CN101595128B - 免疫应答增强的转基因动物和用于制备其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于生产非人类转基因(Tg)动物的方法，包括将提供增强的MHCI类相关的新生动物Fc受体(RcRn)活性的遗传构建体导入所述非人类动物体内，与相同种属的非转基因对照动物相比，所述非人类转基因动物针对抗原能够形成的体液免疫应答增强。本发明还提供了一种包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人类Tg动物以及这种动物在非治疗性方法中的应用。还提供了治疗性遗传构建体和方法。本发明进一步提供了用于生产免疫球蛋白的方法。

Description

免疫应答增强的转基因动物和用于制备其的方法
技术领域
本发明涉及免疫学领域。更具体地，本发明提供一种用于生产非人类转基因(Tg)动物的方法，包括将提供增强的MHC I类相关的新生动物的Fc受体(FcRn)活性的遗传构建体导入所述非人类动物体内，与相同种属的非转基因对照动物相比，所述非人类转基因动物针对抗原能够形成的体液免疫应答增强。本发明还提供了一种包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人类Tg动物以及这种动物在非治疗性方法中的应用。还提供了治疗性遗传构建体和方法。本发明进一步提供了用于生产免疫球蛋白的方法。
背景技术
在特异性体液免疫应答中，由于对抗原起反应，浆细胞从B淋巴细胞发育而来，该反应在抗原刺激后约1-2周达到顶峰。第二次遇到抗原时则引起对抗原亲和性增加的抗体分泌、特异性血清抗体滴度峰值增加以及血清中的抗体水平持续。保持特异性血清抗体水平需要浆细胞持续性分泌Ig并保护其不被快速清除。尽管IgM、IgA、IgE会相对迅速地从体内清除，但IgG的血清半衰期则相对较长。1958年，Brambell阐述了一个介导母体IgG转运的可饱和性受体系统(Brambell，1958)；随后，他推断存在一个类似或相同的受体可保护IgG免受催化，从而使其在所有的血浆蛋白中存在时间最长(Brambell，et al.，1964)。最终证实Brambell受体(FcRB)既介导出生前和/或新生动物期的IgG转运，用名词FcRn(新生儿/新生动物Fc受体)表达，又能介导IgG免受催化(Junghans，1997)。
FcRn首先在啮齿类动物中被鉴定为可通过新生儿/新生动物肠道将母体免疫球蛋白从母亲转移至新生动物的受体(Rodewald，1976；Simister and Rees，1985)。自从Simister和Mostov首次在鼠新生动物肠道中对其加以描述(Simister and Mostov，1989)以来，已有多个研究证实了FcRn在调节IgG在不同起源细胞内部和之间进行转运时发挥关键作用(Antohe et al.，2001；Claypool et al.，2004；Dickinson et al.，1999；Kobayashi et al.，2002；McCarthy et al.，2000；Ober et al.，2004；Spiekermann et al.，2002)。其作用还在于保护IgG和白蛋白免于降解，这两者是在血清中大量可溶的蛋白质，从而延长了它们的半衰期(Ghetie et al.，1996；Israel et al.，1996；Junghans and Anderson，1996)。最初人们认为该机制主要由血管内皮排列的内皮细胞介导(Borvak et al.，1998)，然而，近期的研究结果表明其他细胞中也存在该过程(Akilesh et al.，2007；Lu et al.，2007)。在这些细胞中，FcRn主要存在于早期/循环内含体中，在内含体中FcRn与通过流动相内吞而内化的IgG和白蛋白相遇。内含体的酸性环境有利于该相互作用。相互结合的IgG和白蛋白循环回表面并从细胞释放，而未结合的配体则向下游移动而被溶酶体降解(Anderson et al.，2006；Roopenian and Akilesh，2007)。更近期的数据则支持一个新观念，即其中FcRn在IgG介导的吞噬中发挥主要作用(Vidarsson et al.，2006)。
功能性FcRn分子是由MHC I类样α链(或重链)与β2-微球蛋白(β2m；另一个名称：轻链)组成的异源二聚体(Simister andMostov，1989)，其以pH依赖性方式结合IgG和白蛋白(Chaudhuryet al.，2003；Simister and Mostov，1989)，尽管是在不同的结合位点(Andersen et al.，2006；Chaudhury et al.，2006)。
FcRn已从大量的哺乳动物种属中克隆出来，其中包括鼠(Simister and Mostov，1989)、小鼠(Ahouse et al.，1993)、人(Storyet al.，1994)、牛(Kacskovics et al.，2000)、负鼠(Adamski et al.，2000)、绵羊(Mayer et al.，2002)、猪(Schnulle and Hurley，2003；Zhaoet al.，2003)、骆驼和狗(Kacskovics et al.，2006b)。近来，本发明人克隆并表征了兔FcRnα链。尽管大多数由FcRn执行的功能均在小鼠中加以描述，在其他哺乳动物中开展的研究表明FcRn在IgG催化中所发挥的作用与在所研究的全部哺乳动物如啮齿类、人类和灵长类(Ghetie and Ward，2002)、猪(Harmsen et al.，2005)和牛(Kacskovics et al.，2006a)中具有类似的重要性。
近来在两种不同的小鼠模型中证实，牛FcRnα链(bFcRn)过表达(过量表达，overexpression)显著延长了这些动物中的小鼠IgG半衰期(Bender et al.，Lu et al.，2007)，表明bFcRn与小鼠β2m(mβ2m)构成了功能性复合体，且其结合小鼠和人IgG。本发明人也发现bFcRn在转基因(Tg)小鼠中的过表达(Bender et al.，2007)能使这些动物在免疫接种后产生水平显著提高的抗原特异性IgG和IgM。
WO2007061292提交较早但在本发明的优先权日之后公开，披露了单克隆抗体的制备，其中抗体生成细胞用编码FcRn基因的核酸进行转染。该被修饰的细胞表达FcRn，且抗体生成增加。该作者未能对转基因动物制备或动物本身进行披露，但他们提到了含有至少一个(额外)拷贝编码FcRn的核酸的非人类动物对于上调血液中抗体水平的优势。然而，该学说明显是理论性的，且基于其对体内如小鼠腹水中单克隆抗体生成的描述。他们也未能指出FcRn过表达对于增强免疫应答的优势。
很明显，本领域中仍然需要提供含量和质量高度改善的诊断性、研究性和治疗性免疫球蛋白。为了实现该需求，本发明提供转基因动物，其对抗原刺激产生水平显著提高的特异性体液免疫应答。
我们意外地发现，牛FcRnα链(由牛FCGRT基因编码)拷贝数依赖性过表达的BAC Tg小鼠不仅使牛FcRnα链与小鼠β2m形成功能性复合体，且显著增加了外源性给予的小鼠和人IgG的半衰期，与其野生型对照相比，这些转基因动物在免疫接种后还表现出显著增强的体液免疫应答。该抗原特异性抗体多数是IgG，然而在次级免疫应答过程中IgM滴度也增加。分析可能的原因是，与其野生型对照相比，本发明人在免疫接种后的bFcRn转基因小鼠中检测到数量显著增加的抗原特异性B细胞、树突状细胞以及次级淋巴器官中中性粒细胞的大量流入。值得注意的是，在野生型对照中也观察到了虽然较弱但类似的变化。因此，可以证实与其野生型对照相比，bFcRn Tg动物中抗原特异性IgG和IgM水平增加不仅是由于IgG保护增加，而且是由于抗原特异性B细胞克隆扩增较强以及因此免疫球蛋白合成增多。这些结果指出了FcRn在免疫应答中的新作用。本发明首次披露了由于正常动物中不存在显著的过表达FcRn状态，其对于免疫接种后的免疫应答具有广泛的效应，这使得该系统对于针对多种抗原产生不同类型的抗体有用。
发明内容
因此，本发明提供一种用于生产非人类转基因(Tg)动物的方法，包括将提供增强的MHCI类相关新生动物Fc受体(FcRn)活性的遗传构建体导入所述非人类动物，而与相同种属的非转基因对照动物相比，所述非人类转基因动物针对抗原所能形成的体液免疫应答增强。
另一方面，本发明提供一种包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人类Tg动物，条件为：
如果所述动物是FVB/N小鼠，则所述遗传构建体并不包含细菌人工染色体(BAC)克隆#128E04的整个牛插入片段。
如果所述FcRn是人类FcRn(hFcRn)，则所述遗传构建体不是包含完整hFcRn基因及10kb 5’和10kb 3’侧翼序列的33kb人粘粒克隆；也不是携带巨细胞病毒(CMV)增强子和鸡β-肌动蛋白启动子且含克隆于其中的hFcRnα链的载体E；也不是包含来自人源BAC文库的完整hFcRn基因的34kb XhoI片段。
如果所述FcRn是牛FcRn(bFcRn)，则所述遗传构建体不是包含编码bFcRnα链序列的pBC1-bFcRn的NotI-SalI片段也不是编码bFcRn轻链的pBC1-bb2m的NotI-SalI片段。
如果所述FcRn是鼠类FcRn(mFcRn)，则所述遗传构建体不是IFABP-m FcRn也不是IFABP-mb2m。
另一方面，本发明提供一种包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人类Tg动物在非治疗性方法中的应用，该方法包含一个步骤即在所述动物体内针对感兴趣抗原形成增强的体液免疫应答。
另外一方面，本发明提供一种用于生成免疫球蛋白的方法，包括一个步骤即按照任何已建立的可实现免疫球蛋白生成的方案应用Tg动物，Tg动物包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述体液免疫应答增强包括在用抗原免疫接种后生成水平升高的免疫球蛋白，其中所述动物在所述免疫接种后生成对免疫球蛋白具有特异亲和性的FcRn。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述体液免疫应答增强包括抗原特异性B细胞克隆扩增增强。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述体液免疫应答增强包括刺激中性粒细胞流入次级淋巴器官。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述体液免疫应答增强包括刺激树突状细胞和/或巨噬细胞流入次级淋巴器官。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述次级淋巴器官包括脾。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述抗原是较弱的免疫原。
另一方面，本发明提供一种用于生成免疫球蛋白的方法，包括采用包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的Tg动物，所述方法包括至少一个步骤，即其中所应用的方案经该步骤调整后，与相同种属的非转基因对照动物相比，所述Tg动物在较少次数的抗原刺激后即能形成相同水平的体液免疫应答。
另外一方面，本发明提供一种用于生成免疫球蛋白的方法，包括采用包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的Tg动物，所述方法包括至少一个步骤，即其中所应用的方案经该步骤调整后，与相同种属的非转基因对照动物相比，所述Tg动物能够较快形成相同水平的体液免疫应答。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述动物是哺乳动物。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述哺乳动物是啮齿类动物。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述啮齿类动物是小鼠。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述哺乳动物是兔。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述哺乳动物选自由牛、猪、骆驼、山羊、绵羊、狗、驴和马组成的组。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述转基因哺乳动物由对于单克隆抗体生成有用的种系获得或者经遗传改造变得更加适于单克隆抗体生成种系获得的。
另一方面，本发明提供一种杂交瘤细胞系，由根据权利本发明所述动物获得的细胞或者根据本发明所述方法或应用而生成或采用的动物获得的细胞产生。另一方面，本发明提供一种单克隆抗体，利用根据本发明所述方法、应用或动物生成。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述转基因动物从对于多克隆抗体生成有用的种系获得或者经遗传改造变得更加适于多克隆抗体生成。
