JPH06245670A - トランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】色素性乾皮症遺伝子が機能しないように改変さ
れたホモ接合体の改変色素性乾皮症遺伝子を有すること
を特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物、およ
びトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作成方法におい
て、ＥＳ細胞の動物胚への注入が、８細胞期胚に透明帯
を除去せずに行うことを特徴とするトランスジェニック
非ヒト哺乳動物の作成方法。 【効果】本発明のトランスジェニック動物は、遺伝子異
常に起因する実際のヒトの病気を反映した発ガンモデル
動物として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は相同組換えにより破壊さ
れた改変色素性乾皮症遺伝子を有するトランスジェニッ
ク動物、その動物又はその動物由来の体細胞を用いた変
異原物質、発ガン物質または制ガン物質の試験方法、そ
の動物にガンを発生させたヒト疾患モデル動物、その動
物に遺伝子疾患を発生させた遺伝子治療の実験モデル動
物および該トランスジェニック動物の作成方法に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来の変
異原物質、発ガン物質および制ガン物質に関する試験方
法としては、一般に以下のようなものが知られている。 （ｉ）細胞レベルの評価系 Ａｍｅｓおよび共同研究者ら（Ａｍｅｓら、Mut. Res.,
31, 347-364 (1975))は、化学物質を肝抽出物とインキ
ュベートした後、その化学物質でSalmonella typhimuri
um菌を処理することにより、制限条件下でのみ生育でき
る細菌の復帰変異頻度をアッセイすればその化学物質の
変異原性を解析することができることを報告している。

【０００３】また、変異原物質または発ガン物質を検出
するために現在用いられている他の方法には、培養中の
哺乳動物細胞における突然変異を選択する方法がある。
Ｈｓｉｅらは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ細胞）を変異原物質で処理し、特異誘発を適当な培地
で選択して、変異原性および発ガン性の指標としている
（Ｈｓｉｅら、in Strategies for Short-Term Testing
for Mutagens/Carcinogens, Butterworth編、CRC Pres
s, FL (1979)) 。

【０００４】しかしながら、生体における発ガンが、イ
ニシエーション・プロモーションと呼ばれている多段階
のステップによって形成されることを考えると（フォウ
ルズ（L. Foulds), Cancer Res, 14,327 (1954); Neopl
astic Development (Academic press, New York, 196
9); ペト(R. Peto), in Origines of human cancer, H.
H. Hiatt, J. D. Watson, J. A. Winsten, Eds. (Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,
1977), pp1403-1428; ヌッドソン(A. G. Knudson, J
r., ibid., pp45-52.) 、これらの方法では生体におけ
る変異原性、発ガン性を真に見きわめることは困難であ
る。

【０００５】現在、最も典型的な制ガン剤の評価系とし
ては、Leukemia L1210, Sarcoma180などの腫瘍細胞を用
いて、その細胞の増殖抑制を評価する方法が知られてい
る。しかしながら、これらの系においては、自然に発症
するガンに対して試験物質の制ガン効果を評価している
ものではなく、この点からさらに適切な制ガン剤の評価
系が望まれている。

【０００６】（ii）トランスジェニック動物を用いた評
価系 最近、トランスジェニック動物を用いて、発ガン物質を
検出する方法が報告されている。即ち、既に活性化され
た腫瘍遺伝子を有するトランスジェニック動物を用いる
もの（レダーとステュアート，特開昭６１−８１７４３
号公報）およびヒトガン遺伝子を導入したトランスジェ
ニックマウスを用いるもの（勝木、特開平３−１８７３
７７号公報）等が報告されている。トランスジェニック
マウスを利用した発ガンの研究に関してはハナハンの総
説に詳しく報告されている（ハナハン（D. Hanahann),
Science, 246, 1265 (1989))。しかしながら、これらの
例は、動物に導入した遺伝子が発現して機能することを
利用したものであり、実際のヒトの病気を反映したモデ
ル動物ではない。

【０００７】以上まとめると、変異原物質、発ガン物
質、および制ガン物質に関する従来の細胞レベルの評価
系では、ガンの多段階発現の観点から問題がある。ま
た、トランスジェニック動物を用いた評価系では活性化
された外来遺伝子を利用するものであり、実際のヒトの
病気を反映した発ガンモデル動物とはなっていないとい
う問題がある。このようなことから、変異原性、発ガン
性または、制ガン活性を試験するための有用な評価系の
確立は、産業上極めて重要な課題となっている。

【０００８】ところで、実際のヒトの病気を反映した発
ガンモデル動物として利用するために、発ガンに関連す
る遺伝子を破壊して不活性化する事を利用した例とし
て、ガン抑制遺伝子の発現を欠如させたトランスジェニ
ックマウスに関する記載（ウエン−ホウア、特表平３−
５０５６７５号公報）がある。しかしながら、この報告
は網膜芽細胞腫（Retinoblastoma) のガン抑制遺伝子の
発現を抑制するものであり、それによって発ガンする部
位は網膜等に限定される可能性があり、それ以外の部位
のガンの発ガン性、制ガン活性を広く評価することは困
難である。

