JP4470077B2

JP4470077B2 - 好中球走化性因子ｌｅｃｔ２遺伝子の機能が欠損したマウス

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Publication number: JP4470077B2
Application number: JP32530799A
Authority: JP
Inventors: 智山越; 和男鈴木; 洋一郎岩倉; 武齋藤; 雅秀浅野
Original assignee: 和男鈴木
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 1999-11-16
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2019-11-16
Also published as: CA2387006A1; JP2001136866A; US6541681B1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、好中球走化性因子ＬＥＣＴ２遺伝子を欠損した新規の動物に関する。本発明動物は、実験、研究用のマウスであり、ＬＥＣＴ２遺伝子の全部あるいは一部に変異あるいは欠損を有し、ＬＥＣＴ２活性およびＬＥＣＴ２蛋白質が欠損している。この特質を有するマウスは、ＬＥＣＴ２の関与する肝臓、骨、脳、呼吸器系、循環器系ならびに免疫系の疾患、例えば、肝炎、肝硬変、肝癌、肝再生、骨代謝、リウマチ、脳障害、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流障害、腎炎の病態生理、原因の解明および治療法の開発等の研究のための実験動物として極めて有用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
肝臓は、物資の貯蔵、解毒、感染防御、生体機能維持に関わる生存にとって中心的な役割を担っている。肝臓が、肝炎、肝硬変、肝癌などによってその機能が低下すると、肝実質細胞は分化増殖を始め、肝臓の機能を正常化しようとする。通常、肝実質細胞はほとんど増殖せず分裂が抑制された状態にある。しかし、肝臓の傷害によって肝臓が再生する時は、この細胞の分裂が開始される。この増殖調節機構には、ＴＮＦα、ＩＬ−６をはじめとするいくつかのサイトカインや増殖因子が関与していることが明らかにされている（文献１、２、３）。しかし、これらのサイトカイン・増殖因子だけでは増殖調節機構が説明できない。一方、肝臓に特異的に発現してるサイトカインＬＥＣＴ２は、肝実質細胞に発現しており、肝機能を調節していることが示唆されている（文献４）。
【０００３】
ＬＥＣＴ２は好中球走化性因子として単離され（文献５）、マクロファージの分化にも作用し、肝臓に特異的に発現・存在している蛋白質である（文献４）。肝臓に発現しているＬＥＣＴ２の主たるｍＲＮＡおよび蛋白質発現細胞は、肝実質細胞であることが抗体染色および肝臓由来の細胞株で確認されている（文献４）。したがって、ＬＥＣＴ２は、肝臓機能と関連があると考えられている。事実、本発明者らは、正常肝臓が、肝癌へと移行するに伴い、ＬＥＣＴ２の発現が低下することを明らかにしている（文献６、７）。
【０００４】
最近、コンドロモジュリンIIはＬＥＣＴ２と同じアミノ酸配列構造（ＬＥＣＴ２と同じ遺伝子・蛋白質）を持ち、骨芽細胞の増殖を高めることが示された（文献８）。即ち、ＬＥＣＴ２が骨代謝に関与していることが示唆されている。骨代謝は、骨格を維持するために不可欠であり、骨芽細胞の増殖と破骨細胞の機能のバランスによって支えられている。この代謝には種々のサイトカインが関与しているが、詳細は、解明されていない。
【０００５】
このように、肝炎、肝癌、肝硬変、肝臓再生などの肝臓の機能の異常、自己免疫にかかわる疾患や、骨代謝異常がかかわる疾患がどのような機構でおこっているかは、いまだに不明で、明白にされていない。これらの疾患において、ＬＥＣＴ２が生体内で多様で重要な作用に関与しているものと予想されるが、その本来の生体内での機能は、不明のままであった。このため、ＬＥＣＴ２の生体内での役割を解明することが急務の課題であった。そこで、この課題を究明するための絶好の実験材料として、ＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したモデル動物の作製が強く望まれていた。
