 타겟 서열을 가진 적어도 두 개의 메가뉴클레아제가 사용된다. 적어도 2 개의 메가뉴클레아제는 생식 세포에서 발현되며, 이때 메가뉴클레아제는 대상체 동물의 생식 세포에 내생적인 면역글로불린 유전자자리에 또는 그 부근의 별개의 타겟 서열을 인지한다.
바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 J 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은 내생적 Ig 유전자자리 내 하나 이상의 J 유전자 분절의 상류 및 하류에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클레아제가 절단하여 하나 이상의 J 유전자 분절을 포함하는 게놈 DNA 분절을 결손한다.
또 다른 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제는 불변 영역 유전자 분절을 타겟팅한다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열은 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절의 상류 및 하류에서 함께 취해져, 제 1 및 제 2 의 인코딩된 메가뉴클라아제가 절단하여 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 게놈 DNA 분절을 결손한다. 바람직한 구현예에서, 불변 영역 유전자는 면역글로불린 μ 을 인코딩한다.
한 구현예에서, 전체의 내생적 Ig 중쇄 및/또는 Ig 경쇄 유전자자리, 또는 이의 큰 부분이 대상체 동물의 게놈으로부터 결손된다. 이러한 동물은 또한 불활성되어진 내생적 유전자자리를 포함하는 것으로서 지칭된다.
한 구현예에서, 적어도 하나의 메가뉴클레아제가 사용되어 내생적 Ig 중쇄 유전자자리의 CH1 영역을 파괴하면서, 그 유전자자리의 나머지는 그대로 두고 전형적인 면역글로불린 : 샤페론 연합을 우회시키는 Ig 중쇄를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 상기 CH1 타겟팅은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍된 동물에서 실시된다. 그러한 동물에서 상기 타겟팅은 중쇄 독존의 항체를 생산하는데 유용하다.
한 구현예에서, 하나 초과의 메가뉴클레아제가 Ig 중쇄 유전자자리 내 CH1 을 타겟팅하는데 사용된다.
한 구현예에서, 인접한 부위를 인지하는 두 개의 메가뉴클레아제가 사용된다. 한 구현예에서, 상기 부위는 팔린드롬 (palindrome) 의 요소이다. 한 구현예에서, 두 개의 메가뉴클레아제는 링커 (linker) 에 의해 결박되어 있다.
바람직한 구현예에서, 사용되는 번식 전략은 내생적 Ig 경쇄 및/또는 내생적 Ig 중쇄에 있어서 무접합형인 동물을 수득하는 것으로 고안되어 있다.
조절가능한 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 동물
한 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 조절가능한 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 동물을 제공한다.
트랜스제닉 동물은 작은 실험실 동물, 특히 조류 (닭, 칠면조, 메추라기, 오리, 꿩 또는 거위 등), 설치류 (예를 들어, 래트, 햄스터 및 기니 피그), 및 족제비류 (예를 들어, 흰족제비) 로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 조절가능한 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물은 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 발현 조절 영역을 포함한다. 유도성 발현 조절 영역은 특정 트랜스제닉 동물의 생식 세포에서 유도적으로 작용적이며, 인코딩된 메가뉴클레아제는 대상체 동물의 내생적 면역글로불린 유전자자리에 또는 그 부근에 위치된 메가뉴클레아제 타겟 서열에 대해서 선택적이다.
조절가능 메가뉴클레아제 발현 구축물은, 유도성 프로모터, 예를 들어, 열-유도성 프로모터, 방사선-유도성 프로모터, 테트라사이클린 오페론, 호르몬 유도성 프로모터, 및 트랜스활성자의 이합체화에 의해 유도가능한 프로모터 등을 매개로 조절된 발현을 통해, 특정 메가뉴클레아제의 발현과 연관된 세포독성 효과의 최소화를 대비한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 2 개의 별개의 타겟 서열을 인지하는 2 개의 별개의 메가뉴클레아제를 인코딩하는 2 개의 별개의 핵산을 포함하는 2 개의 조절가능 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함한다. 상기 2 개의 메가뉴클레아제는 조합되어 내생적 Ig 유전자자리의 게놈 DNA 분절을 결손시키도록 작용되며 이로써 이를 불활성화시킨다.
적어도 하나의 조절가능 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 동물은, 당업계에 익히 공지된 방법으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 발현 조절 영역을 포함하는 트랜스제닉 벡터가 수용자 세포 또는 세포들에 도입될 수 있고, 그 다음에 무작위 혼입에 의해 또는 타겟팅된 혼입에 의해 상기 수령자 세포 또는 세포들의 게놈에 혼입될 수 있다.
무작위 혼입에 있어서, 그러한 트랜스제닉 벡터는 표준 트랜스제닉 기술에 의해 수령자 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 벡터를 수정된 난모세포의 전핵 (pronucleus) 에 직접 주입할 수 있다. 트랜스제닉 벡터는 또한 난모세포 수정 전 트랜스제닉 벡터를 가진 정자의 공동-인큐베이션 (co-incubation) 에 의해 도입될 수 있다. 트랜스제닉 동물은 수정된 난모세포로부터 발생될 수 있다. 트랜스제닉 벡터를 도입하는 또 다른 방법은 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 세포 (예를 들어 원시 생식 세포) 를 트랜스펙션한 다음 후속해서 유전자 조작된 세포를 발달 중인 배아에 주입하는 것에 의한 것이다. 대안적으로, 트랜스제닉 벡터 (나상 (naked) 또는 촉진 시약과 조합) 를 발달중인 배아에 직접 주입할 수 있다. 또 다른 구현예에서는, 트랜스제닉 벡터가 세포 게놈에 도입되어, 동물이 핵 이식 클로닝에 의해 트랜스펙션된 세포로부터 유도된다.
타겟팅된 혼입에 있어서, 상기 트랜스제닉 벡터는 배아 줄기 세포 또는 이미 분화된 체세포와 같은 적절한 수령자 세포로 도입될 수 있다. 후에, 도입유전자가 상동 재조합으로 타겟팅된 부위에서 동물 게놈에 혼입되어 있는 세포를 표준 방법으로 선택할 수 있다. 이때, 선택된 세포는 제핵된 핵 이식 단위 세포, 예를 들어 난모세포 또는 배아 줄기 세포, 전능성 (totipotent) 이고 작용적 신생아를 형성할 수 있는 세포와 융합될 수 있다. 융합은 익히 확립된 종래의 기술에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Cibelli et al., Science (1998) 280:1256 Zhou et al. Science (2003) 301 : 1179] 을 참조한다. 난모세포의 제핵 및 핵 이식이 또한 주입 피펫을 이용해 미세수술로 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wakayama et al., Nature (1998) 394:369] 을 참조한다.) 이어서, 수득한 세포를 적절한 배지에서 배양하고, 이를 트랜스제닉 동물을 생산하기 위해 동기화된 (synchronized) 수령자에 이동한다. 대안적으로는, 선택된 유전자 조작된 세포를 발달중인 배아에 주입할 수 있다.
한 구현예에서, 메가뉴클레아제를 사용해 타겟 부위에서 이중-가닥 DNA 절단을 통한 상동 재조합의 빈도를 증가시킨다.
인공 Ig 유전자자리를 포함하고, 인간 이디오타입을 가진 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물
한 측면에서, 본 발명은 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 및 이의 생산 방법을 제공한다.
사용된 트랜스제닉 동물은 특히 조류 (닭, 칠면조, 메추라기, 오리, 꿩 또는 거위 등), 설치류 (예를 들어, 래트, 햄스터 및 기니 피그), 및 족제비류 (예를 들어, 흰족제비) 로부터 선택된다.
본 발명에서 인간화 항체 생산에 사용되는 트랜스제닉 동물은 하나 이상의 메가뉴클레아제의 활성에 의해 초래되는 내생적 Ig 유전자자리 내 생식계열 돌연변이를 지닌다. 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 내생적 Ig 중쇄 및/또는 내생적 Ig 경쇄에 있어서 무접합형이다. 게다가, 이들 동물은 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 면역글로불린 분자의 레퍼토리를 만들 수 있는 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 가진다. 본 발명에서 사용되는 인공 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리 및 적어도 하나의 인공 Ig 경쇄 유전자자리를 보유하는데 이는 각각 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 면역글로불린 분자의 레퍼토리를 만들 수 있으며, 상기 면역글로불린 분자의 레퍼토리는 인간 이디오타입을 가진 항체를 포함한다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 비인간 C 유전자를 포함하는 인공 유전자자리가 사용되고, 인간 이디오타입 및 비인간 불변 영역을 가진 키메라 항체를 생산할 수 있는 동물이 제공된다. 한 구현예에서, 적어도 하나의 인간 C 유전자를 포함하는 인공 유전자자리가 사용되고, 및 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 항체를 생산할 수 있는 동물이 제공된다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 적어도 하나의 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 보유하며, 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리는 결핍되어 있다. 이러한 동물은 중쇄 독존의 항체의 생산에서 유용한 것으로 보인다.
이러한 트랜스제닉 동물의 생산에는, 하나 이상의 인공 중쇄 Ig 유전자자리 및 하나 이상의 인공 경쇄 Ig 유전자자리를, 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화되었거나 또는 될 수 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물의 게놈으로의 혼입이 포함된다. 바람직하게는, 트랜스제닉 동물은 내생적 Ig 중쇄 및/또는 내생적 Ig 경쇄에 있어서 무접합형이며, 그에 따라 내생적 면역글로불린을 생산할 수 없다. 염색체 위치와 관계없이, 본 발명의 인공 Ig 유전자자리는 유전자 재배열을 행할 역량이 있어, 이로 인해 면역글로불린 분자의 다각화된 레퍼토리를 만든다. 유전자 재배열을 행할 역량을 가진 Ig 유전자자리는 또한 "작용적인" Ig 유전자자리로서 본원에서 지칭되며, 이 작용적인 Ig 유전자자리에 의해 생산된 다양한 항체가 또한 본원에서 "작용적인" 항체 또는 "작용적인" 항체 레퍼토리로 지칭된다.
상기 트랜스제닉 동물을 생산하는데 사용되는 인공 유전자자리는 각각 다수의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는데, 이는 적어도 하나의 V 영역 유전자 분절, 하나 이상의 J 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절 (중쇄 유전자자리의 경우임) 및 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함한다. 본 발명에서, V 유전자 분절 중 적어도 하나는 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩한다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 동물은 인간 이디오타입을 가진 항체를 포함하는, 면역글로불린 분자의 다각적인 레퍼토리를 만들 수 있는 역량을 지닌다.
