ES2286484T3 - Mamiferos no humanos mutantes deficientes en receptores sigma y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
El genoma del mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, contiene una mutación que comprende una disrupción en un gen de un receptor Sigma endógeno, en donde dicha disrupción génica da lugar a un mutante que carece de niveles detectables de receptor Sigma endógeno. El mutante puede ser utilizado como animal control para ensayos in vivo así como fuente de células que pueden ser utilizadas en ensayos in vitro. Los mutantes deficientes en el receptor Sigma-1 pueden utilizarse como modelos para estudiar in vivo desórdenes del sistema nervioso central, alteraciones de la memoria, condiciones de estrés y adicción a drogas, procesos de analgesia y neuroprotección. Los mutantes deficientes en el receptor Sigma-2 pueden utilizarse para estudiar herramientas, diagnósticas o terapéuticas, para combatir el cáncer y/o procesos degenerativos y/o para el diseño de compuestos capaces de prevenir, reducir o aliviar la patología secundaria asociada a la administración de agentes neurolépticos.
Description
Mamíferos no humanos mutantes deficientes en
receptores Sigma y sus aplicaciones.
La invención se refiere a mamíferos no humanos
mutantes deficientes en receptores Sigma endógenos, a células
derivadas de dichos animales mutantes, y a sus aplicaciones. La
invención también se refiere a un vector de recombinación homóloga
con selección positiva-negativa útil para la
generación de dichos mamíferos no humanos mutantes deficientes en
receptores Sigma endógenos.
Los receptores Sigma son unos sitios de unión
con afinidad por distintos ligandos, algunos de los cuales son
fármacos con distinta actividad. Inicialmente, el interés por los
receptores Sigma fue debido a su potencial papel en las acciones de
los fármacos anti-psicóticos debido a que mostraban
elevada afinidad por agentes neurolépticos típicos, tales como el
haloperidol u otros compuestos que causan actividad psicomimética,
por ejemplo, N-alilnormetazocina
(SKF-10047). Posteriormente, se ha encontrado que
dichos receptores Sigma pueden estar implicados en otros mecanismos
fisiológicos.
Se han identificado dos subclases de receptores
Sigma, denominadas receptor Sigma de tipo 1 y receptor Sigma de
tipo 2, diferenciables por su perfil farmacológico, función y tamaño
molecular. Ambos tipos muestran de alta a moderada afinidad por
agentes neurolépticos típicos, en particular, haloperidol. Sin
embargo, los receptores Sigma de tipo 1 exhiben una elevada
afinidad por (+)-pentazocina,
(+)-SKF10047 y otros
(+)-benzo-morfanos, mientras que
los receptores Sigma de tipo 2 muestran baja afinidad por dichos
compuestos. Los receptores Sigma de tipo 1 tienen un peso molecular
típico de 25 kDa, mientras que el peso molecular de los receptores
Sigma de tipo 2 es de 18-21 kDa (determinado en
ambos casos por marcaje de fotoafinidad).
El receptor Sigma de tipo 1, en adelante
receptor Sigma-1, es un receptor de tipo no opiáceo,
que se expresa en multitud de tejidos adultos de mamíferos (sistema
nervioso central, ovario, testículo, placenta, glándula adrenal,
bazo, hígado, riñón, tracto gastrointestinal, etc.) y también a lo
largo del desarrollo embrionario desde sus fases más tempranas y
que, aparentemente, está implicado en un elevado número de funciones
fisiológicas. Se ha descrito su elevada afinidad por distintos
fármacos, tales como SKF-10047,
(+)-pentazocina, haloperidol y rimcazole, entre
otros, ligandos conocidos con actividad analgésica, ansiolítica,
antidepresiva, antiamnésica, antipsicótica, y neuroprotectora, por
lo que el estudio del receptor Sigma-1 es de gran
interés en farmacología debido a su posible papel fisiológico en
procesos relacionados con la analgesia, ansiedad, adicción, amnesia,
depresión, esquizofrenia, estrés, neuroprotección y psicosis [1],
[2] y [3]. Sin embargo, el papel real que desempeña el receptor
Sigma-1 sigue siendo todavía desconocido y
enigmático. De hecho, se desconoce su ligando endógeno concreto,
aunque se cree que interactúa con hormonas esteroides endógenas,
tales como la progesterona y la testosterona.
Se ha descrito la secuencia de ADNc que codifica
para el receptor Sigma-1 en conejillos de indias, la
secuencia de ADNc y el gen del receptor Sigma-1 en
humanos, la secuencia de ADNc y el gen del receptor
Sigma-1 en ratones, y la secuencia de ADNc que
codifica para el receptor Sigma-1 en ratas.
El primer trabajo que consiguió obtener una
secuencia genética codificante para un receptor
Sigma-1 se debe a Hanner y colaboradores [4]. En
ese trabajo, utilizando las características específicas de unión de
este receptor a determinados compuestos marcados radiactivamente,
por ejemplo, (+)[^{3}H]Pentazocina, se obtuvo primero una
proteína y, posteriormente, un clon de ADNc que codificaba para la
misma. El clon se aisló de una genoteca de ADNc preparada a partir
de ARNm de hígado de conejillo de indias (C. porcellus) [ADNc
de 1857 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso:
Z66537]. Seguidamente, basándose en dicha secuencia de ADNc,
diferentes grupos de trabajo procedieron a clonar mediante homología
de secuencias, sucesivamente, el ADNc en humanos [5] (ADNc de 1653
pares de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: HSU75283),
el ADNc y el gen de ratón [6] (ADNc de 1567 pares de bases, Base de
datos GenBank, Código de acceso: AF030198; gen de 6973 pares de
bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF030199), el ADNc
de rata [7] (ADNc de 1582 pares de bases, Base de datos GenBank,
Código de acceso: AF004218) y el gen en humanos [8] (gen descrito
en tres fragmentos de ADN que contienen, respectivamente, el
promotor (3589 pares de bases, Base de datos GenBank, Código de
acceso: AF001975), el exón 1, 2 y 3 (757 pares de bases, Base de
datos GenBank, Código de acceso: AF001976) y el exón 4 (1630 pares
de bases, Base de datos GenBank, Código de acceso: AF001977)).
Un análisis de la homología existente entre
dichas secuencias, tanto a nivel de nucleótidos como de aminoácidos,
ha puesto de manifiesto el elevado grado de homología existente
entre ellas. El conocimiento de dichas secuencias puede ser
utilizado en el desarrollo de modelos animales destinados a estudiar
la fisiología y patología asociada con alteraciones en receptores
Sigma y el efecto de fármacos potencialmente útiles para el
tratamiento o prevención de patologías asociadas con alteraciones
en dichos receptores o en las que están implicadas dichos
receptores.
La manipulación genética de mamíferos permite
obtener animales transgénicos que expresen un determinado gen o
que, por el contrario, tengan un gen inactivado mediante una
mutación específica (animales "knockout" o mutantes). En ambos
casos es evidente el potencial que representa para el diseño de
modelos experimentales en animales de laboratorio que sirvan para
analizar la función, in vivo, de un determinado gen.
La tecnología "knockout" para la generación
de animales mutantes está bien establecida y ha sido objeto de
numerosas publicaciones. A modo ilustrativo, pueden citarse las
patentes norteamericanas US 5.464.764, US 5.487.992, US 5.627.059,
US 5.631.153, US 6.194.633, US 6.207.876, US 6.239.326, US
6.245.963, US 6.245.965 y US 6.252.132, entre otras.
La no expresión de un gen puede conferir un
nuevo fenotipo a un animal mutante. Dependiendo del gen no expresado
por dicho animal, éste puede hacerse más o menos susceptible a una
alteración patológica determinada. Tales animales mutantes son
modelos valiosos para el estudio in vivo del papel que
desempeña el gen así como para el estudio de compuestos que
potencialmente podrían ser útiles en el tratamiento o prevención de
patologías relacionadas con la expresión nula o ineficaz del
producto de dicho gen.
Aunque se ha descrito que los receptores Sigma
muestran afinidad por compuestos con distintas actividades
farmacológicas actualmente se desconoce el papel real que desempeñan
dichos receptores, por lo que existe la necesidad de generar
modelos animales para estudiar in vivo el papel desempeñado
por los receptores Sigma endógenos. Un animal mutante, deficiente
en receptores Sigma endógenos, ayudaría a definir el papel que
desempeñan in vivo dichos receptores y permitiría el diseño y
evaluación de compuestos potencialmente interesantes para el
tratamiento de procesos relacionados con la expresión nula o
ineficaz de dichos receptores Sigma. La invención proporciona una
solución a dicha necesidad existente.
La invención se refiere a un mamífero no humano
mutante que tiene células somáticas y germinales en las que, al
menos un alelo y, preferentemente, ambos alelos, de un gen de un
receptor Sigma endógeno contienen un ADN exógeno que ha sido
insertado en dicho gen de manera que dicho mamífero no humano
mutante no expresa el producto del gen del receptor Sigma endógeno.
En una realización específica, el ADN exógeno insertado en el alelo
del gen Sigma endógeno comprende un marcador de selección
positiva.
