ES2209650B2 - Mamiferos no humanos mutantes deficientes en receptores sigma y sus aplicaciones. - Google Patents
Mamiferos no humanos mutantes deficientes en receptores sigma y sus aplicaciones.Info
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Abstract
Mamíferos no humanos mutantes deficientes en receptores sigma y sus aplicaciones. El genoma del mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, contiene una mutación que comprende una disrupción en un gen de un receptor Sigma endógeno, en donde dicha disrupción génica da lugar a un mutante que carece de niveles detectables de receptor Sigma endógeno. El mutante puede ser utilizado como animal control para ensayos in vivo así como fuente de células que pueden ser utilizadas en ensayos in vitro. Los mutantes deficientes en el receptor Sigma-1 pueden utilizarse como modelos para estudiar in vivo desórdenes del sistema nervioso central, alteraciones de la memoria, condiciones de estrés y adicción a drogas, procesos de analgesia y neuroprotección. Los mutantes deficientes en el receptor Sigma- 2 pueden utilizarse para estudiar herramientas, diagnósticas o terapéuticas, para combatir el cáncer y/o procesos degenerativos y/o para el diseño de compuestos capaces de prevenir, reducir o aliviar la patología secundaria asociada a la administración de agentes neurolépticos.
Description
Mamíferos no humanos mutantes deficientes en
receptores Sigma y sus aplicaciones.
La invención se refiere a mamíferos no humanos
mutantes deficientes en receptores Sigma endógenos, a células
derivadas de dichos animales mutantes, y a sus aplicaciones. La
invención también se refiere a un vector de recombinación homóloga
con selección positiva-negativa útil para la
generación de dichos mamíferos no humanos mutantes deficientes en
receptores Sigma endógenos.
Los receptores Sigma son unos sitios de unión con
afinidad por distintos ligandos, algunos de los cuales son
fármacos con distinta actividad. Inicialmente, el interés por los
receptores Sigma fue debido a su potencial papel en las acciones de
los fármacos anti-psicóticos debido a que mostraban
elevada afinidad por agentes neurolépticos típicos, tales como el
haloperidol u otros compuestos que causan actividad psicomimética,
por ejemplo, N-alilnonnetazocina
(SKF-10047). Posteriormente, se ha encontrado que
dichos receptores Sigma pueden estar implicados en otros
mecanismos fisiológicos.
Se han identificado dos subclases de receptores
Sigma, denominadas receptor Sigma de tipo 1 y receptor Sigma de
tipo 2, diferenciables por su perfil farmacológico, función y
tamaño molecular. Ambos tipos muestran de alta a moderada afinidad
por agentes neurolépticos típicos, en particular, haloperidol. Sin
embargo, los receptores Sigma de tipo 1 exhiben una elevada
afinidad por (+)-pentazocina,
(+)-SKF10047 y otros
(+)-benzomorfanos, mientras que los receptores Sigma
de tipo 2 muestran baja afinidad por dichos compuestos. Los
receptores Sigma de tipo 1 tienen un peso molecular típico de 25
kDa, mientras que el peso molecular de los receptores Sigma de tipo
2 es de 18-21 kDa (determinado en ambos casos por
marcaje de fotoafinidad).
El receptor Sigma de tipo 1, en adelante receptor
Sigma-1, es un receptor de tipo no opiáceo, que se
expresa en multitud de tejidos adultos de mamíferos (sistema
nervioso central, ovario, testículo, placenta, glándula adrenal,
bazo, hígado, riñón, tracto gastrointestinal, etc.) y también a lo
largo del desarrollo embrionario desde sus fases más tempranas y
que, aparentemente, está implicado en un elevado número de funciones
fisiológicas. Se ha descrito su elevada afinidad por distintos
fármacos, tales como SKF-10047,
(+)-pentazocina, haloperidol y rimcazole, entre
otros, ligandos conocidos con actividad analgésica, ansiolítica,
antidepresiva, antiamnésica, antipsicótica, y neuroprotectora, por
lo que el estudio del receptor Sigma-1 es de gran
interés en farmacología debido a su posible papel fisiológico en
procesos relacionados con la analgesia, ansiedad, adicción,
amnesia, depresión, esquizofrenia, estrés, neuroprotección y
psicosis [1], [2] y [3]. Sin embargo, el papel real que desempeña el
receptor Sigma-1 sigue siendo todavía desconocido
y enigmático. De hecho, se desconoce su ligando endógeno concreto,
aunque se cree que interactúa con hormonas esteroides endógenas,
tales como la progesterona y la testosterona.
Se ha descrito la secuencia de cDNA que codifica
para el receptor Sigma-1 en conejillos de indias,
la secuencia de cDNA y el gen del receptor Sigma-1
en humanos, la secuencia de cDNA y el gen del receptor
Sigma-1 en ratones, y la secuencia de cDNA que
codifica para el receptor Sigma-1 en ratas.
El primer trabajo que consiguió obtener una
secuencia genética codificante para un receptor
Sigma-1 se debe a Hanner y colaboradores [4]. En ese
trabajo, utilizando las características específicas de unión de
este receptor a determinados compuestos marcados radiactivamente,
por ejemplo, (+)[^{3}H]Pentazocina, se obtuvo primero una
proteína y, posteriormente, un clon de cDNA que codificaba para la
misma. El clon se aisló de una genoteca de cDNA preparada a partir
de mRNAs de hígado de conejillo de indias (C. porcellus)
[cDNA de 1857 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de
acceso: Z66537]. Seguidamente, basándose en dicha secuencia de
cDNA, diferentes grupos de trabajo procedieron a clonar mediante
homología de secuencias, sucesivamente, el cDNA en humanos [5]
(cDNA de 1653 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de
acceso: HSU75283), el cDNA y el gen de ratón [6] (cDNA de 1567
pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF030198;
gen de 6973 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de
acceso: AF030199), el cDNA de rata [7] (cDNA de 1582 pares de
bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF004218) y el gen
en humanos [8] (gen descrito en tres fragmentos de DNA que
contienen, respectivamente, el promotor (3589 pares de bases, Base
de datos GenBank, Código de acceso: AF001975), el exon 1, 2 y 3
(757 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso:
AF001976) y el exon 4 (1630 pares de bases, Base de datos GenBank,
Código de acceso: AF001977)).
El análisis de la homología existente entre
dichas secuencias, tanto a nivel de nucleótidos como de
aminoácidos, ha puesto de manifiesto el elevado grado de homología
existente entre ellas. El conocimiento de dichas secuencias puede
ser utilizado en el desarrollo de modelos animales destinados a
estudiar la fisiología y patología asociada con alteraciones en
receptores Sigma y el efecto de fármacos potencialmente útiles para
el tratamiento o prevención de patologías asociadas con
alteraciones en dichos receptores o en las que están implicadas
dichos receptores.
El receptor Sigma de tipo 2, en adelante receptor
Sigma-2, es un receptor que se expresa en multitud
de tejidos adultos de mamíferos (sistema nervioso, inmune,
endocrino, hígado. riñón, etc.). Los receptores
Sigma-2 pueden ser los componentes de una nueva
ruta de apoptosis que podría jugar un importante papel en la
regulación de la proliferación celular o en el desarrollo celular.
Esta ruta parece estar constituida por receptores
Sigma-2 unidos a membranas intracelulares,
localizadas en orgánulos que almacenan calcio, por ejemplo,
retículo endoplásmico y mitocondrias, que poseen, además, la
capacidad de liberar calcio a partir de dichos orgánulos. Las
señales de calcio pueden ser utilizadas en la ruta de señalización
de las células normales y/o en la inducción de apoptosis.
Los agonistas de los receptores
Sigma-2 inducen cambios en la morfología celular,
apoptosis en diversos tipos de líneas celulares y regulan la
expresión de mRNA de la p-glicoproteína, por lo que
son potencialmente útiles como agentes antineoplásicos en el
tratamiento del cáncer. De hecho, se ha observado que agonistas de
receptores Sigma-2 inducen apoptosis en líneas
celulares de tumores de mama resistentes a agentes antineoplásicos
comunes que dañan al DNA. Además, agonistas de receptores
Sigma-2 potencian los efectos citotóxicos de dichos
compuestos antineoplásicos a concentraciones en las que dicho
agonista no es citotóxico. Por tanto, los agonistas de los
receptores Sigma-2 pueden ser utilizados como
agentes antineoplásicos a dosis que inducen apoptosis o bien a
dosis sub-tóxicas, en combinación con otros
antineoplásicos, para revertir la resistencia al fármaco
permitiendo de este modo el empleo de dosis más bajas del agente
antineoplásico y reduciendo consecuentemente sus efectos adversos.
Los agonistas de los receptores Sigma-2 pueden
utilizarse, además, en el diagnóstico por imagen del cáncer como
agentes para la visualización no invasiva de tumores y sus
metástasis utilizando técnicas de diagnóstico por imagen, por
ejemplo, SPECT o PET. Por tanto, los receptores
Sigma-2 constituyen unas dianas muy interesantes
para herramientas con las que combatir el cáncer.
Los antagonistas de los receptores
Sigma-2 pueden prevenir los efectos secundarios
motores irreversibles causados por los agentes neurolépticos
típicos. De hecho, se ha comprobado que antagonistas de los
receptores Sigma-2 pueden ser útiles como agentes
para mejorar los efectos debilitantes de la disquinesia tardía que
aparece en los pacientes como consecuencia del tratamiento crónico
de la psicosis con fármacos antipsicóticos típicos, por ejemplo,
haloperidol. Los receptores Sigma-2 también parecen
estar implicados en ciertos desórdenes degenerativos en donde el
bloqueo de dichos receptores podría ser útil. Para más información
sobre los receptores Sigma-2 véase el artículo de
W.D. Bowen [3].
Los receptores Sigma-2 parecen
estar implicados en numerosas funciones fisiológicas; no obstante,
al igual que ocurre con los receptores Sigma-1, el
papel real que desempeñan los receptores Sigma-2 no
es totalmente conocido, por lo que existe la necesidad de
profundizar en el conocimiento de los mismos. Una alternativa para
contribuir al conocimiento de las funciones fisiológicas en las que
están implicados dichos receptores Sigma-2
consiste en el desarrollo de modelos animales destinados a estudiar
la fisiología y patología en la que pueden estar implicados dichos
receptores y el efecto de fármacos potencialmente útiles para el
tratamiento y prevención de patologías en las que están implicados
dichos receptores.
La manipulación genética de mamíferos permite
obtener animales transgénicos que expresen un determinado gen o
que, por el contrario, tengan un gen inactivado mediante una
mutación específica (animales "knockout" o mutantes). En ambos
casos es evidente el potencial que representa para el diseño de
modelos experimentales en animales de laboratorio que sirvan para
analizar la función, in vivo, de un determinado gen.