한 구현예에서, 사용된 인공 유전자자리는 적어도 하나의 비인간 C 영역 유전자 분절을 포함한다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 동물은 인간 이디오타입을 가진 키메라 항체를 포함하는 면역글로불린 분자의 다각적인 레퍼토리를 만들 역량을 지닌다.
한 구현예에서, 사용된 인공 유전자자리는 적어도 하나의 인간 C 영역 유전자 분절을 포함한다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 동물은 인간 이디오타입 및 인간 불변 영역을 가진 항체를 포함하는 면역글로불린 분자의 다각적인 레퍼토리를 만들 역량을 지닌다.
한 구현예에서, 사용된 인공 유전자자리는 적어도 하나의 인공 불변 영역 유전자를 포함한다. 예를 들어, 예시의 인공 C 불변 영역 유전자는, 인간 IgG CH1 도메인 및 래트 IgG CH2 및 CH3 도메인을 인코딩하는 불변 영역 유전자이다. 따라서, 이러한 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 분자의 다각적인 레퍼토리를 만들 역량을 지니며, 이는 인간 성분 및 비인간 성분 모두를 포함하는 인공 불변 영역 및 인간 이디오타입을 가진 항체를 포함한다.
인공 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 벡터는 수령자 세포 또는 세포들에 도입한 다음, 무작위 혼입 또는 타겟팅된 혼입에 의해 수령자 세포 또는 세포들의 게놈에 혼입된다.
무작위 혼입에 있어서, 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 벡터는 표준 트랜스제닉 기술에 의해 수령자 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 트랜스제닉 벡터를 수정된 난모세포의 전핵에 직접 주입할 수 있다. 트랜스제닉 벡터는 또한 난모세포 수정 전 트랜스제닉 벡터를 가진 정자의 공동-인큐베이션에 의해 도입될 수 있다. 트랜스제닉 동물은 수정된 난모세포로부터 발달할 수 있다. 트랜스제닉 벡터를 도입하는 또 다른 방법은 배아 줄기 세포 또는 기타 다능성 세포 (예를 들어 원시 생식 세포) 를 트랜스펙션한 다음 후속해서 유전자 조작된 세포를 발달 중인 배아에 주입하는 것에 의한 것이다. 대안적으로, 트랜스제닉 벡터 (나상 또는 촉진 시약과 조합됨) 를 발달중인 배아에 직접 주입할 수 있다. 결국, 키메라 트랜스제닉 동물은 적어도 일부의 트랜스제닉 동물 체세포의 게놈에 혼입된 인공 Ig 도입유전자를 포함하는 배아로부터 생산된다. 또 다른 구현예에서는, 트랜스제닉 벡터가 세포 게놈에 도입되어, 동물이 핵 이식 클로닝에 의해 트랜스펙션된 세포로부터 유도된다.
바람직한 구현예에서, 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 도입유전자는 수령자 세포 (예컨대 수정된 난모세포 또는 발달 중인 배아) 의 게놈에 무작위로 혼입된다. 수령자 세포는 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화되어져 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 동물에서 유도된다. 대안적으로, 인공 면역글로불린 유전자자리를 보유한 트랜스제닉 동물은 하나 이상의 메가뉴클레아제의 작용에 의해 불활성화되어져 있는 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리를 가진 트랜스제닉 동물과 교배될 수 있다. 사용된 특정 방법과는 관계없이, 바람직한 구현예에서, 내생적 Ig 중쇄 및/또는 Ig 경쇄에 있어서 무접합형이고 따라서 내생적 면역글로불린을 생산할 수 없고, 트랜스제닉 면역글로불린을 생산할 수 있는 자손이 수득된다.
타겟팅된 혼입에 있어서, 트랜스제닉 벡터는 배아 줄기 세포, 기타 다능성 세포 또는 이미 분화된 체세포와 같은 적절한 수령자 세포로 도입될 수 있다. 후에, 도입유전자가 상동 재조합으로 동물 게놈에 혼입되어, 해당 내생적 Ig 유전자자리를 대체한 세포가 표준 방법으로 선택될 수 있다. 이때 선택된 세포는 제핵된 핵 이식 단위 세포, 예를 들어 난모세포 또는 배아 줄기 세포, 전능성이고 작용적 신생아를 형성할 수 있는 세포와 융합될 수 있다. 융합은 익히 확립된 종래의 기술에 따라 수행된다. 예를 들어, 문헌 [Cibelli et al., Science (1998) 280:1256; Zhou et al. Science (2003) 301 : 1179] 을 참조한다. 난모세포의 제핵 및 핵 이식이 또한 주입 피펫을 이용해 미세수술로 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wakayama et al., Nature (1998) 394:369] 을 참조한다.) 이어서, 수득한 세포를 적절한 배지에서 배양하고, 이를 트랜스제닉 동물을 생산하기 위해 동기화된 수령자에 이동한다. 대안적으로는, 선택된 유전자 조작된 세포를, 발달 중인 배아에 주입할 수 있으며, 이를 후속해서 키메라 동물 내로 발달시킨다.
한 구현예에서, 메가뉴클레아제를 사용해 타겟 부위에서 이중 가닥 DNA 절단을 통한 상동 재조합의 빈도를 증가시킨다. 내생적 면역글로불린 유전자자리로의 혼입을 위해, 부위 특이적 메가뉴클레아제를 사용할 수 있다. 한 구현예에서, 내생적 Ig 유전자자리를 타겟팅하는 메가뉴클레아제를 사용하여, 내생적 Ig 유전자자리 또는 그의 일부를 인공 Ig 유전자자리 또는 그의 일부로 상동 재조합 및 대체하는 빈도를 증가시킨다.
한 구현예에서, 트랜스제닉 동물은 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고, 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함한다.
인공 Ig 유전자자리
본 발명은 인공 Ig 유전자자리, 및 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물의 생산에서 상기 인공 Ig 유전자자리의 용도에 관한 것이다.
각각의 인공 Ig 유전자자리는 다수의 면역글로불린 유전자 분절을 포함하는데, 이는 적어도 하나의 V 영역 유전자 분절, 하나 이상의 J 유전자 분절, 하나 이상의 D 유전자 분절 (중쇄 유전자자리의 경우임), 및 하나 이상의 불변 영역 유전자를 포함한다. 본 발명에서, V 유전자 분절 중 적어도 하나는 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열을 인코딩한다. 따라서, 상기 트랜스제닉 동물은 면역글로불린 분자의 다각화된 레퍼토리를 만들 수 있는 역량을 지니는데, 여기에는 인간 이디오타입을 가진 항체가 포함된다. 중쇄 유전자자리에서, 인간 또는 비인간-유래의 D-유전자 분절이 인공 Ig 유전자자리에 포함될 수 있다. 그러한 유전자자리에서 상기 유전자 분절은 서로 간 재배열되지 않은 배위 (또는 "생식 계열 배위") 또는 부분적 또는 완전히 재배열된 배위로 나란히 놓여진다. 인공 Ig 유전자자리는 대상체 동물에서 유전자 재배열 (유전자 분절이 완전히 재배열되지 않은 경우임) 을 행하는 역량을 가지므로 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린의 다각화된 레퍼토리를 만든다.
프로모터, 인핸서, 스위치 영역, 재조합 신호 등과 같은 조절 요소는 인간 또는 비인간 기원일 수 있다. 요구되는 것은 인공 유전자자리가 작용적이 되도록, 상기 요소가 관심 동물종에서 작동가능해야 하는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 숙주 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어 인간 이디오타입을 가진 중쇄의 다각화된 레퍼토리를 만들 수 있는 인공 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 구축물을 제공한다. 도입유전자의 인공 중쇄 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역을 포함한다. 바람직하게는, V-영역은 적어도 약 5-100 인간 중쇄 V (또는 "VH") 유전자 분절을 포함한다. 상기에서 기술한 바와 같이, 인간 VH 분절은 인간 VH 유전자 분절의 천연 발생 서열, 인간 VH 유전자 분절의 천연 발생 서열의 변성형뿐 아니라 인간 중쇄 V 도메인 폴리펩티드와 실질적으로 (즉, 적어도 약 85%-95%) 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 합성 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 인공 중쇄 유전자자리는 적어도 하나의 또는 수 개의 래트 불변 영역 유전자, 예를 들어, Cδ, Cμ 및 Cγ (Cγ 하부부류의 임의의 것 포함) 를 포함한다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 인공 중쇄 유전자자리는 인공 불변 영역 유전자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 인공 불변 영역 유전자는 인간 CH1 도메인 및 래트 CH2 CH3 도메인, 또는 인간 CH1 및 래트 CH2, CH3 및 CH4 도메인을 인코딩한다. 인간 CH1 도메인을 가진 하이브리드 중쇄는 효과적으로 완전한 인간 경쇄와 쌍을 이룬다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 인공 중쇄 유전자자리는 CH1 도메인이 결핍된 인공 불변 영역 유전자를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 인공 불변 영역 유전자는, CH1 도메인은 결핍되나, CH2, 및 CH3, 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인을 포함하는, 끝이 잘린 (truncated) IgM 및/또는 IgG 를 인코딩한다. CH1 도메인이 결핍된 중쇄는 Ig 경쇄와 효과적으로 쌍을 이룰 수 없어, 중쇄 독존의 항체를 형성한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 숙주 동물에서 유전자 재배열을 행할 수 있어, 인간 이디오타입을 가진 경쇄의 다각화된 레퍼토리를 만들 수 있는 인공 경쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 구축물을 제공한다. 도입유전자의 인공 경쇄 유전자자리는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역, 예를 들어, 적어도 하나의 인간 VL 유전자 및/또는 적어도 하나의 재배열된 인간 VJ 분절을 가진 V-영역을 포함한다. 바람직하게는, V-영역은 적어도 약 5-100 인간 경쇄 V (또는 "VL") 유전자 분절을 포함한다. 시종일관하여, 인간 VL 분절은 인간 VL 유전자 분절의 천연 발생 서열, 인간 VL 유전자 분절의 천연 발생 서열의 변성형뿐 아니라, 인간 경쇄 V 도메인 폴리펩티드와 실질적으로 (즉, 적어도 약 85%-95%) 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 합성 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 인공 경쇄 Ig 유전자자리는 적어도 하나의 래트 C 유전자를 가진 C-영역 (예를 들어, 래트 Cλ 또는 Cκ) 을 가진다.
