PT2336329E - Composições e métodos para inibição de genes de imunoglobulina endógena e produção de anticorpos transgénicos humanos idiotípicos - Google Patents

Composições e métodos para inibição de genes de imunoglobulina endógena e produção de anticorpos transgénicos humanos idiotípicos Download PDF

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Description

1
DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA INIBIÇÃO DE GENES DE IMUNOGLOBULINA ENDÓGENA E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS TRANSGÉNICOS HUMANOS IDIOTÍPICOS"
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção é destinada aos animais transgénicos que têm um ou mais loci de imunoglobulina endógena inativados e aos métodos para realização da mesma. A invenção além disso também é destinada a composições e métodos para produção de anticorpos humanizados e totalmente humanos utilizando esses animais transgénicos e os anticorpos produzidos desse modo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os anticorpos são uma classe importante dos produtos farmacêuticos que têm sido utilizados com sucesso no tratamento de várias doenças e condições humanas, incluindo doenças infecciosas, cancro, doenças alérgicas, e doenças de rejeição de enxerto contra o anfitrião, bem como na prevenção da rejeição de transplante.
Um problema associado com a aplicação terapêutica de imunoglobulinas não-humanas é a potencial imunogenicidade da mesma nos pacientes humanos. De forma a reduzir a imunogenicidade de tais preparações, foram desenvolvidas várias estratégias para a produção de anticorpos parcialmente humanos (humanizados) e totalmente humanos. A capacidade de produzir anticorpos transgénicos tendo um idiotipico humano em animais não-humanos é particularmente desejável uma vez que o antigeno de ligação dos determinantes está dentro da região idiotípica, e pensa-se que os idiotípicos não-humanos contribuem para a 2 imunogenicidade da presente terapêutica de anticorpos. 0 idiotipico humano é uma consideração especialmente importante em relação à terapêutica de anticorpo monoclonal, que consiste na entrega de um único idiótipo a concentração relativamente elevada ao contrário da variedade de idiótipos entregues a concentrações mais baixas através de uma mistura de anticorpos policlonais.
Apesar de ter sido descrito um número de aproximações para produção de anticorpos transgénicos humanizados em animais não-humanos, foi encontrado um problema principal em muitas dessas aproximações que é a produção do anticorpo endógeno, tanto preferencialmente ou em combinação com anticorpos transgénicos no animal hospedeiro. Vários esquemas de clonagem recombinantes foram utilizados em tentativas de interromper a produção de imunoglobulina endógena nos animais hospedeiros de forma a direcionar este problema. No entanto, a inativação funcional de genes de imunoglobulina apresenta muitos obstáculos em muitas espécies vertebradas.
Por exemplo, enquanto ratos mutantes homozigotos com loci JH eliminados foram produzidos com sucesso utilizando a recombinação homóloga, ES ou outras células pluripotentes sustentáveis nas quais pode ser efetuada a recombinação homóloga de forma a inativar os loci endógenos não estão disponíveis de imediato na maior parte das espécies vertebradas.
Além disso, as mutações que interferem com a expressão da superfície da célula mas não com o reajuste produtivo da imunoglobulina VDJ ou segmentos genéticos VJ são insuficientes para ativarem completamente a expressão Ig endógena. Isto é exemplificado pelo facto de os ratos 3 mutante homozigotos com uma membrana disruptiva de exão de cadeia pesada μ (denominados ratos μΜΤ) não produzirem IgM ou IgG, mas ainda produzirem quantidades significantes de igA (Macpehrson e outros. Nature Immunol 2 (7) : 625 - 631 (2001). Além disso, o soro de ratos mutantes heterozigóticos contém IgM e IgG codificada por ambos os alelos, o alelo do tipo selvagem e o alelo μΜΤ transformado (Kitamura e Rajewky, Nature 356: 154 - 156 (1992). Isto é devido ao facto de o primeiro reajuste no decorrer do desenvolvimento da célula B ser a junção dos e segmentos genéticos DH-e JH- em ambos os cromossomas homólogos, gerando uma célula pro-B. Se, nos ratos μΜΤ/+, uma célula pro-B sofrer primeiro uma posterior junção de VH-DHJH no locus IgH mutado e a junção for na estrutura ("produtiva"), a célula pre-B resultante pode exprimir uma cadeia μ da forma segregada, mas não pode exprimir a ligação μ -membrana. Uma vez que a expressão ligação μ - membrana é necessária para a exclusão alélica, essa célula ainda é capaz de sofrer a junção de VH-DHJH no locus IgH de tipo selvagem; e se este segundo reajuste também for produtivo, a célula exprime duas cadeias μ diferentes, uma das quais se liga à membrana. O soro desses ratos contém IgM derivada de ambos os alelos. Além disso, a IgG derivada de ambos os alelos pode ser encontrada no soro de tais ratos uma vez que a comutação é muitas vezes é concomitantemente induzida em ambos os loci IgH de uma célula B. A exclusão alélica incompleta também é observada em animais com loci de imunoglobulina transgénica funcionais e loci de imunoglobulina endógena mutados que ainda podem reajustar os segmentos genéticos VDJ ou VJ de forma produtiva. Uma célula B que reajusta VH-DHJH em um ou em ambos os loci endógenos mutados ainda pode reajustar a produtividade dos 4 loci da imunoglobulina transgénica. Tal célula B exprime a ligação da membrana à imunoglobulina transgénica e desenvolve-se numa célula B matura. Durante a alteração do isótopo de desenvolvimento da célula B no locus endógeno mutado pode resultar numa célula B que exprime imunoglobulina endógena. De acordo com isso, tais mutações são insuficientes para a inativação completa da expressão da imunoglobulina endógena em animais com loci de imunoglobulina transgénica.
Gorman e outros. (1991, Reshaping a therapeutic CD4 antibody. PNAS, 88) divulga um anticorpo de rato imunossupressor (compath-9) contra um DC4 humano que foi reformulado para utilização na gestão da autoimunidade e na prevenção da rejeição dos enxertos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Um problema principal associado com a produção de anticorpos transgénicos humanizados em animais não-humanos foi a produção ou a coprodução preferencial de anticorpos endógenos no hospedeiro. A presente invenção resolve este problema ao conferir animais transgénicos que acolhem pelo menos um locus Ig artificial e não têm a capacidade de produzir imunoglobulina endógena. Estes animais são altamente úteis para a produção de anticorpos transgénicos humanizados e totalmente humanos. Os métodos utilizados para gerar tais animais transgénicos são eficazes em muitas espécies, incluindo espécies a partir das quais as células ES ou as células pluripotentes sustentáveis não estão atualmente disponíveis de imediato e nas quais a recombinação homóloga e a inativação dos genes não se fazem de imediato. 5 A presente invenção provem em parte da descoberta que uma meganuclease pode ser utilizada de forma a permitir funcionalmente que os loci de imunoglobulina endógena gerem animais transgénicos úteis para a produção de anticorpos transgénicos humanizados e totalmente humanos. Além disso, podem ser utilizadas duas meganucleases distintas direcionadas para locais genómicos distintos de forma a eliminar efetivamente uma grande parte de um locus de imunoglobulina (até vários kb) , assegurando desse modo a inativação completa do locus e assegurando também que os animais transgénicos que transportam a mutação da linha germinal não geram qualquer célula B capaz de produzir imunoglobulina endógena.
Num aspeto, a invenção confere um método de geração de um rato, compreendendo: (A) injeção numa célula germinal de rato, o oócito de rato fertilizado ou um embrião de rato, uma meganuclease especifica para fragmentos genéticos de Ig em loci de cadeia pesada e/ou leve endógenos ao rato, em que a meganuclease introduz quebras de cadeia dupla nos referidos loci de cadeia pesada e/ou leve; ou (B) injeção numa célula germinal de rato, o oócito de rato fertilizado ou um embrião de rato, um vetor de expressão ou ácido nucleico que codifica uma meganuclease especifica para fragmentos genéticos de Ig em loci de cadeia pesada e/ou leve endógenos ao rato, em que a meganuclease introduz quebras de cadeia dupla nos referidos loci de cadeia pesada e/ou leve.
Num segundo aspeto, a invenção confere um rato nulizigótico para Ig de loci de cadeia leve endógenos e/ou loci de cadeia pesada endógenas. 6
Num terceiro aspeto, a invenção confere um método para produção de um anticorpo monoclonal, compreendendo: (i) imunização de um rato da invenção com um imunogénio; (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do rato em que a célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; e (iii) utilização da célula de produção do anticorpo monoclonal de forma a produzir o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio, ou utilizando a célula de produção do anticorpo monoclonal de forma a produzir uma célula hibridoma que produz o anticorpo monoclonal e utilizando a célula hibridoma de forma a produzir o anticorpo monoclonal.
Num quarto aspeto, a invenção confere um método para produção de um anticorpo monoclonal compreendendo: (i) imunização de um rato da invenção com um imunogénio; (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do rato em que a célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; (iii) isolação a partir da célula de produção do anticorpo monoclonal de um ácido nucleico do anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; e (iv) utilização do ácido nucleico do anticorpo monoclonal de forma a produzir um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio, em que opcionalmente o anticorpo monoclonal tem um idiotípico humano.
Num quinto aspeto, a invenção confere um método para produção de um anticorpo monoclonal compreendendo: (i) imunização de um rato da invenção com um imunogénio; (ii) 7 isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do rato em que a célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; (iii) isolação a partir da célula de produção do anticorpo monoclonal de um ácido nucleico do anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; (iv) modificação do ácido nucleico do anticorpo monoclonal de forma a produzir um ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano; e (v) utilização do ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano de forma a produzir o anticorpo monoclonal totalmente humano codificado.
Num sexto aspeto, a invenção confere uma célula conseguivel através de um método da invenção.
Num sétimo aspeto, a invenção confere uma célula transfetata que compreende um ácido nucleico que codifica um anticorpo monoclonal da invenção.
Num oitavo aspeto, a invenção confere a célula transfectada compreendendo um ácido nucleico monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio conforme definido acima.
Num nono aspeto, a invenção confere um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo monoclonal conseguivel através de um método da invenção, em que o locus artificial compreende pelo menos um segmento genético humano J, em que o anticorpo monoclonal é uma imunoglobulina quimérica que compreende uma parte da sequência de polipéptidos de imunoglobulina humana e uma parte da sequência de polipéptidos de imunoglobulina do rato.
Num décimo aspeto, a invenção confere uma imunoglobulina quimérica compreendendo uma sequência de polipéptidos codificada por um ácido nucleico da invenção, em que a imunoglobulina quimérica compreende uma parte da sequência de polipéptidos de imunoglobulina humana e uma parte da sequência de polipéptido de imunoglobulina de rato.
Num décimo primeiro aspeto, a invenção confere uma célula transfetata que compreende o ácido nucleico da invenção.
De acordo com isso, a invenção confere animais transgénicos compreendendo pelo menos um locus Ig artificial e tendo pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena. Os animais utilizados na invenção são pequenos animais de laboratório, particularmente pássaros, roedores e doninhas. Os loci artificiais utilizados na invenção compreendem pelo menos um segmento genético humano V. Numa forma de realização preferencial, um locus de Ig artificial compreende (i) uma região V tendo pelo menos um segmento genético humano V que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos genéticos J; e (iii) um ou mais genes de região constante, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de sofrer reajuste genético e produzir um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico.
Numa forma de realização, o animal transgénico compreende um locus de cadeia pesada de Ig endógena inativado. Numa forma de realização preferida, o animal transgénico tem tanto loci de cadeia pesada de Ig endógena inativado e de 9 acordo com isso não transporta um locus de cadeia pesada de Ig endógena funcional.
Numa forma de realização, o animal transgénico compreende um locus de cadeia leve de Ig endógena inativado. Numa forma de realização preferida, o animal transgénico tem tanto loci de cadeia leve de Ig endógena inativado e de acordo com isso não transporta um locus de cadeia leve de Ig endógena funcional.
Numa forma de realização preferida, o animal transgénico tem falta de locus de cadeia pesada de Ig endógena funcional e de um locus de cadeia leve de Ig funcional.
Numa forma de realização, o animal transgénico compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Numa forma de realização, o animal transgénico tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
Numa forma de realização, o animal transgénico compreende pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Numa forma de realização, o animal transgénico compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Numa forma de realização preferida, os loci de Ig artificial são funcionais e são capazes de sofrerem o reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotípico humano. 10
Numa forma de realização, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante não-humano e são funcionais e capazes de sofrer o reajuste genético e de produzir um repertório de imunoglobulinas quiméricas no animal transgénico, cujo repertório de imunoglobulinas quiméricas inclui imunoglobulinas quiméricas tendo um idiotipico humano.
Numa forma de realização, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante humano e são funcionais e capazes de sofrer o reajuste genético e de produzir um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotipico humano e região constante humana. A invenção compreende animais transgénicos capazes de gerarem células germinais viáveis que têm pelo menos um locus de Ig endógena que está inativado.
Numa forma de realização, tais animais transgénicos compreendem um elemento de expressão de meganuclease genómica, preferivelmente um elemento que tem uma região de controlo de expressão induzivel ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação de meganuclease, em que o meganuclease codificado reconhece uma sequência alvo de meganuclease presente em ou proximal a um locus de Ig endógena do animal transgénico. Quando o animal transgénico está sexualmente maduro e compreende células germinais viáveis, e o elemento de expressão de meganuclease genómica pode ser utilizado de forma a inativar o locus de Ig 11 endógena nessas células germinais, in vitro ou in vivo, sem comprometer a viabilidade das mesmas, assegurando que se podem obter os animais F1 que transportam uma mutação de uma linha germinal num locus de Ig, a partir dessas.