【０００６】
上記の実情に基づき、本発明者らはＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したマウスを作製して、その生体内での機能を解析することによって、ＬＥＣＴ２の生理的な役割を直接明らかにすることを可能にするとともに、ＬＥＣＴ２の関与する種々の病態の解明あるいは治療法の研究のために、遺伝的背景の明確な動物モデルを提供しようとするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者らは近年開発されてきたジーンターゲッティング法（文献９）を用いて鋭意研究を進め、ＬＥＣＴ２遺伝子を特定のベクターと相同的組換えを起こさせることにより、ＬＥＣＴ２遺伝子を欠損した動物を作製することに至り、本発明を完成した。即ち、本発明は、遺伝子の全部または一部が、欠損または他の遺伝子により置換されており、実質的にＬＥＣＴ２をコードする遺伝子を含まないマウスに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明により作製されるマウスは、ＬＥＣＴ２遺伝子の全部又は一部が、欠損又は他の遺伝子により置換されており、実質的にＬＥＣＴ２をコードする遺伝子を含まないことを特徴とする。本発明のマウスには、ＬＥＣＴ２遺伝子をホモで欠損しているマウス、ヘテロで欠損しているマウスのいずれも含まれる。
【０００９】
本発明マウスの作製方法を説明する。
〔マウスＬＥＣＴ２遺伝子ＤＮＡのターゲティングベクターの作製〕
ＬＥＣＴ２遺伝子の機能を人為的に欠損させたマウスを得るためには、マウス由来のＬＥＣＴ２遺伝子をクローニングし、ＬＥＣＴ２の遺伝子に欠損や挿入あるいは他の遺伝子との置換などの変異を起こした後に、マウスにもどす方法が用いられる。ＬＥＣＴ２遺伝子のクローニングは、例えばマウス肝臓の細胞から染色体ＤＮＡを抽出し、常法に従ってＤＮＡライブラリーを作製し、これをすでに決定されているマウスＬＥＣＴ２遺伝子（文献１０）の塩基配列を基に作製した当該遺伝子のポリメラーゼ鎖状反応（ＰＣＲ）増幅断片を用いてスクリーニングすればよい。
【００１０】
ＬＥＣＴ２遺伝子の機能の欠損には、ＬＥＣＴ２遺伝子の全体あるいは、いずれかの部位を欠失させればよく、または、いずれかの部位に他の遺伝子を挿入させてもよい。他の遺伝子を挿入させる場合、ＬＥＣＴ２遺伝子の欠損を検出するためのマーカー遺伝子としても機能できる他の遺伝子を挿入することが好ましく、この様な遺伝子としてはジェネティシン（Ｇ４１８）耐性によって選択できるネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）およびガンシクロビル耐性によって選択できるヘルペス単純ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）やジフテリアトキシンＡ断片遺伝子（ＤＴ−Ａ）等が用いられる。これらの遺伝子の挿入は試験管内で常用のＤＮＡ組換え技法により行うことができる。本実施にあたっては、ＬＥＣＴ２遺伝子の全エキソンあるいは一部の遺伝子機能が欠失しており、その欠失領域に選択マーカー遺伝子が挿入されることが望ましい。
【００１１】
より具体的には、マウス染色体ＤＮＡライブラリーにＬＥＣＴ２遺伝子の部分配列をプローブとしてハイブリダイズし、陽性クローンを得る。これをベクターに挿入後、制限酵素で消化して特定のエキソンを含む染色体ＤＮＡをサブクローニングする。次いで、ＬＥＣＴ２遺伝子の構造を破壊しかつポジティブ／ネガティブセレクションを行うために、ＮｅｏやＤＴ−Ａなどのマーカー遺伝子を挿入してターゲティングベクターを作製する。
【００１２】
〔ジーンターゲティングによるマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）でのＬＥＣＴ２遺伝子変異〕
次に、こうして得られたターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、ＥＳ細胞中のＬＥＣＴ２遺伝子と相同的組換えを行う。ＥＳ細胞は株化されたものであり、多分化能を保持し、しかも培養細胞として維持、継代が可能な細胞である。ターゲティングベクターの挿入は、例えば常用の電気パルス法やアグリゲーション法により行うことができる。この相同的組換えにおいては、ＥＳ細胞内のＬＥＣＴ２遺伝子のＤＮＡとターゲティングベクターの対応する領域との間で組換えが生じ、ターゲティングベクター中に挿入されていたマーカー遺伝子がＥＳ細胞の染色体ＬＥＣＴ２遺伝子に挿入される。この結果、ＥＳ細胞はＬＥＣＴ２遺伝子を欠失し、同時にマーカー遺伝子を得る。このマーカー遺伝子に基づいてＬＥＣＴ２遺伝子を欠失したＥＳ細胞を得ることができる。より具体的には、ターゲティングベクターとＥＳ細胞を混合し、遺伝子導入を行う。次いで、Ｇ４１８等で選択培養を行う。