본 발명의 또다른 측면은 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은, Ig 유전자자리 또는 이의 단편을 단리하고, 이를 인간 V 영역 요소를 인코딩하는 서열을 포함하는 1 또는 수 개의 DNA 단편과 조합하는 것을 포함한다. Ig 유전자 분절(들)은, 인공 Ig 유전자자리 또는 그의 부분에, 결찰 또는 상동 재조합에 의해, 상기 유전자자리가 대상체 동물에서 유효한 유전자 재배열을 행하는 역량을 보유하도록 하는 방식으로 삽입된다.
바람직하게는, 비인간 Ig 유전자자리는, 이의 게놈 DNA 로부터 제조된, 플라스미드, 코스미드, YAC 또는 BAC, 등의 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리된다. YAC 클론은 2 이하의 메가염기 (megabase) 의 DNA 단편을 가질 수 있어, 전체의 동물 중쇄 유전자자리 또는 그의 큰 부분은 하나의 YAC 클론에서 단리될 수 있거나 또는 하나의 YAC 클론에 함유되도록 재구축될 수 있다. BAC 클론은 더 작은 크기 (약 50 ~ 500 kb) 의 DNA 단편을 가질 수 있다. 그러나, Ig 유전자자리의 중복 단편들을 포함하는 다수의 BAC 클론들은 따로따로 변경될 수 있고 이후에 동물 수령자 세포 내로 함께 주입될 수 있는데, 이때 중복 단편들은 수령자 동물 세포에서 재조합되어 연속의 Ig 유전자자리를 형성한다.
인간 Ig 유전자 분절은 상동 재조합을 통해서 DNA 단편들의 결찰 또는 DNA 단편들의 삽입을 포함하는 각종 방법으로 벡터 (예를 들어 BAC 클론) 상에 Ig 유전자자리로 혼입될 수 있다. 인간 Ig 유전자 분절의 혼입은, 인간 Ig 유전자 분절이 도입유전자에서 숙주 동물 서열과 작동적으로 연결되어 작용적인 인간화 Ig 유전자자리, 즉 인간 이디오타입을 가진 항체의 다각화된 레퍼토리의 제작을 이끄는 유전자 재배열을 행할 수 있는 Ig 유전자자리를 생산하는 방식으로 수행된다. 상동 재조합이 높은 빈도로 일어나는 박테리아, 효모 및 기타 세포에서 상동 재조합은 수행할 수 있다. 조작된 YAC 및 BAC 는 세포에서 용이하게 단리될 수 있으며 트랜스제닉 동물을 생산하는데 사용될 수 있다.
인간 이디오타입이 있는 면역글로불린
인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물이 일단 만들어지면, 상기 동물을 항원으로 면역화시켜 항원에 대항하는 면역글로불린 및 항체 제제를 용이하게 수득할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "다클론 항혈청 조성물" 은 친화도 정제된 다클론 항체 제제를 포함한다.
각종 항원이 트랜스제닉 동물을 면역화하는데 사용될 수 있다. 이러한 항원에는 미생물, 예를 들어 바이러스 및 단세포 유기체 (예컨대 박테리아 및 진균류), 살아있는, 약독화 또는 죽은 미생물 단편, 또는 미생물에서 단리된 항원성 분자가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
동물을 면역화하는데 사용되기에 바람직한 박테리아성 항원은, 황색포도구균 (Staphylococcus aureus), 예컨대 협막 다당류 유형 5 및 8, 알파 독소의 정제된 항원, 부착소 결합 단백질, 콜라겐 결합 단백질, 및 섬유결합소 결합 단백질 등의 독력 인자의 재조합 버젼을 포함한다. 바람직한 박테리아성 항원은 또한 황색포도구균, 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 장내구균 (enterococcus), 장내세균 (enterobacter), 및 폐렴막대균 (Klebsiella pneumoniae), 또는 이들 박테리아 세포의 배양 상청액의 약독화 버젼을 포함한다. 면역화에 사용될 수 있는 기타 박테리아성 항원은, 정제된 지질다당류 (LPS), 협막 항원, 협막 다당류 및/또는 녹농균, 장내구균, 장내세균, 및 폐렴막대균의 내독소 및 외독소, 외막 단백질, 섬유결합소 결합 단백질의 재조합 버젼을 포함한다.
진균류에 대한 항체 생산을 위한 바람직한 항원은 진균류 또는 그의 외막 단백질의 약독화 버젼을 포함하며, 상기 진균류는 이에 제한되는 것은 아니나, 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 파라프실로시스 (Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 및 크립토코쿠스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans) 를 포함한다.
바이러스에 대항하는 항체를 생산하기 위해서 면역화에서 사용하기에 바람직한 항원은, 호흡기세포융합 바이러스 (RSV) (특히 F-단백질), C 형 간염바이러스 (HCV), B 형 간염바이러스 (HBV), 거대세포바이러스 (CMV), EBV, 및 HSV 를 포함하나 이에 제한되지 않는 바이러스의 약독화 버젼 및 외피 단백질을 포함한다.
암에 대해 특이적인 항체는, 단리된 종양 세포 또는 종양 세포주뿐 아니라, 이에 제한되는 것은 아니나 Her-2-neu 항원 (유방암 치료에 유용한 항체에 대한 것); CD20, CD22 및 CD53 항원 (B 세포 림프종 치료에 유용한 항체에 대한 것), 전립선 특이 막 항원 (PMSA) (전립선암 치료에 유용한 항체에 대한 것) 및 17-1A 분자 (결장암 치료에 유용한 항체에 대한 것) 를 포함하는 종양과 관련된 항원으로 트랜스제닉 동물을 면역화함으로써 생산할 수 있다.
항원은 임의의 편리한 방법으로 애쥬번트 (adjuvant) 와 함께 또는 없이 트랜스제닉 동물에 투여될 수 있으며, 미리 예정된 스케쥴에 따라 투여될 수 있다.
단일클론 항체를 만들기 위해서는, 비장 세포를 면역화된 트랜스제닉 동물에서 단리하고, 형질전환된 세포주와 세포융합시켜 하이브리도마 생산을 하여 사용하거나, 또는 항체를 인코딩하는 cDNA 를 표준 분자 생물 기술로 클로닝해 트랜스펙션된 세포에서 발현시킨다. 단일클론 항체 생산 절차는 당업계에 익히 확립되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 출원 0 583 980 A1 ("Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"), U.S. 특허 No. 4,977,081 ("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof), WO 97/16537 ("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof), 및 EP 0491 057 B1 ("Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G") 을 참조하는데, 이들 문헌의 개시물은 본원에서 참조인용되고 있다. 클로닝된 cDNA 분자로부터 단일클론 항체의 시험관 내 생산은 문헌 [Andris-Widhopf et al., "Methods for the generation of chicken monoclonal fragments by phage display", J Immunol Methods 242:159 (2000)], 및 문헌 [Burton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995)] 에 기술되어 있다.
일단 인간 이디오타입을 가진 키메라 단일클론 항체가 생산되면, 이러한 키메라 항체는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 완전한 인간 항체로 용이하게 전환될 수 있다. 완전한 인간 단일클론 항체는 인간 내에서는 면역원성이지 않아, 인간 대상체의 치료학적 치료에 사용하기에 적당하다.
본 발명의 항체는 중쇄 독존의 항체를 포함한다.
한 구현예에서, 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리가 결핍되어 있고 인공 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물을 항원으로 면역화시켜, 항원에 특이적으로 결합하는 중쇄 독존의 항체를 생산한다.
한 구현예에서, 본 발명은 상기 동물로부터 유래되는 단일클론 항체를 생산하는 세포 또한 이로부터 유래된 핵산을 제공한다. 또한, 이로부터 유래된 하이브리도마를 제공한다. 또한, 완전한 인간의 중쇄 독존의 항체, 및 이로부터 유래된, 상기의 인코딩 핵산을 제공한다.
중쇄 독존의 항체에 대한 교시는 당업계에서 발견된다. 예를 들어, PCT 공보 WO02085944, WO02085945, WO2006008548, 및 WO2007096779 를 참조한다. 또한 US 5,840,526; US 5,874,541 ; US 6,005,079; US 6,765,087; US 5,800,988; EP 1589107; WO 9734103; 및 US 6,015,695 를 참조한다.
약학적 조성물
본 발명의 추가 구현예에서, 정제된 단일클론 또는 다클론 항체는 환자에게 투여하기에 적합한 적절한 약학적 담체와 함께 혼합되어 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물로 치료되는 환자는, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이나, 수의과적 용도도 또한 고려된다.
본 약학적 조성물에서 활용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체는 임의의 및 모든 용매, 분산매질, 등장제 등일 수 있다. 임의의 통상적인 매질, 시약, 희석제 또는 담체가 수령자에 또는 그 안에 포함된 항체의 치료학적 유효성에 불리한 경우를 제외하고는, 본 발명의 약학적 조성물 내에서 이를 사용하는 것은 적절하다.
담체는 액체, 반-고체, 예를 들어 페이스트 또는 고체 담체일 수 있다. 담체의 예는 오일, 물, 염수액, 알코올, 당, 겔, 지질, 리포좀, 수지, 다공성 매트리스, 결합제, 충전제, 코팅제, 보존제 등 또는 이들의 조합을 포함한다.
치료 방법
본 발명의 추가 측면에서, 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 영장류 (인간 대상체가 특히 바람직한 구현예임) 의 질병을 치료하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 그러한 질병을 치료하기에 적합한 본 발명의 정제된 항체 조성물의 투여에 의한 것이다.
항체 조성물은 질병을 일으키거나 또는 그의 원인이 되거나, 또는 바람직하지 않거나 또는 비정상인 면역반응을 도출하는 인간 신체 조직에서 항원체에 결합하여, 중화 또는 조절하는데 사용될 수 있다. "항원체" 는 본원에서 단백질을 포함하는 임의의 가용성 또는 세포 표면 결합형 분자뿐 아니라 적어도 항체에 결합할 수 있고, 바람직하게는 또한 면역 반응을 자극할 수도 있는 세포 또는 감염병-유발 유기체 또는 시약을 포함하는 것으로 정의된다.
