PT1584232E - Mamíferos não humanos mutantes deficientes em receptores sigma e aplicações associadas. - Google Patents

Description

Campo da Invenção A invenção refere-se aos mamíferos não-humanos mutantes deficientes no receptor endógeno Sigma, as células derivadas dos referidos animais mutantes e as aplicações associadas. A invenção também se refere ao vector de recombinação homóloga com selecção positiva-negativa útil para gerar os referidos mamíferos não-humanos mutantes deficientes nos receptores endógenos S i gma.

Antecedentes da invenção

Os receptores Sigma são sítios de ligação com afinidade com diversos ligandos, alguns dos quais são fármacos com actividades diversas. Inicialmente, o interesse nos receptores Sigma estava associado ao seu potencial papel na actividade dos fármacos antipsicóticos, uma vez que estes demonstram uma elevada afinidade para com os agentes neurolépticos típicos como o haloperidol ou outros compostos com actividade psicomimética, como o N-alilnormetazocina (SKF-10047) . Mais tarde descobriu-se que os receptores Sigma poderiam estar envolvidos noutros mecanismos fisiológicos.

As duas subclasses dos receptores Sigma foram identificadas, e são conhecidas como receptores Tipo-1 e

Tipo-2, podendo ser diferenciados pelo seu perfil farmacológico, função e tamanho molecular. Ambos os tipos demonstram uma elevada a moderada afinidade para com os agentes neurolépticos típicos, particularmente o haloperidol. No entanto, os receptores Sigma tipo-1 demonstram uma elevada afinidade para (+)-pentazocina, (+)-SKF10047 e outros (+) -benzo-morfanos, enquanto os receptores Sigma Tipo-2 mostram uma baixa afinidade para estes compostos. Os receptores Sigma do Tipo-1 têm uma massa molecular típica de 25kDa, enquanto a massa molecular do receptor Sigma do Tipo-2 é de 18-21kDa (em ambos os caso estas são determinadas pela marca de foto-afinidade) .

Receptor Sigma do Tipo-1 0 receptor Sigma do tipo-1, referido posteriormente como receptor Sigma-1, é um receptor do tipo não opiáceo expresso em inúmeros tecidos de mamíferos adultos (sistema nervoso central, ovários, testículos, placenta, glândulas supra-renais, baço, fígado, rins, tracto gastrointestinal, etc.) bem como nas fases iniciais do desenvolvimento embrionário, e aparentemente está envolvido num grande número de funções fisiológicas. A sua elevada afinidade para com vários fármacos está descrita, por exemplo com SKF-10047, (+)-pentazocina, haloperidol e rimcazole, entre outros, ligandos com actividade conhecida como analgésicos, ansiolíticos, antidepressivos, anti-amnésicos, antipsicóticos e actividade neuroprotectora, de modo que o estudo do receptor Sigma-1 é de grande interesse do ponto de vista farmacológico, dado o possível papel fisiológico nos processos relacionados com a analgesia, ansiedade, dependência, amnésia, depressão, esquizofrenia, stress, neuroprotecção e psicose [1]> [2] e [3] . No entanto, o actual papel desenvolvido pelo receptor Sigma-1 é ainda desconhecido. De facto, o seu ligando especifico endógeno não é conhecido, embora se acredite que este interaja com esteróides humanos endógenos como a progesterona e a testoterona. A sequência cADN que codifica o receptor Sigma-1 nos porquinhos-da-índia, a sequência cADN e o gene do receptor Sigma-1 nos humanos, a sequência cADN e o gene do receptor Sigma-1 nos ratinhos e o cADN que codifica o receptor Sigma-1 nas ratazanas foram todas descritas. 0 primeiro trabalho para obter a sequência do gene que codifica o receptor Sigma-1 deve-se a Hanner et al.

[4] . Neste trabalho, utilizando a caracteristicas de ligação especificas deste receptor a uma certa radioactividade dos compostos marcados, como (+) [ 3H]Pentazocina, foram obtidos primeiro uma proteína e depois o clone de cADN de codificação. 0 clone é isolado do banco genómico de cADN preparado a partir do mRNA do fígado do porquinho-da-índia (C.porcellus) [cADN com 1857 pares base, base de dados GenBank, código de acesso Z66537]. Depois, baseado nesta sequência de cADN, vários grupos de trabalho procedem a clonagem sucessiva por homologia sequencial do cADN humano [5] (cADN com 1653 pares base, base de dados GenBank, código de acesso:HSU75283), do cADN e do gene do ratinho [6] (cADN com 1567 pares base, base de dados GenBank, código de acesso:AF030199), do cADN da ratazana[7] (cADN com 1582 pares base, base de dados GenBank, código de acesso:AF004218) e do gene humano [8] (gene descrito em três fragmentos de ADN, contendo respectivamente o promotor (3589 pares de base, base de dados GenBank, código de acesso:AF001976) e o éxon 4 ( 1630 pares base, base de dados GenBank, código de acesso:AF001977)).

Uma análise da homologia entre estas sequências, quer na base dos nucleótidos e dos aminoácidos, tem manifestado um elevado grau de homologia entre estes. O conhecimento destas sequências poderá ser utilizado para desenvolver modelos animais vocacionados para o estudo da fisiologia e da patologia associada as alterações dos receptores Sigma e o efeito dos fármacos potencialmente utilizados para o tratamento ou prevenção das patologias associadas as alterações nos referidos receptores e em que os referidos receptores estão envolvidos. Técnica "Knock-out" A manipulação genética dos mamíferos permite obter animais transgénicos expressando um gene específico, ou alternativamente com um gene inactivo pela mutação específica ("knock-out" ou animais mutantes). Em ambos os casos, o seu potencial de utilização nos modelos experimentais com animais de laboratório, permitindo a análise da função de um dado gene em in vivo é óbvia. A técnica "knock-out"para gerar animais mutantes está bem definida e é objecto de várias publicações. Por exemplo, as seguintes patentes dos Estados Unidos da América podem ser citadasUS 5464764, US 5487992, US 5627059, US 5631153, US 6194633, US 6207876, US 6239326, US 6245963, US 6245965 e US 6252132, entre outras. A ausência de expressão de um gene pode conferir um novo fenótipo ao animal mutante. Dependendo do gene que não é expressado pelo animal, este poderá tornar-se mais ou menos susceptível a uma dada alteração patológica. Estes animais mutantes são modelos de grande valor para o estudo in vivo do papel do gene, bem como no estudo dos compostos que podem potencialmente ser úteis no tratamento ou prevenção de patologias relacionadas com a ausência de expressão ou expressão incapaz do produto deste gene.

Embora os receptores Sigma tenham sido descritos como tendo uma afinidade para com compostos com várias actividades farmacológicas, o papel efectivo desempenhado pelos receptores é desconhecido, de forma que é necessário gerar modelos animais para estudar in vivo o papel desempenhado pelos receptores endógenos Sigma. Um animal mutante deficiente nos receptores endógenos Sigma iria contribuir para definir o papel desempenhado in vivo por estes receptores e iria permitir conceber e avaliar os compostos potencialmente interessantes para os processos de tratamento relacionados com a expressão nula ou ineficaz destes receptores Sigma. A presente invenção dá uma solução para esta necessidade corrente.

Sumário da invenção A invenção refere-se a um mamífero não-humano mutante com células somáticas e germinais em que pelo menos um alelo e preferencialmente ambos alelos de um gene do receptor endógeno Sigma-1 contém um ADN exógeno inserido no referido gene, de forma que o mamífero não-humano mutante não expresse o produto do gene do receptor endógeno Sigma-1. Numa configuração específica, o ADN exógeno inserido no alelo do gene endógeno Sigma inclui um marcador de selecção positiva.

Por esse motivo, num aspecto a invenção refere-se a um mamífero não-humano viável cujo genoma inclui o receptor Sigma-1 mutante e apresenta ausência dos níveis detectáveis do ARN mensageiro ou proteínas do referido receptor endógeno Sigma. 0 referido mamífero mutante é um animal não-humano que pertence a classe dos mamíferos, como um rato mutante deficiente no receptor endógeno Sigma-1. Os ratos deficientes no receptor Sigma-1 são viáveis, férteis e nas condições de laboratório não manifestam nenhuns sintomas que os distinguissem dos ratos geneticamente similares com falta da referida mutação. Em condições estáveis controladas os ratos mutantes do receptor Sigma-1 são indistinguíveis dos seus irmãos selvagens das lixeiras. A função (ou disfunção) do receptor Sigma-1 foi postulado por ser associado as desordens do sistema nervoso central, como a ansiedade, depressão, esquizofrenia ou psicose. 0 receptor Sigma-1 parece ter uma actividade anti-amnésica e neuro-protectora e também foi relatado a percepção e a transdução da analgesia, dependência ou stress. Para estas situações em que os humanos podem derivar nas condições patológicas, um rato deficiente no receptor Sigma-1 poderá ser útil tanto no estudo do referido das condições para validar e/ou desenvolver medicamentos concebidos para controlar ou aliviar os efeitos das alterações patológicas e as condições em que os referidos receptores Sigma-1 são envolvidos. A mutação no gene do receptor endógeno Sigma presente na célula do genoma poderá ser inserida pela recombinação homologa na referida célula entre o alelo do receptor endógeno Sigma e a recombinação homologa do vector com a selecção positiva-negativa incluindo as regiões de homologia com as correspondentes sequências de nucleótidos presentes nos referidos genes receptores endógenos Sigma e, ao seleccionar os recombinantes homólogos pela selecção técnica positiva-negativa que são então introduzidos no embriões, que posteriormente são introduzidos nas fêmeas receptoras para gestão adequada que é levada até ao fim do termo. As quimeras capazes de transmitir de forma eficaz o genótipo dos recombinantes homólogos aos seus rebentos através da linha do embrião são cruzados com os mamíferos não-humanos selvagens para obter os mutantes heterozigóticos para quebrar o gene do receptor endógeno Sigma e mais tarde os mutantes heterozigóticos são cruzados um com o outro para produzir mutantes homozigóticos , seguindo a segregação de alelo clássica de Mendelian.