Numa forma de realização, o animal transgénico também compreende pelo menos um locus de Ig artificial. A invenção inclui animais transgénicos compreendendo células germinais viáveis em que pelo menos um locus de Ig endógena está inativado. Numa forma de realização, o animal transgénico também compreende pelo menos um locus de Ig artificial.
Numa forma de realização, a invenção confere métodos para produção de animais transgénicos compreendendo pelo menos um locus Ig artificial e tendo pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena. Numa forma de realização preferida, o animal transgénico é nulizigótico para cadeia leve Ig endógena e/ou cadeia pesada de Ig endógena.
Preferivelmente, um locus de Ig endógena é inativado numa célula germinal progenitora, ou a célula germinal de um predecessor, através da expressão de uma meganuclease nessa mesma. Os métodos compreendem a produção de uma meganuclease na célula germinal, em que a meganuclease reconhece uma sequência alvo de meganuclease presente em ou proximal a um locus de Ig endógena e seletivamente inativa o locus de Ig alvo na célula germinal produzindo desse modo uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado. Tal célula germinal tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado é utilizada de forma a 12 produzir um animal tendo pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena. Numa forma de realização, a célula germinal, ou aquela com a qual essa está combinada, compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Numa forma de realização, a célula germinal, ou aquela com a qual essa está combinada, compreende pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. Numa forma de realização, a célula germinal, ou aquela com a qual essa está combinada, compreende pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
Numa forma de realização, os métodos envolvem a introdução de um elemento de expressão de meganuclease ou de um ácido nucleico de codificação da meganuclease na célula germinal.
Numa forma de realização preferida, a célula germinal compreende um elemento de expressão de meganuclease genómica, que compreende uma região de controlo da expressão ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação da meganuclease. Numa forma de realização preferida, a célula germinal compreende um elemento de expressão de meganuclease genómica induzível e os métodos envolvem induzir a expressão do ácido nucleico de codificação da meganuclease na célula germinal. Numa forma de realização, os métodos envolvem a repetição do passo de induzir a expressão do ácido nucleico de codificação da meganuclease na célula germinal. Numa forma de realização, a indução é feita in vivo. Noutra forma de realização, a indução é feita loci de Ig. Numa forma de realização, a célula germinal compreende um elemento de expressão de meganuclease genómica, que compreende uma região de 13 controlo que apresenta atividade especifica da célula germinal.
As células germinais resultantes podem ser utilizadas de modo a gerar um animal F1 tendo pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena. 0 animal Fl pode compreender um ou mais loci Ig artificial ou pode ser cruzado de forma a gerar tais animais que compreendem pelo menos um locus de Ig artificial.
Numa forma de realização alternativa, o método envolve a introdução de um elemento de expressão meganuclease ou ácido nucleico de codificação da meganuclease um oócito ou embrião fertilizado e gerando uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig inativado no animal fundador resultante. 0 animal fundador pode ser utilizado de modo a gerar um animal Fl tendo pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena. 0 animal Fl pode compreender um ou mais loci Ig artificial ou pode ser cruzado de forma a gerar tais animais que compreendem pelo menos um locus de Ig artificial.
Numa forma de realização, a sequência alvo de meganuclease está presente em ou proximal a um segmento genético J.
Numa forma de realização, a sequência alvo de meganuclease está presente em ou proximal a um segmento genético de região constante de imunoglobulina. Numa forma de realização preferida, o gene de região constante codifica a imunoglobulina μ.
Numa forma de realização, os métodos envolvem células germinais de proteção da viabilidade e inativação de um 14 locus de Ig endógena. Numa forma de realização, os métodos envolvem células germinais de proteção da presença de um locus de Ig artificial.
Em métodos neste documento, o cruzamento de animais é preferivelmente entre animais tendo loci endógenos inativados, de forma a gerar animais que são nulizigótico para a cadeia leve de Ig endógena e/ou para a cadeia pesada de Ig endógena.
Numa forma de realização preferida, os métodos também compreendem a utilização de uma segunda meganuclease. A segunda meganuclease reconhece uma segunda sequência alvo de meganuclease presente em ou proximal ao locus Ig endógena e seletivamente divide o locus Ig endógena em conjunto com a primeira meganuclease mas num local distinto daquele da primeira meganuclease, inativando dessa forma pelo menos um locus de Ig endógena.
Numa forma de realização preferida, a célula germinal compreende um segundo elemento de expressão de meganuclease genómica, que compreende uma região de controlo da expressão ligada de forma operacional a um segundo ácido nucleico de codificação da meganuclease. Numa forma de realização preferida, a região de controlo de expressão é uma região de controlo de expressão induzivel, e o método também compreende a indução da expressão do segundo ácido nucleico de codificação da meganuclease na célula germinal, através do qual se produz a segunda meganuclease codificada e, em conjunto com a primeira meganuclease, seletivamente inativa o locus Ig alvo na célula germinal. Numa forma de realização, os métodos envolvem a repetição do passo de induzir a expressão do segundo ácido nucleico de 15 codificação da meganuclease na célula germinal. Numa forma de realização, a indução é feita in vivo. Numa forma de realização, a indução é feita loci de Ig. Numa forma de realização, o segundo elemento de expressão de meganuclease genómica, compreende uma região de controlo gue apresenta atividade especifica da célula germinal.
Numa forma de realização alternativa, os métodos envolvem a introdução de um segundo elemento de expressão de meganuclease ou de um segundo ácido nucleico de codificação da meganuclease na célula germinal.
Numa forma de realização alternativa, os métodos envolvem a introdução de um segundo elemento de expressão meganuclease ou de um segundo ácido nucleico de codificação da meganuclease num oócito ou embrião fertilizado e gerando uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig inativado no animal fundador resultante. 0 animal fundador pode ser utilizado de modo a gerar um animal F1 tendo pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena. 0 animal Fl pode compreender um ou mais loci Ig artificial ou pode ser cruzado de forma a gerar tais animais que compreendem pelo menos um locus de Ig artificial.
Numa forma de realização preferida, as primeiras e segundas meganucleases têm como alvo segmentos genéticos J. Numa forma de realização, as primeiras e segundas sequências alvo de meganuclease estão, consideradas em conjunto, a montante e a jusante de um ou mais segmentos genéticos J dentro do locus Ig endógena, e a divisão pela primeiras e segundas meganucleases codificadas produz a eliminação de um segmento de ADN genómico compreendendo um ou mais segmentos genéticos J. 16
Numa outra forma de realização, as primeiras e segundas meganucleases têm como alvo segmentos genéticos de região constante. Numa forma de realização, as primeiras e segundas sequências alvo de meganuclease estão, consideradas em conjunto, a montante e a jusante de um ou mais segmentos genéticos de região constante de imunoglobulina, e a divisão pela primeiras e segundas meganucleases codificadas produz a eliminação de um segmento de ADN genómico compreendendo um ou mais segmentos genéticos de região constante de imunoglobulina. Numa forma de realização preferida, o gene de região constante codifica a imunoglobulina μ.
Em métodos neste documento, os loci artificiais utilizados compreendem pelo menos um segmento genético humano V. Numa forma de realização preferencial, um locus de Ig artificial compreende (i) uma região V tendo pelo menos um segmento genético humano V que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos genéticos J; e (iii) um ou mais genes de região constante, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de sofrer reajuste genético e produzir um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico.
Numa forma de realização, pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial é incorporado no genoma de um animal transgénico da invenção. Numa forma de realização, o animal transgénico tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional. 17
Numa forma de realização, pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial é incorporado no genoma de um animal transgénico da invenção. Numa forma de realização, pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig é incorporado no genoma de um animal transgénico da invenção.
Numa forma de realização preferida, os loci de Ig artificial são funcionais e são capazes de sofrerem o reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotípico humano.
Numa forma de realização, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante não-humano e são funcionais e capazes de sofrer o reajuste genético e de produzir um repertório de imunoglobulinas quiméricas no animal transgénico, cujo repertório de imunoglobulinas quiméricas inclui imunoglobulinas quiméricas tendo um idiotípico humano.
Numa forma de realização, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante humano e são funcionais e capazes de sofrer o reajuste genético e de produzir um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotípico humano e região constante humana. 18
Também são divulgados métodos para fazer um animal transgénico da invenção, cujos métodos compreendem o cruzamento de um animal transgénico que tem pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena com um segundo animal transgénico tendo pelo menos um locus de Ig artificial, cujo locus compreende (i) uma região V tendo pelo menos um segmento genético humano V que codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos genéticos J; e (iii) um ou mais genes de região constante, de forma a produzir um animal transgénico Fl, em que o animal transgénico Fl compreende o pelo menos um locus de Ig artificial do segundo animal transgénico, e em que o locus de Ig artificial a partir do segundo animal transgénico é funcional e capaz de sofrer o reajuste genético e produzir um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico Fl. 0 cruzamento pode ser efetuado através da procriação dos animais ou combinando os gametas de outra forma, incluindo manipulações loci de Ig. 0 segundo animal transgénico pode compreender pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. 0 segundo animal transgénico pode compreender pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Opcionalmente, os primeiros e segundos animais transgénicos têm falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional, e o segundo animal transgénico compreende um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Os animais podem ser cruzados de forma a produzirem um Fl que tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e compreende um locus de cadeia pesada de Ig artificial. 19
Opcionalmente, o segundo animal transgénico compreende pelo menos dois loci de Ig artificial, incluindo pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. Opcionalmente, os loci de Ig artificial do segundo animal transgénico são funcionais e são capazes de sofrerem o reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico Fl, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotipico humano. Opcionalmente, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante não-humano e são funcionais e capazes de sofrer reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas quiméricas no animal transgénico Fl, cujo repertório de imunoglobulinas quiméricas inclui imunoglobulinas quiméricas tendo um idiotipico humano. Opcionalmente, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante humano e são funcionais e capazes de sofrer reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico Fl, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotipico humano e uma região constante humana.
Do mesmo modo, há métodos divulgados que compreendem o cruzamento de um segundo animal transgénico tendo pelo menos um locus de Ig artificial com um animal transgénico da invenção que é capaz de gerar uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena que está inativado. Preferencialmente, o segundo animal transgénico compreende pelo menos dois loci de Ig artificial, incluindo 20 pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Numa forma de realização, os métodos compreendem a introdução de pelo menos um locus de Ig artificial numa célula germinal tendo pelo menos um locus de Ig endógena que foi, ou é capaz de ser inativado pela atividade de uma ou mais meganucleases, em que pelo menos um locus de Ig artificial compreende (i) uma região V que tem pelo menos um segmento genético humano V que codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos de região v humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos genéticos J; e (iii) um ou mais genes de região constante, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de sofrer o reajuste genético e produzir um repertório de imunoglobulinas artificiais num animal transgénico derivado a partir da célula germinal. Os métodos também compreendem derivar um animal transgénico F1 compreendendo pelo menos um locus de Ig artificial e tendo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena que foi inativada pela ação de um ou mais meganucleases a partir da célula germinal então produzida.
Numa forma de realização, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
Numa forma de realização, a célula germinal tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e o locus de Ig artificial introduzido na célula germinal é um locus de cadeia pesada de Ig. 21
Numa forma de realização, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Numa forma de realização preferida, pelo menos dois loci artificiais são introduzidos na célula germinal, incluindo pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. Numa forma de realização, os loci de Ig artificiais são funcionais e são capazes de sofrerem o reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico F1 derivado, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotípico humano. Numa forma de realização, um ou vários genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante não-humano e são funcionais e capazes de sofrer reajuste genético e de produzirem um repertório de imunoglobulinas quiméricas no animal transgénico F1 derivado, cujo repertório de imunoglobulinas quiméricas inclui imunoglobulinas quiméricas tendo um idiotipico humano, numa forma de realização, um ou mais genes de região constante dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante humano e são funcionais e capazes de sofrer reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico F1 derivado, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotipico humano e região constante humana.
Numa forma de realização, os métodos envolvem células germinais de proteção da viabilidade e inativação de um locus de Ig endógena. 22
Numa forma de realização, os métodos envolvem células germinais de proteção da presença de um locus de Ig artificial.
Numa forma de realização, os métodos compreendem a introdução de pelo menos um locus de Ig artificial num oócito ou embrião fertilizado derivado a partir da célula germinal tendo pelo menos um locus de Ig endógena que foi, ou é capaz de ser inativado pela ação de uma ou mais meganucleases, em que pelo menos um locus de Ig artificial compreende (i) uma região V que tem pelo menos um segmento genético humano V que codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos genéticos J; e (iii) um ou mais genes de região constante, em que o locus de Ig artificial é funcional e capaz de sofrer o reajuste genético e produzir um repertório de imunoglobulinas artificiais no animal transgénico original, ou um descendente desse, derivado a partir do oócito ou embrião fertilizado. Os métodos também compreendem derivar a partir do oócito ou embrião fertilizado o animal transgénico fundador, e opcionalmente o descendente desse, de forma a produzir um animal transgénico que compreende pelo menos um locus de Ig artificial e tendo pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena que foi inativada pela ação de uma ou mais meganucleases.
Numa forma de realização, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. 23
Numa forma de realização, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Numa forma de realização, o oócito ou embrião fertilizado tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e o locus de Ig artificial introduzido no oócito ou embrião fertilizado é um locus de cadeia pesada de Ig.