단일요법으로서 또는 화학요법과 병용되는 감염체에 대한 항체 조성물의 투여로, 감염 입자는 제거된다. 항체의 단일 투여는 다수의 감염 입자를 일반적으로 10 내지 100 배, 더욱 통상적으로는 1000 배 초과로 감소시킨다. 마찬가지로, 단일요법으로서 또는 화학요법과 병용되어 활용되는 악성 질환을 앓고 있는 환자에 있어서 항체 요법은 다수의 악성 세포를 일반적으로 10 내지 100 배, 또는 1000 배 초과로 감소시킨다. 감염 입자, 악성 세포 등의 완전한 제거를 확신하도록 충분한 시간에 걸쳐서 요법을 반복할 수 있다. 몇몇의 사례에서는, 항체 제제를 이용한 요법은, 감염 입자 또는 바람직하지 않은 세포가 검출되지 않은 채 연장된 시간 기간 동안 계속될 것이다.
마찬가지로, 면역 반응의 조절을 위한 항체 요법의 이용은 치료학적 항체의 단일 또는 다중 투여로 이루어질 수 있다. 요법은 임의의 질병 증상 부재 하에서 연장된 시간 기간 동안 계속될 수 있다.
대상체 치료는 감염병 또는 악성종양을 억제하기에 충분한 투약으로 화학요법과 함께 활용될 수 있다. 자가면역 질환 환자 또는 이식 수령자에 있어서, 항체 요법은 면역 반응을 억제하기에 충분한 투약으로 면역억제 요법과 함께 활용될 수 있다.
모든 인용문은 그 전체가 본원에서 참조로 명백하게 삽입되었다.
[실시예]
실험
래트 면역글로불린 서열에 특이적인 귀소 엔도뉴클레아제의 유도된 진화
래트 IgM 엑손 서열을 분석하여, 조작된 귀소 엔도뉴클레아제에 대한 여러 타겟 절단 서열을 확인하였다. 귀소 엔도뉴클레아제 I-Scel 을 이용하여, 두 개의 타겟 서열을 동정하였는데, 그 중 하나는 래트 IgM 엑손 II (CGTGGATCACAGGGGTCT) 내에 있었고, 나머지 하나는 래트 IgM 엑손 III (CTGGGATAACAGGAAGGA) 내에 있었다. 이들 부위는 I-Scel 의 천연 인지 서열 (TAGGGATAACAGGGTAAT) 과 61% (18 개의 염기 중 11 개) 서열 상동성을 공유한다.
표 1. 래트 IgM 엑손 내 타겟 서열 (상이한 뉴클레오티드는 밑줄 그음)
이들 타겟 서열에 대해 특이적인 귀소 엔도뉴클레아제의 조작에 있어서, 본 출원인은 효소 DNA 절단물을 살아 있는 숙주 세포와 결합하는 귀소 엔도뉴클레아제의 유도된 진화를 위해 매우 민감한 선택을 이용했다 (Chen 및 Zhao 의 문헌 "Nucleic Acid Research 33(18):e154, 2005 "에 자세히 기술됨). 시험관 내 공진화 (coevolution) 전략을 사용하여, 타겟 서열 특이성을 지닌 I-Scel 변이체를 조작했다. 표 2 에서 보듯이, 타겟 서열 T3 을 위해서, 두 개의 새로운 서열, 즉 T3i1 및 T3i2 를 중간체 서열로서 선택하였으며, 한편 타겟 서열 T4 를 위해서는, 두 개의 새로운 서열 T4i1 및 T4i2 를 중간체 서열로 선택하였다. T3i1 및 T4i1 서열을 리포터 플라스미드로 클로닝하여 p11-LacY-T3i1 및 p11-LacY-T4i1 를 각각 수득하였다.
표 2. 3 단계에서의 서열 (상이한 뉴클레오티드는 밑줄 그음)
T3i1 또는 T4i1 서열 특이성을 지닌 I-Scel 돌연변이를 수득하기 위해, 분자 모형화를 먼저 실시하여, 사용되는 잔기를 동정하였고, 포화 변이유발 (saturation mutagenesis) 을 통해 포커싱된 라이브러리를 만들었다. 도 2 에서 보듯이, I-Scel 은 DNA 의 작은 홈 (minor groove) 에 놓인 느슨한 루프 (loop) 를 통해 T3i1 또는 T4i1 의 3' 말단에 결합한다. 잔기 Gly13, Pro14, Asn15 및 Lys20 는 상기 3' 말단에 가깝고, Asn15 은 야생형 인지 서열의 3' 말단에서 마지막 티민에 수소 결합을 통해 직접 결합한다. 이들 4 개의 선택된 잔기에서 가능한 모든 아미노산 치환 조합물을 포함하는 돌연변이의 라이브러리를 포화 변이유발을 통해 구축하였다. 충분히 큰 라이브러리를 생산하기 위해, 수 회의 시도를 거쳐 결찰 반응 및 DNA 형질전환 절차를 최적화하였다. 2.9 10 6 돌연변이로 이루어진 라이브러리를 만들었다.
T3i1 서열에 대해 활성이 증가된 I-Scel 돌연변이에 대해서, 라이브러리를 스크리닝했다. 라운드 O (야생형 I-Scel) 과 비교했을 때, 제 1 라운드의 스크리닝은 세포 생존률이 10 배 증가하였기 때문에 T3i1 서열에 대한 활성이 증가한 돌연변이를 나타내었다. 라운드 2 및 3 에서 잠재적으로 양성인 돌연변이의 보강으로 세포 생존률에서의 추가 개선을 보였다. 마찬가지로, T4i1 서열에 대한 활성이 증가된 I-Scel 돌연변이에 대해 라이브러리를 스크리닝했다. 돌연변이의 스크리닝 결과 T4i1 서열에 대해 활성이 증가된 돌연변이를 수득했다.
병행하여, 인지 서열의 5' 말단을 타겟팅하는 I-Scel 돌연변이의 제 2 의 라이브러리를 고안했다. 포화 변이유발을 이용해 생산된 제 1 의 라이브러리를 I-Scel 인지 서열의 4 개의 뉴클레오티드의 3'말단과 상호작용하는 잔기들 상에 포커싱하였다. 분자 모형을 기반으로 하면, Trp149, Asp150, Tyr151 및 Asn152 은 5'말단 뉴클레오티드에 의해 형성된 큰 홈 (major groove) 에 놓여 있다. Asn152 은 수소 결합을 통해 T(-7) 과 직접 상호작용한다. Asp150 및 Tyr152 는 물 분자를 통해 간접적으로 A(-6) 와 맞은편의 T 와 상호작용한다. Trp149 및 Tyr151 는 포스페이트 주쇄 (backbone) 와 상호작용한다. 따라서 이들 4 개의 잔기는 I-Scel 의 서열 특이성에서 중요해, 이들 4 개의 잔기 상에서 동시적인 포화 변이유발을 행하여 제 2 의 I-Scel 돌연변이 라이브러리를 만들었다.
이들 효소의 추가 공진화로 래트 IgM 엑손 II 및 III 내 타겟 서열 (CGTGGATCACAGGGGTCT 및 CTGGGATAACAGGAAGGA) 에 대해 특이적인 신규한 메가뉴클레아제를 생산한다.
정의된 서열 특이성을 가진 I-Cre 의 조작
신규한 타겟 서열에 대해 특이적인 귀소 엔도뉴클레아제의 조작에 있어서, 본 출원인은 효소 DNA 절단물을 살아 있는 숙주 세포와 결합하는 귀소 엔도뉴클레아제의 유도된 진화를 위해 매우 민감한 선택을 이용했다 (Chen 및 Zhao 의 문헌 "Nucleic Acid Research 33(18):e154, 2005 "에 자세히 기술됨). 게다가, 정의된 서열 특이성을 가진 I-Crel 돌연변이를 조작하기 위한 일반적인 전략을 고안했다. I-Crel 은 모조의 팔린드롬 방식의 타겟 서열을 인지한다. 팔린드롬의 염기는 I-Crel 이 직접 인지하며, 변경되기 어려울 수 있다 (J. Mol. Biol., 280, 345- 353) (도 4).
이러한 특성은 비(非)팔린드롬 서열을 인지하는 I-Crel 유도체의 직접 조작을 방해한다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 타겟 서열을 왼쪽으로 절반 (상류로 절반) 및 오른쪽으로 절반 (하류로 절반) 나누었다. I-Crel 을 왼쪽으로 절반인 팔린드롬 및 오른쪽으로 절반인 팔린드롬 각각의 중간체 서열에 대해 최적화한다. (도 4). 이때, 중간체 서열에 대해 최적화된 I-Crel 돌연변이를 타겟 서열 팔린드롬을 인지하도록 조작한다. 종국에는, 왼쪽 절반에 대해 최적화되고 오른쪽 절반으로 최적화된 각각의 I-Crel 돌연변이가 공동-발현되어 타겟 서열을 절단할 것이다. 게다가, 왼쪽 절반이 최적화된 돌연변이와 오른쪽 절반이 최적화된 돌연변이의 폴리펩티드 링커에 의한 융합이 조사된다.
귀소 엔도뉴클레아제 I-Crel 의 천연 인지 서열과, 59% 의 서열 상동성을 공유하는 엑손 IV 내 타겟 서열 (CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG) 을 동정했다. 후속해서, 본래의 ICrel 타겟 서열 내 팔린드롬 염기의 상동성을 기준으로, 2 개의 서열인 T5 및 T6 를 I-Crel 조작을 위한 타겟 서열로서 선택했다.
I-Crel 인지 서열 및 2 개의 타겟 서열:
2 개의 타겟 서열인 T5 및 T6 을 리포터 플라스미드 내로 클로닝했다. I-Crel 유전자를 pTrc 플라스미드 내로 클로닝하고 서열화하여, PCR 증폭 동안 어떠한 돌연변이도 도입되지 않았다는 점을 확인했다. I-Crel 선택 시스템으로 세포 생존률에 대해 평가한다.
또한, 분자 모형화를 수행하고, DNA 기질에 직접 접촉하는 단백질 잔기를 동정했다. 또한, 본 출원인은 시험관 내 공동-진화 실험을 위한 중간체 서열을 고안했다.