Numa configuração específica, os referidos mamíferos não-humanos mutantes deficientes num receptor endógeno Sigma é um mutante homozigótico na referida mutação.

Os rebentos dos mutantes mamíferos não-humano deficientes num receptor endógeno Sigma constituem um aspecto adicional na presente invenção.

Noutro aspecto, a invenção refere-se as células isoladas do referido mamífero não-humano mutante deficiente num receptor endógeno Sigma-1 que pode ser propagado e opcionalmente imortalizado. Estas células podem ser heterozigóticos, por exemplo, contendo um alelo mutante e um alelo de tipo selvagem para o gene do receptor endógeno Sigma, ou homozigóticos, por exemplo contendo dois alelos para o gene do receptor endógeno Sigma.

Num outro aspecto, a invenção refere-se a uma recombinação homóloga do vector com a selecção positiva-negativa, útil para introdução de uma quebra funcional no gene do receptor Sigma-1, incluindo: a) A primeira região de homologia, posicionada no 5 a terminal da sequência do nucleótido codificando um marcador de selecção positiva, onde a referida primeira região de homologia tem uma sequência de nucleótido que é substancialmente idêntica a primeira sequência do gene do receptor Sigma; b) Uma sequência nucleótido codificando uma selecção positiva; c) Uma segunda região de homologia, colocada no 3a terminal da referida sequência nucleótido codificando um marcador de selecção positiva, onde a referida segunda região de homologia tem uma sequência de necloetide que é substancialmente idêntica a segunda sequência do gene do receptor Sigma, o segundo receptor Sigma estando posicionado no 3'v na primeira sequência referida anteriormente do gene do receptor Sigma num tipo selvagem do gene endógeno Sigma; e d) Uma sequência nucleótido que codifica um marcador de selecção negativa.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira que na recombinação homóloga do vector referida anteriormente com a selecção positiva-negativa foi introduzida pela recombinação homóloga entre o referido vector e o gene do receptor Sigma correspondente da referida célula hospedeira, produzindo uma quebra funcional neste gene do receptor Sigma. Numa configuração especifica, a referida célula hospedeira é diferenciada, expressando normalmente o produto do gene do receptor Sigma ou indiferenciadamente uma célula imortal multipotencial como uma célula estaminal ES embrionária estabelecida a partir da massa interna da célula do embrião, na fase de pré-implantação conhecida como blastócito. Numa configuração específica, estas células embrionadas ES são células de rato. 0 mamífero não-humano mutante da invenção poderá ser utilizado como um animal modelo para estudar para estudar in vivo o papel desempenhado pelos receptores endógenos Sigma, bem como a concepção e avaliação de compostos químicos de potencial interesse para o tratamento de alterações patológicas relacionadas com a expressão nula ou ineficaz dos produtos dos referidos genes, ou em que os referidos genes são envolvidos. Adicionalmente, os referidos mamíferos não-humanos mutantes da invenção poderão ser usados como fonte de células para cultura de células.

Os aspectos adicionais da presente invenção serão óbvios para um especialista da área, tendo em conta descrição e as reivindicações.

Breve descrição das ilustrações A figura 1 ilustra esquematicamente o primeiro cADN (Figura 1 A) e os clones genómico (Figura 1 B) obtidos por TR-PCR ou pelos métodos PCR respectivamente. A figura 1 mostra o plasmídeo pmcSl/N correspondendo ao fragmento de cADN com 1020 pares base obtidos dos oligoucleotídeo MS2/MS4 [ver tabela 1]. A figura 2 ilustra o mapa de sequências adjacentes ao gene do receptor Sigma-1 do rato obtido por sobreposição os mapas correspondentes aos quatro clones bacteriófagos (ÀSg2, ÀSg5, ÀSg6) isolados com as sequências 5' e 3', envolvendo a sequência de genes publicada. As abreviações das restrições de enzimas são descritas na figura 3. A figura 3 ilustra esquematicamente os vários plasmideos originais obtidos com as inserções de ADN genómico correspondendo as sequências posicionadas nas regiões 5' e 3' do gene do receptor Sigma-1 do rato, identificado pela sua subsequente utilização na construção do vector recombinante homólogo. As abreviações de restrições de enzimas estão incluídas, as caixas negras correspondem aos quatro éxons do gene do receptor Sigma-1 do rato. A figura 4 ilustra esquematicamente a sequência do gene do receptor Sigma-1 do rato para ser eliminado pelos processos recombinante homólogo nas células ES do rato, utilizando a sequência AF030199, como referência. Os quadrados negros representam as áreas codificadas, enquanto os quadrados listados representam as sequências 3' e 5' transcritas mas não traduzidas. A figura 5 ilustra esquematicamente a homologia das sequências 5' e 3', com um tamanho de 6.8 e 3.1 kb respectivamente, seleccionadas para a inclusão no vector recombinante homologo pHR53TK, de forma a inactivar o gene do receptor de Sigma-1 do rato. As abreviações das restrições das enzimas estão descritas na Figura 3. A figura 6 ilustra a sequência de verificação do ADN, na fusão de transcrição entre a região de homologia 5' do gene do receptor de Sigma-1 e os primeiros nucleótidos do gene indicador lacZ presente no vector pHM2. A figura 7 ilustra o mapa do vector recombinante homólogo para a inactivação do gene do receptor Sigma-1 nas células embrionadas ES. A única restrição do local Sal 1 é indicada, ao identificar a linearização do ponto do vector para a transferência das células ES. A figura 8 ilustra o design experimental utilizado para distinguir o alelo mutante do alelo gene do receptor Sigma-1 do rato selvagem na análise por polimorfismos associados a restrição da enzima de digestão na análise do Southern blot. A figura 9 ilustra o resultado da análise do Southern blot do ADN genómico nos 12 clones positivos das células recombinantes ES dos clones, mostrando os polimorfismos esperados, ambos na sonsa 5' e na sonda 3'. Os corredores C e M representam o controlo de células de ADN ES e o marcador de massa molecular. A figura 10 ilustra o esquema dos testes analíticos PCR utilizados para estabelecer o genótipo do rato que transporta os alelos mutantes e selvagem, do gene do receptor Sigma-1. A figura 11 ilustra os resultados da análise do Southern Blot dos homozigóticos selvagens (+/+), heterozigóticos C4/V) e homozigóticos mutantes (-/-) pela digestão do ADN genómico com as enzimas Hind III e EcoR e a consecutiva hibridação com as sondas 5' e 3'. O tamanho dos fragmentos corresponde aos valores esperados do design experimental. A figura 12 ilustra os resultados da análise da Nothern blot no receptor Sigma-1(mSRl)na totalidade do fígado, rim, cérebro, e ARN isolado do coração do homozigótico selvagem do rato (+/+),heterozigóticos (+/-) e homozigóticos mutantes (-/-) . A fotografia da ribossoma ARN utilizado como controlo de carga é incluída na área inferior. A figura 13 ilustra os resultados do Western blot dos homozigóticos do rato selvagem (+/+),heterozigóticos (+/-) e homozigóticos mutantes (-/-), ilustrando a expressão do gene do receptor Sigma-1 no cérebro do rato utilizando um anticorpo posicionai específico, no receptor Sigma-1 do rato. A Figura 14 ilustra a actividade (função) do receptor Sigma-1 do rato através de um teste de ligação ao ligamento [3H]-pentazocina. A figura 14A é um gráfico representando uma ligação especial (ordenadas) do referido ligamento dos receptores Sigma-1 dos homozigóticos selvagens, heterozigótico e homozigótico selvagem do rato como uma função da concentração do ligamento (abcissa). A figura 14B é um gráfico representando o "ligamento de ligação/ligamento livre" (B/F) ratio (ordenadas) versus a concentração do ligamento de ligação como função da origem dos referidos receptores Sigma-1 (homozigóticos selvagens, heterozigóticos e homozigóticos selvagens do rato).

Descrição detalhada da invenção.

