JP2001136866A - 好中球走化性因子ｌｅｃｔ２遺伝子の機能が欠損したマウス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＬＥＣＴ２の生体内での役割を解明するため
の実験材料としてのマウスの提供。 【解決手段】 好中球走化性因子ＬＥＣＴ２遺伝子の機
能が欠損しているマウス。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、好中球走化性因子
ＬＥＣＴ２遺伝子を欠損した新規の動物に関する。本発
明動物は、実験、研究用のマウスであり、ＬＥＣＴ２遺
伝子の全部あるいは一部に変異あるいは欠損を有し、Ｌ
ＥＣＴ２活性およびＬＥＣＴ２蛋白質が欠損している。
この特質を有するマウスは、ＬＥＣＴ２の関与する肝
臓、骨、脳、呼吸器系、循環器系ならびに免疫系の疾
患、例えば、肝炎、肝硬変、肝癌、肝再生、骨代謝、リ
ウマチ、脳障害、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流障害、
腎炎の病態生理、原因の解明および治療法の開発等の研
究のための実験動物として極めて有用である。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】肝臓
は、物資の貯蔵、解毒、感染防御、生体機能維持に関わ
る生存にとって中心的な役割を担っている。肝臓が、肝
炎、肝硬変、肝癌などによってその機能が低下すると、
肝実質細胞は分化増殖を始め、肝臓の機能を正常化しよ
うとする。通常、肝実質細胞はほとんど増殖せず分裂が
抑制された状態にある。しかし、肝臓の傷害によって肝
臓が再生する時は、この細胞の分裂が開始される。この
増殖調節機構には、ＴＮＦα、ＩＬ−６をはじめとする
いくつかのサイトカインや増殖因子が関与していること
が明らかにされている（文献１、２、３）。しかし、こ
れらのサイトカイン・増殖因子だけでは増殖調節機構が
説明できない。一方、肝臓に特異的に発現してるサイト
カインＬＥＣＴ２は、肝実質細胞に発現しており、肝機
能を調節していることが示唆されている（文献４）。

【０００３】ＬＥＣＴ２は好中球走化性因子として単離
され（文献５）、マクロファージの分化にも作用し、肝
臓に特異的に発現・存在している蛋白質である（文献
４）。肝臓に発現しているＬＥＣＴ２の主たるｍＲＮＡ
および蛋白質発現細胞は、肝実質細胞であることが抗体
染色および肝臓由来の細胞株で確認されている（文献
４）。したがって、ＬＥＣＴ２は、肝臓機能と関連があ
ると考えられている。事実、本発明者らは、正常肝臓
が、肝癌へと移行するに伴い、ＬＥＣＴ２の発現が低下
することを明らかにしている（文献６、７）。

【０００４】最近、コンドロモジュリンIIはＬＥＣＴ２
と同じアミノ酸配列構造（ＬＥＣＴ２と同じ遺伝子・蛋
白質）を持ち、骨芽細胞の増殖を高めることが示された
（文献８）。即ち、ＬＥＣＴ２が骨代謝に関与している
ことが示唆されている。骨代謝は、骨格を維持するため
に不可欠であり、骨芽細胞の増殖と破骨細胞の機能のバ
ランスによって支えられている。この代謝には種々のサ
イトカインが関与しているが、詳細は、解明されていな
い。

【０００５】このように、肝炎、肝癌、肝硬変、肝臓再
生などの肝臓の機能の異常、自己免疫にかかわる疾患
や、骨代謝異常がかかわる疾患がどのような機構でおこ
っているかは、いまだに不明で、明白にされていない。
これらの疾患において、ＬＥＣＴ２が生体内で多様で重
要な作用に関与しているものと予想されるが、その本来
の生体内での機能は、不明のままであった。このため、
ＬＥＣＴ２の生体内での役割を解明することが急務の課
題であった。そこで、この課題を究明するための絶好の
実験材料として、ＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したモデル動
物の作製が強く望まれていた。