Numa forma de realização preferida, pelo menos dois loci artificiais são introduzidos no oócito ou embrião fertilizado, incluindo pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. Numa forma de realização, os loci de Ig artificiais são funcionais e são capazes de sofrerem o reajuste genético e produzirem um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico fundador, ou um descendente desse, cujo repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotípico humano. Numa forma de realização, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante não-humano e são funcionais e capazes de sofrer o reajuste genético e de produzir um repertório de imunoglobulinas quiméricas no animal transgénico fundador, ou um descendente desse, cujo repertório de imunoglobulinas quiméricas inclui imunoglobulinas quiméricas tendo um idiotípico humano. Numa forma de realização, um ou mais genes de região constantes dos loci de Ig artificial compreendem pelo menos um gene de região constante humano e são funcionais e capazes de sofrer o reajuste genético e de produzir um repertório de imunoglobulinas no animal transgénico fundador, ou um descendente desse, cujo 24 repertório de imunoglobulinas inclui imunoglobulinas tendo um idiotipico humano e região constante humana. A divulgação confere métodos para produção de animais transgénicos capazes de gerarem uma célula germinal viável em que pelo menos um locus de Ig endógena está inativado. Numa forma de realização preferida, os métodos compreendem a geração de um animal transgénico tendo um elemento de expressão de meganuclease genómica, em que o elemento de expressão compreende uma região de controlo da expressão ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação da meganuclease. Numa forma de realização preferida, o elemento é um elemento de expressão de meganuclease genómica induzivel que pode ser induzido de forma a expressar o ácido nucleico de codificação da meganuclease numa célula germinal. A divulgação confere métodos para produção de um animal transgénico capaz de ter uma célula germinal viável em que pelo menos um locus de Ig endógena está inativado. Os métodos compreendem a inativação do locus de Ig endógena na célula germinal, ou numa célula germinal progenitora ou oócito ou embrião fertilizado derivado a partir desse, através da expressão de uma meganuclease nesse. A divulgação confere uma célula germinal viável em que pelo menos um locus de Ig endógena é capaz de ser inativado. Numa forma de realização preferida, a célula germinal compreende um elemento de expressão de meganuclease genómica, em que o elemento de expressão compreende uma região de controlo da expressão ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação da meganuclease. Numa 25 forma de realização preferida, o elemento é um elemento de expressão de meganuclease genómica induzível que pode ser induzido de forma a expressar o ácido nucleico de codificação da meganuclease numa célula germinal.
Opcionalmente, a célula germinal compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
Opcionalmente, a célula germinal compreende pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Opcionalmente, a célula germinal compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Também é divulgada uma célula germinal viável em que pelo menos um locus de Ig endógena é inativado.
Opcionalmente, a célula germinal compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
Opcionalmente, a célula germinal compreende pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Opcionalmente, a célula germinal compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial. A divulgação confere métodos para produção de uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado. Os métodos envolvem a expressão de pelo menos uma meganuclease numa célula germinal, oócito ou embrião fertilizado, de forma a gerar uma célula germinal viável 26 tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado. A meganuclease assim expressa reconhece uma de sequência alvo de meganuclease presente no ou proximal ao referido locus de Ig endógena.
Opcionalmente, em que a meganuclease é expressa numa célula germinal, a célula germinal na qual a meganuclease é expressa produz uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado. Alternativamente, uma célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado pode ser obtida a partir de um animal derivado a partir da célula germinal na qual a meganuclease foi expressa.
Opcionalmente, em que a meganuclease é expressa num oócito ou embrião fertilizado, a célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado pode ser obtida a partir de um animal derivado a partir do oócito ou embrião fertilizado no qual a meganuclease foi expressa.
Opcionalmente, pelo menos um locus de Ig endógena é inativado in vitro. Numa forma de realização, pelo menos um locus de Ig endógena é inativado in vivo.
Opcionalmente, a célula germinal também compreende pelo menos um locus de Ig artificial. Numa forma de realização, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial. Numa forma de realização, o pelo menos um locus de Ig artificial inclui pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Opcionalmente, pelo menos dois loci de Ig artificiais são introduzidos na célula germinal, incluindo pelo menos um 27 locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial.
Também divulgados são anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, hibridomas, e métodos para realização e utilização dos mesmos, gue provêm da produção de anticorpos nos animais transgénicos presentemente divulgados que transportam um ou mais loci artificiais e tendo um ou mais loci de Ig endógenas inativados através da atividade da meganuclease.
Opcionalmente, os anticorpos são anticorpos apenas de cadeia pesada, que são produzidos utilizando animais transgénicos que tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e que compreendem um locus de cadeia pesada artificiais, obtido pelos métodos descritos neste documento.
Além disso são divulgados métodos para produção de anticorpos utilizando animais transgénicos conferidos neste documento. Os métodos compreendem a imunização de um animal transgénico da invenção, cujo animal tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado e transporta pelo menos um locus de Ig artificial conforme descrito neste documento, com um imunogénio. Num método preferido, o animal transgénico é nulizigótico para cadeia pesada de Ig endógena e/ou cadeia leve de Ig endógena e, de acordo com isso, incapaz de produzir imunoglobulinas endógenas. Num método, o animal transgénico tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e compreende um locus de cadeia pesada de Ig artificial. 28 A divulgação inclui composiçoes de antissoro policlonais assim produzidas. Os antissoros policlonais da invenção preferivelmente compreendem anticorpos tendo um idiotípico humano. Preferivelmente, um antissoro policlonal compreende anticorpos que consistem essencialmente em anticorpos que têm um idiotipico humano. A invenção confere métodos para produção de anticorpos monoclonais conforme descrito acima.
Numa forma de realização preferida, o anticorpo monoclonal tem um idiotipico humano. A invenção confere anticorpos monoclonais produzidos pelos métodos acima mencionados. A invenção confere ácidos nucleicos isolados que codificam esses anticorpos monoclonais. A invenção inclui anticorpos monoclonais totalmente humanos produzidos através dos métodos para produção de anticorpos monoclonais totalmente humanos descritos acima.
Numa forma de realização, um imunogénio utilizado nos métodos neste documento compreende um organismo causador de doença ou parte antigénica desse.
Numa forma de realização, um imunogénio utilizado nos métodos neste documento é um antigeno endógeno aos seres humanos. Numa forma de realização alternativa, um imunogénio utilizado nos métodos neste documento é um antigeno exógeno aos seres humanos. 29 A divulgação inclui métodos para neutralização ou modulação da atividade de uma entidade antigénica num componente do corpo humano. Numa forma de realização, os métodos compreendem o contacto do componente do corpo com uma composição de antissoro policlonal da invenção, em que a composição de antissoro policlonal compreende moléculas de imunoglobulina que se ligam especificamente a e neutralizam ou modulam a atividade da entidade antigénica.
Opcionalmente, os métodos compreendem o contacto do componente do corpo com um anticorpo monoclonal da invenção, em o anticorpo monoclonal se liga especificamente a e neutraliza ou modula a atividade da entidade antigénica.
Opcionalmente, o anticorpo monoclonal é um anticorpo monoclonal totalmente humano.
Opcionalmente, a entidade antigénica é originária de um organismo que provoca uma doença infeciosa.
Opcionalmente, a entidade antigénica é uma molécula de superfície celular.
Opcionalmente, a entidade antigénica é uma citocina humana ou uma quimiocina humana.
Opcionalmente, a entidade antigénica é uma molécula de superfície celular em umas células de um cancro maligno.
As células podem ser derivadas a partir de animais transgénicos da invenção. 30
As células podem ser derivadas a partir do baço de animais transgénicos da invenção.
Também são divulgadas células B derivadas a partir de animais transgénicos da invenção, cujas células B são capazes de produzir anticorpos tendo um idiotípico humano e células germinais derivadas a partir de animais transgénicos da invenção. A divulgação inclui métodos para realização de hibridomas capazes de produzirem anticorpos tendo um idiotípico humano. Os métodos compreendem a utilização de células derivadas a partir de animais transgénicos da invenção. A divulgação inclui hibridomas assim produzidos e anticorpos tendo um idiotípico humano, cujos anticorpos são produzidos através de um hibridoma da invenção. Também são divulgadas composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo da invenção, cujo anticorpo tem um idiotípico humano.
Também são divulgados métodos para tratamento de um paciente com necessidade de tratamento, compreendendo a administração ao paciente de um montante terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A Figura 1 mostra uma representação esquemática de uma cadeia pesada artificial composta de uma região humana V-, D, e J-, um realçador intrónico de rato e vários genes de região constantes artificiais. Os genes de região constantes artificiais contêm exãos que codificam um domínio CHI humano e domínios CH2, 3 e 4 de rato. A 31 extensão da membrana e as sequências de polipéptido citoplasmático são codificadas pelos exãos do rato.
Figura 2 - Esquemática da interação de I-Scel e ADN na extremidade 3' da sequência de reconhecimento.
Figura 3 - Esquemática da interação da extremidade 5' da sequência de reconhecimento de I-Scel com I-Scel.
Figura 4 - Esquemática do mecanismo de reconhecimento da sequência de I-Crel (a partir de Nucleic Acids Res., 34, 4791 - 4800) .
Figura 5 - Diagrama esquemático da estratégia para alterar a sequência de reconhecimento de I-Crel.
Figura 6 - Proteína de dedo de zinco (ZFP) projetada contra sequências que codificam a IgM do rato expressa em células, foi preparado ADN cromossomático, e a região apropriada do locus de IgM foi amplificado com PCR. Os produtos de reação foram analisados através da eletroforese em gel de poliacrilamida. As figuras mostram um exemplo típico que demonstra a atividade de divisão.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Por "locus de imunoglobulina artificial" pretende-se que seja um locus de imunoglobulina compreendendo os fragmentos dos loci de imunoglobulina humanos e não-humanos, incluindo múltiplos segmentos genéticos de imunoglobulina, os quais incluem pelo menos um segmento genético de região variável (V), um ou mais segmentos genéticos J, um ou mais segmentos genéticos D no caso de um locus de cadeia pesada, e um ou mais segmentos genéticos de região constante. Na presente invenção, pelo menos um dos segmentos genéticos V codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada. Numa forma de realização preferida, um locus de imunoglobulina artificial da invenção é funcional 32 e capaz do reajuste e da produção de um repertório de imunoglobulinas. Numa forma de realização preferida, pelo menos um segmento genético D é um segmento genético humano D. "Locus de Ig artificial" conforme utilizado neste documento pode referir-se a loci não reajustados, loci parcialmente reajustados e loci reajustados. Os loci de Ig artificial incluem loci de cadeia leve de Ig artificial e loci de cadeia pesada de Ig artificial. Numa forma de realização, um locus de Ig artificial compreende um gene de região C não-humano e é capaz de produzir um repertório de imunoglobulinas incluindo imunoglobulinas quiméricas tendo uma região C não-humana. Numa forma de realização, um locus de Ig artificial compreende um gene de região C humano e é capaz de produzir um repertório de imunoglobulinas incluindo imunoglobulinas tendo uma região C humana. Numa forma de realização, um locus de Ig artificial compreende um "gene de região constante artificial", através do qual se pretende que um gene de região constante que compreende sequências de nucleótido derive a partir de genes de regiões constantes humanos e não-humanos. Por exemplo, um gene de região constante C artificial exemplificativo é um gene de região constante que codifica um IgG de domínio CHI humano e domínios CH2 e CH3 de rato.
Em algumas formas de realização, um locus de cadeia pesada de Ig artificial tem falta de CHI, ou de uma sequência equivalente que permite que a imunoglobulina resultante iluda a associação típica de imunoglobulina: chaperona. Tais loci artificiais conferidos para a produção de anticorpos apenas de cadeia pesada em animais transgénicos que tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e que por isso não expressam a cadeia leve de Ig funcional. Tais loci de cadeia pesada de Ig artificial, neste 33 documento, são utilizados em métodos para produzir animais transgénicos que têm falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional, e compreendem um locus de cadeia pesada de Ig artificial, cujos animais são capazes de produzir anticorpos apenas de cadeia pesada. Alternativamente, um locus de Ig artificial pode ser manipulado in situ de forma a interromper CHI ou uma região equivalente e gerar um locus de cadeia pesada de Ig artificial que provê a produção de anticorpos apenas de cadeia pesada. Tendo em conta a produção de anticorpos apenas de cadeia pesada em ratos deficientes em cadeia leve, por exemplo ver Zou e outros., JEM, 204: 3271 - 3283, 2007.
Por "idiotípico humano" pretende-se que seja uma sequência de polipéptido presente num anticorpo humano codificado por um segmento genético V de imunoglobulina. O termo "idiotípico humano" conforme utilizado neste documento inclui tanto as sequências de um anticorpo humano que ocorrem naturalmente, bem como as sequências sintéticas substancialmente idênticas ao polipéptido encontrado nos anticorpos humanos que ocorrem naturalmente. Por "substancialmente" pretende-se que o grau da identidade da sequência de aminoácidos seja pelo menos cerca de 85% -95%. Preferivelmente, o grau da identidade da sequência de aminoácidos é maior do que 90%, mais preferivelmente maior do que 95%.
Por um "anticorpo quimérico" ou uma "imunoglobulina quimérica" pretende-se que seja uma molécula de imunoglobulina compreendendo uma parte de uma sequência de polipéptido de imunoglobulina humana (ou uma sequência de polipéptido codificada por um segmento genético de Ig humana) e uma parte de uma sequência de polipéptido de 34 imunoglobulina não-humana. As moléculas de imunoglobulina quimérica da presente invenção são imunoglobulinas com regiões Fc não-humanas ou regiões Fc artificiais, e idiótipos humanos. Tais imunoglobulinas podem ser isoladas a partir de animais da invenção que foram projetados de forma a produzirem moléculas de imunoglobulina quimérica.