La tecnología "knockout" para la generación
de animales mutantes está bien establecida y ha sido objeto de
numerosas publicaciones. A modo ilustrativo, pueden citarse las
patentes norteamericanas US 5.464.764, US 5.487.992, US 5.627.059,
US 5.631.153, US 6.194.633, US 6.207.876, US 6.239.326, US
6.245.963, US 6.245.965 y US 6.252.132, entre otras.
La no expresión de un gen puede conferir un nuevo
fenotipo a un animal mutante. Dependiendo del gen no expresado por
dicho animal, éste puede hacerse más o menos susceptible a una
alteración patológica determinada. Tales animales mutantes son
modelos valiosos para el estudio in vivo del papel que
desempeña el gen así como para el estudio de compuestos que
potencialmente podrían ser útiles en el tratamiento o prevención de
patologías relacionadas con la expresión nula o ineficaz del
producto de dicho gen.
Aunque se ha descrito que los receptores Sigma
muestran afinidad por compuestos con distintas actividades
farmacológicas actualmente se desconoce el papel real que
desempeñan dichos receptores, por lo que existe la necesidad de
generar modelos animales para estudiar in vivo el papel
desempeñado por los receptores Sigma endógenos. Un animal mutante,
deficiente en receptores Sigma endógenos, ayudaría a definir el
papel que desempeñan in vivo dichos receptores y permitiría
el diseño y evaluación de compuestos potencialmente interesantes
para el tratamiento de procesos relacionados con la expresión nula
o ineficaz de dichos receptores Sigma. La invención proporciona una
solución a dicha necesidad existente.
La invención se relaciona con un mamífero no
humano mutante que tiene células somáticas y germinales en las que,
al menos un alelo y, preferentemente, ambos alelos, de un gen de
un receptor Sigma endógeno contienen un DNA exógeno que ha sido
insertado en dicho gen de manera que dicho mamífero no humano
mutante no expresa el producto del gen del receptor Sigma
endógeno. Dicho receptor Sigma puede ser cualquier receptor Sigma,
por ejemplo, el receptor Sigma-1 o el receptor
Sigma-2. En una realización particular, el DNA
exógeno insertado en el alelo del gen Sigma endógeno comprende un
marcador de selección positiva.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
relaciona con un mamífero no humano, viable, cuyo genoma posee el
gen de un receptor Sigma endógeno mutado y carece de niveles
detectables de RNA mensajero o proteínas para dicho receptor Sigma
endógeno. En una realización particular, dicho mamífero no humano
mutante es un animal no humano perteneciente a la clase de los
mamíferos, por ejemplo, un ratón mutante, deficiente en el
receptor Sigma-1 endógeno. Los ratones deficientes
en el receptor Sigma-1 son viables, fértiles y no
manifiestan, en condiciones de laboratorio, ningún síntoma que los
diferencie de ratones genéticamente similares pero carentes de
dicha mutación. En condiciones de estabulación controlada los
ratones mutantes en el receptor Sigma-1 son
indistinguibles de sus hermanos de camada salvajes. La función (o
disfunción) del receptor Sigma-1 se ha postulado
que puede estar asociada a desórdenes del sistema nervioso central,
tales corno la ansiedad, depresión, esquizofrenia o psicosis. El
receptor Sigma-1 parece tener actividad
anti-amnésica y neuroprotectora y se le ha
relacionado, además, con la percepción y transducción de la
analgesia, adicción o estrés. Para estas situaciones, que en
humanos pueden derivar en condiciones patológicas, el ratón
deficiente en el receptor Sigma-1 podría resultar
útil tanto para el estudio de las mismas como para la validación y/o
el desarrollo de fármacos diseñados para regular o paliar los
efectos de las alteraciones y condiciones patológicas en las que
están implicados dichos receptores Sigma-1.
En otra realización particular, dicho mamífero no
humano mutante es un animal no humano perteneciente a la clase de
los mamíferos, por ejemplo, un ratón mutante, deficiente en el
receptor Sigma-2 endógeno. Los receptores
Sigma-2 parecen ser dianas muy interesantes para el
diseño de herramientas, tanto diagnósticas como terapéuticas, para
combatir el cáncer y/o compuestos capaces de prevenir, reducir o
aliviar los efectos secundarios motores provocados en pacientes
sometidos a tratamiento continuado con agentes neurolépticos. Por
tanto, los ratones deficientes en receptores Sigma-2
podrían resultar útiles en la validación y/o desarrollo de
fármacos diseñados para el diagnóstico o tratamiento del cáncer,
en la validación y/o desarrollo de. fármacos diseñados para la
prevención y/o tratamiento de procesos degenerativos, así como en la
validación y/o desarrollo de fármacos para prevenir, reducir o
aliviar los efectos secundarios asociados con la administración
continuada de agentes neurolépticos a un paciente, en particular,
los efectos secundarios motores.
La mutación en el gen del receptor Sigma endógeno
presente en el genoma de una célula puede ser introducida por
recombinación homóloga en dicha célula entre un alelo del gen del
receptor Sigma endógeno y un vector de recombinación homóloga con
selección positiva-negativa que comprende unas
regiones de homología con sendas secuencias de nucleótidos
presentes en dicho gen del receptor Sigma endógeno, y selección de
los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección
positiva-negativa, los cuales se introducen en
embriones que posteriormente son implantados en hembras receptoras
para su adecuada gestación y se deja que se desarrollen a término.
Las quimeras capaces de transmitir eficazmente el genotipo de los
homólogos recombinantes a su descendencia a través de la línea
germinal se cruzan con mamíferos no humanos tipo salvaje para
obtener mutantes heterocigotos para la disrupción del gen del
receptor Sigma endógeno y, posteriormente, los mutantes
heterocigotos se cruzan entre sí para obtener mutantes
homocigotos, siguiendo una clásica segregación alélica de tipo
mendeliano.
En una realización particular, dicho mamífero no
humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, es un
mutante heterocigoto para dicha mutación, mientras que en otra
realización particular, dicho mamífero no humano mutante, es un
mutante homocigoto para dicha mutación.
La descendencia del mamífero no humano mutante
deficiente en un receptor Sigma endógeno constituye un aspecto
adicional de la presente invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
células aisladas a partir de dicho mamífero no humano mutante
deficiente en un receptor Sigma endógeno, las cuales pueden ser
propagadas y, opcionalmente, inmortalizadas. Dichas células pueden
ser heterocigotas, es decir. que contienen un alelo mutante y un
alelo tipo salvaje del gen del receptor Sigma endógeno o bien
homocigotos, es decir, que contienen los dos alelos mutantes del
gen del receptor Sigma endógeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa, útil para introducir una
disrupción funcional en un gen de un receptor Sigma, que
comprende: a) una primera región de homología, situada en el
extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica para un
marcador de selección positiva, en donde dicha primera región de
homología tiene una secuencia de nucleótidos que es
sustancialmente idéntica a una primera secuencia de un gen de un
receptor Sigma; b) una secuencia de nucleótidos que codifica para
un marcador de selección positiva; c) una segunda región de
homología, situada en el extremo 3' de dicha secuencia de
nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en
donde dicha segunda región de homología tiene una secuencia de
nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una segunda
secuencia de dicho gen del receptor Sigma, estando dicha segunda
secuencia del gen del receptor Sigma en una posición 3' respecto a
dicha primera secuencia del gen del receptor Sigma en un gen Sigma
endógeno tipo salvaje; y d) una secuencia de nucleótidos que
codifica para un marcador de selección negativa.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
una célula hospedadora en la que dicho vector de recombinación
homóloga con selección positiva-negativa ha sido
introducido por recombinación homóloga entre dicho vector y el
correspondiente gen del receptor Sigma endógeno de dicha célula
hospedadora, dando como resultado una disrupción funcional en dicho
gen del receptor Sigma endógeno. En una realización particular,
dicha célula hospedadora es una célula diferenciada que normalmente
expresa el producto del gen de un receptor Sigma o una célula
pluripotente indiferenciada e inmortal, tal como una célula
embrional ES (embryonic stem cell), establecida a partir de
la masa interna celular del embrión en la fase preimplantatoria
denominada blastocisto. En una realización concreta. dichas
células embrionales ES son células de ratón.
El mamífero no humano mutante de la invención
puede ser utilizado como modelo animal para estudiar in vivo
el papel desempeñado por los receptores Sigma endógenos así como
en el diseño y evaluación de compuestos químicos que podrían ser
potencialmente interesantes para el tratamiento de alteraciones
patológicas relacionadas con la expresión nula o ineficaz de los
productos de dichos genes, o en las que estuvieran involucrados
tales genes. Asimismo, dicho mamífero no humano mutante de la
invención podría ser utilizado como fuente de células para
cultivos celulares.
Aspectos adicionales de la presente invención
resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la
descripción y reivindicaciones.
La Figura 1 muestra esquemáticamente los primeros
clones de cDNA (Figura 1A) y genómicos (Figura 1B) obtenidos a
partir de métodos de RT-PCR o PCR, respectivamente.
En la Figura 1 A se representa el plásmido pmcS1/N, que
corresponde al fragmento cDNA de 1020 pares de bases, obtenido a
partir de los oligonucleótidos MS2/MS4 [véase la Tabla I].
La Figura 2 muestra el mapa de las secuencias
colindantes al gen del receptor Sigma-1 de ratón
obtenido a partir del solapamiento de los mapas correspondientes a
los cuatro clones de bacteriófagos (\lambdaDSg1, \lambdaSg2,
\lambdaSg5, \lambdaSg6) aislados con secuencias 5' y 3',
circundantes a la secuencia publicada del gen. Las abreviaturas de
los enzimas de restricción se describen en la Figura 3. Las cajas
negras corresponden a los cuatro exones del gen del receptor
Sigma-1 de ratón.
La Figura 3 muestra esquemáticamente los
diferentes plásmidos originales obtenidos con insertos de DNA
genómico correspondientes a secuencias situadas en la región 5' y
3' del gen del receptor Sigma-1 de ratón,
identificados para su posterior utilización en la construcción del
vector de recombinación homóloga. Se incluyen las abreviaturas de
los enzimas de restricción. Las cajas negras corresponden a los
cuatro exones del gen del receptor Sigma-1 de
ratón.
La Figura 4 muestra esquemáticamente la secuencia
del gen del receptor Sigma-1 de ratón a eliminar
utilizando procedimientos de recombinación homóloga en células ES
de ratón, usando la secuencia AF030199 como referencia. Las cajas
negras representan las zonas codificantes mientras que las cajas a
rayas representan las secuencias 5' y 3' transcritas pero no
traducidas.