Por tanto, en un aspecto, la invención se
refiere a un mamífero no humano, viable, cuyo genoma posee el gen
de un receptor Sigma-1 mutado y carece de niveles
detectables de ARN mensajero o proteínas para dicho receptor Sigma
endógeno. Dicho mamífero no humano mutante es un animal no humano
perteneciente a la clase de los mamíferos, tal como un ratón
mutante, deficiente en el receptor Sigma-1 endógeno.
Los ratones deficientes en el receptor Sigma-1 son
viables, fértiles y no manifiestan, en condiciones de laboratorio,
ningún síntoma que los diferencie de ratones genéticamente
similares pero carentes de dicha mutación. En condiciones de
estabulación controlada los ratones mutantes en el receptor
Sigma-1 son indistinguibles de sus hermanos de
camada salvajes. La función (o disfunción) del receptor
Sigma-1 se ha postulado que puede estar asociada a
desórdenes del sistema nervioso central, tales como la ansiedad,
depresión, esquizofrenia o psicosis. El receptor
Sigma-1 parece tener actividad
anti-amnésica y neuroprotectora y se le ha
relacionado, además, con la percepción y transducción de la
analgesia, adicción o estrés. Para estas situaciones, que en
humanos pueden derivar en condiciones patológicas, el ratón
deficiente en el receptor Sigma-1 podría resultar
útil tanto para el estudio de las mismas como para la validación
y/o el desarrollo de fármacos diseñados para regular o paliar los
efectos de las alteraciones y condiciones patológicas en las que
están implicados dichos receptores Sigma-1.
La mutación en el gen del receptor Sigma
endógeno presente en el genoma de una célula puede ser introducida
por recombinación homóloga en dicha célula entre un alelo del gen
del receptor Sigma endógeno y un vector de recombinación homóloga
con selección positiva-negativa que comprende unas
regiones de homología con sendas secuencias de nucleótidos
presentes en dicho gen del receptor Sigma endógeno, y selección de
los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección
positiva-negativa, los cuales se introducen en
embriones que posteriormente son implantados en hembras receptoras
para su adecuada gestación y se deja que se desarrollen a término.
Las quimeras capaces de transmitir eficazmente el genotipo de los
homólogos recombinantes a su descendencia a través de la línea
germinal se cruzan con mamíferos no humanos tipo salvaje para
obtener mutantes heterocigotos para la disrupción del gen del
receptor Sigma endógeno y, posteriormente, los mutantes
heterocigotos se cruzan entre sí para obtener mutantes homocigotos,
siguiendo una clásica segregación alélica de tipo mendeliano.
En una realización específica, dicho mamífero no
humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, es un
mutante heterocigoto para dicha mutación.
La descendencia del mamífero no humano mutante
deficiente en un receptor Sigma endógeno constituye un aspecto
adicional de la presente invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
células aisladas a partir de dicho mamífero no humano mutante
deficiente en un receptor Sigma endógeno, las cuales pueden ser
propagadas y, opcionalmente, inmortalizadas. Dichas células pueden
ser heterocigotas, es decir, que contienen un alelo mutante y un
alelo tipo salvaje del gen del receptor Sigma endógeno o bien
homocigotas, es decir, que contienen los dos alelos mutantes del
gen del receptor Sigma endógeno.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa, útil para introducir una
disrupción funcional en un gen de un receptor Sigma, que comprende:
a) una primera región de homología, situada en el extremo 5' de una
secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección
positiva, en donde dicha primera región de homología tiene una
secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una
primera secuencia de un gen de un receptor Sigma; b) una secuencia
de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva;
c) una segunda región de homología, situada en el extremo 3' de
dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de
selección positiva, en donde dicha segunda región de homología
tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a
una segunda secuencia de dicho gen del receptor Sigma, estando
dicha segunda secuencia del gen del receptor Sigma en una posición
3' respecto a dicha primera secuencia del gen del receptor Sigma en
un gen Sigma endógeno tipo salvaje; y d) una secuencia de
nucleótidos que codifica para un marcador de selección negativa.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
célula hospedadora en la que dicho vector de recombinación homóloga
anteriormente mencionado con selección
positiva-negativa ha sido introducido por
recombinación homóloga entre dicho vector y el correspondiente gen
del receptor Sigma endógeno de dicha célula hospedadora, dando como
resultado una disrupción funcional en dicho gen del receptor Sigma
endógeno. En una realización específica, dicha célula hospedadora
es una célula diferenciada que normalmente expresa el producto del
gen de un receptor Sigma o una célula pluripotente indiferenciada e
inmortal, tal como una célula embrionaria ES establecida a partir
de la masa interna celular del embrión en la fase antes del implante
denominada blastocisto. En una realización específica, dichas
células embrionarias ES son células de ratón.
El mamífero no humano mutante de la invención
puede ser utilizado como modelo animal para estudiar in vivo
el papel desempeñado por los receptores Sigma endógenos así como en
el diseño y evaluación de compuestos químicos que podrían ser
potencialmente interesantes para el tratamiento de alteraciones
patológicas relacionadas con la expresión nula o ineficaz de los
productos de dichos genes, o en las que estuvieran involucrados
tales genes. Asimismo, dicho mamífero no humano mutante de la
invención podría ser utilizado como fuente de células para cultivos
celulares.
Aspectos adicionales de la presente invención
resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la
descripción y reivindicaciones.
La Figura 1 muestra esquemáticamente los
primeros clones de ADNc (Figura 1A) y genómicos (Figura 1B)
obtenidos a partir de procedimientos de RT-PCR o
PCR, respectivamente. En la Figura 1A se representa el plásmido
pmcS1/N, que corresponde al fragmento de ADNc de 1020 pares
de bases, obtenido a partir de los oligonucleótidos MS2/MS4 [véase
la Tabla I].
La Figura 2 muestra el mapa de las secuencias
colindantes al gen del receptor Sigma-1 de ratón
obtenido a partir del solapamiento de los mapas correspondientes a
los cuatro clones de bacteriófagos (\lambdaSg1, \lambdaSg2,
\lambdaSg5, \lambdaSg6) aislados con secuencias 5' y 3',
circundantes a la secuencia publicada del gen. Las abreviaturas de
los enzimas de restricción se describen en la Figura 3. Los
cuadrados negros corresponden a los cuatro exones del gen del
receptor Sigma-1 de ratón.
La Figura 3 muestra esquemáticamente los
diferentes plásmidos originales obtenidos con insertos de ADN
genómico correspondientes a secuencias situadas en la región 5' y
3' del gen del receptor Sigma-1 de ratón,
identificados para su posterior utilización en la construcción del
vector de recombinación homóloga. Se incluyen las abreviaturas de
los enzimas de restricción. Las cajas negras corresponden a los
cuatro exones del gen del receptor Sigma-1 de
ratón.
La Figura 4 muestra esquemáticamente la
secuencia del gen del receptor Sigma-1 de ratón a
eliminar utilizando procedimientos de recombinación homóloga en
células ES de ratón, usando la secuencia AF030199 como referencia.
Las cajas negras representan las zonas codificantes mientras que las
cajas a rayas representan las secuencias 5' y 3' transcritas pero
no traducidas.
La Figura 5 muestra esquemáticamente las
secuencias de homología 5' y 3', de 6,8 y 3,1 kb de tamaño
respectivamente, seleccionadas para su inclusión en el vector de
recombinación homóloga pHR53TK con objeto de inactivar el gen del
receptor Sigma-1 de ratón. Las abreviaturas de los
enzimas de restricción se describen en la Figura 3.
La Figura 6 ilustra la verificación de la
secuencia de ADN en la fusión transcripcional entre la región 5' de
homología del gen del receptor Sigma-1 de ratón y
los primeros nucleótidos del gen indicador lacZ, presente en
el vector pHM2.
La Figura 7 muestra el mapa del vector de
recombinación homóloga para la inactivación del gen del receptor
Sigma-1 de ratón en células embrionarias ES. Se
indica el sitio de restricción único Sal I, que identifica
el punto de linealización del vector para su transfección en células
ES.
La Figura 8 ilustra el diseño experimental
utilizado para distinguir el alelo mutante del alelo salvaje del
gen del receptor Sigma-1 de ratón en análisis
mediante polimorfismos asociados a la digestión por enzimas de
restricción en análisis por transferencia de Southern.
La Figura 9 muestra el resultado de los análisis
mediante transferencia de Southern del ADN genómico correspondiente
a los 12 clones positivos de células ES recombinantes en donde se
muestran los polimorfismos esperados, tanto con la sonda 5' como
con la sonda 3'. Los carriles C y M representan ADN de células ES
control y un marcador de peso molecular.
La Figura 10 muestra el esquema de los ensayos
analíticos mediante PCR usado para establecer el genotipo de los
ratones portadores de alelos mutantes y salvajes del gen del
receptor Sigma-1.
La Figura 11 muestra los resultados de los
análisis mediante transferencia de Southern de ratones homocigotos
salvajes (+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-)
mediante digestión de ADN genómico con los enzimas Hind III
y EcoR I e hibridación consecutiva con las sondas 5' y 3',
respectivamente. Los tamaños de los fragmentos de ADN corresponden
a los esperados según el diseño experimental (Figura 8).