【０００６】上記の実情に基づき、本発明者らはＬＥＣ
Ｔ２遺伝子を欠損したマウスを作製して、その生体内で
の機能を解析することによって、ＬＥＣＴ２の生理的な
役割を直接明らかにすることを可能にするとともに、Ｌ
ＥＣＴ２の関与する種々の病態の解明あるいは治療法の
研究のために、遺伝的背景の明確な動物モデルを提供し
ようとするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは近年
開発されてきたジーンターゲッティング法（文献９）を
用いて鋭意研究を進め、ＬＥＣＴ２遺伝子を特定のベク
ターと相同的組換えを起こさせることにより、ＬＥＣＴ
２遺伝子を欠損した動物を作製することに至り、本発明
を完成した。即ち、本発明は、遺伝子の全部または一部
が、欠損または他の遺伝子により置換されており、実質
的にＬＥＣＴ２をコードする遺伝子を含まないマウスに
関する。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明により作製されるマウスは、ＬＥＣＴ２遺伝子の
全部又は一部が、欠損又は他の遺伝子により置換されて
おり、実質的にＬＥＣＴ２をコードする遺伝子を含まな
いことを特徴とする。本発明のマウスには、ＬＥＣＴ２
遺伝子をホモで欠損しているマウス、ヘテロで欠損して
いるマウスのいずれも含まれる。

【０００９】本発明マウスの作製方法を説明する。 〔マウスＬＥＣＴ２遺伝子ＤＮＡのターゲティングベク
ターの作製〕ＬＥＣＴ２遺伝子の機能を人為的に欠損さ
せたマウスを得るためには、マウス由来のＬＥＣＴ２遺
伝子をクローニングし、ＬＥＣＴ２の遺伝子に欠損や挿
入あるいは他の遺伝子との置換などの変異を起こした後
に、マウスにもどす方法が用いられる。ＬＥＣＴ２遺伝
子のクローニングは、例えばマウス肝臓の細胞から染色
体ＤＮＡを抽出し、常法に従ってＤＮＡライブラリーを
作製し、これをすでに決定されているマウスＬＥＣＴ２
遺伝子（文献１０）の塩基配列を基に作製した当該遺伝
子のポリメラーゼ鎖状反応（ＰＣＲ）増幅断片を用いて
スクリーニングすればよい。

【００１０】ＬＥＣＴ２遺伝子の機能の欠損には、ＬＥ
ＣＴ２遺伝子の全体あるいは、いずれかの部位を欠失さ
せればよく、または、いずれかの部位に他の遺伝子を挿
入させてもよい。他の遺伝子を挿入させる場合、ＬＥＣ
Ｔ２遺伝子の欠損を検出するためのマーカー遺伝子とし
ても機能できる他の遺伝子を挿入することが好ましく、
この様な遺伝子としてはジェネティシン（Ｇ４１８）耐
性によって選択できるネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅ
ｏ）およびガンシクロビル耐性によって選択できるヘル
ペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−
ＴＫ）やジフテリアトキシンＡ断片遺伝子（ＤＴ−Ａ）
等が用いられる。これらの遺伝子の挿入は試験管内で常
用のＤＮＡ組換え技法により行うことができる。本実施
にあたっては、ＬＥＣＴ２遺伝子の全エキソンあるいは
一部の遺伝子機能が欠失しており、その欠失領域に選択
マーカー遺伝子が挿入されることが望ましい。

【００１１】より具体的には、マウス染色体ＤＮＡライ
ブラリーにＬＥＣＴ２遺伝子の部分配列をプローブとし
てハイブリダイズし、陽性クローンを得る。これをベク
ターに挿入後、制限酵素で消化して特定のエキソンを含
む染色体ＤＮＡをサブクローニングする。次いで、ＬＥ
ＣＴ２遺伝子の構造を破壊しかつポジティブ／ネガティ
ブセレクションを行うために、ＮｅｏやＤＴ−Ａなどの
マーカー遺伝子を挿入してターゲティングベクターを作
製する。

【００１２】〔ジーンターゲティングによるマウス胚性
幹細胞（ＥＳ細胞）でのＬＥＣＴ２遺伝子変異〕次に、
こうして得られたターゲティングベクターをＥＳ細胞に
導入し、ＥＳ細胞中のＬＥＣＴ２遺伝子と相同的組換え
を行う。ＥＳ細胞は株化されたものであり、多分化能を
保持し、しかも培養細胞として維持、継代が可能な細胞
である。ターゲティングベクターの挿入は、例えば常用
の電気パルス法やアグリゲーション法により行うことが
できる。この相同的組換えにおいては、ＥＳ細胞内のＬ
ＥＣＴ２遺伝子のＤＮＡとターゲティングベクターの対
応する領域との間で組換えが生じ、ターゲティングベク
ター中に挿入されていたマーカー遺伝子がＥＳ細胞の染
色体ＬＥＣＴ２遺伝子に挿入される。この結果、ＥＳ細
胞はＬＥＣＴ２遺伝子を欠失し、同時にマーカー遺伝子
を得る。このマーカー遺伝子に基づいてＬＥＣＴ２遺伝
子を欠失したＥＳ細胞を得ることができる。より具体的
には、ターゲティングベクターとＥＳ細胞を混合し、遺
伝子導入を行う。次いで、Ｇ４１８等で選択培養を行
う。