La Figura 5 muestra esquemáticamente las
secuencias de homología 5' y 3', de 6,8 y 3,1 kb de tamaño
respectivamente, seleccionadas para su inclusión en el vector de
recombinación homóloga pHR53TK con objeto de inactivar el gen del
receptor Sigma-1 de ratón. Las abreviaturas de los
enzimas de restricción se describen en la Figura 3.
La Figura 6 ilustra la verificación de la
secuencia de DNA en la fusión transcripcional entre la región 5' de
homología del gen del receptor Sigma-1 de ratón y
los primeros nucleótidos del gen indicador lacZ, presente en
el vector pHM2.
La Figura 7 muestra el mapa del vector de
recombinación homóloga para la inactivación del gen del receptor
Sigma-1 de ratón en células embrionales ES. Se
indica el sitio de restricción único Sal I, que identifica
el punto de linearización del vector para su transfección en
células ES.
La Figura 8 ilustra el diseño experimental
utilizado para distinguir el alelo mutante del alelo salvaje del
gen del receptor Sigma-1 de ratón en análisis
mediante polimorfismos asociados a la digestión por enzimas de
restricción en análisis por Southern blot.
La Figura 9 muestra el resultado de los análisis
mediante Southern blot del DNA genómico correspondiente a
los 12 clones positivos de células ES recombinantes en donde se
muestran los polimorfismos esperados, tanto con la sonda 5' como con
la sonda 3'. Los carriles C y M representan DNA de células ES
control y un marcador de peso molecular.
La Figura 10 muestra el esquema de los tests
analíticos mediante PCR usado para establecer el genotipo de los
ratones portadores de alelos mutantes y salvajes del gen del
receptor Sigma-1.
La Figura 11 muestra los resultados de los
análisis mediante Southern blot de ratones homocigotos
salvajes (+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-)
mediante digestión de DNA genómico con los enzimas Hind III
y EcoR I e hibridación consecutiva con las sondas 5' y 3',
respectivamente. Los tamaños de los fragmentos de DNA corresponden
a los esperados según el diseño experimental (Figura 8).
La Figura 12 muestra los resultados de los
análisis mediante Northern blot de la expresión del gen del
receptor Sigma-1 (mSR1) en RNA total de hígado,
riñón, cerebro y corazón aislado de ratones homocigotos salvajes
(+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-). Se
incluye, en la zona inferior, la fotografía de los RNA ribosomales
utilizada como control de carga.
La Figura 13 muestra los resultados de los
análisis mediante Western blot de ratones homocigotos
salvajes (+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-)
ilustrativos de la expresión del gen del receptor
Sigma-1 en cerebro de ratón usando un anticuerpo
policlonal específico frente al receptor Sigma-1 de
ratón.
La Figura 14 ilustra la actividad (función) del
receptor Sigma-1 de ratón mediante un ensayo de
unión específica al ligando [^{3}H]-pentazocina.
La Figura 14A es una gráfica en la que se representa la unión
específica (ordenadas) de dicho ligando a receptores
Sigma-1 de ratones homocigotos salvajes,
heterocigotos y homocigotos mutantes en función de la
concentración de ligando (abscisas). La Figura 14B es una gráfica
que representa la relación "ligando unido/ligando libre"
(B/F) (ordenadas) frente a la concentración de ligando unido
(abscisas) en función del origen de dichos receptores
Sigma-1 (ratones homocigotos salvajes,
heterocigotos y homocigotos mutantes).
En un aspecto, la invención proporciona un
mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma
endógeno, en adelante mamífero no humano mutante de la invención,
cuyo genoma contiene una mutación que comprende una disrupción en un
gen de un receptor Sigma endógeno.
El término "mamífero no humano", tal como se
utiliza en esta descripción, incluye a cualquier animal no humano
perteneciente a la clase de los mamíferos, por ejemplo, ratones.
El término "mamífero no humano mutante de la invención", tal
como aquí se utiliza, se refiere a un mamífero no humano que ha
sido manipulado para que sea deficiente en un receptor Sigma
endógeno, es decir, que tiene una mutación que impide la expresión
normal del producto del gen de un receptor Sigma y, por tanto,
carece de niveles detectables de RNA mensajero o proteína para el
receptor Sigma endógeno. Dicha expresión "mamífero no humano
mutante de la invención" incluye tanto mutantes heterocigotos (es
decir, que contienen un alelo mutante y un alelo tipo salvaje del
gen del receptor Sigma endógeno) como homocigotos. En una
realización particular y preferida de esta invención, el mamífero
no humano mutante de la invención es un mutante homocigoto, es
decir, contiene los dos alelos mutantes del gen del receptor Sigma
endógeno dando como resultado una expresión no detectable del
producto génico.
El término "receptor Sigma", tal como aquí
se utiliza, se refiere al receptor Sigma de tipo 1
(Sigma-1) y al receptor Sigma de tipo 2
(Sigma-2).
La mutación presente en el genoma del mamífero no
humano de la invención puede estar presente tanto en las células
somáticas como en las células germinales del mamífero no humano
mutante de la invención. Ventajosamente, dicha mutación está
presente en las células germinales del mamífero no humano mutante
de la invención, confiriéndole de ese modo la capacidad de
transferir dicha mutación a su descendencia. Por tanto, en una
realización particular de esta invención, el mamífero no humano
mutante de la invención es fértil y puede transmitir la mutación
que posee a su descendencia.
La mutación presente en el mamífero no humano
mutante de la invención comprende una inserción, una deleción o una
mutación puntual que causa una disrupción funcional en un gen de
un receptor Sigma endógeno, dando lugar a un mamífero no humano
mutante deficiente en dicho receptor Sigma endógeno. En una
realización particular, el genoma del mamífero no humano mutante
de la invención comprende un transgén dentro de la mutación
introducida en el gen del receptor Sigma endógeno. A modo
ilustrativo, dicho transgén comprende un gen que codifica para un
marcador de selección positiva, por ejemplo, el gen de la
neomicina fosfotransferasa (neo) que codifica para la
resistencia a neomicina o cualquier otro de los marcadores de
selección positiva mencionados más adelante en relación con el
vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa proporcionado por esta
invención.
En una realización concreta de esta invención, se
proporciona un ratón mutante, deficiente en el receptor
Sigma-1 endógeno, homocigoto para el gen del
receptor Sigma-1 endógeno, fértil, cuyo genoma
contiene una disrupción en dicho gen que comprende el gen
neo.
El mamífero no humano mutante de la invención
puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende la
introducción de una disrupción funcional en un gen de un receptor
Sigma endógeno presente en el genoma de una célula. En una
realización particular, dicha disrupción funcional se introduce
mediante recombinación homóloga en un gen de un receptor Sigma
endógeno, por ejemplo, en el gen del receptor
Sigma-1 o en el gen del receptor
Sigma-2, presente en el genoma de una célula
apropiada, tal como, por ejemplo, una célula diferenciada que
normalmente expresa dicho gen del receptor Sigma, o una célula
embrional ES pluripotente, mediante la introducción de un vector de
recombinación homóloga con selección
positiva-negativa en dicha célula, y selección de
los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección
positiva-negativa, los cuales pueden utilizarse
para la generación de los mamíferos no humanos mutantes de la
invención tal como se describe más adelante. Alternativamente, el
mamífero no humano mutante de la invención puede obtenerse
mediante técnicas de cruzamiento clásico, o fertilización in
vitro, entre mamíferos no humanos mutantes de la invención que
actúen como progenitores.
En otro aspecto, la invención proporciona clones
recombinantes de células embrionales ES pluripotentes
heterocigotas, es decir, que poseen uno de los alelos génicos de
un receptor Sigma Hurtado. A partir de dichas células se pueden
obtener quimeras y, a partir de éstas, mamíferos no humanos
mutantes deficientes en un receptor Sigma. En una realización
particular, dichas células embrionales ES pluripotentes
heterocigotas son células de ratón a partir de las cuales se pueden
obtener quimeras y, a partir de éstas, ratones mutantes
deficientes en un receptor Sigma.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa, en adelante vector de la
invención, que comprende:
- a)
- una primera región de homología, situada en el extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha primera región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una primera secuencia de un gen de un receptor Sigma;
- b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva;
- c)
- una segunda región de homología, situada en el extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha segunda región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una segunda secuencia de dicho gen del receptor Sigma, estando dicha segunda secuencia del gen del receptor Sigma en una posición 3' respecto a dicha primera secuencia del gen del receptor Sigma en un gen Sigma endógeno tipo salvaje; y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección negativa.
El receptor Sigma puede ser cualquier receptor
Sigma, por ejemplo, un receptor Sigma-1 o un
receptor Sigma-2.
El vector de la invención puede ser utilizado
para introducir una disrupción funcional en un gen de un receptor
Sigma endógeno, por ejemplo, en el gen del receptor
Sigma-1 o en el gen del receptor
Sigma-2, contenido en el genoma de una célula
mediante la técnica de recombinación homóloga y selección
positiva-negativa de los recombinantes homólogos,
los cuales pueden ser utilizados en la obtención de mamíferos no
humanos mutantes deficientes en un receptor Sigma endógeno.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección positiva está flanqueada en sus posiciones
5' y 3' por unas secuencias de nucleótidos sustancialmente
idénticas a unas secuencias de dicho gen del receptor Sigma que
corresponden a dichas primera y segunda regiones de homología,
respectivamente. Tal como se utiliza en esta descripción, una
secuencia de nucleótidos es "sustancialmente idéntica" a una
secuencia de un gen de un receptor Sigma cuando dicha secuencia de
nucleótidos tiene la suficiente homología con la secuencia de
dicho gen del receptor Sigma como para permitir la recombinación
homóloga entre dicha secuencia de nucleótidos y una secuencia del
gen Sigma endógeno en una célula hospedadora. Típicamente, las
secuencias de nucleótidos de dichas primera y segunda regiones de
homología son, al menos, un 90%, preferentemente, al menos, un 95%
y aun más preferentemente, un 100% idénticas a las secuencias de
nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno a las que van
dirigidas para la recombinación homóloga. Ventajosamente, dichas
primera y segunda regiones de homología son isogénicas con respecto
al alelo endógeno al que van dirigidas (es decir, el DNA de dichas
regiones de homología se aísla a partir de células del mismo fondo
genético que el de la célula en el que se va a introducir el vector
de la invención). Dichas regiones de homología deben tener una
longitud suficiente como para que tenga lugar la recombinación
homóloga entre el vector de la invención y el gen del receptor Sigma
endógeno en una célula hospedadora cuando el vector de la
invención se introduce en dicha célula. Típicamente, la longitud
total de dichas regiones de homología es de, al menos, 5 kilobases
(kb), preferentemente de, al menos, 10 kb.