【０００９】一方、色素性乾皮症（Xeroderma Pigmento
sa：XP）は、ＤＮＡ修復機構に異常を持つ常染色体劣性
遺伝病で、４万人〜２５万人に１人の割合で発症する。
本疾病では、紫外線露出部位に正常人よりも数千倍の高
頻度で皮膚ガンを発生する。皮膚ガン以外の臓器ガン
も、正常人に比べ１０〜２０倍高頻度に発生し、また進
行性の知能低下、小頭症、神経性難聴、小脳性運動失
調、神経原性筋萎縮等種々の精神神経症状を臨床的特徴
とする。従って、色素性乾皮症遺伝子の機能が抑制され
たトランスジェニック動物を提供することができれば、
実際のヒトの病気を反映した発ガンモデル動物としてき
わめて有用であり、皮膚ガンをはじめ、それ以外の部位
のガンの発ガン性、制ガン活性等の評価に利用すること
が可能となる。さらに、進行性の知能低下、小頭症、神
経性難聴、小脳性運動失調、神経原性筋萎縮等種々の精
神神経症状の治療のためのスクリーニング研究等に利用
することが可能となる。

【００１０】ＸＰはＤＮＡ修復の初期ステップに異常を
持つことが示唆されていた。しかし、長らく原因となる
遺伝子のクローニングは成功せず、その分子レベルでの
異常は不明のままであった。しかも、細胞融合を用いた
遺伝的相補性テストにより、ＸＰにはＡ〜Ｇ群それにバ
リアントと呼ばれる計８つの相補性群が知られており、
それぞれに対応するＸＰ遺伝子が存在すると考えられて
いる。ＸＰは、ＸＰ遺伝子が機能しないためＤＮＡ修復
のタンパクが発現せず、そのため色素性乾皮症を発症す
ると考えられる。ＸＰ患者の大部分はＡ，Ｃ，Ｄ群に属
するが、日本ではＡ群、欧米ではＣ群が多い。最近にな
り、本発明者らによりＡ群のＸＰ遺伝子（ＸＰＡＣ遺伝
子）が単離された（田中ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA., 86, 5512 (1989)）。また、Weeda らにより、Ｂ群
のＸＰ遺伝子も報告されている(Weedaら、Cell, 62, 77
7 (1990)) 。

【００１１】色素性乾皮症遺伝子の機能が抑制されたト
ランスジェニック動物を作成する試みは、本発明者らに
よりその初期的な報告が既になされている。即ち、本発
明者らは、ＸＰのＡ群の遺伝子（ＸＰＡＣ遺伝子）のク
ローニングを行い、遺伝子標的導入によるＡ群ＸＰモデ
ルマウスを作成するために、マウスゲノムの第３から第
４エクソンの領域にＭＣｌｎｅｏとＨＳＶ−ｔｋを含む
ターゲッティングベクターを構築し、これをマウス胚盤
胞由来の胚幹（ＥＳ）細胞に電気穿孔法で導入した。そ
して選択薬剤としてＧ４１８とＧＡＮＣを用いた二重選
択法により、ＸＰＡＣ遺伝子における相同組換え体を取
得し、これを８細胞期胚に注入して生殖系列のキメラマ
ウスの作成を試みていることを既に報告している（第３
６回日本人類遺伝学会大会、１９９１年；第１４回分子
生物学会年会、１９９１年）。しかしながら、生殖系列
のキメラマウスの作成は常法による操作では極めて困難
であり、目的とするトランスジェニック動物の作成は成
功するに至っていないのが実情であった。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、前記課題を
解決するために鋭意検討した結果、本発明に至った。即
ち、本発明の要旨は、（１）色素性乾皮症遺伝子が機能
しないように改変されたホモ接合体の改変色素性乾皮症
遺伝子を有することを特徴とするトランスジェニック非
ヒト哺乳動物、（２）前記（１）記載の動物由来の体細
胞、（３）前記（１）記載の動物よりなる、又は該動物
に色素性乾皮症遺伝子の欠損に基づく遺伝子疾患を発生
させてなることを特徴とする、色素性乾皮症遺伝子の欠
損に基づく疾患の治療の実験モデル動物、（４）前記
（１）記載の動物よりなる、又は該動物にガンを発生さ
せてなることを特徴とするヒト疾患モデル動物、並びに
（５）色素性乾皮症（ＸＰ）遺伝子を特異的に破壊する
ターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入する工程、
相同組換えによりＸＰ遺伝子が破壊された改変遺伝子を
有するＥＳ細胞を単離する工程、単離されたＥＳ細胞を
動物胚へ注入し仮親の子宮に移植して生殖系列のキメラ
動物を得る工程、及び該キメラ動物を正常な動物と交配
させてヘテロ接合体を得、該ヘテロ接合体同士を交配さ
せてホモ接合体を得る工程を有するトランスジェニック
非ヒト哺乳動物の作成方法において、該ＥＳ細胞の動物
胚への注入が、８細胞期胚に透明帯を除去せずに行うこ
とを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作
成方法に関する。

【００１３】本明細書において、トランスジェニック動
物とは、生殖系に導入された外来遺伝子を含有するヒト
以外の哺乳動物をいう。このような動物としてはマウ
ス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ブタ等が挙
げられマウス、ラット等のゲッ歯動物が好ましい。生殖
系列のキメラ動物とは、精子あるいは卵子においてキメ
ラ形成の認められる動物を意味する。また、本発明にお
いて改変色素性乾皮症遺伝子とは、色素性乾皮症遺伝子
の一部が外来遺伝子の挿入により破壊され、色素性乾皮
症遺伝子が機能しないように改変された遺伝子をいい、
ホモ接合体の改変色素性乾皮症遺伝子とは、両方の対立
遺伝子がそのような破壊された改変遺伝子であることを
意味する。このような色素性乾皮症遺伝子の破壊は、タ
ーゲッティングベクターによる相同組換えにより行うこ
とができ、挿入される遺伝子としてはネオマイシン耐性
遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子等が好適に使用
される。このような遺伝子の色素性乾皮症遺伝子上の挿
入部位は、挿入により色素性乾皮症遺伝子の機能が破壊
される部位が選択される。本発明において対象とされる
色素性乾皮症遺伝子としては、前記のような８つの相補
性群のいずれでもよいが、Ａ群ＸＰ患者の臨床症状が他
の相補性群ＸＰに比して強いこと、Ａ群ＸＰ遺伝子の発
現が全くなくても患者は致死的ではないことから、例え
ばＡ群のＸＰ遺伝子（ＸＰＡＣ遺伝子）が好適な例とし
て挙げられる。