【００１３】
〔ＬＥＣＴ２遺伝子変異ＥＳ細胞によるキメラマウスの作製〕
このＥＳ細胞をマウスの胚盤胞に注入し、さらに偽妊娠マウスの子宮内に移植して産仔を得る。次に、こうして得たキメラマウスを適当な系統のマウスと交配することにより産仔を得る。キメラ動物の生殖細胞が、ＬＥＣＴ２遺伝子が欠損されている相同的組換え体に由来すればＬＥＣＴ２遺伝子を欠損した動物を得ることができる。
【００１４】
〔ホモ変異マウスの作製〕
移植によって得られたキメラ動物を、目的とする系統のマウスと交配させ産仔を得る。キメラマウスの生殖細胞がＥＳ細胞に由来しているか、交配マウスの系統に由来しているかは、得られた産仔の適当な特質によって決定できる。ＬＥＣＴ２遺伝子のヘテロ変異マウス同士を交配し、産仔のＬＥＣＴ２遺伝子をサザンハイブリダイゼーションによって確認し、目的物であるＬＥＣＴ２遺伝子ホモ変異マウス、即ちＬＥＣＴ２遺伝子の機能が欠損したマウスを得る。本発明の動物の飼育方法は特別な方法を用いる必要はなく、一般の動物と同様な方法により飼育することができる。
【００１５】
【実施例】
以下に、アグリゲーション法によるキメラマウスの作製法（文献１１、１２）による実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の限定を意図するものでない。
【００１６】
実施例１
〔マウスゲノム遺伝子のクローニングとターゲティングベクターの構築〕
マウスゲノムライブラリーは、１２９／ＳｖＪマウスの肝臓より作製されたものを用いた。マウスＬＥＣＴ２のノーマルタイプｃＤＮＡをプローブとして用い、マウスＬＥＣＴ２遺伝子および両側の配列を含む染色体ＤＮＡをクローニングした。次いでＬＥＣＴ２遺伝子の両側の配列をサブクローンし、ポジティブ／ネガティブセレクションを行うためにＮｅｏおよびＤＴ−Ａを用いて、ターゲティングベクターを作製した（図１）。より具体的には制限酵素ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ断片（７．７kb、遺伝子の５′側）とＡａｔＩ−ＳｃａＩ断片（１．４kb、遺伝子の３′側）を相同領域として用い、ＬＥＣＴ２遺伝子の位置にＮｅｏを５′側にＤＴ−Ａを選択マーカーとして挿入し、ターゲティングベクターを作製した。相同的組み換えが起こった場合には、マウスＬＥＣＴ２遺伝子全長がＮｅｏカセット（１．６kb）に置き換わることになる。
【００１７】
実施例２
〔ＥＳ細胞の調製およびその培養方法〕
実施例１により調製したマウスＬＥＣＴ２遺伝子ＤＮＡのターゲティングベクターを導入する細胞として、１２９系マウス胚盤胞由来のＥＳ細胞Ｅ１４株の亜株であるＥ１４．１株（文献１３）を用いた。ＥＳ細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１５％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．１mMの２−メルカプトエタノール、０．３５％のグルコース、および０．０５８％のＬ−グルタミンを添加した培養液を用いた。また、ＥＳ細胞のフィーダー細胞として用いるマウス胚繊維芽細胞（ＥＦ）の培養には、ＤＭＥＭに７％のＦＢＳ、０．３５％のグルコース、および０．０５８％のＬ−グルタミンを添加した培地を用いた。ＥＦ細胞は３−４日間隔で継代を行い、以下の様にマイトマイシン（ＭＭＣ）で処理してフィーダー細胞として用いた。ほぼコンフルエント状態に達したＥＦ細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴＥ）溶液で処理して細胞を剥離した。次いで、遠心後、細胞を２−４ｘ１０⁴個／cm²に調製し、ＭＭＣを加えた。この細胞をゼラチンでコートしたフラスコ、シャーレあるいはマイクロプレート上に分注した。ＥＳ細胞の継代は、３７℃で５分間、ＴＥ溶液で処理後、ピペッティングによって単一細胞にまで分散させ、フィーダー細胞層上に播種することにより行った。培養液は２日に一度の間隔で交換した。