En una realización particular, dichas primera y
segunda regiones de homología se eligen de manera que sus
secuencias de nucleótidos sean sustancialmente idénticas a sendas
secuencias de nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno que
flanqueen una región de dicho gen destinada a ser eliminada
mediante recombinación homóloga y reemplazada por la secuencia de
nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva.
Dichas primera y segunda regiones de homología se
elegirán en función de la secuencia del gen del receptor Sigma
endógeno en el que se desea introducir una disrupción que da lugar
a la ausencia de niveles detectables de receptor Sigma endógeno en
el homólogo recombinante y, consecuentemente, en función del animal
mutante, deficiente en el receptor Sigma endógeno, que se desea
obtener. Se han descrito la secuencia de cDNA que codifica para el
receptor Sigma-1 en conejillos de indias, la
secuencia de cDNA y el gen del receptor Sigma-1 en
humanos, la secuencia de cDNA y el gen del receptor
Sigma-1 en ratones. y la secuencia de cDNA que
codifica para el receptor Sigma-1 en ratas [4]-[8].
Clones genómicos o de cDNA codificantes de receptores
Sigma-1 endógenos de animales para los que todavía
no se conoce su secuencia de nucleótidos pueden obtenerse por
métodos convencionales a partir de genotecas de células de dichas
especies a la vista de las secuencias de los genes de receptores
Sigma-1 conocidas debido a la elevada homología
observada entre las mismas. Asimismo, información sobre la secuencia
de DNA genómico o de cDNA del gen del receptor
Sigma-2 puede obtenerse a partir de publicaciones o
bases de datos de secuencias de ácidos nucleicos o de proteínas, o
bien se pueden obtener clones genómicos o de cDNA codificantes de
receptores Sigma-2 endógenos mediante el empleo de
métodos convencionales, con las debidas modificaciones, a partir de
genotecas de células que los expresan mediante una estrategia
similar a la descrita en los Ejemplos 1 y 2 de esta descripción o
bien mediante aproximaciones similares, con las debidas
modificaciones, a las seguidas por otros autores para la obtención
de la secuencia codificante del gen del receptor
Sigma-1 [4].
Dichas primera y segunda regiones de homología
pueden obtenerse por métodos convencionales a la vista de la
secuencia de nucleótidos del gen del receptor Sigma en el que se
desea introducir una disrupción, por ejemplo, mediante el empleo de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o RT/PCR
[transcripción inversa/reacción en cadena de la polimerasa]
utilizando los oligonucleótidos iniciadores apropiados. En el
Ejemplo 1.1 se describe el aislamiento del gen del receptor
Sigma-1 de ratón.
En una realización particular, el vector de la
invención comprende una primera región de homología cuya secuencia
de nucleótidos es sustancialmente idéntica a una primera secuencia
de nucleótidos de 6,8 kb del gen del receptor
Sigma-1 de ratón y una segunda región de homología
cuya secuencia de nucleótidos es sustancialmente idéntica a una
segunda secuencia de nucleótidos de 3,1 kb de dicho gen del receptor
Sigma-1 de ratón, que delimitan una secuencia
de
1,9 kb de dicho gen [véase la Figura 5] que se elimina mediante recombinación homóloga con el vector de la invención.
1,9 kb de dicho gen [véase la Figura 5] que se elimina mediante recombinación homóloga con el vector de la invención.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección positiva confiere una característica de
selección positiva en las células que lo contienen, es decir,
permite seleccionar las células que contienen y expresan dicho
marcador de selección positiva frente a las células que no lo
contienen. La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección positiva puede estar operativamente unida a
unos elementos reguladores que controlan de forma independiente la
expresión de dicho marcador, constituyendo un cassette de expresión
de selección positiva, o bien el vector de la invención puede
construirse de manera que la expresión de dicho marcador tenga
lugar bajo el control de los elementos reguladores del gen del
receptor Sigma endógeno. Prácticamente cualquier marcador de
selección positiva puede ser utilizado en la construcción del
vector de la invención. Ejemplos ilustrativos de marcadores de
selección positiva pueden encontrarse, por ejemplo, en la
descripción de la patente norteamericana US 5.464.764. En una
realización particular, el vector de la invención contiene una
secuencia de nucleótidos que comprende el gen neo que confiere
resistencia a la mortalidad celular asociada al tratamiento con el
antibiótico frente a la neomicina o alguno de sus análogos, tales
corno el sulfato de G418.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección negativa está situada en una posición
distal, 5' ó 3', respecto a dichas primera y segunda regiones de
homología, y está operativamente unida a los elementos reguladores
que controlan la expresión de dicho marcador de selección negativa
constituyendo un cassette de expresión de selección negativa.
Ventajosamente, dicha secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador negativo es sustancialmente "no idéntica" a ninguna
secuencia del gen del receptor Sigma, es decir, la secuencia de
nucleótidos que codifica para el marcador de selección negativa no
tiene la suficiente homología con ninguna secuencia del gen del
receptor Sigma como para permitir la recombinación homóloga entre
dichas secuencias, es decir, el grado de identidad entre los
nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección negativa y la secuencia del gen del receptor
Sigma debe ser inferior al 45%, preferentemente inferior al 30% con
el fin de evitar recombinaciones indeseadas. Además, esta secuencia
de nucleótidos, ventajosamente, no es idéntica a ninguna otra
secuencia del genoma del mamífero no humano. El marcador de
selección negativa confiere una característica de selección negativa
en las células que lo contienen, es decir, permite seleccionar las
células que no contienen dicho marcador de selección negativa
frente a las células que lo contienen y expresan ya que estas
últimas morirán por acción del agente de selección negativa
mientras que las que no lo contienen sobrevivirán. Aunque
prácticamente cualquier marcador de selección negativa puede ser
utilizado en la construcción del vector de la invención,
preferentemente se elegirán aquellos que cumplan la condición de
que la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho marcador
de selección negativa no sea sustancialmente idéntica a la secuencia
de nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno ni a ninguna
otra secuencia del genoma del mamífero no humano. Ejemplos
ilustrativos de marcadores de selección negativa pueden
encontrarse, por ejemplo, en la patente norteamericana US 5.464.764.
En una realización particular de esta invención, el vector de la
invención contiene una secuencia de nucleótidos que comprende el
gen de la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simplex
(HSV). La síntesis de DNA puede interrumpirse en las células que
contienen y expresan dicho gen tk. Estas células pueden
eliminarse utilizando como agente de selección negativa el
ganciclovir o cualquier otro análogo nucleotídico funcionalmente
equivalente.
En una realización particular, el vector de la
invención es un vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa que comprende unas primera y
segunda regiones de homología sustancialmente idénticas a unas
primera y segunda secuencias, respectivamente, del gen
Sigma-1 de ratón, una secuencia de nucleótidos que
comprende el gen neo y una secuencia de nucleótidos que
comprende el gen tk, tal como el vector denominado pHR53TK
[véase la Figura 7], que puede ser utilizado para transformar
células de ratón, por ejemplo, células embrionales ES de ratón, que
contienen el gen del receptor Sigma-1 endógeno,
mediante recombinación homóloga y obtener células de ratón, en
primer lugar con uno de los alelos mutados del gen del receptor
Sigma-1 endógeno, y, en segundo lugar, mediante un
segundo evento de recombinación homóloga en el alelo salvaje
restante del genoma, que carecen de niveles detectables de RNA
mensajero o proteína para el receptor Sigma-1
endógeno. En el Ejemplo 1.2 se describe de forma detallada la
constricción del vector pHR53TK.
Para la construcción del vector de recombinación
homóloga con selección positiva-negativa
proporcionado por esta invención se pueden utilizar métodos
convencionales de digestión con enzimas de restricción y unión, y
similares, tales como los descritos por Sambrook et al.
[17].
El vector de la invención permite el empleo de la
técnica de selección "positiva-negativa" para
seleccionar los recombinantes homólogos, es decir, permite
seleccionar las células en las que se ha introducido dicho vector
ya que éstas contienen y expresan el marcador de selección
positiva pero han perdido el marcador de selección negativa como
resultado de la recombinación homóloga entre el vector y el gen del
receptor Sigma endógeno.
El vector de la invención puede ser utilizado
para introducir una disrupción funcional en el gen de un receptor
Sigma endógeno, por ejemplo, en el gen del receptor
Sigma-1 o en el gen del receptor
Sigma-2, presente en el genoma de una célula de
mamífero no humano, y crear homólogos recombinantes (células
hospedadoras recombinantes) que, a su vez, pueden ser utilizados
para generar mamíferos no humanos mutantes, deficientes en un
receptor Sigma endógeno. Para ello, el vector de la invención se
introduce en dicha célula por cualquier método convencional
adecuado para la introducción de un DNA exógeno en una célula, por
ejemplo, precipitación con fosfato cálcico, transfección,
microinyección, lipofección, etc., preferentemente mediante
electroporación. Tras la introducción del vector de la invención
en la célula hospedadora, ésta se cultiva durante un periodo de
tiempo apropiado bajo condiciones que permitan la recombinación
homóloga entre el vector de la invención y el gen del receptor
Sigma endógeno. Los recombinantes homólogos se seleccionan
mediante el proceso de selección positiva-negativa y
se analiza la existencia de recombinación homóloga en el locus del
gen del receptor Sigma endógeno por técnicas convencionales, por
ejemplo, mediante un análisis Southern blot utilizando una
sonda que permite diferenciar entre el alelo endógeno normal (tipo
salvaje) y el alelo del recombinante homólogo. En el Ejemplo 2.1
se describe la inactivación del gen del receptor
Sigma-1 de ratón mediante recombinación homóloga en
células embrionales ES de ratón y la obtención de ratones
quiméricos (quimeras) con una mutación en el gen del receptor
Sigma-1 de ratón mediante la técnica de agregación
de mórulas, evaluándose la transmisión por línea germinal de dicha
mutación mediante cruces de las quimeras respectivas con hembras
de una cepa receptora, tal como una hembra de la cepa no
consanguínea CD-1, cuyo pelaje albino es netamente
distinguible del pelaje pigmentado característico de los ratones
híbridos F_{1} generados a partir de cruces entre las cepas
129X1/SvJ y 129S1/Sv del cual derivan las células ES R1 utilizadas
en el proceso de recombinación
homóloga.
homóloga.
