JP2005502341A - B1ブラジキニン受容体タンパク質を調節するための動物モデルとしてのトランスジェニックげっ歯類 - Google Patents
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Abstract
ゲノムに霊長類B1ブラジキニン受容体導入遺伝子を組込んだトランスジェニックラットを作製する。前記トランスジェニックラットでB1ブラジキニン受容体遺伝子を発現させると、前記受容体の霊長類形態(例えば、ヒト形態)に対して選択的であるが前記受容体のラット形態に対しては選択的でない化合物が結合する。よって、トランスジェニック系統内の発現導入遺伝子は野生型霊長類B1ブラジキニン受容体のアンタゴニスト及びアンゴニスト選択性を模倣する。前記トランスジェニック動物は、ヒトまたは近縁種由来のB1ブラジキニン受容体のモジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして有用であり、前記B1ブラジキニンモジュレーターの薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、機能的B1ブラジキニン受容体タンパク質、好ましくは哺乳動物B1ブラジキニン受容体タンパク質、特に機能的非ヒト霊長類またはヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質を発現するトランスジェニックげっ歯類に関する。本明細書では、異種プロモーターの制御下でヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質のオープンリーディングフレームをコードするDNA配列をげっ歯類ゲノムにランダムに組込んだトランスジェニックげっ歯類の作製を例示しているが、これに限定されない。本発明はまた、非ヒト霊長類またはヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質の機能的修飾を発現するトランスジェニックげっ歯類に関し、前記修飾にはアミノ酸欠失、付加、置換、NH2−またはCOOH−末端切断、スプライス変異、及びタンパク質にヒトB1ブラジキニン様活性を与えるものが含まれるが、これらに限定されない。前記トランスジェニック系統内の発現導入遺伝子は野生型B1ブラジキニン受容体のアンタゴニスト及びアンゴニスト選択性を模倣する。従って、本発明のトランスジェニック動物は、B1ブラジキニン受容体(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)のモジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして有用であり、受容体活性のアンタゴニストまたはアゴニストのようなB1ブラジキニンモジュレーター(例えば、ヒトB1ブラジキニンモジュレーター)の薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供する。
【背景技術】
【0002】
Dray及びPerkins(TINS,16:99−104(1993))やProud及びKaplan(Annual Review Immunology,6:49−83(1988))は、薬理学的特性に基づいて2つの哺乳動物ブラジキニン受容体サブタイプB1及びB2を定義している。ノナペプチドブラジキニン(BK)及びデカペプチドLys−BK(カリジン)はカリクレインのタンパク質分解作用により大型タンパク質前駆体キニノーゲンから遊離する。BK及びカリジンはいずれもB2受容体を活性化する。これらのB2受容体アゴニストは、カルボキシペプチダーゼにより分解してB1受容体アゴニストの脱−Arg9BK及び脱−Arg10カリジンを生じたり、アンギオテンシン変換酵素(ACE)により分解して不活性ペプチドを生ずる。BK及びカリジンはB2ブラジキニン受容体サブタイプで等能力アゴニストとして作用する。対照的に、BKはB1ブラジキニン受容体サブタイプで全体的に不活性である。脱−Arg10,Leu9[カリジン](ここでは、“DALK”)はカリジンに類似の構造を有するペプチドアンタゴニストである。
【0003】
B2及びB1ブラジキニン受容体はGタンパク質結合性受容体のスーパーファミリーのメンバーである。多数の哺乳動物B1及びB2受容体遺伝子が単離され、特性決定されている。例えば、
ヒトB1ブラジキニン(いずれも1998年1月28日及び1999年10月12日付けでMenkeらに付与された米国特許第5,712,111号明細書及び同第5,965,367号明細書、及びMenkeら,J,Biol.Chem.,269:21583−21586(1994));
家兎B1ブラジキニン(MacNeilら,Biochem.Biophys.Acta,1264:223−228(1995));
マウスB1ブラジキニン(Hessら,Immunopharmacology,33:1−8(1996));
ラットB2ブラジキニン(McEachernら,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:7724−7728(1991));
ヒトB2ブラジキニン(Hessら,Biochem.Biophys.Res.Comm.,184:260−268(1992));
ラットB1ブラジキニン(Jonesら,Eur.J.Pharmacol.,374(3):423−433(1999))。
【0004】
Hessら(Immunopharmacology,33:1−8(1996))は、B1受容体アゴニストの選択性はマウス、ヒト及び家兎B1受容体を比較したとき種特異性であることを示している。
【0005】
Bock及びLongmore(Current Opin.in Chem.Biol.,4(4):401−407(2000))は、最新の公知のB1及び/またはB2ブラジキニン受容体活性モジュレーターを記載している。著者らが検討しているように、正常組織ではB1受容体ではなくB2受容体が発現していることは科学界で広く認められている。対照的に、炎症、疼痛、組織損傷を招く生物学的プロセスは急速にB1受容体活性及び細菌感染を誘発する可能性がある。病的状態でのB1受容体の見かけ誘導能により、B1受容体アンタゴニストを消炎/鎮痛剤として使用する治療機会が与えられ得、よってB1受容体を魅力的な薬物標的とし得る。
【0006】
このために、B1ブラジキニン受容体モジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして使用するためのトランスジェニックラットモデルのような動物モデル、及びヒトB1ブラジキニン受容体に対する特異性に対する潜在的モジュレーターの薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供することが依然として要望されている。本発明はヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質を発現する各種トランスジェニックげっ歯類を開示することにより継続中の要望を満たす。
【発明の開示】
【0007】
本発明は、非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする1つ以上の導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物(この中には非限定的に創始動物が含まれる)及び/または非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。好ましい非ヒトトランスジェニック細胞はげっ歯類細胞であり、げっ歯類ゲノムに安定的に組込むための好ましい非天然B1ブラジキニン受容体遺伝子は霊長類B1ブラジキニン受容体遺伝子である。
【0008】
本発明の具体例では、非ヒトトランスジェニック動物細胞及び胚はその後トランスジェニックラットを生ずるラットの細胞及び胚であり、前記トランスジェニックラットには、初期創始動物、同腹子、及び後続のヒトB1ブラジキニン受容体の機能的形態を発現する安定なトランスジェニック系統のメンバーからなる動物が含まれる。前記トランスジェニック動物は修飾動物がヒトB1ブラジキニン受容体の薬理学的特性を有する機能的タンパク質を発現するような遺伝子修飾、すなわちトランスジェニック動物(本明細書では、トランスジェニックラットを例とする)の脳から作成した膜が非トランスジェニック動物とは異なる薬理学的特性を有するような遺伝子修飾を含む。
【0009】
好ましくは、本発明は、ヒトB1ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする導入遺伝子の少なくとも1つを標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ動物細胞に関する。更に、本発明は、ヒトB1ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする導入遺伝子の少なくとも1つを含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子及び他のトランスジェニック動物に関する。トランスジェニック動物細胞、動物及び同腹子は天然(野生型)B1ブラジキニン受容体の存在下でも非存在下でも非天然B1ブラジキニン受容体(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)を発現し得る。本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法にてらして、好ましいトランスジェニック細胞、胚及び/または動物は天然B1ブラジキニン受容体及びトランスジェニック非天然B1ブラジキニン受容体に対する対立遺伝子を含む。
【0010】
本明細書に記載されているトランスジェニックラットモデルは、受容体活性を有する潜在的モジュレーター(例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト)をスクリーニングするために有用であり、前記モジュレーターには非限定的にペプチド、タンパク質または非タンパク質の有機もしくは無機分子が含まれる。よって、本発明は、本発明のトランスジェニックラット及びその子孫の作製方法、並びに薬理試験のためのその使用に関する。更に、本発明は、試験化合物(類)をトランスジェニックラットに投与し、ヒトB1ブラジキニン受容体の活性に対する該化合物の効果を調べることによりヒトB1ブラジキニン受容体の潜在的モジュレーターの選択性及び活性を測定する方法に関する。よって、本発明は、試験化合物の血液脳関門への浸透、組織への分布及びヒトB1ブラジキニン受容体への結合能力を測定する例えば脳組織を用いる各種占有率アッセイに関する。
【0011】
本明細書中、「機能的」は、細胞またはインビボ系中に存在するとき天然、すなわち未変性の条件または環境中のように通常通り機能する遺伝子またはタンパク質を指す。従って、機能的でない(すなわち、“非機能的”、“破壊”、“変性”等)遺伝子は野生型、天然または未変性タンパク質として機能しないタンパク質をコードしたり、またはタンパク質を全くコードしない。非機能的遺伝子は本明細書に記載されている相同組換えの産物であり得、非機能的遺伝子は遺伝子の機能的形態を含む標的染色体の領域を特異的に標的して野生型または天然遺伝子をノックアウトする。
【0012】
本明細書中、「モジュレーター」は、ヒトB1ブラジキニン受容体のような哺乳動物B2またはB1ブラジキニン受容体の発現または活性を変化させたり受容体とそのリガンドまたは他のタンパク質との相互作用の影響を変化させる化合物であり、例えばアンタゴニストまたはアゴニストである。
【0013】
本発明のトランスジェニック動物に関して、本明細書中で「導入遺伝子」及び「遺伝子」を用いる。遺伝子はタンパク質または構造RNAをコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び/または導入遺伝子は当業界で公知の遺伝子調節要素及び/または構造要素をも含み得る。本明細書中、導入遺伝子は遺伝子を含む遺伝構築物である。導入遺伝子は当業界で公知の方法により動物の細胞中の1つ以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子はトランスジェニック動物のゲノム、好ましくは染色体中の少なくとも1ヶ所に運ばれる。当該導入遺伝子はラットまたは他の哺乳動物の標的ゲノムに導入され、よって安定的に組み込まれ且つ所望機能を発揮し得るように生殖細胞及び/または体細胞に導入される。導入遺伝子は標的細胞/動物内の導入遺伝子のオープンリーディングフレームを転写する当業界で公知の異種遺伝子調節要素及び/または構造要素、例えば異種プロモーター配列及び/または異種エンハンサー配列をも含み得る。前記異種調節配列は遺伝子が適切に発現されるようにコード領域に“融合”または“作動的に連結”している。染色体が導入遺伝子を標的動物に安定的に組込むのに好ましい標的であるが、「ゲノム」は核DNA(染色体または染色体外DNA)を含めた生物の全DNA補体並びに細胞の細胞質内に局在するミトコンドリアDNAを指す。上記したように、本発明のトランスジェニックラットは、導入遺伝子(例えば、ヒトB1ブラジキニン遺伝子の機能的形態)を発現させてヒトB1ブラジキニン受容体モジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルを提供し、ヒトB1ブラジキニン受容体を調節する試験化合物の選択性を研究するための薬力学的動物モデルシステムを提供するという所望効果を達成するように1つ以上の導入遺伝子をラットの胚細胞及び/または体細胞(好ましくは両方)に安定的に組込んでいる。情報を子孫に伝える能力を付与するように導入遺伝子を生殖細胞系に導入することが好ましい。実際子孫が遺伝情報の一部または全部を保有しているならば、その子孫もトランスジェニック動物である。
【0014】
本明細書中、「動物」はすべての哺乳動物を含み得るが、トランスジェニック動物を指すときにはヒトが除かれる。動物には胚及び胎児段階を含めたすべての発育段階の動物が含まれる。「トランスジェニック動物」は細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作、例えばマイクロインジェクション、相同組換えのような標的遺伝子デリバリーまたは組換えウイルスの感染により直接または間接的に受けた遺伝子情報を有する1つ以上の細胞を含む動物である。上記したように、この導入DNA分子(導入遺伝子)は染色体内に組込まれ得るかまたは染色体外で複製するDNAであり得る。
【0015】
本明細書中、「げっ歯類」は囓るために一対の上下切歯を有し、歯が連続的に成長し、切歯と臼歯の間にすき間があるげっ歯目のメンバーの種である。トランスジェニック動物を作製するための好ましい例にはドブネズミ(Rattus norvegicus)、クマネズミ(Rattus rattus)及びハツカネズミ(Mus musculus)が含まれるが、これらに限定されない。
【0016】
本明細書中、「ラット」は、系統的動物学の見地からクマネズミ属(Rattus)に属する動物を指す。本発明のトランスジェニック動物をクマネズミ属の任意の種から作製し得る。前記種にはドブネズミ(Rattus norvegicus)やクマネズミ(Rattus rattus)が含まれるが、これらに限定されない。
【0017】
本明細書中、「創始動物」は、げっ歯類遺伝子をそのヒトホモログで置換するように相同組換えにより標的された胚性幹細胞のようなマイクロインジェクトされた卵または標的細胞から発生するトランスジェニック動物を指す。創始動物は遺伝子産物の適当なアッセイにより機能的遺伝子の発現について試験される。
【0018】
本明細書中、「系統」は、1つの創始細胞の直系子孫であり、生殖系列に安定的に組込まれた1つの導入遺伝子座を有する動物を指す。
【0019】
本明細書中、「同系繁殖系」は、すべての内在性遺伝子座で遺伝的に同一である動物を指す。当業界で使用するとき、同系繁殖系は1つの動物から次の動物への再現性、動物の中で細胞または組織を伝達する能力及び内在性遺伝子の役割を同定するために規定遺伝子研究を実施する能力を含めるために使用され得る。同系繁殖系はマイクロインジェクションのために使用されるラットが樹立された同系繁殖系のメンバーである前記系統から発達し得る。
【0020】
本明細書中、「遺伝子型」は生物の遺伝子構成成分である。
【0021】
本明細書中、「表現型」は、遺伝子型と環境の相互作用により生ずる細胞または生物が有する形態学的、生理学的及び/または生化学的形質の集まりである。この表現型の定義には、遺伝子型プロフィールが変化し、よって動物内での導入遺伝子の発現により1つ以上の化合物に対する新しい薬理学的選択性、例えば当該導入遺伝子の機能的発現に基づく選択性が生ずるように非天然導入遺伝子が動物に導入されている生化学的形質が含まれる。「表現型発現」は、産物(例えば、ポリペプチドまたはタンパク質)を産生したり接合子または生物の天然表現型の発現を変化させる導入遺伝子の発現を指す。
【0022】
本明細書中、「ラットエノラーゼプロモーター」、「ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター」、「NSE」等は、本明細書で詳記するように本発明を例示するために使用されるプロモーター断片を指すべく本明細書中同義的に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0023】
本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込まれた動物細胞に関する。よって、本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。好ましい非ヒトトランスジェニック細胞はげっ歯類細胞であり、げっ歯類ゲノムに安定的に組込むのに好ましい非天然B1ブラジキニン受容体遺伝子は霊長類B1ブラジキニン受容体遺伝子である。B1ブラジキニン受容体をコードする単離DNA分子の各種非ヒト霊長類ソースの例には、旧世界ザル類のメンバー、例えばアカゲザル(Macaca mulatta)のようなマカク(Macaca)属の各種メンバー;新世界ザル類のメンバー、例えばタマリンのようなタマリン(Saguinus)属の各種メンバー;レムル(Lemur)メンバーのような原猿類;チンパンジー(Pan troglodytes)、オランウータン(Pongo pygmaeus)やゴリラ(Gorilla gorilla)のような大形類人猿が含まれるが、これらに限定されない。
【0024】
従って、本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体をコードする1つ以上の導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び/または非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。本発明の好ましい実施態様は機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体を発現し、よってラットトランスジェニック細胞及び胚を含むトランスジェニックラットに関し、前記細胞及び胚からは初期創始動物、同腹子、及び後続の機能的形態のヒト動物B1ブラジキニン受容体を発現する安定なトランスジェニック系統となるトランスジェニックラットを含めたトランスジェニックラットが生ずる。当該導入遺伝子は、宿主動物において機能するエンハンサー及び/またはプロモーター断片のような調節配列に作動的に連結させた霊長類B1ブラジキニン受容体発現カセット及びB1オープンリーディングフレームの下流に終結シグナルを含む。本発明のトランスジェニック動物により、前記動物において発現導入遺伝子(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)の薬理学的活性を研究して、前記トランスジェニック動物内である試験化合物の効果を試験することができ、よって新しい薬理学的に活性な物質を開発するための予備試験を実施することができる。本明細書に記載されているデーターから、機能的ヒトB1ブラジキニン遺伝子またはその生物学的均等物を含む非ヒトトランスジェニック動物が一定の表現型を示し、該トランスジェニック動物がヒトB1ブラジキニン受容体の特定の薬理学的性質を有するように有効量の機能的導入遺伝子産物を発現していることは明らかである。上記した表現型については、非トランスジェニックラットとは異なる薬理学的特性を有することが判明しているトランスジェニックラットの脳から作成した膜を用いる結合アッセイにより本明細書中に詳細に記載されている。このことは、ラットB1受容体に対する親和性が乏しいヒト特異的B1化合物が実施例に記載されているトランスジェニックラットの脳から作成した膜に対して高い親和性を有することを示す結合データーから明らかである。内在性ラット受容体はいずれの表現型も隠蔽しないようである。ラジオリガンド3H−DALKはラットB1受容体よりもむしろヒトB1受容体に対して高い親和性を有する。このことが、このリガンドを用いて全脳ホモジネートアッセイでも脳切片の受容体オートラジオグラフィーでも非トランスジェニックラットでは内在性B1受容体活性が見られない理由の一部である。対照的に、ヒトB1受容体を発現する例示トランスジェニックラットでは、3H−DALKを用いていずれの方法でも容易に検出され得る結合部位がある。