【００１３】〔ＬＥＣＴ２遺伝子変異ＥＳ細胞によるキ
メラマウスの作製〕このＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に注
入し、さらに偽妊娠マウスの子宮内に移植して産仔を得
る。次に、こうして得たキメラマウスを適当な系統のマ
ウスと交配することにより産仔を得る。キメラ動物の生
殖細胞が、ＬＥＣＴ２遺伝子が欠損されている相同的組
換え体に由来すればＬＥＣＴ２遺伝子を欠損した動物を
得ることができる。

【００１４】〔ホモ変異マウスの作製〕移植によって得
られたキメラ動物を、目的とする系統のマウスと交配さ
せ産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由
来しているか、交配マウスの系統に由来しているかは、
得られた産仔の適当な特質によって決定できる。ＬＥＣ
Ｔ２遺伝子のヘテロ変異マウス同士を交配し、産仔のＬ
ＥＣＴ２遺伝子をサザンハイブリダイゼーションによっ
て確認し、目的物であるＬＥＣＴ２遺伝子ホモ変異マウ
ス、即ちＬＥＣＴ２遺伝子の機能が欠損したマウスを得
る。本発明の動物の飼育方法は特別な方法を用いる必要
はなく、一般の動物と同様な方法により飼育することが
できる。

【００１５】

【実施例】以下に、アグリゲーション法によるキメラマ
ウスの作製法（文献１１、１２）による実施例を挙げて
本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の限
定を意図するものでない。

【００１６】実施例１ 〔マウスゲノム遺伝子のクローニングとターゲティング
ベクターの構築〕マウスゲノムライブラリーは、１２９
／ＳｖＪマウスの肝臓より作製されたものを用いた。マ
ウスＬＥＣＴ２のノーマルタイプｃＤＮＡをプローブと
して用い、マウスＬＥＣＴ２遺伝子および両側の配列を
含む染色体ＤＮＡをクローニングした。次いでＬＥＣＴ
２遺伝子の両側の配列をサブクローンし、ポジティブ／
ネガティブセレクションを行うためにＮｅｏおよびＤＴ
−Ａを用いて、ターゲティングベクターを作製した（図
１）。より具体的には制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断
片（７．７kb、遺伝子の５′側）とＡａｔＩ−ＳｃａＩ
断片（１．４kb、遺伝子の３′側）を相同領域として用
い、ＬＥＣＴ２遺伝子の位置にＮｅｏを５′側にＤＴ−
Ａを選択マーカーとして挿入し、ターゲティングベクタ
ーを作製した。相同的組み換えが起こった場合には、マ
ウスＬＥＣＴ２遺伝子全長がＮｅｏカセット（１．６k
b）に置き換わることになる。