Los recombinantes homólogos (células hospedadoras
recombinantes), que contienen un alelo del gen del receptor Sigma
mutado, pueden utilizarse para generar los mamíferos no humanos
mutantes de la invención. Para ello, dichas células hospedadoras
recombinantes que contienen una disrupción en el gen del receptor
Sigma endógeno se introducen en embriones por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante agregación de las células
recombinantes con embriones en fase de 8 células (mórulas), los
cuales son posteriormente implantados en mamíferos hembras
receptoras pseudogestantes y se deja que los embriones se
desarrollen a término. Los animales resultantes son unas quimeras
sobre las que se analiza la transmisibilidad de la mutación por
vía germinal. Las quimeras capaces de transmitir eficazmente el
genotipo de las células hospedadoras a su descendencia a través de
la línea germinal se cruzan con mamíferos no humanos tipo salvaje
para obtener mutantes heterocigotos para la disrupción del gen
Sigma endógeno en células somáticas y germinales. Posteriormente,
los mutantes heterocigotos se cruzan entre sí para obtener mutantes
homocigotos. El Ejemplo 2.2 describe la obtención de ratones
mutantes (heterocigotos y homcigotos) para el gen del receptor
Sigma-1 endógeno verificándose que eran deficientes
en dicho gen tal como se describe en el Ejemplo 2.3 mediante los
correspondientes análisis estructurales, de expresión y función, en
los ratones mutantes homocigotos.
La descendencia de un mamífero no humano mutante
de la invención, que constituye un aspecto adicional de esta
invención, puede obtenerse mediante métodos convencionales, por
ejemplo, mediante técnicas de cruzamiento clásico entre mamíferos
no humanos mutantes de la invención (progenitores) o bien,
alternativamente, mediante fertilización in vitro de huevos
y/o esperma de los mamíferos no humanos mutantes de la invención o
mediante clonación, por transferencia nuclear y reconstrucción
posterior de óvulos enucleados con núcleos de células mutantes o
portadoras de la mutación de tipo embrional o somático. Tal como
se utiliza en esta descripción, el término "descendencia" y
"descendencia de un mamífero no humano mutante de la invención"
se refiere a todos y cada uno de los descendientes de cada
generación posterior a la de los mamíferos no humanos originalmente
transformados.
Los mamíferos no humanos mutantes de la invención
pueden ser utilizados como animales control para la realización de
ensayos in vivo (véase más adelante). Asimismo, los
mamíferos no humanos mutantes de la invención pueden ser utilizados
como fuente de células somáticas, fetales o embrionales, las
cuales, una vez aisladas y cultivadas pueden ser utilizadas en
ensayos in vitro. Además, si se desea, se pueden preparar
líneas celulares inmortalizadas a partir de dichas células mediante
el empleo de técnicas convencionales [18-21]. Por
tanto, en otro aspecto, la invención proporciona una línea celular
aislada derivada del mamífero no humano mutante de la invención. En
una realización particular, dicha línea celular proporcionada por
esta invención es una línea celular murina, por ejemplo, una línea
de células embrionales ES de ratón que comprende una mutación en el
gen del receptor Sigma-1 de ratón en donde dicha
línea celular carece de niveles detectables de receptor
Sigma-1.
Los mamíferos no humanos mutantes de la invención
pueden ser utilizados, además, como animales modelo para estudiar
el papel desempeñado in vivo por los receptores Sigma
endógenos, en particular, los receptores Sigma-1 o
Sigma-2, y como animales control para la
realización de ensayos in vivo.
El receptor Sigma-1 parece estar
implicado en desórdenes del sistema nervioso central, tales como la
ansiedad, depresión o esquizofrenia, en alteraciones de la memoria,
por ejemplo, amnesia, y en condiciones de estrés y adicción a
drogas. Asimismo, dicho receptor Sigma-1 parece
estar implicado en procesos de analgesia y neuroprotección. Por
tanto, un mamífero no humano mutante, deficiente en el receptor
Sigma-1, proporcionado por esta invención, puede
resultar útil tanto para el estudio de tales situaciones así como
para la validación y/o el desarrollo de fármacos diseñados para
regular o paliar los efectos de las alteraciones y condiciones
patológicas en las que estén implicados dichos receptores
Sigma-1.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de un mamífero no humano mutante de la
invención, o de una línea celular proporcionada por esta invención,
deficiente en el receptor Sigma-1, para evaluar
compuestos potencialmente útiles destinados a
- prevenir y/o tratar desórdenes del sistema nervioso central, por ejemplo, ansiedad, esquizofrenia o depresión;
- prevenir y/o tratar alteraciones de la memoria, por ejemplo, amnesia;
- prevenir y/o tratar condiciones de estrés;
- prevenir y/o tratar condiciones de adicción a drogas;
- producir analgesia; o
- producir neuroprotección.
Los receptores Sigma-2 parecen
ser dianas para el diseño de herramientas, tanto diagnósticas como
terapéuticas, para combatir el cáncer y/o procesos degenerativos
y/o para el diseño de compuestos capaces de prevenir, reducir o
aliviar la patología secundaria asociada a la administración de
agentes neurolépticos, por ejemplo, alteraciones secundarias
motoras provocadas en pacientes sometidos a tratamiento continuado
con agentes neurolépticos, tales como haloperidol. Por tanto, un
mamífero no humano deficiente en el receptor
Sigma-2 puede resultar útil en la validación y/o
desarrollo de fármacos diseñados para el diagnóstico o tratamiento
del cáncer, así como en la validación y/o desarrollo de fármacos
para la prevención y/o el tratamiento de procesos degenerativos, o
en la validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para
prevenir, reducir o aliviar los efectos secundarios asociados con
la administración continuada a un paciente de agentes
neurolépticos, en particular, los efectos secundarios motores.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
relaciona con el empleo de un mamífero no humano mutante de la
invención, o de una línea celular proporcionada por esta invención,
deficiente en el receptor Sigma-2, para la
validación y/o desarrollo de fármacos diseñados para
- el diagnóstico o tratamiento del cáncer;
- la prevención y/o el tratamiento de procesos degenerativos, o para
- prevenir, reducir o aliviar los efectos secundarios asociados con la administración de agentes neurolépticos.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
método para determinar el efecto de un compuesto a ensayar sobre
un mamífero no humano deficiente en un receptor Sigma endógeno,
tal como un receptor Sigma-1 o
Sigma-2, que comprende poner en contacto un
mamífero no humano mutante de la invención con dicho compuesto a
ensayar y detectar la presencia o ausencia de un cambio
fisiológico en dicho mamífero no humano mutante en respuesta al
contacto con dicho compuesto; o bien, administrar un compuesto a
ensayar a dicho mamífero no humano mutante de la invención,
administrar dicho compuesto a ensayar a un mamífero no humano
control que expresa el receptor Sigma endógeno funcional
correspondiente, por ejemplo, el receptor Sigma-1 o
el receptor Sigma-2, y observar si dicho compuesto
produce un efecto sobre el fenotipo en dicho mamífero no humano
mutante cuando se compara con el mamífero no humano control.
Cualquier efecto observable sobre el fenotipo podría estar
relacionado, en principio, con la función (o disfunción) del
receptor Sigma considerado.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un
método para determinar el efecto de un compuesto sobre células que
expresan un receptor Sigma, por ejemplo, el receptor
Sigma-1 o el receptor Sigma-2, y
sobre células que no expresan dicho receptor Sigma, que comprende
introducir un compuesto a ensayar en una población de células, o en
un homogeneizado de las mismas, en donde dichas células son células
aisladas o establecidas a partir de un mamífero no humano mutante
de la invención, administrar dicho compuesto a ensayar a una
población de células de mamífero no humano control, o a un
homogeneizado de las mismas, que expresa el correspondiente
receptor Sigma funcional. y observar o analizar si dicho compuesto
a ensayar produce un efecto sobre la expresión de dicho receptor
Sigma en las células de dicho mamífero no humano mutante de la
invención cuando se compara con células de mamífero no humano
control. En principio, cualquier efecto observable sobre el
fenotipo podría estar relacionado con la función (o disfunción)
del receptor Sigma considerado.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma. La
combinación de los Ejemplos 1 y 2 describe de forma detallada un
procedimiento para la generación de ratones mutantes en el gen del
receptor Sigma-1 endógeno que carecen de niveles
detestables del receptor Sigma-1 de ratón. En el
Ejemplo 1 se describe el aislamiento y clonaje del gen del receptor
Sigma-1 de ratón y la construcción de un vector de
recombinación homóloga con selección
positiva-negativa, mientras que en el Ejemplo 2 se
describe la transfección de células ES de ratón y la generación de
ratones mutantes deficientes en el receptor Sigma-1
murino.
A partir de las secuencias publicadas del cDNA y
del gen del receptor Sigma-1 de ratón [8] se
diseñaron cuatro oligonucleótidos con el objetivo de aislar y
clonar dicho gen. Las características de dichos oligonucleótidos,
denominados MS1, MS2, MS3 y MS4, se detallan en la Tabla I. Las
posiciones relativas de estos oligonucleótidos, respecto a las
secuencias publicadas del cDNA y del gen de ratón, se representan
esquematizadas en la Figura 1.
| Oligonucleótido | Secuencia de DNA | Posición relativa | Posición relativa |
| (5'->3') | respecto al gen [AF030199] | respecto al cDNA [AF030198] | |
| MS1 | SEQ.ID.NO:1 | 2567-2584 | - |
| MS2 | SEQ.ID.NO:2 | 3437-3458 | 113-134 |
| MS3 | SEQ.ID.NO:3 | 3726-3708 | 277-259 |
| MS4 | SEQ.ID.NO:4 | 5683-5664 | 1132-1113 |
Con dichos oligonucleótidos se obtuvieron
fragmentos específicos de DNA del tamaño esperado a partir de DNA
genómico y RNA total de ratón de las cepas NMRI y BALB/C,
utilizando protocolos de PCR y RT/PCR habituales [9]. Se utilizaron
inicialmente las parejas de oligonucleótidos MS1/MS3 y MS2/MS4 que
produjeron, mediante PCR sobre DNA genómico, fragmentos de 1160 y
2246 pares de bases (pb), respectivamente. Además. a partir de RNA
total, mediante RT-PCR se clonó el cDNA
correspondiente al fragmento de 1020 pb a partir del par de
oligonucleótidos MS2/MS4. Los fragmentos de DNA obtenidos fueron
subclonados en el vector plasmídico Bluescript KS+ (Stratagene),
usando métodos habituales [9]. En la Figura 1 se describen los
plásmidos obtenidos con secuencias del cDNA y del gen. En
particular se describe el plásmido pmcS1/N, que corresponde
al fragmento cDNA de 1020 pb, obtenido a partir de los
oligonucleótidos MS2/MS4, que posteriormente fue usado para la
obtención de clones genómicos del gen del receptor
Sigma-1 de ratón.