La Figura 12 muestra los resultados de los
análisis mediante transferencia de Northerndel receptor
Sigma-1 (mSR1) en ARN total de hígado, riñón,
cerebro y corazón aislado de ratones homocigotos salvajes (+/+),
heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-). Se incluye, en la
zona inferior, la fotografía de los ARN ribosomales utilizados como
control de carga.
La Figura 13 muestra los resultados de los
análisis mediante transferencia de Westernde ratones homocigotos
salvajes (+/+), heterocigotos (+/-) y homocigotos mutantes (-/-)
ilustrativos de la expresión del gen del receptor
Sigma-1 en cerebro de ratón usando un anticuerpo
policlonal específico frente al receptor Sigma-1 de
ratón.
La Figura 14 ilustra la actividad (función) del
receptor Sigma-1 de ratón mediante un ensayo de
unión específica al ligando [^{3}H]-pentazocina.
La Figura 14A es una gráfica en la que se representa la unión
específica (ordenadas) de dicho ligando a receptores
Sigma-1 de ratones homocigotos salvajes,
heterocigotos y homocigotos mutantes en función de la concentración
de ligando (abscisas). La Figura 14B es una gráfica que representa
la relación "ligando unido/ligando libre" (B/F) (ordenadas)
frente a la concentración de ligando unido (abscisas) en función
del origen de dichos receptores Sigma-1 (ratones
homocigotos salvajes, heterocigotos y homocigotos mutantes).
En un aspecto, la invención proporciona un
mamífero no humano mutante, deficiente en un receptor Sigma
endógeno, en adelante mamífero no humano mutante de la invención,
cuyo genoma contiene una mutación que comprende una disrupción en
un gen de un receptor Sigma endógeno.
El término "mamífero no humano", tal como
se utiliza en esta descripción, incluye a cualquier animal no humano
perteneciente a la clase de los mamíferos, por ejemplo, ratones. El
término "mamífero no humano mutante de la invención", tal como
aquí se utiliza, se refiere a un mamífero no humano que ha sido
manipulado para que sea deficiente en un receptor Sigma endógeno,
es decir, que tiene una mutación que impide la expresión normal del
producto del gen de un receptor Sigma y, por tanto, carece de
niveles detectables de ARN mensajero o proteína para el receptor
Sigma endógeno. Dicha expresión "mamífero no humano mutante de la
invención" incluye tanto mutantes heterocigotos (es decir, que
contienen un alelo mutante y un alelo tipo salvaje del gen del
receptor Sigma endógeno) como homocigotos. En una realización
particular y preferida de esta invención, el mamífero no humano
mutante de la invención es un mutante homocigoto, es decir, contiene
los dos alelos mutantes del gen del receptor Sigma endógeno dando
como resultado una expresión no detectable del producto génico.
El término "receptor Sigma", tal como aquí
se utiliza, se refiere al receptor Sigma de tipo 1
(Sigma-1).
La mutación presente en el genoma del mamífero
no humano de la invención puede estar presente tanto en las células
somáticas como en las células germinales del mamífero no humano
mutante de la invención. Ventajosamente, dicha mutación está
presente en las células germinales del mamífero no humano mutante de
la invención, confiriéndole de ese modo la capacidad de transferir
dicha mutación a su descendencia. Por tanto, en una realización
particular de esta invención, el mamífero no humano mutante de la
invención es fértil y puede transmitir la mutación que posee a su
descendencia.
La mutación presente en el mamífero no humano
mutante de la invención comprende una inserción, una supresión o
una mutación puntual que causa una disrupción funcional en un gen de
un receptor Sigma endógeno, dando lugar a un mamífero no humano
mutante deficiente en dicho receptor Sigma endógeno. En una
realización específica, el genoma del mamífero no humano mutante de
la invención comprende un transgen dentro de la mutación introducida
en el gen del receptor Sigma endógeno. A modo ilustrativo, dicho
transgen comprende un gen que codifica para un marcador de
selección positiva, por ejemplo, el gen de la neomicina
fosfotransferasa (neo) que codifica para la resistencia a
neomicina o cualquier otro de los marcadores de selección positiva
mencionados más adelante en relación con el vector de recombinación
homóloga con selección positiva-negativa
proporcionado por esta invención.
En una realización específica de esta invención,
se proporciona un ratón mutante, deficiente en el receptor
Sigma-1 endógeno, homocigoto para el gen del
receptor Sigma-1 endógeno, fértil, cuyo genoma
contiene una disrupción en dicho gen que comprende el gen
neo.
El mamífero no humano mutante de la invención
puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende la
introducción de una disrupción funcional en un gen de un receptor
Sigma endógeno presente en el genoma de una célula. En una
realización específica, dicha disrupción funcional se introduce
mediante recombinación homóloga en un gen de un receptor
Sigma-1 endógeno presente en el genoma de una célula
apropiada, tal como, por ejemplo, una célula diferenciada que
normalmente expresa dicho gen del receptor Sigma-1,
o una célula embrionaria ES pluripotente, mediante la introducción
de un vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa en dicha célula, y selección de
los homólogos recombinantes mediante la técnica de selección
positiva-negativa, los cuales pueden utilizarse
para la generación de los mamíferos no humanos mutantes de la
invención tal como se describe más adelante. Como alternativa, el
mamífero no humano mutante de la invención puede obtenerse mediante
técnicas de cruzamiento clásico, o fertilización in vitro,
entre mamíferos no humanos mutantes de la invención que actúen
como
progenitores.
progenitores.
En otro aspecto, la invención proporciona clones
recombinantes de células embrionarias ES pluripotentes
heterocigotas, es decir, que poseen uno de los alelos génicos de un
receptor Sigma mutado. A partir de dichas células se pueden obtener
quimeras y, a partir de éstas, mamíferos no humanos mutantes
deficientes en un receptor Sigma. En una realización específica,
dichas células embrionarias ES pluripotentes heterocigotas son
células de ratón a partir de las cuales se pueden obtener quimeras
y, a partir de éstas, ratones mutantes deficientes en un receptor
Sigma.
En otro aspecto, la invención proporciona un
vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa, en adelante vector de la
invención, que comprende:
- a)
- una primera región de homología, situada en el extremo 5' de una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha primera región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una primera secuencia de un gen de un receptor Sigma;
- b)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva;
- c)
- una segunda región de homología, situada en el extremo 3' de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva, en donde dicha segunda región de homología tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a una segunda secuencia de dicho gen del receptor Sigma, estando dicha segunda secuencia del gen del receptor Sigma en una posición 3' respecto a dicha primera secuencia del gen del receptor Sigma en un gen Sigma endógeno tipo salvaje; y
- d)
- una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador de selección negativa.
El receptor Sigma es un receptor
Sigma-1.
El vector de la invención puede ser utilizado
para introducir una disrupción funcional en un gen de un receptor
Sigma-1 endógeno, contenido en el genoma de una
célula mediante la técnica de recombinación homóloga y selección
positiva-negativa de los recombinantes homólogos,
los cuales pueden ser utilizados en la obtención de mamíferos no
humanos mutantes deficientes en un receptor Sigma endógeno.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección positiva está flanqueada en sus posiciones 5'
y 3' por unas secuencias de nucleótidos sustancialmente idénticas a
unas secuencias de dicho gen del receptor Sigma que corresponden a
dichas primera y segunda regiones de homología, respectivamente. Tal
como se utiliza en esta descripción, una secuencia de nucleótidos
es "sustancialmente idéntica" a una secuencia de un gen de un
receptor Sigma cuando dicha secuencia de nucleótidos tiene la
suficiente homología con la secuencia de dicho gen del receptor
Sigma como para permitir la recombinación homóloga entre dicha
secuencia de nucleótidos y una secuencia del gen Sigma endógeno en
una célula hospedadora. Típicamente, las secuencias de nucleótidos
de dichas primera y segunda regiones de homología son, al menos, un
90%, preferentemente, al menos, un 95% y aun más preferentemente,
un 100% idénticas a las secuencias de nucleótidos del gen del
receptor Sigma endógeno a las que van dirigidas para la
recombinación homóloga. Ventajosamente, dichas primera y segunda
regiones de homología son isogénicas con respecto al alelo endógeno
al que van dirigidas (es decir, el ADN de dichas regiones de
homología se aísla a partir de células del mismo fondo genético que
el de la célula en el que se va a introducir el vector de la
invención). Dichas regiones de homología deben tener una longitud
suficiente como para que tenga lugar la recombinación homóloga
entre el vector de la invención y el gen del receptor Sigma
endógeno en una célula hospedadora cuando el vector de la invención
se introduce en dicha célula. Típicamente, la longitud total de
dichas regiones de homología es de, al menos, 5 kilobases (kb),
preferentemente de, al menos, 10 kb.
En una realización específica, dichas primera y
segunda regiones de homología se eligen de manera que sus
secuencias de nucleótidos sean sustancialmente idénticas a sendas
secuencias de nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno que
flanqueen una región de dicho gen destinada a ser eliminada mediante
recombinación homóloga y reemplazada por la secuencia de
nucleótidos que codifica para un marcador de selección positiva.