Num dos seus aspectos, a invenção fornece um mamífero mutante não-humano deficiente num receptor endógeno de Sigma, que posteriormente será referido como o mamífero não-humano da invenção cujo genoma contém uma mutação que inclui uma alteração no gene do receptor endógeno Sigma. 0 termo "mamífero não-humano" tal como é utilizado nesta descrição inclui qualquer animal não-humano que pertença a classe dos mamíferos, como os ratos. 0 termo " mamífero não-humano mutante da invenção" tal como aqui é utilizado, refere-se a uma mamífero não-humano manipulado para que o seu receptor endógeno Sigma seja deficiente, ou seja que tenha uma mutação previna a expressão normal do produto do gene do receptor Sigma, e assim a falta de níveis detectáveis do mensageiro ARN ou proteína para o receptor endógeno Sigma. A expressão "mamífero não-humano mutante da invenção" inclui ambos os heterozigóticos mutantes (aqueles que contêm um alelo mutante e um tipo selvagem de alelo do gene do receptor endógeno Sigma) e homozigóticos. Numa configuração preferida específica desta invenção, o mamífero não-humano mutante da invenção é um homozigótico mutante, ou seja, contém ambos alelos mutantes do gene do receptor endógeno Sigma, resultando numa expressão não-detectável do produto do gene. 0 termo "Receptor Sigma" tal como aqui é utilizado refere-se ao receptor Sigma tipo.l (Sigma-1). A mutação presente no genoma do mamífero não-humano da invenção pode estar presente tanto nas células somáticas ou células embrionárias do mamífero não-humano da invenção. Com a vantagem, da referida mutação estar presente nas células embrionárias do mamífero não-humano da invenção, conferindo assim a sua habilidade de transmitir a sua mutação, aos seus descendentes. Assim, numa configuração específica da invenção o mamífero não-humano da invenção é fértil e pode transmitir a sua mutação aos seus descendentes. A mutação presente no mamífero não-humano da invenção inclui uma inserção, uma supressão ou mutação pontual provocando uma mutação funcional no gene do receptor endógeno Sigma, levando a que o mamífero não-humano seja deficiente no referido receptor Sigma. Numa configuração especifica, o genoma do mamífero não-humano da invenção inclui o transfere dentro da mutação inserido no gene do receptor Sigma endógeno. Como forma de ilustração, o referido transgene inclui um gene codificador marcador de selecção positiva, como a neomicina fosfotransferase (neo), gene codificador da resistência a neomicina ou de qualquer outro marcador de selecção positiva mencionado mais abaixo, no vector recombinante homólogo com a selecção positiva-negativa fornecida por esta invenção.

Numa configuração específica desta invenção é fornecido um rato mutante deficiente no receptor endógeno Sigma-1, homozigótico para o gene do receptor endógeno Sigma-1, fértil cujo genoma contém a mutação, no referido gene incluindo o não gene. 0 mamífero não-humano da invenção poderá ser obtido pelo processo que inclui a inserção de uma mutação funcional no gene do receptor Sigma presente na célula do genoma. Numa configuração específica, a referida mutação é introduzida pela recombinação homóloga num gene do receptor endógeno Sigma-1 presente no genoma da célula adequada, como uma célula diferenciada que normalmente expressa o referido gene do receptor Sigma-1, ou numa célula embrionária pluripotente ES, ao introduzir um vector recombinante homólogo com uma selecção positiva-negativa, na referida célula e ao seleccionar os homólogos recombinantes pela técnica da selecção positiva-negativa que poderá ser utilizada para gerar o mamífero não-humano da invenção como será aqui descrito. Alternativamente, o mamífero não-humano da invenção poderá ser gerado através das técnicas clássicas de cruzamento, ou pela fertilização in vitro, entre os mamíferos não-humanos mutantes agindo como progenitores.

Ainda num outro aspecto, a invenção fornece clones das células embrionárias ES pluripotente heterozigoticas, ou seja, com um dos genes alelo do receptor Sigma mutado. A partir destas células é possível obter quimeras e destes mamíferos não-humanos deficientes, no receptor Sigma. Num configuração especifica, as referidas células embrionários pluripotente ES do rato de onde a quimera poderá ser obtida e destes, os ratos mutantes no receptor Sigma.

Num outro aspecto, a invenção fornece um vector recombinante análogo com a selecção negativa que posteriormente será o vector da invenção, incluindo: a) Uma primeira região de homologia localizada na extremidade da sequência 5' do nucleótido, codificando um marcador de selecção positiva, onde a primeira região de homologia referida têm uma sequência de nucleótido que é substancialmente idêntica a primeira sequência do gene do receptor Sigma; b) Uma sequência de nucleótido que codifica um marcador de selecção positiva; c) Uma segunda região de homologia localizada na extremidade da sequência 3' do referido nucleótido, codificando um marcador de selecção positiva, onde a segunda região de homologia tem uma sequência de nucleótido que é substancialmente idêntica a segunda sequência do gene do receptor Sigma, num gene endógeno selvagem do tipo Sigma e; d) Uma sequência de nucleótido codificando um marcador de selecção negativa. 0 receptor Sigma é um receptor Sigma-1. 0 vector da invenção poderá ser utilizado como uma mutação funcional do receptor endógeno Sigma-1, contendo uma célula de genoma através da técnica de recombinação homóloga e uma selecção positiva-negativa dos recombinantes homólogos que poderão ser utilizados para fazer o mamífero mutante não-humano deficiente no receptor endógeno Sigma. A sequência de nucleótido codificando o marcador de selecção positivo está ladeada pelas posições 5' e 3' das sequências do nucleótido substancialmente idênticas ao referido gene do receptor Sigma, correspondendo as regiões da primeira e segunda homologia anteriormente referidas, respectivamente. Tal como é utilizada na descrição, a sequência do nucleótido é "substancialmente idêntica" a sequência do gene do receptor Sigma quando a referida sequência do nucleótido é suficientemente homóloga com a sequência do referido gene do receptor Sigma, quando a sequência do nucleótido referida anteriormente permite uma recombinação homóloga entre a referida sequência do nucleótido e a sequência do gene endógeno Sigma, na célula hospedeira. Tipicamente, as sequências Sigma da primeira e segunda regiões de homologia referidas anteriormente são pelo menos 90%, preferencialmente 95% e ainda mais preferencialmente 100% idênticas a sequência do nucleótido do receptor endógeno Sigma com qual é intencionada a recombinação. Com a vantagem, das referidas primeira e segunda região da homologia serem isogénicas no que diz respeito ao alelo endógeno com o qual elas são intencionadas (ou seja, o ADN das referidas regiões de homologia é isolado das células do mesmo banco de genes de que a célula onde o vector da invenção será inserido). As referidas regiões da homologia devem ser suficientemente longas para permitir a recombinação homóloga entre o vector da invenção e o gene do receptor endógeno Sigma, na célula hospedeira quando o vector da invenção é inserido na respectiva célula. Tipicamente, o comprimento local das referidas regiões de homologia é de pelo menos 5 kilobases (kb) e preferencialmente pelo menos 10 kb.

Numa configuração especifica, as referidas primeira e segunda região da homologia são escolhidas de forma que as suas sequências sejam substancialmente idênticas as sequências do nucleótido correspondentes do gene do receptor endógeno Sigma que flanqueia a região do referido gene a ser eliminado pela recombinação homóloga e substituída pela sequência do nucleótido que codifica o marcador positivo de selecção.

As referidas primeira e segunda região da homologia serão escolhidas de acordo com gene do receptor endógeno Sigma da sequência, onde ser introduzida a mutação para dar lugar a uma ausência em níveis apreciáveis do receptor endógeno Sigma, na recombinante homologa, e assim dependente do animal mutante deficiente, no receptor endógeno Sigma a ser obtido em humanos e a sequência cADN que codifica o receptor Sigma—1 nas ratazanas foi descrita em [4]-[8]. Os códigos genómicos ou códigos de ADN que codificam o receptor Sigma-1 dos animais cuja sequência de nucleótido é ainda desconhecida para ser obtida através dos métodos convencionais das bibliotecas de genes para as células de tais espécies, tendo em vista as sequências conhecidas de dos genes receptores de Sigma-1 devido a elevada homologia observada entre eles.

As referidas primeira e segunda região da homologia podem ser obtidas por métodos convencionais, tendo em conta a sequência do nucleótido em que foi introduzida a mutação, como através da reacção da cadeia de polimerase (PCR) ou RT/PCR (transcrição reversa/reacção em cadeia do polimerase) utilizando o iniciador de oligoucleotideo apropriado. 0 exemplo 1.1 descreve o isolamento do gene do receptor Sigma-1 do rato.