포화 변이유발을 위한 타겟 서열
후속해서, ICrel 돌연변이의 라이브러리를 생산하고, 신규한 타겟 서열을 가진 ICrel 유도체에 대해서 스크리닝했다. 이들 효소의 추가 공진화로 래트 IgM 의 엑손 IV 내 타겟 서열 (CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG) 에 대해 특이적인 신규한 메가뉴클레아제를 생산한다.
징크-핑거 뉴클레아제의 공법
징크-핑거 단백질 (ZFP) 을 래트 IgM (엑손 1-4) 를 인코딩하는 서열에 대하여 고안하고, 하기에 기술된 바와 같이 어셈블링하여 (assembling), 하기 ZFP 부분을 수득했다: Zhang, L. et al. Synthetic zing finger transcription factor action at an endogenous chromosomal site, Activation of the human erythropoietin gene. J. Biol. Chem 275:33850-33860, 2000, 및 Liu, P. Q. et al. Regulation of an endogenous locus against a panel of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. Activation of vascular endothelial growth factor. J Biol. Chem. 2765:11323-11334, 2001).
ZFP 를 인코딩하는 DNA 를 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 래트 C6 세포를 American Type Culture Collection 로부터 입수하고, 권고되는 대로 5% 적격 송아지 태아 혈청 (FCS, Hyclone), 15% 말혈청 (Invitrogen) 및 5mM 글루타민으로 보충된 F-12 배지 (Invitrogen) 에서 키웠다. 세포를 TrypLE Select 프로테아제 (Invitrogen) 를 이용하여 플라스틱제품에서 분리했다. 트랜스펙션을 위해, 200,000 C6 세포를 400ng 플라스미드 DNA 및 20μL Amaxa Solution SF 와 혼합했다. 세포를 Amaxa Nucleofector II Shuttle 에서 프로그램 96 FF-137 을 이용해 트랜스펙션시킨 다음 0.1 L 의 따뜻한 보충된 F-12 배지로 회수하였다. 트랜스팩션 후 3 및 9 일에, 세포를 수집하고 염색체 DNA 를 Quick Extract Soultion 1.0 (Epicentre) 를 이용해 생산하였다. IgM 유전자자리의 적절한 영역을 Accuprime High-fidelity DNA 폴리머라아제 (Invitrogen) 를 이용해 PCR 증폭했다. PCR 반응물을 94°로 가열한 다음, 서서히 실온으로 냉각시켰다. 약 200ng 의 어닐링된 DNA 를 0.33μL CEL-I 효소 (Transgenomic) 와 혼합하고, 20 분 동안 42°에서 인큐베이션했다. 반응 생산물을 1X Tris-borate-EDTA 버퍼 중 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석했다. 절단 활성을 입증하는 전형적인 예를 도 6 에 나타낸다.
메가뉴클레아제를 인코딩하는 발현 플라스미드를 이용한 불활성화된 내생적 중쇄 유전자자리가 있는 래트의 생산
래트 Cμ엑손에 대해 특이적인 메가뉴클레아제를 인코딩하는 cDNA 서열을, 테트라사이클린 오퍼레이터 서열에 의해 발현이 조절되는 발현 벡터 내로 클로닝한다. 플라스미드 DNA 를 제한 효소 소화로 선형화하고 정제한다. 래트 난모세포를, 테트라사이클린-반응성 역 트랜스활성자를 인코딩하는 도입유전자를 가진 래트 유래의 정자와 수정시킨다. 정제된 플라스미드 DNA 를 상기 수정된 래트 난모세포의 전핵에 주입한다. 이어서, 래트 배아를 양엄마에게 이동시키고 분만시켰다. 신생아를 조직 샘플에서 단리된 DNA 를 이용하는 PCR 로써 메가뉴클레아제-인코딩 도입유전자의 존재에 대해 분석했다. 수컷의 트랜스제닉 시조 동물이 성적 성숙기에 도달했을 때, 이들을 4 달 동안 가두어 둔다. 트랜스제닉 동물 내 메가뉴클레아제의 발현을, 1 내지 7 일 동안 독시사이클린을 매일 투여하여 유도한다. 후속해서, 정자를 일주일에 2 회 수집하여 PCR 로 분석한다. 돌연변이 정자를 생산하는 수컷의 동물을 번식에 이용한다. 돌연변이된 래트 Cμ 를 가진 자손을, 조직 샘플의 PCR 분석으로 동정한다.
특이적인 메가뉴클레아제를 인코딩하는 플라스미드 DNA 를 가진 수정된 난모세포의 미세주입에 의한 불활성화된 내생적 중쇄 유전자자리를 가진 래트의 생산.
래트 Cμ 엑손에 특이적인 메가뉴클레아제를 인코딩하는 cDNA 서열을, CAG-프로모터에 의해 발현이 조절되는 발현 벡터 내에 클로닝한다. 정제된 플라스미드 DNA 를 수정된 래트 난모세포의 전핵에 주입한다. 후속해서, 래트 배아를 양모에게 이동시키고, 분만시킨다. 신생아를 PCR 및 직접 서열화에 의해 돌연변이된 IgM 엑손 존재에 대해 분석한다. 대안적으로, 돌연변이된 IgM 엑손을 가진 세포를 함유하는 동물을, CEL-I 효소 함유 가열 및 냉각 PCR 생산물의 인큐베이션 다음 겔 전기영동으로 동정한다.
Claims (34)
- 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 적어도 하나의 메가뉴클레아제를 발현시켜, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 것을 포함하는 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포를 생산하는 방법으로, 이때 상기 메가뉴클레아제가 상기 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지하는 방법.
- 제 1 항의 방법에 따라 생산된 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포, 또는 그의 생식 세포 자손으로부터 트랜스제닉 동물을 유도하는 것을 포함하는 적어도 하나의 생식계열의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물의 생산 방법으로, 이때 상기 트랜스제닉 동물은 조류, 설치류 및 족제비류로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 상기 생존가능한 생식 세포가 인공 Ig 유전자자리를 추가로 포함하는 방법으로, 이로 인해 상기 트랜스제닉 동물이 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 상기 생존가능한 생식 세포에 또는 그의 생식 세포 자손 또는 그로부터 유래된 수정된 난모세포 또는 배아에 인공 Ig 유전자자리를 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법으로, 이로 인해 상기 트랜스제닉 동물이 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 방법.
- 제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 상기 생존가능한 생식 세포로부터 트랜스제닉 동물을 유도하는 것이, 상기 생존가능한 생식 세포 또는 그의 생식 세포 자손을 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 배우자와 조합하는 것을 포함하는 방법으로, 이로 인해 상기 트랜스제닉 동물이 인공 Ig 유전자자리를 포함하는 방법.
- 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 Ig 유전자자리가 (i) 생식계열 또는 초돌연변이된 인간 V-영역 아미노산 서열를 인코딩하는 적어도 하나의 인간 V 유전자 분절을 가진 V-영역; (ii) 하나 이상의 J 유전자 분절; 및 (iii) 하나 이상의 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 방법으로, 이때 상기 인공 Ig 유전자자리는 상기 생식 세포에서 유도된 트랜스제닉 동물에서 작용적이고 유전자 재배열을 행할 수 있어 인공 면역글로불린의 레퍼토리를 만들 수 있는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 배우자가 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 갖는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 메가뉴클레아제 타겟 서열이 상기 적어도 하나의 내생적 Ig 유전자자리 내 J 유전자 분절에 또는 그 부근에 존재하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 메가뉴클레아제 타겟 서열이 면역글로불린 불변 영역 유전자에 또는 그 부근에 존재하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에 제 2 의 메가뉴클레아제를 발현시키는 것을 추가로 포함하는 방법으로, 이때 상기 제 2 의 메가뉴클레아제가 상기 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아가 상기 메가뉴클레아제를 인코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 발현 조절 영역을 포함하는 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하며, 이때 상기 메가뉴클레아제가 상기 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 상기 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물의 발현을 유도함으로써 발현되는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물의 발현을 유도하는 단계를 반복하는 것을 포함하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아가 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 제 2 의 유도성 발현 조절 영역을 포함하는 제 2 의 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하고, 이때 상기 제 2 의 인코딩된 메가뉴클레아제는 상기 내생적 Ig 유전자자리에 존재하는 제 2 의 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지하고, 이때 상기 방법이 상기 생식 세포, 수정된 난모세포 또는 배아에서 상기 제 2 의 메가뉴클레아제-인코딩 핵산의 발현을 유도하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제 1 항에 따른 방법에 의해 생산된 적어도 하나의 불활성화된 내생적 Ig 유전자자리를 가진 생존가능한 생식 세포,
- 제 2 항에 따른 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 동물.
- 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 트랜스제닉 동물.
- 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물이 작용적인 내생적 Ig 경쇄 유전자자리를 결핍하고 있는 트랜스제닉 동물.
- 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물이 작용적인 내생적 Ig 중쇄 유전자자리를 결핍하고 있는 트랜스제닉 동물.
- 제 16 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물이 인간 이디오타입을 가진 면역글로불린을 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물.
- 제 16 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물이 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리를 결핍하고 있고, 인공 Ig 중쇄 유전자자리를 포함하며, 이때 상기 트랜스제닉 동물이 중쇄 독존의 항체를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물.
- 제 16 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물이 작용적인 Ig 경쇄 유전자자리를 결핍하고 있고, 작용적인 CH1 도메인을 인코딩하는 서열이 결핍되어 있는 적어도 하나의 C-영역 유전자를 갖는 적어도 하나의 Ig 중쇄 유전자자리를 포함하는 트랜스제닉 동물.
- 게놈 메가뉴클레아제 발현 구축물을 포함하는 트랜스제닉 동물로, 이때 상기 구축물이 메가뉴클레아제-인코딩 핵산에 작동적으로 연결된 유도성 발현 조절 영역을 포함하고, 이때 상기 인코딩된 메가뉴클레아제가 상기 트랜스제닉 동물의 내생적 Ig 유전자자리에 또는 그 부근에 존재하는 메가뉴클레아제 타겟 서열을 인지하고, 이때 상기 트랜스제닉 동물이 조류, 설치류 및 족제비류로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 동물.
- 제 22 항에 있어서, 상기 트랜스제닉 동물의 게놈이 적어도 하나의 인공 Ig 유전자자리를 추가로 포함하는 트랜스제닉 동물.
- 제 16 항에 따른 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것을 포함하는 항체 생산 방법.