Por "região Fc artificial" pretende-se que seja uma região Fc codificada por um gene de região constante artificial. 0 termo "segmento genético de Ig" conforme utilizado neste documento refere-se aos segmentos de ADN que codificam várias partes de uma molécula de Ig, que estão presentes na linha germinal de animais não-humanos e humanos, e que se são colocadas em conjunto nas células B de modo a formarem genes de Ig reajustada. Desse modo, segmentos genéticos de Ig conforme utilizado neste documento incluem segmentos genéticos V, segmentos genéticos D, segmentos genéticos J e segmentos genéticos de região C. 0 termo "segmento genético de Ig humana" conforme utilizado neste documento inclui tanto as sequências que ocorrem naturalmente de um segmento genético de Ig humana, formas degeneradas de sequências que ocorrem naturalmente de um segmento genético de Ig humana, bem como sequências sintéticas que codificam uma sequência de polipéptido substancialmente idêntica ao polipéptido codificado por uma sequência que ocorre naturalmente de um segmento genético de Ig humana. Por "substancialmente" pretende-se que o grau da identidade da sequência de aminoácidos seja pelo menos cerca de 85% - 95%. Preferivelmente, o grau da identidade da sequência de aminoácidos é maior do que 90%, mais preferivelmente maior do que 95%. 35
Por "meganuclease" pretende-se que seja uma endodeoxiribonuclease que reconhece longos locais de reconhecimento no ADN, preferivelmente pelo menos 12, mais preferivelmente pelo menos 13, mais preferivelmente pelo menos 14, mais preferivelmente pelo menos 15, mais preferivelmente pelo menos 16, mais preferivelmente pelo menos 17, e preferencialmente pelo menos 18 nucleótidos em comprimento. As meganucleases incluem as nucleases de dedo de zinco, as endonucleases estruturais que ocorrem naturalmente e as nucleases de dedo de zinco personalizadas e as endonucleases estruturais. 0 que é necessário para a utilização na invenção é que a meganuclease reconheça uma sequência alvo de meganuclease presente em ou proximal a um locus de Ig endógena no animal em causa, de tal forma que uma mutação funcional pode ser introduzida no locus de Ig pela ação da meganuclease. Para mais discussão das meganucleases, ver, por exemplo, os Pedidos de Publicação das Patentes dos Estados Unidos N° 20060206949, 20060153826, 20040002092, 20060078552, e 20050064474.
As nucleases de dedo de zinco com a especificidade alterada podem ser geradas a partir da combinação de dedos de zinco individuais com diferentes alvos triplos. A especificidade das endonucleases estruturais que ocorrem naturalmente pode ser alterada através pela manipulação de proteína com base na estrutura. Por exemplo, ver Proteus e Carroll, nature biotechnology 23 (8): 967 - 97, 2005.
Um animal tendo uma "linha germinal de locus de Ig inativado", ou "linha germinal de locus de Ig endógena inativado", ou "linha germinal de mutação num locus de Ig endógena", tem um locus de Ig endógena inativado em todas 36 as células, isto é, em cada célula somática e germinal. Na presente invenção, os animais que têm linha germinal de loci inativado são produzidos através da mutação, conforme efetuado pela ação de uma meganuclease numa célula germinal que origina o animal resultante, ou um predecessor desse.
Produção de Células Germinais Viáveis e Animais
Transgénicos Tendo Loci de Ig endógena Inativado Na presente invenção, as meganucleases são utilizadas de forma a inativarem os loci de Ig endógenas de modo a produzirem células germinais viáveis que têm pelo menos um locus de Ig endógena inativado. Os métodos envolvem a expressão de pelo menos uma meganuclease numa célula germinal, oócito ou embrião fertilizado, de forma a gerar uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado. A meganuclease assim expressa reconhece uma sequência alvo de meganuclease presente no ou proximal ao locus de Ig endógena no animal em causa.
Numa forma de realização, em que a meganuclease é expressa numa célula germinal, a célula germinal na qual a meganuclease é expressa produz uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado. Alternativamente, uma célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado pode ser obtida a partir de um animal derivado a partir da célula germinal na qual a meganuclease foi expressa.
Numa forma de realização, em que a meganuclease é expressa num oócito ou embrião fertilizado, a célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado pode ser obtida a partir de um animal derivado a partir do oócito ou embrião fertilizado no qual a meganuclease foi expressa. 37 A invenção também confere métodos para produção de animais transgénicos que compreendem pelo menos uma linha germinal inativada de locus de Ig endógena. Os métodos compreendem a derivação de um animal transgénico a partir de uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado produzido de acordo com os métodos deste documento.
Numa forma de realização, a célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado também compreende um locus de Ig artificial, e o animal transgénico produzido desse modo compreende um locus de Ig artificial.
Numa forma de realização, os métodos também compreendem a introdução de um locus de Ig artificial na célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado, ou uma célula germinal descendente desse ou um oócito ou embrião fertilizado derivado a partir desse, e o animal transgénico produzido desse modo compreende um locus de Ig artificial.
Numa forma de realização, os métodos compreendem a combinação de uma célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado, ou uma célula germinal descendente desse com um gâmeta compreendendo loci de Ig artificial, e o animal transgénico produzido desse modo compreende um locus de Ig artificial.
Inativação de loci de Ig endógena A inativação de loci de Ig endógena é efetuada utilizando meganucleases específicas para fragmentos genéticos de 38 imunoglobulina em loci de cadeia pesada e/ou leve endógenos ao animal em causa. Numa forma de realização podem ser induzidas guebras de cadeia dupla através da injeção de uma meganuclease nas células germinais, oócitos ou embriões fertilizados. Alternativamente, os vetores de expressão ou o ácido nucleico gue codificam uma meganuclease e capazes de serem expressos nas células germinais, os oócitos ou embriões fertilizados podem ser injetados no mesmo.
Numa forma de realização, o método envolve a transfetação de células germinais, gue podem incluir os seus próprios precursores, tais como células de origem espermatogónia, loci de Ig ou in vivo com uma meganuclease gue codifica ácido nucleico ou o elemento de expressão. Por exemplo, ver Ryu e outros, J. Aridrol., 28: 353 - 360, 2007; Orwig e outros, Biol. Report, 67: 874 - 879, 2002.
Numa forma de realização preferida, um elemento de expressão de meganuclease é integrado no genoma do animal em causa. A expressão da codificação transgénica da meganuclease em células germinais irá resultar em quebras de cadeia dupla em loci de Ig endógena e subsequente mutação do local de restrição. O acasalamento desses animais transgénicos resulta em descendência com loci de imunoglobulina mutados/ inativados.
Numa forma de realização altamente preferida da presente invenção, um elemento de expressão de meganuclease regulável é integrado no genoma do animal em causa, cujo elemento de regulação é induzivel nas células germinais. Tais elementos conferidos para a minimização dos efeitos citotóxicos associados com a expressão de uma determinada meganuclease através da expressão controlada através de 39 promotores induzíveis, por exemplo promotores induzíveis pelo calor, promotores induzíveis pela radiação, operão de tetraciclina, promotores induzíveis por hormonas, e promotores induzíveis por dimerização de transativadores, e semelhantes. Por exemplo, ver Vilaboa e outros, Current Gene Therapy, 6: 421 - 438, 2006.
Alternativamente, a expressão meganuclease pode ser induzida num embrião derivado a partir da célula germinal.
Numa forma de realização, uma única meganuclease é expressa numa célula germinal, em que a meganuclease reconhece uma sequência alvo em ou proximal a um locus de imunoglobulina endógena à célula germinal do animal em causa. Numa forma de realização preferida, a sequência alvo de meganuclease está em ou proximal a um segmento genético J. Numa outra forma de realização preferida, a sequência alvo de meganuclease está em ou proximal a um gene de região constante de imunoglobulina. Numa forma de realização preferida, o gene de região constante de imoglubina codifica a imunoglobulina μ.
Numa forma de realização preferida, são utilizadas pelo menos duas meganucleases tendo sequências alvo distintas. As pelo menos duas meganucleases são expressas numa célula germinal, em que as meganucleases reconhecem sequências alvo distintas em ou proximal a um locus de imunoglobulina endógena à célula germinal do animal em causa.
Numa forma de realização preferida, as primeiras e segundas meganucleases têm como alvo segmentos genéticos J. Numa forma de realização, as primeiras e segundas sequências alvo de meganuclease estão, consideradas em conjunto, a 40 montante e a jusante de um ou mais segmentos genéticos J dentro do locus de Ig endógena, e a divisão pela primeiras e segundas meganucleases codificadas produz a eliminação de um segmento de ADN genómico compreendendo um ou mais segmentos genéticos J.
Numa outra forma de realização, as primeiras e segundas meganucleases têm como alvo segmentos genéticos de região constante. Numa forma de realização, as primeiras e segundas sequências alvo de meganuclease estão, consideradas em conjunto, a montante e a jusante de um ou mais segmentos genéticos de região constante de imunoglobulina, e a divisão pela primeiras e segundas meganucleases codificadas produz a eliminação de um segmento de ADN genómico compreendendo um ou mais segmentos genéticos de região constante de imunoglobulina. Numa forma de realização preferida, o gene de região constante codifica a imunoglobulina μ.
Numa forma de realização, a totalidade do locus de uma cadeia pesada de Ig endógena e/ou de cadeia leve de Ig, ou grandes partes dessas são eliminadas a partir do genoma do animal em causa. Tais animais são também referidos como compreendendo um locus endógeno que foi inativado.
Numa forma de realização, é utilizada pelo menos uma meganuclease para interromper a região CHI do locus de cadeia pesada de Ig endógena, deixando o resto do locus intato e capaz de produzir uma cadeia pesada de Ig que ilude a associação tipica da imunoglobulina: chaperona. Preferivelmente, este alvo de CHI é efetuado num animal que tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional. Tal 41 alvo em tais animais é útil para produzir anticorpos apenas de cadeia pesada.
Numa forma de realização, é utilizada mais do que uma meganuclease tendo CHI como alvo dentro do locus de cadeia pesada de Ig.
Numa forma de realização, são utilizadas duas meganucleases de reconhecimento de locais adjacentes. Numa forma de realização, os locais são os elementos de um palíndromo. Numa forma de realização, as duas meganucleases são ligadas por um ligador.
Em formas de realização preferenciais, as estratégias de reprodução utilizadas são projetadas de forma a obter animais que são nulizigóticos para cadeia leve de Ig endógena e/ou cadeia pesada de Ig endógena.
Animais Transgénicos que compreendem elementos de expressão de meganuclease genómica reguláveis
Num aspeto, a invenção confere animais transgénicos que compreendem pelo menos um elemento de expressão de meganuclease genómica regulável.
Os animais transgénicos são selecionados a partir de pequenos animais de laboratório, particularmente pássaros (frango, peru, codorniz, pato, faisão ou ganso e semelhantes), roedores (p. ex., ratos, hamsters e porquinhos da índia), e doninhas (p. ex., furões).
Numa forma de realização preferida, o elemento de expressão de meganuclease genómica regulável, compreende uma região de controlo da expressão induzivel ligada de forma 42 operacional a um ácido nucleico de codificação da meganuclease. A região de controlo da expressão induzivel é induzivel funcional numa célula germinal do animal transgénico em causa, e a meganuclease codificada é seletiva para uma sequência alvo da meganuclease situada em ou proximal a um locus de imunoglobulina endógena do animal em causa.
Um elemento de expressão de meganuclease regulável conferido para a minimização dos efeitos citotóxicos associados com a expressão de uma determinada meganuclease através da expressão controlada através de promotores induziveis, por exemplo promotores induziveis pelo calor, promotores induziveis pela radiação, operão de tetraciclina, promotores induziveis por hormonas, e promotores induziveis por dimerização de transativadores, e semelhantes.
Numa forma de realização preferida, um animal transgénico da invenção compreende dois elementos de expressão de meganuclease genómica regulável, compreendendo dois ácidos nucleicos distintos que codificam duas meganucleases distintas que reconhecem duas sequências alvo distintas. As duas meganucleases em combinação funcionam de forma a eliminar um segmento de ADN genómico de um locus de Ig endógena e dessa forma inativam o mesmo.
Os animais transgénicos que compreendem pelo menos um elemento de expressão de meganuclease genómica regulável podem ser feitos através de meios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um vetor transgénico que contém uma região de controlo da expressão induzivel ligado de forma operacional a um ácido nucleico de codificação da 43 meganuclease pode ser introduzido numa célula ou células do recetor e depois ser integrado no genoma da célula ou células do recetor através de integração aleatória ou por integração alvo.
Para a integração aleatória, esse vetor transgénico pode ser introduzido numa célula do recetor através da tecnologia transgénica padrão. Por exemplo, um vetor transgénicos pode ser diretamente injetado no pronúcleo de um oócito fertilizado. Um vetor transgénico também pode ser introduzido através da co-incubação de esperma com o vetor transgénico antes da fertilização do oócito. Os animais transgénicos podem ser desenvolvidos a partir de oócitos fertilizados. Outro modo de introduzir um vetor transgénico é através da transfetação de células de origem embrionária ou outras células pluripotentes (por exemplo células germinais primordiais) e posteriormente injetar as células geneticamente modificadas nos embriões em desenvolvimento. Alternativamente, um vetor transgénico (isolado ou em combinação com reagentes de facilitação) pode ser diretamente injetado num embrião em desenvolvimento. Noutra forma de realização, o vetor transgénico é introduzido no genoma de uma célula e um animal é derivado a partir da célula transfectada pela clonagem de transferência nuclear.