このＥＳ細胞にターゲティングベクターを須藤、岩倉の方法（文献１２）により導入した。１×１０⁷個のＥＳ細胞と２０μgのターゲティングベクターを混ぜ、Shimadzu GTE-1（２５０V、５００μF、electrode distance ０．２cm）を用いた電気パルス法により細胞にＤＮＡを導入した。５−７m秒電気パルスをかけた細胞を、フィーダー細胞をコートした１０cm径のシャーレに播種した。電気パルスをかけてから２４時間経過した後、Ｇ４１８を２５０μg/mlの濃度になるように添加した。約１０日後、現れてきた９６個コロニーを２４穴のプレートに移し、さらに培養を続け、充分増殖したところで細胞を集めた。半分は液体窒素で保存し、残り半分をサザンハイブリダイゼーションによる組換え体検出のための染色体ＤＮＡ抽出に使用した。ＤＮＡ抽出は、常法に従った。こうして、相同的組換え体したＥＳ細胞を含むコロニーを得た。
【００１８】
実施例３
〔相同的組み換えを起こした細胞の選択〕
相同的組換えを起こしたＥＳ細胞の検出は、ＰＣＲおよびサザンハイブリダイゼーションにより行った。ＰＣＲのプライマーとしては図１のようにターゲティングベクターの３′端の外側の塩基配列、およびＮｅｏ遺伝子の内部の塩基配列を用いた。ＰＣＲで陽性だった２クローンについてゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、あるいはＢｌｎＩ／ＸｈｏＩで切断し、図１のプローブによりサザンハイブリダイゼーションを行い計画通りの組換えが起こってるかを確認した。その結果、１クローンのみに正しい組換えが起こってることを確認した。得られた相同的組換え体のクローン数は、Ｇ４１８耐性のクローン３２０個のうち１個であった。
【００１９】
実施例４
〔キメラマウスの作製とミュータントマウスの選別〕
Ｃ５７ＢＬ／６系マウスの交尾後３．５日目に卵管より胚盤胞を取得し、タイロード液にて相同的組換えＥＳ細胞と凝集させた。それを擬妊娠させたＩＣＲマウスの子宮内に戻した。この仮親から娩出される産仔は、胚盤由来のＣ５７ＢＬ／６系マウス由来の細胞とＥＳ細胞が由来する１２９系マウス由来の細胞からなるキメラであり、そのキメリズムの良し悪しは毛色で判断した。１２９系マウス由来の細胞の寄与率が高いほどキメラマウスは野生色あるいは白色の割合が上がり、毛色は黒色・野生色と白色のまだら模様となる。生まれたキメラマウスの中でＥＳ細胞の寄与が大きいと考えられる体毛の黒色が淡くなったマウス７匹を選び、Ｃ５７ＢＬ／６系マウスと交配を行った。生まれた３３匹のアグーチ色の毛色を持つマウスについて、尻尾よりＤＮＡを抽出し、常法によりサザンハイブリダイゼーションで遺伝子型の解析を行った結果、ＬＥＣＴ２遺伝子がヘテロに変異したマウス〔ＬＥＣＴ２（＋／−）マウス〕を１７匹確認した。さらに、ヘテロ変異の遺伝子座をもつマウス同士を交配し、ホモでＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したマウス〔ＬＥＣＴ２（−／−）マウス〕を取得した。
【００２０】
実施例５
〔ＬＥＣＴ２遺伝子欠損マウスの遺伝子の発現量〕
両遺伝子座ともにＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したマウスについて、ノザンハイブリダイゼーションでＬＥＣＴ２ｍＲＮＡの発現の有無を調べた。ＬＥＣＴ２（−／−）マウス、ＬＥＣＴ２（＋／−）マウス、および対照として野生型マウス〔ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウス〕について肝臓から全ＲＮＡを常法により抽出した。ＬＥＣＴ２遺伝子を欠損したマウスについて、ノザンハイブリダイゼーションでＬＥＣＴ２ｍＲＮＡの発現の有無を調べた。マウスＬＥＣＴ２ｃＤＮＡ４５０−ｂｐをプローブにしてノザンハイブリダイゼーションを行った。ＬＥＣＴ２（−／−）マウスではＬＥＣＴ２ｍＲＮＡは全く検出されなかった（図２）。また、ＬＥＣＴ２（＋／−）マウスではＬＥＣＴ２ｍＲＮＡの発現量はＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスの約半分量に低下していた。
【００２１】
実施例６