【００１４】本発明の改変色素性乾皮症遺伝子を有する
トランスジェニック非ヒト哺乳動物を作成するには、次
のステップが必要である。 （１）まず、色素性乾皮症遺伝子（ＸＰ遺伝子）を同定
しクローニングする。 （２）この遺伝子の機能を抑制するためにその遺伝子を
特異的に破壊した改変遺伝子を含むターゲッティング機
能ベクターを構築する。 （３）このターゲッティングベクターを発生学的に全能
性をもつ未分化な細胞であるＥＳ細胞に導入する。 （４）相同組換えによりＸＰ遺伝子が破壊された改変遺
伝子を有するＥＳ細胞を単離する。 （５）単離されたＥＳ細胞を動物胚へ注入し、仮親の子
宮に移植して生殖系列のキメラ動物を得る。このキメラ
動物を正常な動物と交配させるとヘテロ接合体動物（＋
／−）が得られ、ヘテロ接合体同士を交配させるとホモ
接合体動物（−／−）すなわちＸＰ対立遺伝子が双方と
も破壊された改変色素性乾皮症遺伝子を有する目的のト
ランスジェニック動物を得ることができる。

【００１５】以上のステップのうちで、まず第１のステ
ップである色素性乾皮症遺伝子の同定、単離という困難
な課題は、前述のように、本発明者らが世界に先駆けて
成功を収めた。わが国で最も多くみられる色素性乾皮症
Ａ群の遺伝子（ＸＰＡＣ遺伝子）は本発明者らによって
１９８９年に単離されている（Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 86, 5512 (1989))。その方法は、Ａ群ＸＰ遺伝
子をクローニングする目的で、Ａ群ＸＰ細胞に正常マウ
スのゲノムＤＮＡをトランスフェクションし、ＵＶ抵抗
性のＸＰトランスフェクタントを選別し、マウス特異的
繰り返し配列をプローブとしてマウスＤＮＡがゲノムに
取り込まれたことを確認したのち、このトランスフェク
タントのゲノムＤＮＡよりコスミッドライブラリー、フ
ァージライブラリー等を作成し、すべてのトランスフェ
クタントに共通するマウスＤＮＡを同定する。さらにこ
の遺伝子から転写されるｍＲＮＡを検出し、対応するｃ
ＤＮＡもクローニングする。このｃＤＮＡクローンはＸ
Ｐ細胞のＤＮＡ修復能を正常化できる。

【００１６】第２のステップであるターゲッティングベ
クターの構築は、以下のように行うことができる。ター
ゲッティングベクターの目的は、相同組換えにより標的
遺伝子たるＸＰ遺伝子に遺伝子断片を導入して、ＸＰ遺
伝子を破壊して改変することにある。ここに相同組換え
とは、導入した遺伝子断片と染色体上の対応する遺伝子
の間で塩基配列の相同性に基づいて起こる組換えであ
る。この相同組換えにより、改変を加えたい標的遺伝子
の一部と同じ塩基配列の領域（相同領域）を外来遺伝子
に持たせることにより、その同じ塩基配列の部分相互間
で組換えが生じて外来遺伝子が狙った部位に挿入され標
的遺伝子を破壊することが可能となる。ただし、現実に
は相同組換えよりもランダム組換えの方が高頻度で生ず
るため、目的の相同組換えが生じたものを容易に選別で
きるようにターゲッティングベクターを構築する必要が
ある。そこで以下のような手法が用いられる。

【００１７】ＸＰ遺伝子のフラグメントをｐＵＣ１９等
の適当なプラスミッドに組み込み、そのＸＰ遺伝子フラ
グメントに例えばｐＭＣｌｎｅｏ ｐｏｌｙ（Ａ）
^- （Stratagene) の１．１Ｋｂ ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ
ｎｅｏｍｙｃｉｎ（ｎｅｏ）カセットを挿入する。こ
うして得られるターゲッティングベクターはｎｅｏの両
側にＸＰ遺伝子との相同部位を有するため、相同組換え
により標的ＸＰ遺伝子にｎｅｏが導入され標的遺伝子が
破壊される。組換えが生じたことはネオマイシン耐性の
獲得により判定が可能となる。ネオマイシン耐性遺伝子
の代わりにハイグロマイシンＢ耐性等の他の薬剤耐性遺
伝子を用いることも可能である。さらにランダム組換え
体を除くため、ポジティブ−ネガティブ選別が可能とな
るように相同部位の外側にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を導入す
る。こうして得られるターゲッティングベクターはラン
ダム組換えによりＨＳＶ−ｔｋ遺伝子をも取り込むとＧ
ＡＮＣ感受性となる。したがって、ポジティブ−ネガテ
ィブ選別を行うことにより相同組換え体のみを効率的に
取得することが可能となる。相同組換え体の確認はＰＣ
Ｒ法またはサザンハイブリダイゼーション法により行
う。