另一方面，本发明提供一种多克隆抗体，利用根据本发明所述方法、应用或动物生成。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述免疫球蛋白是IgG。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述免疫球蛋白是IgM。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述动物经转基因用于生成人类或人源化免疫球蛋白。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述遗传构建体适于编码FcRn蛋白α链的核酸序列表达。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述编码FcRn蛋白α链的核酸序列被突变。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述突变使得所述FcRn蛋白的白蛋白结合位点变得无功能。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述核酸序列编码嵌合的FcRn蛋白。
另一方面，本发明提供一种动物繁殖材料，从根据本发明所述的Tg动物或者根据本发明所述方法得到的Tg动物获得，所述动物繁殖材料包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种动物繁殖材料，其选自由精子、精原细胞、卵子、卵巢组织、胚胎或用于体细胞克隆的组织样品组成的组。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述FcRn活性增强是通过将一个以上编码所述FcRn的核酸序列的功能性拷贝整合入所述动物的基因组内提供的。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法、应用或动物，其中所述遗传构建体包括BAC克隆#128E04的牛插入片段或者BAC克隆#262E02的兔插入片段。
另一方面，本发明提供一种用于生成白蛋白的方法，包括一个步骤即按照任何已建立的可实现白蛋白生成的方案应用Tg动物，其包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种方法，其中所述遗传构建体适于编码FcRn蛋白α链的核酸序列表达，其中消除了所述FcRn蛋白的免疫球蛋白结合活性。
另一方面，本发明提供一种应用于需要增强体液免疫应答的患者基因治疗中的遗传构建体，其中所述遗传构建体提供增强的FcRn活性。
另一方面，本发明提供一种用于需要增强体液免疫应答的患者治疗的方法，所述方法包括将提供增强的FcRn活性的遗传构建体导入所述患者体内。
另一方面，本发明提供一种应用于需要增加血清免疫球蛋白水平的患者基因治疗中的遗传构建体，该增加来自于内源性天然免疫球蛋白生成或者外源性治疗方法，其中所述遗传构建体提供增强的FcRn活性，所述对免疫球蛋白具有特异亲和性的FcRn由所述患者产生或者给予所述患者。
另一方面，本发明提供一种用于需要增加血清免疫球蛋白水平患者的治疗方法，所述方法包括将提供增强的FcRn活性的遗传构建体导入所述患者体内，所述对免疫球蛋白具有特异亲和性的FcRn由所述患者产生或者给予所述患者。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种用于基因治疗中的遗传构建体或方法，其中所述患者是人类。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种用于基因治疗中的遗传构建体或方法，其中所述遗传构建体适于编码所述FcRn蛋白α链的核酸序列表达。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种用于基因治疗中的遗传构建体或方法，其中所述FcRn活性增强是通过将一个以上编码所述FcRn的核酸序列的功能性拷贝整合入所述患者的基因组内提供的。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种用于基因治疗的遗传构建体或方法，其中所述编码该FcRn蛋白α链的核酸序列被突变。
在一个优选实施方式中，本发明提供一种用于基因治疗的遗传构建体或方法，其中所述突变使得所述FcRn蛋白的白蛋白结合位点变得无功能。
另一方面，本发明提供一种用于增强模型动物体液免疫应答的方法，该模型动物对于实施涉及与免疫应答改变相关的条件的检测有用，包括一个步骤即将提供增强的FcRn活性的遗传构建体导入所述动物。
附图说明
图1：128E04牛BAC转基因的结构和表征。A：具有相对bFCGRT位置的128E04 BAC基因组片段和五种公认的蛋白编码基因FLT3LG、LOC539196和LOC522073、LOC511234、LOC511235的示意图。B：通过PCR检测所整合转基因的完整性。I：来自转基因株系#9的基因组DNA；II：来自转基因株系#14的基因组DNA；III：来自转基因株系#19的基因组DNA；以及IV：对照BAC 128E04的基因组DNA模板。孔：MM：1kb梯度，1：BAC 128E04 5’末端，2：FLT3LG，3：LOC539196，4：FCGRT，5：LOC522073，6：LOC511234，7：LOC511235，8：BAC 128E04 3’末端特异性PCR。可注意到，未从转基因株系#9的基因组DNA扩增出LOC511234、LOC511235和3’末端特异性片段。
图2：源自转基因株系#14和#19的成纤维细胞的分裂中期图像。FISH分析表明，荧光标记的BAC 128E04克隆(携带bFCGRT)分别杂交于#14和#19小鼠成纤维细胞中完全不同的染色体片段，其排除了一种可能性即转基因小鼠株系#14和#19的表型是整合位点依赖性的。
图3：小鼠β-肌动蛋白和bFcRnα链(bFCGRT)各自的Ct对于log拷贝数(Q)的标准曲线，以利用定量实时PCR测定Tg小鼠(株系#14和#19)中bFcRn拷贝数绝对值。Ct是采用定量实时PCR时荧光跨过一个阈值所处于的循环数。检测利用荧光5k核酸酶技术在ABI Prism7000序列检测系统(Applied Biosystems FosterCity CA，USA)上进行。
图4：转基因拷贝数依赖性bFcRn特异性mRNA表达。A：来自转基因株系#9(1、4、7、10)、#14(2、5、8、11)、#19(3、6、9、12)各自半合子组织样品的RT-PCR。孔：MW：1kb梯度，1-3肺；4-6肝；7-9新生动物肠道；10-12乳腺。B：检测肝总RNA样品中bFcRnα链mRNA表达的Northern分析。孔1：野生型小鼠；2：牛，3-4：株系#14的半和纯合子小鼠对应两个和四个拷贝的bFcRn转基因；5-6：株系#19的半合子和纯合子小鼠对应五个和十个拷贝的bFcRn转基因；C：定量评价转基因拷贝数依赖性bFcRn表达，如通过Northern分析所检测的。柱表示光密度(均值)，而误差棒表示均值的标准差。统计学显著性如下表示：*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图5：wt和Tg小鼠肺内bFcRn拷贝数依赖性蛋白水平。利用亲和纯化的兔抗血清进行细胞总蛋白的Western blot(B4-bFcRnα链稳定转染的MAC-T细胞株提取物(Kacskovics et al.，2006a)；WT-野生型小鼠；TG2-半合子小鼠，株系#14；TG5-半合子小鼠，株系#19)。左侧示出了分子量标志物，以千道尔顿计。bFcRnα链特异性亲和纯化的血清(Mayer et al.，2002)在转基因肺组织样品中检测到一个约40kDa条带，类似于bFcRn转染(B4)的阳性对照细胞提取物。第二个条带(虚线箭头)可表示一种丰度较低的非糖基化形式受体。比较TG2和TG5(分别对应两个和五个转基因拷贝)中重组FcRnα链的量表明，不仅在mRNA水平而且在蛋白水平该拷贝数依赖性表达均比较明显。
图6：bFcRn Tg(株系#14，纯合子，携带4拷贝bFcRn)和wt小鼠中小鼠(A)和人(B)IgG的药物动力学。建模数据(根据初期药物动力学参数的几何平均数模拟)和三至五只动物(年轻成年同窝仔)所观测到的小鼠(10mg/BWkg)和人(10和20mg/BWkg)IgG平均血清抗体浓度(μg/ml)作为时间(注射后的小时数)的函数而绘制。插入图片示出了所注射IgG的半衰期值，其通过WinNonLin专业软件应用两隔间模型(compartmental model)计算得到。与wt小鼠相比，Tg动物内IgG半衰期明显更长。样品一式两份地测定，误差棒表示均值的标准差(SEM)。统计学显著性如下表示：*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图7：bFcRn过表达引起Tg小鼠内免疫应答大大增强，而未影响其性质。Tg和wt小鼠利用OVA/CFA腹腔注射免疫接种，14天后，则利用OVA/IFA免疫接种。所采集的血清依次分析OVA特异性IgM和IgG。在小鼠中，与初次免疫应答中的IgM水平相比，次级免疫应答中的IgM滴度较高，且其显著高于wt小鼠。显著性水平表示Tg与wt小鼠之间的差异(A)。在次级免疫应答过程中，Tg小鼠中OVA特异性的IgG滴度几乎为wt动物的3倍。显著性水平表示Tg与wt小鼠之间的差异(B)。免疫接种32天时，分析了OVA特异性IgG亚型的滴度。Tg小鼠产生了显著较高的IgG亚型(除了IgG3之外)滴度，然而，与wt小鼠相比，他们之间的比例并没有什么不同，表明bFcRn过表达增加了OVA特异性IgG生成而未影响其比例(C)。总IgG生产量反映了OVA特异性IgG滴度，与其wt同胞相比，Tg小鼠生成了明显更高的IgG量。值得注意的是，即使在免疫接种之前，它们示出了更高的IgG水平。示出的值为均值±SEM。*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；ns，p＞0.5。
FITC-OVA免疫复合物的吸收效率利用FACS分析(E)。黑色点线表示P388细胞的自体荧光，灰线则表示非免疫复合物的OVA-FITC吸收；黑线表示从wt血清制备的OVA-FITC免疫复合物的吸收，而灰色填充区域表示由Tg血清制备的OVA-FITC免疫复合物的吸收。与OVA-FITC吸收(2.5μl)相比，利用2.5μl血清时我们未发现吞噬增强。然而，利用10μl Tg小鼠血清时则观察到了显著性增强，而用该量(10μl)wt小鼠血清时则无吞噬增强。最后，与非免疫复合物形式的OVA-FITC(40μl)相比，40μl来自Tg和wt小鼠的血清所引起的吞噬增加相同。
图8：Tg和wt小鼠对FITC-葡聚糖免疫接种的反应类似。用FITC-葡聚糖腹膜内免疫Tg(株系#14)和wt小鼠，两周后进行同样的处理。我们主要观察到FITC特异性IgM，且Tg和wt动物之间不存在差异。分析免疫过程中的免疫应答，我们注意到第二次免疫接种后Tg和wt小鼠中IgM生成均增加。
图9：来自小鼠(每一组三只雄性动物)的脾细胞，该小鼠用OVA+CFA免疫接种，第14天再用OVA+IFA处理，于第25天收集。与wt动物相比，Tg小鼠脾内OVA特异性IgM生成细胞达两倍，而OVA特异性IgG细胞则达到三倍以上(A)。OVA免疫接种后25天，wt和Tg小鼠中脾脏重量(B)和细胞数量(C)均有所增加，然而，Tg小鼠中脾脏大小和细胞数量则显著高于wt小鼠。示出的值为均值±SD。(*，p＜0.05；***，p＜0.01；p＜0.001)。
图10：分析正常和OVA免疫接种的(免疫接种25天后)wt和Tg小鼠中脾脏的细胞分布。我们发现，免疫接种后，携带CD45R/B220(B淋巴细胞)和I-A/I-E(MHC II类)抗原的细胞比例显著减少(p＜0.05)。而wt和Tg小鼠中，则携带CD3标志物(T淋巴细胞)的细胞分别为无差异或减少不明显。直方图示出了携带CD45R/B220(B淋巴细胞)、CD3(T淋巴细胞)和I-A/I-E(MHC II类)抗原的细胞(阴影部分)或亚型特异性对照物(黑线)的百分比(均值±SD)。此处示出了所实施2次实验中的一个典型实验(n＝3只小鼠/组)。
图11：免疫接种引起中性粒细胞大量流入脾脏内。为了进一步表征免疫接种25天后迁移入脾脏内的细胞，我们利用双标记技术通过流式细胞术对其进行分析。我们发现，免疫接种后，Tg小鼠中携带CD11bhigh和Gr-1high抗原的细胞在wt小鼠中增加约五倍和在Tg小鼠中增加九倍(A)。我们还发现，与其wt对照相比，Tg小鼠中携带CD11b和MHC II类抗原(巨噬细胞、树突状细胞)(B)以及CD11b和CD11c抗原(树突状细胞)(C-阳性细胞)的细胞比例显著增加。密度图示出了所实施2次实验中的一个典型实验(n＝3只小鼠/组)。所释出的条形图值为均值±SD；*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图12：来自腹膜细胞的中性粒细胞和巨噬细胞中的bFcRn特异性RT-PCR表达。bFcRn特异性扩增产物可从Tg小鼠样品成功扩增。标志物：M1-BenchTop 100bp DNA ladder(Promega)；1-未纯化的wt小鼠腹膜细胞；2-未纯化的Tg小鼠腹膜细胞；3-来自Tg小鼠的纯化中性粒细胞(CD11bhigh、Gr-1high)、巨噬细胞和树突状细胞(CD11bhigh和Gr-1low)也通过流式细胞术分析，4-从含bFcRnα链cDNA的质粒进行扩增。箭头示出了特异于bFcRn的548bpDNA条带。密度图示出了所实施2次实验中的一个典型实验。