Dichas primera y segunda regiones de homología
se elegirán en función de la secuencia del gen del receptor Sigma
endógeno en el que se desea introducir una disrupción que da lugar a
la ausencia de niveles detectables de receptor Sigma endógeno en el
homólogo recombinante y, consecuentemente, en función del animal
mutante, deficiente en el receptor Sigma endógeno, que se desea
obtener. Se han descrito la secuencia de ADNc que codifica para el
receptor Sigma-1 en conejillos de indias, la
secuencia de ADNc y el gen del receptor Sigma-1 en
humanos, la secuencia de ADNc y el gen del receptor
Sigma-1 en ratones, y la secuencia de ADNc que
codifica para el receptor Sigma-1 en ratas [4]-[8].
Códigos genómicos o de ADNc codificantes de receptores
Sigma-1 endógenos de animales para los que todavía
no se conoce su secuencia de nucleótidos pueden obtenerse por
procedimientos convencionales a partir de genotecas de células de
dichas especies a la vista de las secuencias de los genes de
receptores Sigma-1 conocidas debido a la elevada
homología observada entre las mismas.
Dichas primera y segunda regiones de homología
pueden obtenerse por métodos convencionales a la vista de la
secuencia de nucleótidos del gen del receptor Sigma en el que se
desea introducir una disrupción, por ejemplo, mediante el empleo de
la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o RT/PCR [transcripción
inversa/reacción en cadena de la polimerasa] utilizando los
oligonucleótidos iniciadores apropiados. En el Ejemplo 1.1 se
describe el aislamiento del gen del receptor
Sigma-1 de ratón.
En una realización específica, el vector de la
invención comprende una primera región de homología cuya secuencia
de nucleótidos es sustancialmente idéntica a una primera secuencia
de nucleótidos de 6,8 kb del gen del receptor
Sigma-1 de ratón y una segunda región de homología
cuya secuencia de nucleótidos es sustancialmente idéntica a una
segunda secuencia de nucleótidos de 3,1 kb de dicho gen del receptor
Sigma-1 de ratón, que delimitan una secuencia de
1,9 kb de dicho gen [véase la Figura 5] que se elimina mediante
recombinación homóloga con el vector de la invención.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección positiva confiere una característica de
selección positiva en las células que lo contienen, es decir,
permite seleccionar las células que contienen y expresan dicho
marcador de selección positiva frente a las células que no lo
contienen. La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección positiva puede estar operativamente unida a
unos elementos reguladores que controlan de forma independiente la
expresión de dicho marcador, constituyendo un módulo de expresión
de selección positiva, o bien el vector de la invención puede
construirse de manera que la expresión de dicho marcador tenga
lugar bajo el control de los elementos reguladores del gen del
receptor Sigma endógeno. Prácticamente cualquier marcador de
selección positiva puede ser utilizado en la construcción del vector
de la invención. Ejemplos ilustrativos de marcadores de selección
positiva pueden encontrarse, por ejemplo, en la descripción de la
patente norteamericana US 5.464.764. En una realización particular,
el vector de la invención contiene una secuencia de nucleótidos que
comprende el gen neo que confiere resistencia a la mortalidad
celular asociada al tratamiento con el antibiótico frente a la
neomicina o alguno de sus análogos, tales como el sulfato de
G418.
La secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección negativa está situada en una posición distal,
5' ó 3', respecto a dichas primera y segunda regiones de homología,
y está operativamente unida a los elementos reguladores que
controlan la expresión de dicho marcador de selección negativa
constituyendo un módulo de expresión de selección negativa.
Ventajosamente, dicha secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador negativo es sustancialmente "no idéntica" a ninguna
secuencia del gen del receptor Sigma, es decir, la secuencia de
nucleótidos que codifica para el marcador de selección negativa no
tiene la suficiente homología con ninguna secuencia del gen del
receptor Sigma como para permitir la recombinación homóloga entre
dichas secuencias, es decir, el grado de identidad entre los
nucleótidos de dicha secuencia de nucleótidos que codifica para el
marcador de selección negativa y la secuencia del gen del receptor
Sigma debe ser inferior al 45%, preferentemente inferior al 30% con
el fin de evitar recombinaciones indeseadas. Además, esta secuencia
de nucleótidos, ventajosamente, no es idéntica a ninguna otra
secuencia del genoma del mamífero no humano. El marcador de
selección negativa confiere una característica de selección negativa
en las células que lo contienen, es decir, permite seleccionar las
células que no contienen dicho marcador de selección negativa
frente a las células que lo contienen y expresan ya que estas
últimas morirán por acción del agente de selección negativa
mientras que las que no lo contienen sobrevivirán. Aunque
prácticamente cualquier marcador de selección negativa puede ser
utilizado en la construcción del vector de la invención,
preferentemente se elegirán aquellos que cumplan la condición de
que la secuencia de nucleótidos que codifica para dicho marcador de
selección negativa no sea sustancialmente idéntica a la secuencia
de nucleótidos del gen del receptor Sigma endógeno ni a ninguna
otra secuencia del genoma del mamífero no humano. Ejemplos
ilustrativos de marcadores de selección negativa pueden
encontrarse, por ejemplo, en la patente norteamericana US 5.464.764.
En una realización particular de esta invención, el vector de la
invención contiene una secuencia de nucleótidos que comprende el gen
de la timidina quinasa (tk) del virus del herpes simplex
(HSV). La síntesis de ADN puede interrumpirse en las células que
contienen y expresan dicho gen tk. Estas células pueden
eliminarse utilizando como agente de selección negativa el
ganciclovir o cualquier otro análogo nucleotídico
funcionalmente
equivalente.
equivalente.
En una realización específica, el vector de la
invención es un vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa que comprende unas primera y
segunda regiones de homología sustancialmente idénticas a unas
primera y segunda secuencias, respectivamente, del gen
Sigma-1 de ratón, una secuencia de nucleótidos que
comprende el gen neo y una secuencia de nucleótidos que
comprende el gen tk, tal como el vector denominado pHR53TK
[véase la Figura 7], que puede ser utilizado para transformar
células de ratón, por ejemplo, células embrionarias ES de ratón,
que contienen el gen del receptor Sigma-1 endógeno,
mediante recombinación homóloga y obtener células de ratón, en
primer lugar con uno de los alelos mutados del gen del receptor
Sigma-1 endógeno, y, en segundo lugar, mediante un
segundo evento de recombinación homóloga en el alelo salvaje
restante del genoma, que carecen de niveles detectables de ARN
mensajero o proteína para el receptor Sigma-1
endógeno. En el Ejemplo 1.2 se describe de forma detallada la
construcción del vector pHR53TK.
Para la construcción del vector de recombinación
homóloga con selección positiva-negativa
proporcionado por esta invención se pueden utilizar procedimientos
convencionales de digestión con enzimas de restricción y unión, y
similares, tales como los descritos por Sambrook et al.
[17].
El vector de la invención permite el empleo de
la técnica de selección "positiva-negativa"
para seleccionar los recombinantes homólogos, es decir, permite
seleccionar las células en las que se ha introducido dicho vector
ya que éstas contienen y expresan el marcador de selección positiva
pero han perdido el marcador de selección negativa como resultado
de la recombinación homóloga entre el vector y el gen del receptor
Sigma endógeno.
El vector de la invención puede ser utilizado
para introducir una disrupción funcional en el gen de un receptor
Sigma-1 endógeno presente en el genoma de una célula
de mamífero no humano, y crear homólogos recombinantes (células
hospedadoras recombinantes) que, a su vez, pueden ser utilizados
para generar mamíferos no humanos mutantes, deficientes en un
receptor Sigma endógeno. Para ello, el vector de la invención se
introduce en dicha célula por cualquier método convencional
adecuado para la introducción de un ADN exógeno en una célula, por
ejemplo, precipitación con fosfato cálcico, transfección,
microinyección, lipofección, etc., preferentemente mediante
electroporación. Tras la introducción del vector de la invención en
la célula hospedadora, ésta se cultiva durante un periodo de tiempo
apropiado bajo condiciones que permitan la recombinación homóloga
entre el vector de la invención y el gen del receptor Sigma
endógeno. Los recombinantes homólogos se seleccionan mediante el
proceso de selección positiva-negativa y se analiza
la existencia de recombinación homóloga en el locus del gen del
receptor Sigma endógeno por técnicas convencionales, por ejemplo,
mediante un análisis de transferencia de Southernutilizando una
sonda que permite diferenciar entre el alelo endógeno normal (tipo
salvaje) y el alelo del recombinante homólogo. En el Ejemplo 2.1 se
describe la inactivación del gen del receptor
Sigma-1 de ratón mediante recombinación homóloga en
células embrionarias ES de ratón y la obtención de ratones
quiméricos (quimeras) con una mutación en el gen del receptor
Sigma-1 de ratón mediante la técnica de agregación
de mórulas, evaluándose la transmisión por línea germinal de dicha
mutación mediante cruces de las quimeras respectivas con hembras de
una cepa receptora, tal como una hembra de la cepa no consanguínea
CD-1, cuyo pelaje albino es netamente distinguible
del pelaje pigmentado característico de los ratones híbridos F_{1}
generados a partir de cruces entre las cepas 129X1/SvJ y 129S1/Sv
del cual derivan las células ES R1 utilizadas en el proceso de
recombinación homóloga.