【００１８】第３のステップである動物のＥＳ細胞への
ターゲッティングベクターの導入は、エレクトロポレー
ション法またはマイクロインジェクション法等を用いて
常法に従って行うことができる。ＥＳ細胞とは動物胚盤
胞の内部細胞塊より樹立された発生学的全能性を持つ未
分化な細胞であり、初期胚に戻してやると宿主胚の細胞
と渾然一体となり発生を続けるという性質を有する。

【００１９】ＥＳ細胞にターゲッティングベクターを導
入するには、ＥＳ細胞を生殖細胞への分化能を保つよう
に未分化の状態で培養維持する必要がある。そのために
は、培地に適当な栄養細胞をフィーダーとして加え、ま
たヒトＬＩＦ（Leukemia Inhibitory Factor) を添加
し、さらに牛胎児血清、ヌクレオシド、非必須アミノ
酸、２−メルカプトエタノール等を添加して培養するこ
とを要する。栄養細胞としてはＳＴＯ細胞かマウス胎仔
線維芽細胞が適当である。栄養細胞の添加濃度は、約１
×１０⁶ 細胞／３５ｍｍ培養皿が好ましい。ヒトＬＩＦ
は、ヒトＬＩＦｃＤＮＡをＣＨＯ細胞で発現させたその
培養上清を用いることもできる。ＥＳ細胞の培養条件と
して、ヒトＬＩＦの添加濃度は、１０³ ユニット／ｍｌ
が好ましいがそれ以上でもよい。牛胎児血清の添加濃度
は１５〜２０％、ヌクレオシドの添加濃度は１０〜３０
ｎＭが好ましい。非必須アミノ酸としては、Ｇｉｂｃｏ
社製の非必須アミノ酸溶液が好ましく、その濃度は各
０．１ｍＭが好ましい。２−メルカプトエタノールの濃
度は０．１ｍＭが好ましい。

【００２０】エレクトロポレーション法でＥＳ細胞にタ
ーゲッティングベクターを挿入するには、ＥＳ細胞を一
定の濃度になるように緩衝液に浮遊させ、適当な制限酵
素で処理して線状化したターゲッティングベクターを添
加し、Ｂｉｏ Ｒａｄジーンパルサー等の適当なエレク
トロポレーション用装置を用い２８０〜３５０Ｖ／０．
４ｃｍ、５００μＦＤでエレクトロポレーションを行う
ことが好ましい。ＥＳ細胞の濃度は約１×１０⁷ 個／ｍ
ｌが好ましい。緩衝液としてはＰＢＳ（ＣａＣｌ₂ ０．
１ｍＭ添加）等を用いてｐＨを７．０に調整するのが好
ましい。制限酵素はターゲッティングベクターの制限酵
素部位を考慮して選択する。

【００２１】また、マイクロインジェクション法でＥＳ
細胞にターゲッティングベクターを導入することもでき
る。

【００２２】ターゲッティングベクターを導入した後、
ＥＳ細胞を上記の培地で４８時間培養し、その後１５０
〜２００μｇ／ｍｌのＧ４１８、及び２μＭのＧａｎｃ
ｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮＣ）を含む培地と交換する。１
〜２日毎にフレッシュなＧ４１８、ＧＡＮＣ添加培地と
交換し、７〜１０日間培養を続ける。

【００２３】第４のステップでは、ターゲッティングベ
クターを導入して得られたＧ４１８およびＧＡＮＣのい
ずれにも抵抗性のクローンを拾い上げ、相同組換え体を
単離し、確認を行う。まず、上記の薬剤耐性ＥＳ細胞を
増殖させ、その一部からＤＮＡを抽出する。相同組換え
体の検出はまずＰＣＲ法で行う。プライマーとしては、
ターゲッティングベクター由来のＤＮＡフラグメントを
用いる。増幅されたＤＮＡ断片をサザンハイブリダイゼ
ーション法により確認する。一方、薬剤耐性ＥＳ細胞の
ゲノムＤＮＡを抽出後、制限酵素処理を行い、アガロー
スゲル電気泳動を行った後、ＸＰ遺伝子ｃＤＮＡをプロ
ーブにサザンハイブリダイゼーションを行う。こうし
て、ターゲッティングベクターの断片を検出できれば、
そのＥＳ細胞は標的ＸＰ遺伝子の一方の対立遺伝子がタ
ーゲッティングベクターと相同組換えを起こしたクロー
ンであることが証明されたことになる。

【００２４】第５のステップである生殖系列のキメラ動
物およびＸＰ遺伝子の破壊された改変遺伝子を有するト
ランスジェニック動物の作成は、前記のように従来より
本発明者を含め、何人も成功することができなかったも
のである。本発明者は、ＥＳ細胞へのターゲッティング
ベクターの導入方法、得られたヘテロ接合体ＥＳ細胞の
動物胚への注入方法等について詳細な検討を加えた結
果、生殖系列のキメラ動物を作成することに成功し、本
発明を完成させるに至ったものである。