ＬＥＣＴ２遺伝子欠損マウスは正常に誕生したことから、マウスの発生について必須の因子ではないと考えられる。また、体重も野生型マウスと変わらなかった。
【００２２】
実施例７
ＬＥＣＴ２遺伝子欠損が生殖に及ぼす影響を調べるために、オス、メスともにＬＥＣＴ２遺伝子を欠いたマウスを交配させた。その結果、次世代のマウスは正常に誕生したことから、ＬＥＣＴ２遺伝子欠損は生殖には影響しなかった。
【００２３】
実施例８
ＬＥＣＴ２遺伝子の欠損がもたらす生体機能の変化を調べるため、まず、血液学的検査を行った。ＬＥＣＴ２（−／−）マウスおよびＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスの全血を採取し、血液検査を行った。その結果、ＬＥＣＴ２（−／−）において、白血球数がＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスのそれよりも低かった。それ以外の血球数や各種血清マーカーの値については、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスとＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスでは顕著な差は見られなかった（表１）。
【００２４】
【表１】

【００２５】
実施例９
〔ミュータントマウスの臓器像〕
ＬＥＣＴ２遺伝子の欠損がもたらす生体機能の変化を調べるため、まず各種臓器の組織染色を行ったところ、肝臓では、肝臓の実質細胞が、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により細胞内が弱く染色され、また、複数の核の存在が認められた（表２）。しかし、肝臓以外には顕著な疾患組織像は認められなかった。
【００２６】
【表２】

【００２７】
実施例１０
〔ミュータントマウスの肝臓機能〕
肝臓の組織像についてしらべた。ＬＥＣＴ２産生臓器である肝臓においては、野生型マウスと比べて肝細胞の大きさの不同化、２核の細胞や萎縮した核を持つ細胞の割合が高くなっていた。この結果はＬＥＣＴ２（−／−）マウスでは肝細胞の増殖、およびそれに伴う細胞死の制御が正常に保たれていないことを示した（図３）。
【００２８】
実施例１１
ＬＥＣＴ２遺伝子欠損マウスで比較的多く観察された、萎縮した核を持つ肝細胞がアポトーシスを起こした細胞かどうかをＴＵＮＥＬ（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling）法（文献１４）で検討した。本法により、アポトーシスの生化学的な指標とされるＤＮＡ断片化を組織化学的に検出することが出来る。その結果、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスでは、ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスに比べてアポトーシス細胞の数が２〜５倍多くなっていることが確認された（図４）。この結果から、ＬＥＣＴ２遺伝子欠損マウスの肝臓では、肝細胞の代謝回転の異常が起こっていることが考えられる。
【００２９】
実施例１２
ＬＥＣＴ２（−／−）マウスが肝細胞のアポトーシスを誘発していることを示したことは、ＬＥＣＴ２が肝臓の細胞増殖に重要なサイトカインであることを意味している。
【００３０】
実施例１３
ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスとＬＥＣＴ２（−／−）マウスとの細胞増殖・アポトーシスの相違から、肝臓の細胞増殖・アポトーシス機構に、ＬＥＣＴ２がどのように関与しているかに興味が持たれた。
【００３１】
【発明の効果】
以上のとおり、本発明はＬＥＣＴ２遺伝子とＮｅｏ遺伝子を置換すること等によって、ＬＥＣＴ２遺伝子の機能が欠損しているマウスを提供する。このマウスは、ＬＥＣＴ２の関与する肝炎、肝癌、肝硬変、肝臓再生、免疫系疾患、リウマチ、骨粗鬆症、骨代謝異常症、腎炎、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流障害、呼吸器系、循環器系機能障害および脳障害の病態生理、原因の解明、予後の判定および治療法の開発等の研究のための実験動物として有用である。
【００３２】