Para a integração alvo, esse vetor transgénico pode ser introduzido em células do recetor apropriadas tais como células de origem embrionária ou células somáticas já diferenciadas. Depois disso, as células nas quais o transgénico foi integrado no genoma dos animais no local alvo através da recombinação homóloga podem ser selecionadas através de métodos padrão. As células selecionadas podem então ser fundidas com células de 44 unidade de transferência nucleares enucleadas, p. ex. oócitos ou células de origem embrionária, células que são totipotentes e capazes de formar um neonato funcional. A fusão é efetuada de acordo com técnicas convencionais que estão bem estabelecidas. Ver, por exemplo, Cibelli e outros., Science (1998) 280: 1256 Zhou e outros. Science (2003) 301: 1179. O desenvolvimento de oócitos e transferência nuclear também pode ser efetuado pela microcirurgia através da utilização de pipetas de injeção. (Ver, por exemplo, Wakayama e outros., Nature (1998) 394: 369.) As células resultantes são então cultivadas num meio apropriado, e transferidas para recipientes sincronizados para a geração de animais transgénicos. Alternativamente, as células selecionadas geneticamente modificadas podem ser injetadas em embriões em desenvolvimento.
Numa forma de realização, é utilizada uma meganuclease de forma a aumentar a frequência da recombinação homóloga num local alvo através da divisão do ADN de cadeia dupla.
Animais transgénicos que compreendem loci de Ig artificial e capazes de produzir anticorpos tendo idiótipos humanos Num aspeto, a invenção confere animais transgénicos capazes de produzirem imunoglobulinas tendo idiótipos humanos, bem como métodos para realização das mesmas.
Os animais transgénicos utilizados são selecionados a partir de particularmente pássaros (frango, peru, codorniz, pato, faisão ou ganso e semelhantes), roedores (p. ex., ratos, hamsters e porquinhos da índia), e doninhas (p. ex., furões) . 45
Os animais transgénicos utilizados para a produção de anticorpos humanizados na invenção transportam mutações das linhas germinal em loci de Ig endógena que foram efetuados através da atividade de uma ou mais meganucleases. Numa forma de realização preferida, os animais transgénicos são nulizigóticos para cadeia pesada de Ig endógena e/ou cadeia leve de Ig endógena. Além disso, estes animais transportam pelo menos um locus de Ig artificial que é funcional e capaz de produzir um repertório de moléculas de imunoglobulina no animal transgénico. Os loci artificiais utilizados na invenção incluem pelo menos um segmento genético humano V.
Numa forma de realização preferida, os animais transgénicos transportam pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e pelo menos um locus de cadeia leve de Ig artificial em que cada um é funcional e capaz de produzir um repertório de moléculas de imunoglobulina no animal transgénico, cujo repertório de moléculas de imunoglobulina inclui anticorpos que têm um idiotípico humano. Numa forma de realização, são utilizados loci artificiais incluindo pelo menos um gene C não-humano, e são conferidos animais capazes de produzirem anticorpos quiméricos tendo um idiotípico humano e uma região constante não-humana. Numa forma de realização, são utilizados loci artificiais incluindo pelo menos um gene C humano, e são conferidos animais capazes de produzirem anticorpos tendo um idiotípico humano e uma região constante humana.
Numa outra forma de realização preferida, os animais transgénicos compreendem pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig artificial e têm falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional. Tais animais encontram utilização na produção de anticorpos apenas de cadeia pesada. A produção de tais animais transgénicos envolve a integração de um ou mais loci de cadeia pesada de Ig artificial e um ou mais loci de cadeia leve de Ig artificial no genoma de um animal transgénico que tem pelo menos um locus de Ig endógena que foi ou será inativado através da ação de uma ou mais meganucleases. De preferência, os animais transgénicos são nulizigóticos para cadeia pesada de Ig endógena e/ou cadeia leve de Ig endógena e, de acordo com isso, incapazes de produzir imunoglobulinas endógenas. Apesar da posição cromossomática, um locus de Ig artificial da presente invenção tem a capacidade de sofrer o reajuste genético e através desse produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglobulina. Um locus de Ig que tem a capacidade de sofrer reajuste genético também é referido neste documento como um locus de Ig "funcional", e os anticorpos com uma diversidade gerada através de um locus de Ig funcional também são referidos neste documento como anticorpos "funcionais" ou um repertório "funcional" de anticorpos.
Os loci artificiais utilizados para gerar tais animais transgénicos cada um inclui múltiplos segmentos genéticos de imunoglobulina, os quais incluem pelo menos um segmento genético de região V, um ou mais segmentos genéticos J, um ou mais segmentos genéticos D no caso de um locus de cadeia pesada, e um ou mais genes de região constante. Na presente invenção, pelo menos um dos segmentos genéticos V codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada. De acordo com isso, tais animais 47 transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglobulina, o que inclui anticorpos que têm um idiotípico humano.
Numa forma de realização, os loci artificiais utilizados compreendem pelo menos um segmento genético não-humano de região C. De acordo com isso, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglobulina, o que inclui anticorpos quiméricos que têm um idiotípico humano.
Numa forma de realização, os loci artificiais utilizados compreendem pelo menos um segmento genético humano de região C. De acordo com isso, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglobulina, o que inclui anticorpos que têm um idiotípico humano e uma região constante humana.
Numa forma de realização, os loci artificiais utilizados compreendem pelo menos um gene de região constante artificial. Por exemplo, um gene de região constante C artificial exemplificativo é um gene de região constante que codifica um IgG de domínio CHI humano e domínios CH2 e CH3 de rato. De acordo com isso, tais animais transgénicos têm a capacidade de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglobulina, o que inclui anticorpos que têm um idiotípico humano e uma região constante artificial compreendendo tanto componentes humanas como não-humanas. 0 vetor transgénico que contém um locus de Ig artificial é introduzido na célula ou células do recetor e depois ser integrado no genoma da célula ou células do recetor através de integração aleatória ou por integração alvo. 48
Para a integração aleatória, o vetor transgénico que contém o locus de Ig artificial pode ser introduzido numa célula do recetor através da tecnologia transgénica padrão. Por exemplo, um vetor transgénico pode ser diretamente injetado no pronúcleo de um oócito fertilizado. Um vetor transgénico também pode ser introduzido através da co-incubação de esperma com o vetor transgénico antes da fertilização do oócito. Os animais transgénicos podem ser desenvolvidos a partir de oócitos fertilizados. Outro modo de introduzir um vetor transgénico é através da transfectação de células de origem embrionária ou outras células pluripotentes (por exemplo células germinais primordiais) e posteriormente injetar as células geneticamente modificadas nos embriões em desenvolvimento. Alternativamente, um vetor transgénico (isolado ou em combinação com reagentes de facilitação) pode ser diretamente injetado num embrião em desenvolvimento. Ultimamente, os animais transgénicos quiméricos são produzidos a partir de embriões que contêm Ig transgénico artificial integrado no genoma de pelo menos algumas células somáticas do animal transgénico. Em outra forma de realização, o vetor transgénico é introduzido no genoma de uma célula e um animal é derivado a partir da célula transfectada pela clonagem de transferência nuclear.
Numa forma de realização preferida, um transgénico que contém um locus de Ig artificial é aleatoriamente integrado no genoma de células do recetor (tal como um oócito ou embriões fertilizados em desenvolvimento). As células do recetor são derivadas a partir de um animal que tem pelo menos um locus de Ig endógena que foi inativado através da ação de uma ou mais meganucleases. Alternativamente, os animais transgénicos que transportam loci de imunoglobulina 49 artificial, podem ser cruzados com animais transgénicos que têm pelo menos um locus de Ig endógena que foi inativado através da ação de uma ou mais meganucleases. Apesar do método particular utilizado, numa forma de realização preferida, é obtida a descendência que é nulizigótica para a cadeia pesada de Ig endógena e/ou cadeia leve de Ig e, de acordo com isso, incapaz de produzir imunoglobulinas endógenas e capaz de produzir imunoglobulinas transgénicas.
Para a integração alvo, um vetor transgénico pode ser introduzido em células do recetor apropriadas tais como células de origem embrionária, outras células pluripotentes ou células somáticas já diferenciadas. Depois disso, as células nas quais o transgénico foi integrado no genoma dos animais e foram substituídas no locus de Ig endógena correspondente através da recombinação homóloga podem ser selecionadas através de métodos padrão. As células selecionadas podem então ser fundidas com células de unidade de transferência nucleares enucleadas, p. ex. oócitos ou células de origem embrionária, células que são totipotentes e capazes de formar um neonato funcional. A fusão é efetuada de acordo com técnicas convencionais que estão bem estabelecidas. Ver, por exemplo, Cibelli e outros., Science (1998) 280: 1256 Zhou e outros. Science (2003) 301: 1179. O desenvolvimento de oócitos e transferência nuclear também pode ser efetuada pela microcirurgia através da utilização de pipetas de injeção. (Ver, por exemplo, Wakayama e outros., Nature (1998) 394: 369.) As células resultantes são então cultivadas num meio apropriado, e transferidas para recipientes sincronizados para a geração de animais transgénicos. Alternativamente, as células selecionadas geneticamente modificadas podem ser 50 injetadas em embriões em desenvolvimento que se desenvolvem posteriormente em animais quiméricos.
Numa forma de realização, é utilizada uma meganuclease de forma a aumentar a frequência da recombinação homóloga num local alvo através da divisão do ADN de cadeia dupla. Para a integração em loci de imunoglobulina endógena pode ser utilizada meganuclease num local especifico. Numa forma de realização, é utilizada uma meganuclease com o alvo de um locus de Ig endógena de forma a aumentar a frequência da recombinação homóloga e a substituição de um locus de Ig endógena, ou partes dessa com um locus de Ig artificial ou partes desse.
Numa forma de realização, o animal transgénico tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e compreende um locus de cadeia pesada de Ig artificial.
Loci de Ig artificial A presente invenção também é destinada a loci de Ig artificial e à sua utilização na criação de animais transgénicos capazes de produzirem imunoglobulinas tendo um idiotipico humano.
Cada locus de Ig artificial compreende múltiplos segmentos genéticos de imunoglobulina, os quais incluem pelo menos um segmento genético de região V, um ou mais segmentos genéticos J, um ou mais segmentos genéticos D no caso de um locus de cadeia pesada, e um ou mais genes de região constante. Na presente invenção, pelo menos um dos segmentos genéticos V codifica uma linha germinal ou sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada. De acordo com isso, tais animais transgénicos têm a capacidade 51 de produzir um repertório diversificado de moléculas de imunoglobulina, o que inclui anticorpos que têm um idiotipico humano. Nos loci de cadeia pesada humanos ou não-humanos derivados podem ser incluídos segmentos de gene D nos loci de Ig artificial. Os segmentos genéticos em tais loci estão justapostos em relação um ao outro numa configuração não reajustada (ou "configuração de linha germinal"), ou numa configuração parcialmente ou totalmente reajustada. Os loci de Ig artificial têm a capacidade de sofrer o reajuste genético (se os segmentos genéticos não forem totalmente reajustados) no animal em causa produzindo desse modo um repertório diversificado de imunoglobulinas que têm idiótipos humano.
Os elementos reguladores como promotores, realçadores, regiões de comutação, sinais de recombinação, e semelhantes podem ser de origem humana ou não-humana. 0 que é necessário é que os elementos sejam operáveis na espécie animal em causa, de forma a originarem os loci artificiais funcionais.
Num aspeto, a invenção confere elementos transgénicos que contêm um locus de cadeia pesada artificial capaz de sofrer o reajuste genético no animal hospedeiro produzindo desse modo um repertório diversificado de cadeias pesadas tendo idiótipos humano. Um locus de cadeia pesada artificial do transgénico contém uma região V com pelo menos um segmento genético humano V. Preferivelmente, a região V inclui pelo menos cerca de 5 - 100 segmentos genéticos de cadeia pesada humana V (ou "VH"). Conforme descrito acima, um segmento humano VH abrange sequências que ocorrem naturalmente de um segmento genético humano VH, formas degeneradas de sequências que ocorrem naturalmente de um segmento genético 52 humano VH, bem como sequências sintéticas que codificam uma sequência de polipéptido substancialmente (isto é, pelo menos cerca de 85% - 95%) idêntica a um polipéptido de domínio de cadeia pesada humana V.
Numa forma de realização preferida, o locus de cadeia pesada artificial contém pelo menos um ou vários genes de região constante de rato, p. ex., Cõ, Cp e Cy (incluindo qualquer uma das subclasses Cy).
Em outra forma de realização preferida, o locus de cadeia pesada artificial contém genes de região constante artificiais. Numa forma de realização preferida, esses genes de região constante artificiais codificam um domínio CHI humano e domínios CH2 CH3 de rato, ou um domínio CHI humano e CH2, CH3 e CH4 de rato. Uma cadeia pesada híbrida com domínio CHI humano emparelha efetivamente com uma cadeia leve totalmente humana.
Em outra forma de realização preferida, o locus de cadeia pesada artificial contém genes de região constante artificial que tem falta de domínios de CHI. Numa forma de realização preferida, tais genes de região constante artificial codificam IgM truncada e/ou IgG com falta do domínio CHI mas compreendendo domínios CH2, e CH3, ou CHI, CH2, CH3 e CH4. As cadeias pesadas que têm falta de domínios CHI não se podem emparelhar efetivamente com as cadeias leves de Ig e formar apenas anticorpos de cadeia pesada.