【００２５】まず、動物の胚にヘテロ接合体ＥＳ細胞を
注入し、２４時間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した後、仮
親の子宮に移植する。ここで、動物の胚は、８細胞期胚
〜胚盤胞が用いられる。キメラの形成に好適であるから
である。注入方法としては、従来より一般に用いられて
いた注入法も用いられるが、本発明者が新たに開発した
後述の改良集合法が好ましい。注入法においては、ＥＳ
細胞を内部細胞塊にとり込ませることで、あたかも構成
細胞のごとくに発生し続けるという現象を利用したもの
であり、マイクロマニュピュレーターを用いてＥＳ細胞
を胚盤胞内へ注入する。

【００２６】本発明において、目的の生殖系列のキメラ
動物を得るためには、かかる注入処理後にもＥＳ細胞が
生殖細胞分化能を有していなければならず、ＥＳ細胞の
生殖細胞分化能に影響を与えない注入方法の選択が本発
明方法のポイントとなる。本発明者は、上記の従来法を
用いて注入を試みたが、生殖系列のキメラ動物を得るこ
とは困難であった。そこで、従来法と異なる改良集合法
とも呼ぶべき方法を用いることにより、高率に生殖系列
のキメラ動物を作成しうるに至った。即ち、本発明にお
いては、動物の８細胞期胚の透明帯を除去せず、一部に
切れ目を入れてヘテロ接合体のＥＳ細胞を注入し、透明
帯の圧力を利用して効率的に注入を行うと良好な結果を
得ることができる。より具体的には次の方法による。す
なわち、ＥＳ細胞は８細胞期胚（割球）への接着性が低
い。したがって、フィトヘマグルチニンを使っても、一
時的には接着するが暫くすると解離してしまい集合胚は
得られ難い。そこで予め８細胞期胚の透明帯の一部をカ
ットし、そのスリットから囲卵腔にＥＳ細胞を注入す
る。この方法では初期の段階でＥＳ細胞と割球の間に直
接的な細胞接着がなくても、両者の集合状態を維持する
ことができる。透明帯カットはガラス針で行うのが好ま
しい。ＥＳ細胞は通常１０〜１５個の細胞塊として塊の
まま囲卵腔にそっと注入する。こうして、ＥＳ細胞を注
入された８細胞期胚は前述のように２４時間ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで培養したのち仮親の子宮に移植する。このｉｎ
ｖｉｔｒｏの培養は、通常、Ｍ１６液（「マウス胚の
操作マニュアル」ｐ２５２，１９８９，Ｂｒｉｇｉｄ
Ｈｏｇａｎら著，山内一也ら訳，近代出版）に１０％Ｆ
ＣＳ（牛胎児血清）を添加した培養液を用いて行う。

【００２７】上記の方法によって妊娠した仮親から生ま
れた子のうちキメラ動物の占める割合は極めて高い。そ
して、キメラの寄与率の高いキメラ動物は生殖系列のキ
メラ動物である可能性が高いが全てのキメラ動物を正常
動物と交配させることにより、生殖系列のキメラ動物で
あることの確認が可能である。このようにして生殖系列
のキメラ動物であるヘテロ接合体動物が得られ、ヘテロ
接合体同士の交配によりＸＰ対立遺伝子の両方がターゲ
ッティングベクターにより破壊されたホモ接合体動物を
得ることができる。

【００２８】このようにして得られたホモ接合体動物で
あるトランスジェニック動物のＤＮＡ修復能は低下して
いる。ＤＮＡ修復能の低下は紫外線感受性（Ｄｏ；３７
％紫外線致死量）を調べ、正常動物細胞やヘテロ接合体
動物細胞と比較することにより明確にすることができ
る。例えば後述の実施例において、ホモ接合体動物では
Ａ群色素性乾皮症細胞と同程度の紫外線高感受性を示し
ている。一方、紫外線と同種類のＤＮＡ障害を惹起する
化学発ガン剤である７，１２−ジメチルベンズアントラ
センを剃毛した動物の背に塗布したところ、ホモ接合体
動物にのみ全ての個体に潰瘍形成及び乳頭腫が認められ
ている。

【００２９】これらの結果から、ホモ接合体動物は、個
体レベルでも化学発ガン剤に対して高感受性であり、腫
瘍も高率に誘発されることがわかる。これらのことは、
本発明によって得られたトランスジェニック動物は、色
素性乾皮症（ＸＰ）のモデル動物となることを示すもの
である。さらに、この動物そのものを又はこの動物にガ
ンを発生させることによりヒト疾患モデル動物として、
あるいはこの動物そのものを又はこの動物に色素性乾皮
症遺伝子の欠損に基づく遺伝子疾患を発生させて色素性
乾皮症遺伝子の欠損に基づく疾患の治療の実験モデル動
物としても利用することができる。即ち、ヒトの色素性
乾皮症遺伝子では進行性の知能低下、小頭症、神経性難
聴、小脳性運動失調、神経原性筋萎縮等種々の精神神経
症状を引き起こすが、本発明のトランスジェニック動物
は、これらの症状の改善のためのスクリーニング研究の
モデル動物になる。また、新しく遺伝子を導入して、治
療するためのモデル動物となる。本発明のトランスジェ
ニック動物にガンや遺伝子疾患を発生させるには、特に
限定されることはなく例えば紫外線、発ガン剤などによ
って、発ガン、突然変異、細胞死をおこさせることがで
きる。