图13：脾脏中携带OVA-FITC细胞的存在情况。OVA免疫的(免疫接种后56天)和未免疫转基因小鼠(纯合子#14)用OVA-FITC进行腹膜内处理。处理后五小时，利用流式细胞术分析脾脏细胞，我们发现OVA-免疫的小鼠脾脏中存在15.1±1.4％的OVA-FITC阳性细胞，而在未免疫动物中则未发现相当数量的VA-FITC阳性细胞(2.1±0.3％)。共聚焦图像示出了来自OVA-免疫和未免疫小鼠脾脏的细胞。细胞核用细胞可透过性DRAQ5红色荧光DNA探针进行染色，可看到FITC-OVA为亮点(A)。在OVA免疫的动物中，FITC-阳性细胞中61.2±5.4％为B220阳性(B-淋巴细胞)、18.5±0.6％为CD11bhigh和Gr-1high(中性粒细胞)而13.5±2.1％是CD11b和CD11c阳性(树突状)细胞(B)。OVA-FITC内化入含多叶状核的典型中性粒细胞中，而OVA-FITC则在含大圆形核和薄层胞质的细胞(可能是B淋巴细胞)表面上检测到(C)。密度图和柱状图示出了一个典型实验(n＝3只小鼠/组)；数据表示细胞百分比(均值±SD)。尺度棒表示10μm。
图14：HIV-P2-FcRn转基因首建小鼠的RT-PCR分析。A用设计用于P2启动子的引物进行RT-PCR，预期片段大小：579bp，B用设计用于牛FcRn第4外显子的引物进行RT-PCR，预期片段大小：161bp。样品：1，HIV-P2-FcRn小鼠肺；2 HIV-P2-FcRn小鼠肝；3HIV-P2-FcRn小鼠肠道；4.HIV-P2-FcRn小鼠脾脏；5.HIV-P2-FcRn小鼠基因组DNA；6.牛基因组DNA；7.对照小鼠的基因组DNA；8.牛肝cDNA；9.对照小鼠cDNA，10.阴性对照。
图15：bFcRn过表达严重影响白蛋白代谢。缺乏FcRn(FcRnKO)、wt、纯合型#14和#19(分别表达4和10拷贝的bFcRn)中的血清白蛋白水平。当我们比较KO和WT小鼠(p＜0.01)；WT和TG4或TG10小鼠(p＜0.001)的白蛋白水平时，观察到了显著性差异。
图16：FcRn-/-(KO)和FcRn-/-牛FcRn转基因(KO_bFcRn)小鼠中的兔IgG清除率。A.多重PCR，用来鉴定基因型为bFcRn/mFcRn-/-的F2小鼠(用矩形表示)。F2小鼠通过F1小鼠杂交而得到，而F1小鼠通过使bFcRn/mFcRn X mFcRn-/-neo+亲本株系杂交而出生。引物如实施例12中所述。预期片段大小：bFcRn：610bp；neo：345bp；mFcRn278bp。孔1.bFcRn+，neo+，mFcRn+；2.bFcRn+，neo+，mFcRn-；3.bFcRn+，neo+，mFcRn+；4.bFcRn-，neo+，mFcRn-；5.bFcRn-，neo+，mFcRn-；6.bFcRn+，neo+，mFcRn+；7.bFcRn+，neo-，mFcRn+；8.bFcRn+neo+，mFcRn+；9.bFcRn-，neo+，mFcRn+；10.bFcRn+，neo+，mFcRn+；11.bFcRn+，neo+，mFcRn+；12.bFcRn+，neo-，mFcRn+；13.牛基因组DNA；14.bFcRn+，neo-，mFcRn+；15.阴性对照B.FcRn-/-(KO)和FcRn-/-牛FcRn转基因(KO_bFcRn)小鼠中兔IgG的药物代谢动力学。FcRn-/-小鼠中兔IgG清除迅速(半衰期：15小时)，但其在bFcRn/FcRn-/-小鼠中得到保护(半衰期：67小时)。这些动物用150μg兔IgG静脉注射。每组处理三只小鼠，数据表示两次独立实验。数据示出了平均值，误差棒则表示均值的标准差(SEM)。
图17：bFcRn转基因兔的PCR分析。设计用来检测牛FCGRT第四个外显子的引物实施PCR。预期片段大小是160bp。样品：1.38/JT兔基因组DNA；2.牛基因组DNA；3.FVB/n小鼠基因组DNA；4.空白对照；MM 1kb梯度。
图18：表征262E02兔BAC。用于评价兔基因存在的引物和PCR条件在实施例15的表7中阐述。
具体实施方式
第一方面，本发明提供一种用于生产非人类Tg动物的方法，包括将提供增强的MHCI类相关新生儿Fc受体(FcRn)活性的遗传构建体导入所述非人类动物体内，而与相同种属的非转基因对照动物相比，所述非人类Tg动物针对抗原所能形成的体液免疫应答增强。
第二方面，本发明提供一种包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人类Tg动物。这方面，必须注意到几个现有技术的披露内容中论及了携带FcRn转基因的Tg动物。然而，所有这些披露内容都被认为是偶然性预测，如下文将讨论的。
Bender et al.(Bender et al.，2004)披露了一种Tg动物，其通过利用牛BAC克隆#128E04将编码牛FcRn蛋白α链的基因导入FVB/N小鼠体内，以研究牛FcRn体内的转录调节和功能。该公开未披露如本文所披露的转基因动物的具体特征，尽管那些特征的确已存在，但尚未进行检测。因此，很明显该披露应该视为偶然性预测。
US2006/0031954和Petkova et al.(Petkova et al.，2006)披露了包含纯合型FcRn破坏和人FcRn(hFcRn)转基因的Tg敲除小鼠。该进一步显著延长了外源性给予的人IgG的半衰期，且倾向于表达类似于内源性表达水平的hFcRn。他们还提到，表达水平大大高于内源的FcRn可能是有用的，但未再提到任何具体细节。可以推测，利用强表达载体可将表达水平增至高达内源性表达水平的10至100倍。这些披露内容介绍了几种可获得Tg动物的独特构建体。在第一种情况中，采用了一种33kb的人粘粒克隆，其包括完整hFcRn基因以及10kb的5’和10kb的3’侧翼序列。作者将该Tg动物命名为“基因组hFcRn转基因株系32”。在第二种情况中，“cDNA转基因株系276”株系携带一个包含已克隆入载体E内的hFcRnα链的遗传构建体，该载体E携带CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子。在第三种情况中，他们的转基因动物携带一种包含34kb XhoI片段的遗传构建体，该片段包含来自Genome Systems，Inc的人源性细菌人工染色体(BAC)文库的完整hFcRn基因。显然，该作者通过直接遗传操作(如利用C57BL/6J和BXSB/MpJ小鼠)或常规杂交(例如利用MRL/MpJ和NZM2410株)得到了几种Tg小鼠种系，因此几乎不可能正确清点(enumeration)所有动物。因而，根据所携带的遗传构建体将不能认出这些Tg动物。
Lu et al.披露了通过利用含乳腺特异性调节元件的构建体而在其乳腺中携带bFcRn的Tg小鼠(Lu et al.，2006)。利用不同拷贝数(1至15之间)的bFcRn以及拷贝数为1至10的牛β2m建立了几种小鼠种系。对其表达进行检测并记录了血清IgG水平的变化。然而，该系统仅提供了泌乳后腺泡乳腺上皮细胞内有限的bFcRn表达，且用来研究泌乳期乳腺内的IgG转运。这些动物还未用于分析免疫应答。用于生成这些Tg小鼠的构建体是两种表达载体，其中羊β-酪蛋白启动子调节感兴趣和插入基因的转录，一个基因包含编码重链(α)的序列(pBC1-bFcRn)，另一个则编码牛FcRn的轻链(pBC1-bβ2m)。插入该Tg动物内的遗传构建体是通过用NotI和SalI酶消化可得到16.9千碱基(kb)的重链和16.1kb的轻链而生成的片段，并将其以相同浓度微注射入受精的昆明小白鼠(KunmingWhite mouse)卵内。
Yoshida et al.(Yoshida et al.，2006)研究了肠上皮内小鼠FcRn(mFcRn)在介导抗微生物免疫中的作用。他们建立了FcRn Tg小鼠种系，其中mFcRn和mβ2m利用组织特异性肠型脂肪酸结合蛋白基因启动子(IFABP)由肠上皮细胞特异性表达，以生成IFABP-mFcRnTg/mβ2mTg小鼠。他们也过量表达β2m，以确保其在FcRn转基因的表达中不是底物限制性的。然后，再一次将该Tg动物进一步与FcRn-/-小鼠然后与BALB/c或C57BL/6(CD45.2+)回交。
就上文提及的公开而论，由于所涉及研究的性质，因此存在一种可能性即各个作者已利用与上文所论及类似或不同的遗传构建体生成了几种其他转基因株系，所述公开内容中未对其加以清楚披露。因此，很明显，这些动物也被视为偶然性推测，因此，将任何携带与如上讨论的稍有不同的遗传构建体的这种参考文件如“转基因株系X”并入本讨论中。
因此，根据本发明所述Tg动物做出下列否认声明，以避开上文提到的偶然性推测：
如果所述动物是FVB/N小鼠，所述遗传构建体并非包含细菌
人工染色体(BAC)克隆#128E04的整个牛插入片段；
如果所述FcRn是人类FcRn(hFcRn)，所述遗传构建体不是
包含完整hFcRn基因及10kb 5’和10kb 3’侧翼序列的33kb人粘粒克隆；也不是携带巨细胞病毒(CMV)增强子和鸡β-肌动蛋白启动子且含克隆于其中的hFcRnα链的载体E；也不是包含来自人源BAC文库的完整hFcRn基因的34kb XhoI片段；
如果所述FcRn是牛FcRn(bFcRn)，所述遗传构建体不是包含编码bFcRnα链序列的pBC1-bFcRn的NotI-SalI片段，也不是编码bFcRn轻链的pBC1-bb2m的NotI-SalI片段；
如果所述FcRn是鼠类FcRn(mFcRn)，所述遗传构建体不是IFABP-m FcRn也不是IFABP-mb2m。
如本文中使用的，术语“非人类动物”涵盖动物中的脊椎动物级优选哺乳动物。本发明所适用的动物可根据功能标准即能够生成免疫球蛋白或其功能等价物而选择。在优选的实施方式中，本发明所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、猪、骆驼、绵羊、山羊、牛、驴和马。在更优选的实施方式中，该动物是小鼠、兔、猪、绵羊、山羊和牛。采用本领域中通常用于生产免疫球蛋白(单克隆抗体或多克隆抗血清)的任何动物均在本发明的范围内。
如本文中使用的，术语“相同种属的对照动物”或“相同种属的非转基因对照动物”用来描述未经生成本发明所述Tg动物所涉及步骤的动物。然而，在生成多克隆或单克隆抗体所必需的操作过程(例如初次免疫接种、必需的免疫加强以及全抗体生成过程中)中，对该相同种属对照动物的处理和保存均类似于本发明所述Tg动物。
如本文中使用的，术语“免疫球蛋白”指免疫球蛋白超家族中作为抗体发挥作用的糖蛋白。在本文中，术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互相交换使用。抗体是包含适应性免疫系统中主要效应器之一的宿主蛋白，其实用性已经得到了利用，因为它们已经且将继续广泛用作诊断和研究试剂。而且抗体正成为临床医生治疗疾病的全套设备中的一种重要治疗工具。抗体已用来进行分析、纯化和富集以及介导或调节生理反应。抗体能够以高度亲和力和特异性结合抗原的能力已经使其普遍应用于多个科学和医学学科中。抗原-抗体相互作用对于抗体的天然生物学功能以及其作为研究或治疗试剂的用途均非常关键。
在结构方面，抗体是球蛋白(位于蛋白电泳的γ区)。哺乳动物中存在五种类型的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(Ig代表免疫球蛋白，在本说明书全文中也用来表示抗体)。这些抗体根据其重链恒定区的差异进行分类，每一种免疫球蛋白类别在其生物学特征上均有所差异，且已发展为可处理不同的抗原。IgA存在于含粘液的区域(例如消化道、呼吸道或泌尿生殖道中)并防止病原体在粘膜区域的克隆。IgD主要作为B细胞上的抗原受体发挥作用。IgE结合变应原并触发组胺从肥大细胞释放(变态反应的基础机制)且保护机体免受蠕虫(肠虫)感染。IgM在B细胞表面上表达，还可以分泌形式用于在B细胞所介导免疫的早期清除病原体。IgG则在抵抗侵入性病原体的抗体免疫中发挥主要作用。
在本发明的一个优选实施方式中，所生成的免疫球蛋白是IgG，尽管本发明的范围不限于IgG同种型(类别)，或者IgG可能包含一些改变，如下文所论及的。
IgG可以分为不同的形式或亚类，这是不同哺乳动物中基因复制的结果。在啮齿类动物、人类、家养反刍动物、马、猪、骆驼科和豚鼠中，其中不同亚类具有不同的生物学特征。例如，由于对FcγR1的高亲和力，人IgG1和IgG3结合吞噬细胞。因此，IgG1和IgG3在(a)去除小的IgG-Ag复合物和(b)阳性和阴性刺激B细胞发育和抗体生成中可能非常重要。IgG3是一种强有力的补体激活剂，IgG1则是优先通过胎盘转运的主要血清IgG(Janeway Jr.et al.，2001)。人们已熟知亚类多样性在哺乳动物中差异极大。兔仅具有一种IgG基因，而小鼠和人表达四种IgG，马则具有七种。牛具有三种IgG，而猪则存在五种公认的IgG亚类基因。在研究较少的哺乳动物中，免疫球蛋白亚类之间生物学功能和相对表达方面可能也将存在类似的差异(Butler，2006)。
本发明可用来提高所述IgG亚型中任何一种或多种的产量而没有具体限制。然而，由受体动物生成的IgG亚型与含特定外源FcRnα链的FcRn蛋白的结合可能比含另一种外源FcRnα链的FcRn蛋白的结合更加紧密。通过用对所述IgG亚型的最佳结合能力和活性而选择FcRnα链转基因，利用特定FcRnα链转基因提高抗血清中特定IgG亚型的量或比例也在本发明的范围内。