Los recombinantes homólogos (células
hospedadoras recombinantes), que contienen un alelo del gen del
receptor Sigma mutado, pueden utilizarse para generar los mamíferos
no humanos mutantes de la invención. Para ello, dichas células
hospedadoras recombinantes que contienen una disrupción en el gen
del receptor Sigma endógeno se introducen en embriones por métodos
convencionales, por ejemplo, mediante agregación de las células
recombinantes con embriones en fase de 8 células (mórulas), los
cuales son posteriormente implantados en mamíferos hembras
receptoras pseudogestantes y se deja que los embriones se
desarrollen a término. Los animales resultantes son unas quimeras
sobre las que se analiza la transmisibilidad de la mutación por vía
germinal. Las quimeras capaces de transmitir eficazmente el
genotipo de las células hospedadoras a su descendencia a través de
la línea germinal se cruzan con mamíferos no humanos tipo salvaje
para obtener mutantes heterocigotos para la disrupción del gen
Sigma endógeno en células somáticas y germinales. Posteriormente,
los mutantes heterocigotos se cruzan entre sí para obtener mutantes
homocigotos. El Ejemplo 2.2 describe la obtención de ratones
mutantes (heterocigotos y homcigotos) para el gen del receptor
Sigma-1 endógeno verificándose que eran deficientes
en dicho gen tal como se describe en el Ejemplo 2.3 mediante los
correspondientes análisis estructurales, de expresión y función, en
los ratones mutantes homocigotos.
La descendencia de un mamífero no humano mutante
de la invención, que constituye un aspecto adicional de esta
invención, puede obtenerse mediante procedimientos convencionales,
por ejemplo, mediante técnicas de cruzamiento clásico entre
mamíferos no humanos mutantes de la invención (progenitores) o bien,
alternativamente, mediante fertilización in vitro de huevos
y/o esperma de los mamíferos no humanos mutantes de la invención o
mediante clonación, por transferencia nuclear y reconstrucción
posterior de óvulos enucleados con núcleos de células mutantes o
portadoras de la mutación de tipo embrionario o somático. Tal como
se utiliza en esta descripción, el término "descendencia" y
"descendencia de un mamífero no humano mutante de la invención"
se refiere a todos y cada uno de los descendientes de cada
generación posterior a la de los mamíferos no humanos originalmente
transformados.
Los mamíferos no humanos mutantes de la
invención pueden ser utilizados como animales control para la
realización de ensayos in vivo (véase más adelante).
Asimismo, los mamíferos no humanos mutantes de la invención pueden
ser utilizados como fuente de células somáticas, fetales o
embrionarias, las cuales, una vez aisladas y cultivadas pueden ser
utilizadas en ensayos in vitro. Además, si se desea, se
pueden preparar líneas celulares inmortalizadas a partir de dichas
células mediante el empleo de técnicas convencionales
[18-21]. Por tanto, en otro aspecto, la invención
proporciona una línea celular aislada derivada del mamífero no
humano mutante de la invención. En una realización particular,
dicha línea celular proporcionada por esta invención es una línea
celular murina, por ejemplo, una línea de células embrionarias ES
de ratón que comprende una mutación en el gen del receptor
Sigma-1 de ratón en donde dicha línea celular carece
de niveles detectables de receptor Sigma-1.
\newpage
Los mamíferos no humanos mutantes de la
invención pueden ser utilizados, además, como animales modelo para
estudiar el papel desempeñado in vivo por el receptor
Sigma-1 endógeno y como animales control para la
realización de ensayos in vivo.
El receptor Sigma-1 parece estar
implicado en desórdenes del sistema nervioso central, tales como la
ansiedad, depresión o esquizofrenia, en alteraciones de la memoria,
por ejemplo, amnesia, y en condiciones de estrés y adicción a
drogas. Asimismo, dicho receptor Sigma-1 parece
estar implicado en procesos de analgesia y neuroprotección. Por
tanto, un mamífero no humano mutante, deficiente en el receptor
Sigma-1, proporcionado por esta invención, puede
resultar útil tanto para el estudio de tales situaciones así como
para la validación y/o el desarrollo de fármacos diseñados para
regular o paliar los efectos de las alteraciones y condiciones
patológicas en las que estén implicados dichos receptores
Sigma-1.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se
refiere al empleo de un mamífero no humano mutante de la invención,
o de una línea celular proporcionada por esta invención, deficiente
en el receptor Sigma-1, para evaluar compuestos
potencialmente útiles destinados a
- prevenir y/o tratar desórdenes del sistema nervioso central, por ejemplo, ansiedad, esquizofrenia o depresión;
- prevenir y/o tratar alteraciones de la memoria, por ejemplo, amnesia;
- prevenir y/o tratar condiciones de estrés;
- prevenir y/o tratar condiciones de adicción a drogas;
- producir analgesia; o
- producir neuroprotección.
En otro aspecto, la invención se relaciona con
un procedimiento para determinar el efecto de un compuesto a
ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en el receptor
Sigma-1 endógeno, que comprende poner en contacto
un mamífero no humano mutante de la invención con el compuesto a
ensayar y detectar la presencia o ausencia de un cambio fisiológico
en dicho mamífero no humano mutante en respuesta al contacto con
dicho compuesto; o bien, administrar dicho compuesto a ensayar a un
mamífero no humano control que expresa el receptor
Sigma-1 endógeno correspondiente, y observar si
dicho compuesto produce un efecto sobre el fenotipo en dicho
mamífero no humano mutante cuando se compara con el mamífero no
humano control. Cualquier efecto observable sobre el fenotipo
podría estar relacionado, en principio, con la función (o
disfunción) del receptor Sigma considerado.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento para determinar el efecto de un compuesto sobre
células que expresan el receptor Sigma-1 y sobre
células que no expresan dicho receptor Sigma, que comprende
introducir dicho compuesto a ensayar en una población de células, o
en un homogeneizado de dichas células, en donde dichas células son
células aisladas o establecidas a partir de un mamífero no humano
mutante de la invención, administrar dicho compuesto a ensayar a
una población de células de mamífero no humano control, o a un
homogeneizado de las mismas, que expresa el correspondiente receptor
Sigma funcional, y observar o analizar si dicho compuesto a ensayar
produce un efecto sobre la expresión de dicho receptor Sigma en las
células de dicho mamífero no humano mutante de la invención cuando
se compara con células de mamífero no humano control. En principio,
cualquier efecto observable sobre el fenotipo podría estar
relacionado con la función (o disfunción) del receptor Sigma
considerado.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma. La
combinación de los Ejemplos 1 y 2 describe de forma detallada un
procedimiento para la generación de ratones mutantes en el gen del
receptor Sigma-1 endógeno que carece de niveles
detectables del receptor Sigma-1 de ratón. En el
Ejemplo 1 se describe el aislamiento y clonación del gen del
receptor Sigma-1 de ratón y la construcción de un
vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa, mientras que en el Ejemplo 2 se
describe la transfección de células ES de ratón y la generación de
ratones mutantes deficientes en el receptor Sigma-1
murino.
A partir de las secuencias publicadas del ADNc y
del gen del receptor Sigma-1 de ratón [8] se
diseñaron cuatro oligonucleótidos con el objetivo de aislar y
clonar dicho gen. Las características de dichos oligonucleótidos,
denominados MS1, MS2, MS3 y MS4, se detallan en la Tabla I. Las
posiciones relativas de estos oligonucleótidos, respecto a las
secuencias publicadas del ADNc y del gen de ratón, se representan
esquematizadas en la Figura 1.
Estos oligonucleótidos se usaron para obtener
fragmentos específicos de ADN del tamaño esperado a partir de ADN
genómico y ARN total de ratón de las cepas NMRI y BALB/C, utilizando
protocolos de PCR y RT/PCR habituales [9]. Se utilizaron
inicialmente las parejas de oligonucleótidos MS1/MS3 y MS2/MS4 que
produjeron, mediante PCR sobre ADN genómico, fragmentos de 1160 y
2246 pares de bases (pb), respectivamente. Además, a partir de ARN
total, mediante RT-PCR se clonó el ADNc
correspondiente al fragmento de 1020 pb a partir del par de
oligonucleótidos MS2/MS4. Los fragmentos de ADN obtenidos fueron
subclonados en el vector plasmídico Bluescript KS+ (Stratagene),
usando métodos habituales [9]. En la Figura 1 se describen los
plásmidos obtenidos con secuencias del ADNc y del gen. En
particular se describe el plásmido pmcS1/N, que corresponde
al fragmento ADNc de 1020 pb, obtenido a partir de los
oligonucleótidos MS2/MS4, que posteriormente fue usado para la
obtención de clones genómicos del gen del receptor
Sigma-1 de ratón.