【００３０】また、この動物由来の体細胞はＸＰ患者の
体細胞と同様の性質を示すものである。従って、これら
の動物又はその動物由来の体細胞を利用し、変異原性、
発ガン性、また制ガン活性を示す物質の評価が可能とな
る。即ち、変異原物質、発ガン物質、制ガン物質を試験
するための動物として有用である。変異原性または発ガ
ン性の試験方法としては、常法により行うことができ
る。例えば剃毛した動物の皮膚に供試化合物を適当なビ
ーイクルと混合して塗布し、潰瘍、腫瘍の発生頻度を調
べる方法、供試化合物を腹腔内に、静脈内に、脳脊髄液
内に、あるいは経口的に投与して各組織における腫瘍の
発生頻度を調べる方法、等が利用できる。また、供試化
合物の制ガン効果を調べる方法としては、例えば供試化
合物を腹腔内に、静脈内に、脳脊髄液内に、あるいは経
口的に投与してガン組織の重量測定、病理組織学的観
察、腫瘍マーカーの解析、延命効果等の判定等を行う方
法が利用できる。

【００３１】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらによって制限されるものでは
ない。

【００３２】実施例１ ＸＰＡＣ遺伝子の破壊されたト
ランスジェニックマウスの作成 （１）マウスＸＰＡＣ遺伝子の単離 色素性乾皮症（Ｘｅｒｏｄｅｒｍａ Ｐｉｇｍｅｎｔｏ
ｓｕｍ；ＸＰ）細胞は、ＤＮＡ修復能に異常をもち、そ
のために紫外線（ＵＶ）に高感受性を示す。細胞融合法
により、ＸＰにはＡからＧそれにバリアントの計８つの
遺伝的相補性群が存在する。Ａ群が日本では最も多く、
臨床症状も重い。Ａ群ＸＰ遺伝子をクローニングする目
的で、Ａ群ＸＰ細胞に正常マウスのゲノムＤＮＡをリン
酸カルシウム法でトランスフェクションし、ＵＶ抵抗性
のＸＰトランスフェクタントを選別した（ＸＲ１３とＸ
Ｒ４９）。マウス特異的繰り返し配列（ＭＩＦ，Ｂａｍ
５，Ｂ１，Ｒ）をプローブにし、ＢａｍＨＩで消化した
ＸＲ１３、ＸＲ４９および親Ａ群ＸＰ細胞（ＸＰ２ＯＳ
ＳＶ）のゲノムＤＮＡを用いたサザンブロット解析によ
り、これらのトランスフェクタントには沢山のマウスＤ
ＮＡがゲノムに取りこまれていることが明らかになっ
た。そこで、ＸＲ１３とＸＲ４９のゲノムＤＮＡを抽出
し、それを再びＸＰ２ＯＳＳＶ細胞にトランスフェクシ
ョンし、ＵＶ抵抗性のＸＰトランスフェクタントを選別
した（第２次トランスフェクション）。その結果ＵＶ抵
抗性の第２次トランスフェクタントが１つとれた（ＸＲ
II１３０）。マウス繰り返し配列をプローブにしたサザ
ンブロット解析で、ＸＲII１３０には僅かのマウスＤＮ
Ａが保持されていることが明らかになった。

【００３３】このマウスＤＮＡの中に、Ａ群ＸＰ細胞の
ＤＮＡ修復能を正常化する遺伝子が保持されていると考
えられたので、ＸＲII１３０のゲノムＤＮＡよりコスミ
ッド（ｐＨＣ７９）およびファージ（ＥＭＢＬ３）ライ
ブラリーを作成し、マウス繰り返し配列をプローブにし
て、ＸＲII１３０に保持されているマウスＤＮＡをクロ
ーニングした（図１）。その結果、ＸＲ１３、ＸＲ４９
およびＸＲII１３０には、約５０ｋｂの共通したマウス
ＤＮＡが保持されていることがわかった。この領域は、
２つのコスミッドおよび２つのファージクローンにより
クローニングされたが、２つのファージクローン（ＥＭ
ＢＬ３／２４ＢとＥＭＢＬ３／６０Ａ）ＤＮＡをＡ群Ｘ
Ｐ細胞にトランスフェクションすると、高率にＵＶ抵抗
性のＡ群ＸＰ細胞が得られ、この部分にＡ群ＸＰ細胞の
ＤＮＡ修復能を正常化するＤＮＡ修復遺伝子が存在する
ことが明らかになった。

【００３４】この遺伝子から転写されるｍＲＮＡも検出
し、対応するｃＤＮＡも、マウス繊維芽細胞より作成し
たｐｃＤ₂ 発現ｃＤＮＡライブラリーよりクローニング
した。このｃＤＮＡクローンはＡ群であればすべてのＸ
Ｐ細胞のＤＮＡ修復能を正常化できるが、他の相補性群
には無効であり、この遺伝子をＸＰＡＣ（Ｘｅｒｏｄｅ
ｒｍａ Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ ｇｒｏｕｐ Ａ Ｃ
ｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）遺伝子と名付けた。マウス
ＸＰＡＣｃＤＮＡは、２７２個のアミノ酸からなり、
Ｚｎフィンガーモチーフを有する親水性蛋白をコードす
る。マウスＸＰＡＣゲノムは約２５ｋｂの大きさをも
ち、６つのエクソンからなる。