Num outro aspeto, a invenção confere elementos transgénicos que contêm um locus de cadeia pesada artificial capaz de sofrer o reajuste genético no animal hospedeiro produzindo 53 desse modo um repertório diversificado de cadeias leves tendo idiótipos humano. Um locus de cadeia leve artificial do transgénico contém uma região V com pelo menos um segmento genético humano V, p. ex., uma região V que tem pelo menos um gene VL humano e/ou pelo menos um segmento VJ humano reajustado. Preferivelmente, a região V inclui pelo menos cerca de 5 - 100 segmentos genéticos de cadeia leve humana V (ou "VL"). Consistentemente, um segmento humano VL abrange sequências que ocorrem naturalmente de um segmento genético humano VL, formas degeneradas de sequências que ocorrem naturalmente de um segmento genético humano VL, bem como sequências sintéticas que codificam uma sequência de polipéptido substancialmente (isto é, pelo menos cerca de 85% - 95%) idêntica a um polipéptido de domínio de cadeia leve humana V. Numa forma de realização, o locus de Ig de cadeia leve artificial tem uma região C que tem pelo menos um gene C de rato (p. ex., rato CX ou Ck) .
Outro aspeto da presente invenção é destinado a métodos para fazer um vetor transgénico contendo um locus de Ig artificial. Esses métodos envolvem a isolação loci de Ig ou fragmentos desses, e combinação dos mesmos, com um ou mais fragmentos de ADN compreendendo sequências que codificam elementos de região V humana. 0(s) segmento(s) genético(s) de Ig são inseridos no locus de Ig artificial ou uma parte desse através de ligação ou recombinação homóloga de tal modo que conserva a capacidade do locus sofrer o reajuste genético efetivo no animal em causa.
Preferivelmente, um locus de Ig não-humano é isolado triando uma biblioteca de plasmídeos, cosmídeos, YACs ou BACs, e semelhantes, preparados a partir do ADN genómico do mesmo. Os clones de YAC podem transportar fragmentos de ADN 54 de até 2 megabases, assim um locus de cadeia pesada de um animal completo ou uma grande parte desse pode ser isolado num clone de YAC, ou reconstruído de forma a ser contido num clone de YAC. Os clones de BAC são capazes de transportar fragmentos de ADN de tamanhos mais pequenos (cerca de 50 - 500 kb). No entanto, múltiplos clones de BAC contendo fragmentos de sobreposição de um locus de Ig podem ser alterados separadamente e posteriormente injetados em conjunto numa célula do recetor do animal, em que os fragmentos de sobreposição se recombinam na célula do animal recetor de forma a gerar um locus de Ig contínuo.
Os segmentos genéticos de Ig humana podem ser integrados no locus de Ig num vetor (p. ex., um clone de BAC) por uma variedade de métodos, incluindo ligação de fragmentos de ADN, ou inserção de fragmentos de ADN através de recombinação homóloga. A integração dos segmentos genéticos de Ig humanas é feita de tal forma que o segmento genético de Ig humana se liga de forma operacional à sequência do animal hospedeiro no transgénico de forma a produzir um locus de Ig humanizado funcional, isto é, um locus de Ig capaz do reajuste genético que leva à produção de um repertório diversificado de anticorpos com idiótipos humano. A recombinação homóloga pode ser efetuada em bactérias, levedura e outras células com uma elevada frequência de eventos de recombinação homóloga. Os YACs e BACs projetados podem ser prontamente isolados a partir das células e serem utilizados na criação de animais transgénicos.
Imunoglobulinas tendo um idiotípico humano
Uma vez que for criado um animal transgénico capaz de produzir imunoglobulinas tendo um idiotípico humano, as 55 imunoglobulinas e as preparações de anticorpos contra um antígeno podem ser prontamente obtidas através da imunização do animal com o antígeno. "Composição de antissoro policlonais" conforme utilizado neste documento inclui a afinidade com as preparações de anticorpos policlonais purificadas afinidade.
Uma variedade de antígenos pode ser utilizada de forma a imunizar um animal transgénico. Esses antígenos incluem mas não se limitam a, microrganismos, p. ex. vírus e organismos unicelulares (tais como bactérias e fungos), vivos, atenuados ou mortos, fragmentos dos microrganismos ou moléculas antigénicas isoladas a partir dos microrganismos.
Os antígenos bacterianos preferenciais para utilização na imunização de um animal incluem antígenos purificados a partir do Staphylococcus aureus como polissacarídeo capsular do tipo 5 e 8, as versões recombinantes dos fatores de virulência tais como toxina alfa, proteína de ligação adesiva, proteína de ligação de colagénio e proteína de ligação de fibronectina. Os antígenos bacterianos preferenciais também incluem uma versão atenuada de S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, enterococo, enterobacter, e Klebsiella pneumoniae, ou cultura sobrenadante destas células de bactérias. Outros antígenos bacterianos que podem ser utilizados na imunização incluem lipopolissacarídico purificado (LPS), antígenos capsulares, polissacarídeos capsular e/ou versões recombinantes da proteína da membrana exterior, proteína de ligação de fibronectina, endotoxina, e exotoxina de Pseudomonas aeruginosa, enterococo, enterobacter, e Klebsiella pneumoniae. 56
Os antígenos preferenciais para a geração de anticorpos contra fungos incluem a versão atenuada de fungos ou proteína da membrana exterior desses, cujos fungos incluem, mas não se limitam a, Candida albicans, Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, e Cryptococcus neoformans.
Os antígenos preferenciais para utilização na imunização de forma a gerar anticorpos contra vírus incluem as proteínas de envelope e as versões atenuadas dos vírus que incluem, mas não se limitam ao vírus sincilial respiratório (RSV) (em particular a proteína F) , Vírus da hepatite C (HCV) , Vírus da hepatite B (HBV), cytomegalovirus (CMV), EBV e HSV.
Os anticorpos específicos para o cancro podem ser gerados através da imunização de animais transgénicos com células de tumor isoladas ou linhas celulares de tumor bem como antígenos associados com o tumor que incluem, mas não se limitam a, antígeno de Her-2-neu (anticorpos contra os quais são úteis para o tratamento do cancro da mama) ; antígenos CD20, CD22 e CD53 (anticorpos contra os quais são úteis para o tratamento de linfomas de célula B), antígeno de membrana específica da próstata (PMSA) (anticorpos contra os quais são úteis para o tratamento do cancro da próstata), e molécula 17-1 A (anticorpos contra os quais são úteis para o tratamento do cancro do cólon).
Os antígenos podem ser administrados a um animal transgénico de qualquer maneira conveniente, com ou sem um adjuvante, e podem ser administrados de acordo com um horário predeterminado. 57
Para fazer um anticorpo monoclonal, são isoladas células do baço do animal transgénico imunizado e utilizadas tanto na fusão de célula com linhas celulares transformadas para a produção de hibridomas ou os anticorpos que codificam cDNAs são clonados através de técnicas de biologia molecular padrão e expressos em células transfectadas. Os procedimentos para efetuar anticorpos monoclonais estão bem estabelecidos na técnica. Ver, p. ex., o Pedido de Patente Europeia 0 583 980 AI ("Method For Generating Monoclonal
Antibodies From Rabbits"), a Patente dos Estados Unidos n° 4,977,081 ("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof), o documento WO 97/16537 ("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof) , e o documento EP 0491 057 BI ("Hybridoma Which Produces Avian Specific
Immunoglobulin G") . A produção loci de Ig de anticorpos monoclonais de moléculas de cDNA clonadas foi descrita por Andris-Widhopf e outros. "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Immunol Methods 242: 159 (2000), e por Burton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1: 87 (1995).
Uma vez que os anticorpos monoclonais quiméricos com idiótipos humano foram gerados, tais anticorpos quiméricos podem ser facilmente convertidos em anticorpos totalmente humanos utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Os anticorpos monoclonais totalmente humanos não são imunogénicos em humanos e são apropriados para a utilização no tratamento terapêutico de seres humanos.
Anticorpos da invenção incluem anticorpos apenas de cadeia pesada
Numa forma de realização, os animais transgénicos que têm falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional, e que 58 compreendem um locus de cadeia pesada artificial, estão imunizados com o antigeno de forma a produzirem anticorpos apenas de cadeia pesada que se ligam especificamente ao antigeno.
Numa forma de realização, a invenção confere células de produção de anticorpo monoclonais derivadas a partir de tais animais, bem como ácidos nucleicos derivados dos mesmos. Também são fornecidos hibridomas derivados a partir dos mesmos. Também são fornecidos anticorpos apenas de cadeia pesada totalmente humanos, bem como codificando ácidos nucleicos, conseguidos a partir dos mesmos.
Os ensinamentos em anticorpos apenas de cadeia pesada são encontrados na técnica. Por exemplo, ver as publicações de PCT WO02085944, WO02085945, WO2006008548, e W02007096779. Ver também os documentos US 5,840,526; US 5,874,541; US 6,005,079; US 6,765,087; US 5,800,988; EP 1589107; WO 9734103; e US 6,015,695.
Composições farmacêuticas
Numa outra forma de realização da presente invenção, os anticorpos monoclonais ou policlonais purificados são misturados com um transportador farmacêutico apropriado adequado para a administração aos pacientes, de forma a conferir composições farmacêuticas.
Os pacientes tratados com as composições farmacêuticas da invenção são preferivelmente mamíferos, mais preferivelmente humanos, embora as utilizações veterinárias também estejam contempladas. 59
Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas presentes composições farmacêuticas podem ser algum e todos os solventes, meios de dispersão, agentes isotónicos e semelhantes. Exceto na medida que quaisquer meios, agentes, diluentes ou transportadores convencionais sejam prejudiciais para o recipiente ou para a eficácia terapêutica dos anticorpos contidos nos mesmos, a sua utilização nas composições farmacêuticas da presente invenção é apropriada. 0 transportador pode ser liquido, semissólido, p. ex., pastas ou transportadores sólidos. Exemplos de transportadores incluem óleos, água, soluções salinas, álcool, açúcar, gel, lipídios, lipossomas, resinas, matrizes porosas, ligantes, enchimentos, revestimentos, conservantes e semelhantes ou combinações desses. Métodos de tratamento
Também divulgados são métodos para tratar uma doença num vertebrado, de preferência um mamífero, de preferência um primata, com os seres humanos a serem uma forma de realização especialmente preferida, através da administração de uma composição de anticorpo purificada da invenção desejável para o tratamento dessa doença.
As composições de anticorpos podem ser utilizadas de modo a ligar e neutralizar ou modular uma entidade antigénica em tecidos do corpo humano que provoca ou contribui para a doença ou que elicia respostas imunitárias indesejáveis ou anormais. Uma "entidade antigénica" é definida neste documento de forma a abranger quaisquer moléculas de ligação de superfície solúvel ou celular incluindo proteínas, bem como células ou organismos provocadores da 60 doença infecciosa ou agentes que são pelo menos capazes de se ligar a um anticorpo e de preferência também são capazes de estimular uma resposta imunitária. A administração de uma composição de anticorpo contra um agente infeccioso como uma monoterapia ou em combinação com quimioterapia resulta na eliminação de partículas contagiosas. Uma única administração de anticorpos diminui o número de partículas infecciosas geralmente 10 a 100 vezes, mais comummente mais do que 1.000 vezes. Semelhantemente a terapia de anticorpo em pacientes com uma doença maligna utilizada como uma monoterapia ou em combinação com a quimioterapia reduz o número de células malignas geralmente 10 a 100 vezes, ou mais do que de 1.000 vezes. A terapia pode ser repetida ao longo de um período de tempo extenso de forma a assegurar a completa eliminação de partículas infecciosas, células malignas, etc. Em alguns casos, a terapia com preparações de anticorpos vai ser continuada durante períodos de tempo prolongados na ausência de montantes detetáveis de partículas infecciosas ou células indesejáveis.
Da mesma forma, a utilização da terapia de anticorpos para a modulação de respostas imunitárias pode consistir em administrações únicas ou múltiplas de anticorpos terapêuticos. A terapia pode ser continuada durante períodos prolongados de tempo na ausência de quaisquer sintomas de doença. O tratamento em causa pode ser utilizado em conjugação com quimioterapia em dosagens suficientes de forma a inibir as doenças contagiosas ou malignas. Em pacientes com doenças autoimunes ou recetores de transplantes, a terapia de 61 anticorpo pode ser utilizada em conjunto com a terapia imunossupressora em dosagens suficientes de forma a inibir reações imunes.
Experimental
Evolução Direcionada de endonucleases estruturais especificas para sequências de imunoglobulina de rato.
Uma análise das sequências de exão da IgM de rato resultou na identificação de várias sequências alvo de quebra das endonucleases estruturais projetadas. Utilizando endonuclease estrutural I-Scel, foram identificadas duas sequências alvo, uma dentro do exão II da IgM de rato (CGTGGATCACAGGGGTCT) e a outra dentro do exão II da IgM de rato (CGTGGATCACAGGGGTCT) e a outra dentro do exão III da IgM de rato(CTGGGATAACAGGAAGGA). Estes locais compartilham 61% (11 de 18 bases) das sequências de identidade com a sequência de reconhecimento natural de I-Scel (TAGGGATAACAGGGTAAT).