La clonación, por PCR y por RT/PCR, de los
diferentes fragmentos genómicos y de cDNA correspondientes al gen
del receptor Sigma-1 de ratón proporcionó sondas
genéticas específicas para ser utilizadas en el aislamiento de
clones genómicos intactos de una genoteca de ratón. Dado que el
objetivo último reside en la obtención de un ratón mutante para
este gen se debe procurar obtener clones secuencias isogénicas (esto
es, de la misma cepa de ratón) con objeto de optimizar el proceso
de recombinación homóloga en las células embrionales pluripotentes
ES [10]. Las células ES de ratón que se utilizaron, células ES R1
[11], provienen de un híbrido FI de dos sub-cepas de
ratón 129/Sv [129X1/SvJ x 129S1/SvJ]. Por ello, se decidió abordar
el aislamiento de clones genómicos a partir de una genoteca
comercial preparada a partir de DNA de ratones 129/Sv (Stratagene,
Cat. Nr. #946313). Se analizaron 1 x 10^{6} clones recombinantes
de la genoteca distribuidos en 6 placas grandes (Nunc, 243 mm x
243 mm, 530 cm{2}) a razón de 170.000 faltos por placa,
aproximadamente. Se procedió a obtener dos réplicas consecutivas de
cada placa en membrana de Nylon (Hybond-N,
Amersham). Estas membranas fueron hibridadas con la sonda
específica correspondiente al inserto del plásmido pmcS1/N,
siguiendo protocolos habituales [9].
Inicialmente se identificaron nueve señales
específicas (en ambos duplicados de las réplicas) y se procedió a
purificar los bacteriófagos presentes en las placas que habían dado
señal positiva, siguiendo protocolos habituales [9]. La utilización
de los oligonucleótidos mencionados (MS1, MS2, MS3 y MS4) y el
análisis mediante Southern blot permitió comprobar que
cuatro de estos clones seleccionados (\lambdaSg1, \lambdaSg2,
\lambdaSg5, \lambdaSg6) contenían la totalidad del gen del
receptor Sigma-1 de ratón. En la Figura 2 se
presenta el mapa de las secuencias colindantes al gen del receptor
Sigma-1 de ratón obtenido a partir del
solapamiento de los mapas de los cuatro clones de bacteriófagos
mencionados. Se constató la obtención novedosa del mapa
estructural de unas 30 kilobases (kb) circundantes al gen, lo cual
excedía de la información publicada y depositada en las bases de
datos (inferior a 7 kb, centradas alrededor del gen) [6]. Estas
secuencias se subclonaron en plásmidos para poder ser utilizadas
en la construcción del vector de la recombinación homóloga con
selección positiva-negativa. En la Figura 3 se
representan los diferentes clones originales obtenidos con
secuencias genómicas correspondientes a secuencias situadas en la
región 5' y 3' del gen.
Para la construcción del vector de recombinación
homóloga con selección positiva-negativa
denominado
pHR53TK se utilizó, como plásmido de soporte e inicio de los sucesivos clonajes, el vector pHM2 [12] (8451 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: X76682), el cual ya había sido utilizado con éxito en la preparación de vectores de recombinación homóloga que habían conducido a la inactivación efectiva de otros genes del ratón, véase, por ejemplo [13].
pHR53TK se utilizó, como plásmido de soporte e inicio de los sucesivos clonajes, el vector pHM2 [12] (8451 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: X76682), el cual ya había sido utilizado con éxito en la preparación de vectores de recombinación homóloga que habían conducido a la inactivación efectiva de otros genes del ratón, véase, por ejemplo [13].
A partir del plásmido pmgS1 Eag6.7 (véase la
Figura 3) se obtuvo, mediante digestión con el enzima de
restricción Bgl II, un fragmento de 3,1 kb portador de la
secuencia de homología 3' del gen del receptor
Sigma-1 de ratón. Este fragmento Bgl II de
3,1 kb se insertó en el plásmido pHM2, previamente digerido con el
mismo enzima, cuyo único sitio de corte para Bgl II se
sitúa en la posición 8171, generándose el plásmido intermedio
pHR3A, con un tamaño de 11,6 kb. Seguidamente, sobre el plásmido
pHR3A se insertó, en el sitio único de corte para el enzima de
restricción Pml I (posición 2259 relativa al plásmido
pHM2), la secuencia de homología 5' del gen del receptor
Sigma-1 de ratón, obtenida como un fragmento de
6,8 kb mediante digestión con los enzimas Sal I y Sac
II a partir del DNA del bacteriófago \lambdaSg6 (Figura 2). La
posterior fusión, previa conversión a extremos romos de las
secuencias de DNA, del sitio Sac II (de la secuencia del gen
del receptor Sigma-1 de ratón, posición 3356 de la
secuencia AF030199) y
\hbox{ Pml I} (del vector
pHR3A) permitió obtener la fusión transcripcional entre los
primeros cuatro aminoácidos del gen del receptor
Sigma-1 con el resto de aminoácidos del gen
indicador lacZ, presente en el vector original pHM2 [12]. La
adición de la secuencia de homología 5' del gen del receptor
Sigma-1 permitió obtener el plásmido intermedio
pHR53, el cual delimitaba exactamente los nucleótidos a suprimir
(deleccionar) del gen entre las posiciones 3356 (Sac II) y
5263 (Bgl II), relativas a la secuencia original del gen
depositada en GenBank AF030199. En efecto, esto producía la
eliminación de 1907 nucleótidos, los cuales incluyen la práctica
totalidad de secuencias codificantes para el gen del receptor
Sigma-1 de ratón, con la excepción de los primeros
cuatro aminoácidos. En la Figura 4 se representan gráficamente los
límites precisos de la secuencia cuya eliminación estaba prevista
realizar a través de recombinación homóloga en células ES de ratón
(Ejemplo 1.3). En la Figura 5 se puede observar la posición
relativa de las secuencias de homología 5' y 3', de 6,8 y 3,1 kb
de tamaño y presentes en el vector pHR53, respecto al solapamiento
de 30 kb previamente descrito. Estas secuencias de homología 5' y
3' a su vez delimitan la zona del gen del receptor.
Sigma-1 a eliminar, de un tamaño de 1,9 kb.
Con objeto de verificar la presencia y fusión
exacta de los fragmentos de DNA utilizados para la construcción del
vector pHR53 se procedió a secuenciar los extremos de los mismos.
En particular, se verificó la fusión transcripcional entre los
primeros nucleótidos codificantes del gen del receptor
Sigma-1 de ratón con la secuencia codificante para
el gen indicador lacZ, tal y como se presenta en la Figura
6.
Finalmente, con objeto de obtener un vector de
recombinación homóloga con selección
positiva-negativa sobre el que poder aplicar los
procedimientos de selección positiva (gen de resistencia a
neomicina, presente en el plásmido pHM2) combinados con los de
selección negativa [14] (gen de resistencia a ganciclovir, timidina
quinasa del virus del herpes simplex, HSV-TK,
ausente en el plásmido pHM2 pero presente en el plásmido pPNT
[15]) se procedió a clonar el cassette de expresión con el gen
HSV-TK en el sitio de restricción Not I del
plásmido pHR53 a través de una construcción intermedia en la que se
obtuvo el gen HSV-TK en el vector pSX [12],
generándose finalmente sobre éste último plásmido el vector
pHR53TK de 20,8 kb de tamaño, cuyo mapa se muestra en la
Figura 7. El plásmido pHR53TK ha sido depositado en la CECT con
fecha 4 de octubre de 2002 y le ha correspondido el número de
acceso CECT 5737.
Una vez construido el vector pHR53TK se linearizó
mediante digestión con el enzima de restricción Sal I
(Figura 7). A continuación, 20 \mug del vector pHR53TK
linearizado se utilizaron para transfectar 9,6 x 10^{6} células ES
R1 [11] mediante electroporación (condiciones de electroporación:
500 \muF, 250 V). A las 24 horas se inició el proceso de
selección positiva mediante la adición de 300 \mug/ml del
antibiótico G418. A las 48 horas se adicionó la droga ganciclovir,
para el proceso de selección negativa, hasta alcanzar una
concentración final de 2 \muM. Ocho días más tarde se procedió a
identificar clones recombinantes independientes (resistentes a G418
y ganciclovir) que fueron subcultivados por separado. Todo el
proceso se realizó en presencia de fibroblastos embrionarios de
ratón (MEFs) resistentes a G418 y del factor de crecimiento L.I.F.
(leucemia inhibitory factor o factor de inhibición de la
leucemia) para inhibir la diferenciación espontánea de las células
ES pluripotentes. En todo momento se siguieron protocolos
descritos en la literatura para el cultivo, transfección y
manipulación de células ES de ratón [10] (información relativa al
proceso de selección positiva-negativa se puede
obtenerse, por ejemplo, en las patentes norteamericanas US
5.464.764, US 5.487.992, US 5.627.059 y US 5.631.153).
Se analizaron un total de 272 clones
recombinantes de células ES de ratón mediante el procedimiento de
Southern blot, descrito en la literatura [9]. Para ello se
diseñaron dos sondas. una sonda 5' y otra sonda 3', alejadas de las
zonas de homología del gen del receptor Sigma-1 de
ratón incluidas en el vector pHR53TK con el objetivo de identificar
dos polimorfismos en el tamaño de fragmentos de restricción. Así
pues, mediante digestión con el enzima de restricción Hind
III y utilizando la sonda 5' se podía distinguir el alelo salvaje
(10,7 kb) del alelo mutante (19 kb) del gen del receptor
Sigma-1 de ratón. De igual manera, mediante
digestión con el enzima de restricción EcoR I y utilizando la
sonda 3' se podía distinguir el alelo salvaje (13,7 kb) del alelo
mutante (11,9 kb) del gen del receptor Sigma-1 de
ratón. En la Figura 8 se indica el diseño experimental utilizado
para diferenciar el alelo mutante del alelo salvaje del gen del
receptor Sigma-1 de ratón.
De los 272 clones de células ES independientes
analizados 12 (es decir, un 4,4%) presentaron los polimorfismos
esperados utilizando la sonda 5' y la sonda 3' (Figura 8). En la
Figura 9 se muestra el resultado de los análisis mediante
Southern blot del DNA genómico correspondiente a estos 12
clones de células ES.
Seguidamente se seleccionaron 4 clones
recombinantes positivos de células ES independientes con el objeto
de proceder a la generación de los ratones quiméricos (quimeras)
correspondientes, mediante la técnica de agregación de mórulas,
utilizando procedimientos descritos en la literatura [10], [11].