在本发明另一个优选实施方式中，所生成的免疫球蛋白是IgM。IgM占全部血浆免疫球蛋白的约10％，且构成了早期抗体的主要组分，该早期抗体针对抗原性复杂的细胞膜抗原、传染性微生物和可溶性抗原而生成。至于其结构，体内IgM为五聚体结构。组成IgM五聚体结构的五个亚单位具有类似于IgG的四链结构。与IgG结构相比，主要区别之一是IgM特征在于其具有μ重链。此外，它们的差异还在于μ链在其恒定区内比γ链多一个结构域，且IgM具有一个多肽链，称为J链，其不存在于IgG中，且认为其能在IgM从抗体生成细胞分泌之前促进μ链的聚合。本领域中已经有人在尝试利用重组方法学生成功能等同于天然产物的IgM(见例如US2007154469)。与通过将异源或以其他方式修饰的免疫球蛋白基因导入动物体内而设法提高IgM产量的方法相比，本发明通过提供包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的Tg动物而提供了一种替换解决方法，该动物随后对抗原起反应而生成水平增高的内源性IgM。
如在本文中使用的，术语“体液免疫应答”指活生物体内的一个过程，其中抗体针对分子和生物体产生，该分子和生物体最终被中和和/或清除。抗体应答的特异性由T和/或B细胞通过膜结合受体(其结合单一特异性的抗原)而介导。结合恰当抗原并接收多种其他激活信号后，B淋巴细胞发生分裂，生成记忆性B细胞且最终分化为分泌抗体的浆细胞克隆，每一个克隆产生的抗体所识别的抗原表位均与其抗原受体所识别的相同。记忆性B淋巴细胞休眠直至其随后被其特异性抗原激活。这些淋巴细胞提供了记忆以及再次暴露于特异性抗原时所引起抗体应答成比例上升的细胞基础。
提到体液免疫应答时，术语“增强(enhanced)”指一种免疫应答，其中与针对特定抗原产生的抗体相同属性或者与相同种属的对照动物和相同抗原接触时的免疫应答相比，针对特定抗原所生成抗体的水平和多克隆化显著更高，或者所述免疫应答的产生显著更快，或者针对特定抗原的免疫应答更强。
如本文中使用的，术语“免疫接种”指一个过程，通过该过程个体暴露于一种抗原，该抗原常与佐剂结合，而佐剂设计用来强化其免疫系统对该抗原的抗性。该试剂称为“免疫原”或“抗原”。免疫接种与接种(inoculation)和疫苗接种(vaccination)相同，因为接种和疫苗接种如同免疫接种一样均采用活的感染性试剂。除了初次免疫接种过程，人们发现免疫接种的有效性可通过周期性重复注射该试剂而加强，其称为“加强”免疫接种。
提到免疫接种时，术语免疫球蛋白的“水平升高”指特异性血清免疫球蛋白的浓度显著高于相同种属的对照动物血清中相同免疫球蛋白的水平，如通过免疫应答强度所测定的例如所测量的其引起的抗体滴度峰值。该水平升高通常为至少高50％，优选高75％，较优选高100％，甚至优选高150％。
免疫接种的结局高度依赖于抗原性质，广泛被接受的是，任何可引发免疫应答的物质均称为具有免疫原性且称为免疫原。抗原则定义为任何可结合特异性抗体的物质。因此，所有抗原均具有诱发特异性抗体的潜能，但其中一些需要与免疫原结合方可诱发抗体。即尽管所有免疫原都是抗原，但并非所有抗原都有免疫原性。实验免疫学中应用最多的抗原是蛋白，针对蛋白的抗体在实验生物学和医学中具有广泛的应用。然而，纯化蛋白并非始终具有高度免疫原性，为了激发免疫应答必须与佐剂一起给予。碳水化合物、核酸和其他类型的分子均为潜在抗原，但常常仅诱发免疫应答如果连接于蛋白质载体。因此，蛋白抗原的免疫原性决定着几乎每一种免疫应答的结局。给予抗原的途径影响着所获得的免疫应答的强度和类型。最常用来将抗原导入机体内的途径是通过皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内注射或输液而注射入组织内。口服用药提供的抗原进入胃肠道内，而鼻内给药或吸入则将抗原带入呼吸道内。
抗体可将几乎每一种生物分子均识别为抗原，包括简单的中间代谢物、糖、脂质、内泌素和激素以及大分子如复杂的碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白。然而，仅大分子能够刺激B淋巴细胞而启动体液免疫应答。小化合物如二硝基酚可结合抗体但不能独立激活B细胞(即，它们不具有免疫原性)。为了产生用于这些小化合物的抗体，免疫学家通常在免疫接种前将其连接于大分子。在这些情况下，小化合物被称为“半抗原”，其该大分子被称为载体。与游离半抗原不同，半抗原-载体复合物可用作免疫原(Abbas and Lichtman，2003)。类似以及其他的免疫接种方法在本领域中已经广为人知，且熟练技术人员将能够轻易选择恰当方法实施本发明。
初次免疫应答通常仅引起针对所引入免疫原/抗原所产生的特异性抗体和总免疫球蛋白水平少量且不显著的增加。免疫应答的强度依赖于所给予免疫原的剂量。低于某个阈剂量时，多数蛋白均不能引发任何免疫应答。高于该阈剂量时，随着抗原剂量增加免疫应答逐步增加直至达到一个较宽的平台水平，随后在非常高的抗原剂量时出现下降。通常，二次及随后的免疫应答在较低的抗原剂量即可出现，并达到较高的平台值，这是免疫记忆的一个标志。这是为什么为了获得显著增高的特异性抗体滴度通常必须实施加强免疫的原因。加强免疫的次数可随多个因素而变化，例如抗原的抗原性、免疫佐剂的类型、免疫接种的途径和方案(Stills，2005)。
由于大多数抗原都高度复杂，因此它们表现出众多可由大量淋巴细胞识别的表位。每一个淋巴细胞激活后均可增殖并分化为浆细胞，所引起的抗体应答是多克隆抗体(PAbs)。适应性免疫应答的一个重要特征是免疫记忆。免疫记忆由于最初或初次免疫接种(其激起了初次免疫应答)而产生。
大多数蛋白在单独给予时免疫原性均较差或者无免疫原性。针对蛋白抗原的适应性免疫应答常常需要将抗原与佐剂混合注射。佐剂是任何能促进与其相混合物质的免疫原性的物质。佐剂不同于蛋白载体，因为其不与免疫原形成稳定的连接键。用佐剂初始化后，在无佐剂的情况下给予加强剂量的需佐剂型免疫原时，免疫原---即使是产生应答较弱甚至不产生应答的免疫原----仍将产生实质性免疫应答(Janeway Jr.et al.，2001；Leenaars and Hendriksen，2005；Lipman et al.，2005；McCullough and Summerfield，2005；Schunk andMacallum，2005；Stills，2005)。
机体对每一次免疫接种的应答会越来越强烈，因此第二次、第三次以及随后的应答强度会随之增加。用抗原重复刺激以实现增强的免疫状态，称为超免疫法(hyperimmunization)。临床和免疫化学技术中应用的抗体多为多克隆抗体，其可通过用恰当抗原悬液超免疫接种恰当动物如啮齿类动物、兔、山羊、驴或绵羊而激发。在抗体生成达到峰值时收集血清，通过该方法可获得浓度约1至10mg/mL的特异性免疫球蛋白G(IgG)。尽管已证实单克隆抗体(mAbs)为表征良好、免疫原性较低且高度有效的工具的一个来源，但多克隆抗体仍然有其应用空间。正如天然免疫系统在对病原体发生反应时采用多克隆而非mAbs，多克隆抗体还可在多种情况下优选用于被动免疫疗法。多克隆抗体的优势包括其在免疫复合体形成方面的效价可能增加、其在抗感染性疾病方面的应用，所述疾病由不同株病原体引起或者其需要中和多个表位以达到有效治疗。多克隆抗体还在免疫化学技术方面比较有用，因为其通常相对易于制备且生成费用较低。此外，多克隆抗体可在多个种属包括兔、山羊、绵羊、驴、鸡等中产生，从而在实验设计时为用户提供了多种选择。然而，多克隆制备时特异性抗体的量有时仅占全部抗体蛋白的一小部分。因此，为此，抗体制备的首要目标是获得高滴度、高亲和性抗血清。
在本领域中广泛应用的超免疫流程中，常规加强免疫对于保持较高IgG水平是必需的，因为免疫球蛋白代谢在正常动物中有所增加，如很早已在IgG代谢研究中所示出的(Andersen and Bjorneboe，1964)。相反，本发明提供了一种更有效的流程以获得稳定增加的免疫球蛋白生成水平，其中高IgG水平可保持相对较长时间而无需进一步免疫接种或者只需要次数较少的免疫接种。
在多克隆抗体的生成中，可鉴定多个可能影响动物实验结局的关键步骤，如免疫结局以及动物的疼痛和损害。如果抗原(针对其来激发抗体)的免疫原性较差，则免疫系统需要一个刺激以诱发有效的免疫应答。佐剂可用于该目的，且可指导免疫系统抵抗另一次细胞或体液应答。尽管人们已经描述了多于100种佐剂，但仅少数几种佐剂常规用于多克隆抗体生成(如福氏完全佐剂(FCA)、福氏不完全佐剂、铝盐、Quil A、免疫刺激复合物(Iscom)、Montanide、TiterMaxTM和RIBITM等)。FCA常常用于多克隆抗体生成，因为对于几乎所有类型的抗原均诱发较高抗体滴度。然而，已有多个研究者报道了注射如FCA、TiterMax和RIBI佐剂后的严重副反应。病理学改变的严重性不仅依赖于佐剂而且依赖于所用抗原的类型。此外，可选择的佐剂常常不能诱发有效的抗体应答。科研人员已发现所注射的体积对所造成损伤的程度具有额外效应(Leenaars andHendriksen，2005)。基于这些因素，本发明提供了一种更有效的方法，除了经济价值，其在动物健康方面具有较大优势，因为该方法减少了动物疼痛和伤害，同时获得了最佳的免疫应答。
因此，本发明提供了一种用于生成多克隆免疫球蛋白的方法，包括按照任何已建立的能够生产多克隆免疫球蛋白的免疫接种方法应用含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的Tg动物。该转基因动物优选从一株对于多克隆抗体生成有用的株系获得，且经过遗传改造可变得更加适于多克隆抗体生成。
在另一个优选实施方式中，本发明提供了一种利用本发明所述方法、应用和动物而生产的多克隆抗体。通过利用标准分子生物学技术分析含抗体的粗制或部分纯化血清制品，可以很清楚且明确地将根据本发明所述生成的抗体与未按照本发明生成的制剂区分开。这些可能涉及通过测定所分析血清中小基因组DNA片段中FcRn重链的拷贝数或种属特异性，而与获自已知的相同种属的非转基因对照动物的对照血清样品进行比较(Emanuel and Pestka，1993；Linand Floros，2000；Sandford and Pare，1997)。
与PAbs相比，单克隆抗体(MAbs)是由单个B淋巴细胞克隆产生的抗体。在20世纪70年代中期，和Milstein设计了用于生成具有想得到的特异性的单克隆抗体的技术，为此他们被授予了诺贝尔奖(Kohler and Milstein，1975)。在MAbs领域中经过几十年实践并积累经验，本领域中的普通技术人员应该在单克隆抗体生成的所有方面足够精通。为了生成特异于特定抗原的单克隆抗体，用该抗原免疫小鼠、大鼠或兔，且可采用B细胞，如脾细胞、淋巴结淋巴细胞或者其他外周血淋巴细胞或该动物其他组织的淋巴细胞。哺乳动物宿主可再次进行免疫接种以进一步增加所需抗原特异性B细胞群并增加抗原特异性。随后将这些分离的B细胞与合适的永生化细胞系融合。骨髓瘤细胞系是B细胞的最佳融合伴侣，因为类似的细胞倾向于融合且比其他细胞能更加有效的产生稳定杂交体。永生化细胞是淋巴样干细胞或浆细胞瘤细胞如骨髓瘤细胞，其为抗体生成细胞且为恶性。筛查杂交瘤上清以选择具有期望抗原结合特性的最佳杂交瘤。克隆和冷藏保存所选择的杂交瘤细胞。
本文中，涉及单克隆抗体，动物指任何非人动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、豚鼠、猪和牛。本发明进一步包括几种用来生成淋巴样细胞系的转基因动物。
除了常规或经典技术，应用重组技术已经开启了一个多克隆和单克隆抗体生成的新时代，且其适于改造抗体(例如，将抗体减小为其功能片段的大小或者制备人源化抗体)(Lonberg，2005；Peterson，2005)。
因此，本发明提供了一种用于生成单克隆免疫球蛋白的方法，包括按照任何已建立的能够生成单克隆免疫球蛋白的免疫接种方法应用含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的Tg动物。该转基因动物优选从一株对于单克隆抗体生成有用的株系而获得，且经过遗传改造可变得更加适于单克隆抗体生成的株系获得。
在进一步的优选实施方式中，本发明提供了一种杂交瘤细胞系，通过利用从根据本发明所述动物或者从按照本发明所述方法或应用生成或应用的动物获得一个现有技术方法中的细胞而产生。还提供了按照本发明所述方法、应用或动物生成的单克隆抗体。
如本文中使用的，词语“转基因动物”中的术语“转基因”指包含一种基因或其他核酸序列的动物，所述基因或核酸序列不能通过正常的育种或交配活动获得。术语“基因”指一种表达mRNA、功能性RNA或特异性蛋白的核酸片段，包括调节性序列。术语“天然基因”指天然存在的基因。“转基因”指一种通过转化导入基因组内并稳定保持的基因。在上下文中，术语“转化”在本文中用作一个表示将外来DNA导入细胞内的宽泛术语。该术语还涵盖用于将外来DNA导入细胞内的功能等同性方法如微注射、转染、感染、转导或者供体细胞与受体细胞的融合。转基因可以包括例如与特定待转化动物异源或同源的基因。此外，转基因可包括插入非天然生物体内的天然基因或者嵌合基因。术语“内源性基因”指处于生物体基因组内天然位置的天然基因。
将转基因导入受体动物体内通常通过利用携带感兴趣转基因的遗传构建体而完成。如本文中使用的，术语“遗传构建体”的意思包括人工创建的重组DNA，其包含的核酸序列一旦导入受体细胞内即能表达所述导入的核酸序列。遗传构建体可包括编码序列和调节性序列。术语“编码序列”指编码特异性氨基酸序列的DNA或RNA序列，不包括非编码序列。术语“调节性序列”指定位于编码序列上游(5’非编码序列)、内部或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码基因的转录、RNA加工或稳定性或者翻译。调节性序列包括增强子、启动子、翻译引导序列、内含子以及多腺苷酸化信号序列。它们包括天然和合成的序列以及可能是合成与天然序列相结合的序列。某些在本发明中比较有用的调节性序列将包括但不限于组成型启动子、组织特异性启动子、发育期特异性启动子、可诱导性启动子以及病毒启动子。