【００１７】実施例２ 〔ＥＳ細胞の調製およびその培養方法〕実施例１により
調製したマウスＬＥＣＴ２遺伝子ＤＮＡのターゲティン
グベクターを導入する細胞として、１２９系マウス胚盤
胞由来のＥＳ細胞Ｅ１４株の亜株であるＥ１４．１株
（文献１３）を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッ
コ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１５％の牛胎児血清
（ＦＢＳ）、０．１mMの２−メルカプトエタノール、
０．３５％のグルコース、および０．０５８％のＬ−グ
ルタミンを添加した培養液を用いた。また、ＥＳ細胞の
フィーダー細胞として用いるマウス胚繊維芽細胞（Ｅ
Ｆ）の培養には、ＤＭＥＭに７％のＦＢＳ、０．３５％
のグルコース、および０．０５８％のＬ−グルタミンを
添加した培地を用いた。ＥＦ細胞は３−４日間隔で継代
を行い、以下の様にマイトマイシン（ＭＭＣ）で処理し
てフィーダー細胞として用いた。ほぼコンフルエント状
態に達したＥＦ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）溶
液で処理して細胞を剥離した。次いで、遠心後、細胞を
２−４ｘ１０⁴個／cm²に調製し、ＭＭＣを加えた。この
細胞をゼラチンでコートしたフラスコ、シャーレあるい
はマイクロプレート上に分注した。ＥＳ細胞の継代は、
３７℃で５分間、ＴＥ溶液で処理後、ピペッティングに
よって単一細胞にまで分散させ、フィーダー細胞層上に
播種することにより行った。培養液は２日に一度の間隔
で交換した。このＥＳ細胞にターゲティングベクターを
須藤、岩倉の方法（文献１２）により導入した。１×１
０⁷個のＥＳ細胞と２０μgのターゲティングベクターを
混ぜ、Shimadzu GTE-1（２５０V、５００μF、electrod
e distance ０．２cm）を用いた電気パルス法により細
胞にＤＮＡを導入した。５−７m秒電気パルスをかけた
細胞を、フィーダー細胞をコートした１０cm径のシャー
レに播種した。電気パルスをかけてから２４時間経過し
た後、Ｇ４１８を２５０μg/mlの濃度になるように添加
した。約１０日後、現れてきた９６個コロニーを２４穴
のプレートに移し、さらに培養を続け、充分増殖したと
ころで細胞を集めた。半分は液体窒素で保存し、残り半
分をサザンハイブリダイゼーションによる組換え体検出
のための染色体ＤＮＡ抽出に使用した。ＤＮＡ抽出は、
常法に従った。こうして、相同的組換え体したＥＳ細胞
を含むコロニーを得た。

【００１８】実施例３ 〔相同的組み換えを起こした細胞の選択〕相同的組換え
を起こしたＥＳ細胞の検出は、ＰＣＲおよびサザンハイ
ブリダイゼーションにより行った。ＰＣＲのプライマー
としては図１のようにターゲティングベクターの３′端
の外側の塩基配列、およびＮｅｏ遺伝子の内部の塩基配
列を用いた。ＰＣＲで陽性だった２クローンについてゲ
ノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、あるいはＢｌｎＩ／
ＸｈｏＩで切断し、図１のプローブによりサザンハイブ
リダイゼーションを行い計画通りの組換えが起こってる
かを確認した。その結果、１クローンのみに正しい組換
えが起こってることを確認した。得られた相同的組換え
体のクローン数は、Ｇ４１８耐性のクローン３２０個の
うち１個であった。

【００１９】実施例４ 〔キメラマウスの作製とミュータントマウスの選別〕Ｃ
５７ＢＬ／６系マウスの交尾後３．５日目に卵管より胚
盤胞を取得し、タイロード液にて相同的組換えＥＳ細胞
と凝集させた。それを擬妊娠させたＩＣＲマウスの子宮
内に戻した。この仮親から娩出される産仔は、胚盤由来
のＣ５７ＢＬ／６系マウス由来の細胞とＥＳ細胞が由来
する１２９系マウス由来の細胞からなるキメラであり、
そのキメリズムの良し悪しは毛色で判断した。１２９系
マウス由来の細胞の寄与率が高いほどキメラマウスは野
生色あるいは白色の割合が上がり、毛色は黒色・野生色
と白色のまだら模様となる。生まれたキメラマウスの中
でＥＳ細胞の寄与が大きいと考えられる体毛の黒色が淡
くなったマウス７匹を選び、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと
交配を行った。生まれた３３匹のアグーチ色の毛色を持
つマウスについて、尻尾よりＤＮＡを抽出し、常法によ
りサザンハイブリダイゼーションで遺伝子型の解析を行
った結果、ＬＥＣＴ２遺伝子がヘテロに変異したマウス
〔ＬＥＣＴ２（＋／−）マウス〕を１７匹確認した。さ
らに、ヘテロ変異の遺伝子座をもつマウス同士を交配
し、ホモでＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したマウス〔ＬＥＣ
Ｔ２（−／−）マウス〕を取得した。