Numa configuração especifica, o vector da invenção inclui a primeira região de homologia onde a sequência do nucleótido é substancialmente idêntica a primeira sequência do nucleótido de 6.8 kb do gene do receptor de Sigma-1 do rato e a segunda região de homologia onde a sequência do nucleótido é substancialmente idêntica a segunda sequência do nucleótido de 3.1 kb do referido gene, no gene do receptor de Sigma-1 do rato, delimitando uma sequência de 1.9 kb do referido gene [ver figura 5] que é eliminada pela recombinação homóloga com o vector da invenção. A sequência do nucleótido que codifica o marcador de selecção positiva confere a caracteristica de selecção positiva nas células que a contêm, Ou seja, permite a selecção de células que contêm e expressam o referido marcador de selecção positiva, em oposição as células que não contêm. A sequência do nucleótido que codifica o marcador de selecção positiva pode ser operacionalmente ligada aos elementos reguladores que controlam a expressão do referido marcador independentemente, constituindo uma cassete de expressão positiva ou, o vector da invenção pode ser construído para que a expressão do referido marcador possa ter lugar sob o controlo dos elementos de regulação do gene do receptor endógeno de Sigma-1. Quase qualquer um dos marcadores de selecção positiva pode ser utilizado na construção do vector de invenção. Os exemplos ilustrativos dos marcadores de selecção positiva podem ser encontrados por exemplo, na descrição da patente US n°. 5464764. Numa configuração especifica, o vector da invenção contém uma sequência de nucleótido que inclui o neo gene que confere resistência a mortalidade da célula associada ao tratamento com o antibiótico de neomicina ou um dos seus análogos como o sulfato G418. A sequência do nucleótido que codifica o marcador de selecção negativa está colocada a mesma distância, 5' ou 3' da primeira e da segunda região da homologia respectivamente e, está operacionalmente ligado aos elementos reguladores de controlo que controlam a expressão do referido marcador de selecção negativa constituindo uma cassete de selecção de expressão negativa. Com a vantagem, da referida sequência que codifica o marcador de selecção negativa e substancialmente "não idêntica" a nenhuma sequência do gene do receptor de Sigma, de forma que a sequência do nucleótido que codifica o marcador de selecção negativa não é suficiente homólogo com qualquer sequência do receptor Sigma para permitir uma recombinante entre as referidas sequências, ou seja o grau de identidade entre os nucleótidos da referida sequência de nucleótidos que codificam o marcador de selecção negativa e a sequência do gene do receptor de Sigma deve ser de menos 45%, preferencialmente menos de 30%, de forma a prevenir as recombinações não desejadas.

De acrescentar que esta sequência de nucleótidos tem ainda a vantagem de não ser idêntica a qualquer ou sequência no genoma do mamífero não-humano. 0 marcador de selecção negativa confere as características de marcador de selecção negativo as células que o contenham, ou seja permite a selecção de células que não contêm o referido marcador de selecção negativa das células que o contêm e o expressam e que posteriormente irão morrer devido a acção do agente de selecção negativo, enquanto as células que não contêm irão sobreviver.

No entanto quase qualquer marcador de selecção negativa pode ser utilizado para construir o vector da invenção, o que preencherem a condição de que a sequência do nucleótido que codifica o marcador de selecção negativa não seja substancialmente idêntico a sequência do gene do receptor endógeno do receptor Sigma, nem outra sequência do genoma do mamífero não-humano será seleccionado preferencialmente. Exemplos ilustrativos dos marcadores de selecção negativa podem ser encontrados por exemplo, na descrição da patente US n°. 5464764. Numa configuração específica, o vector da invenção contém uma sequência de nucleótido que inclui o gene de quinasse de timidina (tk) dos herpes do vírus simplex (HSV). A síntese do ADN pode ser interrompida nas células que contenham e expressem o referido gene tk. Estas células podem ser eliminadas utilizando ganciclovir ou qualquer equivalente funcional do análogo do nucleótido, Como um marcador de selecção negativa.

Numa configuração específica, o vector da invenção é uma recombinação homologa com a selecção positiva-negativa, incluindo a primeira e segunda região de homologia substancialmente idêntico a primeira e segunda sequência, respectivamente, do gene do receptor de Sigma-1 do rato, uma sequência do nucleótido incluindo o neo gene e a sequência do nucleótido incluindo o gene tk, como o vector conhecido por pHR53TK [ver figura 7] e que pode ser utilizado para transformar as células do rato, como as células embrionárias ES do rato, contendo o gene do receptor endógeno Sigma-1, pela recombinação homologa e para obter as células do rato, primeiro com os alelos mutantes do gene do receptor endógeno Sigma-1, e depois, por uma segunda recombinação homologa do evento no alelo selvagem remanescente do genoma que apresenta ausência dos níveis detectáveis do mensageiro ARN ou proteína para o receptor endógeno Sigma-1. 0 exemplo 1.2 descreve detalhadamente a construção do vector pHR53TK. A recombinante homóloga do vector com a selecção positiva-negativa fornecida por esta invenção pode ser construída através dos métodos convencionais de digestão com as enzimas de restrição e de ligação e as semelhantes as que foram descritas por Sambrook et al. [17]. 0 vector da invenção permite a utilização da técnica de selecção "positiva- negativa" para seleccionar os recombinantes homólogos, ou seja, permite a selecção de células em que este vector foi inserido, como as células que contêm e expressam o marcador de selecção positiva mas que perderam o marcador de selecção negativa como resultado da recombinação homóloga entre o vector e o gene do receptor endógeno de Sigma-1. 0 vector da invenção pode ser utilizado para inserir uma mutação funcional no gene do receptor endógeno Sigma-1 presente nas células do genoma do mamífero não humano e criar recombinantes homólogas (recombinantes das células hospedeiras) que por sua vez, podem ser utilizadas para gerar mamíferos mutantes não humano deficientes, num receptor endógeno Sigma. Para este objectivo, o vector da invenção é inserido na referida célula por qualquer método convencional adequado para inserir o ADN exógeno nas células como a precipitação com fosfato de cálcio, transferência, micro-injecção, lipofecção, etc., preferencialmente por electroporação. Após a introdução do vector da invenção na célula hospedeira, o segundo é cultivado durante o período adequado sob as condições que permitem a recombinação homóloga entre o vector da invenção e o gene do receptor endógeno de Sigma. Os recombinantes homólogos são seleccionados no locus analisado do gene do receptor endógeno Sigma através das técnicas convencionais como a análise do Southern blot utilizando uma sonda que permite a diferenciação do alelo normal endógeno (tipo selvagem) e o recombinante do alelo. 0 exemplo 2.1 descreve a inactivação do gene do receptor de Sigma-1 do rato pela recombinante homóloga no rato com as células embrionadas ES e a produção de ratos quiméricos (quimera) com a mutação do gene do receptor Sigma-1 através da técnica de agregação morula, avaliando a transmissão pela linha do bacilo da referida mutação através do cruzamento do respectivo quimera com as fêmeas, como a fêmea do CD-I não-procriada cujo pêlo albina é facilmente distinguível do pêlo pigmentado característico das ratazanas híbridas ;Fi geradas pelos cruzamentos entre a linhagem 129Xl/SvJ e 12951/Sv, de onde as células ES RI são utilizadas nos processos de recombinação homólogos.

As recombinantes homólogas (recombinantes das células hospedeiras) contendo um alelo do gene do receptor Sigma mutado podem ser utilizadas para produzir os mamíferos não-humanos mutantes da invenção. Para este objectivo, a recombinante das células hospedeiras contendo uma alteração no gene do receptor endógeno são introduzidos nos embriões através dos métodos convencionais, como a agregação das células recombinantes com os embriões no estágio de 8-células (morulae) que são então implementados no receptor fêmea mamífera pseudo-gestor e é permitido aos embriões chegarem até ao fim do termo. Os animais resultantes são quimeras em que a transmissão da mutação pelo bacilo é analisada. As quimeras pode eficientemente transmitir o genótipo das células hospedeiras a sua descendência através da linha de bacilo e são cruzados com o tipo selvagem de mamíferos não humanos para obter os mutantes heterozigóticos para provocar a alteração no gene do receptor endógeno Sigma, nas células somáticas e células bacilo. Os mutantes heterozigotos são cruzados entre si para obter os mutantes heterozigóticos. 0 exemplo 2.2 descreve a produção de um rato mutante (heterozigótico e homozigótico) para o gene do receptor endógeno Sigma-1, verificando que estes são deficientes nos referidos gene tal como é descrito no exemplo 2.3, através das análises estruturais correspondentes da expressão e da função, nos ratos mutantes homozigóticos. A descendência do mamífero mutante não-humano da invenção que constitui um aspecto adicional desta invenção poderá ser obtida através dos métodos convencionais como as técnicas de cruzamento clássicas entre os mamíferos não-humanos mutantes da invenção (progenitores) ou, alternativamente, através de fertilização in vitro da ova e/ou esperma do mamífero não-humano mutante da invenção, ou através da clonagem pela transferência nuclear e posterior reconstrução da ova enucleada com as células mutantes ou embrionadas ou células somáticas que têm em sim a mutação. Tal como é utilizado na descrição, o termo "descendência" e "descendência dos mamíferos não-humanos mutantes da invenção" refere-se a cada um e todos os descendentes de cada geração após os mamíferos não-humanos originais transformados. 0 mamífero mutante não humano da invenção poderá ser utilizado como controlo de animais para os testes in vivo ( ver mais abaixo). Adicionalmente, o mamífero mutante não humano da invenção poderá ser utilizado como uma fonte de células somáticas, fetais ou embrionárias que cada uma isolada e cultivada poderá ser utilizada nos testes in vitro. Adicionalmente, se desejado, é possível preparar linhas de células imortalizadas das referidas células utilizando técnicas convencionais [18-21]. Assim, noutro aspecto, a invenção fornece uma linha de células isoladas derivadas do mamífero mutante não-humano da invenção. Numa configuração específica, a linha de células fornecida por esta invenção é linha de células murine em que a referida linha de células apresenta ausência dos níveis detectáveis do receptor Sigma-1.