术语“启动子”指一种核苷酸序列，通常位于其编码序列的上游(5’)，其通过识别RNA聚合酶以及正确转录必需的其他因子而控制该编码序列的表达。术语“启动子”包括最小启动子，这是一种通常由TATA盒以及其他用来指明转录起始位点的序列构成的短DNA序列，所述转录位点可加入调节元件用于控制表达。“启动子”还指一种核苷酸序列，其包括最小启动子以及调节元件，能够控制编码序列或功能RNA的表达。这种类型的启动子序列由近端和较远端的上游元件组成，后者常称为增强子。因此，“增强子”是一种DNA序列，其可刺激启动子活性，可为启动子的固有元件或插入的异源性元件以增强启动子的水平或组织特异性。其能够在两个方向(正常或倒转的)进行操作，甚至当向启动子的上游或下游移动时还能够发挥作用。增强子和其他上游启动子元件均结合可介导其效应的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以全部来自一个天然基因，或者由来自自然界中所存在的不同启动子的不同元件(element)构成，甚至由合成的DNA节段构成。启动子还可以包含结合蛋白因子时涉及的DNA序列，该蛋白因子针对生理性或发育性条件控制转录起始的有效性。转录调节还依赖于不同化学试剂、激素、诱导物质等的存在。本领域中的熟练技术人员将能够轻易选择并组装最适于特殊应用的调节序列。
转基因技术已经广泛用于科学研究，且已经建立了几种不同的流程。本发明绝不以任何方式局限于生成本发明所述Tg动物而选择的具体变化。尽管本领域中已有多个关于传统转基因技术局限性的报道，但转基因表达的水平在不同株系之间(Palmiter et al.，1984)甚至有时在相同株系动物之间变化较大(Dobie et al.，1996；Sutherland et al.，2000)，尤其是采用cDNA而非基因组片段时。变化多样的转基因表达依赖于该转基因整合入宿主基因组的位点并影响转基因表达(Opsahl et al.，2003)。质粒基转基因微注射的局限性可通过应用可容纳百万碱基以内(submegabase)的DNA如YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)或PAC(P1噬菌体人工染色体)的克隆系统而克服。在Tg小鼠生成过程中已经很好地建立了这些技术(综述见Giraldo and Montoliu，2001)。熟练技术人员将能够根据现有技术以及本文提供的理论而开展生成及表征本发明所述Tg动物的必需步骤。
在一个优选实施方式中，根据本发明所述遗传构建体包含牛BAC克隆#128E04插入片段。该BAC克隆#128E04是一种来自牛BAC文库的克隆，所述文库由来自高级荷斯坦公牛的雄性胎儿生殖脊的DNA(获自INRA牛BAC文库)制备而成(Eggen et al.，2001)。插入片段克隆#128E04定义为核苷酸位置53543852与53652024之间牛基因组染色体18的一个节段，如NCBI Map Viewer，Bos taurus(母牛)Btau3.1(基于Btau3.1)所展示的(截止到2007年8月11日)。
在一个优选实施方式中，根据本发明所述遗传构建体包含兔BAC克隆#262E02插入片段。该BAC克隆#262E02从兔BAC文库分离而来(Rogel-Gaillard et al.，2001)。所述BAC文库构建于pBeloBAC11载体内，该高分子量DNA从新西兰兔的白细胞制备而来。该兔BAC文库由INRA家养动物资源中心管理而且可以共享。
本发明所述Tg动物中存在的具体变化不是为了限制本发明的范围，只要其适于过量表达编码具有FcRn活性的蛋白α链的基因。如本文中使用的，术语“过量表达(过表达，overexpression)”指在特定种属中表达水平高于预期感兴趣基因的两个基因组拷贝的表达水平。过量表达可在生物化学过程的几个水平加以评价，例如转录、翻译、翻译后修饰等水平，只要与野生型动物中的基础表达水平相比，该升高的表达水平能够引起FcRn功能出现可检测性变化即可。例如，由感兴趣基因编码的蛋白表达量可增加，如本发明的几个实例中，具有FcRn活性的蛋白α链合成水平提高。
过表达可利用分子生物学领域中熟练技术人员所熟知的几种不同方式实现。过表达感兴趣基因的示例性方式为增加基因拷贝数或者增加启动子区的结合强度或者上调增强元件或者相反地抑制或阻断抑制元件等。
在本发明的优选实施方式中，过表达与整合位点无关，而依赖于整合拷贝数。然而，本领域中的熟练技术人员将能够确定何时采用一些可用的遗传元件以获得该转基因的限制表达是有利或必需的。可诱导性调节元件以及组织、器官、发育期等依赖性调节元件可实现感兴趣基因的精细表达调节的实例在现有技术中非常丰富，且经本领域熟练技术人员处理可令其将本发明转化为实践。
在本发明的进一步优选实施方式中，过表达可通过将一个以上功能拷贝的感兴趣基因整合入本发明所述Tg动物基因组内而实现。优选的，含FcRnα链基因的DNA片段从动物分离而来。这种大DNA片段可通过筛查粘粒、YAC或BAC等文库(从非人动物的基因组DNA制备)等而分离。YAC克隆可携带达200万个碱基的DNA片段，BAC克隆能够携带较小的DNA片段(约150-250kb)。源动物可以为任何种属，例如在多克隆或单克隆商业生产中起重要作用的种属，如小鼠、大鼠、兔、绵羊、山羊、牛、猪、驴和马。很明显，选择转基因来源不是限制性的，本发明所述方法中基因的适用性可由本领域中的熟练技术人员根据本文中提供的教导加以确定。
用于将转基因导入受体动物以及选择Tg动物的步骤为熟练技术人员所熟知。简单而言，将携带FcRnα链基因的转基因载体导入受体细胞内然后通过随机整合或通过定向整合而整合入受体细胞基因组内。对于随即整合，含FcRn基因座的转基因载体可通过标准转基因技术导入动物的受体细胞内。例如，转基因载体可直接注射入受精卵的前核内。转基因载体还可通过卵子受精前将精子与该转基因载体共孵育而形成。转基因动物可从受精卵发育而来。
另一种导入转基因载体的方式是慢病毒基因转移。这种最近开发的方法-尽管其转基因的大小受限-已证实在多个种属例如小鼠、大鼠、猪等中创建Tg动物方面非常有效，而且在开发基因治疗方法方面是一种极为有前途的工具(Pfeifer，2006)。另一种导入转基因载体的方式是通过转染胚胎干细胞随后将遗传改造的胚胎干细胞注射入发育期的胚胎内。最后，嵌合Tg动物可从含FcRn转基因的胚胎而生成，该转基因整合于该Tg动物至少部分体细胞的基因组内。对于定向整合，转基因载体可导入恰当的动物受体细胞内如胚胎干细胞或已分化的体细胞。
在特殊实施方式中，由于采用同源重组步骤，转基因的整合可引起相应内源性FcRnα链基因座的丢失。可替换地，该天然FcRn座可以独立地从转基因的导入中敲除。例如，所需动物可通过经典的育种和交配活动利用具有敲除基因型的亲本而获得。然而，取代内源性FcRn基因座对于实现本发明的目标并非是必需的。本领域中的熟练技术人员将能够确定内源性基因的存在对于免疫球蛋白产量提高是否有害。然而，如果插入多拷贝编码具FcRn活性的蛋白α链的基因用于实现基因过表达，在正常情况下则无需考虑这种取代方法。
如果需要富集特异性IgG亚型，该特异性IgG亚型与来源于外源性FcRnα链的FcRn的结合比其内源性相应部分更加紧密，则优选缺失(敲除)该内源性FcRn和/或将其用外源性FcRnα链取代。一个重要的实例为人IgG在Tg动物中的过生成，该Tg动物携带编码人免疫球蛋白基因重链和轻链的人染色体DNA。可以预测，在过表达例如牛FcRnα链且缺失宿主FcRnα链的动物中，消耗与外源性FcRnα链结合较弱从而能够较快清除的宿主IgG而富集人类IgG是非常有好处的。一个类似的实例是当消耗其他IgG亚型时优先富集其中一种宿主IgG亚型。
所选细胞随后可与去核的核转移单位细胞例如卵母细胞融合。融合按照本领域中已建立的常规技术而实施(见例如(Cibelli et al.，1998))。卵母细胞的去核及核转移还可利用注射移液管通过显微外科而实施(见例如(Wakayama et al.，1998))。所得卵细胞随后种植于恰当介质中，并转入同步化受体内用于生成Tg动物。可替代地，所选遗传修饰的胚胎干细胞可注射入正发育的胚胎内，其随后可发育为嵌合体动物。
本发明的一个优选实施方式是其中Tg动物携带多拷贝的转基因。理论上，关于导入本发明的Tg动物内的转基因拷贝数并无限制。本领域中的熟练技术人员将能够轻易确定编码具有FcRn活性的蛋白α链的基因过表达能否提供相对较高的FcRn表达，以提供本发明的有益效应但不使该基因的表达强烈至可能危害细胞稳态和功能性。在本文所示的实例中，在含高达10拷贝完整FcRn基因的不同Tg株系动物之间未观察到表型改变(Bender et al.，2007)。此外，Lu et al.(Lu et al.2007)示出了含高达15拷贝bFcRn cDNA(处于乳腺特异性启动子控制之下)的Tg株系，而无显著的表型改变。
如本文中使用的，术语“FcRn活性”用来表示一系列体内发生的事件。如在描述发明领域时已经讨论过的，FcRn首先在啮齿类动物内鉴定为可将母体免疫球蛋白借助新生儿肠道从母体转移至新生动物的受体，随后研究表明FcRn在调节IgG在不同来源细胞的内部及其之间转运时发挥关键性作用。在本发明书的范围内，术语“FcRn活性”主要指保护IgG免于被降解。因此，如本文中使用的，将FcRn活性定义为结合IgG-Fc并保护IgG免于被降解的能力。
此外，如本文中首次披露的，本文中使用的术语“FcRn活性”还指FcRn增强体液免疫应答尤其是增强抗原特异性B细胞克隆扩增并因此促进IgM和IgG合成的能力。
FcRn活性例如可在保护IgG过程中的一个或多个步骤进行测定，可认为其机制主要受血管内排列的内皮细胞介导。在这些细胞内部，FcRn主要定位于早期/循环性内涵体，其中FcRn与通过液相内吞而内化的IgG相遇。内涵体的酸性环境有利于该相互作用。结合的IgG和白蛋白循环回表面并从细胞释放，而未结合的配体则向下游移动被溶酶体降解。
然而，某些步骤可被建模并独立于该术语的全部含义而定义。
感兴趣的IgG或者含IgG恒定区或其Fc片段的分子与FcRn的结合能力可利用多种体外分析进行表征。WO 97/34631详细披露多种方法，且其全部内容均结合于此供参考。
一种用于测定IgG与FcRn之间结合的方法是一种利用分离的FcRn与β2m复合物的体外分析，在pH6时该复合物可保持结合IgG-Fc的体内功能，当pH变为约7.2时结合的IgG-Fc释放。术语“大约”，如本文中提到pH时使用的，指±0.2的pH值。该FcRn/β2m复合物可结合至固态支持物如微量测试孔、滤器、膜、柱子或珠子。常用作固态支持物的材料为尼龙、聚苯乙烯、聚丙烯和琼脂糖。通常，通过将组分一起加入水性溶液中而实现分子组分的接触，该溶液常为适当缓冲的且能使所述组分彼此发生反应达预定时间量。根据该分析的设置方案，填加不同组分之间的洗涤步骤可能是必需的。这些组分用来测定所述组分之间发生的结合，且可按照几个熟知的分析模式来设置，例如竞争性结合分析、直接结合分析、夹心分析法等。全部结合步骤均发生后，则利用本领域中通常应用的技术进行检测，例如通过检测一种信号如放射性、酶、荧光或其他熟知的信号。所测信号与被测信号成正比例(如在直接结合分析中)或者竞争。
用于测定IgG与FcRn之间结合的通用方法经恰当改变可用来鉴定恰当的FcRnα链和/或β2m对，其与感兴趣IgG形成理想的FcRn异源二聚体结合。在这种情况中，源自不同种属或突变结果的FcRnα链以及与感兴趣IgG亲和性最高的β2m用于该检测中。首先，已与FcRn结合的IgG，例如与bFcRn结合的人类IgG在适于结合的条件下被应用。初始设置后即开展实验，其中初始FcRnα链将被不同种属的FcRnα链取代，或利用体外诱变作用而生成，随后将测定与正研究的IgG的结合。最佳FcRnα链可通过比较该复合物与初始结合复合物的结合亲和力而鉴定。可替代的或另外，可应用高通量技术同时测定几对FcRnα链与β2m组合。所分离的FcRn与β2m复合物，其保持IgG-Fc结合的体内功能，优选从编码各自蛋白的改造核酸通过体外合成生成。所述蛋白可单独合成，然后一起加入而生成该复合物。编码该蛋白的DNA节段可整合入重组载体内，整合的位置使得该载体能够表达蛋白。根据本披露内容以及参考文献如(Ausubel et al.，1998)，用于以该方法处理DNA片段的技术，如通过采用限制性内切酶的遗传改造术，为本领域中的熟练技术人员所掌握。本领域中的熟练技术人员认识到还存在其他方法可用来生成适于上文直接描述的体外方法的复合物。可替代地，内源性复合物组分可从恰当细胞来源分离而来。
感兴趣IgG与FcRn的亲和力可利用表面等离子体共振(SPR)测定法例如BIAcore 2000(BIAcore Inc.)进行测定，如之前所述(Karlsson et al.，1991；Popov et al.，1996)。在该方法中，将FcRn分子偶联于BIAcore传感芯片(例如Pharmacia的CM5芯片)，并以某个流速测定所需IgG与固定的FcRn的结合以利用BIA评价2.1软件而获得传感图，根据它可计算所需IgG恒定区或其片段与FcRn的结合速率和解离速率。
感兴趣IgG或其片段与FcRn的相对亲和力还可通过例如竞争性结合分析而测定。将感兴趣IgG以不同量加入96孔板的孔内，该板内已固定了FcRn。随后往每一个孔内加入恒定量放射性标记的感兴趣IgG。结合部分放射性的百分比相对于野生型IgG的量而绘制曲线，从该曲线的斜率可计算其相对亲和力。此外，感兴趣IgG或其片段与FcRn的亲和力还可通过饱和度研究和Scatchard分析或者通过其他方法例如非线性回归(曲线拟合)计算法而测定。