【００２０】実施例５ 〔ＬＥＣＴ２遺伝子欠損マウスの遺伝子の発現量〕両遺
伝子座ともにＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したマウスについ
て、ノザンハイブリダイゼーションでＬＥＣＴ２ ｍＲ
ＮＡの発現の有無を調べた。ＬＥＣＴ２（−／−）マウ
ス、ＬＥＣＴ２（＋／−）マウス、および対照として野
生型マウス〔ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウス〕について肝
臓から全ＲＮＡを常法により抽出した。ＬＥＣＴ２遺伝
子を欠損したマウスについて、ノザンハイブリダイゼー
ションでＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの発現の有無を調べた。
マウスＬＥＣＴ２ ｃＤＮＡ４５０−ｂｐをプローブに
してノザンハイブリダイゼーションを行った。ＬＥＣＴ
２（−／−）マウスではＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡは全く検
出されなかった（図２）。また、ＬＥＣＴ２（＋／−）
マウスではＬＥＣＴ２ ｍＲＮＡの発現量はＬＥＣＴ２
（＋／＋）マウスの約半分量に低下していた。

【００２１】実施例６ ＬＥＣＴ２遺伝子欠損マウスは正常に誕生したことか
ら、マウスの発生について必須の因子ではないと考えら
れる。また、体重も野生型マウスと変わらなかった。

【００２２】実施例７ ＬＥＣＴ２遺伝子欠損が生殖に及ぼす影響を調べるため
に、オス、メスともにＬＥＣＴ２遺伝子を欠いたマウス
を交配させた。その結果、次世代のマウスは正常に誕生
したことから、ＬＥＣＴ２遺伝子欠損は生殖には影響し
なかった。

【００２３】実施例８ ＬＥＣＴ２遺伝子の欠損がもたらす生体機能の変化を調
べるため、まず、血液学的検査を行った。ＬＥＣＴ２
（−／−）マウスおよびＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスの
全血を採取し、血液検査を行った。その結果、ＬＥＣＴ
２（−／−）において、白血球数がＬＥＣＴ２（＋／
＋）マウスのそれよりも低かった。それ以外の血球数や
各種血清マーカーの値については、ＬＥＣＴ２（−／
−）マウスとＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスでは顕著な差
は見られなかった（表１）。

【００２４】

【表１】

【００２５】実施例９ 〔ミュータントマウスの臓器像〕ＬＥＣＴ２遺伝子の欠
損がもたらす生体機能の変化を調べるため、まず各種臓
器の組織染色を行ったところ、肝臓では、肝臓の実質細
胞が、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により細
胞内が弱く染色され、また、複数の核の存在が認められ
た（表２）。しかし、肝臓以外には顕著な疾患組織像は
認められなかった。

【００２６】

【表２】

【００２７】実施例１０ 〔ミュータントマウスの肝臓機能〕肝臓の組織像につい
てしらべた。ＬＥＣＴ２産生臓器である肝臓において
は、野生型マウスと比べて肝細胞の大きさの不同化、２
核の細胞や萎縮した核を持つ細胞の割合が高くなってい
た。この結果はＬＥＣＴ２（−／−）マウスでは肝細胞
の増殖、およびそれに伴う細胞死の制御が正常に保たれ
ていないことを示した（図３）。

【００２８】実施例１１ ＬＥＣＴ２遺伝子欠損マウスで比較的多く観察された、
萎縮した核を持つ肝細胞がアポトーシスを起こした細胞
かどうかをＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl tr
ansferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling）
法（文献１４）で検討した。本法により、アポトーシス
の生化学的な指標とされるＤＮＡ断片化を組織化学的に
検出することが出来る。その結果、ＬＥＣＴ２（−／
−）マウスでは、ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスに比べて
アポトーシス細胞の数が２〜５倍多くなっていることが
確認された（図４）。この結果から、ＬＥＣＴ２遺伝子
欠損マウスの肝臓では、肝細胞の代謝回転の異常が起こ
っていることが考えられる。

【００２９】実施例１２ ＬＥＣＴ２（−／−）マウスが肝細胞のアポトーシスを
誘発していることを示したことは、ＬＥＣＴ２が肝臓の
細胞増殖に重要なサイトカインであることを意味してい
る。

【００３０】実施例１３ ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスとＬＥＣＴ２（−／−）マ
ウスとの細胞増殖・アポトーシスの相違から、肝臓の細
胞増殖・アポトーシス機構に、ＬＥＣＴ２がどのように
関与しているかに興味が持たれた。