【0025】
本明細書に記載されているトランスジェニックラットモデルは受容体活性の潜在的モジュレーター(例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト)をスクリーニングするために有用である。前記モジュレーターにはペプチド、タンパク質、または非タンパク質有機もしくは無機分子が含まれるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック動物は、試験化合物のヒトB1ブラジキニン受容体活性に対するインビボ効果を研究するための改良モデルを提供する。本発明以前では、野生型B1ブラジキニン発現を増加させる物質(例えば、細菌性リポ多糖類)で試験動物を処理すると、B1ブラジキニン発現が増加したり血液脳関門の性質を変化させるようにバラバラの結果が生じた。たとえ成功しても、ヒトに対して選択的な化合物の特性を評価することはできなかった。この問題を解決するために、薬理学的特性がヒトB1ブラジキニン受容体に適合している種を同定しようと試みた。その欠点は、1つの種が考慮中のすべての化学的シリーズのすべてではなく1つに関してしかヒトと類似の特性を有し得ないことである。或いは、遺伝的にヒトに近縁の種(例えば、非ヒト霊長類)を使用し得る。しかしながら、非ヒト霊長類のような非トランスジェニック動物を用いて化合物をアッセイすると処理量は少なくなる。
【0026】
非限定的例として提示する1つのアッセイでは、試験化合物の血液脳関門を浸透する能力及び組織に分布し受容体に結合する能力を評価するために脳での占有率アッセイにおいて本発明のトランスジェニック動物を使用する。占有率受容体アッセイは、本発明のトランスジェニック動物を使用し、ヒトB1ブラジキニン受容体に結合する公知の放射線標識化合物の置換を測定することにより実施され得る。例えば、トランスジェニックまたは非トランスジェニックSprague Dawley雄ラットに試験化合物を経口投与し、一晩断食させてもよい。実験当日に体重を測定する。総結合を測定するために50% PEG/D5Wベヒクルを静注するかまたは1% メトセルを経口投与する。静注投与化合物の場合には、ラットにベヒクル、試験化合物及び/または非特異的結合を測定するために使用する第2化合物を尾静脈に注射するためにラットをperspexラット拘束装置に置く。7.5分後、ラットを拘束装置に戻し、200μCi/kgの[3H]−試験化合物を静注する。経口投与化合物の場合には、ラットにベヒクルまたは化合物を胃管を介して投与する。非特異的結合を測定する。60分後、ラットを拘束装置に置き、200μCi/kgの[3H]−試験化合物を静注する。尾静脈には1cc注射器、25ゲージ,1インチの針を用いて注射する。ラットを温め、尾をアルコールスワブを用いて拭くことにより尾静脈を拡張させる。アイソトープを注入してから7.5分後、動物をCO2により安楽死させ、眼窩に向かう脊髄開口で頭蓋基部から頭蓋を開く。約100〜150mgの皮質スライスを切断し、直ちに風袋を測定済みのポリプロピレンチューブに入れ、秤量する。1N NaOHでpH7.4とした冷HEPES緩衝液(10mM)[脱イオン水2Lあたり7.4g NaCl(150mM),4.8g HEPES(10mM),0.750g KCl(5mM)]を各チューブに39vols添加する。NaCl及びKClはFisher Scientific、HEPES(C8H18N2O4S)はBoehringer Mannheimから購入した。脳をポリトロンホモジナイザーを用いフルスピードで10秒間ホモジナイズする。直ちにホモジネート500μlを濾過装置(Hoeffer)を用いて(0.2% PEIに予め浸した)25mm Pall A/Eフィルターを介して2回濾過する。ホモジネートがフィルターの全表面を覆うように閉じられ、濾過・洗浄するときには開かれる弁を備えたフィルターにホモジネートをヒペットで移した直後に、冷HEPES[KCl(5mM),NaCl(150mM),HEPES(10mM)]緩衝液を5mlずつ用いて5回洗浄する。各フィルターをシンチレーションバイアルに置き、Ultima Goldシンチレーション流体(10ml)を各バイアルに添加する。500μlずつ2つのホモジネートアリコートをシンチレーションバイアルに入れ、Ultima Goldシンチレーション流体(10ml)を添加し、カウントして、全脳標識を測定する。トリチウム計数プログラムでカウントする前にサンプルを4時間放置する。アイソトープ溶液をトリチウムプログラムで計数して実際のmCi濃度を測定する。サンプル0.001mlを、シンチレーション流体10mlを含むバイアルにピペットで移す(ピペットの先端をキムワイプで注意深く拭く)。次のように計算する:
(1)各サンプルにつき標識の蓄積率(% Acc)=(フィルターdpm/ホモジネートdpm)×100、
(2)全アッセイにつき特異的蓄積率(% Sp Acc)=総結合の平均% Acc−非特異的結合の平均% Acc、
(3)結合阻害率(% Inh)=((総結合の平均% Acc−サンプルの平均% Acc)/% Sp Acc)×100、
(4)1μCi=2.2×106DPM(0.001mlアイソトープ溶液(0.2mCi/ml)=4.4×105DPM。
150gのラットに0.15mlを投与する場合の試験化合物の用量は200μCi/kg体重である:1mlの1mC/ml(NEN)+4ml 食塩水。
【0027】
本発明の好ましい実施態様は、機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする1つの導入遺伝子を標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだトランスジェニックげっ歯類の作製である。しかしながら、本発明は、ラット及びマウスの好ましい標的だけでなく、本明細書に例示したトランスジェニックラットと実質的に同様の表現型形質を示す他のトランスジェニック非ヒト動物の作製に関する。前記非ヒト動物の例にはウシ、ブタ、家兎、モルモット、ヒツジ、ハムスター及びヤギが含まれるが、これらに限定されない。
【0028】
好ましくは、本発明は、機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ動物細胞にも関する。更には、本発明は、機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。トランスジェニック動物細胞、動物及び同腹子は天然(野生型)B1ブラジキニン受容体の存在下でも非存在下でも非天然B1ブラジキニン受容体(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)を発現し得る。本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法にてらして、好ましいトランスジェニック細胞、胚及び/または動物は天然及びトランスジェニック非天然B1ブラジキニン受容体の両方に対する対立遺伝子を含む。典型的には、当該導入遺伝子は、宿主動物において機能するエンハンサー及び/またはプロモーター断片のような調節配列に連結させたヒトB1ブラジキニン受容体発現カセット及びB1オープンリーディングフレームの下流に終結シグナルを含む。ヒトB1ブラジキニン受容体をコードするトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法では、導入遺伝子を通常非相同組込みにより宿主染色体位置に組込む。これらの導入遺伝子は更に、エンハンサー(例えば、SV40エンハンサー)に連結したホスホグリセレートキナーゼ(pgk)プロモーターまたはHSV tk遺伝子プロモーターのような構成的プロモーターに作動的に連結させた選択マーカー、例えばneoまたはgpt遺伝子を含み得る。
【0029】
ヒトB1ブラジキニン遺伝子をマウスに標的導入するような幾つかの実施態様では、内在性非ヒトB1対立遺伝子を機能的に破壊して、内在的にコードしたマウスB1の発現を抑制または消滅させてヒトB1導入遺伝子の発現を干渉させない。導入遺伝子は胚、胎児または成熟多能性幹細胞に導入され得る(援用により本明細書に含まれるとするCapecchi,Science,244:1288−1292(1991);2001年3月20日に付与された米国特許第5,464,764号明細書、同第5,487,992号明細書、同第5,627,059号明細書、同第5,631,153号明細書及び同第6,204,061号明細書も参照)。胚性幹細胞はインビトロで培養した胚盤胞から単離され、分化内で安定的に培養され得る。例えば、導入遺伝子は、標的ES細胞内の特定ゲノム部位に導入遺伝子を指向させるべく使用され得る相同アーム(例えば、上掲のCappecchi)を含む遺伝子標的ベクター中に含まれ得る。外来DNAはエレクトロポレーションにより胚性幹細胞に導入され得る。適当に導入遺伝子を有する胚性幹細胞を胚盤胞の内部細胞塊に注入する。キメラ動物を作製し、これを交雑育種させてすべての細胞が導入遺伝子を有する動物を得る。以下に記載するマイクロインジェクションを用いて、トランスジェニックマウスを作製するための好ましい方法はES細胞ベース技術である。ES細胞に遺伝子を標的させることにより遺伝子機能を破壊するための一般的スキームは、ES細胞ゲノムにおいて染色体対応物との相同組換えを受けるように設計した標的構築物を構築することである。標的構築物は通常、ポジティブ選択マーカーのような追加配列を標的遺伝子のコーディング要素に挿入して該遺伝子を機能的に破壊するように配置される。よって、本発明はまた、相同的組換え標的構築物を用いる遺伝子標的により不活化した内在性B1遺伝子を有する非ヒト動物(例えば、非霊長類哺乳動物)の作製方法に関する。標的構築物の構築及び選択方法に関する一般原理は援用により本明細書に含まれるとするBradleyら,Bio/Technology,10:534(1992)に記載されている。
【0030】
本発明では、各B1ブラジキニン受容体の発現をB1ブラジキニン遺伝子に作動的に連結した各種の同種または異種調節配列によりコントロールするように哺乳動物形態をコードする導入遺伝子をDNA構築物として宿主標的細胞に提示する。その例を図1(ラットニューロン特異的エノラーゼ[NSE]プロモーター、及びウシ成長ホルモン(BGH)転写終止及びポリアデニル化シグナルの上流にあるヒトB1ブラジキニン受容体遺伝子に融合(すなわち、作動的に連結した)CMVイントロンA)に示すが、これに限定されない。この構築物を組込む動物は中枢神経系統においてニューロン特異的発現を提示する。対照的に、ヒトB1ブラジキニン遺伝子の末梢発現は図4(内部リボソームエントリー部位(IRES)により分離される第2オープンリーディングフレーム(LacZ)の上流にあるヒトB1ブラジキニン受容体遺伝子に融合したCMVプロモーター/イントロンA及びLacZ ORFの下流にBGH終結シグナル)に示す組込み構築物を介して生ずる。また、図7に示す導入遺伝子構築物(内部リボソームエントリー部位(IRES)により分離される第2オープンリーディングフレーム(LacZ)の上流にあるヒトB1ブラジキニン受容体遺伝子に融合したThy−1プロモーター及びLacZ ORFの下流にBGH終結シグナル)は脳特異的発現を促進しなければならない。前記した各種構築は、無数のプロモーター/導入遺伝子構築物が安定的なゲノムDNA組込み及びその後の操作によりトランスジェニック動物を作製するための標的細胞への導入のために作製され得ることを示している。本明細書に例示されている構築物により、ジスシストロン構築物が非ヒトトランスジェニック動物に組込まれる。好ましいジスシストロン構築物は各オープンリーディグフレーム(ORF)を分離するために内部リボソームエントリー部位(IRES)を利用する。好ましくは、第1ORFは機能的形態の霊長類B1ブラジキニン受容体をコードし、第2ORFは組織及び/または細胞特異的発現を容易に検出し得るリポーター遺伝子をコードする。各種のリポーター遺伝子が当業界で公知であり、その非限定的例としてLacZ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アルカリホスファターゼ及びルシフェラーゼが挙げられる。
【0031】
トランスジェニックラットを作製するための好ましい方法は、通常特定導入遺伝子を含むDNAをラットの生殖細胞(通常、受精卵)に導入することを含む。次いで、受精生殖細胞を用いて完全なトランスジェニック動物を作製する。2つの前核の1つに無傷のDNAを注入するマイクロインジェクターピペット及び顕微鏡を用いてDNAを生殖細胞に導入することを含む公知のマイクロインジェクション方法を用いてDNAを生殖細胞に導入することが好ましい。少なくとも1つ、恐らくは2つ以上の特定導入遺伝子がゲノムに組込まれたトランスジェニック動物を選択する。安定的に組込まれた導入遺伝子を含む少なくとも1つのトランスジェニックラット系統を樹立するように繁殖のために少なくとも1つの創始トランスジェニックラットを選択する。この方法は米国特許第4,873,191号明細書に記載されている。本発明のトランスジェニック動物を作製するために当業界で利用されている他の公知の方法を用いることができるが、この方法には外在性DNAのキャリアとして精子を用いるインビトロ受精、エレクトロポレーションが含まれるが、これらに限定されない。また、ラット胚性幹細胞系にトランスフェクションして導入遺伝子をラットゲノムに直接標的した後特定の組換えES細胞を選択し、ラットの胚盤胞に導入してもよい。各種方法がMullinsら,「トランスジェニック動物:作製及び使用(Transgenic Animal: Generation and Use)」,第2章,「トランスジェニックラット(Transgenic Ras)」,p.7−9,Harwood Academic Publisher(1997年)発行に記載されている。従って、本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい公知方法は、過剰排卵を促進するために(卵胞刺激ホルモンを連続注入して)雌をホルモン状態に置くステップ、(好ましくは受精雄と繁殖させるかまたは人工受精により)過剰排卵雌を受精させるステップ、導入遺伝子をマイクロインジェクションのような公知技術を用いて受精卵に導入するステップ、受精卵を偽妊娠雌ラットに移植し、その後出産まで進めるステップを含む。偽妊娠雌の胎児が出産に至ったら、創始動物を離乳子孫由来のゲノムDNAへ導入遺伝子DNAをハイブリダイズする一般的方法または導入遺伝子の存在に対して特異的なPCRアッセシにより同定する。遺伝子を発現する創始動物、特に遺伝子を高レベル且つ所期の組織分布で発現する(例えば、脳特異的発現)創始動物を選択し、繁殖させて、意図するトランスジェニックラット系統を樹立する。
【0032】
本発明を実施する際、ヒトB1ブラジキニン遺伝子を組込んだトランスジェニック動物のすべてが当該B1遺伝子の適切な発現を示さないことは自明である。例えば、実施例3及び6に提示されているデーターには、ヒトB1ブラジキニン受容体を発現する3つの別々のトランスジェニックラット系統についてヒトB1ブラジキニン受容体に対する3H−DALKの結合の違いが示されている。適当なトランスジェニック系統を同定することはプロモーター強度、ゲノムに組込む導入遺伝子の数、組込む事象の位置の違いのように特異的な構築物でもあり得る。ラットB1受容体は通常導入遺伝子よりも非常に低いレベルでしか発現しないが、その発現はある処理、例えばリポ多糖類またはストレプトゾシンにより誘導され得る。トランスジェニックラットと非トランスジェニックラットを比較した本明細書の記載から明らかなように、ラットB1ブラジキニン受容体はヒト受容体とは明確に異なる薬理学的特性を有する。すなわち、ヒトB1受容体に対して高い親和性を有する多くの合成化合物はラットB1受容体に対しては低い親和性しか有さない。通常条件下で十分量の導入遺伝子を発現する動物は受容体占有率アッセイにおいて特に有用である。全組織アッセイで測定して系統0004と同じかまたはそれ以上の発現レベルを有する動物が好ましい。しかしながら、例えば発現が更なる研究のために利用し得る組織の散在領域に局在化しているならば、低い組織発現を示す系統(例えば、系統0014及び0015)を使用することもできる。よって、当業者は生じた系統の少なくとも1つが確実に所望の形質を発揮するように約6〜約10またはそれ以上の系統を作製しようとする。ヒトB1ブラジキニンの複数コピー、例えば特定導入遺伝子の2〜約50コピーを標的ゲノムに組込んだ動物を同定し、繁殖することも有用であり得る。従って、特定試験化合物の結合及び/または受容体占有率特性を調べるためのインビボ/エキソビボアッセイに対して最適の適合を見つけるために特定トランスジェニック動物を特徴づけることは本発明の範囲であり、前記アッセイでは試験化合物は天然及びトランスジェニックB1ブラジキニン受容体タンパク質に対して特定結合/薬理学的プロフィールを発揮する。
【0033】
本明細書で使用されている命名法並びにトランスジェニックプロトコル、細胞培養、分子遺伝学及び分子生物学の実験手順は当業界で公知であり、慣用されている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養及び導入遺伝子の導入のためには一般的方法(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション)が使用される。各種酵素反応、オリゴヌクレオチド合成及び精製ステップは製造業者の仕様に従って実施する。技術及び手順は通常当業界の慣用方法及び本明細書に掲げられている文献に従って実施する。本明細書に記載されている手順は当業界で公知であると考えられ、読者の便宜のために記述されている。本明細書に含まれている情報はすべて援用により本明細書に含まれるとする。例示のために下記実施例を提示する。当業者には各種の他の態様が自明であるので、下記実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例1】
【0034】
トランスジェニック標的ベクターの構築
構築物#1:ラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2ベクター
(ステップ1)
ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター領域を含むPCR断片を作成するための鋳型としてラットゲノムDNA(50または100ng/50ul反応物)を使用した。Expand High fidelityポリメラーゼ(Roche)を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分)を32サイクル実施した。正プライマーはRat_enl.2f(5’−CATCACTGAGCCCAACACAA−3’)(配列番号5)であり、逆プライマーはRat_enl.2r(5’−TCACCTCGAGGACTGCAGAC−3’)(配列番号6)であった。このPCR産物の長さは2059bpであった。
【0035】
(ステップ2)
ステップ1からの精製PCR産物(Qiaquick PCR精製)を、BamHI制限部位を付加するための第2回PCRのための鋳型として使用した。以下のプライマー及びExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分)を30サイクル実施した。正プライマーはRat_enl.4f(5’−GCCGATCCTGAGCTCCTCCTCTGCTCGC−3’)(配列番号7)であり、逆プライマーはNSE_1R(5’−CTCGAGGACTGCAGACTCAG−3’)(配列番号8)であった。このPCR産物の長さは1814bpであった。
【0036】
(ステップ3a)
CMVイントロンA配列を含むプラスミドDNAをサブクローニング用PCR断片を作成するための鋳型として使用した。Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分)を25サイクル実施した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはCMVintA.1R(5’−CTGCAGAAAAGACCCATGGAAAGG−3’)(配列番号10)であった。このPCR産物の長さは827bpであった。
【0037】
(ステップ3b)
ステップ3aのCMVイントロンA産物に重複末端を付加するためにPfuポリメラーゼ(Stratagene)またはExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×1分10秒)を12サイクル実施した。正プライマーはNSE_CMV.OLF1(5’−GAGTCTGCAGTCCTCGAGGTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号11)であり、逆プライマーはCMV_hB1.OLR1(5’−TGGCGGCGGTACCAAGCTTCTGCAGAAAAGACCCATGGAAAG−3’)(配列番号12)であった。このPCR産物の長さは863bpであった。
【0038】
(ステップ4)