- 제 24 항의 방법에 의해 생산된 다클론 항혈청 조성물.
- (i) 제 16 항에 따른 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것; (ii) 상기 트랜스제닉 동물로부터 단일클론 항체 생산 세포를 단리하는 것, 이때 상기 단일클론 항체 생산 세포가 상기 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; 및 (iii) 상기 단일클론 항체 생산 세포를 이용해 상기 면역원에 특이적으로 결합하는 상기 단일클론 항체를 생산하는 것 또는 상기 단일클론 항체 생산 세포를 이용해 상기 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 생산하는 것 및 상기 하이브리도마 세포를 이용해 상기 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함하는 단일클론 항체의 생산 방법.
- (i) 제 16 항에 따른 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것; (ii) 상기 트랜스제닉 동물로부터 단일클론 항체 생산 세포를 단리하는 것, 이때 상기 단일클론 항체 생산 세포는 상기 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; (iii) 상기 단일클론 항체 생산 세포로부터 상기 면역원에 특이적으로 결합하는 상기 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단리하는 것; 및 (iv) 상기 단일클론 항체 핵산을 이용해 상기 면역원에 특이적으로 결합하는 상기 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함하는 단일클론 항체의 생산 방법.
- 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 인간 이디오타입을 갖는 방법.
- (i) 제 16 항에 따른 트랜스제닉 동물을 면역원으로 면역화하는 것; (ii) 상기 트랜스제닉 동물로부터 단일클론 항체 생산 세포를 단리하는 것, 이때 상기 단일클론 항체 생산 세포가 상기 면역원에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산함; (iii) 상기 단일클론 항체 생산 세포로부터 상기 면역원에 특이적으로 결합하는 상기 단일클론 항체를 인코딩하는 단일클론 항체 핵산을 단리하는 것; (iv) 상기 단일클론 항체 핵산을 개질하여 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 재조합 핵산을 생산하는 것; 및 (v) 완전한 인간 단일클론 항체를 인코딩하는 상기 재조합 핵산을 이용해 인코딩된 완전한 인간 단일클론 항체를 생산하는 것을 포함하는 완전한 인간 단일클론 항체의 생산 방법.
- 제 26 항, 제 27 항 또는 제 29 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생산된 단일클론 항체.
- 인간 신체 성분 내 항원체를 중화하는 방법으로, 상기 방법이 상기 신체 성분을 제 25 항에 따른 다클론 항혈청 조성물과 접촉하는 것을 포함하고, 이때 상기 다클론 항혈청 조성물은 상기 항원체에 특이적으로 결합하고 중화하는 면역글로불린 분자를 포함하는 방법.
- 인간 신체 성분 내 항원체를 중화하는 방법으로, 상기 방법이 상기 신체 성분을 제 30 항에 따른 단일클론 항체와 접촉시키는 것을 포함하고, 이때 상기 단일클론 항체는 상기 항원체에 특이적으로 결합하고 중화하는 방법.
- 제 20 항 또는 제 21 항에 따른 트랜스제닉 동물을 면역화하는 것을 포함하는 중쇄 독존의 항체를 생산하는 방법.
- 제 33 항에 따른 방법에 의해 생산된 중쇄 독존의 항체.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US94161907P | 2007-06-01 | 2007-06-01 | |
US60/914,619 | 2007-06-01 | ||
US4432408P | 2008-04-11 | 2008-04-11 | |
US61/044,324 | 2008-04-11 | ||
PCT/US2008/065419 WO2008151081A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177002729A Division KR101886610B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20180090395A true KR20180090395A (ko) | 2018-08-10 |
KR102096731B1 KR102096731B1 (ko) | 2020-04-02 |
Family
ID=40111008
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177002729A KR101886610B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
KR1020187022408A KR102096731B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
KR1020097024974A KR101661357B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
KR1020157022196A KR101703299B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177002729A KR101886610B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020097024974A KR101661357B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
KR1020157022196A KR101703299B1 (ko) | 2007-06-01 | 2008-05-30 | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US8703485B2 (ko) |
EP (4) | EP2152880B1 (ko) |
JP (6) | JP5823690B2 (ko) |
KR (4) | KR101886610B1 (ko) |
CN (1) | CN101784664B (ko) |
AT (1) | ATE522611T1 (ko) |
AU (1) | AU2008259939B2 (ko) |
CA (2) | CA2688834C (ko) |
CY (1) | CY1120383T1 (ko) |
DK (3) | DK2602323T3 (ko) |
ES (3) | ES2664218T3 (ko) |
HK (1) | HK1135138A1 (ko) |
HR (1) | HRP20180506T1 (ko) |
HU (1) | HUE037302T2 (ko) |
IL (2) | IL202302A (ko) |
LT (1) | LT2602323T (ko) |
NZ (1) | NZ581396A (ko) |
PL (3) | PL2602323T3 (ko) |
PT (3) | PT2152880E (ko) |
SG (2) | SG10201509853UA (ko) |
SI (1) | SI2602323T1 (ko) |
WO (1) | WO2008151081A1 (ko) |
Families Citing this family (98)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1978032A3 (en) | 2004-07-22 | 2009-02-18 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Binding molecules |
LT2602323T (lt) * | 2007-06-01 | 2018-04-10 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Kompozicijos ir būdai endogeninių imunoglobulinų genams slopinti ir transgeniniams žmogaus idiotipo antikūnams gaminti |
US9273296B2 (en) * | 2008-09-08 | 2016-03-01 | Cellectis | Meganuclease variants cleaving a DNA target sequence from a glutamine synthetase gene and uses thereof |
PL2346994T3 (pl) * | 2008-09-30 | 2022-04-19 | Ablexis, Llc | Myszy knock-in do wytwarzania chimerycznych przeciwciał |
CA2745031C (en) * | 2008-12-04 | 2018-08-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
US20110314563A1 (en) * | 2008-12-18 | 2011-12-22 | Kingdon Craig R | Antibody production |
GB0905023D0 (en) | 2009-03-24 | 2009-05-06 | Univ Erasmus Medical Ct | Binding molecules |
HUE055817T2 (hu) | 2009-07-08 | 2021-12-28 | Kymab Ltd | Állatmodellek és terápiás molekulák |
US9445581B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-09-20 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
CN102711449B (zh) | 2009-12-10 | 2015-01-07 | 瑞泽恩制药公司 | 生产重链抗体的小鼠 |
US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
NZ719253A (en) | 2010-02-08 | 2022-08-26 | Regeneron Pharma | Common light chain mouse |
US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
CA3006800C (en) * | 2010-03-31 | 2022-10-04 | Ablexis, Llc | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
EP2582230A1 (en) * | 2010-06-17 | 2013-04-24 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
US10793829B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-10-06 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
US10662256B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-05-26 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
JP6482757B2 (ja) | 2010-07-26 | 2019-03-13 | トリアンニ インコーポレイテッドTrianni,Inc. | トランスジェニック動物および使用方法 |
EP3960865A1 (en) | 2010-08-02 | 2022-03-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
HUE037095T2 (hu) | 2011-03-09 | 2018-08-28 | Cell Signaling Technology Inc | Eljárások és reagensek monoklonális ellenanyagok elõállítására |
SG194089A1 (en) * | 2011-04-27 | 2013-11-29 | Amyris Inc | Methods for genomic modification |
SG2014007686A (en) | 2011-08-05 | 2014-03-28 | Regeneron Pharma | Humanized universal light chain mice |
CN103945689B (zh) | 2011-09-19 | 2016-10-19 | 科马布有限公司 | 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂 |
US9150847B2 (en) * | 2011-09-21 | 2015-10-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for regulation of transgene expression |
WO2013045916A1 (en) | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Kymab Limited | Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb |
US10246509B2 (en) | 2011-10-17 | 2019-04-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Restricted immunoglobulin heavy chain mice |
US9253965B2 (en) | 2012-03-28 | 2016-02-09 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
GB2502127A (en) | 2012-05-17 | 2013-11-20 | Kymab Ltd | Multivalent antibodies and in vivo methods for their production |
US10251377B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-04-09 | Kymab Limited | Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies |
PL2847335T3 (pl) | 2012-04-25 | 2019-01-31 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Celowanie dużymi wektorami do celowania wspomagane nukleazą |
PT2858487T (pt) | 2012-06-12 | 2020-01-15 | Regeneron Pharma | Animais não humanos humanizados com locus de cadeias pesadas imunoglobulina restrito |
BR112014031080A2 (pt) * | 2012-06-12 | 2018-05-08 | Genentech Inc | métodos e composições de geração de alelos knock-out condicionais. |
LT2931030T (lt) * | 2012-12-14 | 2020-11-10 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Polinukleotidai, koduojantys graužikų antikūnus su žmogaus idiotipais, ir juos apimantys gyvūnai |
MY185881A (en) | 2013-02-20 | 2021-06-14 | Regeneron Pharma | Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences |
ES2829376T3 (es) | 2013-03-14 | 2021-05-31 | Univ Erasmus Med Ct Rotterdam | Mamífero no humano transgénico para la producción de anticuerpos |
WO2014141192A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Erasmus University Medical Center | Generation of heavy chain-only antibodies |
US9788534B2 (en) | 2013-03-18 | 2017-10-17 | Kymab Limited | Animal models and therapeutic molecules |
RU2676708C2 (ru) | 2013-04-16 | 2019-01-10 | Регенерон Фармасьютикалс, Инк. | Направленная модификация генома крысы |
EP2986709A4 (en) * | 2013-04-16 | 2017-03-15 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Activating an alternative pathway for homology-directed repair to stimulate targeted gene correction and genome engineering |
US9783618B2 (en) | 2013-05-01 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics |
US9783593B2 (en) | 2013-05-02 | 2017-10-10 | Kymab Limited | Antibodies, variable domains and chains tailored for human use |
US11707056B2 (en) | 2013-05-02 | 2023-07-25 | Kymab Limited | Animals, repertoires and methods |
SG10201802295XA (en) | 2013-10-01 | 2018-04-27 | Kymab Ltd | Animal Models and Therapeutic Molecules |
JP6174811B2 (ja) | 2013-12-11 | 2017-08-02 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | ゲノムの標的改変のための方法及び組成物 |
EP3119811B1 (en) | 2014-03-21 | 2019-10-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
WO2015143414A2 (en) | 2014-03-21 | 2015-09-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals that make single domain binding proteins |
RS64542B1 (sr) | 2014-04-30 | 2023-09-29 | Hanall Biopharma Co Ltd | Vezivanje antitela za fcrn za lečenje autoimunih bolesti |