【００３１】

【発明の効果】以上のとおり、本発明はＬＥＣＴ２遺伝
子とＮｅｏ遺伝子を置換すること等によって、ＬＥＣＴ
２遺伝子の機能が欠損しているマウスを提供する。この
マウスは、ＬＥＣＴ２の関与する肝炎、肝癌、肝硬変、
肝臓再生、免疫系疾患、リウマチ、骨粗鬆症、骨代謝異
常症、腎炎、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流障害、呼吸
器系、循環器系機能障害および脳障害の病態生理、原因
の解明、予後の判定および治療法の開発等の研究のため
の実験動物として有用である。

【００３２】肝炎、肝癌、肝臓再生、リウマチ、骨代謝
異常、脳障害、腎炎、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流傷
害などの患者の予後は必ずしも良好ではなく、治療期間
中に死亡する患者も多い。そこで、より効果的なこれら
の疾患の治療薬の開発が強く望まれている。新薬の評価
方法として最も望ましい方法は、in vivoで評価するこ
とであり、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスはこの目的のた
めに有効利用できると期待できる。

【００３３】ＬＥＣＴ２や炎症性サイトカインが、肝
炎、肝癌、肝臓再生、リウマチ、骨代謝異常、脳障害、
腎炎、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流傷害などの引き金
や、悪性化、増悪化に関与している可能性がある。しか
し、ＬＥＣＴ２がこれらの疾患に関わっていることを個
体レベルで証明された実例はない。本発明のＬＥＣＴ２
（−／−）マウスは、ＬＥＣＴ２と炎症性疾患や上記疾
患との因果関係を個体レベルで解析し、また炎症性疾患
や上記疾患の発症機構の究明、およびそれら疾患の治療
薬を開発するのに有用である。

【００３４】〔文献〕 １． Tsubouchi, H., Kawakami, S., Hirono, S., Miya
zaki, H., Kimoto, M.,Arima, T., Sekiyama, K., Yosh
iba, M., Arakaki, N. and Daikuhara, Y. Predication
of outcome in fulminant hepatic failure by serum
human hepatocyte growth factor (letter) Lancet 34
0, 307, 1992. ２． Yamada, Y., Kirillova, I., Peschon, J. J. and
Fausto, N. Initiationof liver growth by tumor nec
rosis factor: Deficient liver regenerationin mice
lacking type I tumor necrosis factor receptor. Pro
c. Natl. Acad.Sci. USA. 94, 1441-1446, 1997. ３． Cressman, D. E., Greenbaum, L. E., Deangelis,
R. A., Ciliberto, G.,Furth, E. E., Poli, V. and T
aub, R. Liver failure and defective hepatocyte reg
eneration in interleukin-6 deficient mice. Science
274, 1379-1383, 1996. ４． Yamagoe, S., Akasaka, T., Uchida, T., Hachiy
a, T., Okabe, T., Yamakawa, Y., Arai, T., Mizuno,
S. and Suzuki, K. Expression of a neutrophilchemot
actic protein LECT2 in human hepatocytes revealed
by immunochemical studies using polyclonal and mon
oclonal antibodies to a recombinant LECT2. Bioche
m. Biophys. Res. Commun. 237, 116-120, 1997. ５． Yamagoe, S., Yamakawa, Y., Matsuo, Y., Minowa
da, J., Mizuno, S. andSuzuki, K. LECT2: Purificati
on of novel human neutrophil chemotactic protein.
Immunol. Lett. 52, 9-13, 1996. ６． H. Nagai, T. Hamada, T. Uchida, S. Yamagoe,
K. Suzuki. Systemic expression of a newly recogniz
ed protein, LECT2, in human body. Pathology Intern
ational 48, 882-886, 1998. ７． T. Uchida, H. Nagai, K. Gotoh, H. Kanagawa,
H. Kouyama, T. Kawanishi, S. Mima, S. Yamagoe and
K. Suzuki. Expression pattern of newly recognized
protein, LECT2, in hepatocellular carcinoma and it
s premalignant lesion. Pathology International 49,
147-151, 1999. ８． Y. Mori, Y. Hiraki, C. Shukunami, S. Kakudo,
M. Shiokawa, M. Kagoshima, H. Mano, Y. Hakeda, T.
Kurokawa, F. Suzuki, M. Kumegawa. FEBS Lett.406, 3
10-314, 1997. ９． Smithies O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Kora
lewski, M. A., and Kucherlapati, R. S. Insertion o
f DNA sequences into the human chromosomalb-globin
locus by homologous recombination. Nature 317: 23
0-234, 1985. １０． S. Yamagoe, T. Watanabe, S.Mizuno, K. Suzuk
i. The Mouse LECT2 Gene: Cloning of a cDNA, Struct
ural Characterization and Chromosomal Localizatio
n. Gene 216, 171-178, 1998. １１． Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Ne
wcrely, W. and Roder,J. Derivation of completely c
ell culture-derived mice from early-passageembyoni
c stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 90, 8424-
8428. 1993. １２． 須藤カツ子、岩倉洋一郎. アグリゲーション法
による変異マウスの作製実験医学別冊「新遺伝子工学ハ
ンドブック 改訂３版」 pp250-256, 1999. １３． Kuhn, R., Rajewsky, K. and Muller, W. Gener
ation and analysis ofInterleukin-4 deficient mice.
Science 254, 707-710. 1991. １４． Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben, S.S. Identi
fication of programmedcell death in situ via speci
fic labeling of nuclear DNA fragmentation.J. Cell
Biol. 119. 493-501, 1992.