通过FcRn将所需IgG或其片段跨细胞转移可通过体外转移分析，采用放射性标记的IgG或其片段和表达FcRn的细胞，比较单层细胞一侧与另一侧的放射性而测定。
另一种用来鉴定在体内保护IgG的FcRn的分析法是细胞培养分析。培养物中功能性表达FcRn的哺乳动物细胞从之前存在的哺乳动物细胞生成或鉴定。适于该分析的细胞能够分解IgG，这些细胞中表达FcRn引起该分解代谢减少。在体内分析中提到的功能性FcRn表达表示FcRnα链与β2m的复合体与感兴趣IgG结合而保护结合的IgG免于被降解。为了鉴定恰当的FcRnα链，使一系列表达不同FcRnα链和感兴趣IgG的细胞与该细胞接触。在恰当且有助于正常细胞功能的条件下孵育该细胞，随后分析IgG的分解代谢。与不表达FcRn的对照细胞中IgG分解代谢相比，表达FcRn的细胞中IgG分解代谢显著下降，表明该候选FcRnα链保护IgG免被降解。该分析通过与IgG结合、内化和保护IgG而检测FcRn的功能。本领域中已知的细胞系，以及所选经免疫后可生成抗体的种属的原代细胞，可用于细胞培养分析。该分析对于检测那些杂合FcRnα链分子非常重要，该分子由胞外部分(在结合IgG方面比较有优势)及跨膜和胞内区片段(特异于将用于免疫接种的种属)构成。
如描述现有技术时提到的，FcRn是一种异源二聚体分子，由MHC I类样α链和β2微球蛋白(β2m)构成。该FcRnα链(通用符号：FCGRT，通用名称：Fc受体、IgG、α链转运体、Fc片段免疫球蛋白G受体、新生儿Fc受体、FcRnα链)提供了该分子的特异性特征，而β2m则是几种不同蛋白复合物中均存在的普遍组分。对于本领域中的熟练技术人员而言，很显然为了用于本发明所述方法，该异源二聚体的两个亚单位必须足量存在。用于生成本发明所述水平升高的免疫球蛋白的本质特征在于过表达编码该FcRn分子α链的基因，如上文所述。然而，很明显，等摩尔量的另一条链β2m对于生成功能性FcRn也是必需的。因此，为了实施本发明，熟练技术人员应该考虑β2m的细胞可利用度。根据对Tg所做遗传修饰而致FcRn异源二聚体的预期水平与所测得FcRn活性之间的关联应该能表示任何由于β2m供给量不足引起的问题。用于评价两个因素的方法对于现有技术中的熟练技术人员而言是可用的，本说明书中也存在这些方法。类似地，如果有必要，熟练技术人员可通过采用例如现有技术中的转基因方法学而增加β2m水平。在特殊实施方式中，本发明可进一步通过提供同时过表达来自相同或不同遗传构建体(或由其表达)的FcRnα链和β2微球蛋白链的Tg动物而改进。
从上文对FcRn活性的讨论部分，很明显该异源二聚体的组成可以为决定其活性的一个明显因素。因此，本发明可提供α链与β2m的任何组合，以实现本发明所述Tg动物血清中的免疫球蛋白水平升高。上文详细描述了FcRn结合特征和特异亲和力的意义；然而，FcRn异源二聚体的这些特征还可由其亚单位组成来决定。如在描述现有技术时讨论的，牛FcRn与人IgG之间结合的强度高于人FcRn与人IgG之间。因此，本发明一个非常重要的方面是提供结合特征优于该Tg动物天然FcRn分子的FcRn分子。特别地，该目标可通过检测并选择用于本发明所述Tg动物中生成免疫球蛋白的最佳可能性α链与β2m组合而实现。这一点可通过导入来自不同或相同动物种属的恰当α链或β2m实现。如本文详细描述的，确定结合特征后，本领域中的熟练技术人员将能够在本发明所述Tg动物中进行必要的改良。因此，本说明书提到本发明的Tg动物时，指的是一种动物，其不仅整合编码具有FcRn活性蛋白的α链的基因，如有必要，则整合编码具有FcRn活性蛋白的α链基因和编码β2微球蛋白的基因。
通过将编码β2m的遗传构建体导入非人动物而增强FcRn活性，也在本发明的范围内。本领域中的熟练技术人员将能够实现该增强所必需的条件。关于FcRnα链论述的全部考虑事项经必要修正均适用于涉及β2-微球蛋白(β2m)的改良。
采用α链或β2m的突变体也在本发明的范围内，只要该突变变化得到的功能性FcRn分子能完成上述活性要求。突变技术为分子生物学领域中的熟练技术人员所熟知。然而，为了确定恰当的FcRn蛋白，而非活性要求，可在突变和天然蛋白之间建立结构同源性。这里需要强调，该结构同源性是一种用来表征本发明所述转基因的可利用但非限制性特征。FcRn蛋白的α链可与本发明的理论中采用的牛FcRn蛋白序列具有约60％或更多的序列一致性。术语“序列一致性”、“同源性”和“变异体”在本说明书中可以互相交换使用。如果一个氨基酸与另一个同源，表示所讨论氨基酸序列中的一种与另一种序列具有至少60％、优选至少70％、较优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选95％的序列一致性。为了确定所述序列是否，比如，达到至少60％一致，可采用EMBL或SWISSPROT数据库的FastDB程序。本领域中熟知的其他算法及其计算机化实施方式也可用于确定该同源性。
在一个特殊实施方式中，FcRn蛋白α链的突变体缺少功能性的白蛋白结合位点。如上文所讨论的，该FcRn具有两个独立的用于免疫球蛋白和白蛋白的结合位点。白蛋白是一种67kD的分子，其构成血清蛋白质量的三分之二。它转运一大类分子如脂肪酸、胆汁酸、类花生酸、维生素、激素、离子、毒素和药物。而且，白蛋白赋予血液大部分胶体渗透压，而且是血清中主要的pH缓冲蛋白。在正常条件下，总体IgG水平在10-15mg/ml的范围内(Manz et al.，2005)，而白蛋白水平为40-48mg/ml(Beers and Berkow，1999)。总体血浆胶体渗透压的约75％来自白蛋白成分，25％则来自球蛋白(大部分是IgG)(Guyton，1991)。根据对其分子比值(其包括胶体渗透压)的简单计算，IgG分子量几乎是白蛋白的三倍大(150-160vs.67kDa)，因此关于血浆渗透压(其为源于血清蛋白成分的压力)，增加三单位IgG等同于增加一单位白蛋白。因此，过表达FcRn可能对于生成更多抗原特异性IgG是有益的，然而可能引起相当有害的病症，尤其是如果同时具有高于正常水平的白蛋白时。因为FcRn在两个不同位点结合IgG和白蛋白(Andersen et al.，2006；Chaudhuryet al.，2006)，且一个近期研究证实FcRnα链中白蛋白结合位点的突变性缺失未引起体外IgG结合的丧失(Andersen et al.，2006)，因此可以推断这两个配体之间不存在竞争。
即使缺乏所谓的竞争效应，根据本发明所述Tg动物中存在的FcRn拷贝数，血清白蛋白水平可能增至一个高水平从而引起动物的问题。因此，根据本发明，携带非功能性白蛋白结合位点的突变FcRn的动物将能够更好地发挥作用而生成有用的抗体。本领域中的熟练技术人员将轻易确定引起白蛋白结合位点功能不良的特异性突变类型，且他/她将能够执行生成本发明所述Tg动物必需的分子生物学和其他步骤，而无过度实验负担。
如本文中已经提到的，本发明所述动物的整体健康对于以一种经济上可行的方式实施本发明非常重要。如本文中示出的Tg动物已证实可存活一年以上，而无病理学症状。
在本发明的另一个实施方式中，本发明所述方法利用一种携带具有FcRn活性蛋白的Tg动物，该蛋白包含一种嵌合α链，包括所述Tg动物FcRn蛋白的内源性细胞内结构域以及外源性细胞外结构域，该细胞外结构域组分如前所述进行选择。在该实施方式中，所述嵌合α链可有助于克服那些情形，其中由于其细胞内信号传导特征与受体动物的该特征不相容，由转基因编码的蛋白将不能正确发挥功能。这将使得该FcRn异源二聚体变为无功能性，然而，该外来受体的较高免疫球蛋白结合能力使其适于利用这种嵌合体。本领域中的熟练技术人员将能够易于应用现有技术中的遗传改造方法学而生成本实施方式所述的嵌合受体。
在本发明另一个优选实施方式中，本发明所述Tg动物从已经转基因用于生成人或人源化免疫球蛋白的动物而制备。本领域认识到在Tg动物中生成人或人源化免疫球蛋白的重要性，且最近已经生成了不同种属的这种动物。一种已经利用来生成用于体内人治疗的低免疫原性mAb的技术涉及到应用表达人抗体基因序列所有组成成分的Tg小鼠。将来可能将该技术延用至啮齿类动物之外，而采用Tg农场动物(例如牛、兔)以直接生成并生产人序列多克隆血清(Lonberg，2005)。US2006117395描述了Tg牛的生成，其包含可引起其内源性抗体失活及表达丧失的遗传修饰，并引起一种抗体优选人抗体的表达。这可通过失活牛IgM重链的表达以及可选地失活牛Ig轻链表达并通过进一步导入引起非牛抗体优选人抗体表达的人工染色体而实现。US20070033661披露了另一种通过过表达凋亡抑制剂而增加非人转基因动物中免疫球蛋白表达的方法，该抑制剂的表达受该动物B细胞中的B细胞特异性启动子特异性驱动，从而促进B细胞的存活。WO0212437披露了从非人Tg动物生成的人源化抗体，其经遗传改造而包含一种或多种人源化免疫球蛋白的基因座，非人Tg动物中其能够经过基因重排和基因转换而生成多样化人源化免疫球蛋白。最近已报道了表达人源化抗体全部组成成分的Tg兔(Thorey et al.，2006)。
本发明提供了这些Tg动物中用于增强免疫球蛋白生成的明显优势。例如，选择并导入根据本发明中所列出步骤的FcRn转基因将能够确保这些Tg动物中的免疫球蛋白生成可通过利用用于受体动物所生成免疫球蛋白的最有效FcRn结合蛋白而优化，所述免疫球蛋白是内源性免疫球蛋白或者可转基因生成的人或人源化抗体。因此，本发明计划采用可生成人或人源化免疫球蛋白的已转基因(Tg)动物作为起始点而导入一个或多个拷贝FcRnα链，并提供本发明的优势。可替代地，具有本发明所提供有益表型的双转基因动物可通过使生成人源化免疫球蛋白的Tg动物与根据本发明所述生成的动物交配而得到。
在本发明的另一方面，提供了一种用于动物血清中免疫球蛋白生成水平升高的方法，包括提供上文所述Tg动物并按照用于免疫球蛋白生成的任何已建立免疫接种方法应用所述动物。
在本发明的另一方面，增强免疫应答包括促进抗原特异性B细胞克隆的扩增。本文中首次报道了FcRn在通过B细胞克隆性扩增和免疫球蛋白合成中调节免疫应答中的作用，这是一个惊人且意外的发现。在阐述缺乏功能性FcRn的动物中体液免疫状态的研究(β2m敲除小鼠中的早期研究或最近在FcRnα链敲除动物中的研究)中，大多数未表现出IgG合成障碍，这些动物中的低血清IgG水平通过IgG保护受损而确定(Junghans and Anderson，1996；Roopenian et al.，2003)。然而，其他研究报道，在缺乏β2m的动物中IgG合成减少，然而其未给出最终的解释(Ghetie et al.，1996；Israelet al.，1995)。
本文示出，OVA免疫接种后25天，与wt动物相比，在Tg小鼠中分泌OVA特异性IgM的细胞达到两倍，分泌OVA特异性IgG的细胞则多三倍。该抗原特异的B细胞克隆性扩增增加部分可由一个发现解释，即与其wt对照相比，Tg小鼠的脾脏明显更大，如其所观察到的。更加增高的免疫应答进一步得到细胞免疫谱的支持，其中，免疫接种后Tg和wt小鼠中的细胞组分比例存在类似改变，但Tg小鼠则表现出更加剧烈的改变。两组中均出现了表达B220、CD3的细胞比例下降，同时出现CD11b+/CD11c+/MHC II中度但明显的增加以及携带CD11bhigh/Gr-1high的细胞的明显大量流入，表明次级免疫应答过程中流入脾脏内的优势细胞群是中性粒细胞，较小部分是巨噬细胞和/或树突状细胞。因此，在本发明的另一方面，免疫应答的增强包括刺激中性粒细胞、巨噬细胞和/或树突状细胞流入次级淋巴器官内。
周围或次级淋巴器官是启动适应性免疫应答并保存淋巴细胞的位置。其为淋巴结、脾脏和粘膜淋巴器官。因此，在优选实施方式中，次级淋巴器官是脾脏和淋巴结。
尽管单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中观察到了FcRn表达(Sachs et al.，2006；Stirling et al.，2005；Zhu et al.，2001)，其在这些细胞中的功能仍不清楚，因此FcRn在抗原提呈中的作用(其对于免疫球蛋白合成具有直接影响)也尚不清楚。另一方面，一个近期研究揭示，在多形核白细胞和单核细胞中FcRn在IgG介导的吞噬中实现主要作用(Vidarsson et.Al.，2006)。尽管在源自Tg小鼠腹膜的中性粒细胞和巨噬细胞中检测到FcRn表达，因此可假设这些细胞中FcRn过表达介导(以免疫复合体形式)吞噬抗原甚至提呈抗原增强，随后在次级淋巴器官中形成更多生成抗原特异性IgM和IgG的浆细胞。如果该理论正确，则一旦IgG生成且并非较早期，该增强即非常明显。的确，OVA特异性IgG出现后，仅观察到IgM滴度增加，主要是在次级免疫应答中。然而，分析脾脏的细胞免疫谱表明免疫接种后流入脾脏内的细胞类型是中性粒细胞。根据另一个最近的报道(Maletto et al.，2006)，中性粒细胞构成了淋巴器官中携带抗原的主要细胞群，一旦出现特异性免疫应答，则形成IgG-抗原免疫复合体。还证实，次级淋巴器官中的中性粒细胞主要表达TNF-α，并促进已建立的次级免疫应答。该发现给出了一种本发明者的wt和Tg小鼠中为什么显著流入携带CD11bhigh/Gr-1high细胞的合理解释。考虑到Tg小鼠生成更多OVA特异性IgG且这些细胞中过表达FcRn，因此还可解释为什么与野生型对照相比，Tg小鼠表现为这些细胞更多流入脾脏内、较大量抗原特异性B细胞克隆性扩增以及因此更强的抗体应答。
本发明的一个重要方面即包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人Tg动物可用于非治疗性方法中，其中与相同种属的非转基因对照动物相比，经过少数几次抗原刺激即形成相同水平的体液免疫应答。如果同时需要大量抗血清，且有时用昂贵抗原平行免疫接种大量动物，则本发明的这个特征非常有益。甚至仅减少一次加强注射，节省的费用可能也是大量的。