ウシ成長ホルモン(BGH)ポリA配列に融合してヒトブラジキニンB1受容体配列を含むプラスミドpcDNA3に対してPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×3分)を25サイクル実施して、ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列及び重複末端を有するBGHポリAシグナルを含むPCR断片を構築した。正プライマーはCMV_hB1.OLF1(5’−CTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGAAGCTTGGTACCGCCGCCA−3’)(配列番号13)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは1518bpであった。
【0039】
(ステップ5)
ステップ3及びステップ4から精製した鋳型を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分30秒)を25サイクル実施して、CMVイントロンAをヒトB1_BGHポリA断片と組み合わせた。正プライマーはNSE_CMV.OLF1(5’−GAGTCTGCAGTCCTCGAGGTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号15)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは2342bpであった。
【0040】
(ステップ6)
ステップ2からのPCR産物をBamHIで消化し、ステップ5からのPCR産物をNotIで消化した。BamHI/NotI消化PCR(登録商標)−Blunt II−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)を用いて三方リゲーションを実施した。
【0041】
PCRエラーが最小のクローンを選択するためにDNA配列を分析した。選択したクローンを、BamHI/AflII 2443bp断片及びAflII/NotI 1699bp断片と三方リゲーションすることによりBamHI/NotI消化pBlueScript(pBS)にサブクローン化した。生じた導入遺伝子を図1に示し、導入遺伝子のヌクレオチド配列を図2A〜Bに示す。この構築物の転写物の概略図を図3Aに示し、転写物の投影転写物(DNA配列として示す)のヌクレオチド配列を図3Bに示す。
【0042】
構築物#2:CMVプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1 cds_BGHポリAシグナルベクター
(ステップ1:CMVプロモーター)
pcDNA3(100ng)に対してPfuまたはExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分)を18サイクル実施した。正プライマーはCMVプロモーター1F(5’−CGGCGGCCGCCGATGTACGGGCCAGATATAC−16’)(配列番号16)であり、逆プライマーは(5’−GACTCTATAGGCGGTACTTACCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCG−3’)(配列番号17)であった。このPCR産物の長さは702bpであった。
【0043】
(ステップ2:CMVイントロンA)
CMVイントロンA断片を含むDNAプラスミド鋳型(100ng)に対してPfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分)を18サイクル実施した。正プライマーはCMVプロモーター_イントロンA 1F(5’−CGAAATTAATACGACTCACTATAGGTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号18)であり、逆プライマーはCMVintA.1R(5’−CTGCAGAAAAGACCCATGGAAAGG−3’)(配列番号10)であった。このPCR産物の長さは850bpであった。
【0044】
(ステップ3)
ステップ1及びステップ2からのPCR産物に対してPfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分30秒)を18サイクル実施し、CMVプロモーター断片をCMVイントロンAに連結した。鋳型はステップ1及びステップ2からのPCR産物それぞれ2ngであった。正プライマーはCMVプロモーター1F(5’−CGGCGGCCGCCGATGTACGGGCCAGATATAC−3’)(配列番号16)であり、逆プライマーはCMVintA.1R(5’−CTGCAGAAAAGACCCATGGAAAGG−3’)(配列番号10)であった。このPCR産物の長さは1058bpであった。
【0045】
(ステップ4)
ステップ3からのPCR産物をAflII(CMVイントロンA中で切断)で消化することによりCMVプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列_BGHポリAシグナルを構築した。本実施例に記載されているラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2ベクターをEcoRV及びAflIIで消化し、これらの消化断片を連結して、図4に示す導入遺伝子を作成した。
【0046】
構築物#3:CMVイントロンA:ヒトB1コーディング:IRES要素:LacZ:BGHポリA
図5に詳記する標的ベクターを以下のように作成した。
【0047】
(ステップ1)
pIRESプロプラスミド(Clontech)を鋳型として使用して、IRES要素を含むPCR断片を作成した。Expand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×1分30秒)を20サイクル実施した。正プライマーはHB1_IRES F(5’−CCAACTTTTCTGGCGGAATTAATGCATCTAGGGCGGCCAATTC−3’)(配列番号19)であり、逆プライマーはIS_LACZ_1R(5’−GTAAAACGACGGGATCTATCATGGTGGCGGCGGTTGGCAAGCTTATCATCGTG−3’)(配列番号20)であった。このPCR産物の長さは639bpであった。
【0048】
(ステップ2)
pcDNA3β−GalプラスミドDNA(Invitrogen)を鋳型として用い、Pfu及びExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分)を28サイクル実施して、LacZコード領域をPCR断片として作成した。正プライマーはIS_LACZ_1F(5’−CACGATGATAAGCTTGCCAACCGCCGCCACCATGATAGATCCCGTCGTTTTAC−3’)(配列番号21)であり、逆プライマーは(5’−GCCTCGAGCTATTTTTGACACCAGACCAACTG−3’)(配列番号22)であった。このPCR産物の長さは3098bpであった。
【0049】
(ステップ3)
Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施して、ステップ1及びステップ2のPCR産物を連結した。正プライマーはHB1_IRES F(5’−CCAACTTTTCTGGCGGAATTAATGCATCTAGGGCGGCCAATTC−3’)(配列番号19)であり、逆プライマーはIS_BGH R(5’−CATTTAGGTGACACTATAGAATCTATTTTTGACACCAGACCAACTG−3’)(配列番号23)であった。このPCR産物の長さは3721bpであった。
【0050】
(ステップ4)
プラスミドpcDNA3(Invitrogen)からExpand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施して、BGH ポリAシグナルを作成した。正プライマーはLZ_BGH F(5’−CAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAGATTCTATAGTGTCACCTAAATG−3’)(配列番号24)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。
【0051】
(ステップ5)
Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分30秒)を20サイクル実施して、ステップ4からのBGHポリA PCR断片をステップ3のIRES:LacZ断片に連結した。正プライマーはHB1_IRES F(5’−CCAACTTTTCTGGCGGAATTAATGCATCTAGGGCGGCCAATTC−3’)(配列番号19)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは3963bpであった。
【0052】
(ステップ6)
本実施例に記載のラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2ベクターを鋳型として用い、Pfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×2分30秒)を18サイクル実施して、CMVイントロンA:B1コード配列を作成した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはHB1_IRES R(5’−GAATTGGCCGCCCTAGATGCATTAATTCCGCCAGAAAAGTTGG−3’)(配列番号25)であった。このPCR産物の長さは1931bpであった。
【0053】
(ステップ7)
ステップ6のPCR産物(CMVイントロンA:ヒトB1 cds)及びステップ1からのPCR産物(IRES)を鋳型として用い、Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分30秒)を20サイクル実施して、DNA断片に連結した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはIS_LACZ_1R(5’−GTAAAACGACGGGATCTATCATGGTGGCGGCGGTTGGCAAGCTTATCATCGTG−3’)(配列番号20)であった。このPCR産物の長さは2549bpであった。
【0054】
(ステップ8)
ステップ7及びステップ5のPCR産物を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×7分30秒)を18サイクル実施して、CMVイントロンA:ヒトB cds(ステップ7)をIRES_LacZ_BGHポリA(ステップ6)に連結した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは5851bpであった。次いで、この断片をDNA発現プラスミドpCRII Topo Blunt(Invitroten)にサブクローン化し、DNA配列分析にかけて、適当な導入遺伝子の作成を確認した。
【0055】
構築物#4:CMVプロモーター:CMVイントロンA:ヒトB1コーディング:IRES2要素:LacZ:BGHポリA
(ステップ1)
構築物3からの520bp BglII/NsiI断片をpIRES−EGFP(Clontech)にサブクローン化する。このサブクローンをBglII/NcoIで消化する。pcDNA3_ベーターGal(Invitrogen)鋳型からPfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×2分30秒)を37サイクル実施して、LacZの一部に及ぶPCR断片を作成する。正プライマーはLZ_BspHI(5’GGCATCATGATAGATCCCGTCGTTTTAC−3’)(配列番号26)であり、逆プライマーは5‘−IZ_2699R(5’−TACTGTGAGCCAGAGTTGCC−3’)(配列番号27)であった。このPCR産物の長さは2081bpであった。この産物をBspHI及びEcoRVで消化する。この1113bp断片及び上記したBglII/NcoI断片を構築物#2にライゲートし、BglII及びEcoRVで消化する。標的導入遺伝子を図6に概略的に示し、導入遺伝子のヌクレオチド配列を図6A−Bに示す。
【0056】
構築物#5:Thy−1プロモーター:ヒトB1コーディング:IRES2要素:LacZ:BGHポリA
(ステップ1)
マウスゲノムDNAを鋳型として用いてPCR反応からマウスThy−1プロモーターを含むDNA断片を作成した。Expand High Fidelityポリメラーゼを用いるPCR反応(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分30秒)を30サイクル実施した。正プライマーはThy1_1f_Not(5’−GCGCGGCCGCTCTGGTTATCCAGGCTTCTG−3’)(配列番号28)であり、逆プライマーはThy1_hB1r(5’−GGTGGCGGCGGTACCAAGCTTGTGCCAAGAGTTCCGACTTG−3’)(配列番号29)であった。このPCR産物の長さは2923bpであった。
【0057】
(ステップ2)
pcDNA3にクローン化したヒトB1受容体(10ng)からヒトB1ブラジキニンコード配列の一部を作成した。Pfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施した。正プライマーはThy1_hB1f(5’−CAAGTCGGAACTCTTGGCACAAGCTTGGTACCGCCGCCACC−3’)(配列番号30)であり、逆プライマーはhB1_2r(5’−TGCTTGCACCTGGAATAAG−3’)(配列番号31)であった。このPCR産物の長さは881bpであった。
【0058】
(ステップ3)
Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施して、ステップ1及びステップ2からのPCR産物を連結した。正プライマーはThy1_1f_Not(5’−GCGCGGCCGCTCTGGTTATCCAGGCTTCTG−3’)(配列番号28)であり、逆プライマーはhB1_2r(5’−TGCTTGCACCTGGAATAAG−3’)(配列番号32)であった。このPCR産物の長さは3753bpであり、TOPO TAベクター(Invitrogen)にクローン化した後、クローンのDNA配列を分析した。
【0059】
(ステップ4)
ステップ3からのクローンをNotI/BglIIで消化し、3473bpの断片を単離する。構築物#4をBglI/NotIIで消化し、4451bpの断片を単離する。これら2つの断片をNotI消化pBlueScript(pBS)にライゲートして図7に概略的に図示し、図8A〜Cのヌクレオチド配列を有する導入遺伝子を得る。
【実施例2】
【0060】
ヒトB 1 ブラジキニン1受容体を発現するトランスジェニックラットの作製
pBlueScriptにクローン化したNSEプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1(図1)約20μgをBamHIで消化した。4.1kbインサートを3kbベクターから0.8%アガロースゲルを用いて分離した。4.1kbバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction(Qiagen)を用いて抽出した後、断片を更に0.8%アガロースゲル分離により精製した。Quiquickカラムを用いて2回精製するように改変したが、上記したようにバンドをゲルから切り出し、抽出した。最終産物を10mM トリス(pH7.4),0.1mM EDTAに約50ng/ulの濃度で再懸濁した。CMV(図4)及びThy−1プロモーター構築物(図7)を、ベクターからマイクロインジェクション用線状DNA断片を切り出すためにNotI消化を使用した以外は同様にして作成した。
【0061】
前記導入遺伝子を含むトランスジェニックラットを作製するために精製NSEプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1(構築物#1,図1A)断片をニュージャージー州プリンストンに所在のDNX Transgenic Sciences(Now Xenogen Corporation)に契約で移した。一般的方法を用いて前記構築物をSprague−Dawleyラット卵に導入して、少なくとも1つの導入遺伝子コピーをゲノムに組込んだトランスジェニックラット系統を作製する(例えば、米国特許第4,873,191号明細書参照)。導入し、更なるゲノム及び表現型分析にかけた3つのトランスジェニック系統は系統0004、0014及び0015であった。系統0004は約10コピーを有し、系統0014は系統0004よりも多くのコピーを有すると推定される。勿論、相関関係はあるが、コピー数及び発現レベルの相関関係は通常低い。
【0062】
NSEプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列_BGHポリAシグナルを含むトランスジェニックインサートから生じた転写物に対してTaqmanアッセイを実施した。CMVイントロンAのスプライシングにより、ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列に融合してニューロン特異的エノラーゼ遺伝子のエクソン1の118ヌクレオチドを含む転写物が生じた(図3A)。正プライマーのNSE_TM1f(5’−GAGTCTGCAGTCCTCGAGAAGC−3’)(配列番号33)またはNSE_TM2f(5’−TGAGTCTGCAGTCCTCGAGAAG−3’)(配列番号34)の3’末端がスプライス転写物に相当し、よって未スプライス転写物もゲノムDNAも検出しないようにPCRプライマーを設計した。FAM及びTAMRAで標識したTaqmanプロープのNSE_TAQ1(5’−CTCCAATCCTCCAACCAGAGCCAGC−3’)(配列番号35)及びNSE_TAQ2(5’−TCCAATCCTCCAACCAGAGCCAGCT−3’)(配列番号36)を設計してPCR産物を検出した。
【0063】
Oligotex Direct mRNAキット(Qiagen)を用いて系統004由来の2匹のトランスジェニックラット及び1匹の非トランスジェニックラットの脳からmRNAを作成した。トランスジェニック構築物由来の産物を内部コントロールとしてげっ歯GAPDHを用い、ABI PRISM 7700配列検出システムで検出した。げっ歯GAPDHはすべてのサンプルで検出されたのに対して、導入遺伝子に由来する産物はトランスジェニック動物でのみ検出された。このことは、系統004のトランスジェニックインサートに由来する転写物が適正に処理され、このアッセイがトランスジェニック動物と非トランスジェニック動物を区別するために使用できることを示している。
【0064】
ラットゲノムDNAをプロテイナーゼK消化後フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿して組織から作成した。ゲノムDNA(5〜10ug)をEcoRIで消化し、断片を1%アガロースゲルにより分離した。DNAをVacuGeneシステム(Pharmacia Biotech)を用いてゲルからZeta−Probe Genomic Testedブロッティング膜(BioRad)に移した。トランスジェニック構築物の701ヌクレオチドPCR産物を正プライマーCMV_381F(5’−AATCTCGGGTACGTGTTCCG−3’)(配列番号37)及び逆プライマーEnl_gt2r(5’−TTGGCCAGGTAGATTTCTGC−3’)(配列番号38)を用いて増幅するためにPfuポリメラーゼを用いた。産物をQiaquick PCR精製(Qiagen)により精製し、ランダムプライムラベリング(Roche)を用いてα32PdCTPで放射性標識した。ハイブリダイゼーションを0.25M Na2HPO4、6.5% SDS及び10% 硫酸デキストランにおいて65℃で一晩実施した。ブロットを0.1xSSC 0.1% SDSの最終洗浄液を用いて60℃で30分間洗浄し、フィルムに露出させた。NSEプロモーター構築物中に1つのEcoRI部位があり、消化により4132ヌクレオチドの単位長さバンドが生じる。同様に、6522のCMV構築物も1つのEcoRI部位を含んでいる。
【実施例3】
【0065】
トランスジェニックラットから精製したヒトB 1 ブラジキニン受容体へのリガンド結合