La clonación, por PCR y por RT/PCR, de los
diferentes fragmentos genómicos y de ADNc correspondientes al gen
del receptor Sigma-1 de ratón proporcionó sondas
genéticas específicas para ser utilizadas en el aislamiento de
clones genómicos intactos de una genoteca de ratón. Dado que el
objetivo último reside en la obtención de un ratón mutante para
este gen se debe procurar obtener clones secuencias isogénicas (esto
es, de la misma cepa de ratón) con objeto de optimizar el proceso
de recombinación homóloga en las células embrionarias pluripotentes
ES [10]. Las células ES de ratón que se utilizaron, células ES R1
[11], provienen de un híbrido F1 de dos sub-cepas
de ratón 129/Sv [129X1/SvJ x 129S1/SvJ]. Por ello, se decidió
abordar el aislamiento de clones genómicos a partir de una genoteca
comercial preparada a partir de ADN de ratones 129/Sv (Stratagene,
Cat. Nr. nº 946313). Se analizaron 1 x 10^{6} clones
recombinantes de la genoteca distribuidos en 6 placas grandes (Nunc,
243 mm x 243 mm, 530 cm^{2}) a razón de 170.000 fagos por placa,
aproximadamente. Se procedió a obtener dos réplicas consecutivas de
cada placa en membrana de Nylon (Hybond-N,
Amersham). Estas membranas fueron hibridadas con la sonda
específica correspondiente al inserto del plásmido pmcS1/N,
siguiendo protocolos habituales [9].
Inicialmente se identificaron nueve señales
específicas (en ambos duplicados de las réplicas) y se procedió a
purificar los bacteriófagos presentes en las placas que habían dado
señal positiva, siguiendo protocolos habituales [9]. La utilización
de los oligonucleótidos mencionados (MS1, MS2, MS3 y MS4) y el
análisis mediante transferencia de Southernpermitió comprobar que
cuatro de estos clones seleccionados (\lambdaSg1, \lambdaSg2,
\lambdaSg5, \lambdaSg6) contenían la totalidad del gen del
receptor Sigma-1 de ratón. En la Figura 2 se
presenta el mapa de las secuencias colindantes al gen del receptor
Sigma-1 de ratón obtenido a partir del solapamiento
de los mapas de los cuatro clones de bacteriófagos mencionados. Se
constató la obtención novedosa del mapa estructural de unas 30
kilobases (kb) circundantes al gen, lo cual excedía de la
información publicada y depositada en las bases de datos (inferior
a 7 kb, centradas alrededor del gen) [6]. Estas secuencias se
subclonaron en plásmidos para poder ser utilizadas en la
construcción del vector de la recombinación homóloga con selección
positiva-negativa. En la Figura 3 se representan los
diferentes clones originales obtenidos con secuencias genómicas
correspondientes a secuencias situadas en la región 5' y 3' del
gen.
Para la construcción del vector de recombinación
homóloga con selección positiva-negativa denominado
pHR53TK se utilizó, como plásmido de soporte e inicio de los
sucesivos clonajes, el vector pHM2 [12] (8451 pares de bases, Base
de datos GenBank, Código de acceso: X76682), el cual ya había sido
utilizado con éxito en la preparación de vectores de recombinación
homóloga que habían conducido a la inactivación efectiva de otros
genes del ratón, véase, por ejemplo [13].
A partir del plásmido pmgS1 Eag6.7 (véase la
Figura 3) se obtuvo, mediante digestión con el enzima de restricción
Bgl II, un fragmento de 3,1 kb portador de la secuencia de
homología 3' del gen del receptor Sigma-1 de ratón.
Este fragmento Bgl II de 3,1 kb se insertó en el plásmido
pHM2, previamente digerido con el mismo enzima, cuyo único sitio de
corte para Bgl II se sitúa en la posición 8171, generándose
el plásmido intermedio pHR3A, con un tamaño de 11,6 kb.
Seguidamente, sobre el plásmido pHR3A se insertó, en el sitio único
de corte para el enzima de restricción Pml I (posición 2259
relativa al plásmido pHM2), la secuencia de homología 5' del gen
del receptor Sigma-1 de ratón, obtenida como un
fragmento de 6,8 kb mediante digestión con los enzimas Sal I
y Sac II a partir del ADN del bacteriófago \lambdaSg6
(Figura 2). La posterior fusión, previa conversión a extremos romos
de las secuencias de ADN, del sitio Sac II (de la secuencia
del gen del receptor Sigma-1 de ratón, posición
3356 de la secuencia AF030199) y Pml I (del vector pHR3A)
permitió obtener la fusión transcripcional entre los primeros
cuatro aminoácidos del gen del receptor Sigma-1 con
el resto de aminoácidos del gen indicador lacZ, presente en
el vector original pHM2 [12]. La adición de la secuencia de
homología 5' del gen del receptor Sigma-1 permitió
obtener el plásmido intermedio pHR53, el cual delimitaba
exactamente los nucleótidos a suprimir (supresión) del gen entre las
posiciones 3356 (Sac II) y 5263 (Bgl II), relativas a
la secuencia original del gen depositada en GenBank AF030199. En
efecto, esto producía la eliminación de 1907 nucleótidos, los
cuales incluyen la práctica totalidad de secuencias codificantes
para el gen del receptor Sigma-1 de ratón, con la
excepción de los primeros cuatro aminoácidos. En la Figura 4 se
representan gráficamente los límites precisos de la secuencia cuya
eliminación estaba prevista realizar a través de recombinación
homóloga en células ES de ratón (Ejemplo 1.3). En la Figura 5 se
puede observar la posición relativa de las secuencias de homología
5' y 3', de 6,8 y 3,1 kb de tamaño y presentes en el vector pHR53,
respecto al solapamiento de 30 kb previamente descrito. Estas
secuencias de homología 5' y 3' a su vez delimitan la zona del gen
del receptor Sigma-1 a eliminar, de un tamaño de 1,9
kb.
Con objeto de verificar la presencia y fusión
exacta de los fragmentos de ADN utilizados para la construcción del
vector pHR53 se procedió a secuenciar los extremos de los mismos. En
particular, se verificó la fusión transcripcional entre los
primeros nucleótidos codificantes del gen del receptor
Sigma-1 de ratón con la secuencia codificante para
el gen indicador lacZ, tal y como se presenta en la Figura
6.
Finalmente, con objeto de obtener un vector de
recombinación homóloga con selección
positiva-negativa sobre el que poder aplicar los
procedimientos de selección positiva (gen de resistencia a
neomicina, presente en el plásmido pHM2) combinados con los de
selección negativa [14] (gen de resistencia a ganciclovir, timidina
quinasa del virus del herpes simplex, HSV-TK,
ausente en el plásmido pHM2 pero presente en el plásmido pPNT [15])
se procedió a clonar el módulo de expresión con el gen
HSV-TK en el sitio de restricción Not I del
plásmido pHR53 a través de una construcción intermedia en la que se
obtuvo el gen HSV-TK en el vector pSX [12],
generándose finalmente sobre éste último plásmido el vector
pHR53TK de 20,8 kb de tamaño, cuyo mapa se muestra en la
Figura 7. El plásmido pHR53TK ha
sido depositado en la CECT con fecha 4 de octubre de 2002 y le ha correspondido el número de acceso CECT 5737.
sido depositado en la CECT con fecha 4 de octubre de 2002 y le ha correspondido el número de acceso CECT 5737.
Una vez construido el vector pHR53TK se
linearizó mediante digestión con el enzima de restricción Sal
I (Figura 7). A continuación, 20 \mug del vector pHR53TK
linearizado se utilizaron para transfectar 9,6 x 10^{6} células
ES R1 [11] mediante electroporación (condiciones de electroporación:
500 \muF, 250 V). A las 24 horas se inició el proceso de
selección positiva mediante la adición de 300 \mug/ml del
antibiótico G418. A las 48 horas se adicionó la droga ganciclovir,
para el proceso de selección negativa, hasta alcanzar una
concentración final de 2 \muM. Ocho días más tarde se procedió a
identificar clones recombinantes independientes (resistentes a G418
y ganciclovir) que fueron subcultivados por separado. Todo el
proceso se realizó en presencia de fibroblastos embrionarios de
ratón (MEFs) resistentes a G418 y del factor de crecimiento L.I.F.
(factor de inhibición de leucemia) para inhibir la diferenciación
espontánea de las células ES pluripotentes. En todo momento se
siguieron protocolos descritos en la literatura para el cultivo,
transfección y manipulación de células ES de ratón [10]
(información relativa al proceso de selección
positiva-negativa se puede obtenerse, por ejemplo,
en las patentes norteamericanas US 5.464.764, US 5.487.992, US
5.627.059 y US 5.631.153).
Se analizaron un total de 272 clones
recombinantes de células ES de ratón mediante el procedimiento de
transferencia de Southern, descrito en la literatura [9]. Para ello
se diseñaron dos sondas, una sonda 5' y otra sonda 3', alejadas de
las zonas de homología del gen del receptor Sigma-1
de ratón incluidas en el vector pHR53TK con el objetivo de
identificar dos polimorfismos en el tamaño de fragmentos de
restricción. Así pues, mediante digestión con el enzima de
restricción Hind III y utilizando la sonda 5' se podía
distinguir el alelo salvaje (10,7 kb) del alelo mutante (19 kb) del
gen del receptor Sigma-1 de ratón. De igual manera,
mediante digestión con el enzima de restricción EcoR I y
utilizando la sonda 3' se podía distinguir el alelo salvaje (13,7
kb) del alelo mutante (11,9 kb) del gen del receptor
Sigma-1 de ratón. En la Figura 8 se indica el diseño
experimental utilizado para diferenciar el alelo mutante del alelo
salvaje del gen del receptor Sigma-1 de ratón.