【図面の簡単な説明】

【図１】マウスＬＥＣＴ２遺伝子欠損用ターゲティング
ベクターの構築と各種プローブの対応部位を示す図であ
る。マウスＬＥＣＴ２遺伝子構造と置換遺伝子の構造を
しめす。野生型（Wild-type、ＬＥＣＴ２（＋／
＋））、ターゲティングベクター（Targeting vector）
およびＬＥＣＴ２遺伝子の相同的組換え体（Mutant all
ele）の模式図を示す。また、スクリーニング用のＰＣ
Ｒプライマーならびに５′プローブと３′プローブの位
置を示す。また、各制限酵素サイトを示す。

【図２】肝臓中の肝細胞におけるｍＲＮＡの発現を比較
するために、マウスＬＥＣＴ２ｃＤＮＡをプローブとし
て行ったノーザンハイブリダイゼーション分析の結果を
示す電気泳動写真である。また、ＧＡＰＤＨ（グリセロ
アルデヒド脱水素酵素）をプローブとして行ったノーザ
ンハイブリダイゼーションは、全ＲＮＡ量を比較するた
めの対照実験である。ＷＴ：野生型（Wild-type、ＬＥ
ＣＴ２（＋／＋））マウスの肝臓から抽出したｍＲＮ
Ａ，ＫＯ：欠損型（Knock-out、ＬＥＣＴ２（−／
−））マウスの肝臓から抽出したｍＲＮＡ，数値は、マ
ウスの番号を示している。

【図３】肝臓の組織をヘマトキシリン・エオジン（Ｈ
Ｅ）で染色した顕微鏡像写真を示す。左図は、ＬＥＣＴ
２（＋／＋）マウスの組織染色の顕微鏡写真を示し、右
図は、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスの組織染色の顕微鏡
写真を示す。ＬＥＣＴ２（−／−）マウスでは、細胞内
の染色が薄く、２核の細胞が多い。

【図４】肝臓の細胞のアポトーシスを示す顕微鏡写真で
ある。左図は、ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスのＴＵＮＥ
Ｌ染色の顕微鏡写真を示し、右図は、ＬＥＣＴ２（−／
−）マウスのＴＵＮＥＬ染色の顕微鏡写真を示す。アポ
トーシスを起こしている細胞は、茶色に染色（矢印）さ
れており、ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスでは存在しない
が、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスでは、視野に数個の茶
色陽性の細胞が観察される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 齋藤 武 東京都江戸川区西葛西６丁目10番５号 タ ーキーズビル405号室 (72)発明者 浅野 雅秀 神奈川県川崎市宮前区土橋４丁目９番６号 クレッセント鷺沼ＩＩ307号室 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 CA03 CA09 CA20 DA02 FA10 GA14 GA18 GA27 HA12 HA13

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 好中球走化性因子ＬＥＣＴ２遺伝子の機
   能が欠損しているマウス。
2. 【請求項２】 ＬＥＣＴ２遺伝子の全部もしくは一部が
   欠失、またはいずれかの部位に他の遺伝子が挿入される
   ことによりＬＥＣＴ２遺伝子の機能が欠損している請求
   項１に記載のマウス。
3. 【請求項３】 前記他の遺伝子が選択マーカー遺伝子で
   ある請求項２に記載のマウス。