Las condiciones experimentales para la agregación de las células
ES recombinantes (en número promedio de 10) con embriones en fase
de 8-células (mórulas) de la cepa de ratón
CD-1 comprendían el empleo de un 4% de medio
condicionado de células ES en el proceso de agregación.
Usando estas condiciones se identificaron 11
quimeras supervivientes, obtenidas a partir de 19 quimeras
inicialmente identificadas a término entre los 40 fetos que
lograron progresar en su gestación a partir de 382 embriones
agregados y transferidos. En la Tabla II aparece. de forma
resumida el proceso de agregación utilizado.
| Nº | Nº embriones | Nº embriones | Nº fetos a | Nº quimeras | Nº quimeras |
| embriones agregados | transferidos | gestados | término | identificadas | supervivientes |
| (% agregados) | (% transferidos) | ||||
| 399 | 382 (95,7%) | 71 (18,6%) | 40 | 19 | 11 |
Las once quimeras supervivientes obtenidas
correspondían a dos clones de células ES independientes, el clon #8
y el clon #175, siguiendo las recomendaciones incluidas en los
protocolos habituales de generación de quimeras, que exigen la
obtención de la mutación por lo menos a partir de dos clones
independientes para evitar problemas inherentes a un determinado
clon que pudieran generar un fenotipo anómalo del ratón mutante
[10].
Seguidamente se evaluó la transmisión por línea
germinal de la mutación mediante cruces de las quimeras respectivas
con hembras de la cepa receptora CD-1, cuyo pelaje
albino es netamente distinguible del pelaje pigmentado
característico de las cepas 129Sv de las que derivan las células
ES RI utilizadas en el proceso de recombinación homóloga [11].
En la Tabla III se describen los resultados de
los análisis de transmisión del fenotipo pigmentado (asociado al
genotipo presente en las células ES) realizados sobre las 11
quimeras identificadas.
| Quimera | Clon | Sexo | % | % Transmisión | Crías F1 pigmentadas en |
| ES | Quimerismo | Línea Germinal | cruces con CD-1 / totales | ||
| 1 | #175 | Macho | 70% | 100% | 71/71 |
| 2 | #175 | Macho | 5% | 0% | 0/130 |
| 3 | #8 | Macho | 65% | 100% | 91/91 |
| 4 | #8 | Macho | 20% | 0% | 0* |
TABLA III
(continuación)
| Quimera | Clon | Sexo | % | % Transmisión | Crías F1 pigmentadas en |
| ES | Quimerismo | Línea Germinal | cruces con CD-1 / totales | ||
| 5 | #8 | Hermafrodita | 40% | 0% | 0** |
| 6 | #175 | Macho | 50 % | 0% | 0/30 |
| 7 | #175 | Macho | 100% | 0% | 0* |
| 8 | #8 | Macho | 70% | 100% | 27/27 |
| 9 | #8 | Macho | 70% | 100% | 8/8 |
| 10 | #8 | Macho | 10% | 0% | 0/28 |
| 11 | #8 | Macho | 25% | 0% | 0/38 |
| (*) Sin tapones vaginales (estéril) | |||||
| (**) Tapones vaginales no productivos (estéril) |
Los análisis de transmisibilidad demostraron que
cuatro quimeras independientes (1 derivada del clon #175 y 3
derivadas del clon #8) fueron capaces de transmitir eficazmente
(al 100 %) el genotipo de las células ES a su descendencia, a través
de la línea germinal. Estos animales F1 fueron utilizados para
analizar la presencia del alelo mutante y, mediante cruces
sucesivos, generar el correspondiente ratón mutante.
Una vez verificada la transmisión a línea
germinal en cuatro de las once quimeras obtenidas (con individuos
representantes de los dos clones ES recombinantes utilizados) por
la presencia de pigmentación en las crías F1 obtenidas a partir de
los cruces con ratones albinos CD-1 se verificó la
presencia de alelos mutados del gen del receptor
Sigma-1. La detección de pigmentación no garantiza
la presencia del alelo mutado puesto que solamente un 50% heredará
el alelo portador de la mutación, el 50% restante heredará el alelo
salvaje, intacto, de las células ES originales. Por ello, y para la
posterior identificación de individuos homocigotos mutantes y
salvajes, se diseñaron dos tests analíticos mediante la técnica de
PCR (PCR-Sigma y PCR-Neo, Figura
10), usando métodos habituales [9] que permitían identificar
inequívocamente los tres genotipos, concretamente: homocigotos
salvajes, heterocigotos (portadores de la mutación) y homocigotos
mutantes (Véase la Tabla IV).
| Genotipo | PCR-Sigma | PCR-Neo |
| Homocigoto salvaje | + | - |
| Heterocigoto | + | + |
| Homocigoto mutante | - | + |
La PCR-Sigma utiliza los
oligonucleótidos MS1 y MS3 [Tabla I] que solamente pueden
amplificar un fragmento de DNA específico de 1,16 kb cuando alguno
de los dos alelos del gen del receptor Sigma-1
está intacto. De forma similar, la PCR-Neo emplea
dos oligonucleótidos específicos e internos al gen que confiere
resistencia a la neomicina (gen neo) [Neo I (SEQ. ID. NO: 5)
y Neo 2 (SEQ. ID. NO: 6)], que amplifican una fragmento de DNA
específico de 0,7 kb solamente si alguno de los dos alelos
transporta la mutación inicialmente detectada en las células
ES.
En la Tabla V se detalla la identificación de
individuos heterocigotos entre los individuos obtenidos en la F1
resultante de cruces entre quimeras transmisoras y hembras
CD-1. Solamente los individuos pigmentados fueron
analizados mediante la PCR-Neo. La detección de la
banda analítica de 0,7 kb indica que ese individuo es portador de
la mutación en uno de los alelos del gen del receptor
Sigma-1. Aproximadamente la mitad de los
individuos pigmentados, en cada uno de los dos clones, corresponden
a ratones chinchilla. La otra mitad son ratones agouti, el pelaje
salvaje. De igual manera, un poco menos de la mitad de los
individuos F1 pigmentados resultaron ser, en cada uno de los dos
clones analizados, heterocigotos y por lo tanto portadores de la
mutación.
| Quimeras | Total individuos | Heterocigotos | Heterocigotos | Heterocigotos |
| F1 pigmentados | (+/-) identificados | con pelaje | con pelaje agouti | |
| analizados por PCR | (% total) | chinchilla | (salvaje) | |
| Clon ES | 71 | 31 (43,7%) | 14 | 17 |
| #175 | ||||
| Clon ES #8 | 112 | 51 (45,5%) | 25 | 26 |
Una vez identificados suficientes individuos
heterocigotos (de los dos sexos) de cada uno de los dos clones ES
utilizados, se establecieron cruces entre estos individuos
heterocigotos con el objetivo, según las leyes de la Genética
Clásica (Mendel), de Lograr detectar individuos mutantes
(homocigotos para el alelo mutante) en la segunda generación (F2)
resultante.
La obtención del genotipo de los animales F2
generados se basó en los dos tests analíticos por PCR
(PCR-Sigma y PCR-Neo) anteriormente
descritos (véase la Tabla IV). El resultado de estos cruces y los
números totales de cada uno de los tres genotipos obtenidos en los
individuos de la segunda generación se detallan en la Tabla VI.
| Clones | Total | Individuos | Individuos | Individuos |
| individuos F2 | salvajes | heterocigotos | homocigotos | |
| analizados | (+/+) | (+/-) | mutantes (-/-) | |
| por PCR | identificados | identificados | identificados | |
| Clon ES #175 | 130 | 42 | 60 | 28 |
| Clon ES #8 | 48 | 12 | 25 | 11 |
Según las leyes de Mendel el resultado del cruce
entre dos individuos heterocigotos, con dos alelos distintos para
un mismo locus, se distribuye como sigue: 25% de individuos
salvajes (+/+), 50% de individuos heterocigotos (+/-) y 25% de
homocigotos mutantes (-/-). En la Tabla VIT se comparan los
resultados obtenidos en la F2 (Tabla VI) frente a los esperados,
según las leyes de Mendel.
\vskip1.000000\baselineskip
| Total | Salvajes | Heterocigotos | Mutantes (-/-) | |
| individuos F2 | (+/+) (% total) | (+/-) (% total) | (% total) | |
| Clon ES #175 | ||||
| Resultados obtenidos | 130 | 42 (32,3%) | 60 (46,2%) | 28 (21,5%) |
| Clon ES #175 | ||||
| Resultados esperados | 130 | 32,5 (25%) | 65 (50%) | 32,5 (25%) |
| Clon ES #8 | ||||
| Resultados obtenidos | 48 | 12 (25%) | 25 (52,1%) | 11 (22,9%) |
| Clon ES #8 | ||||
| Resultados esperados | 48 | 12 (25%) | 24 (50%) | 12 (25%) |
\newpage
El análisis estadístico de estos datos da como
resultado, en ambos casos, un valor \chi^{2} calculado inferior
al tabulado para p= 0,05 y (3-1= 2) 2 grados de
libertad (\chi^{2}= 5,991) [Clon ES #175 \chi^{2}= 3,785; Clon
ES #8 \chi^{2}= 0,125] por lo que se puede concluir, que la
distribución de genotipos se ajusta a la prevista según Mendel (p=
0,05). No es pues estadísticamente significativa la ligera
disminución de mutantes identificados respecto a los valores
teóricamente esperados.
Como conclusión adicional a este primer análisis
se puede añadir que se obtienen, por igual, machos y hembras
homocigotos mutantes. La distribución por sexos entre los
homocigotos mutantes identificados se ajusta a lo esperable (50% de
cada sexo), no observándose, por el momento desviaciones
estadísticamente significativas. En el caso del clon ES #175 de
los 28 mutantes detectados 13 son machos, mientras que en el caso
del clon ES #8 de los 11 mutantes detectados 4 son machos. Ambos
valores se acercan a la normalidad y siguen la distribución
esperada (p=0,05, grados de libertad=1, \chi^{2} calculado= 3,841)
[Clon ES #175 \chi^{2}= 0,143; Clon ES #8 \chi^{2}= 0,818].
Adicionalmente se ha observado que tanto las
hembras como los machos homocigotos mutantes son fértiles, por lo
que han podido obtenerse colonias de esta mutación estables. No se
ha detectado manifestación externa ni observable que,
aparentemente, distinga a los ratones mutantes de los ratones
salvajes. No obstante, los ratones están siendo analizados
pormenorizadamente para evaluar el efecto de la mutación en el gen
del receptor Sigma-1 mediante paradigmas encaminados
a dilucidar su participación en procesos de analgesia, adicción,
depresión, psicosis y esquizofrenia usando métodos habituales en
esta área de conocimiento [16].