US10336825B2 (en) | 2014-04-30 | 2019-07-02 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Antibody binding to FcRn for treating autoimmune diseases |
GB201407852D0 (en) | 2014-05-02 | 2014-06-18 | Iontas Ltd | Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules |
MX2016016133A (es) | 2014-06-06 | 2017-08-04 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para modificar un locus dirigido. |
EP3461885B1 (en) | 2014-06-26 | 2021-10-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use |
US20170226209A1 (en) | 2014-08-01 | 2017-08-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | An anti-cd45rc antibody for use as drug |
JP6727199B2 (ja) | 2014-11-21 | 2020-07-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. | ガイドrnaのペアを使用したターゲティングによる遺伝子改変の方法及び組成物 |
ES2760508T3 (es) | 2014-12-19 | 2020-05-14 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida a través de la transformación múltiple en una sola etapa |
CN107438622A (zh) | 2015-03-19 | 2017-12-05 | 瑞泽恩制药公司 | 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物 |
EP3277823B1 (en) * | 2015-04-03 | 2023-09-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Composition and methods of genome editing of b-cells |
WO2017020291A1 (en) | 2015-08-06 | 2017-02-09 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. | Novel anti-pd-l1 antibodies |
IL293385A (en) | 2015-08-11 | 2022-07-01 | Omniab Inc | New anti–pd–1 antibodies |
KR20180038055A (ko) * | 2015-08-24 | 2018-04-13 | 트리아니, 인코포레이티드 | 면역글로불린의 강화된 생산 |
EP3384030A4 (en) | 2015-12-03 | 2019-07-03 | Trianni, Inc. | IMPROVED IMMUNOGLULINIVITY |
US11053288B2 (en) | 2016-02-04 | 2021-07-06 | Trianni, Inc. | Enhanced production of immunoglobulins |
CN116458475A (zh) | 2016-06-03 | 2023-07-21 | 瑞泽恩制药公司 | 表达外源末端脱氧核苷酸转移酶的非人动物 |
RS65595B1 (sr) | 2016-09-14 | 2024-06-28 | Teneoone Inc | Antitela koja vezuju cd3 |
US11111313B2 (en) | 2016-09-20 | 2021-09-07 | WuXi Biologics Ireland Limited | Anti-PCSK9 antibodies |
WO2018065552A1 (en) | 2016-10-06 | 2018-04-12 | Innate Pharma | Anti-cd39 antibodies |
EP3558369A4 (en) | 2016-12-21 | 2020-09-09 | Cephalon, Inc. | ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO HUMAN IL-15 AND THEIR USES |
US11434299B2 (en) | 2016-12-21 | 2022-09-06 | Teneobio, Inc. | Anti-BCMA heavy chain-only antibodies |
EP3570668A1 (en) | 2017-01-19 | 2019-11-27 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
WO2018237037A2 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Teneobio, Inc. | HEAVY CHAIN ANTIBODY ONLY ANTI-BCMA |
WO2018237006A1 (en) | 2017-06-20 | 2018-12-27 | Teneoone, Inc. | ANTIBODIES ONLY TO HEAVY ANTI-BCMA CHAINS |
JP2020532991A (ja) | 2017-09-07 | 2020-11-19 | オーガスタ ユニバーシティ リサーチ インスティテュート,インコーポレーテッド | プログラム細胞死タンパク質1に対する抗体 |
CA3075399A1 (en) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | Teneobio, Inc. | Heavy chain antibodies binding to ectoenzymes |
EP3498293A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-19 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Treatment of monogenic diseases with an anti-cd45rc antibody |
AU2018392088A1 (en) | 2017-12-22 | 2020-08-13 | Teneobio, Inc. | Heavy chain antibodies binding to CD22 |
CA3087061A1 (en) | 2017-12-27 | 2019-07-04 | Teneobio, Inc. | Cd3-delta/epsilon heterodimer specific antibodies |
TWI842701B (zh) | 2018-03-24 | 2024-05-21 | 美商再生元醫藥公司 | 用於產生抗肽-mhc複合物之治療性抗體的經基因修飾的非人類動物、其製法與用途 |
US20210230629A1 (en) * | 2018-06-13 | 2021-07-29 | Crystal Bioscience Inc. | Camelization of a human variable domain by gene conversion |
AU2019284256A1 (en) * | 2018-06-13 | 2020-12-24 | Crystal Bioscience Inc. | Transgenic chicken that makes antibodies with long CDR-H3S stabilized by multiple disulfide bridges and diversified by gene conversion |
KR102444180B1 (ko) | 2018-06-14 | 2022-09-16 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 면역글로불린 중쇄 암호화 서열에서 dh-dh 재배열 가능한 비인간 동물 |
SG11202011597RA (en) | 2018-07-20 | 2020-12-30 | Teneobio Inc | Heavy chain antibodies binding to cd19 |
US11332534B2 (en) | 2018-08-01 | 2022-05-17 | Cephalon, Inc. | Anti-CXCR2 antibodies and uses thereof |
EP3626265A1 (en) | 2018-09-21 | 2020-03-25 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-human cd45rc antibodies and uses thereof |
WO2020152290A1 (en) | 2019-01-23 | 2020-07-30 | Encefa | Cd31 competitors and uses thereof |
CA3125380A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-27 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus |
EP3972997A1 (en) | 2019-05-20 | 2022-03-30 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) | Novel anti-cd25 antibodies |
KR20220020810A (ko) | 2019-06-14 | 2022-02-21 | 테네오바이오, 인코포레이티드 | Cd22와 cd3에 결합하는 다중특이적 중쇄 항체 |
EP4034561A2 (en) | 2019-09-27 | 2022-08-03 | Starkage Therapeutics | Senescent cell-associated antigen-binding domains, antibodies and chimeric antigen receptors comprising the same, and uses thereof |
CA3163549A1 (en) | 2019-12-02 | 2021-06-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Peptide-mhc ii protein constructs and uses thereof |
EP4186564A1 (en) | 2020-04-29 | 2023-05-31 | Teneoone, Inc. | Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions |
KR20230018439A (ko) | 2020-06-02 | 2023-02-07 | 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드 | 공동 경쇄 면역글로불린 좌위를 갖는 유전자 변형 비인간 동물 |
KR20230066386A (ko) | 2020-09-11 | 2023-05-15 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 항원 특이적 항체의 확인 및 제조 |
KR20230118108A (ko) | 2020-11-20 | 2023-08-10 | 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔) | 항-cd25 항체 |
US20240002521A1 (en) | 2020-11-20 | 2024-01-04 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-cd25 antibodies |
WO2022132943A1 (en) | 2020-12-16 | 2022-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing humanized fc alpha receptors |
US20220195014A1 (en) | 2020-12-23 | 2022-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof |
WO2023170207A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Alderaan Biotechnology | Anti-cd160 transmembrane isoform antibodies |
US11926669B2 (en) | 2022-05-30 | 2024-03-12 | Hanall Biopharma Co., Ltd. | Anti-FcRn antibody or antigen binding fragment thereof with improved stability |
WO2024062019A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Synabs | Anti-ccr8 antibodies and uses thereof |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US20060117398A1 (en) * | 2004-10-22 | 2006-06-01 | Roland Buelow | Suppression of endogenous immunoglobulin expression |
US20060153826A1 (en) * | 2003-01-28 | 2006-07-13 | Sylvain Arnould | Use of meganucleases for inducing homologous recombination ex vivo and in toto in vertebrate somatic tissues and application thereof |
WO2007060495A1 (en) * | 2005-10-25 | 2007-05-31 | Cellectis | I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof |
Family Cites Families (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4977081A (en) | 1987-05-04 | 1990-12-11 | Adi Diagnostics, Inc. | Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof |
GB8823869D0 (en) | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
US5175384A (en) | 1988-12-05 | 1992-12-29 | Genpharm International | Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice |
FR2646438B1 (fr) | 1989-03-20 | 2007-11-02 | Pasteur Institut | Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration |
US5574205A (en) * | 1989-07-25 | 1996-11-12 | Cell Genesys | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
US6673986B1 (en) * | 1990-01-12 | 2004-01-06 | Abgenix, Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
US6150584A (en) * | 1990-01-12 | 2000-11-21 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
DE69133566T2 (de) | 1990-01-12 | 2007-12-06 | Amgen Fremont Inc. | Bildung von xenogenen Antikörpern |
US6713610B1 (en) * | 1990-01-12 | 2004-03-30 | Raju Kucherlapati | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US6657103B1 (en) * | 1990-01-12 | 2003-12-02 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5411881A (en) | 1990-07-10 | 1995-05-02 | Nkk Corporation | Chicken-specific immunoglobulin G-producing hybridoma |
EP0814159B1 (en) | 1990-08-29 | 2005-07-27 | GenPharm International, Inc. | Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies |
US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
US7041871B1 (en) * | 1995-10-10 | 2006-05-09 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
EP0546091B1 (en) | 1990-08-29 | 2007-01-24 | Pharming Intellectual Property BV | Homologous recombination in mammalian cells |
US5770429A (en) | 1990-08-29 | 1998-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
DE4119749A1 (de) | 1991-06-15 | 1992-12-17 | Claas Ohg | Verfahren zum entholzen von flachs und flachsaufbereitungsmaschine zur durchfuehrung dieses verfahrens |
EP0652950B1 (en) | 1992-07-24 | 2007-12-19 | Amgen Fremont Inc. | Generation of xenogeneic antibodies |
EP0583980A1 (en) | 1992-08-20 | 1994-02-23 | Eli Lilly And Company | Method for generating monoclonal antibodies from rabbits |
US6005079A (en) | 1992-08-21 | 1999-12-21 | Vrije Universiteit Brussels | Immunoglobulins devoid of light chains |
US6765087B1 (en) | 1992-08-21 | 2004-07-20 | Vrije Universiteit Brussel | Immunoglobulins devoid of light chains |
EP1621554B2 (en) | 1992-08-21 | 2012-08-29 | Vrije Universiteit Brussel | Immunoglobulins devoid of light chains |
US5795974A (en) | 1993-12-10 | 1998-08-18 | University Of Utah Research Foundation | Mycoplasma arthritidis superantigen |
US6130364A (en) | 1995-03-29 | 2000-10-10 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