Os mamíferos não-humanos mutantes da invenção também podem ser utilizados como modelos animais para o estudo do papel desempenhado in vivo pelo receptor endógeno Sigma-1 e como controlo de animais em testes in vivo. 0 receptor Sigma-1 parece estar envolvido nas desordens do sistema nervoso como a ansiedade, depressão como a ou esquizofrenia, nas alterações de memória, amnésia e em condições de stress e de dependência de drogas. Adicionalmente o receptor Sigma.1 parece estar envolvido nos processos de analgesia e de neuro-protecção. Assim, um mamífero mutante não-humano deficiente no receptor endógeno fornecido por esta invenção, poderá ser útil no estudo de destas situações bem como para validar e/ou desenvolver medicamentos concebidos para regular ou aliviar os efeitos das alterações e das condições patológicas, que os receptores Sigma-1 estão envolvidos.

Assim, noutro aspecto, a invenção refere-se a utilização do mamífero mutante não-humano da invenção ou de uma célula fornecida pela presente invenção, deficiente no receptor Sigma-lpara avaliar potencialmente os compostos úteis para:

Prevenir e/ou tratar de desordens do sistema nervoso central, como a ansiedade, esquizofrenia ou depressão;

Prevenir e/ou tratar alterações de memória como a amnésia;

Prevenir e/ou tratar condições de stress;

Prevenir e/ou tratar condições de dependência de drogas;

Produção de analgesia; ou

Produção de neuro-protecção.

Noutro aspecto, a invenção refere-se a um método para determinar o efeito de um composto para ser testado num mamífero mutante não-humano deficiente no receptor endógeno Sigma-1 que inclui a colocar um mamífero mutante não-humano em contacto com o composto a ser testado e detectar a presença ou ausência de uma mudança fisiológica no referido mamífero mutante não-humano, como uma resposta ao contacto com o referido composto; ou em vez de se administrar o referido composto para ser testado no controlo de um mamífero não-humano que expresse o receptor endógeno Sigma-1 e, observar se o referido composto tem efeito no fenótipo do referido mamífero mutante não-humano quando comparado com o controlo do mamífero não-humano. Qualquer efeito observável no fenótipo pode ser em princípio, ser relacionado com a função ou disfunção do receptor Sigma considerado.

Noutro aspecto, a invenção refere-se ao método para determinar o efeito de um composto nas células que expressam o receptor Sigma-1 e nas células que não expressam o referido receptor Sigma-1 que inclui uma introdução do teste do referido composto numa população de células ou numa homogeneização das referidas células, onde as referidas são células isoladas ou as células constituídas a partir do mamífero mutante não-animal da invenção, administrando o referido composto a ser testado, numa população de controlo das células do mamífero não-humano., ou para a homogeneização destas, que expressam o correspondente receptor Sigma funcional e que observam ou analisam se o referido composto a ser testado, tem um efeito na expressão do referido receptor Sigma nas células do mamífero mutante não animal quando comparado com as células de controlo do mamífero não-humano.

Em princípio, qualquer efeito observável no fenótipo pode ser relacionado com a função (disfunção) do receptor Sigma considerado.

Os exemplos que se seguem ilustram a invenção e não devem ser considerados como um objectivo limitativo desta. A combinação dos exemplos 1 e 2 descreve detalhadamente o processo de gerar ratos com a mutação do gene do receptor Sigma-1 que tem falhas nos níveis detectáveis do receptor Sigma-1 do rato. 0 exemplo 1 descreve o isolamento e a clonagem do gene do receptor Sigma-1 do rato e a construção de um vector recombinante homólogo com a selecção postiva-negativa, enquanto o exemplo 2 descreve as transferência das células ES do rato e concepção de um rato mutante deficiente no receptor Sigma-1 murine. EXEMPLO 1

Isolamento e clonagem do gene do receptor Sigma-1 do rato e concepção deum vector recombinantehomólogo com a selecção postiva-negativa. 1.1 Isolamento do gene do receptor Sigma-1 do rato

Utilizando as sequências publicadas para o cADN do receptor Simga-1 do rato e gene [8], foram concebidos quatro oligoucleotídeo de forma a isolar e clonar o referido gene. As características destes oligoucleotídeo conhecidos como MSI, MS2, MS3 e MS4 são detalhadas na Tabela I. As posições relativas destes nucleótidos em relação ao cDNA publicado do rato e das sequências de genes esquematicamente representadas na Figura 1.

Tabela I

Oligonucleotídeo utilizados para clonar o gene do receptor Sigma-1

Oligonucleotídeo Sequência Posição Posição ADN (5'—3’) relativa do relativa ao gene cADN làfpíàTllj [AF030198] A\·.\> À- MS 2 34;Η···3·:οΒ 1172 MS3 SEQ.ID.N°:3 .372*·· 3708 27 7 **\7 $:¾ MS 4 SEQ.ID,N°:4 11:32-+1113

Estes oligoucleotídeo ?âío utilizados para obter fragmentos de ADN específicos com o tamanho esperado do ADN genómico e do ARN total do NMRI e BALB/C da linhagem do rato, utilizando os protocolos padrão do PCR e RT/PCR [9]. Inicialmente, os pares oligoucleotídeo MS1/MS3 e MS2/MS4 foram utilizados, produzidos através do PCR nos fragmentos genómicos de ADN dos pares base 1160 e 2246 (bp) respectivamente. Adicionalmente, do ARN total por RT-PCR, o cADN correspondente ao fragmento 1020 bp foi clonado a partir do par oligoucleotídeo MS2/MS4. Os fragmentos de ADN obtidos foram sub-clonados no Bluescript KS+ (Stratagene) vector plasmídeo através dos métodos padrão [9].A figura 1 descreve os plasmídeos obtidos com as sequências do gene e cADN. É descrito em particular o plasmídeo correspondendo ao fragmento 1020 bp cADN, obtido dos oligoucleotídeo MS2/MS4 que mais tarde será utilizado para obter os clones genómicos do gene do receptor de Sigma-1 do rato. A clonagem por PCR e RT/PCR dos vários fragmentos genómicos e cADN correspondendo ao gene do receptor Sigma-1, fornecido pelas sondas adequadas, para ser utilizado no isolamento dos clones genómicos intactos do gene 1 receptor de gene do rato, fornecido por sondas genéticas específicas para ser utilizado no isolamento de genes genomáticos intactos dos clones do banco de genes do rato. Com o objectivo posterior é obter um rato mutante neste gene, é necessário obter a sequência isogénica dos clones ( por exemplo da mesma linhagem de ratos), de forma a optimizar o processo de recombinação homólogo, nas células embrionadas ES pluripotente [10] . As células ES do rato utilizadas, células ES Rl [11] são obtidas a partir de um i'l híbrido de duas sub-linhagens de ratos 129/Sv rillMl/SvJ x 12951/SvJ] . Por este motivo, foi decidido fazer uma abordagem, no isolamento dos genes genómicos de um banco de genes comercial preparado com o ADN do rato 129/Sv (Stratagene, Cat. Nr#946313). 1x106 dos clones recombinantes do banco de genes foram analisados, distribuídos em 6 pratos grandes (Nunc, 243 mmx243, 530cm2) com 170,000 fages por prato, aproximadamente. As duas réplicas consecutivas foram então obtidas em cada prato, numa membrana de Nylon (Hybond-N, Arnersham) . Estas membranas foram hibridizadas com uma sonda específica correspondente ao plasmídeo pmcSl/N inserido de acordo com os protocolos convencionais [9].

Inicialmente, nove sinais específicos foram identificados (em ambas as réplicas duplicadas) e os bacteriófagos presentes nos pratos deram origem a um sinal positivo, e que foram purificados através dos protocolos convencionais. A utilização dos oligoucleotídeo mencionados anteriormente (MSI, MS2, MS3 e MS4) e da análise do Southern Blot permitiram a verificar que quatro destes clones (XSgl, XSg2, ÀSg5, λβρβ) continham o gene do receptor de Sigma-1 inteiro. A figura 2 mostra o mapa das sequências adjacentes ao gene do receptor de Sigma-1 obtido através de sobreposição dos mapas dos clones bacteriófagos mencionados anteriormente. A nova produção foi confirmada pelo mapa estrutural de cerca de 30 kilobases (kb) que envolviam o gene que excedeu a informação publicada nas bases de dados (menos de 7 kb, centrados a volta do gene) [6] . Estas sequências foram sub-clonadas em plasmídeos para serem utilizados na construção do vector de recombinação homólogo com a selecção positiva-negativa. A figura 3 mostra vários clones originais obtidos com sequências genómicas correspondentes as sequências posicionadas nas regiões do gene 5' e 3'. 1.2 Construção do vector recombinante homólogo com a selecção positiva-negativa (pHR53TK) para inactivaçao através de mutação do gene do receptor Siqma-1 nas células ES do rato.