De los 272 clones de células ES independientes
analizados 12 (es decir, un 4,4%) presentaron los polimorfismos
esperados utilizando la sonda 5' y la sonda 3' (Figura 8). En la
Figura 9 se muestra el resultado de los análisis mediante
transferencia de Southern del ADN genómico correspondiente a estos
12 clones de células ES.
Seguidamente se seleccionaron 4 clones
recombinantes positivos de células ES independientes con el objeto
de proceder a la generación de los ratones quiméricos (quimeras)
correspondientes, mediante la técnica de agregación de mórulas,
utilizando procedimientos descritos en la literatura [10], [11]. Las
condiciones experimentales para la agregación de las células ES
recombinantes (en número promedio de 10) con embriones en fase de
8-células (mórulas) de la cepa de ratón
CD-1 comprendían el empleo de un 4% de medio
condicionado de células ES en el proceso de agregación.
Usando estas condiciones se identificaron 11
quimeras supervivientes, obtenidas a partir de 19 quimeras
inicialmente identificadas a término entre los 40 fetos que
lograron progresar en su gestación a partir de 382 embriones
agregados y transferidos. En la Tabla II aparece, de forma resumida
el proceso de agregación utilizado.
Las once quimeras supervivientes obtenidas
correspondían a dos clones de células ES independientes, el clon nº
8 y el clon nº 175, siguiendo las recomendaciones incluidas en los
protocolos habituales de generación de quimeras, que exigen la
obtención de la mutación por lo menos a partir de dos clones
independientes para evitar problemas inherentes a un determinado
clon que pudieran generar un fenotipo anómalo del ratón mutante
[10].
Seguidamente se evaluó la transmisión por línea
germinal de la mutación mediante cruces de las quimeras respectivas
con hembras de la cepa receptora CD-1, cuyo pelaje
albino es netamente distinguible del pelaje pigmentado
característico de las cepas 129Sv de las que derivan las células ES
R1 utilizadas en el proceso de recombinación homóloga [11].
En la Tabla III se describen los resultados de
los análisis de transmisión del fenotipo pigmentado (asociado al
genotipo presente en las células ES) realizados sobre las 11
quimeras identificadas.
Los análisis de transmisibilidad demostraron que
cuatro quimeras independientes (1 derivada del clon nº 175 y 3
derivadas del clon nº 8) fueron capaces de transmitir eficazmente
(al 100 %) el genotipo de las células ES a su descendencia, a
través de la línea germinal. Estos animales F1 fueron utilizados
para analizar la presencia del alelo mutante y, mediante cruces
sucesivos, generar el correspondiente ratón mutante.
Una vez verificada la transmisión a línea
germinal en cuatro de las once quimeras obtenidas (con individuos
representantes de los dos clones ES recombinantes utilizados) por la
presencia de pigmentación en las crías F1 obtenidas a partir de los
cruces con ratones albinos CD-1 se verificó la
presencia de alelos mutados del gen del receptor
Sigma-1. La detección de pigmentación no garantiza
la presencia del alelo mutado puesto que solamente un 50% heredará
el alelo portador de la mutación, el 50% restante heredará el alelo
salvaje, intacto, de las células ES originales. Por ello, y para la
posterior identificación de individuos homocigotos mutantes y
salvajes, se diseñaron dos ensayos analíticos mediante la técnica de
PCR (PCR-Sigma y PCR-Neo, Figura
10), usando métodos habituales [9] que permitían identificar
inequívocamente los tres genotipos, concretamente: homocigotos
salvajes, heterocigotos (portadores de la mutación) y homocigotos
mutantes (Véase la Tabla IV).
La técnica PCR-Sigma utiliza los
oligonucleótidos MS1 y MS3 [Tabla I] que solamente pueden amplificar
un fragmento de ADN específico de 1,16 kb cuando alguno de los dos
alelos del gen del receptor Sigma-1 está intacto. De
forma similar, la PCR-Neo emplea dos
oligonucleótidos específicos e internos al gen que confiere
resistencia a la neomicina (gen neo) [Neo 1 (SEQ. ID. NO: 5)
y Neo 2 (SEQ. ID. NO: 6)], que amplifican una fragmento de ADN
específico de 0,7 kb solamente si alguno de los dos alelos
transporta la mutación inicialmente detectada en las células
ES.
En la Tabla V se detalla la identificación de
individuos heterocigotos entre los individuos obtenidos en la F1
resultante de cruces entre quimeras transmisoras y hembras
CD-1. Solamente los individuos pigmentados fueron
analizados mediante la PCR-Neo. La detección de la
banda analítica de 0,7 kb indica que ese individuo es portador de
la mutación en uno de los alelos del gen del receptor
Sigma-1. Aproximadamente la mitad de los individuos
pigmentados, en cada uno de los dos clones, corresponden a ratones
chinchilla. La otra mitad son ratones agouti, el pelaje salvaje. De
igual manera, un poco menos de la mitad de los individuos F1
pigmentados resultaron ser, en cada uno de los dos clones
analizados, heterocigotos y por lo tanto portadores de la
mutación.
Una vez identificados suficientes individuos
heterocigotos (de los dos sexos) de cada uno de los dos clones ES
utilizados, se establecieron cruces entre estos individuos
heterocigotos con el objetivo, según las leyes de la Genética
Clásica (Mendel), de lograr detectar individuos mutantes
(homocigotos para el alelo mutante) en la segunda generación (F2)
resultante.
La obtención del genotipo de los animales F2
generados se basó en los dos ensayos analíticos por PCR
(PCR-Sigma y PCR-Neo) anteriormente
descritos (véase la Tabla IV). El resultado de estos cruces y los
números totales de cada uno de los tres genotipos obtenidos en los
individuos de la segunda generación se detallan en la Tabla VI.
Según las leyes de Mendel el resultado del cruce
entre dos individuos heterocigotos, con dos alelos distintos para
un mismo locus, se distribuye como sigue: 25% de individuos salvajes
(+/+), 50% de individuos heterocigotos (+/-) y 25% de homocigotos
mutantes (-/-). En la Tabla VII se comparan los resultados obtenidos
en la F2 (Tabla VI) frente a los esperados, según las leyes de
Mendel.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis estadístico de estos datos da como
resultado, en ambos casos, un valor \chi^{2} calculado inferior
al tabulado para p=0,05 y (3-1 = 2) 2 grados de
libertad (\chi^{2} = 5,991) [Clon ES nº 175 \chi^{2} =
3,785; Clon ES nº 8 \chi^{2} = 0,125] por lo que se puede
concluir, que la distribución de genotipos se ajusta a la prevista
según Mendel (p=0,05). No es pues estadísticamente significativa la
ligera disminución de mutantes identificados respecto a los valores
teóricamente esperados.
Como conclusión adicional a este primer análisis
se puede añadir que se obtienen, por igual, machos y hembras
homocigotos mutantes. La distribución por sexos entre los
homocigotos mutantes identificados se ajusta a lo esperable (50% de
cada sexo), no observándose, por el momento desviaciones
estadísticamente significativas. En el caso del clon ES nº 175 de
los 28 mutantes detectados 13 son machos, mientras que en el caso
del clon ES nº 8 de los 11 mutantes detectados 4 son machos. Ambos
valores se acercan a la normalidad y siguen la distribución
esperada (p=0,05, grados de libertad=1, \chi^{2}
calculado=3,841) [Clon ES nº 175 \chi^{2} = 0,143; Clon ES nº 8
\chi^{2} = 0,818].
\newpage
Adicionalmente se ha observado que tanto las
hembras como los machos homocigotos mutantes son fértiles, por lo
que han podido obtenerse colonias de esta mutación estables. No se
ha detectado manifestación externa ni observable que,
aparentemente, distinga a los ratones mutantes de los ratones
salvajes. No obstante, los ratones están siendo analizados
pormenorizadamente para evaluar el efecto de la mutación en el gen
del receptor Sigma-1 mediante paradigmas
encaminados a dilucidar su participación en procesos de analgesia,
adicción, depresión, psicosis y esquizofrenia usando métodos
habituales en esta área de conocimiento [16].
La mutación se ha obtenido y analizado en dos
fondos genéticos mixtos distintos (129Sv x CD-1 y
129Sv x C57BL/6J).
Una vez generados los ratones mutantes para el
gen del receptor Sigma-1 de ratón se verificó la
ausencia del gen (ADN), de expresión del mismo (RNA mensajero), de
proteína y de actividad (función) para verificar que, en efecto,
los ratones mutantes eran deficientes en el gen del receptor
Sigma-1.