Tabela 1 - Sequências alvo nos exãos de IgM de tao (os diferentes nucleóticos estão sublinhados)
Alvo Sequência Similaridade Posição T3 eGGATCACAGGdfcT 61% Exão II T4 ITGGGATAACAGGIIÍÍI 61% Exão III Tipo Selvagem TAGGGATAACAGGGTAAT
Para a manipulação das endonucleases estruturais específicas para estas sequências alvo utilizámos uma seleção altamente sensível para a evolução direcionada de endonucleases estruturais que liga a divisão do ADN enzimático com as células sobreviventes do hospedeiro 62 (descrito em detalhe por Chen e Zhao, Nucleic Acid Research 33 (18) : el54, 2005) . Uma estratégia de coevolução in vitro loci de Ig foi utilizada de forma a projetar variantes da I-Scel com a especificidade da sequência alvo. Conforme mostrado na Tabela 2, para a sequência alvo T3, foram selecionadas duas novas sequências, T3il e T3i2, como sequências intermédias, enquanto para a sequência alvo T4, foram selecionadas duas novas sequências, T4il e T4i2, como sequências intermédias. As sequências T3il e T4il foram clonadas no relatório plasmídeo de forma a produzirem pll-LacY-T3il e pll-LacY-T4il, respetivamente.
Tabela 2 - Sequências em três etapas (os diferentes nucleóticos estão sublinhados)
Etapa 1 T3il TAGGGATAACAGGGlllT T4il i AGGGATAACAGGGAGGA Etapa 2 T3i2 illGGATAACAGGGlIlT T4i2 GiGGGATAACAGGAiÉiill Etapa 3 T3 lllGGATlACAGGGlIlT T4 eiGGGATAACAGGAAGGA
De modo a obter mutantes I-Scel com especificidade de sequências T3il ou T4il, a modelagem molecular foi em primeiro lugar efetuada de modo a identificar os resíduos a serem utilizados de forma a criar uma biblioteca focada através da saturação da mutagénese. Conforme mostrado na Figura 2, a I-Scel liga-se à extremidade 3' de T3il ou T4il através de uma ligação laça na menor ranhura do ADN. Os resíduos Glyl3, Prol4, Asnl5 e Lys20 estão perto desta extremidade 3' e o Asnl5 liga-se diretamente à última timina na extremidade 3' da sequência de reconhecimento do tipo selvagem através de ligações de hidrogénio. Uma biblioteca de mutantes que contem todas as possíveis combinações de substituições de aminoácidos nestes quatro resíduos escolhidos foi construída através da saturação da mutagénese. De forma a gerar uma biblioteca suficientemente 63 grande, a reação da ligação e os procedimentos de transformação de ADN foram otimizados através de vários testes. Foi construída uma biblioteca composta por 2,9 x 106 mutantes. A biblioteca foi tríada para mutantes I-Scel com a atividade aumentada no sentido da sequência T3il. Em comparação com a ronda 0 (I-Scel do tipo selvagem), a primeira ronda de triagem produziu mutantes com a atividade aumentada no sentido da sequência T3il uma vez que a taxa de sobrevivência da célula foi aumentada em 10 vezes. O enriquecimento dos mutantes potencialmente positivos na ronda 2 e 3 mostrou outras melhorias na taxa de sobrevivência da célula. Da mesma forma, a biblioteca foi tríada para mutantes I-Scel com a atividade aumentada no sentido da sequência T4il. A triagem de mutantes produziu mutantes que aumentaram a atividade no sentido da sequência T4il .
Em paralelo, foi projetada uma segunda biblioteca de mutantes I-Scel com alvo para a extremidade 5' da sequência de reconhecimento. A primeira biblioteca criada utilizando a saturação da mutagénese foi focada naqueles resíduos que interagem com a extremidade 3' dos quatro nucleótidos da sequência de reconhecimento I-Scel. Com base na modelagem molecular, Trpl49, Aspl50, Tyrl51 e Asnl52 estão no entalhe principal formado pelos nucleótidos da extremidade 5'. O Asnl52 interage diretamente com T (-7) através de ligações de hidrogénio. O Aspl50 e o Tyrl52 interagem T de forma oposta ao A(-6) indiretamente apesar de uma molécula de água. O Trpl49 e o Tyrl51 interagem com a base de fosfato. Desse modo, estes quatro resíduos são importantes para a especificidade de sequência de I-Scel e simultaneamente foi 64 efetuada a saturação da mutagénese nestes quatro resíduos de forma a criar uma segunda biblioteca de mutante I-Scel. A posterior coevolução destas enzimas resulta na geração de novas meganucleases específicas para sequências alvo nos exãos II e III da IgM de rato (CGTGGATCACAGGGGTCT e CTGGGATAACAGGAAGGA).
Manipulação de I-Cre com especificidade da sequência definida
Para a manipulação de endonucleases estruturais específicas para novas sequências alvo utilizámos uma seleção altamente sensível para a evolução direcionada de endonucleases estruturais que liga a divisão do ADN enzimático com as células sobreviventes do hospedeiro (descrito em detalhe por Chen e Zhao, Nucleic Acid Research 33 (18) : el54, 2005). Além disso, foi projetada uma estratégia geral para o projeto do mutante de I-Crel com a especificidade de sequência definida. O I-Crel reconhece uma sequência alvo de uma forma pseudo-palindrómica. As bases palindrómicas são diretamente reconhecidas através do I-Crel e podem ser difíceis de ser alteradas (J. Mol. Biol., 280, 345 - 353) (Fig. 4).
Esta propriedade impede a manipulação direta dos derivados de I-Crel que reconhecem uma sequência não-palindrómica. De forma a superar este problema, a sequência alvo foi dividia na metade esquerda (metade a montante) e na metade direita (metade a jusante). O I-Crel é otimizado para as sequências intermediárias do palíndromo da metade esquerda e do palíndromo da metade direita, respetivamente (Figura 4). Depois, os mutantes de I-Crel, otimizados para sequências intermediárias, são projetados de forma a reconhecer o 65 palíndromo da sequência alvo. Finalmente, o mutante de I-Crel respetivamente otimizado para a metade esquerda e aquele para a metade direita irão co-exprimir-se de forma a dividir a sequência alvo. Além disso, é examinada a fusão do mutante otimizado da metade esquerda com o mutante otimizado da metade direita por um ligador polipéptido.
Foi identificada uma sequência alvo dentro do exão IV (CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG) que compartilha 59% da identidade de sequência com a sequência de reconhecimento natural da endonuclease estrutural I-Crel. Posteriormente, com base na identidade de bases palindrómicas dentro da sequência alvo de ICrel original, foram selecionadas duas sequências, T5 e T6, como sequências alvo para manipulação do I-Crel.
Sequência de reconhecimento de I-Crel e 2 sequências alvo: -li -10 *S -8 '7 -6 -5 4 -3 2 -i 1 I 2 2. 3 4 s e 7 8 8 10 Is Fvi5r€i :··* <t> .etõ-á-e χβηεγ È u PiSTTinfCgíã Origina A tl.«. & T 1 6 A A G TS Tg. A r C T r j : τ 6 A 6 A G Alálll 50,0¾ S9.1K f>4.38 57.1» A* ta s*s ps I ws-réo? íca s estac- reaSçat a s. Αξ ta s*s cc-ríservada* ss íà-s s negrito
As duas sequências alvo, T5 e T6, foram clonadas nos plasmídeos reportados. 0 gene I-Crel foi clonado no plasmídeo pTrc e sequenciado de forma a confirmar que não foram incluídas mutações durante a amplificação PCR. 0 sistema de seleção de I-Crel é avaliado para a taxa de sobrevivência da célula.
Além disso, a modelagem molecular foi efetuada e os resíduos proteicos que contactam diretamente com o substrato de ADN foram identificados. Além disso, projetámos as sequências intermédias para as experiências da co-evolução loci de Ig in vitro. 66
Resíduos alvo para a saturação da mutagénese
Resíduo Alvo Resíduo Alvo YN-TS5-L Q26 e S32 YN-TS6-L Q26, K2 8 e R68 YN-TS5-RÍ1 R68, R70 e D75 YN-TS6-RÍ1 Q44 e R68 YN-TS5-RÍ2 Q26 e K28 YN-TS6-RÍ2 N30, Y33 e Q38 YN-TS5-RÍ3 N30, Y33 e Q38
Posteriormente, as bibliotecas dos mutantes de ICrel são geradas e triadas para derivados de ICrel com novas sequências alvo. A consequente co-evolução destas enzimas resulta na geração de novas meganucleases especificas para uma sequência alvo dentro do exão IV da IgM do rato (CAACTGATCCTGAGGGAGTCGG).
Manipulação de nucleases de dedo de zinco
As proteínas de dedo do zinco (ZFP) foram projetadas contra sequências que codificam IgM de rato (exãos 1 - 4) e embaladas conforme descrito (Zhang, L. e outros. Synthetic zing finger transcription factor action at an endogenous chromosomal site. Activation of the human erythropoietin gene. J. Biol. Chem 275: 33850 - 33860, 2000, e Liu, P.Q. e outros. Regulation of an endogenous locus against a panei of designed zinc finger proteins targeted to accessible chromatin regions. Activation of vascular endothelial growth factor. J Biol. Chem. 2765: 11323 - 11334, 2001), de forma a produzir as seguintes metades ZFP. 67 1,0 ή Ç3 οι ό ιΛ Ò "0 οι 0 -tf Ο Τ5 0J Ο <τη ΰ Ό tu ό Μ Ο
Φ Q Ο Τ5 tu Õ 8 a OJ Τ5 CT ω t/ϊ m m m X X X X X X ντί ÕuA. CL )£ ^ j*Sf a ÍL az a 3sr Ui ui V* u S< ui m WJ g O 5$ ço o? ΟΛ /Λ P g o }- V> 3^ Cf v s— j—. £L % & £ & C: o o· P Φ
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Os ZFPs que codificam o ADN foram clonados num vetor de expressão. Células C6 de rato foram obtidas obteve-se a partir da American Type Culture Collection e cultivadas conforme recomendado no meio F-12 (Invitrogen) suplementado com 5% de soro de bezerro fetal qualificado (FCS, Hyclone), 15% de soro de cavalo (Invitrogen) e 5 mM de glutamina. As células foram desassociadas dos materiais plásticos utilizando a protease TrypLE Escolhida (Invitrogen). Para a transfecção, 200.000 células C6 foram misturadas com 400ng de ADN plasmideo e 20pL de Solução Amaxa SF. As células foram transfectadas num Amaxa Nucleofector II Shuttle utilizando o programa 96 FF 137 e recuperadas em 0,1 L quente, suplementado, com meio F-12. Três e nove dias depois da trasfecção as células foram colhidas e o ADN cromossómico foi preparado utilizado uma Solução Quick Extract 1,0 (Epicentre). A região apropriada do locus de IgM foi a amplificada PCR utilizando polimerase de ADN de Alta-fidelidade Accuprime (Invitrogen). As reações PCR foram aquecidas a 94°, posteriormente gradualmente arrefecidas até à temperatura ambiente. Aproximadamente 200 ng do ADN recozido foi misturado com a 0,33 pL de enzima CEL-I (Transgenomic) e incubado durante 20 minutos a 42°. Os produtos de reação foram analisados através da electroforese em gel de poliacrilamida em IX tampão de Tris-borate-EDTA. Um exemplo típico que demonstra a atividade de divisão é mostrado na Figura 6.
Geração de ratos com locus de cadeia pesada endógena inativado utilizando plasmídeos de expressão que codificam uma meganuclease.
Uma sequência de cDNA que codifica uma meganuclease específica para um exão de rato Cp é clonada num vetor de 69 expressão onde a expressão é controlada através da sequência de operador de tetraciclina. 0 plasmídeo do ADN é linearizado através de digestão de enzima de restrição e purificado. Os oócitos de rato são fertilizados com esperma originado de ratos com um transgene que codifica um transativator reverso de resposta à tetraciclina. 0 plasmídeo do ADN purificado é injetado no pronúcleo desses oócitos de rato fertilizados. Posteriormente, os embriões de rato são transferidos para mães adotivas e gerados até ao termo da gestação. Os recém-nascidos são analisados para a presença de transgene que codifica a meganuclease através de PCR utilizando ADN isolado a partir de amostras de tecido. Os animais de fundador transgénico machos são alojados durante quatro meses quando atingem a maturidade sexual. A expressão de meganuclease nos animais transgénicos é induzida pela administração de doxiciclina de um a sete dias. Posteriormente, o esperma é recolhido duas vezes por semana e analisado por PCR. Os animais machos que produzem esperma transformado são utilizados para a procriação. A descendência obtida a partir do rato mutado Cp são identificados através de análise PCR das amostras de tecido.