Na construção do vector recombinante homologo com a selecção positiva-negativa denominado de pHR53TK, o plasmídeo utilizado para apoiar e iniciar as sucessivas clonagens foi o pHM2[12] (8451 pares base, base de dados

GenBank, código de acesso: X76682) que foi anteriormente utilizado com sucesso na preparação de vectores recombinantes homólogos levando a inactivação dos outros genes do rato, ver por exemplo [13]. A partir do plasmídeo pmgSl Eag6.7 (ver figura 3) através da digestão da enzima de restrição do fragmento Bgl II foi inserido no plasmídeo pHM2, anteriormente digerido com a mesma enzima, apenas na posição para Bgl II que fica localizada na posição 8171, gerando o plasmídeo intermediário pHR3A com o tamanho de 11.6 kbb. A seguir, foi inserida no plasmídeo pHR3A, no único local para a enzima de restrição Pml (posição 2259 relativa ao plasmídeo pHM2) a homologia da sequência 5' do receptor Sigma do rato, obtida como o fragmento 6.8 kb por digestão das enzimas Sac I e Sac II do ADN do bactiofage XSg6 (ver figura 2). A fusão subsequente após a conversão para os terminais da sequência de ADN do local Sac II (o gene do receptor Sigma-1 do rato na sequência, posição 3356 da sequência AF030199) e o Pml I (do vector pHR3A) permitiram obter uma transcrição funcional entre os primeiros quatro aminoácidos do gene do receptor Sigma-1 com o indicador dos restantes aminoácidos do gene lacZ, no vector original pHM2 [12]. Adicionalmente, a sequência da homologia 5' do gene do receptor Sigma-1 permite obter o plasmídeo intermédio pHR53 que delimita precisamente os nucleótidos a serem suprimidos (supressão) do gene das posições entre 3356 (Sac II) e 5263 (Blg 11), relativas a sequência original do gene depositado no GenBank AF030199. De facto, isto poderá provocar a eliminação dos nucleótidos 1907 que incluem quase todas as sequências que codificam o gene do receptor Sigma-1, com excepção dos primeiros quatro aminoácidos. A figura 4 representa graficamente com precisão os limites da sequência cuja eliminação foi intencionada com através da recombinação homóloga nas células ES do rato (Exemplo 1.3). A figura 5 mostra a posição relativa das posições relativas das sequências de homologia 5' e 3', com um tamanho de 6.8 e 3.1 kb presentes no vector pHR53, no que diz respeito a sobreposição dos 30 kb referida anteriormente. Estas sequências de homologia 5' e 3' por sua vez delimitam a área do gene do receptor de Sigma-1 a ser eliminado, com o tamanho de 1.9 kb.

De forma a verificar a presença e a fusão exacta dos fragmentos de ADN utilizados na construção do vector pHR53, os seus terminais foram sequenciados. Especificamente, a fusão transcripcional entre os primeiros nucleótidos que codificam o gene do receptor de Sigma-1 com a sequência de codificação do gene indicador lacZ verificada, tal como é ilustrado na figura 6.

Finalmente, de forma a obter o vector recombinante homologo com a selecção positiva-negativa em que se aplicam os processos de selecção positiva ( o gene de resistência neomicina, presente no plasmideo pHM2) combinados com os processos de selecção negativa [1.4] (gene de resistência ganciclovir, vírus de herpes simplex, timidina quinase, HSV-TK, ausente no plasmideo pHM2 mas presente no plasmideo pPNT [15]) a cassete de expressão com o gene HSV-TK foi clonada no local de restrição Not I do plasmideo pHR53 através de um intermediário de construção em que o gene HSV-TK foi obtido no vector pSX 812], gerando o vector plasmideo pHR53TK com o tamanho 20.8kb, cujo mapa é ilustrado na figura 7. 0 plasmideo pHR53TK foi depositado no CECT a 4 de Outubro de 2002, tendo recebido o número de acesso CECT 5737. EXEMPLO 2

Criação de um rato mutante deficiente no serie do receptor Sigma-1 2.1 Inactivação do gene do receptor de Sigma-1 através da recombinação homologa das células ES e produção de ratos quiméricos com a referida mutação.

Após a construção do vector pHR53TK, foi linearizado através da digestão com a enzima de restrição Sal I ( figura 7). Então, 20 pg do pHR53TK linearizado foi utilizado para a transferência das células ES 9.6xl06 [11] através da electroporação (condições de electroporação: 500 pF, 250 V) . Após 24 horas no processo de selecção positiva que foi inicializado com a adição de 300 pg/ml de antibiótico G418. Após 48 horas o medicamento ganciclovir foi adicionado ao processo de selecção negativo, até atingir a concentração final de 2 pM. Oito dias mais tarde era possível identificar os clones recombinantes independentemente (resistentes ao G418 e ao ganciclovir) que foram sub-cultivados em separado. Todo o processo foi efectuado na presença dos fibroblastos embrionários do rato resistentes ao G418 (MEFs) e L.I.F (factor inibidor de leucemia) factor de crescimento de forma a inibir a diferenciação espontânea entre as células ES pluripotente. De todas as vezes os protocolos foi seguidos como descrito na literatura para as culturas, transferência e manipulação das células ES do rato [10] a informação relativa a selecção positiva-negativa poderá ser encontrada, por exemplo nas patentes US 5464764, US 5487992, US 5627059, US 5631153.

Um total de 272 clones recombinantes das células ES de rato foi analisado pelo processo Southern Blot, descrito nas áreas do gene do receptor de Sigma-1 incluindo o vector pHR53TK de forma a identificar os dois polimorfismos no tamanho de restrição dos fragmentos. Assim, a digestão com a enzima de restrição Hind III e a utilização da sonda 5' permite distinguir o alelo selvagem (10.7kb) do alelo mutante (19kb) do gene do receptor

Sigma-1. De forma similar, a digestão com a enzima de restrição EcoR e a utilização da sonda 3' permite distinguir o alelo selvagem (13.7kb) do alelo mutante (11.9kb) do gene do receptor Sigma-1 do rato. A figura 8 ilustra a concepção experimental a ser utilizada para diferenciar os alelos mutantes dos selvagens do gene do receptor Sigma-1 do rato.

Das 272 células clones ES independentes 12 (por exemplo 4,4%) mostraram o polimorfismo esperado utilizando a sonda 5' e a sonda 3' (Figura 8) . A figura 9 mostra o resultado das analises com o Southern blot do ADN genómico correspondentes estas 12 células clones ES.

De acordo com isto, os clones recombinantes positivos com as células ES foram seleccionados para continuar com a criação dos ratos quiméricos correspondentes (quimeras) utilizando a técnica de agregação morula através dos processos descritos na literatura [10], [11]. As condições experimentais para a agregação das células recombinantes ES (num número médio de 10) com as 8- células embrionárias (morulae) na linhagem do rato compreendidas na utilização de 4% das células ES condicionadas no processo de agregação.

Sob estas condições, 11 quimeras sobreviventes foram identificados e obtidos de inicialmente 19 quimeras que chegaram a termo entre 40 fetos que conseguiram evoluir na gestação de 382 de embriões agregados e transferidos. A tabela II mostra um sumário do processo de agregação utilizado.

Tabela II

Agravação do morulae (8- células embrionárias de rato da linhagem CD-I) com a recombinante positiva das Células ES dos clones N° de N° de N° de N° de N°de N°de embri embriões embriões fetos quime qui ões com em até ras meras agre transferên gestação ao identi sobrevi gados cia (%agre (% transfe termo ficadas ventes gados) rência) 399 382 (95.7%) 71 (18.6%) 40 19 11

Os onze quimeras sobreviventes obtidos correspondem aos dois clones de células ES independentes, clone n° 8 e clone n° 175, de acordo com as recomendações incluídas nos protocolos usuais para a criação de quimeras, que necessitam para se obter a mutação de pelo menos dois clones independentes para evitar problemas inerentes a um clone especifico que possa gerar um fenótipo anómalo do rato mutante [10] .

Após a transmissão pela linha de bacilo, a mutação foi avaliada através do cruzamento das quimeras correspondentes com as fêmeas da linhagem CD-I, cujo pêlo albino é facilmente distinguível do característico pêlo pigmentado das linhagens 129Sv de que derivam as células ES RI utilizadas nos processos recombinantes homólogos c ·$ 't ·? A tabela III descreve os resultados das análises de transmissão do fenótipo pigmentado (associado ao genótipo presente nas células ES) efectuado nas 11 quimeras identificados.