実施例のセクション2に記載した構築物#1(ヒトB1ブラジキニン受容体の発現を誘導するニューロン特異的エノラーゼプロモーター)を含むトランスジェニックラットの5系統のうちの3系統(0004、0014及び0015)の、3H−DALK、このリガンドに対して約40倍選択的である化合物への結合能について試験した。このアッセイにおいて重要なことはニューロン組織での内在性B1受容体の発現レベルが低いことである。要するに、系統0004、0014及び0015のトランスジェニック動物(すべて雌)を麻酔後断頭し、全脳を摘出し、矢状方向に二分し、全1/2脳の重量を秤量した。重量は、系統0004で813mg、系統0014mgで851mg、系統0015で843mgであった。脳組織を氷冷50mM トリス−HCl、1mM EDTA、1mM o−フェナントロリン(pH7.4)中でポリトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートを50,000×gで20分間遠心した。ペレットをトリス緩衝液中に再懸濁し、再びホモジナイズし、遠心ステップを繰り返した。最終ペレットをアッセイ緩衝液(20mM HEPES、120mM NaCl、5mM KCl、1mM o−フェナントロリン、0.2uM エナリプリラット(アンギオテンシン変換酵素を阻害するために加えるエナリプリルの二酸形態及び活性代謝物)、100μg/ml バシトラシン、3μM アマスタチン、1μM ホスホラミドン、0.1% BSA(pH7.4))中に再懸濁した。アッセイを0.5ml容量で10mg湿重量組織/チューブを用いて室温で60分間実施した。総タンパク質をBioRad DCアッセイキットを用いて測定した。B1特異的リガンドの冷DALKまたはヒトB1受容体に対して特異性を有する化合物との競合に感受性であるものとして特異的結合を測定する。図9A、9B及び9Cは、ヒトB1ブラジキニン受容体を発現しているトランスジェニックラット組織に対する3H−DALKの総結合、非特異的結合及び特異的結合の量の測定結果を示す。系統0004(図9A)は40fmol/mg−タンパク質の発現を示し、系統0014(図9B)は4fmol/mg−タンパク質の発現を示し、系統0015(図9C)は7fmol/mg−タンパク質の発現を示す。対照的に、非トランスジェニックラットの脳ではB1受容体は検出されない。系統0004において3つの標準リード化合物に対して測定したKi値は、CHO細胞で発現したクローン化hB1受容体で得られた値と非常に類似している。従って、系統0004におけるヒトB1ブラジキニン受容体の発現はヒトB1受容体に関して予想した特性を有している。
【0066】
トランスジェニックラット脳及び脊髄におけるヒトブラジキニンB1受容体の発現を調べるために系統0004をオートラジオグラフィーにかけた。トランスジェニックラット(系統0004)をまず麻酔にかけた後脳を摘出した直後ドライアイスで凍結した。脳の冠状切片(20μm)をクリオスタットにおいて作成した。選択した脳領域の隣接切片を2つに分け、緩衝液A中室温(RT)で15分間プレインキュベートした。プレインキュベート後、2つの脳切片を別々に緩衝液B中室温で90分間インキュベートした。前記切片の1組は0.3nM [3H]DALKとインキュベートし、別の組は0.3nM [3H]DALK及び200μM 非標識L−864747とインキュベートした。インキュベーション後、両切片を氷冷緩衝液Aで4分ずつ3回洗浄した後氷冷脱イオン水で5秒間濯いだ。切片を室温で冷風を用いて乾燥した後Fujiイメージングプレート(BAS−TR2025)のカセットに室温で1週間置いた。プレートをFuji BAS−5000マシンでスキャンし、画像をMCID M5ソフトウェア(Imaging Research Inc.)を用いて分析した。緩衝液Aは50mM トリス−HCl(pH7.5)、120mM NaCl及び5mM KClであり、緩衝液Bは50mM トリス−HCl(pH7.5)、120mM NaCl、5mM KCl、100μg/ml バシトラシン(Sigma B−0125)、1μM ホスホラミドン(Sigma R−7385)、1mM o−フェナントロリン(Sigma P−9375)、3μM アマスタチン(Sigma A−1276)、0.1% BSA(Sigma A−7030)である。[3H]DALKはNEN Life Science(カタログ番号NET1096)から購入する。
【0067】
本研究の目的は、ヒトブラジキニンB1受容体遺伝子を有するトランスジェニックラットの脊髄及び脳組織におけるヒトブラジキニンB1受容体の発現をオートラジオグラフィーにより特徴づけることである。本研究では、B1受容体に対して放射性トレーサー[3H]DALKを使用し、[3H]DALKの受容体特異的結合を阻止するためにヒトブラジキニンB1受容体のアンタゴニストを使用した。アンタゴニストと競合しなかったシグナルを[3H]DALKの非特異的結合として定義した。オートラジオグラフィー研究の結果から、トランスジェニックラットの脊髄及び脳組織においてヒトブラジキニンB1受容体が発現したことが分かる。NSE_ヒトB1受容体トランスジェニック系統0004では、ヒトブラジキニンB1受容体の発現が調べた脳及び脊髄の領域により異なっている。トランスジェニックラットにおいて[3H]DALKに対して最高の結合シグナルは脊髄の後角、大脳皮質、視床下部、視床、小脳、黒質、脚間核、孤束核、中脳水道周囲灰白質及び橋核で見られた。対照的に、[3H]DALKは非トランスジェニックラットの脳及び脊髄の対応領域において特異的結合シグナルを示さなかった。このことから、ヒトB1ブラジキニン遺伝子をラットゲノムへ組込むと、各種試験化合物及びヒトB1ブラジキニン受容体の公知モジュレーターに対して非天然選択的結合特性の表現型が与えられることが分かる。
【実施例4】
【0068】
NSE−hB1系統0004に対する導入遺伝子導入部位のマッピング
ゲノムDNAを系統0004のトランスジェニックラットの組織から作成した。ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼSau3A1で部分的に消化し、製造業者(カリフォルニア州ラホーヤに所在のStratagene)の指示に従ってsuperCOS Iベクターにクローン化した。コスミドクローンを、701ヌクレオチドからなる放射線標識プローブを用いるバクテリアコロニーの標準in situハイブリダイゼーションによりスクリーニングにかけた。プローブは、プライマー5’−AATCTCGGGTACGTGTTCCG−3’(配列番号39)及び5’−TTGGCCAGGTAGATTTCTGC−3’(配列番号40)、鋳型としてNSE−hB1導入遺伝子構築物を用い、標準PCR条件で得た。ポジティブコロニーを再びスクリーニングにかけ、第二回スクリーニングでポジティブだったクローンからコスミドDNAを作成した。コスミド末端の配列決定をT3及びT7プライマーを用いて実施した。T3プライマーを用いて得たコスミドクローン19のDNA配列は、透明な糖タンパク質遺伝子1(ZP−1)の一部を含むラットゲノムDNAに一致していることが判明し、T7プライマー由来の配列はNSE_hB1導入遺伝子構築物の一部に一致した。導入遺伝子導入部位を精巧にマッピングするために、コスミド19を制限エンドヌクレアーゼDraIで消化し、生じた断片をベクターpBluescript II(カリフォルニア州ラホーヤに所在のStratagene)にサブクローン化した。プラスミドDNAはアンピシリン耐性コロニーから作成し、インサートの大きさを測定し、各種サイズインサートを有するクローンをm13正プラスイマー及び逆プラスイマーを用いるDNA配列分析により分析した。クローンDra37のDNA配列分析から、このクローンはラットゲノムDNA及びNSE−hB1導入遺伝子構築物の一部を含んでいることが分かった。よって、クローンDra37は導入遺伝子導入部位の1端を含んでいた。Dra37由来のラットゲノムDNA配列のバイオインフォーマティックス分析から、このDNAがドブネズミ(Rattus norvegicus)クローンCH230−6B11(GenBank受託番号AC097387)のDNA配列と一致していたことを示した。クローンCH230−6B11は、コスミドクローン19の末端配列決定により同定した同じ遺伝子である透明帯糖タンパク質遺伝子1(ZP1)を含んでおり、染色体1にマッピングされる。従って、染色体1に組込まれた導入遺伝子はZP1遺伝子に近い。導入遺伝子の組込み部位を描写すると、系統0004ホモ接合型トランスジェニックラットを同定するための表現型アッセイを開発できた。このランダム導入部位は複数の導入遺伝子コピーを含んでいる。系統0004導入遺伝子導入部位を含むクローンDra37の配列は次の通りである。
【0069】
【化1】
【実施例5】
【0070】
NSE_hB 1 系統0004ホモ接合型トランスジェニックラットに対する遺伝子型アッセイの開発
遺伝子導入部位の下流のゲノムDNA配列を用いて、正PCRプライマー5’−GAGGTGAAGGCCACATTTTCTAGC−3’(配列番号42)及び逆PCRプライマー5’−ATGGGGAAGGAGTTGATGAAAGGTAGCC−3’(配列番号43)PCRプライマーを設計した。コスミドDNA鋳型及び標準PCR手順を用いて、前記プライマーから922ヌクレオチドの産物を作成した。この922ヌクレオチドの断片は、放射線標識され、トランスジェニック染色体から野生型を識別するためのサザンブロット分析に使用され得る外部プローブとして役立つ。従って、野生型ラットゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼDraIを用いてサザンブロット分析すると、外部プローブで約3.1kbの単一断片が検出される。対照的に、導入遺伝子に対してヘテロ接合型のラットから作成したゲノムDNAを消化すると、2つの断片が検出され、1つの断片は3.1kbであり、もう一方の断片は約1.6kbである。1.6kb断片は導入遺伝子導入部位を有する染色体に相当し、3.1kb断片は野生型染色体に相当している。よって、DraI消化及び外部プローブを用いるサザンブロット分析はホモ接合型野生型動物、ヘテロ接合型トランスジェニック動物及びホモ接合型トランスジェニック動物を同定するために使用することができる。これを使用して、ホモ接合型トランスジェニック繁殖コロニーを同定、樹立した。驚くことに、系統0004ホモ接合型動物はヘテロ接合型動物に比して脳及び脊髄においてヒトB1ブラジキニン受容体を2倍以上発現する。
【実施例6】
【0071】
NSE hB 1 トランスジェニックラットにおけるエキソビボ受容体占有率アッセイ
トランスジェニックラットを誘導チャンバに入れ、Flow Sciencesフードの下でイソフルラン麻酔する。麻酔をかけたら、ラットを循環水加温ブランケット(Gaumar Tポンプ)上に置き、ノーズコーンを介して2%イソフルランを用いて麻酔し続ける。尾静脈に、試験化合物またはベヒクルを収容したシリンジに接続した25G翼付き注入装置を用いてカニューレを挿入する。所望用量の試験化合物を投与する。実験終了時に血液サンプルを採取し、ラットを安楽死させ、その後のアッセイのために組織(通常、脳及び脊髄)を摘出する。
【0072】
ヒトB1受容体発現のオートラジオグラフィー分析のために、トランスジェニックラットから摘出した組織をドライアイス粉末で凍結し、−70℃で保存した。クリオスタット(Leica,CM3050)を用いて脳の冠状切片及び脊髄の横断切片をそれぞれ20μMずつ作成した。凍結切片を−70℃で保存した。分析のために、凍結切片を室温(RT)で15分間加温した後、室温でラジオリガンドを含まない緩衝液中で15分間プレインキュベートした。プレインキュベート後、切片をインキュベーション緩衝液に移し、室温で90分間インキュベートした。0.3nM [H−3]DALKを含む緩衝液中でインキュベートすることにより非特異的結合及び特異的結合の両方の総結合を測定した。隣接切片を用いて非特異的結合を測定した。この切片を0.3nMの[H−3]DALKに加えて200nMのヒトB1ブラジキニン受容体に対して高い親和性及び特異性を示す非ペプチド受容体アンタゴニストを含む緩衝液においてインキュベートした。90分間インキュベートした後、切片を緩衝液で3分間ずつ3回洗浄し、DIH2Oを用いて4℃で30分間濯ぎ、室温で送風機により乾燥した。切片をFujiイメージングプレートに置き、室温で一週間露出した。プレートをFuji PhosphorImager BAS 5000を用いてスキャンし、画像をMCID M5ソフトウェアを用いて分析した。図10に、NSE_hB1系統0004トランスジェニックラットの脳及び脊髄切片のオートラジオグラムを示す。高い結合レベルを示す脳及び脊髄の領域を示す。特異的[H−3]DALK結合[(総結合)−(非特異的結合)]がヒトB1ブラジキニン受容体発現のレベルを表す。非トランスジェニック対照ラットでは[H−3]DALKの特異的結合は検出できない。
【0073】
ホモジネートベースの結合アッセイのために、凍結させた脳(大脳皮質または小脳)または脊髄(35mg)を大量の氷冷アッセイ緩衝液(20mM HEPES,120mM NaCl,5mM KCl,pH7.4)においてポリトロンを用いてホモジナイズし、2つの冷却遠心管に移した。ペレット膜に対して管を4℃に予冷したローターにおいて75,000×gで10分間遠心した。上清を捨て各チューブを氷冷緩衝液(20ml)で濯いだ後氷冷アッセイ緩衝液においてペレットをホモジナイズした。ホモジネートをプールし、ラジオトレーサー、20pMの35S標識非ペプチドヒトB1受容体アンタゴニストラジオトレーサーを収容しているチューブに加えた。各チューブには0.5mlの室温アッセイ緩衝液を収容されている。ホモジネートをラジオトレーサー及び100nMの非標識非ペプチドヒトB1受容体アンタゴニストを含むチューブに添加することにより非特異的結合を測定する。所定時間(1、2、4、6、8、10分)に、3つのチューブの内容物を0.05%トリトン−100に予浸積した25mm GF/Bフィルターを用いて濾過した。濾過ステップは、3つのチューブの各々に氷冷アッセイ緩衝液(4ml)を添加し、フィルター上に内容物を注ぎ、各フィルターを氷冷緩衝液(4ml)で洗浄することにより実施する。濾過のためにHoeffer FH225V濾過マニフォールドを用いる。6つの時点が経過後非特異的結合チューブを同様に濾過する。フィルターを5mlシンチレーションバイアルに移し、Beckman Ready Safeシンチレーション流体(3ml)に10時間浸した後カウントした。
【0074】
各時点で特異的結合を計算し[(総合cpm)−(非特異的cpm)]、線形回帰により会合の勾配を測定する。薬物処理動物における受容体占有率を下記式により求める。
【0075】
占有率%=(1−(勾配薬物/勾配ベヒクル))100
勾配薬物は薬物処理動物からの会合率の勾配であり、勾配ベヒクルはベヒクル処理動物について測定した勾配である。
【0076】
複数の特許文献及び刊行物を本明細書中引用したが、その内容物は援用により本明細書に含まれるとする。
【図面の簡単な説明】
【0077】
【図1】トランスジェニックプラスミド標的構築物のラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2[ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列_BGHポリAシグナル、CMV=ヒトサイトメガロウイルス,BGH=ウシ成長ホルモン(構築物#1;NSE hB1とも称する)]を示す。
【図2A】図1Aに描画した組込んだ導入遺伝子のラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図2B】図1Aに描画した組込んだ導入遺伝子のラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図3A】NSE hB1転写物とも称されるラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2標的ベクターから作成した転写物の構造(図3A)及びその配列番号2に記載の塩基配列(図3B)を示す。
【図3B】NSE hB1転写物とも称されるラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2標的ベクターから作成した転写物の構造(図3A)及びその配列番号2に記載の塩基配列(図3B)を示す。
【図4】トランスジェニックプラスミド標的構築物のCMVプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1 cds_BGHの構造を示す。
【図5】ラットゲノムプラスミド標的構築物のCMVプロモーター_CMVイントロンA_hB1 cds_IRES2/LacZ_BGHポリA(pCMV B1 IZとも称する)の一部を示す。
【図6A】組込んだ導入遺伝子のCMVプロモーター_CMVイントロンA_hB1 cds_IRES2/LacZ_BGHポリAのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。
【図6B】組込んだ導入遺伝子のCMVプロモーター_CMVイントロンA_hB1 cds_IRES2/LacZ_BGHポリAのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。
【図7】ラットゲノムプラスミド標的構築物のThy−1_hB1 cdz_IZ pBS(Thy1 hB1 IZとも称する)の一部を示す。
【図8A】組込んだ導入遺伝子のThy−1_hB1 cdz_IZ pBSのヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。
【図8B】組込んだ導入遺伝子のThy−1_hB1 cdz_IZ pBSのヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。
【図8C】組込んだ導入遺伝子のThy−1_hB1 cdz_IZ pBSのヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。
【図9A】(A):系統0004(ラット#1810)、(B):系統0014(ラット#1813)及び(C):系統0015(ラット#1814)のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する3H−DALK([脱−Arg10,Leu9]−カリジン)の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図9B】(A):系統0004(ラット#1810)、(B):系統0014(ラット#1813)及び(C):系統0015(ラット#1814)のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する3H−DALK([脱−Arg10,Leu9]−カリジン)の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図9C】(A):系統0004(ラット#1810)、(B):系統0014(ラット#1813)及び(C):系統0015(ラット#1814)のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する3H−DALK([脱−Arg10,Leu9]−カリジン)の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図10】NSE_hB1系統0004トランスジェニックラットからの脳及び脊髄切片のオートラジオグラムを示す。非特異的結合はヒトB1受容体に対してサブnMアフィニティーを有するヒトB1ブラジキニン受容体の非ペプチドアンタゴニスト200nMの存在下で0.3nM [H−3]DALKを用いて測定した。総結合は0.3nM [H−3]DALKを用いて測定した。高い結合レベルを示す脳及び脊髄の領域を示す。特異的[H−3]DALK結合[(総結合)−(非特異的結合)]はヒトB1ブラジキニン受容体発現のレベルを表す。非トランスジェニックの対照ラットでは[H−3]DALKの特異的結合を検出できなかった。
【0001】
本発明は、機能的B1ブラジキニン受容体タンパク質、好ましくは哺乳動物B1ブラジキニン受容体タンパク質、特に機能的非ヒト霊長類またはヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質を発現するトランスジェニックげっ歯類に関する。本明細書では、異種プロモーターの制御下でヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質のオープンリーディングフレームをコードするDNA配列をげっ歯類ゲノムにランダムに組込んだトランスジェニックげっ歯類の作製を例示しているが、これに限定されない。本発明はまた、非ヒト霊長類またはヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質の機能的修飾を発現するトランスジェニックげっ歯類に関し、前記修飾にはアミノ酸欠失、付加、置換、NH2−またはCOOH−末端切断、スプライス変異、及びタンパク質にヒトB1ブラジキニン様活性を与えるものが含まれるが、これらに限定されない。前記トランスジェニック系統内の発現導入遺伝子は野生型B1ブラジキニン受容体のアンタゴニスト及びアンゴニスト選択性を模倣する。従って、本発明のトランスジェニック動物は、B1ブラジキニン受容体(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)のモジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして有用であり、受容体活性のアンタゴニストまたはアゴニストのようなB1ブラジキニンモジュレーター(例えば、ヒトB1ブラジキニンモジュレーター)の薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供する。
【背景技術】
【0002】