肝炎、肝癌、肝臓再生、リウマチ、骨代謝異常、脳障害、腎炎、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流傷害などの患者の予後は必ずしも良好ではなく、治療期間中に死亡する患者も多い。そこで、より効果的なこれらの疾患の治療薬の開発が強く望まれている。新薬の評価方法として最も望ましい方法は、in vivoで評価することであり、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスはこの目的のために有効利用できると期待できる。
【００３３】
ＬＥＣＴ２や炎症性サイトカインが、肝炎、肝癌、肝臓再生、リウマチ、骨代謝異常、脳障害、腎炎、血管炎、動脈硬化、虚血再灌流傷害などの引き金や、悪性化、増悪化に関与している可能性がある。しかし、ＬＥＣＴ２がこれらの疾患に関わっていることを個体レベルで証明された実例はない。本発明のＬＥＣＴ２（−／−）マウスは、ＬＥＣＴ２と炎症性疾患や上記疾患との因果関係を個体レベルで解析し、また炎症性疾患や上記疾患の発症機構の究明、およびそれら疾患の治療薬を開発するのに有用である。
【００３４】
〔文献〕
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【図面の簡単な説明】
【図１】マウスＬＥＣＴ２遺伝子欠損用ターゲティングベクターの構築と各種プローブの対応部位を示す図である。マウスＬＥＣＴ２遺伝子構造と置換遺伝子の構造をしめす。野生型（Wild-type、ＬＥＣＴ２（＋／＋））、ターゲティングベクター（Targeting vector）およびＬＥＣＴ２遺伝子の相同的組換え体（Mutant allele）の模式図を示す。また、スクリーニング用のＰＣＲプライマーならびに５′プローブと３′プローブの位置を示す。また、各制限酵素サイトを示す。
【図２】肝臓中の肝細胞におけるｍＲＮＡの発現を比較するために、マウスＬＥＣＴ２ｃＤＮＡをプローブとして行ったノーザンハイブリダイゼーション分析の結果を示す電気泳動写真である。また、ＧＡＰＤＨ（グリセロアルデヒド脱水素酵素）をプローブとして行ったノーザンハイブリダイゼーションは、全ＲＮＡ量を比較するための対照実験である。ＷＴ：野生型（Wild-type、ＬＥＣＴ２（＋／＋））マウスの肝臓から抽出したｍＲＮＡ，ＫＯ：欠損型（Knock-out、ＬＥＣＴ２（−／−））マウスの肝臓から抽出したｍＲＮＡ，数値は、マウスの番号を示している。
【図３】肝臓の組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した顕微鏡像写真を示す。左図は、ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスの組織染色の顕微鏡写真を示し、右図は、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスの組織染色の顕微鏡写真を示す。ＬＥＣＴ２（−／−）マウスでは、細胞内の染色が薄く、２核の細胞が多い。
【図４】肝臓の細胞のアポトーシスを示す顕微鏡写真である。左図は、ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスのＴＵＮＥＬ染色の顕微鏡写真を示し、右図は、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスのＴＵＮＥＬ染色の顕微鏡写真を示す。アポトーシスを起こしている細胞は、茶色に染色（矢印）されており、ＬＥＣＴ２（＋／＋）マウスでは存在しないが、ＬＥＣＴ２（−／−）マウスでは、視野に数個の茶色陽性の細胞が観察される。

Claims

相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を使用し、アグリゲーション法によって作製される好中球走化因子ＬＥＣＴ２遺伝子の機能が欠損しているマウスであって、ＬＥＣＴ２遺伝子の機能が欠損していないマウスに比較して、白血球数が低下していることおよび肝細胞におけるアポトーシスが増加していることを特徴とする、マウス。
相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を使用し、アグリゲーション法によって好中球走化因子ＬＥＣＴ２遺伝子の機能を欠損させる工程を含む、ＬＥＣＴ２遺伝子の機能が欠損していないマウスに比較して、白血球数が低下していることおよび肝細胞におけるアポトーシスが増加していることを特徴とするマウスの製造方法。