En primer lugar se analizó la presencia de los
polimorfismos asociados a las sondas 5' y 3' que permiten detectar
los alelos mutantes y salvajes de forma inequívoca. Para ello se
analizó ADN genómico de ratones salvajes, heterocigotos y mutantes
para el gen del receptor Sigma-1. El resultado del
análisis por transferencia de Southernse incluye en la Figura 11.
Los resultados obtenidos permiten concluir, inequívocamente, la
presencia del alelo mutante según el diseño experimental
previsto.
En segundo lugar se evaluó la expresión del gen
del receptor Sigma-1 en diferentes órganos de
ratones mutantes, heterocigotos y salvajes en los cuales el gen
habitualmente está presente [5]. Para estos análisis de expresión
se utilizó la técnica de transferencia de Northern, siguiendo
protocolos descritos en el área [9]. A continuación, en la Figura
12, se observa la ausencia de señal en aquellos carriles del gel que
corresponden a ARN totales de animales homocigotos mutantes, y por
lo tanto carentes del gen del receptor Sigma-1. En
conclusión, no solamente no está el gen del receptor
Sigma-1 sino que además es imposible encontrar ARN
mensajeros (transcritos) que permitan documentar su expresión. En
efecto, el ratón mutante no expresa el gen del receptor
Sigma-1.
En tercer lugar se evaluó la expresión del gen
del receptor Sigma-1 en cerebro de ratones mutantes,
heterocigotos y salvajes mediante la localización de la proteína
correspondiente en extractos proteicos por un anticuerpo policlonal
específico. Para ello, se utilizó la técnica de transferencia de
Western. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 13,
donde no se observan niveles detectables de proteína (receptor
Sigma-1) en los extractos proteicos de cerebro
procedentes de ratones mutantes homocigotos para el gen
Sigma-1.
En cuarto lugar se evaluó la actividad (función)
del receptor Sigma-1 de ratón mediante un ensayo de
unión específica al ligando [^{3}H]-pentazocina.
Brevemente, cerebros de ratones mutantes (-/-), heterocigotos (+/-)
y salvajes (+/+) fueron homogeneizados y los homogeneizados se
centrifugaron varias veces en distintas condiciones de velocidad
para obtener la fracción de membrana. Posteriormente, se procedió a
la incubación de muestras de la fracción de membrana obtenidas con
el radioligando [^{3}H]-pentazocina en condiciones
de unión óptima para este receptor (37ºC, durante
130-170 minutos), filtración de las muestras, lavado
de las muestras y lectura del conteo de radiactividad presente en
el filtrado [22]. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura
14 y ponen de manifiesto la ausencia de actividad (función) en los
ratones mutantes homocigotos.
En quinto lugar se evaluó la función del
receptor Sigma-1 frente a paradigmas y protocolos de
conducta y comportamiento conocidos. En este sentido no se han
detectado diferencias estadísticamente significativas en el
comportamiento de los ratones mutantes frente a los salvajes en la
siguiente lista de ensayos o paradigmas analizados. Solamente se
han observado diferencias estadísticamente significativas frente a
ratones salvajes en la respuesta de hiperactividad (hipermotilidad)
inducida por el ligando SKF-10047 (datos no
mostrados).
Un cultivo de Escherichia coli Top10F',
denominado pHR53TK conteniendo el vector de plásmido pHR53TK ha
sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo, CECT,
Burjasot, Valencia (España), el 4 de octubre de 2002,
correspondiéndole el número de acceso CECT 5737.
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deficientes en receptores Sigma y sus aplicaciones
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<160> 6
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador MS1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador MS2
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<400> 2
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<210> 3
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido iniciador MS3
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<400> 3
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<212> ADN
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<223> Oligonucleótido iniciador MS4
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<223> Oligonucleótido iniciador Neo 1
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\hfill20
Claims (16)
1. Un mamífero no humano mutante, deficiente en
un receptor Sigma-1 endógeno, cuyo genoma contiene
una mutación que comprende una disrupción en un gen de un receptor
Sigma-1 endógeno, en donde dicha disrupción génica
da lugar a un mamífero no humano mutante que carece de niveles
detectables de receptor Sigma-1 endógeno, que es
fértil y que es un ratón; obtenible mediante el uso del vector
identificado como pHR53TK, depositado en la CECT con el número de
acceso CECT 5737 para insertar una disrupción funcional en el
receptor Sigma-1
endógeno.
endógeno.
2. Mamífero no humano mutante según la
reivindicación 1, en el que dicho mamífero no humano mutante es un
mutante homocigoto para dicha mutación.
3. Vector identificado como pHR53TK, depositado
en al CECT con el número de acceso nº CECT 5737.
4. Una célula hospedadora cuyo genoma contiene
un gen de un receptor Sigma-1 endógeno transfectado
con un vector conforme para ser transfectado con un vector según la
reivindicación 3.
5. Célula según la reivindicación 4, en la que
dicha célula hospedadora cuyo genoma contiene un gen de un receptor
Sigma-1 endógeno se selecciona entre una célula
diferenciada que normalmente expresa el producto del gen del
receptor Sigma-1 y una célula embrional pluripotente
no humana.
6. Célula según la reivindicación 5, que
comprende un alelo mutado del gen del receptor
Sigma-1.
7. Una célula aislada a partir de un mamífero no
humano mutante, deficiente en un receptor Sigma endógeno, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o de su descendencia que
contiene la mutación que implica una disrupción del gen del
receptor Sigma-1 endógeno que da lugar a una célula
aislada que carece de niveles detectables de receptor
Sigma-1 endógeno.
8. Célula según la reivindicación 7, que
comprende ambos alelos mutados del gen del receptor
Sigma-1.
9. Célula según cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, propagada y, opcionalmente,
inmortalizada.
10. La descendencia de un mamífero no humano
mutante, deficiente en el receptor Sigma-1 endógeno,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 caracterizado
porque su genoma contiene la mutación que implica una disrupción
del gen del receptor Sigma-1 que da lugar a una
célula aislada que carece de niveles detectables del receptor
Sigma-1 endógeno.
11. Un procedimiento para la obtención de un
mamífero no humano mutante según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 2, que comprende la introducción de una disrupción funcional en
un gen del receptor Sigma-1 endógeno presente en el
genoma de una célula, por recombinación homóloga en dicha célula
entre un alelo de un gen de un receptor Sigma-1
endógeno y un vector de recombinación homóloga con selección
positiva-negativa según la reivindicación 3, la
selección de los homólogos recombinantes mediante la técnica de
selección positiva-negativa, la introducción de
dichos homólogos recombinantes en embriones, su implantación en
mamíferos hembra receptoras pseudogestantes y su desarrollo a
término, la selección de las quimeras capaces de transmitir
eficazmente el genotipo de los homólogos recombinantes a su
descendencia a través de la línea germinal; el cruzamiento de dichas
quimeras con mamíferos no humanos tipo salvaje para obtener
mutantes heterocigotos para la disrupción del gen del receptor
Sigma-1 endógeno y, si se desea, el cruzamiento de
dichos mutantes heterocigotos entre sí para obtener mutantes
homocigotos.
12. El uso de un mamífero no humano mutante
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, como animales
control para ensayos in vivo.
13. Uso de un mamífero no humano deficiente en
el receptor Sigma-1, de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, o de una línea celular deficiente en el
receptor Sigma-1, según las reivindicaciones 4 a 9
para evaluar compuestos potencialmente útiles destinados a:
- prevenir y/o tratar desórdenes del sistema nervioso central;
- prevenir y/o tratar alteraciones de la memoria;
- prevenir y/o tratar condiciones de estrés;
- prevenir y/o tratar condiciones de adicción a drogas;
- producir analgesia; o
- producir neuroprotección.
14. Un procedimiento para determinar el efecto
de un compuesto a ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en
un gen del receptor Sigma-1 endógeno, que comprende
poner en contacto un mamífero no humano mutante según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 2 con dicho compuesto a ensayar y detectar
la presencia o ausencia de un cambio fisiológico en dicho mamífero
no humano mutante en respuesta al contacto con dicho compuesto.
15. Un procedimiento para determinar el efecto
de un compuesto a ensayar sobre un mamífero no humano deficiente en
un gen del receptor Sigma-1 endógeno, que comprende
administrar dicho compuesto a ensayar a un mamífero no humano
mutante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; administrar
dicho compuesto a ensayar a un mamífero no humano control que
expresa un receptor Sigma-1 endógeno funcional; y
observar si dicho compuesto produce un efecto sobre el fenotipo en
dicho mamífero no humano mutante cuando se compara con el mamífero
no humano control.
16. Un procedimiento para determinar el efecto
de un compuesto sobre células que expresan un receptor
Sigma-1 y sobre células que no expresan dicho
receptor Sigma-1, que comprende introducir un
compuesto a ensayar en una población de células o en un
homogeneizado de dichas células, en donde dichas células son
aisladas o establecidas a partir de un mamífero no humano mutante
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, administrar dicho
compuesto a ensayar a una población de células de mamífero no humano
control o en un homogeneizado de dichas células que expresa un
receptor Sigma-1 funcional, y observar o analizar si
dicho compuesto a ensayar produce un efecto observable sobre el
fenotipo de las células de dicho mamífero no humano mutante cuando
se compara con las células de mamífero no humano control.
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