Dray及びPerkins(TINS,16:99−104(1993))やProud及びKaplan(Annual Review Immunology,6:49−83(1988))は、薬理学的特性に基づいて2つの哺乳動物ブラジキニン受容体サブタイプB1及びB2を定義している。ノナペプチドブラジキニン(BK)及びデカペプチドLys−BK(カリジン)はカリクレインのタンパク質分解作用により大型タンパク質前駆体キニノーゲンから遊離する。BK及びカリジンはいずれもB2受容体を活性化する。これらのB2受容体アゴニストは、カルボキシペプチダーゼにより分解してB1受容体アゴニストの脱−Arg9BK及び脱−Arg10カリジンを生じたり、アンギオテンシン変換酵素(ACE)により分解して不活性ペプチドを生ずる。BK及びカリジンはB2ブラジキニン受容体サブタイプで等能力アゴニストとして作用する。対照的に、BKはB1ブラジキニン受容体サブタイプで全体的に不活性である。脱−Arg10,Leu9[カリジン](ここでは、“DALK”)はカリジンに類似の構造を有するペプチドアンタゴニストである。
【0003】
B2及びB1ブラジキニン受容体はGタンパク質結合性受容体のスーパーファミリーのメンバーである。多数の哺乳動物B1及びB2受容体遺伝子が単離され、特性決定されている。例えば、
ヒトB1ブラジキニン(いずれも1998年1月28日及び1999年10月12日付けでMenkeらに付与された米国特許第5,712,111号明細書及び同第5,965,367号明細書、及びMenkeら,J,Biol.Chem.,269:21583−21586(1994));
家兎B1ブラジキニン(MacNeilら,Biochem.Biophys.Acta,1264:223−228(1995));
マウスB1ブラジキニン(Hessら,Immunopharmacology,33:1−8(1996));
ラットB2ブラジキニン(McEachernら,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:7724−7728(1991));
ヒトB2ブラジキニン(Hessら,Biochem.Biophys.Res.Comm.,184:260−268(1992));
ラットB1ブラジキニン(Jonesら,Eur.J.Pharmacol.,374(3):423−433(1999))。
【0004】
Hessら(Immunopharmacology,33:1−8(1996))は、B1受容体アゴニストの選択性はマウス、ヒト及び家兎B1受容体を比較したとき種特異性であることを示している。
【0005】
Bock及びLongmore(Current Opin.in Chem.Biol.,4(4):401−407(2000))は、最新の公知のB1及び/またはB2ブラジキニン受容体活性モジュレーターを記載している。著者らが検討しているように、正常組織ではB1受容体ではなくB2受容体が発現していることは科学界で広く認められている。対照的に、炎症、疼痛、組織損傷を招く生物学的プロセスは急速にB1受容体活性及び細菌感染を誘発する可能性がある。病的状態でのB1受容体の見かけ誘導能により、B1受容体アンタゴニストを消炎/鎮痛剤として使用する治療機会が与えられ得、よってB1受容体を魅力的な薬物標的とし得る。
【0006】
このために、B1ブラジキニン受容体モジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルとして使用するためのトランスジェニックラットモデルのような動物モデル、及びヒトB1ブラジキニン受容体に対する特異性に対する潜在的モジュレーターの薬力学的特性を評価するための動物モデルシステムを提供することが依然として要望されている。本発明はヒトB1ブラジキニン受容体タンパク質を発現する各種トランスジェニックげっ歯類を開示することにより継続中の要望を満たす。
【発明の開示】
【0007】
本発明は、非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする1つ以上の導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ非ヒトトランスジェニック動物細胞、非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物(この中には非限定的に創始動物が含まれる)及び/または非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。好ましい非ヒトトランスジェニック細胞はげっ歯類細胞であり、げっ歯類ゲノムに安定的に組込むための好ましい非天然B1ブラジキニン受容体遺伝子は霊長類B1ブラジキニン受容体遺伝子である。
【0008】
本発明の具体例では、非ヒトトランスジェニック動物細胞及び胚はその後トランスジェニックラットを生ずるラットの細胞及び胚であり、前記トランスジェニックラットには、初期創始動物、同腹子、及び後続のヒトB1ブラジキニン受容体の機能的形態を発現する安定なトランスジェニック系統のメンバーからなる動物が含まれる。前記トランスジェニック動物は修飾動物がヒトB1ブラジキニン受容体の薬理学的特性を有する機能的タンパク質を発現するような遺伝子修飾、すなわちトランスジェニック動物(本明細書では、トランスジェニックラットを例とする)の脳から作成した膜が非トランスジェニック動物とは異なる薬理学的特性を有するような遺伝子修飾を含む。
【0009】
好ましくは、本発明は、ヒトB1ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする導入遺伝子の少なくとも1つを標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ動物細胞に関する。更に、本発明は、ヒトB1ブラジキニン受容体の機能的形態をコードする導入遺伝子の少なくとも1つを含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック創始動物、同腹子及び他のトランスジェニック動物に関する。トランスジェニック動物細胞、動物及び同腹子は天然(野生型)B1ブラジキニン受容体の存在下でも非存在下でも非天然B1ブラジキニン受容体(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)を発現し得る。本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法にてらして、好ましいトランスジェニック細胞、胚及び/または動物は天然B1ブラジキニン受容体及びトランスジェニック非天然B1ブラジキニン受容体に対する対立遺伝子を含む。
【0010】
本明細書に記載されているトランスジェニックラットモデルは、受容体活性を有する潜在的モジュレーター(例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト)をスクリーニングするために有用であり、前記モジュレーターには非限定的にペプチド、タンパク質または非タンパク質の有機もしくは無機分子が含まれる。よって、本発明は、本発明のトランスジェニックラット及びその子孫の作製方法、並びに薬理試験のためのその使用に関する。更に、本発明は、試験化合物(類)をトランスジェニックラットに投与し、ヒトB1ブラジキニン受容体の活性に対する該化合物の効果を調べることによりヒトB1ブラジキニン受容体の潜在的モジュレーターの選択性及び活性を測定する方法に関する。よって、本発明は、試験化合物の血液脳関門への浸透、組織への分布及びヒトB1ブラジキニン受容体への結合能力を測定する例えば脳組織を用いる各種占有率アッセイに関する。
【0011】
本明細書中、「機能的」は、細胞またはインビボ系中に存在するとき天然、すなわち未変性の条件または環境中のように通常通り機能する遺伝子またはタンパク質を指す。従って、機能的でない(すなわち、“非機能的”、“破壊”、“変性”等)遺伝子は野生型、天然または未変性タンパク質として機能しないタンパク質をコードしたり、またはタンパク質を全くコードしない。非機能的遺伝子は本明細書に記載されている相同組換えの産物であり得、非機能的遺伝子は遺伝子の機能的形態を含む標的染色体の領域を特異的に標的して野生型または天然遺伝子をノックアウトする。
【0012】
本明細書中、「モジュレーター」は、ヒトB1ブラジキニン受容体のような哺乳動物B2またはB1ブラジキニン受容体の発現または活性を変化させたり受容体とそのリガンドまたは他のタンパク質との相互作用の影響を変化させる化合物であり、例えばアンタゴニストまたはアゴニストである。
【0013】
本発明のトランスジェニック動物に関して、本明細書中で「導入遺伝子」及び「遺伝子」を用いる。遺伝子はタンパク質または構造RNAをコードするヌクレオチド配列である。遺伝子及び/または導入遺伝子は当業界で公知の遺伝子調節要素及び/または構造要素をも含み得る。本明細書中、導入遺伝子は遺伝子を含む遺伝構築物である。導入遺伝子は当業界で公知の方法により動物の細胞中の1つ以上の染色体に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子はトランスジェニック動物のゲノム、好ましくは染色体中の少なくとも1ヶ所に運ばれる。当該導入遺伝子はラットまたは他の哺乳動物の標的ゲノムに導入され、よって安定的に組み込まれ且つ所望機能を発揮し得るように生殖細胞及び/または体細胞に導入される。導入遺伝子は標的細胞/動物内の導入遺伝子のオープンリーディングフレームを転写する当業界で公知の異種遺伝子調節要素及び/または構造要素、例えば異種プロモーター配列及び/または異種エンハンサー配列をも含み得る。前記異種調節配列は遺伝子が適切に発現されるようにコード領域に“融合”または“作動的に連結”している。染色体が導入遺伝子を標的動物に安定的に組込むのに好ましい標的であるが、「ゲノム」は核DNA(染色体または染色体外DNA)を含めた生物の全DNA補体並びに細胞の細胞質内に局在するミトコンドリアDNAを指す。上記したように、本発明のトランスジェニックラットは、導入遺伝子(例えば、ヒトB1ブラジキニン遺伝子の機能的形態)を発現させてヒトB1ブラジキニン受容体モジュレーターに対する特異的受容体占有率モデルを提供し、ヒトB1ブラジキニン受容体を調節する試験化合物の選択性を研究するための薬力学的動物モデルシステムを提供するという所望効果を達成するように1つ以上の導入遺伝子をラットの胚細胞及び/または体細胞(好ましくは両方)に安定的に組込んでいる。情報を子孫に伝える能力を付与するように導入遺伝子を生殖細胞系に導入することが好ましい。実際子孫が遺伝情報の一部または全部を保有しているならば、その子孫もトランスジェニック動物である。
【0014】
本明細書中、「動物」はすべての哺乳動物を含み得るが、トランスジェニック動物を指すときにはヒトが除かれる。動物には胚及び胎児段階を含めたすべての発育段階の動物が含まれる。「トランスジェニック動物」は細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作、例えばマイクロインジェクション、相同組換えのような標的遺伝子デリバリーまたは組換えウイルスの感染により直接または間接的に受けた遺伝子情報を有する1つ以上の細胞を含む動物である。上記したように、この導入DNA分子(導入遺伝子)は染色体内に組込まれ得るかまたは染色体外で複製するDNAであり得る。
【0015】
本明細書中、「げっ歯類」は囓るために一対の上下切歯を有し、歯が連続的に成長し、切歯と臼歯の間にすき間があるげっ歯目のメンバーの種である。トランスジェニック動物を作製するための好ましい例にはドブネズミ(Rattus norvegicus)、クマネズミ(Rattus rattus)及びハツカネズミ(Mus musculus)が含まれるが、これらに限定されない。
【0016】
本明細書中、「ラット」は、系統的動物学の見地からクマネズミ属(Rattus)に属する動物を指す。本発明のトランスジェニック動物をクマネズミ属の任意の種から作製し得る。前記種にはドブネズミ(Rattus norvegicus)やクマネズミ(Rattus rattus)が含まれるが、これらに限定されない。
【0017】
本明細書中、「創始動物」は、げっ歯類遺伝子をそのヒトホモログで置換するように相同組換えにより標的された胚性幹細胞のようなマイクロインジェクトされた卵または標的細胞から発生するトランスジェニック動物を指す。創始動物は遺伝子産物の適当なアッセイにより機能的遺伝子の発現について試験される。
【0018】
本明細書中、「系統」は、1つの創始細胞の直系子孫であり、生殖系列に安定的に組込まれた1つの導入遺伝子座を有する動物を指す。
【0019】
本明細書中、「同系繁殖系」は、すべての内在性遺伝子座で遺伝的に同一である動物を指す。当業界で使用するとき、同系繁殖系は1つの動物から次の動物への再現性、動物の中で細胞または組織を伝達する能力及び内在性遺伝子の役割を同定するために規定遺伝子研究を実施する能力を含めるために使用され得る。同系繁殖系はマイクロインジェクションのために使用されるラットが樹立された同系繁殖系のメンバーである前記系統から発達し得る。
【0020】
本明細書中、「遺伝子型」は生物の遺伝子構成成分である。
【0021】
本明細書中、「表現型」は、遺伝子型と環境の相互作用により生ずる細胞または生物が有する形態学的、生理学的及び/または生化学的形質の集まりである。この表現型の定義には、遺伝子型プロフィールが変化し、よって動物内での導入遺伝子の発現により1つ以上の化合物に対する新しい薬理学的選択性、例えば当該導入遺伝子の機能的発現に基づく選択性が生ずるように非天然導入遺伝子が動物に導入されている生化学的形質が含まれる。「表現型発現」は、産物(例えば、ポリペプチドまたはタンパク質)を産生したり接合子または生物の天然表現型の発現を変化させる導入遺伝子の発現を指す。
【0022】
本明細書中、「ラットエノラーゼプロモーター」、「ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター」、「NSE」等は、本明細書で詳記するように本発明を例示するために使用されるプロモーター断片を指すべく本明細書中同義的に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0023】
本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子が標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込まれた動物細胞に関する。よって、本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。好ましい非ヒトトランスジェニック細胞はげっ歯類細胞であり、げっ歯類ゲノムに安定的に組込むのに好ましい非天然B1ブラジキニン受容体遺伝子は霊長類B1ブラジキニン受容体遺伝子である。B1ブラジキニン受容体をコードする単離DNA分子の各種非ヒト霊長類ソースの例には、旧世界ザル類のメンバー、例えばアカゲザル(Macaca mulatta)のようなマカク(Macaca)属の各種メンバー;新世界ザル類のメンバー、例えばタマリンのようなタマリン(Saguinus)属の各種メンバー;レムル(Lemur)メンバーのような原猿類;チンパンジー(Pan troglodytes)、オランウータン(Pongo pygmaeus)やゴリラ(Gorilla gorilla)のような大形類人猿が含まれるが、これらに限定されない。
【0024】
従って、本発明は、機能的形態の非天然哺乳動物B1ブラジキニン受容体をコードする1つ以上の導入遺伝子を非ヒト動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び/または非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。本発明の好ましい実施態様は機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体を発現し、よってラットトランスジェニック細胞及び胚を含むトランスジェニックラットに関し、前記細胞及び胚からは初期創始動物、同腹子、及び後続の機能的形態のヒト動物B1ブラジキニン受容体を発現する安定なトランスジェニック系統となるトランスジェニックラットを含めたトランスジェニックラットが生ずる。当該導入遺伝子は、宿主動物において機能するエンハンサー及び/またはプロモーター断片のような調節配列に作動的に連結させた霊長類B1ブラジキニン受容体発現カセット及びB1オープンリーディングフレームの下流に終結シグナルを含む。本発明のトランスジェニック動物により、前記動物において発現導入遺伝子(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)の薬理学的活性を研究して、前記トランスジェニック動物内である試験化合物の効果を試験することができ、よって新しい薬理学的に活性な物質を開発するための予備試験を実施することができる。本明細書に記載されているデーターから、機能的ヒトB1ブラジキニン遺伝子またはその生物学的均等物を含む非ヒトトランスジェニック動物が一定の表現型を示し、該トランスジェニック動物がヒトB1ブラジキニン受容体の特定の薬理学的性質を有するように有効量の機能的導入遺伝子産物を発現していることは明らかである。上記した表現型については、非トランスジェニックラットとは異なる薬理学的特性を有することが判明しているトランスジェニックラットの脳から作成した膜を用いる結合アッセイにより本明細書中に詳細に記載されている。このことは、ラットB1受容体に対する親和性が乏しいヒト特異的B1化合物が実施例に記載されているトランスジェニックラットの脳から作成した膜に対して高い親和性を有することを示す結合データーから明らかである。内在性ラット受容体はいずれの表現型も隠蔽しないようである。ラジオリガンド3H−DALKはラットB1受容体よりもむしろヒトB1受容体に対して高い親和性を有する。このことが、このリガンドを用いて全脳ホモジネートアッセイでも脳切片の受容体オートラジオグラフィーでも非トランスジェニックラットでは内在性B1受容体活性が見られない理由の一部である。対照的に、ヒトB1受容体を発現する例示トランスジェニックラットでは、3H−DALKを用いていずれの方法でも容易に検出され得る結合部位がある。
【0025】
本明細書に記載されているトランスジェニックラットモデルは受容体活性の潜在的モジュレーター(例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト)をスクリーニングするために有用である。前記モジュレーターにはペプチド、タンパク質、または非タンパク質有機もしくは無機分子が含まれるが、これらに限定されない。本発明のトランスジェニック動物は、試験化合物のヒトB1ブラジキニン受容体活性に対するインビボ効果を研究するための改良モデルを提供する。本発明以前では、野生型B1ブラジキニン発現を増加させる物質(例えば、細菌性リポ多糖類)で試験動物を処理すると、B1ブラジキニン発現が増加したり血液脳関門の性質を変化させるようにバラバラの結果が生じた。たとえ成功しても、ヒトに対して選択的な化合物の特性を評価することはできなかった。この問題を解決するために、薬理学的特性がヒトB1ブラジキニン受容体に適合している種を同定しようと試みた。その欠点は、1つの種が考慮中のすべての化学的シリーズのすべてではなく1つに関してしかヒトと類似の特性を有し得ないことである。或いは、遺伝的にヒトに近縁の種(例えば、非ヒト霊長類)を使用し得る。しかしながら、非ヒト霊長類のような非トランスジェニック動物を用いて化合物をアッセイすると処理量は少なくなる。
【0026】
非限定的例として提示する1つのアッセイでは、試験化合物の血液脳関門を浸透する能力及び組織に分布し受容体に結合する能力を評価するために脳での占有率アッセイにおいて本発明のトランスジェニック動物を使用する。占有率受容体アッセイは、本発明のトランスジェニック動物を使用し、ヒトB1ブラジキニン受容体に結合する公知の放射線標識化合物の置換を測定することにより実施され得る。例えば、トランスジェニックまたは非トランスジェニックSprague Dawley雄ラットに試験化合物を経口投与し、一晩断食させてもよい。実験当日に体重を測定する。総結合を測定するために50% PEG/D5Wベヒクルを静注するかまたは1% メトセルを経口投与する。静注投与化合物の場合には、ラットにベヒクル、試験化合物及び/または非特異的結合を測定するために使用する第2化合物を尾静脈に注射するためにラットをperspexラット拘束装置に置く。7.5分後、ラットを拘束装置に戻し、200μCi/kgの[3H]−試験化合物を静注する。経口投与化合物の場合には、ラットにベヒクルまたは化合物を胃管を介して投与する。非特異的結合を測定する。60分後、ラットを拘束装置に置き、200μCi/kgの[3H]−試験化合物を静注する。尾静脈には1cc注射器、25ゲージ,1インチの針を用いて注射する。ラットを温め、尾をアルコールスワブを用いて拭くことにより尾静脈を拡張させる。アイソトープを注入してから7.5分後、動物をCO2により安楽死させ、眼窩に向かう脊髄開口で頭蓋基部から頭蓋を開く。約100〜150mgの皮質スライスを切断し、直ちに風袋を測定済みのポリプロピレンチューブに入れ、秤量する。1N NaOHでpH7.4とした冷HEPES緩衝液(10mM)[脱イオン水2Lあたり7.4g NaCl(150mM),4.8g HEPES(10mM),0.750g KCl(5mM)]を各チューブに39vols添加する。NaCl及びKClはFisher Scientific、HEPES(C8H18N2O4S)はBoehringer Mannheimから購入した。脳をポリトロンホモジナイザーを用いフルスピードで10秒間ホモジナイズする。直ちにホモジネート500μlを濾過装置(Hoeffer)を用いて(0.2% PEIに予め浸した)25mm Pall A/Eフィルターを介して2回濾過する。ホモジネートがフィルターの全表面を覆うように閉じられ、濾過・洗浄するときには開かれる弁を備えたフィルターにホモジネートをヒペットで移した直後に、冷HEPES[KCl(5mM),NaCl(150mM),HEPES(10mM)]緩衝液を5mlずつ用いて5回洗浄する。各フィルターをシンチレーションバイアルに置き、Ultima Goldシンチレーション流体(10ml)を各バイアルに添加する。500μlずつ2つのホモジネートアリコートをシンチレーションバイアルに入れ、Ultima Goldシンチレーション流体(10ml)を添加し、カウントして、全脳標識を測定する。トリチウム計数プログラムでカウントする前にサンプルを4時間放置する。アイソトープ溶液をトリチウムプログラムで計数して実際のmCi濃度を測定する。サンプル0.001mlを、シンチレーション流体10mlを含むバイアルにピペットで移す(ピペットの先端をキムワイプで注意深く拭く)。次のように計算する:
(1)各サンプルにつき標識の蓄積率(% Acc)=(フィルターdpm/ホモジネートdpm)×100、
(2)全アッセイにつき特異的蓄積率(% Sp Acc)=総結合の平均% Acc−非特異的結合の平均% Acc、
(3)結合阻害率(% Inh)=((総結合の平均% Acc−サンプルの平均% Acc)/% Sp Acc)×100、
(4)1μCi=2.2×106DPM(0.001mlアイソトープ溶液(0.2mCi/ml)=4.4×105DPM。
150gのラットに0.15mlを投与する場合の試験化合物の用量は200μCi/kg体重である:1mlの1mC/ml(NEN)+4ml 食塩水。
【0027】
本発明の好ましい実施態様は、機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする1つの導入遺伝子を標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだトランスジェニックげっ歯類の作製である。しかしながら、本発明は、ラット及びマウスの好ましい標的だけでなく、本明細書に例示したトランスジェニックラットと実質的に同様の表現型形質を示す他のトランスジェニック非ヒト動物の作製に関する。前記非ヒト動物の例にはウシ、ブタ、家兎、モルモット、ヒツジ、ハムスター及びヤギが含まれるが、これらに限定されない。
【0028】
好ましくは、本発明は、機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を標的動物の生殖細胞及び/または体細胞に安定的に組込んだ動物細胞にも関する。更には、本発明は、機能的形態のヒトB1ブラジキニン受容体をコードする少なくとも1つの導入遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック胚、非ヒトトランスジェニック動物及び非ヒトトランスジェニック同腹子に関する。トランスジェニック動物細胞、動物及び同腹子は天然(野生型)B1ブラジキニン受容体の存在下でも非存在下でも非天然B1ブラジキニン受容体(例えば、ヒトB1ブラジキニン受容体)を発現し得る。本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法にてらして、好ましいトランスジェニック細胞、胚及び/または動物は天然及びトランスジェニック非天然B1ブラジキニン受容体の両方に対する対立遺伝子を含む。典型的には、当該導入遺伝子は、宿主動物において機能するエンハンサー及び/またはプロモーター断片のような調節配列に連結させたヒトB1ブラジキニン受容体発現カセット及びB1オープンリーディングフレームの下流に終結シグナルを含む。ヒトB1ブラジキニン受容体をコードするトランスジェニックラットを作製するための好ましい方法では、導入遺伝子を通常非相同組込みにより宿主染色体位置に組込む。これらの導入遺伝子は更に、エンハンサー(例えば、SV40エンハンサー)に連結したホスホグリセレートキナーゼ(pgk)プロモーターまたはHSV tk遺伝子プロモーターのような構成的プロモーターに作動的に連結させた選択マーカー、例えばneoまたはgpt遺伝子を含み得る。
【0029】
ヒトB1ブラジキニン遺伝子をマウスに標的導入するような幾つかの実施態様では、内在性非ヒトB1対立遺伝子を機能的に破壊して、内在的にコードしたマウスB1の発現を抑制または消滅させてヒトB1導入遺伝子の発現を干渉させない。導入遺伝子は胚、胎児または成熟多能性幹細胞に導入され得る(援用により本明細書に含まれるとするCapecchi,Science,244:1288−1292(1991);2001年3月20日に付与された米国特許第5,464,764号明細書、同第5,487,992号明細書、同第5,627,059号明細書、同第5,631,153号明細書及び同第6,204,061号明細書も参照)。胚性幹細胞はインビトロで培養した胚盤胞から単離され、分化内で安定的に培養され得る。例えば、導入遺伝子は、標的ES細胞内の特定ゲノム部位に導入遺伝子を指向させるべく使用され得る相同アーム(例えば、上掲のCappecchi)を含む遺伝子標的ベクター中に含まれ得る。外来DNAはエレクトロポレーションにより胚性幹細胞に導入され得る。適当に導入遺伝子を有する胚性幹細胞を胚盤胞の内部細胞塊に注入する。キメラ動物を作製し、これを交雑育種させてすべての細胞が導入遺伝子を有する動物を得る。以下に記載するマイクロインジェクションを用いて、トランスジェニックマウスを作製するための好ましい方法はES細胞ベース技術である。ES細胞に遺伝子を標的させることにより遺伝子機能を破壊するための一般的スキームは、ES細胞ゲノムにおいて染色体対応物との相同組換えを受けるように設計した標的構築物を構築することである。標的構築物は通常、ポジティブ選択マーカーのような追加配列を標的遺伝子のコーディング要素に挿入して該遺伝子を機能的に破壊するように配置される。よって、本発明はまた、相同的組換え標的構築物を用いる遺伝子標的により不活化した内在性B1遺伝子を有する非ヒト動物(例えば、非霊長類哺乳動物)の作製方法に関する。標的構築物の構築及び選択方法に関する一般原理は援用により本明細書に含まれるとするBradleyら,Bio/Technology,10:534(1992)に記載されている。
【0030】
本発明では、各B1ブラジキニン受容体の発現をB1ブラジキニン遺伝子に作動的に連結した各種の同種または異種調節配列によりコントロールするように哺乳動物形態をコードする導入遺伝子をDNA構築物として宿主標的細胞に提示する。その例を図1(ラットニューロン特異的エノラーゼ[NSE]プロモーター、及びウシ成長ホルモン(BGH)転写終止及びポリアデニル化シグナルの上流にあるヒトB1ブラジキニン受容体遺伝子に融合(すなわち、作動的に連結した)CMVイントロンA)に示すが、これに限定されない。この構築物を組込む動物は中枢神経系統においてニューロン特異的発現を提示する。対照的に、ヒトB1ブラジキニン遺伝子の末梢発現は図4(内部リボソームエントリー部位(IRES)により分離される第2オープンリーディングフレーム(LacZ)の上流にあるヒトB1ブラジキニン受容体遺伝子に融合したCMVプロモーター/イントロンA及びLacZ ORFの下流にBGH終結シグナル)に示す組込み構築物を介して生ずる。また、図7に示す導入遺伝子構築物(内部リボソームエントリー部位(IRES)により分離される第2オープンリーディングフレーム(LacZ)の上流にあるヒトB1ブラジキニン受容体遺伝子に融合したThy−1プロモーター及びLacZ ORFの下流にBGH終結シグナル)は脳特異的発現を促進しなければならない。前記した各種構築は、無数のプロモーター/導入遺伝子構築物が安定的なゲノムDNA組込み及びその後の操作によりトランスジェニック動物を作製するための標的細胞への導入のために作製され得ることを示している。本明細書に例示されている構築物により、ジスシストロン構築物が非ヒトトランスジェニック動物に組込まれる。好ましいジスシストロン構築物は各オープンリーディグフレーム(ORF)を分離するために内部リボソームエントリー部位(IRES)を利用する。好ましくは、第1ORFは機能的形態の霊長類B1ブラジキニン受容体をコードし、第2ORFは組織及び/または細胞特異的発現を容易に検出し得るリポーター遺伝子をコードする。各種のリポーター遺伝子が当業界で公知であり、その非限定的例としてLacZ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アルカリホスファターゼ及びルシフェラーゼが挙げられる。
【0031】
トランスジェニックラットを作製するための好ましい方法は、通常特定導入遺伝子を含むDNAをラットの生殖細胞(通常、受精卵)に導入することを含む。次いで、受精生殖細胞を用いて完全なトランスジェニック動物を作製する。2つの前核の1つに無傷のDNAを注入するマイクロインジェクターピペット及び顕微鏡を用いてDNAを生殖細胞に導入することを含む公知のマイクロインジェクション方法を用いてDNAを生殖細胞に導入することが好ましい。少なくとも1つ、恐らくは2つ以上の特定導入遺伝子がゲノムに組込まれたトランスジェニック動物を選択する。安定的に組込まれた導入遺伝子を含む少なくとも1つのトランスジェニックラット系統を樹立するように繁殖のために少なくとも1つの創始トランスジェニックラットを選択する。この方法は米国特許第4,873,191号明細書に記載されている。本発明のトランスジェニック動物を作製するために当業界で利用されている他の公知の方法を用いることができるが、この方法には外在性DNAのキャリアとして精子を用いるインビトロ受精、エレクトロポレーションが含まれるが、これらに限定されない。また、ラット胚性幹細胞系にトランスフェクションして導入遺伝子をラットゲノムに直接標的した後特定の組換えES細胞を選択し、ラットの胚盤胞に導入してもよい。各種方法がMullinsら,「トランスジェニック動物:作製及び使用(Transgenic Animal: Generation and Use)」,第2章,「トランスジェニックラット(Transgenic Ras)」,p.7−9,Harwood Academic Publisher(1997年)発行に記載されている。従って、本発明のトランスジェニックラットを作製するための好ましい公知方法は、過剰排卵を促進するために(卵胞刺激ホルモンを連続注入して)雌をホルモン状態に置くステップ、(好ましくは受精雄と繁殖させるかまたは人工受精により)過剰排卵雌を受精させるステップ、導入遺伝子をマイクロインジェクションのような公知技術を用いて受精卵に導入するステップ、受精卵を偽妊娠雌ラットに移植し、その後出産まで進めるステップを含む。偽妊娠雌の胎児が出産に至ったら、創始動物を離乳子孫由来のゲノムDNAへ導入遺伝子DNAをハイブリダイズする一般的方法または導入遺伝子の存在に対して特異的なPCRアッセシにより同定する。遺伝子を発現する創始動物、特に遺伝子を高レベル且つ所期の組織分布で発現する(例えば、脳特異的発現)創始動物を選択し、繁殖させて、意図するトランスジェニックラット系統を樹立する。
【0032】
本発明を実施する際、ヒトB1ブラジキニン遺伝子を組込んだトランスジェニック動物のすべてが当該B1遺伝子の適切な発現を示さないことは自明である。例えば、実施例3及び6に提示されているデーターには、ヒトB1ブラジキニン受容体を発現する3つの別々のトランスジェニックラット系統についてヒトB1ブラジキニン受容体に対する3H−DALKの結合の違いが示されている。適当なトランスジェニック系統を同定することはプロモーター強度、ゲノムに組込む導入遺伝子の数、組込む事象の位置の違いのように特異的な構築物でもあり得る。ラットB1受容体は通常導入遺伝子よりも非常に低いレベルでしか発現しないが、その発現はある処理、例えばリポ多糖類またはストレプトゾシンにより誘導され得る。トランスジェニックラットと非トランスジェニックラットを比較した本明細書の記載から明らかなように、ラットB1ブラジキニン受容体はヒト受容体とは明確に異なる薬理学的特性を有する。すなわち、ヒトB1受容体に対して高い親和性を有する多くの合成化合物はラットB1受容体に対しては低い親和性しか有さない。通常条件下で十分量の導入遺伝子を発現する動物は受容体占有率アッセイにおいて特に有用である。全組織アッセイで測定して系統0004と同じかまたはそれ以上の発現レベルを有する動物が好ましい。しかしながら、例えば発現が更なる研究のために利用し得る組織の散在領域に局在化しているならば、低い組織発現を示す系統(例えば、系統0014及び0015)を使用することもできる。よって、当業者は生じた系統の少なくとも1つが確実に所望の形質を発揮するように約6〜約10またはそれ以上の系統を作製しようとする。ヒトB1ブラジキニンの複数コピー、例えば特定導入遺伝子の2〜約50コピーを標的ゲノムに組込んだ動物を同定し、繁殖することも有用であり得る。従って、特定試験化合物の結合及び/または受容体占有率特性を調べるためのインビボ/エキソビボアッセイに対して最適の適合を見つけるために特定トランスジェニック動物を特徴づけることは本発明の範囲であり、前記アッセイでは試験化合物は天然及びトランスジェニックB1ブラジキニン受容体タンパク質に対して特定結合/薬理学的プロフィールを発揮する。
【0033】
本明細書で使用されている命名法並びにトランスジェニックプロトコル、細胞培養、分子遺伝学及び分子生物学の実験手順は当業界で公知であり、慣用されている。組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、細胞培養及び導入遺伝子の導入のためには一般的方法(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション)が使用される。各種酵素反応、オリゴヌクレオチド合成及び精製ステップは製造業者の仕様に従って実施する。技術及び手順は通常当業界の慣用方法及び本明細書に掲げられている文献に従って実施する。本明細書に記載されている手順は当業界で公知であると考えられ、読者の便宜のために記述されている。本明細書に含まれている情報はすべて援用により本明細書に含まれるとする。例示のために下記実施例を提示する。当業者には各種の他の態様が自明であるので、下記実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例1】
【0034】
トランスジェニック標的ベクターの構築
構築物#1:ラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2ベクター
(ステップ1)
ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター領域を含むPCR断片を作成するための鋳型としてラットゲノムDNA(50または100ng/50ul反応物)を使用した。Expand High fidelityポリメラーゼ(Roche)を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分)を32サイクル実施した。正プライマーはRat_enl.2f(5’−CATCACTGAGCCCAACACAA−3’)(配列番号5)であり、逆プライマーはRat_enl.2r(5’−TCACCTCGAGGACTGCAGAC−3’)(配列番号6)であった。このPCR産物の長さは2059bpであった。
【0035】
(ステップ2)
ステップ1からの精製PCR産物(Qiaquick PCR精製)を、BamHI制限部位を付加するための第2回PCRのための鋳型として使用した。以下のプライマー及びExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分)を30サイクル実施した。正プライマーはRat_enl.4f(5’−GCCGATCCTGAGCTCCTCCTCTGCTCGC−3’)(配列番号7)であり、逆プライマーはNSE_1R(5’−CTCGAGGACTGCAGACTCAG−3’)(配列番号8)であった。このPCR産物の長さは1814bpであった。
【0036】
(ステップ3a)
CMVイントロンA配列を含むプラスミドDNAをサブクローニング用PCR断片を作成するための鋳型として使用した。Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分)を25サイクル実施した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはCMVintA.1R(5’−CTGCAGAAAAGACCCATGGAAAGG−3’)(配列番号10)であった。このPCR産物の長さは827bpであった。
【0037】
(ステップ3b)
ステップ3aのCMVイントロンA産物に重複末端を付加するためにPfuポリメラーゼ(Stratagene)またはExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×1分10秒)を12サイクル実施した。正プライマーはNSE_CMV.OLF1(5’−GAGTCTGCAGTCCTCGAGGTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号11)であり、逆プライマーはCMV_hB1.OLR1(5’−TGGCGGCGGTACCAAGCTTCTGCAGAAAAGACCCATGGAAAG−3’)(配列番号12)であった。このPCR産物の長さは863bpであった。
【0038】
(ステップ4)
ウシ成長ホルモン(BGH)ポリA配列に融合してヒトブラジキニンB1受容体配列を含むプラスミドpcDNA3に対してPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×3分)を25サイクル実施して、ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列及び重複末端を有するBGHポリAシグナルを含むPCR断片を構築した。正プライマーはCMV_hB1.OLF1(5’−CTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGAAGCTTGGTACCGCCGCCA−3’)(配列番号13)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは1518bpであった。
【0039】
(ステップ5)
ステップ3及びステップ4から精製した鋳型を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分30秒)を25サイクル実施して、CMVイントロンAをヒトB1_BGHポリA断片と組み合わせた。正プライマーはNSE_CMV.OLF1(5’−GAGTCTGCAGTCCTCGAGGTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号15)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは2342bpであった。
【0040】
(ステップ6)
ステップ2からのPCR産物をBamHIで消化し、ステップ5からのPCR産物をNotIで消化した。BamHI/NotI消化PCR(登録商標)−Blunt II−TOPO(登録商標)ベクター(Invitrogen)を用いて三方リゲーションを実施した。
【0041】
PCRエラーが最小のクローンを選択するためにDNA配列を分析した。選択したクローンを、BamHI/AflII 2443bp断片及びAflII/NotI 1699bp断片と三方リゲーションすることによりBamHI/NotI消化pBlueScript(pBS)にサブクローン化した。生じた導入遺伝子を図1に示し、導入遺伝子のヌクレオチド配列を図2A〜Bに示す。この構築物の転写物の概略図を図3Aに示し、転写物の投影転写物(DNA配列として示す)のヌクレオチド配列を図3Bに示す。
【0042】
構築物#2:CMVプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1 cds_BGHポリAシグナルベクター
(ステップ1:CMVプロモーター)
pcDNA3(100ng)に対してPfuまたはExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分)を18サイクル実施した。正プライマーはCMVプロモーター1F(5’−CGGCGGCCGCCGATGTACGGGCCAGATATAC−16’)(配列番号16)であり、逆プライマーは(5’−GACTCTATAGGCGGTACTTACCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCG−3’)(配列番号17)であった。このPCR産物の長さは702bpであった。
【0043】
(ステップ2:CMVイントロンA)
CMVイントロンA断片を含むDNAプラスミド鋳型(100ng)に対してPfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分)を18サイクル実施した。正プライマーはCMVプロモーター_イントロンA 1F(5’−CGAAATTAATACGACTCACTATAGGTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号18)であり、逆プライマーはCMVintA.1R(5’−CTGCAGAAAAGACCCATGGAAAGG−3’)(配列番号10)であった。このPCR産物の長さは850bpであった。