Tabela III

Quimeras obtidas por mutação do gene do receptor de Sigma-1. Análise de transmissão pela linha de bacilo do genótipo presente nas células ES através do cruzamento com a fêmea rato albina CD-I

Qui mera Clone ES Sexo % Quime rismo e- Linha de bacilo de transmiss ão Descendentes pigmentados de PI no cruzamento com CD-1/total 1 # 175 Macho 70% 100% 71/71 (continuação)

Quimeras obtidos por mutação do gene do receptor Sigma-1. Análise de transmissão pela linha de bacilo do genótipo presente nas células através do cruzamento com a fêmea rato albina CD-I

Qui Clone Sexo Linha Descendên mera ES quime de cia rismo bacilo pigmentada de de iPi com o transmi cruzamento ssão com CD-I 2 n° 175 Macho 5% 0% 0/130 3 co o Macho 65% 100% 91/91 4 co o s Macho 20% 0% 0* 5 co o Hermafrodita 40% 0% o** 6 n° 175 Macho 50% 0% 0/30 7 n° 175 Macho 100% 0% 0* 8 N° 8 Macho 70% 100% 27/27 9 N° 8 Macho 70% 100% 8/8 10 N° 8 Macho 10% 0% 0/28 11 N° 8 Macho 25% 0% 0/38 (*) Sem as trompas vaginais (estéril) (**) Trompas vaginais não produtivas

As análises de transmissão mostram quatro quimeras independentes ( 1 derivado do clone n° 175 e 3 derivados do clone n° 8) foram capazes de transmitir de forma eficiente a célula ES ao genótipo a sua descendência através da linha de bacilo. Estes animais PI foram utilizados para analisar a presença do alelo mutante e, através dos cruzamentos sucessivos gerar o rato mutante correspondente. 2.2 Produção de um rato mutante no gene do receptor Sigma-1

Após a verificação da transmissão através da linha de bacilo em quatro das onze quimeras obtidos (com indivíduos representando os dois clones recombinantes ES utilizados) pela presença da pigmentação na descendência obtida através dos cruzamentos com os ratos albinos CD-I, a presença dos alelos mutantes, apenas 50% irá herdar o alelo que portador da mutação enquanto os restantes 50% irão herdar o alelo selvagem, intacto, das células ES originais. Por este motivo e para uma identificação posterior dos indivíduos mutantes e os homozigóticos selvagens, foram concebidos dois testes analíticos através da técnica PCR (PCR-Sigma e PCR-Neo), Figura 10), utilizando os métodos convencionais [9] que permitem uma identificação inequívoca dos três genótipos, especificamente: homozigóticos selvagens, heterozigóticos (portadores da mutação) e homozigóticos mutantes (Ver tabela IV).

Tabela IV

Genótipo obtido por PCR

Genótipo PCR-SIGMA PCR-NEO Homozigótico selvagem + heterozigótico “ + Homozigótico mutante + A técnica PCR-Sigma utiliza os oligoucleotídeo MSI e MS3 [tabela 1] que apenas podem amplificar 1.16kb do fragmento específico quando um ou dois alelos do gene do receptor Sigma-1 está intacto. Similarmente, o PCR-NEO utiliza do oligoucleotídeo internos ao gene que confere resistência a neomicina (neo gene) [Neo 1 (SEQ. ID. NO 5) e Neo 2 (SEQ. ID. NO 6) que pode amplificar 0.7kb do fragmento de ADN apenas se um dos dois alelos for portador da mutação inicialmente detectada nas células ES. A tabela V mostra detalhadamente a identificação dos indivíduos heterozigóticos entre os indivíduos obtidos em F1 resultantes do cruzamento transmitido pelas quimeras e as fêmeas CD-I. Apenas os indivíduos pigmentados foram analisados pelo PCR-Neo. A detecção da banda analítica 0.7 kb indica que os indivíduos são portadores da mutação num dos alelos do gene do receptor de Sigma-1. Aproximadamente metade dos indivíduos pigmentados em cada um dos dois clones corresponde pode a ratos chinchila. A outra metade é composta por ratos cutia, com pêlo selvagem colorido. Da mesma forma que uma quantidade ligeiramente inferior a metade dos indivíduos f! em cada um dos dois clones foram analisados e descobriu-se que eram heterozigóticos e assim portadores da mutação.

Tabela V

Detecção dos indivíduos heterozigóticos nos cruzamentos entre quimeras e fêmeas CD-I

Quimeras Numero total de indivíduos pigmentados Fi analisados por PCR Heterozigó ticos (+/-) identifica dos (/% total) Hetero Zigóti cos com pêlo de chinchi la Heterozigóticos com pêlo de cutia (selvagem) Clone ES 71 31 (43.7%) 14 17 n° 175 Clone ES 112 51 (45,5%) 25 26 3 O 00

Após terem sido identificados indivíduos heterozigóticos em quantidade suficiente (de ambos os sexos) para cada clone ES utilizado, foram efectuados os cruzamentos entre os indivíduos heterozigóticos de forma a obter, de acordo com as leis da Genética Clássica (Medelian), indivíduos mutantes (homozigóticos para o alelo mutante) na segunda geração (F2) obtida.

Os genótipos obtidos para os animais F2 gerados basearam-se nos testes analíticos PCR referidos anteriormente (PCR-Sigma e PCR-Neo)(ver tabela IV). 0 resultado destes cruzamentos e o número total de cada um dos três genótipos obtidos para os indivíduos a segunda geração são fornecidos na Tabela VI.

Tabela VI

Detecção de indivíduos homozigóticos nos cruzamentos entre animais fl

Clones Total de indivíduos F2 analisados através de PCR Indivíduos selvagens i identifica dos Indiví duos heterozi góticos Ç1 / -} identifi cados Indiví duos mutantes (-/-) identifi cados Clone ES 130 42 60 28 n° 1 7 5 Clone ES 48 12 25 11 00 O

De acordo com as leis de Mendel, o resultado do cruzamento dos dois indivíduos heterozigóticos com dois alelos diferentes para o mesmo locus será distribuído da seguinte forma: 25% de indivíduos selvagens (+/+), 50% de indivíduos heterozigóticos (+/-) e 25% de indivíduos homozigóticos mutantes (-/-). A tabela VII compara os resultados obtidos em F2 (Tabela VI) sem os resultados esperados de acordo com as leis de Mendel.

Tabela VII

Comparaçao entre os resultados esperados e os resultados obtidos para os indivíduos F2

Total de indi víduos F2 selvagens (+/+) (% total) Heterozi góticos i ·*· / ···'·) (% total) Mutantes i; ·'··· / - ) (% total) Clone ES n° 175 Resultados obtidos 130 42 (32.3%) 60 (46,2%) 28 (21,5%) Clone ES n° 175 Resultados obtidos 130 32.5 (25%) 65 (50%) 32.5 (25%) Clone ES n° 8 Resultados Esperados 48 12 (25%) 25 (52,1%) 11 (22,9%) Clone ES n° 8 Resultados Esperados 48 12 (25%) 24 (50%) 12 (25%) A analise estatística destas informações leva em ambos os caso ao calculo de yf do valor mais baixo que tabulado para p=0.05 e (3-1=2) do grau de liberdade (χ2=5.991) [Clone ES n° 175χ2=3.785; clone ES n° 8χ2=3.785] de forma que é possível concluir que a distribuição do genótipo encaixa-se no que foi previsto por Mendel (p=0.05). Assim, uma ligeira redução nos mutantes identificados no que diz respeito aos valores teóricos esperados não estatisticamente significante.

Como uma conclusão adicional para a primeira análise deve-se acrescentar que os machos e fêmeas mutantes homozigóticos são obtidos de forma igual. A distribuição do sexo dos homozigóticos mutantes identificada encaixa-se no que foi previsto (50% de cada sexo) não observando quaisquer desvios significativos estatisticamente nesta fase. No caso do clone ES n° 175, dos 28 mutantes detectados, 13 são machos que no caso do clone ES n° 8 dos 11 mutantes detectados 4 são machos, Ambos os valores aproximam-se da normalidade e seguem a distribuição esperada (p=0.05, grau de liberdade=lx2 calculado=3,841) [Clone ES n° 175 χ2=0.143; Clone ES Bli!.«

De acrescentar que tantos os machos e as fêmeas homozigóticos encontrados são férteis, de forma que é possível obter colónias estáveis desta mutação. Não existem manifestações externas ou observáveis que aparentemente diferenciem os ratos mutantes dos ratos selvagens. No entanto, os ratos estão a ser analisados para avaliar o efeito da mutação do gene do receptor Sigma-1 através dos paradigmas com o intuito de elucidar o seu papel nos processos de analgesia, dependência, depressão, psicose e esquizofrenia utilizando os métodos convencionais deste campo [1¾] . A mutação foi obtida e analisada em dois bancos de genes mistos (129SvxCD-l e 129Sv x G57HL/6JI1 2.3 Análise estrutural, expressão e de função nos ratos mutantes para o gene do receptor Sigma

Após terem sido criados os genes mutantes do receptor Sigma-1, a ausência do gene (DNA) a sua expressão (mensageiro RNA), a proteína e actividade (função) foram analisados para verificar que, de facto os ratos mutantes eram deficientes no gene do receptor Sigma-1.

Primeiro foi estudada a presença dos polimorfismos associados as sondas 5' e 3' que permitem detectar os alelos mutantes e selvagens inequivocamente, Para tal, foi analisado o ADN genómico selvagem, heterozigótico e do rato mutante no receptor Sigma-1. 0 resultado da análise do Southern Blot é ilustrado na Figura 11. Os resultados obtidos permitem inequivocamente concluir que a presença do alelo mutante, de acordo com a concepção experimental esperada.