La mutación se ha obtenido y analizado en dos
fondos genéticos mixtos distintos (129Sv x CD-1 y
129Sv x C57BL/6J).
Una vez generados los ratones mutantes para el
gen del receptor Sigma-1 de ratón se verificó la
ausencia del gen (DNA), de expresión del mismo (RNA mensajero), de
proteína y de actividad (función) para verificar que, en efecto,
los ratones mutantes eran deficientes en el gen del receptor
Sigma-1.
En primer lugar se analizó la presencia de los
polimorfismos asociados a las sondas 5' y 3' que permiten detectar
los alelos mutantes y salvajes de forma inequívoca. Para ello se
analizó DNA genómico de ratones salvajes, heterocigotos y mutantes
para el gen del receptor Sigma-1. El resultado del
análisis por Southern blot se incluye en la Figura 11. Los
resultados obtenidos permiten concluir, inequívocamente, la
presencia del alelo mutante según el diseño experimental
previsto.
En segundo lugar se evaluó la expresión del gen
del receptor Sigma-1 en diferentes órganos de
ratones mutantes, heterocigotos y salvajes en los cuales el gen
habitualmente está presente [5]. Para estos análisis de expresión
se utilizó la técnica de Northern blot, siguiendo
protocolos descritos en el área [9]. A continuación, en la Figura
12, se observa la ausencia de señal en aquellos carriles del gel
que corresponden a RNA totales de animales homocigotos mutantes, y
por lo tanto carentes del gen del receptor Sigma-1.
En conclusión, no solamente no está el gen del receptor
Sigma-1 sino que además es imposible encontrar RNA
mensajeros (transcritos) que permitan documentar su expresión. En
efecto, el ratón mutante no expresa el gen del receptor
Sigma-1.
En tercer lugar se evaluó la expresión del gen
del receptor Sigma-1 en cerebro de ratones
mutantes, heterocigotos y salvajes mediante la localización de la
proteína correspondiente en extractos proteicos por un anticuerpo
policlonal específico. Para ello, se utilizó la técnica de
Western blot. Los resultados obtenidos se muestran en la
Figura 13, donde no se observan niveles detectables de proteína
(receptor Sigma-1) en los extractos proteicos de
cerebro procedentes de ratones mutantes homocigotos para el gen
Sigma-1.
En cuarto lugar se evaluó la actividad (función)
del receptor Sigma-1 de ratón mediante un ensayo de
unión específica al ligando [^{3}H]-pentazocina.
Brevemente, cerebros de ratones mutantes (-/-), heterocigotos (+/-)
y salvajes (+/+) fueron homogeneizados y los homogeneizados se
centrifugaron varias veces en distintas condiciones de velocidad
para obtener la fracción membranaria. Posteriormente, se procedió a
la incubación de muestras de la fracción membranaria obtenidas con
el radioligando [^{3}H]-pentazocina en
condiciones de unión óptima para este receptor (37ºC, durante
130-170 minutos), filtración de las muestras.
lavado de las muestras y lectura del contaje de radiactividad
presente en el filtrado [22]. Los resultados obtenidos se muestran
en la Figura 14 y ponen de manifiesto la ausencia de actividad
(función) en los ratones mutantes homocigotos.
En quinto lugar se evaluó la función del receptor
Sigma-1 frente a paradigmas y protocolos de
conducta y comportamiento conocidos. En este sentido no se han
detectado diferencias estadísticamente significativas en el
comportamiento de los ratones mutantes frente a los salvajes en la
siguiente lista de tests o paradigmas analizados. Solamente se han
observado diferencias estadísticamente significativas frente a
ratones salvajes en la respuesta de hiperactividad
(hipermotilidad) inducida por el ligando SKF-10047
(datos no mostrados).
\newpage
Un cultivo de Escherichia coli Top10F',
denominado pHR53TK conteniendo el vector plasmídico pHR53TK
ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo,
CECT, Burjasot, Valencia (España), el 4 de octubre de 2002,
correspondiéndole el número de acceso CECT 5737.
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<110> Laboratorios del Dr. Esteve, S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mamíferos no humanos mutantes
deficientes en receptores Sigma y sus aplicaciones
\vskip0.400000\baselineskip
<160>6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador MS1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattttgctc ccctcctc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador MS2
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcactcaaaa cttcgtcttc tc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador MS3
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgttcacaaa tacccactg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210>4
\vskip0.400000\baselineskip
<211>20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador MS4
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctcctctt tcccttcacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador Neo 1
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctattcggc tatgactggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido iniciador Neo 2
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggagata gaaggcgatg
\hfill20
Claims (21)
1. Un mamífero no humano mutante, deficiente en
un receptor Sigma-1 endógeno, cuyo genoma contiene
una mutación que comprende una disrupción en un gen de un receptor
Sigma-1 endógeno, en donde dicha disrupción génica
da lugar a un mamífero no humano mutante que carece de niveles
detectables de receptor Sigma endógeno caracterizado porque
se obtiene gracias a un vector de recombinación homóloga
identificado como pHR53TK, depositado en la CECT con el número de
acceso nº CECT 5737.
2. Mamífero no humano mutante según la
reivindicación 1, en el que dicho mamífero no humano mutante es un
mutante heterocigoto para dicha mutación.
3. Mamífero no humano mutante según la
reivindicación 1, en el que dicho mamífero no humano mutante es un
mutante homocigoto para dicha mutación.
4. Mamífero no humano mutante según la
reivindicación 1, en el que dicho mamífero no humano es un
ratón.
5. Mamífero no humano mutante según la
reivindicación 1, en el que el genoma del mamífero no humano mutante
comprende un transgén dentro de la mutación introducida en el gen
del receptor Sigma-1 endógeno que comprende un gen
que codifica para un marcador de selección positiva.
6. Mamífero no humano mutante según la
reivindicación 5, en el que dicho transgén comprende el gen de la
neomicina fosfotransferasa (neo).
7. Mamífero no humano mutante según la
reivindicación 1, en el que dicho mamífero no humano mutante es un
ratón mutante, deficiente en el receptor Sigma-1
endógeno, homocigoto para el gen del receptor
Sigma-1 de ratón, fértil, cuyo genoma contiene una
disrupción en dicho gen que comprende el gen neo.
8. Un vector de recombinación homóloga con
selección positiva-negativa identificado como
pHR53TK, depositado en la CECT con el número de acceso nº CECT
5737.
9. Una célula hospedadora cuyo genoma contiene un
gen de un receptor Sigma-1 endógeno transfectada con
un vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa según la reivindicación 8,
deficiente en un receptor Sigma-1 endógeno.
10. Célula según la reivindicación 9, en la que
dicha célula hospedadora cuyo genoma contiene un gen de un receptor
Sigma-1 endógeno se selecciona entre una célula
diferenciada que normalmente expresa el producto del gen del
receptor Sigma-1 y una célula embrional
pluripotente.
11. Célula según la reivindicación 9, que
comprende un alelo del gen del receptor Sigma-1
mutado.
12. Una célula aislada a partir de un mamífero no
humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de su descendencia.
13. Célula según la reivindicación 12, que
comprende uno o los dos alelos del gen del receptor
Sigma-1 mutados.
14. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 12-13, propagada y, opcionalmente,
inmortalizada.
15. La descendencia de un mamífero no humano
mutante, deficiente en un receptor Sigma-1 endógeno,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
16. Un procedimiento para la obtención de un
mamífero no humano mutante según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7, que comprende la introducción de una disrupción funcional en
un gen de un receptor Sigma-1 endógeno presente en
el genoma de una célula, por recombinación homóloga en dicha célula
entre un alelo de un gen de un receptor Sigma-1
endógeno y un vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa según la reivindicación 8, la
selección de los homólogos recombinantes mediante la técnica de
selección positiva-negativa, la introducción de
dichos homólogos recombinantes en embriones, su implantación en
mamíferos hembra receptoras pseudogestantes y su desarrollo a
término, la selección de las quimeras capaces de transmitir
eficazmente el genotipo de los homólogos recombinantes a su
descendencia a través de la línea germinal; el cruzamiento de dichas
quimeras con mamíferos no humanos tipo salvaje para obtener mutantes
heterocigotos para la disrupción del gen del receptor
Sigma-1 endógeno y, si se desea, el cruzamiento de
dichos mutantes heterocigotos entre sí para obtener mutantes
homocigotos.
17. Empleo de un mamífero no humano mutante según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, como animales control para
la realización de ensayos in vivo.
18. Empleo de un mamífero no humano deficiente en
el receptor Sigma-1 según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, o de una línea celular deficiente en el
receptor Sigma-1 propagada a partir de una célula de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
11-14, para evaluar compuestos potencialmente útiles
destinados a
- prevenir y/o tratar desórdenes del sistema nervioso central;
- prevenir y/o tratar alteraciones de la memoria; prevenir y/o tratar condiciones de estrés;
- prevenir y/o tratar condiciones de adicción a drogas;
- producir analgesia; o
- producir neuroprotección.
19. Un método para determinar el efecto de un
compuesto a ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en un
receptor Sigma-1 endógeno, que comprende poner en
contacto un mamífero no humano mutante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 con dicho compuesto a ensayar y detectar la
presencia o ausencia de un cambio fisiológico en dicho mamífero no
humano mutante en respuesta al contacto con dicho compuesto.
20. Un método para determinar el efecto de un
compuesto a ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en un
receptor Sigma-1 endógeno, que comprende administrar
dicho compuesto a ensayar a un mamífero no humano mutante según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; administrar dicho
compuesto a ensayar a un mamífero no humano control que expresa un
receptor Sigma-1 endógeno funcional; y observar si
dicho compuesto produce un efecto sobre el fenotipo en dicho
mamífero no humano mutante cuando se compara con el mamífero no
humano control.
21. Un método para determinar el efecto de un
compuesto sobre células que expresan un receptor
Sigma-1 y sobre células que no expresan dicho
receptor Sigma-1, que comprende introducir un
compuesto a ensayar en una población de células, o en un
homogeneizado de las mismas, en donde dichas células son células
aisladas o establecidas a partir de un mamífero no humano mutante
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, administrar dicho
compuesto a ensayar a una población de células de mamífero no humano
control, o a un homogeneizado de las mismas, que expresa un receptor
Sigma-1 funcional, y observar o analizar si dicho
compuesto a ensayar produce un efecto sobre la expresión de dicho
receptor Sigma-1 en las células de dicho mamífero no
humano mutante cuando se compara con células de mamífero no humano
control.
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