【0044】
(ステップ3)
ステップ1及びステップ2からのPCR産物に対してPfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,72℃×1分30秒)を18サイクル実施し、CMVプロモーター断片をCMVイントロンAに連結した。鋳型はステップ1及びステップ2からのPCR産物それぞれ2ngであった。正プライマーはCMVプロモーター1F(5’−CGGCGGCCGCCGATGTACGGGCCAGATATAC−3’)(配列番号16)であり、逆プライマーはCMVintA.1R(5’−CTGCAGAAAAGACCCATGGAAAGG−3’)(配列番号10)であった。このPCR産物の長さは1058bpであった。
【0045】
(ステップ4)
ステップ3からのPCR産物をAflII(CMVイントロンA中で切断)で消化することによりCMVプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列_BGHポリAシグナルを構築した。本実施例に記載されているラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2ベクターをEcoRV及びAflIIで消化し、これらの消化断片を連結して、図4に示す導入遺伝子を作成した。
【0046】
構築物#3:CMVイントロンA:ヒトB1コーディング:IRES要素:LacZ:BGHポリA
図5に詳記する標的ベクターを以下のように作成した。
【0047】
(ステップ1)
pIRESプロプラスミド(Clontech)を鋳型として使用して、IRES要素を含むPCR断片を作成した。Expand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×1分30秒)を20サイクル実施した。正プライマーはHB1_IRES F(5’−CCAACTTTTCTGGCGGAATTAATGCATCTAGGGCGGCCAATTC−3’)(配列番号19)であり、逆プライマーはIS_LACZ_1R(5’−GTAAAACGACGGGATCTATCATGGTGGCGGCGGTTGGCAAGCTTATCATCGTG−3’)(配列番号20)であった。このPCR産物の長さは639bpであった。
【0048】
(ステップ2)
pcDNA3β−GalプラスミドDNA(Invitrogen)を鋳型として用い、Pfu及びExpand High fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分)を28サイクル実施して、LacZコード領域をPCR断片として作成した。正プライマーはIS_LACZ_1F(5’−CACGATGATAAGCTTGCCAACCGCCGCCACCATGATAGATCCCGTCGTTTTAC−3’)(配列番号21)であり、逆プライマーは(5’−GCCTCGAGCTATTTTTGACACCAGACCAACTG−3’)(配列番号22)であった。このPCR産物の長さは3098bpであった。
【0049】
(ステップ3)
Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施して、ステップ1及びステップ2のPCR産物を連結した。正プライマーはHB1_IRES F(5’−CCAACTTTTCTGGCGGAATTAATGCATCTAGGGCGGCCAATTC−3’)(配列番号19)であり、逆プライマーはIS_BGH R(5’−CATTTAGGTGACACTATAGAATCTATTTTTGACACCAGACCAACTG−3’)(配列番号23)であった。このPCR産物の長さは3721bpであった。
【0050】
(ステップ4)
プラスミドpcDNA3(Invitrogen)からExpand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施して、BGH ポリAシグナルを作成した。正プライマーはLZ_BGH F(5’−CAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAGATTCTATAGTGTCACCTAAATG−3’)(配列番号24)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。
【0051】
(ステップ5)
Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分30秒)を20サイクル実施して、ステップ4からのBGHポリA PCR断片をステップ3のIRES:LacZ断片に連結した。正プライマーはHB1_IRES F(5’−CCAACTTTTCTGGCGGAATTAATGCATCTAGGGCGGCCAATTC−3’)(配列番号19)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは3963bpであった。
【0052】
(ステップ6)
本実施例に記載のラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2ベクターを鋳型として用い、Pfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×2分30秒)を18サイクル実施して、CMVイントロンA:B1コード配列を作成した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはHB1_IRES R(5’−GAATTGGCCGCCCTAGATGCATTAATTCCGCCAGAAAAGTTGG−3’)(配列番号25)であった。このPCR産物の長さは1931bpであった。
【0053】
(ステップ7)
ステップ6のPCR産物(CMVイントロンA:ヒトB1 cds)及びステップ1からのPCR産物(IRES)を鋳型として用い、Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分30秒)を20サイクル実施して、DNA断片に連結した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはIS_LACZ_1R(5’−GTAAAACGACGGGATCTATCATGGTGGCGGCGGTTGGCAAGCTTATCATCGTG−3’)(配列番号20)であった。このPCR産物の長さは2549bpであった。
【0054】
(ステップ8)
ステップ7及びステップ5のPCR産物を用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×7分30秒)を18サイクル実施して、CMVイントロンA:ヒトB cds(ステップ7)をIRES_LacZ_BGHポリA(ステップ6)に連結した。正プライマーはCMVintA.1F(5’−GTAAGTACCGCCTATAGAGTC−3’)(配列番号9)であり、逆プライマーはBGH.1RNot(5’−GCGCGGCCGCTCCCCAGCATGCCTGCTATTG−3’)(配列番号14)であった。このPCR産物の長さは5851bpであった。次いで、この断片をDNA発現プラスミドpCRII Topo Blunt(Invitroten)にサブクローン化し、DNA配列分析にかけて、適当な導入遺伝子の作成を確認した。
【0055】
構築物#4:CMVプロモーター:CMVイントロンA:ヒトB1コーディング:IRES2要素:LacZ:BGHポリA
(ステップ1)
構築物3からの520bp BglII/NsiI断片をpIRES−EGFP(Clontech)にサブクローン化する。このサブクローンをBglII/NcoIで消化する。pcDNA3_ベーターGal(Invitrogen)鋳型からPfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×2分30秒)を37サイクル実施して、LacZの一部に及ぶPCR断片を作成する。正プライマーはLZ_BspHI(5’GGCATCATGATAGATCCCGTCGTTTTAC−3’)(配列番号26)であり、逆プライマーは5‘−IZ_2699R(5’−TACTGTGAGCCAGAGTTGCC−3’)(配列番号27)であった。このPCR産物の長さは2081bpであった。この産物をBspHI及びEcoRVで消化する。この1113bp断片及び上記したBglII/NcoI断片を構築物#2にライゲートし、BglII及びEcoRVで消化する。標的導入遺伝子を図6に概略的に示し、導入遺伝子のヌクレオチド配列を図6A−Bに示す。
【0056】
構築物#5:Thy−1プロモーター:ヒトB1コーディング:IRES2要素:LacZ:BGHポリA
(ステップ1)
マウスゲノムDNAを鋳型として用いてPCR反応からマウスThy−1プロモーターを含むDNA断片を作成した。Expand High Fidelityポリメラーゼを用いるPCR反応(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×3分30秒)を30サイクル実施した。正プライマーはThy1_1f_Not(5’−GCGCGGCCGCTCTGGTTATCCAGGCTTCTG−3’)(配列番号28)であり、逆プライマーはThy1_hB1r(5’−GGTGGCGGCGGTACCAAGCTTGTGCCAAGAGTTCCGACTTG−3’)(配列番号29)であった。このPCR産物の長さは2923bpであった。
【0057】
(ステップ2)
pcDNA3にクローン化したヒトB1受容体(10ng)からヒトB1ブラジキニンコード配列の一部を作成した。Pfuポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施した。正プライマーはThy1_hB1f(5’−CAAGTCGGAACTCTTGGCACAAGCTTGGTACCGCCGCCACC−3’)(配列番号30)であり、逆プライマーはhB1_2r(5’−TGCTTGCACCTGGAATAAG−3’)(配列番号31)であった。このPCR産物の長さは881bpであった。
【0058】
(ステップ3)
Expand High Fidelityポリメラーゼを用いてPCR(94℃×25秒,60℃×25秒,68℃×4分)を18サイクル実施して、ステップ1及びステップ2からのPCR産物を連結した。正プライマーはThy1_1f_Not(5’−GCGCGGCCGCTCTGGTTATCCAGGCTTCTG−3’)(配列番号28)であり、逆プライマーはhB1_2r(5’−TGCTTGCACCTGGAATAAG−3’)(配列番号32)であった。このPCR産物の長さは3753bpであり、TOPO TAベクター(Invitrogen)にクローン化した後、クローンのDNA配列を分析した。
【0059】
(ステップ4)
ステップ3からのクローンをNotI/BglIIで消化し、3473bpの断片を単離する。構築物#4をBglI/NotIIで消化し、4451bpの断片を単離する。これら2つの断片をNotI消化pBlueScript(pBS)にライゲートして図7に概略的に図示し、図8A〜Cのヌクレオチド配列を有する導入遺伝子を得る。
【実施例2】
【0060】
ヒトB 1 ブラジキニン1受容体を発現するトランスジェニックラットの作製
pBlueScriptにクローン化したNSEプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1(図1)約20μgをBamHIで消化した。4.1kbインサートを3kbベクターから0.8%アガロースゲルを用いて分離した。4.1kbバンドを切り出し、Qiaquick Gel Extraction(Qiagen)を用いて抽出した後、断片を更に0.8%アガロースゲル分離により精製した。Quiquickカラムを用いて2回精製するように改変したが、上記したようにバンドをゲルから切り出し、抽出した。最終産物を10mM トリス(pH7.4),0.1mM EDTAに約50ng/ulの濃度で再懸濁した。CMV(図4)及びThy−1プロモーター構築物(図7)を、ベクターからマイクロインジェクション用線状DNA断片を切り出すためにNotI消化を使用した以外は同様にして作成した。
【0061】
前記導入遺伝子を含むトランスジェニックラットを作製するために精製NSEプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1(構築物#1,図1A)断片をニュージャージー州プリンストンに所在のDNX Transgenic Sciences(Now Xenogen Corporation)に契約で移した。一般的方法を用いて前記構築物をSprague−Dawleyラット卵に導入して、少なくとも1つの導入遺伝子コピーをゲノムに組込んだトランスジェニックラット系統を作製する(例えば、米国特許第4,873,191号明細書参照)。導入し、更なるゲノム及び表現型分析にかけた3つのトランスジェニック系統は系統0004、0014及び0015であった。系統0004は約10コピーを有し、系統0014は系統0004よりも多くのコピーを有すると推定される。勿論、相関関係はあるが、コピー数及び発現レベルの相関関係は通常低い。
【0062】
NSEプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列_BGHポリAシグナルを含むトランスジェニックインサートから生じた転写物に対してTaqmanアッセイを実施した。CMVイントロンAのスプライシングにより、ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列に融合してニューロン特異的エノラーゼ遺伝子のエクソン1の118ヌクレオチドを含む転写物が生じた(図3A)。正プライマーのNSE_TM1f(5’−GAGTCTGCAGTCCTCGAGAAGC−3’)(配列番号33)またはNSE_TM2f(5’−TGAGTCTGCAGTCCTCGAGAAG−3’)(配列番号34)の3’末端がスプライス転写物に相当し、よって未スプライス転写物もゲノムDNAも検出しないようにPCRプライマーを設計した。FAM及びTAMRAで標識したTaqmanプロープのNSE_TAQ1(5’−CTCCAATCCTCCAACCAGAGCCAGC−3’)(配列番号35)及びNSE_TAQ2(5’−TCCAATCCTCCAACCAGAGCCAGCT−3’)(配列番号36)を設計してPCR産物を検出した。
【0063】
Oligotex Direct mRNAキット(Qiagen)を用いて系統004由来の2匹のトランスジェニックラット及び1匹の非トランスジェニックラットの脳からmRNAを作成した。トランスジェニック構築物由来の産物を内部コントロールとしてげっ歯GAPDHを用い、ABI PRISM 7700配列検出システムで検出した。げっ歯GAPDHはすべてのサンプルで検出されたのに対して、導入遺伝子に由来する産物はトランスジェニック動物でのみ検出された。このことは、系統004のトランスジェニックインサートに由来する転写物が適正に処理され、このアッセイがトランスジェニック動物と非トランスジェニック動物を区別するために使用できることを示している。
【0064】
ラットゲノムDNAをプロテイナーゼK消化後フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈殿して組織から作成した。ゲノムDNA(5〜10ug)をEcoRIで消化し、断片を1%アガロースゲルにより分離した。DNAをVacuGeneシステム(Pharmacia Biotech)を用いてゲルからZeta−Probe Genomic Testedブロッティング膜(BioRad)に移した。トランスジェニック構築物の701ヌクレオチドPCR産物を正プライマーCMV_381F(5’−AATCTCGGGTACGTGTTCCG−3’)(配列番号37)及び逆プライマーEnl_gt2r(5’−TTGGCCAGGTAGATTTCTGC−3’)(配列番号38)を用いて増幅するためにPfuポリメラーゼを用いた。産物をQiaquick PCR精製(Qiagen)により精製し、ランダムプライムラベリング(Roche)を用いてα32PdCTPで放射性標識した。ハイブリダイゼーションを0.25M Na2HPO4、6.5% SDS及び10% 硫酸デキストランにおいて65℃で一晩実施した。ブロットを0.1xSSC 0.1% SDSの最終洗浄液を用いて60℃で30分間洗浄し、フィルムに露出させた。NSEプロモーター構築物中に1つのEcoRI部位があり、消化により4132ヌクレオチドの単位長さバンドが生じる。同様に、6522のCMV構築物も1つのEcoRI部位を含んでいる。
【実施例3】
【0065】
トランスジェニックラットから精製したヒトB 1 ブラジキニン受容体へのリガンド結合
実施例のセクション2に記載した構築物#1(ヒトB1ブラジキニン受容体の発現を誘導するニューロン特異的エノラーゼプロモーター)を含むトランスジェニックラットの5系統のうちの3系統(0004、0014及び0015)の、3H−DALK、このリガンドに対して約40倍選択的である化合物への結合能について試験した。このアッセイにおいて重要なことはニューロン組織での内在性B1受容体の発現レベルが低いことである。要するに、系統0004、0014及び0015のトランスジェニック動物(すべて雌)を麻酔後断頭し、全脳を摘出し、矢状方向に二分し、全1/2脳の重量を秤量した。重量は、系統0004で813mg、系統0014mgで851mg、系統0015で843mgであった。脳組織を氷冷50mM トリス−HCl、1mM EDTA、1mM o−フェナントロリン(pH7.4)中でポリトロンを用いてホモジナイズした。ホモジネートを50,000×gで20分間遠心した。ペレットをトリス緩衝液中に再懸濁し、再びホモジナイズし、遠心ステップを繰り返した。最終ペレットをアッセイ緩衝液(20mM HEPES、120mM NaCl、5mM KCl、1mM o−フェナントロリン、0.2uM エナリプリラット(アンギオテンシン変換酵素を阻害するために加えるエナリプリルの二酸形態及び活性代謝物)、100μg/ml バシトラシン、3μM アマスタチン、1μM ホスホラミドン、0.1% BSA(pH7.4))中に再懸濁した。アッセイを0.5ml容量で10mg湿重量組織/チューブを用いて室温で60分間実施した。総タンパク質をBioRad DCアッセイキットを用いて測定した。B1特異的リガンドの冷DALKまたはヒトB1受容体に対して特異性を有する化合物との競合に感受性であるものとして特異的結合を測定する。図9A、9B及び9Cは、ヒトB1ブラジキニン受容体を発現しているトランスジェニックラット組織に対する3H−DALKの総結合、非特異的結合及び特異的結合の量の測定結果を示す。系統0004(図9A)は40fmol/mg−タンパク質の発現を示し、系統0014(図9B)は4fmol/mg−タンパク質の発現を示し、系統0015(図9C)は7fmol/mg−タンパク質の発現を示す。対照的に、非トランスジェニックラットの脳ではB1受容体は検出されない。系統0004において3つの標準リード化合物に対して測定したKi値は、CHO細胞で発現したクローン化hB1受容体で得られた値と非常に類似している。従って、系統0004におけるヒトB1ブラジキニン受容体の発現はヒトB1受容体に関して予想した特性を有している。
【0066】
トランスジェニックラット脳及び脊髄におけるヒトブラジキニンB1受容体の発現を調べるために系統0004をオートラジオグラフィーにかけた。トランスジェニックラット(系統0004)をまず麻酔にかけた後脳を摘出した直後ドライアイスで凍結した。脳の冠状切片(20μm)をクリオスタットにおいて作成した。選択した脳領域の隣接切片を2つに分け、緩衝液A中室温(RT)で15分間プレインキュベートした。プレインキュベート後、2つの脳切片を別々に緩衝液B中室温で90分間インキュベートした。前記切片の1組は0.3nM [3H]DALKとインキュベートし、別の組は0.3nM [3H]DALK及び200μM 非標識L−864747とインキュベートした。インキュベーション後、両切片を氷冷緩衝液Aで4分ずつ3回洗浄した後氷冷脱イオン水で5秒間濯いだ。切片を室温で冷風を用いて乾燥した後Fujiイメージングプレート(BAS−TR2025)のカセットに室温で1週間置いた。プレートをFuji BAS−5000マシンでスキャンし、画像をMCID M5ソフトウェア(Imaging Research Inc.)を用いて分析した。緩衝液Aは50mM トリス−HCl(pH7.5)、120mM NaCl及び5mM KClであり、緩衝液Bは50mM トリス−HCl(pH7.5)、120mM NaCl、5mM KCl、100μg/ml バシトラシン(Sigma B−0125)、1μM ホスホラミドン(Sigma R−7385)、1mM o−フェナントロリン(Sigma P−9375)、3μM アマスタチン(Sigma A−1276)、0.1% BSA(Sigma A−7030)である。[3H]DALKはNEN Life Science(カタログ番号NET1096)から購入する。
【0067】