Segundo, a expressão do gene do receptor Sigma-1 em vários órgãos dos ratos mutantes, heterozigóticos e selvagens, em que o gene normalmente presente foi estudado [5]. Esta análise de expressão foi efectuada através da técnica do Southern blot, seguindo os protocolos descritos no campo [9], A figura 12 mostra a ausência do sinal nas alas de gel correspondendo ao total do ARN dos animais mutantes homozigóticos, tendo assim a falta do gene do receptor Sigma-1. Não falta apenas o gene do receptor de Sigma-1 mas também é impossível descobrir o mensageiro ARN (transcrições) permitindo documentar a sua expressão. De facto, o rato mutante não expressa o gene do receptor Sigma-1.

Terceiro, a expressão do gene do receptor Sigma-1 no cérebro do rato mutante, heterozigótico e selvagem foi avaliado ao localizar os extractos de proteína correspondentes pelos meios de anticorpo policlonal. A técnica do Western Blot foi utilizada para esta avaliação. Os resultados obtidos são ilustrados na Figura 13, onde os níveis proteína não detectáveis foram encontrados (receptor Sigma-1) nos extractos de proteína no cérebro para os ratos mutantes homozigóticos para o gene Sigma-1.

Quarto, actividade (função) do receptor Sigma-1 do rato foi avaliada pelo teste específico de ligação ao ligamento f "‘Hj -pfêbt ttoci mi. Rapidamente, os cérebros do rato mutante (+/+), heterozigótico C >/-5 e selvagem (-/-) foram homogeneizados e, as homogeneizações foram centrifugadas várias vezes a diferentes velocidades para obter a fracção da membrana. Então as amostras obtidas da fracção da membrana foram incubadas com o j i! i radio ligamento nas condições de ligação optimizadas para este receptor para 130-170 minutos), as amostras foram filtradas, lavadas e lida a radioactividade presente no filtro [22] . Os resultados obtidos estão ilustrados na Figura 14 e revelam a falta de actividade (função) no rato mutante homozigótico.

Quinto, a função do receptor Sigma-1 foi avaliado de acordo com os paradigmas comportamentais conhecidos e protocolos. Neste sentido, não foram encontradas diferenças significativas entre o comportamento do rato mutante e do rato selvagem, na seguinte listagem de testes ou paradigmas analisados. As diferenças estatisticamente significantes apenas foram observadas no rato selvagem com hiperactividade (hypermotility) a resposta induzida pelo ligamento SKF-10047 (data não mostrada).

Depósito do Material Biológico

Uma cultura Escherichia coliTopFlO', conhecida por pHR53TK, contendo o vector plasmideo pHR53TK foi depositada na Spanish Collection of Standard Cultures (Colección Espafiola de Cultivos Tipo), CECT, Burjasot, Valência (Espanha), a 4 de Outubro de 2002, com o número de acesso CECT 5737.

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Lista de Sequências <110>Laboratórios del Dr. Esteve, S.A. em <120>Mamiferos não-humanos mutantes deficientes receptores Sigma e suas associações <160>6 <210>1 <211> 18 <212> DNa <213> Sequência artificial <223> MSI Iniciador de Oligonucelotideo <400> 1

Aattttgctc cccctcctc 18 <210> 2 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <223>MS2 Iniciador de Oligonucelotideo <400> 2

Gcacctcaaaa cttcgtcttc 22

<210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <223>MS3 Iniciador de Oligonucelotideo <400> 3

Cgttcacaaa tacccactg 19

<210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <223>MS4 Iniciador de Oligonucelotideo <400> 4

Agctcctctt tcccttcacc 20

<210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <223>Neo Iniciador de Oligonucelotideo <400> 5

Agctcctctt tcccttcacc 20

<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <223>Neo2 Iniciador de Oligonucelotideo <400> 6

Agctcctctt tcccttcacc 20

Lisboa, 12/07/2007

Claims (16)

1. Um mamífero não-humano mutante, deficiente num receptor endógeno Sigma-1, cujo genoma contém uma mutação que inclui uma alteração no gene do receptor endógeno Sigma-1, em que a referida alteração no gene dá origem a um mamífero não-humano mutante que apresenta ausência de níveis detectáveis do receptor endógeno Sigma-1, que é fértil e que é um rato; obtido através da utilização do vector identificado como pHR53TK, depositado no CECT com o número de acesso CECT 5737 para inserir uma mutação funcional no receptor endógeno Sigma-1.

2. 0 mamífero não-humano mutante de acordo com a revindicação 1, em que o mamífero não-humano mutante é um mutante homozigótico da referida mutação.

3. 0 vector identificado como pHR53TK, depositado no CECT com o número de acesso CECT 5737.

4. Uma célula hospedeira cujo genoma contém um gene do receptor endógeno Sigma-1 transferido com um vector de acordo com a reivindicação 3.

5. A célula de acordo com a reivindicação 4, em que a referida célula hospedeira cujo genoma contém um gene do receptor endógeno Sigma-1 é seleccionada de entre uma célula diferenciada que normalmente expressa o produto do gene do receptor Sigma-1 e uma célula embrionária multipotencial não-humana.

6. A célula de acordo com a reivindicação 5, que inclui um alelo mutante do gene do receptor Sigma-1.

7. A célula isolada de um mamífero não-humano mutante deficiente em receptor endógeno Sigma de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 2, ou a sua descendência que contém a mutação que implica uma alteração no gene do receptor endógeno Sigma-1, dando lugar a uma célula isolada que apresenta ausência de níveis detectáveis do receptor endógeno Sigma-1.

8. A célula de acordo com a reivindicação 7, que inclui ambos os alelos mutantes do gene do receptor Sigma-

9. A célula de acordo com as reivindicações 7 ou 8, propagada e opcionalmente imortalizada.

10. A descendência do mamífero não-humano mutante deficiente no receptor endógeno Sigma-1 de acordo com qualquer reivindicação de 1 a 2, caracterizada por o respectivo genoma conter a mutação que implica uma alteração do receptor endógeno Sigma-1, dando lugar a uma célula isolada que apresenta ausência de níveis detectáveis do receptor endógeno Sigma-1.

11. Um procedimento para obter um mamífero não-humano mutante de acordo com qualquer uma da reivindicações de 1 a 2, que inclui a introdução de uma mutação funcional no gene do receptor endógeno Sigma-1 presente no genoma da célula, por recombinação homóloga na referida célula entre um alelo do gene do receptor Sigma-1 e um vector recombinante homólogo de selecção positiva-negativa de acordo com a reivindicação 3, a selecção dos homólogos recombinantes através do método de selecção positivo-negativo, a introdução dos referidos homólogos recombinantes em embriões, a sua implantação no mamífero fêmea receptor de pseudo-gestação e o seu desenvolvimento até termo, a selecção de quimeras que possam efectivamente transmitir o genótipo dos homólogos recombinantes a sua descendência pela linha germinal, cruzamento das referidas quimeras com mamíferos não-humanos de fenótipo selvagem para obtenção de mutantes heterozigóticos para criar a mutação no gene do receptor endógeno Sigma-1 e, se desejado, o cruzamento dos referidos mutantes heterozigóticos entre si para obtenção de mutantes homozigóticos.

12 - A utilização do mamífero não-humano mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2 como animal de controlo em testes in vivo.

13 - A utilização do mamífero não-humano deficiente no receptor Sigma-1 de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou de uma linhagem celular deficiente no receptor Sigma-1 de acordo com as reivindicações 4 a 9 para avaliar os compostos potencialmente úteis para: prevenir e/ou tratar distúrbios do sistema nervoso central; prevenir e/ou tratar alterações de memória; prevenir e/ou tratar condições de stress; prevenir e/ou tratar condições de dependência de drogas; provocar analgesia; ou induzir neuro-protecção.

14. Um método para determinar o efeito de um composto a ser testado no mamífero não-humano deficiente no gene do receptor endógeno Sigma-1, que inclui colocar em contacto o mamífero não-humano mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 com o referido composto a ser testado e detectar a presença ou ausência de alteração fisiológica no referido mamífero não-humano mutante como resposta ao contacto com o referido composto.

15. Um método para determinar o efeito de um composto a ser testado no mamífero não-humano deficiente no gene do receptor endógeno Sigma-1, que inclui a administração do referido composto a ser testado a um mamífero não-humano mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, a administração do referido composto a ser testado a um mamífero não-humano de controlo com expressão do receptor endógeno Sigma-1 e observação se o referido composto tem efeito no fenótipo do referido mamífero não-humano mutante quando comparado com o mamífero não-humano de controlo .

16. Um método para determinar o efeito de um composto em células que expressam o receptor Sigma-1 e em células que não expressam o referido receptor Sigma-1, que engloba a introdução de um composto a ser testado numa população de células ou num homogenato das referidas células, em que as referidas células são isoladas ou produzidas por um mamífero não-humano mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, a administração do referido composto a ser testado a uma população de controlo de células de mamífero não-humano ou a um homogenato das referidas células com expressão de um receptor funcional Sigma-1 e observação ou análise de se o referido composto a ser testado tem algum efeito observável sobre o fenótipo das células do referido mamífero não-humano mutante quando comparado com as células de mamífero não-humano de controlo. Lisboa, 12/07/2007