【００３５】（２）ターゲッティングベクターの構築 ファージＥＭＢＬ３／２４Ｂの、エクソン３と４を含む
５．７ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをｐＵＣ１９プラ
スミッドにサブクローニングした。ついで、ｐＭＣ１ｎ
ｅｏ ｐｏｌｙ（Ａ）^- （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の
１．１ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ−ＢａｍＨＩ ｎｅｏｍｙｃｉ
ｎ（ｎｅｏ）カセットをエクソン４のＥｃｏＮＩ部位に
挿入した。従って、ｎｅｏはポリオーマのエンハンサー
とＨＳＶのチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターによ
って発現する。ポジティブ−ネガティブ選別を行うた
め、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子（ＰＴＫ４の２．０ｋｂ Ｐｖ
ｕIIフラグメントにＳａｌＩリンカーをつけたもの）を
ｐＵＣ１９のＳａｌＩ部位に挿入した。このようにして
構築したターゲッティングベクターをｐＮｅｏＸＰ５．
７−ＴＫと名付けた（図２）

【００３６】（３）Ｆ１／１ＥＳ細胞へのターゲッティ
ングベクターのエレクトロポレーション Ｆ１／１は、ＣＢＡ系雄マウスとＣ５７ＢＬ／６系雌マ
ウスのＦ１の胚盤胞から樹立された胚性幹細胞（ＥＳ細
胞）である。Ｆ１／１細胞（農林水産省畜産試験場より
入手）、ｐＳＶ２ｎｅｏで形質転換したＳＴＯ細胞をフ
ィーダーにし（１×１０⁶ 細胞／３５ｍｍプラスチック
皿）、ヒトＬＩＦ（ＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔ
ｅより分与されたヒトＬＩＦｃＤＮＡをＣＭＶエンハン
サーを用いてＣＨＯ細胞で強制発現させたその培養上
清）を添加（１０³ Ｕ／ｍｌ）し、２０％牛胎児血清、
ヌクレオシド、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノ
ールを含むダルベッコ改変培地（実験医学ｖｏｌ７，１
５８７−１５９２，１９８９）で培養した。８×１０⁶
のＦ１／１細胞を８００μｌのＰＢＳ（ＣａＣｌ₂０．
１ｍｍｏｌ添加）（ｐＨ７．０）に浮遊させ、ＳｓｐＩ
で消化し線状化したｐＮｅｏＸＰ５．７−ＴＫを添加
（２０μｇ／ｍｌ）し、Ｂｉｏ Ｒａｄジーンパルサー
を用い、２８０Ｖ／０．４ｃｍ、５００μＦＤでエレク
トロポレーションした。エレクトロポレーション後、４
８時間上記の培地で培養し、その後、１５０μｇ／ｍｌ
のＧ４１８、２μＭのＧａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（ＧＡＮ
Ｃ）を含む培地と交換した。１〜２日毎にフレッシュな
Ｇ４１８、ＧＡＮＣ添加培地と交換し、１０〜１２日間
培養をつづけた。

【００３７】（４）相同組換え体の同定 Ｇ４１８、ＧＡＮＣ抵抗性のクローンをピックアップ
し、６０ｍｍ培養皿に一杯になるまで増殖させた。半分
を液体窒素中で凍結保存し、残りの半分よりＤＮＡを抽
出した。相同組換え体の検出はまずＰＣＲ法で行った。
プライマー（Ａ１、Ｂ２）は、センス鎖はｐＭＣｌｎｅ
ｏ由来の５’−ＧＣＧＧＣＧＡＡＴＧＧＧＣＴＧＡＣＣ
ＧＣ−３’を用いた。アンチセンス鎖は、５’−ＧＣＡ
ＴＣＴＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧ−３’を用いた。
９４℃１分、５５℃２分、７２℃３分のサイクルを３５
回繰り返した後、増幅されたフラグメントをアガロース
ゲル電気泳動し、ナイロンメンブランにブロッティング
した後、ＸＰＡＣゲノムのイントロン４の一部をプロー
ブにしてサザンハイブリダイゼーションを行った。相同
組換え体では１．３ｋｂのＰＣＲフラグメントが検出さ
れるはずであるが、Ｇ４１８とＧＡＮＣ抵抗性細胞の約
１／７で１．３ｋｂフラグメントが認められ、これらは
相同組換え体であることが示唆された。

【００３８】一方、Ｇ４１８とＧＡＮＣ抵抗性細胞のゲ
ノムＤＮＡを抽出後、ＢａｍＨＩ消化し、アガロースゲ
ル電気泳動を行い、ＸＰＡＣｃＤＮＡをプローブにサザ
ンハイブリダイゼーションを行った。野生型の対立遺伝
子では、エクソン３と４を含む５．７ｋｂのＢａｍＨＩ
フラグメント（ターゲッティングベクターに用いられた
ＢａｍＨＩフラグメント）が認められたが、ＰＣＲ陽性
クローンでは、５．７ｋｂの他に、ｐＭＣｌｎｅｏ ｐ
ｏｌｙ（Ａ）^- の１．１ｋｂフラグメントがエクソン４
に挿入された６．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントも認
められ（図３）、これらは確かに一方の対立遺伝子で、
ターゲッティングベクターと相同組換えをおこしたクロ
ーンであることが証明された。