Geração de ratos com locus de cadeia pesada endógena inativado através de microinjeção de oócitos fertilizados com plasmídeo de ADN que codifica uma meganuclease específica
Uma sequência de cDNA que codifica uma meganuclease específica para um exão de rato Cp é clonada num vetor de expressão onde a expressão é controlada através do promotor de CAG. 0 plasmídeo do ADN purificado é injetado no pronúcleo dos oócitos de rato fertilizados. Posteriormente, os embriões de rato são transferidos para mães adotivas e 70 gerados até ao termo da gestação. Os recém-nascidos são analisados para a presença de exãos de IgM mutados através de PCR e sequenciação direta. Alternativamente, os animais que contêm células com exãos de IgM mutados são identificados pela incubação de produtos de PCR aquecidos e arrefecidos com enzima CEL-I e subsequente eletroforese em gel. O presente pedido também inclui a matéria em causa das seguintes cláusulas numeradas: 1. Um método para produção de uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado, compreendendo a expressão de pelo menos uma meganuclease numa célula germinal, oócito ou embrião fertilizado, de forma a gerar uma célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado em que a referida meganuclease reconhece uma sequência alvo de meganuclease presente em ou proximal ao referido locus de Ig endógena. 2. Um método para produção de um animal transgénico compreendendo pelo menos uma linha germinal de locus de Ig endógena inativado, compreendendo a obtenção de um animal transgénico a partir de uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado produzido de acordo com o método da cláusula 1, ou uma célula germinal descendente desse, em que o referido animal transgénico é selecionado a partir do grupo composto por pássaros, roedores e doninhas. 3. O método de acordo com a cláusula 2, em que a referida célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado além disso compreende um locus 71 de Ig artificial, em que o referido animal transgénico compreende um locus de Ig artificial. 4. 0 método de acordo com a cláusula 2, também compreende a introdução de um locus de Ig artificial na referida célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado, ou uma célula germinal descendente desse ou um oócito ou embrião fertilizado derivado a partir desse, em que o referido animal transgénico compreende um locus de Ig artificial. 5. 0 método de acordo com a cláusula 2, em que a referida obtenção de um animal transgénico a partir de uma célula germinal viável que tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado compreende a combinação da referida célula germinal viável, ou uma célula germinal descendente dessa, com um gâmeta compreendendo um locus de Ig artificial, em que o referido animal transgénico compreende um locus de Ig artificial. 6. 0 método de acordo com qualquer uma das cláusulas 3 - 5, em que o referido locus de Ig artificial compreende (i) uma região V tendo pelo menos um segmento genético humano V que codifica uma linha germinal ou uma sequência de aminoácidos de região V humana hipermutada; (ii) um ou mais segmentos genéticos J; e (iii) um ou mais segmentos genéticos de região constante, em que o referido locus de Ig artificial é funcional e capaz de sofrer reajuste genético e produzir um repertório de imunoglobulinas artificiais num animal transgénico derivado a partir da referida célula germinal. 72 7. 0 método de acordo com a cláusula 5, em que a referida gameta tem pelo menos um locus de Ig endógena inativado. 8. 0 método de acordo com a cláusula 1, em que a referida sequência alvo da meganuclease está presente em ou proximal a um segmento genético J dentro do referido pelo menos um locus de Ig endógena. 9. 0 método de acordo com a cláusula 1, em que a referida sequência alvo da meganuclease está presente em ou proximal a um gene de região constante de imunoglobulina. 10. O método de acordo com a cláusula 1, compreendendo também a expressão de uma segunda meganuclease na referida célula germinal, oócito ou embrião fertilizado, em que a referida segunda meganuclease dito reconhece uma segunda sequência alvo de meganuclease presente em ou proximal ao referido locus de Ig endógena. 11. O método de acordo com a cláusula 1, em que a referida célula germinal, oócito ou embrião fertilizado compreendem um elemento de expressão da meganuclease genómica que compreende uma região de controlo de expressão induzivel ligada de forma operacional a um ácido nucleico que codifica a referida meganuclease, e em que a referida meganuclease é expressada na referida célula germinal, oócito ou embrião fertilizado através da indução da 73 expressão do referido elemento de expressão de meganuclease genómica. 12. 0 método de acordo com a cláusula 11, compreendendo a repetição do passo de indução da expressão do referido elemento de expressão de meganuclease genómica. 13. 0 método de acordo com a cláusula 11, em que a referida célula germinal, oócito ou embrião fertilizado compreendem um segundo elemento de expressão de meganuclease genómica que compreende uma segunda região de controlo de expressão induzivel ligada de forma operacional a um segundo ácido nucleico de codificação da meganuclease, em que a referida segunda meganuclease codificada reconhece uma segunda sequência alvo de meganuclease presente no referido locus de Ig endógena, em que o referido método também compreende a expressão de indução do referido segundo ácido nucleico de codificação da meganuclease na referida célula germinal, oócito ou embrião fertilizado. 14. Uma célula germinal viável tendo pelo menos um locus de Ig endógena inativado produzido pelo método de acordo com a cláusula 1. 15. Um animal transgénico produzido pelo método de acordo com a cláusula 2. 16. Um animal transgénico produzido pelo método de acordo com as cláusulas 3-5. 17. 0 animal transgénico de acordo com as cláusulas 15 ou 16, em que o referido animal transgénico tem falta de um locus de cadeia leve de Ig endógena funcional. 18. 0 animal transgénico de acordo com as cláusulas 15 ou 16, em que o referido animal transgénico tem falta de um locus de cadeia pesada de Ig endógena funcional. 19. 0 animal transgénico da cláusula 16, em que o referido animal transgénico é capaz de produzir imunoglobulinas tendo um idiotípico humano. 20. O animal transgénico da cláusula 16, em que o referido animal transgénico tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional e compreende um locus de cadeia pesada de Ig artificial, e em que o referido animal transgénico é capaz de produzir anticorpos apenas de cadeia pesada. 21. O animal transgénico da cláusula 16, em que o referido animal transgénico compreende pelo menos um locus de cadeia pesada de Ig com pelo menos um gene de região C que tem falta de sequências que codificam um domínio CHI funcional, e tem falta de um locus de cadeia leve de Ig funcional. 22. Um animal transgénico que compreende um elemento de expressão de meganuclease genómica, em que o referido elemento compreende uma região de controlo de expressão induzível ligada de forma operacional a um ácido nucleico de codificação da meganuclease, e em 75 que a referida meganuclease codificada reconhece uma sequência alvo de meganuclease presente em ou proximal a um locus de Ig endógena do referido animal transgénico, em que o referido animal transgénico é selecionado a partir do grupo composto por pássaros, roedores e doninhas. 23. 0 animal transgénico da cláusula 22, em que o genoma do referido animal transgénico também compreende pelo menos um locus de Ig artificial. 24. Um método para produção de anticorpos, compreendendo a imunização do animal transgénico de acordo com a cláusula 16 com um imunogénio. 25. Uma composição de antissoro policlonais produzida através do método da cláusula 24. 26. Um método para produção de um anticorpo monoclonal, compreendendo (i) a imunização do animal transgénico de acordo com a cláusula 16 com um imunogénio, (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do referido animal transgénico em que a referida célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao referido imunogénio; e (iii) utilização da referida célula de produção do anticorpo monoclonal de forma a produzir o referido anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao referido imunogénio, ou utilizando a referida célula de produção do anticorpo monoclonal de forma a produzir uma célula hibridoma que produz o referido anticorpo monoclonal e utilizando a referida célula 76 hibridoma de forma a produzir o referido anticorpo monoclonal. 27. Um método para produção de um anticorpo monoclonal, compreendendo (i) a imunização do animal transgénico de acordo com a cláusula 16 com um imunogénio, (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do referido animal transgénico em que a referida célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao referido imunogénio; (iii) isolação a partir da referida célula de produção do anticorpo monoclonal de um ácido nucleico do anticorpo monoclonal que codifica o referido anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao referido imunogénio; e (iv) utilização do referido ácido nucleico do anticorpo monoclonal de forma a produzir o referido anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao referido imunogénio. 28. 0 método de acordo com a cláusula 26 ou 27, em que o referido anticorpo monoclonal tem um idiotípico humano. 29. Um método para produção de um anticorpo monoclonal totalmente humano, compreendendo (i) imunização de um animal transgénico de acordo com a clausula 16 com um imunogénio, (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do referido animal transgénico em que a referida célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao referido imunogénio; (iii) isolação a partir da 77 referida célula de produção do anticorpo monoclonal de um ácido nucleico do anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao referido imunogénio; (iv) modificação do referido ácido nucleico do anticorpo monoclonal de forma a produzir um ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano; e (v) utilização do referido ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano de forma a produzir o anticorpo monoclonal totalmente humano codificado. 30. Um anticorpo monoclonal produzido pelo método de acordo com qualquer uma das cláusulas 26, 27 ou 29. 31. Um método para neutralizar uma entidade antigénica num componente do corpo humano, em que o referido método compreende contactar o referido componente do corpo com uma composição de antissoro policlonais de acordo com a cláusula 25, em que a referida composição de antissoro policlonais compreende moléculas de imunoglobulina que se ligam especificamente e neutralizam a referida entidade antigénica. 32. Um método para neutralizar uma entidade antigénica num componente do corpo humano, em que o referido método compreende contactar o referido componente do corpo com o anticorpo monoclonal de acordo com a cláusula 30, em que o referido anticorpo monoclonal se liga especificamente e neutraliza a referida entidade antigénica. 78 33. Um método para produção de anticorpos apenas de cadeia pesada, compreendendo a imunização de um animal transgénico de acordo com a cláusula 20 ou 21. 34. Um anticorpo apenas de cadeia pesada produzido pelo método de acordo com a cláusula 33.

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para geração de um rato, caracterizado por compreender: (A) injeção numa célula germinal de rato, oócito fertilizado de rato ou um embrião de rato, de uma meganuclease especifica para fragmentos genéticos de Ig em loci de cadeia pesada e/ou leve endógenas ao rato, em que a meganuclease introduz quebras de cadeia dupla nos referidos loci de cadeia pesada e/ou leve; ou (B) injeção numa célula germinal de rato, oócito fertilizado de rato ou um embrião de rato, de um vetor de expressão ou ácido nucleico que codifica uma meganuclease especifica para fragmentos genéticos de Ig em loci de cadeia pesada e/ou leve endógenos ao rato, em que a meganuclease introduz quebras de cadeia dupla nos referidos loci de cadeia pesada e/ou leve.
2. Um rato caracterizado por ser nulizigótico para loci de cadeia leve de Ig endógena e/ou loci de cadeia pesada endógena. 3. 0 rato de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por compreender um locus imunoglobulina artificial (ig) · 4. 0 rato de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o locus de Ig artificial ser um locus de cadeia leve de Ig e/ou um locus de cadeia pesada de Ig. 5. 0 rato de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o locus de Ig artificial compreender um locus de 2 Ig que compreende fragmentos de loci de Ig humanas e de rato incluindo múltiplos segmentos genéticos de imunoglobulina, opcionalmente em que: (i) pelo menos uma variável (V) o segmento genético é um segmento genético humano V; e/ou ii) pelo menos um segmento genético diverso (D) é um segmento genético D humano. 6. 0 rato de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o segmento genético compreender: i) sequências de segmento genético de Ig humana que ocorrem naturalmente; ii) formas degeneradas de sequências que ocorrem naturalmente de um segmento genético de Ig humana; e/ou iii) sequências sintéticas que codificam uma sequência de polipéptido que é 85% - 95% idêntica ao polipéptido codificado por uma sequência que ocorre naturalmente de um segmento genético de Ig humana. 7. 0 rato de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado por ser capaz de produzir imunoglobulinas com idiótipos humanos.
8. Um método para produção de um anticorpo monoclonal, caracterizado por compreender: (i) imunização do rato de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7 com um imunogénio; (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do rato em que a célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; e (iii) utilização da célula de produção do anticorpo monoclonal de forma a produzir o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio, ou utilizando a célula de produção do anticorpo monoclonal de forma a 3 produzir uma célula hibridoma que produz o anticorpo monoclonal e utilizando a célula hibridoma de forma a produzir o anticorpo monoclonal.
9. Um método para produção de um anticorpo monoclonal caracterizado por compreender: (i) imunização do rato de acordo com as reivindicações 3 a 7 com um imunogénio; (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do rato em que a célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; (iii) isolação a partir da célula de produção do anticorpo monoclonal de um ácido nucleico do anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; e (iv) utilização do ácido nucleico do anticorpo monoclonal de forma a produzir um anticorpo monoclonal que se liga especif icamente ao imunogénio, em que opcionalmente o anticorpo monoclonal tem um idiotipico humano.
10. Um método para produção de um anticorpo monoclonal caracterizado por compreender: (i) imunização um rato de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 7 com um imunogénio; (ii) isolação de uma célula de produção de anticorpo monoclonal a partir do rato em que a célula de produção de anticorpo monoclonal produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; (iii) isolação a partir da célula de produção do anticorpo monoclonal de um ácido nucleico do anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio; (iv) modificação 4 do ácido nucleico do anticorpo monoclonal de forma a produzir um ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano; e (v) utilização do ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo monoclonal totalmente humano de forma a produzir o anticorpo monoclonal totalmente humano codificado. 11. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por o método também compreender as etapas de: i) purificação do anticorpo; e ii) mistura do anticorpo com um transportador farmacêutico adequado apropriado para administração a pacientes.
12. Uma célula caracterizada por ser obtida através do método da reivindicação 8.
13. Uma célula transfectada caracterizada por compreender um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal definida na reivindicação 9.
14. A célula transfectada caracterizada por compreender o ácido nucleico de anticorpo monoclonal que codifica o anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao imunogénio conforme definido na reivindicação 10.
15. Um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo monoclonal conseguivel através do método da reivindicação 9, caracterizado por o locus artificial compreender pelo menos um segmento genético humano J, em que o anticorpo monoclonal é uma imunoglobulina quimérica que compreende uma parte da sequência de 5 polipéptidos de imunoglobulina humana e uma parte da sequência de polipéptidos de imunoglobulina do rato.
16. Uma imunoglobulina quimérica caracterizada por compreender uma sequência de polipéptidos codificada através do ácido nucleico da reivindicação 15, em que a imunoglobulina quimérica compreende uma parte da sequência de polipéptidos de imunoglobulina humana e uma parte da sequência de polipéptido de imunoglobulina de rato.
17. A imunoglobulina da reivindicação 16, caracterizada por a imunoglobulina ter uma região constante (C) que é selecionada a partir de (i) um rato de região C constante, ou (ii) uma região constante (C) artificial, em que a região constante artificial é derivada a partir de regiões constantes humanas e de rato, opcionalmente em que a região artificial (C) tem uma IgG de domínio CHI humano e domínios IgG CH2 e CH3 de rato.
18. Uma célula transfectada caracterizada por compreender o ácido nucleico da reivindicação 15.
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