本发明的另一个重要方面即包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人Tg动物可用于非治疗性方法中，其中与相同种属的非转基因对照动物相比，可更快形成相同水平的体液免疫应答。当采用根据本发明所述动物时，本领域的熟练技术人员将能够易于改良任何恰当的免疫接种流程并确定收集所生成抗体的优先时间。当用于抗体生成的动物被重复应用时(如山羊、绵羊、其他大型动物)，本发明的这个特征将引起收集抗血清的循环时间延长，其商业应用很明显。如果动物在该流程结束时处死(如兔)，则商业优势更大：针对用户所供给抗原而专业提供订制抗血清的生产商将能够更快提供所需抗血清，从而使用户在目前这个科学加速发展且竞争广泛存在的世界中处于理想的位置。
在本发明的另一个方面，提供一种用于生成白蛋白的方法，包括按照任何已建立的可实现白蛋白生成的方法应用Tg动物，其包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体。如上文所讨论的，FcRn具有用于免疫球蛋白和白蛋白的两个独立结合位点。尽管该情形中，两个配体之间并不存在竞争，但本领域中的熟练技术人员将能够轻易认识到，本发明所述Tg动物在需要白蛋白产量增加时有用。然而，当白蛋白水平过高时，则可能对动物健康引起有害影响。因此，当本发明所述动物用于白蛋白生成时应该谨慎，尤其是关于该动物中存在的功能性FcRn基因拷贝数。
在一个相关实施方式中，所述Tg动物携带的遗传构建体提供编码FcRn蛋白α链突变形式的基因的过表达，其中消除了免疫球蛋白的结合。因此，携带含非功能性免疫球蛋白结合位点的突变FcRn的Tg动物将能够按照本发明更好地发挥作用而生成更多白蛋白。本领域中的熟练技术人员将能够轻易确定引起免疫球蛋白结合位点功能不良的特异性突变类型，而且他/她将能够执行生成本发明所述Tg动物必需的分子生物学和其他步骤，而无过度实验负担。
在本发明的另一个方面，提供动物繁殖材料，从根据本发明所述Tg动物或者根据本发明所述方法得到的Tg动物获得，所述繁殖材料包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体。如本文中使用的，术语“动物繁殖材料”指来自任何可使熟练技术人员生成另一个基本具有相同遗传组成动物的生物学材料。优选的，该动物繁殖材料选自由精子、精原细胞、卵子、卵巢组织、胚胎或用于体细胞克隆的组织样品组成的组。
在本发明的另一个方面，提供一种用于增强模型动物体液免疫应答的方法，该模型动物对于实施涉及与免疫应答改变相关的情况的检测有用，包括一个步骤即将提供增强的FcRn活性的遗传构建体导入所述动物体内。在优选实施方式中，所提供Tg动物适于作为用于自身免疫疾病的模型动物。根据本文的讨论，很明显，提供增强的FcRn活性的动物将具有增高的总体血清免疫球蛋白水平，其随后将以更高水平和/或较长时间保持可导致自身免疫疾病的患病状态。这种动物对于检测用于治疗这些自身免疫疾病或任何与其相关的其他目标的化合物将有用。
本领域中的熟练技术人员将能够理解，本发明的优势使其适于进一步应用，同时仍然保持本发明的精神。因此，本发明提供一种应用于需要针对感兴趣抗原而增强体液免疫应答的患者基因治疗中的遗传构建体，其中所述遗传构建体提供增强的FcRn活性。
在一个相关实施方式中，本发明涉及一种用于需要增强体液免疫应答的患者治疗的方法，所述方法包括将FcRn活性增强的遗传构建体导入所述患者体内。
通过本说明书可证实FcRn活性增强对于保持血清中的免疫球蛋白非常有益。存在几种疾患和病症，其中天然生成的免疫球蛋白水平大大低于正常从而引起严重病症，例如常见变异型免疫缺陷病(CVID)、X-连锁无丙球蛋白血症、IgG亚类缺陷。治疗方案通常包括几种大量治疗性免疫球蛋白剂量，以增加其水平的天然缺陷。在本发明的精神中，利用本发明所述遗传构建体的基因治疗可缓解对异体免疫球蛋白给药的需求，或者可引起治疗频率的下降并引起天然生成免疫球蛋白滞留增加。
本领域中的熟练技术人员将理解，本发明的优势使其适于进一步应用同时仍然保持本发明的精神。因此，本发明提供一种应用于需要增加血清免疫球蛋白水平的患者基因治疗中的遗传构建体，该增加来自于内源性天然免疫球蛋白生成或者外源性治疗措施，其中所述遗传构建体提供增强的FcRn活性，所述对免疫球蛋白具有特异亲和性的FcRn由所述患者产生或者给予所述患者。
在一个相关实施方式中，本发明涉及一种用于需要增加血清免疫球蛋白水平患者的治疗方法，所述方法包括将提供增强的FcRn活性的遗传构建体导入所述患者体内，所述对免疫球蛋白具有特异亲和性的FcRn由所述患者产生或者给予所述患者。
在一个优选实施方式中，根据本发明所述遗传构建体或方法在患者(即，人)身上应用。
在另一个实施方式中，根据本发明所述遗传构建体或方法提供编码FcRn蛋白α链的基因的过表达。在进一步优选的实施方式中，编码FcRn蛋白α链的基因过表达通过将所述基因的一个以上功能性拷贝整合入所述患者的基因组内。
在另一个实施方式中，根据本发明所述遗传构建体或方法提供编码FcRn蛋白α链的基因仅在内皮细胞中的过表达。人类(Cowanet al.，1998)或其他哺乳动物种属(Hao，et al.，2006)中存在几种内皮特异性启动子，其可被熟练技术人员应用来制备用于转基因的恰当载体。
上文关于非人Tg动物的全部考虑事项进行恰当改良将同样适用于本发明在人类进行的基因治疗方法。
实施例1-分离并表征携带bFcRnα链基因(bFCGRT)的BAC克隆
分离携带bFCGRT的BAC克隆
该90αBAC从牛BAC文库分离而来，该文库从一个成年(2岁)雄性新泽西牛(获自德国人基因组计划(RZDP)的ResourceCenter/Primary Database，德国柏林Max Planck分子遗传学研究所；http://www.rzdp.de/)制备。bFCGRT阳性BAC克隆通过用特异于bFcRnα链mRNA的引物进行PCR筛选而鉴定，[206-425bp；GenBank AF139106)用BFclS：5’-CAGTACCACTTCACCGCCGTGT-3’(SEQ.ID.NO.：1)    和BFclas：5’-CTTGGAGCGCTTCGAGGAAGAG-3’(SEQ.ID.NO.：2)扩增]，接下来，bFCGRT DNA用可与该基因外显子退火结合的引物进行测序(Kacskovics et al.，2000)。为了分析bFCGRT上游侧翼区，该BACDNA用BamH I消化，消化所得DNA在琼脂糖凝胶上分离。利用一个来自α1结构域的DNA片段作为探针，Southern blot检测到一个9kb长的阳性条带。然后，将该9kb长BamH1片段亚克隆至Pgem-11zf(+)载体。另一个利用同一载体中外显子1至外显子3的亚克隆过程得到一个2kb的启动子节段。随后，该插入片段利用ABI Prism BigDye Terminator Cycle sequencing Ready Reaction试剂盒(AB1，373A-Stretch，Perkin Elmer)在Cybergene Company(Huddinge Sweden)进行完全测序。
189HO2和128E04 BAC用来自牛BAC文库的bFCGRT特异性引物分离：FcRnF：5’-CGGCCACCTCTATCACATTr-3′(SEQ.ID.NO.：3)和FcRnR：5′-TGCATTGACCACACTrGGTr-3′(SEQ.ID.NO.：4)(GenBank NW_929385)(Eggen et al.，2001)。通过用Not I限制性内切酶消化该克隆而分析所分离BAC克隆插入片段的大小。ExpandLong Template PCR系统(Roche)用来确定该插入片段中bFCGRT 5’和3’边缘区域的大小。设计了两组引物：pBAC-上游(5′-ACCTCTYrCTCCGCACCCGACATAG，SEQ.ID.NO.：5，U8092911380-11404)和bFcRn反义(GTrCAAGTCCAAAGGCAGGCTATCT，SEQ.ID.NO.：6)引物扩增5’突出区域。另一方面，bFcRn正义(CCTTFACCCACACCCACTCCCCACA，SEQ.ID.NO.：7)和pBAC-上下游(AGAAGTTCGTGCCGCCGCCGTAGTA，SEQ.ID.NO.：8，U80929，3801-3777)用来扩增bFCGRT的3’突出区域。
bFCGRT的表征
将转录起始点上游约1800bp的区域以及整个bFCGRT基因测序并利用BLAST程序与NCBI中储存的牛基因组序列进行比较。利用RepeatMasker程序筛查所测序片段中的散布重复序列和低复杂性DNA序列(Smitet et al.，1996-2004)(http:repeatmasker.org)。利用RepeatMasker筛选的散布重复序列数据库基于重复序列数据库(Repbase Update；(Jurka et al.，2005)。该数据与NCBI中储存的牛序列吻合良好，最开始的3477bp(直至未测序的2.5kb区域)与克隆NW_929385(牛染色体18基因组重叠群)表现出99％的一致性，尽管其在2002至2287bp之间有一个285bp长的缺口属于第一内含子。所分析序列的第二部分包含1780bp(在未测序的2.5kb节段之后)，其与该同一基因组重叠群表现出99％的一致性。该片段也具有一个167bp长的缺口(1203-1370bp之间)属于内含子6。所鉴定的两个节段包含重复序列(简单重复)，这解释了同源性的缺失。根据这些比对，计算出缺失部分的大小为2556bp。因此，可发现该序列与648611-656426bp之间的牛基因组重叠群NW_929385表现出高同源性。
通过将现有bFcRnαcDNA链(参照序列以及来自EST数据库的序列；NCBI)与bFCGRT基因组序列进行比对，还分析了转录起始位点。牛、人、大鼠和小鼠FCGRT基因的基因组结构利用NCBIMap Viewer进行比较(数据未示出)。
bFCGRT阳性BAC克隆的表征
我们分离了三个不同包含牛新生动物Fc受体α链基因(bFCGRT)的BAC克隆-90α、189HO2和128E04及其自身的基因组环境。NotI消化后，来自所述BAC载体的基因组插入片段利用脉冲场凝胶电泳进行分析，表明克隆189HO2、克隆128E04和克隆90α分别包含约130kb、100kb和90kb大小的牛基因组插入片段。
随后，通过长范围(long-range)PCR测定bFCGRT基因边缘区域的大小。数据表明，该90α和189HO2 BAC分别携带8.5kb和14kb的5’和3’侧翼区，根据其大小，其可能不具有可确保bFCGRT独立于整合位点的基因组织特异性表达的全部调节元件。用两组引物PCR扩增克隆128HO2未得到任何产物。因为Expand LongTemplate PCR系统是一种强有效的扩增方法，可从噬菌体DNA得到高达25kb的扩增片段，我们推断该克隆中bFCGRT的5’和3’边缘区域均长于25kb，因此我们选择128E04 BAC用于微注射。牛基因组资源网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/cow/)的近期数据和128E04 BAC的5’和3’末端序列使得我们能够测定基因组环境及bFCGRT边缘区域的精确大小：5’调节区延伸高达44kb，而3’则为50kb长。数据表明，128E04 BAC包含五个公认的蛋白编码基因(FLT3LG、LOC539196、LOC522073、LOC511234、LOC511235)和bFCGRT(图1A)。
实施例2-携带牛BAC 128E04的转基因小鼠的生成和基因分型
从BAC克隆128E04制备102kb的基因组插入片段，用于微注射并生成含牛BAC 128E04的转基因小鼠
通过对Schedl等(Schedl et al.，1996)发表的流程稍作改良，即可制备BAC(克隆128E04)DNA用于微注射。纯化的BAC(用于极低拷贝数质粒的Qiagen质粒纯化)用Not I(Fermentas)消化而释放该插入片段，其在一种预制型脉冲场1％琼脂糖凝胶中分离。包含该插入片段的凝胶块电泳入LMP(低熔点)凝胶中，该凝胶则用Gelase(Epicentre)进行消化。Microcon YM50(Millipore)柱用来将该插入片段从琼脂糖中洗出。该插入片段在适于微注射的缓冲液(10mM Tris-HC1，pH7.5，0.1mM EDTA，pH8.0，100mM NaCl，含或不含0.03mM精胺/0.03mM精胺(SIGMA))中进行洗脱。将DNA浓度用微注射缓冲液(10raM Tris-HC1，pH7.5，0.1mM EDTA，100mM NaCl)调至0.4ng/μl并注射入已受精的FVB/N小鼠卵母细胞中。受体为10周大的CD1雌性。实验动物从Charles RiversLaboratories Hungary Ltd.(Budapest)获得。
转基因小鼠的表征
为了检测小鼠中bFCGRT的存在情况，从同窝动物(出生自胚胎转移及受检者的G1和G2子代)的尾活检组织分离基因组DNA，并通过两个PCR扩增进行筛查。这两个引物对基于90α BAC克隆的bFCGRT序列进行设计。第一个引物对由bFcSuf；5′-CTCCTTrGTCTTGGGCACTT-3′(SEQ.ID.NO.：9)(作为正义)和BFcL 5′-GCCGCGGATCCCTFCCCTCTG-3′(SEQ.ID.NO.：10)(作为反义)构成；其产生一个600bp的产物(1275-1894bp)，而第二个引物对为Fcrnfpr/in5′-AAAGTrTCTCGAGAGAGGCAGAGAC-3′(SEQ.ID.NO.：11)(作为正义)和Fcmrpr/in 5′-TAGTrACAGAGCCTGGAIAGGCTGA-3′(SEQ.ID.NO.：12)(作为反义)，其得到一个410bp的产物(1698-2108bp)。转基因实验的结果示于表1中。