US6091001A (en) | 1995-03-29 | 2000-07-18 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
ATE390933T1 (de) | 1995-04-27 | 2008-04-15 | Amgen Fremont Inc | Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8 |
AU7326796A (en) | 1995-10-30 | 1997-05-22 | Spectral Diagnostics Inc. | Stable chicken b-cell line and method of use thereof |
US5716081A (en) | 1996-03-11 | 1998-02-10 | Automotive Products (Usa), Inc. | Spring clip for quick connect coupling |
AU5702298A (en) * | 1996-12-03 | 1998-06-29 | Abgenix, Inc. | Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and VK regions nd antibodies produced therefrom |
GB9823930D0 (en) | 1998-11-03 | 1998-12-30 | Babraham Inst | Murine expression of human ig\ locus |
US6372956B1 (en) * | 1998-12-31 | 2002-04-16 | The J. David Gladstone Institutes | Transgenic rats and rat cell lines expressing human CD4 and a human chemokine receptor |
US6833268B1 (en) * | 1999-06-10 | 2004-12-21 | Abgenix, Inc. | Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions |
AU2001255613B2 (en) * | 2000-04-24 | 2005-08-04 | Wyeth | Transgenic animal |
CN1468250A (zh) * | 2000-08-03 | 2004-01-14 | ��ķһ����˹��̹ | 在转基因动物中产生人源化抗体 |
US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
US6586251B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
JP3523245B1 (ja) | 2000-11-30 | 2004-04-26 | メダレックス,インコーポレーテッド | ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物 |
GB0110029D0 (en) | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
GB0115256D0 (en) | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Babraham Inst | Mouse light chain locus |
WO2003016495A2 (en) | 2001-08-20 | 2003-02-27 | Merck & Co., Inc. | Transgenic rodents as animal models for modulation of b1 bradykinin receptor protein |
DK1427828T3 (da) * | 2001-09-14 | 2010-07-19 | Cellectis | Tilfældig integration af et polynucleotid efter in vivo-linearisering |
CA2847885C (en) | 2001-11-30 | 2022-03-22 | Amgen Fremont Inc. | Transgenic animals bearing human ig.lambda. light chain genes |
DK1485475T3 (da) | 2002-03-15 | 2008-01-21 | Cellectis | Hybrid meganuklease og enkeltkædet maganuklease og brug deraf |
ATE531796T1 (de) * | 2002-03-21 | 2011-11-15 | Sangamo Biosciences Inc | Verfahren und zusammensetzungen zur verwendung von zinkfinger-endonukleasen zur verbesserung der homologen rekombination |
GB0228210D0 (en) | 2002-12-03 | 2003-01-08 | Babraham Inst | Single chain antibodies |
US20040158880A1 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-12 | Roland Buelow | Suppression of endogenous immunoglobulin expression in transgenic non-human animals expressing humanized or human antibodies |
GB2398784B (en) | 2003-02-26 | 2005-07-27 | Babraham Inst | Removal and modification of the immunoglobulin constant region gene cluster of a non-human mammal |
US7381409B2 (en) * | 2003-06-16 | 2008-06-03 | Celltech R&D, Inc. | Antibodies specific for sclerostin and methods of screening and use therefor |
WO2005007696A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-01-27 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Humanized immunoglobulin loci |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
WO2005019463A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-03-03 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Improved transgenesis with humanized immunoglobulin loci |
WO2005038001A2 (en) * | 2003-10-14 | 2005-04-28 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Improved transgenesis by sperm-mediated gene transfer |
WO2005085427A1 (ja) | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | ラット胚性幹細胞 |
EP1978032A3 (en) | 2004-07-22 | 2009-02-18 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Binding molecules |
ES2679282T3 (es) * | 2004-10-22 | 2018-08-23 | Revivicor Inc. | Porcinos transgénicos que carecen de cadena ligera de inmunoglobulina endógena |
CA2599875A1 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Preventive/therapeutic agent for cancer |
WO2006097784A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
AU2006224248B2 (en) | 2005-03-15 | 2011-01-06 | Cellectis | I-Crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
US7491866B2 (en) | 2005-11-09 | 2009-02-17 | Board Of Regents University Of Texas System | Transgenic rats and spermatogonial stem cells |
KR101481843B1 (ko) | 2006-01-25 | 2015-01-12 | 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 | 형질전환 동물 내에서의 중쇄만의 항체의 생성 |
CA2638774C (en) | 2006-03-31 | 2015-11-24 | Medarex, Inc. | Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies |
LT2602323T (lt) | 2007-06-01 | 2018-04-10 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Kompozicijos ir būdai endogeninių imunoglobulinų genams slopinti ir transgeniniams žmogaus idiotipo antikūnams gaminti |
MY185881A (en) * | 2013-02-20 | 2021-06-14 | Regeneron Pharma | Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences |
-
2008
- 2008-05-30 LT LTEP12187787.2T patent/LT2602323T/lt unknown
- 2008-05-30 US US12/130,818 patent/US8703485B2/en active Active
- 2008-05-30 CA CA2688834A patent/CA2688834C/en active Active
- 2008-05-30 AT AT08769934T patent/ATE522611T1/de active
- 2008-05-30 PL PL12187787T patent/PL2602323T3/pl unknown
- 2008-05-30 SG SG10201509853UA patent/SG10201509853UA/en unknown
- 2008-05-30 KR KR1020177002729A patent/KR101886610B1/ko active IP Right Grant
- 2008-05-30 ES ES12187787.2T patent/ES2664218T3/es active Active
- 2008-05-30 CN CN2008801012988A patent/CN101784664B/zh active Active
- 2008-05-30 WO PCT/US2008/065419 patent/WO2008151081A1/en active Application Filing
- 2008-05-30 EP EP08769934A patent/EP2152880B1/en active Active
- 2008-05-30 EP EP12187787.2A patent/EP2602323B1/en active Active
- 2008-05-30 HU HUE12187787A patent/HUE037302T2/hu unknown
- 2008-05-30 ES ES08769934T patent/ES2372718T3/es active Active
- 2008-05-30 SI SI200831937T patent/SI2602323T1/en unknown
- 2008-05-30 KR KR1020187022408A patent/KR102096731B1/ko active IP Right Grant
- 2008-05-30 PT PT08769934T patent/PT2152880E/pt unknown
- 2008-05-30 SG SG2012039913A patent/SG182144A1/en unknown
- 2008-05-30 PL PL08769934T patent/PL2152880T3/pl unknown
- 2008-05-30 KR KR1020097024974A patent/KR101661357B1/ko active IP Right Grant
- 2008-05-30 CA CA3054224A patent/CA3054224A1/en active Pending
- 2008-05-30 JP JP2010510537A patent/JP5823690B2/ja active Active
- 2008-05-30 DK DK12187787.2T patent/DK2602323T3/en active
- 2008-05-30 PL PL11161775T patent/PL2336329T3/pl unknown
- 2008-05-30 PT PT121877872T patent/PT2602323T/pt unknown
- 2008-05-30 AU AU2008259939A patent/AU2008259939B2/en active Active
- 2008-05-30 NZ NZ581396A patent/NZ581396A/en unknown
- 2008-05-30 DK DK08769934.4T patent/DK2152880T3/da active
- 2008-05-30 EP EP18158882.3A patent/EP3382022A1/en active Pending
- 2008-05-30 KR KR1020157022196A patent/KR101703299B1/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-05-30 PT PT111617759T patent/PT2336329E/pt unknown
- 2008-05-30 DK DK11161775.9T patent/DK2336329T3/da active
- 2008-05-30 ES ES11161775T patent/ES2393826T3/es active Active
- 2008-05-30 EP EP11161775A patent/EP2336329B8/en active Active
-
2009
- 2009-11-24 IL IL202302A patent/IL202302A/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-02-05 US US12/701,464 patent/US8907157B2/en active Active
- 2010-03-18 HK HK10102837.1A patent/HK1135138A1/xx unknown
-
2011
- 2011-07-27 US US13/192,407 patent/US9388233B2/en active Active
-
2012
- 2012-06-06 IL IL220209A patent/IL220209A/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-10-11 JP JP2013213996A patent/JP2014027947A/ja active Pending
-
2015
- 2015-07-30 JP JP2015150597A patent/JP6220827B2/ja active Active
-
2016
- 2016-07-08 US US15/206,063 patent/US10072069B2/en active Active
-
2017
- 2017-09-29 JP JP2017190442A patent/JP6712254B2/ja active Active
-
2018
- 2018-03-27 HR HRP20180506TT patent/HRP20180506T1/hr unknown
- 2018-03-27 CY CY20181100345T patent/CY1120383T1/el unknown
- 2018-09-10 US US16/127,065 patent/US20190169270A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-05-27 JP JP2020092210A patent/JP2020125360A/ja active Pending
- 2020-12-22 US US17/131,164 patent/US20210253673A1/en active Pending
-
2022
- 2022-06-23 JP JP2022101081A patent/JP2022118217A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US20060153826A1 (en) * | 2003-01-28 | 2006-07-13 | Sylvain Arnould | Use of meganucleases for inducing homologous recombination ex vivo and in toto in vertebrate somatic tissues and application thereof |
US20060117398A1 (en) * | 2004-10-22 | 2006-06-01 | Roland Buelow | Suppression of endogenous immunoglobulin expression |
WO2007060495A1 (en) * | 2005-10-25 | 2007-05-31 | Cellectis | I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Buelow Roland 등. Human antibodies. Vol. 15, No. 1-2, 페이지 19-23 (2006.) * |
Nucleic Acids Res. 2003 Jun 1; 31(11): 2952-2962. * |
PNAS vol 103(41), pp. 15130-15135(2006) * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101661357B1 (ko) | 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물 | |
JP2010529042A6 (ja) | 内在性免疫グロブリン遺伝子を阻害し、そして、トランスジェニック・ヒト・イディオタイプ抗体を製造するための組成物及び方法 | |
US20100235929A1 (en) | Compositions and Methods for Producing Antibodies Having Human Idiotypes in Transgenic Birds | |
CN102850452B (zh) | 用于抑制内源性免疫球蛋白基因和生产转基因人独特型抗体的组合物和方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
A201 | Request for examination | ||
AMND | Amendment | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
J201 | Request for trial against refusal decision | ||
B701 | Decision to grant |