本研究の目的は、ヒトブラジキニンB1受容体遺伝子を有するトランスジェニックラットの脊髄及び脳組織におけるヒトブラジキニンB1受容体の発現をオートラジオグラフィーにより特徴づけることである。本研究では、B1受容体に対して放射性トレーサー[3H]DALKを使用し、[3H]DALKの受容体特異的結合を阻止するためにヒトブラジキニンB1受容体のアンタゴニストを使用した。アンタゴニストと競合しなかったシグナルを[3H]DALKの非特異的結合として定義した。オートラジオグラフィー研究の結果から、トランスジェニックラットの脊髄及び脳組織においてヒトブラジキニンB1受容体が発現したことが分かる。NSE_ヒトB1受容体トランスジェニック系統0004では、ヒトブラジキニンB1受容体の発現が調べた脳及び脊髄の領域により異なっている。トランスジェニックラットにおいて[3H]DALKに対して最高の結合シグナルは脊髄の後角、大脳皮質、視床下部、視床、小脳、黒質、脚間核、孤束核、中脳水道周囲灰白質及び橋核で見られた。対照的に、[3H]DALKは非トランスジェニックラットの脳及び脊髄の対応領域において特異的結合シグナルを示さなかった。このことから、ヒトB1ブラジキニン遺伝子をラットゲノムへ組込むと、各種試験化合物及びヒトB1ブラジキニン受容体の公知モジュレーターに対して非天然選択的結合特性の表現型が与えられることが分かる。
【実施例4】
【0068】
NSE−hB1系統0004に対する導入遺伝子導入部位のマッピング
ゲノムDNAを系統0004のトランスジェニックラットの組織から作成した。ゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼSau3A1で部分的に消化し、製造業者(カリフォルニア州ラホーヤに所在のStratagene)の指示に従ってsuperCOS Iベクターにクローン化した。コスミドクローンを、701ヌクレオチドからなる放射線標識プローブを用いるバクテリアコロニーの標準in situハイブリダイゼーションによりスクリーニングにかけた。プローブは、プライマー5’−AATCTCGGGTACGTGTTCCG−3’(配列番号39)及び5’−TTGGCCAGGTAGATTTCTGC−3’(配列番号40)、鋳型としてNSE−hB1導入遺伝子構築物を用い、標準PCR条件で得た。ポジティブコロニーを再びスクリーニングにかけ、第二回スクリーニングでポジティブだったクローンからコスミドDNAを作成した。コスミド末端の配列決定をT3及びT7プライマーを用いて実施した。T3プライマーを用いて得たコスミドクローン19のDNA配列は、透明な糖タンパク質遺伝子1(ZP−1)の一部を含むラットゲノムDNAに一致していることが判明し、T7プライマー由来の配列はNSE_hB1導入遺伝子構築物の一部に一致した。導入遺伝子導入部位を精巧にマッピングするために、コスミド19を制限エンドヌクレアーゼDraIで消化し、生じた断片をベクターpBluescript II(カリフォルニア州ラホーヤに所在のStratagene)にサブクローン化した。プラスミドDNAはアンピシリン耐性コロニーから作成し、インサートの大きさを測定し、各種サイズインサートを有するクローンをm13正プラスイマー及び逆プラスイマーを用いるDNA配列分析により分析した。クローンDra37のDNA配列分析から、このクローンはラットゲノムDNA及びNSE−hB1導入遺伝子構築物の一部を含んでいることが分かった。よって、クローンDra37は導入遺伝子導入部位の1端を含んでいた。Dra37由来のラットゲノムDNA配列のバイオインフォーマティックス分析から、このDNAがドブネズミ(Rattus norvegicus)クローンCH230−6B11(GenBank受託番号AC097387)のDNA配列と一致していたことを示した。クローンCH230−6B11は、コスミドクローン19の末端配列決定により同定した同じ遺伝子である透明帯糖タンパク質遺伝子1(ZP1)を含んでおり、染色体1にマッピングされる。従って、染色体1に組込まれた導入遺伝子はZP1遺伝子に近い。導入遺伝子の組込み部位を描写すると、系統0004ホモ接合型トランスジェニックラットを同定するための表現型アッセイを開発できた。このランダム導入部位は複数の導入遺伝子コピーを含んでいる。系統0004導入遺伝子導入部位を含むクローンDra37の配列は次の通りである。
【0069】
【化1】
【実施例5】
【0070】
NSE_hB 1 系統0004ホモ接合型トランスジェニックラットに対する遺伝子型アッセイの開発
遺伝子導入部位の下流のゲノムDNA配列を用いて、正PCRプライマー5’−GAGGTGAAGGCCACATTTTCTAGC−3’(配列番号42)及び逆PCRプライマー5’−ATGGGGAAGGAGTTGATGAAAGGTAGCC−3’(配列番号43)PCRプライマーを設計した。コスミドDNA鋳型及び標準PCR手順を用いて、前記プライマーから922ヌクレオチドの産物を作成した。この922ヌクレオチドの断片は、放射線標識され、トランスジェニック染色体から野生型を識別するためのサザンブロット分析に使用され得る外部プローブとして役立つ。従って、野生型ラットゲノムDNAを制限エンドヌクレアーゼDraIを用いてサザンブロット分析すると、外部プローブで約3.1kbの単一断片が検出される。対照的に、導入遺伝子に対してヘテロ接合型のラットから作成したゲノムDNAを消化すると、2つの断片が検出され、1つの断片は3.1kbであり、もう一方の断片は約1.6kbである。1.6kb断片は導入遺伝子導入部位を有する染色体に相当し、3.1kb断片は野生型染色体に相当している。よって、DraI消化及び外部プローブを用いるサザンブロット分析はホモ接合型野生型動物、ヘテロ接合型トランスジェニック動物及びホモ接合型トランスジェニック動物を同定するために使用することができる。これを使用して、ホモ接合型トランスジェニック繁殖コロニーを同定、樹立した。驚くことに、系統0004ホモ接合型動物はヘテロ接合型動物に比して脳及び脊髄においてヒトB1ブラジキニン受容体を2倍以上発現する。
【実施例6】
【0071】
NSE hB 1 トランスジェニックラットにおけるエキソビボ受容体占有率アッセイ
トランスジェニックラットを誘導チャンバに入れ、Flow Sciencesフードの下でイソフルラン麻酔する。麻酔をかけたら、ラットを循環水加温ブランケット(Gaumar Tポンプ)上に置き、ノーズコーンを介して2%イソフルランを用いて麻酔し続ける。尾静脈に、試験化合物またはベヒクルを収容したシリンジに接続した25G翼付き注入装置を用いてカニューレを挿入する。所望用量の試験化合物を投与する。実験終了時に血液サンプルを採取し、ラットを安楽死させ、その後のアッセイのために組織(通常、脳及び脊髄)を摘出する。
【0072】
ヒトB1受容体発現のオートラジオグラフィー分析のために、トランスジェニックラットから摘出した組織をドライアイス粉末で凍結し、−70℃で保存した。クリオスタット(Leica,CM3050)を用いて脳の冠状切片及び脊髄の横断切片をそれぞれ20μMずつ作成した。凍結切片を−70℃で保存した。分析のために、凍結切片を室温(RT)で15分間加温した後、室温でラジオリガンドを含まない緩衝液中で15分間プレインキュベートした。プレインキュベート後、切片をインキュベーション緩衝液に移し、室温で90分間インキュベートした。0.3nM [H−3]DALKを含む緩衝液中でインキュベートすることにより非特異的結合及び特異的結合の両方の総結合を測定した。隣接切片を用いて非特異的結合を測定した。この切片を0.3nMの[H−3]DALKに加えて200nMのヒトB1ブラジキニン受容体に対して高い親和性及び特異性を示す非ペプチド受容体アンタゴニストを含む緩衝液においてインキュベートした。90分間インキュベートした後、切片を緩衝液で3分間ずつ3回洗浄し、DIH2Oを用いて4℃で30分間濯ぎ、室温で送風機により乾燥した。切片をFujiイメージングプレートに置き、室温で一週間露出した。プレートをFuji PhosphorImager BAS 5000を用いてスキャンし、画像をMCID M5ソフトウェアを用いて分析した。図10に、NSE_hB1系統0004トランスジェニックラットの脳及び脊髄切片のオートラジオグラムを示す。高い結合レベルを示す脳及び脊髄の領域を示す。特異的[H−3]DALK結合[(総結合)−(非特異的結合)]がヒトB1ブラジキニン受容体発現のレベルを表す。非トランスジェニック対照ラットでは[H−3]DALKの特異的結合は検出できない。
【0073】
ホモジネートベースの結合アッセイのために、凍結させた脳(大脳皮質または小脳)または脊髄(35mg)を大量の氷冷アッセイ緩衝液(20mM HEPES,120mM NaCl,5mM KCl,pH7.4)においてポリトロンを用いてホモジナイズし、2つの冷却遠心管に移した。ペレット膜に対して管を4℃に予冷したローターにおいて75,000×gで10分間遠心した。上清を捨て各チューブを氷冷緩衝液(20ml)で濯いだ後氷冷アッセイ緩衝液においてペレットをホモジナイズした。ホモジネートをプールし、ラジオトレーサー、20pMの35S標識非ペプチドヒトB1受容体アンタゴニストラジオトレーサーを収容しているチューブに加えた。各チューブには0.5mlの室温アッセイ緩衝液を収容されている。ホモジネートをラジオトレーサー及び100nMの非標識非ペプチドヒトB1受容体アンタゴニストを含むチューブに添加することにより非特異的結合を測定する。所定時間(1、2、4、6、8、10分)に、3つのチューブの内容物を0.05%トリトン−100に予浸積した25mm GF/Bフィルターを用いて濾過した。濾過ステップは、3つのチューブの各々に氷冷アッセイ緩衝液(4ml)を添加し、フィルター上に内容物を注ぎ、各フィルターを氷冷緩衝液(4ml)で洗浄することにより実施する。濾過のためにHoeffer FH225V濾過マニフォールドを用いる。6つの時点が経過後非特異的結合チューブを同様に濾過する。フィルターを5mlシンチレーションバイアルに移し、Beckman Ready Safeシンチレーション流体(3ml)に10時間浸した後カウントした。
【0074】
各時点で特異的結合を計算し[(総合cpm)−(非特異的cpm)]、線形回帰により会合の勾配を測定する。薬物処理動物における受容体占有率を下記式により求める。
【0075】
占有率%=(1−(勾配薬物/勾配ベヒクル))100
勾配薬物は薬物処理動物からの会合率の勾配であり、勾配ベヒクルはベヒクル処理動物について測定した勾配である。
【0076】
複数の特許文献及び刊行物を本明細書中引用したが、その内容物は援用により本明細書に含まれるとする。
【図面の簡単な説明】
【0077】
【図1】トランスジェニックプラスミド標的構築物のラットエノラーゼイントロンA hB1ポリA2[ラットニューロン特異的エノラーゼプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1ブラジキニン受容体コード配列_BGHポリAシグナル、CMV=ヒトサイトメガロウイルス,BGH=ウシ成長ホルモン(構築物#1;NSE hB1とも称する)]を示す。
【図2A】図1Aに描画した組込んだ導入遺伝子のラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図2B】図1Aに描画した組込んだ導入遺伝子のラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2のヌクレオチド配列(配列番号1)を示す。
【図3A】NSE hB1転写物とも称されるラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2標的ベクターから作成した転写物の構造(図3A)及びその配列番号2に記載の塩基配列(図3B)を示す。
【図3B】NSE hB1転写物とも称されるラットエノラーゼイントロンA hB1 ポリA2標的ベクターから作成した転写物の構造(図3A)及びその配列番号2に記載の塩基配列(図3B)を示す。
【図4】トランスジェニックプラスミド標的構築物のCMVプロモーター_CMVイントロンA_ヒトB1 cds_BGHの構造を示す。
【図5】ラットゲノムプラスミド標的構築物のCMVプロモーター_CMVイントロンA_hB1 cds_IRES2/LacZ_BGHポリA(pCMV B1 IZとも称する)の一部を示す。
【図6A】組込んだ導入遺伝子のCMVプロモーター_CMVイントロンA_hB1 cds_IRES2/LacZ_BGHポリAのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。
【図6B】組込んだ導入遺伝子のCMVプロモーター_CMVイントロンA_hB1 cds_IRES2/LacZ_BGHポリAのヌクレオチド配列(配列番号3)を示す。
【図7】ラットゲノムプラスミド標的構築物のThy−1_hB1 cdz_IZ pBS(Thy1 hB1 IZとも称する)の一部を示す。
【図8A】組込んだ導入遺伝子のThy−1_hB1 cdz_IZ pBSのヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。
【図8B】組込んだ導入遺伝子のThy−1_hB1 cdz_IZ pBSのヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。
【図8C】組込んだ導入遺伝子のThy−1_hB1 cdz_IZ pBSのヌクレオチド配列(配列番号4)を示す。
【図9A】(A):系統0004(ラット#1810)、(B):系統0014(ラット#1813)及び(C):系統0015(ラット#1814)のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する3H−DALK([脱−Arg10,Leu9]−カリジン)の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図9B】(A):系統0004(ラット#1810)、(B):系統0014(ラット#1813)及び(C):系統0015(ラット#1814)のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する3H−DALK([脱−Arg10,Leu9]−カリジン)の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図9C】(A):系統0004(ラット#1810)、(B):系統0014(ラット#1813)及び(C):系統0015(ラット#1814)のトランスジェニックラット脳組織から単離した膜に対する3H−DALK([脱−Arg10,Leu9]−カリジン)の飽和結合アッセイの結果を示す。
【図10】NSE_hB1系統0004トランスジェニックラットからの脳及び脊髄切片のオートラジオグラムを示す。非特異的結合はヒトB1受容体に対してサブnMアフィニティーを有するヒトB1ブラジキニン受容体の非ペプチドアンタゴニスト200nMの存在下で0.3nM [H−3]DALKを用いて測定した。総結合は0.3nM [H−3]DALKを用いて測定した。高い結合レベルを示す脳及び脊髄の領域を示す。特異的[H−3]DALK結合[(総結合)−(非特異的結合)]はヒトB1ブラジキニン受容体発現のレベルを表す。非トランスジェニックの対照ラットでは[H−3]DALKの特異的結合を検出できなかった。
Claims (28)
- ヒト化B1ブラジキニン受容体占有率または結合プロフィールを示すようにゲノムに霊長類ブラジキニンB1受容体遺伝子またはその機能的均等物をコードする導入遺伝子の少なくとも1つのコピーが組込まれていることを特徴とする非ヒトトランスジェニック動物。
- 非ヒトトランスジェニック動物がラット、マウス、ウシ、ブタ、家兎、モルモット、ヒツジ、ハムスター及びヤギからなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項2に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 導入遺伝子が霊長類ブラジキニンB1受容体遺伝子を発現させる異種プロモーターに作動的に連結していることを特徴とする請求項1に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 非ヒトトランスジェニック動物がラット、マウス、ウシ、ブタ、家兎、モルモット、ヒツジ、ハムスター及びヤギからなる群から選択されることを特徴とする請求項4に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項5に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであることを特徴とする請求項4に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- ヒト化B1ブラジキニン受容体占有率または結合プロフィールを示すようにゲノムに霊長類ブラジキニンB1受容体遺伝子またはその機能的均等物をコードする導入遺伝子の少なくとも1つのコピーが組込まれていることを特徴とするトランスジェニックラット。
- 導入遺伝子が異種プロモーターから発現することを特徴とする請求項8に記載のトランスジェニックラット。
- 異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであることを特徴とする請求項9に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- 導入遺伝子が更にトランスジェニックラット内で検出可能なレベルで発現するリポーター遺伝子を含むジスシストロン導入遺伝子であることを特徴とする請求項10に記載のトランスジェニックラット。
- 導入遺伝子が異種プロモーターから発現することを特徴とする請求項11に記載のトランスジェニックラット。
- 異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであることを特徴とする請求項12に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
- ヒト化B1ブラジキニン受容体占有率または結合プロフィールを示すようにゲノムにヒトブラジキニンB1受容体遺伝子またはその機能的均等物をコードする導入遺伝子の少なくとも1つのコピーが組込まれていることを特徴とするトランスジェニックラット。
- 導入遺伝子が異種プロモーターから発現することを特徴とする請求項14に記載のトランスジェニック動物。
- 異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであることを特徴とする請求項15に記載のトランスジェニック動物。
- 導入遺伝子がNSE_CMVイントロンA_hB1 cds_BGHポリAであることを特徴とする請求項16に記載のトランスジェニック動物。
- 導入遺伝子がCMV_CMVイントロンA_hB1 cds_IRES2_LacZ_BGHポリAであることを特徴とする請求項16に記載のトランスジェニック動物。
- 導入遺伝子がThyl_hBl cds_IRES2_LacZ_BGHポリAであることを特徴とする請求項16に記載のトランスジェニック動物。
- 霊長類ブラジキニン受容体タンパク質及び試験化合物の受容体占有率のエキソビボ測定方法であって、
a)その動物組織内で内在性天然B1ブラジキニン遺伝子の発現よりも実質的に高いレベルで非天然霊長類B1ブラジキニン受容体を発現する非天然霊長類B1ブラジキニン遺伝子の少なくとも1つのコピーが安定的に組込まれてなる非ヒトトランスジェニック動物に試験化合物を投与するステップ、
b)ステップa)のトランスジェニック動物から組織サンプルを摘出するステップ、
c)ステップb)の組織サンプルを分析することにより霊長類B1ブラジキニン受容体への試験化合物の総結合、特異的結合及び非特異的結合を測定するステップ、
d)ステップa)のトランスジェニック動物内での試験化合物の受容体占有率を計算するステップ
を含むことを特徴とする前記方法。 - ステップc)の総結合、特異的結合及び非特異的結合はオートラジオグラフィーまたは組織ホモジネートベースの結合アッセイにより測定することを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 非天然霊長類B1ブラジキニン遺伝子がヒトB1ブラジキニン遺伝子であることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 非天然霊長類B1ブラジキニン遺伝子が異種プロモーターに作動的に結合していることを特徴とする請求項22に記載の方法。
- 異種プロモーターがラットニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーターまたはサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 非ヒトトランスジェニック動物がトランスジェニックラットであることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 非天然霊長類B1ブラジキニン遺伝子が異種プロモーターに作動的に連結しており、更に非ヒトトランスジェニック動物がラット及びマウスからなる群から選択されることを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 非ヒトトランスジェニック動物がトランスジェニックラットであることを特徴とする請求項27に記載の方法。
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