【００３９】（５）キメラマウスおよびＸＰＡＣ破壊マ
ウスの作成 上述のようなターゲッティングにより、一方のＸＰＡＣ
対立遺伝子が破壊されたＦ１／１細胞をＩＣＲ系マウス
の８細胞期胚に透明帯を除去せずに注入し、１日間ｉｎ
ｖｉｔｒｏで培養後、仮親の子宮に移植した。ここ
で、Ｆ１／１細胞の注入操作は、１０〜１５個の塊のま
まカットした透明帯のスリットから囲卵腔に注入する方
法により行った。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養は、
１０％ＦＣＳ添加したＭ１６液中で２４時間３７℃で行
った。その結果、３０５個の胚を２２匹の仮親に移植
し、１６匹の仮親が妊娠し、７４匹の子を得た。毛色か
ら、そのうちの８匹がキメラマウスであった（♂７匹、
♀１匹）。キメラマウスの♂とＩＣＲの♀マウスを交配
したところ、キメラの寄与率が最も高かった♂で生殖系
列のキメラが確認され、一方のＸＰＡＣ対立遺伝子がタ
ーゲッティングにより破壊されたヘテロ接合体マウスを
得た。ヘテロ接合体の♂と♀を交配したところ、その子
孫の１／４が両方の対立遺伝子が破壊されたホモ接合体
マウス（ＸＰＡＣ^- ／ＸＰＡＣ^- ）、１／２がヘテロ接
合体マウス（ＸＰＡＣ^- ／＋）そして１／４が正常マウ
ス（＋／＋）であった。

【００４０】実施例２ ホモ接合体（ＸＰＡＣ^- ／ＸＰ
ＡＣ^- ）マウスのＤＮＡ修復能試験 マウスより線維芽細胞を樹立し、その紫外線（２５４ｎ
ｍ）感受性をコロニー形成能により調べたところ、正常
マウスおよび実施例１で作成したヘテロ接合体マウス細
胞ではＤｏ＝３Ｊ／ｍ² であったのに対し、実施例１で
作成したホモ接合体マウスではＤｏ＝０．４〜０．５Ｊ
／ｍ² であった。即ち、ホモ接合体マウスは、Ａ群色素
性乾皮症細胞と同程度の紫外線高感受性を示した。これ
により紫外線照射後のＤＮＡ修復合成は、ヘテロ接合体
マウス細胞では正常レベルであったが、ホモ接合体マウ
ス細胞ではバックグラウンドレベルであり、ホモ接合体
マウスのＤＮＡ修復能の欠損が確認された。

【００４１】一方、紫外線と同種類のＤＮＡ障害を惹起
する化学発ガン剤７，１２−ジメチルベンズアントラセ
ン１００μｇを、剃毛したマウス（ホモ接合体マウス１
５匹、正常マウス１４匹）の背に塗布したところ、１０
日目にホモ接合体マウスにのみ全ての個体に潰瘍形成が
認められた。さらに１カ月目にホモ接合体マウスの背の
塗布部位に乳頭腫が出現した。一方、正常マウスにはな
んら変化はみられなかった。このことからホモ接合体マ
ウスは個体レベルでも化学発ガン剤に対して高感受性で
あり、腫瘍も高率に誘発されることが立証された。

【００４２】

【発明の効果】本発明の方法によって得られる本発明の
トランスジェニック動物は、遺伝子異常に起因する実際
のヒトの病気を反映した発ガンモデル動物として有用で
ある。また、本発明の動物またはその動物由来の体細胞
を用いて、化学物質の変異原性、発ガン性あるいは制ガ
ン活性を評価することが可能であり、さらに色素性乾皮
症遺伝子の欠損に基づく疾患の治療の実験モデル動物と
しても有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、紫外線抵抗性ＸＰ細胞に取り込まれた
マウスＤＮＡの制限酵素地図を表す。

【図２】図２は、ＸＰＡＣ遺伝子の破壊に用いられるタ
ーゲッティングベクターを示す図である。

【図３】図３は、ジーンターゲッティングによるＸＰＡ
Ｃ遺伝子の破壊の状態を表す。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 色素性乾皮症遺伝子が機能しないように
   改変されたホモ接合体の改変色素性乾皮症遺伝子を有す
   ることを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳動
   物。
2. 【請求項２】 色素性乾皮症遺伝子がＡ群の遺伝子であ
   る請求項１記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
3. 【請求項３】 動物がゲッ歯動物である請求項１又は２
   記載の動物。
4. 【請求項４】 ゲッ歯動物がマウスである請求項３記載
   の動物。
5. 【請求項５】 変異原物質、発ガン物質または制ガン物
   質を試験するための請求項１〜４いずれか記載の動物。
6. 【請求項６】 請求項１〜４いずれか記載の動物由来の
   体細胞。
7. 【請求項７】 請求項１〜４いずれか記載の動物よりな
   る、又は該動物に色素性乾皮症遺伝子の欠損に基づく遺
   伝子疾患を発生させてなることを特徴とする、色素性乾
   皮症遺伝子の欠損に基づく疾患の治療の実験モデル動
   物。
8. 【請求項８】 請求項１〜４いずれか記載の動物よりな
   る、又は該動物にガンを発生させてなることを特徴とす
   るヒト疾患モデル動物。
9. 【請求項９】 色素性乾皮症（ＸＰ）遺伝子を特異的に
   破壊するターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入す
   る工程、相同組換えによりＸＰ遺伝子が破壊された改変
   遺伝子を有するＥＳ細胞を単離する工程、単離されたＥ
   Ｓ細胞を動物胚へ注入し仮親の子宮に移植して生殖系列
   のキメラ動物を得る工程、及び該キメラ動物を正常な動
   物と交配させてヘテロ接合体を得、該ヘテロ接合体同士
   を交配させてホモ接合体を得る工程を有するトランスジ
   ェニック非ヒト哺乳動物の作成方法において、該ＥＳ細
   胞の動物胚への注入が、８細胞期胚に透明帯を除去せず
   に行うことを特徴とするトランスジェニック非ヒト哺乳
   動物の作成方法。