表1.生成携带牛BAC128E04的转基因小鼠
如表1中所示出的，共出生了41个幼崽(pubs)，并从尾DNA用检测bFCGRT的存在情况进行基因分型。现已从所述六个首建者构建了三种独立的Tg株系。这些株系中两种#14、#19在第一代中表现为转基因遗传的孟德尔模式(从携带该转基因的共30和34只同窝动物得到17和12只第一代)，然而，第三个株系#9则表现出首建动物中一定程度的镶嵌现象。根据其重量和总体健康状况，无法区分Tg小鼠。
长范围转基因完整性的分析
三种Tg株系中该转基因的完整性通过特异性引物对进行评价，所述引物设计用于BAC 128E04 5’和3’末端以及五种公认的蛋白编码基因(根据牛基因组图谱GenBank Map Viewer Build 3.1(based on Btau 3.1)(根据Btau3.1)牛染色体18；53543852-53652024之间的区域，其定位于所注射的BAC上)。该引物序列并且条件在表2中加以描述。
表2.用于评价所整合BAC 128E04完整性的引物和PCR条件
公认基因 引物 Tm(℃) 产物(bp)
BAC128EOH 5′末端 5′-TTT AGC TGC ATC GGG ATC TT-3′(SEQ.ID.NO.：13)5′-GGA GTG ATG GCA TTT GGT TT-3′(SEQ.ID.NO.：14) 161 441
FLT3LG 5′-TCG GAG ATG GAG AAA CTG CT-3′(SEQ.ID.NO.：15)5′-CTG GAC GAA GCG AAG ACA G-3′(SEQ.ID.NO.：16) 61 547
LOC539196 5′-AGA ACG TGC GTA CCA AAA GC-3′(SEQ.ID.NO.：17)5′-AGC GGT TGT ACT TTC GGA TG-3′(SEQ.ID.NO.：18) 61 787
bFCGRT 5′-CCA AGT TTG CCC TGA ACG-3′(SEQ.ID.NO.：19)5′-GTG TGG GCA GGA GTA GAG GA-3′(SEQ.ID.NO.：20) 61 161
LOC522073 5′-AGT GGT CCT GGG ATT GAC AG-3′(SEQ.ID.NO.：21)5′-TCA CTG AGT CCC GTA TGT GC-3′(SEQ.ID.NO.：22) 61 266
LOC511234 5′-CTA CGT GTG CGC CGT GAC-3′(SEQ.ID.NO.：23)5′-AAT CAG CTT CTC CAC GCA CT-3′(SEQ.ID.NO.：24) 61 220
LOC511235 5′-GTT GTT CAC ACC AGG GAA CC-3′(SEQ.ID.NO.：25)5′-CCT TTG CCA TTG TAG ATG TAG C-3′(SEQ.ID.NO.：26) 61 295
BAC128EOH 3′末端 5′-AGT CGT GTC CGA CTC TTT GC-3′(SEQ.ID.NO.：27) 61 416
5′-CAG CCT GTC TGG TGT TCT GA-3′(SEQ.ID.NO.：28)
BAC 128EOH 5’末端和BAC 128EOH 3’末端序列获自A.Eggen(Inra，Jouy-en-Josas，France)。所有的引物对均得到与128E04BAC和牛基因组DNA相同的PCR产物，表明除了株系#9 DNA之外均为完整BAC整合，而株系#9DNA中，LOC 511234、LOC 522235和该BAC128E04 3’末端特异性PCR均未得到PCR产物(图1B)。因此，可以推测在该Tg株系中，从所整合BAC转基因的3’末端大约缺失一个30kb长的片段。较大转基因的5’和3’末端均发生基因组片段缺失是一个普遍现象(Raguz et al.，1998)(Raguz et al.，1998)。然而为了避免由于未表征的调节性元件(其可能位于该BAC DNA的缺失部分中)缺失引起bFCGRT表达改变的可能性，株系#9未包括在进一步的研究中。
转基因的染色体定位
为了排除一种可能性即两种转基因株系中牛BAC 128E04偶然性整合于小鼠染色体同一节段从而使得转基因小鼠株系#14和#19的表型均来自于未鉴定基因/转基因整合位点的插入性突变，我们实施了荧光原位杂交(FISH)以使128E04转基因的基因组整合可视化。该128E04 BAC DNA通过用生物素-14-dATP进行缺口平移而进行标记(BioNick labeling kit，Invitrogen，USA)。有丝分裂期染色体获自长春碱处理的成纤维细胞，其在低渗处理和甲醇∶乙酸(3∶1)固定的标准步骤后分别从13.5天大的纯合子#14和#19胚胎分离得到。
FISH基本上按照之前所述而实施(Hayes et al.，1992)。生物素化的探针变性后，与变性的染色体制作标本于37℃杂交过夜。染色体上的杂交位点通过山羊抗生物素抗体(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)进行放大并通过进一步与荧光素轭合的兔抗山羊IgG(Nordic Immunological Laboratories，Tilburg，The Netherlands)一起孵育而使其可视化。染色体制备物利用二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Vector Laboratories，Burlingame，CA)复染，并用NikonEclipse E600 epifluorescence显微镜(Nikon Instruments；Kawasaki，Japan)进行观察。荧光图像则利用Cohu 4910 CCD camera(Cohu，Inc.；San Diego，CA，USA)捕获并通过在Apple Macintosh G4电脑上运行MacProbe 4.3 FISH软件(Applied Imaging；Newcastle upon Tyne，UK)而数字化。
FISH分析的结果表明，在#14和#19小鼠株系中荧光标记的BAC 128E04分别杂交于完全不同的染色体节段。这就排除了一种可能性即其表型为整合位点依赖性。染色体中的单个点表明多拷贝(株系#14中为2拷贝，株系#19中为5拷贝)转基因整合最可能以串联重复的形式发生(图2)。
实施例3-牛FCGRT(bFCGRT)基因拷贝数对FcRn表达的影响
用实时定量聚合酶链反应测定转基因的拷贝数
实时PCR是一种定量且精确的测定Tg动物中转基因拷贝数和接合性的方法(Tesson et al.，2002)。128E04 BAC转基因的拷贝数通过bFCGRT和内标小鼠β-肌动蛋白基因绝对定量而测定，如下文。
128E04 BAC转基因的拷贝数通过TaqMan法利用ABI Prism7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems，Foster City，CA)测定。引物和探针(probe)寡核苷酸序列通过利用默认参数而设计(表3中示出的引物和探针)。传统的酚/氯仿法用于从半合子动物的尾样品提取DNA，其中需另加一个氯仿抽提步骤。
表3.用于测定bFCGRT转基因拷贝数的引物和探针
小鼠β-肌动蛋白 探针 VIC-TGGCTTTCTGAACTTGACAACATTAT-TAMRA(SEQ.ID.NO.：29)
正向 TTCACCTGCCCTGAGTGTTTC(SEQ.ID.NO.：30)
反向 TGAAGGTCTCAAACATGATCTGTAGA(SEQ.ID.NO.：31)
牛FCGRT 探针 FAM-CACAGTCAAGAGTGGCGACGAGCAC-TAMRA(SEQ.ID.NO.：32)
正向 GCACCACGCAGCGGTAGT(SEQ.ID.NO.：33)
反向 CCTTCTACGCCTGGTCATCAC(SEQ.ID.NO.：34)
通过利用熔解曲线的绝对定量法，定量每一个样品中的小鼠β-肌动蛋白和bFCGRT基因。采用32倍范围内稀释的五个点而绘制的标准曲线可使引物对达到高度线性。定量之前验证PCR定量的线性和效率，样品平行测定(图3)。
由两个拷贝/细胞表示的内源性β-肌动蛋白基因用作内标以测定DNA浓度。小鼠基因组DNA则用来设置用于β-肌动蛋白基因的校正曲线。bFCGRT基因的绝对定量根据从补充了小鼠基因组DNA的128E04 BAC系列稀释得到的标准曲线而实施。该标准曲线使得我们能够根据下列计算而确定bFCGRT基因的拷贝数：精确的DNA量决定着样品中二倍体基因组的数量，而bFCGRT基因校正曲线则决定其在株系#14和#19半合子动物的DNA样品中的拷贝数。经过这些计算，确定株系#14和#19Tg小鼠半合子动物中bFCGRT基因的拷贝数分别为2和5(表4)。
表4.细胞数的绝对量和样品FcRn拷贝数的绝对量分别来自小鼠β-肌动蛋白和bFcRn校正曲线(图3)。估计株系#14的半合子动物中bFcRn转基因的拷贝数为2，株系#19中则为5。
#株系 基因 Ct  样品中的基因绝对量(AGN) 样品中的细胞数绝对量(ACN)  bFcRn拷贝数(ACNb-FcRn/ACN) 二倍体半合子动物中bFcRn转基因的估计拷贝数
14 小鼠β-肌动蛋白 31.01  3760.49 1880.248
bFcRn 28.86  3852.48  2.04 2
19 小鼠β-肌动蛋白 30.89  4075.44 2037.722
bFcRn 27.05  10468.18  5.13 5
通过逆转录PCR和Northern分析测定转录水平的拷贝数
利用RNAzolTM B(TEL-TEST INC)从六周大的雌性小鼠肝、肺和乳腺以及新生小鼠肠道提取总RNA。两个微克RNA通过采用莫洛尼(氏)鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶和(dT)17-接头引物而进行逆转录，如制造商推荐的(Acces RT-PCR System；Promega)。利用引物对：：B7 5′-GGCGACGAGCACCACTAC-3′(SEQ.ID.NO.：35)和B8 5′-GATTCCCGGAGGTCWCACA-3′(SEQ.ID.NO.：36)(其中W可以为A或T)进行PCR得到一个367bp长的bFCGRT特异性扩增产物(914-1280bp，(Kacskovics et al.，2000))。所扩增的节段通过在1％琼脂糖上电泳而分离并用溴化乙啶染色。
因为已在多种表皮细胞(Kacskovics et al.，2006b；Mayer et al.，2004；Mayer et al.，2002)中和血管内皮细胞(Kacskovics et al.，2006a)中检测到反刍类FcRn转录本，因此通过采用RT-PCR分析哺乳期Tg雌性小鼠肺、肝和乳腺以及新生小鼠肠道中的bFcRnα链表达。牛FcRnα链mRNA在所选的株系#9、#14和#19半合子动物组织均有表达(图4A)。
为了评价转基因表达的拷贝数依赖性并将其与内源性牛FcRnα链mRNA的量加以比较，我们利用Northern blot分析了来自牛和株系#14和#19个体的肝RNA样品。总RNA从年轻的成年雌性小鼠分离得到，5μg总RNA在1％琼脂糖/2.2M甲醛凝胶上进行大小分级、转移至Hybond N+膜(Amersham)并与32P标记的cDNA探针杂交，该探针如上通过B7-B8引物利用PCR而合成。18S RNA信号用作内标以估计凝胶上的RNA上样量。所获得的信号利用PhosphorImagerTM进行评价并通过STORMTM(分子动力学)进行定量。两个、四个、五个和十个拷贝Tg小鼠中的bFcRn mRNA特异性信号密度通过采用学生氏检验而加以比较。
结果表明转基因mRNA在株系#19中表达较高。株系#14半合子Tg小鼠(携带两拷贝BAC转基因)肝中mRNA表达水平，达到牛肝中所观察到水平的90％(图4B)。
对来自两种Tg株系的两只或三只半-和纯合子动物的定量分析和统计学评价表明，Tg小鼠肝中牛FcRnα链mRNA的量与其转基因拷贝数严格相关，差异具有显著性(概率水平p＜0.05)(图4C)。该结果以及携带两个转基因拷贝的Tg小鼠肝中牛FcRnα链mRNA表达类似于牛肝中的mRNA水平，表明128E04 BAC携带可确保bFCGRT的拷贝数依赖、位置独立性表达所必需的全部调节元件。
检测转基因小鼠肺中的bFcRnα链蛋白
牛FcRnα链在蛋白水平的表达通过Western分析进行检测。蛋白提取物在聚丙烯酰胺变性三甘氨酸凝胶上分离；印迹则用亲和纯化的兔抗血清(针对代表高度保守的bFcRnα链173-186氨基酸残基以及用于与KLH结合的N末端Cys的肽CLEWKEPPSMRLKAR(Mayer et al.，2002)而激发)进行检测。结合的bFcRnα链抗体通过辣根过氧化物酶轭合的羊抗兔抗体和增强的化学发光而检测，采用鲁米诺基溶液作为底物。稳定转染bFcRnα链的牛乳腺上皮细胞系(B4)用作阳性对照(Kacskovics et al.，2006a)。
在来自两种Tg株系的半合子肺样品中-与已知bFcRnα链的分子量一致(Kacskovics et al.，2000)-检测到一个40kD的蛋白，其尚未在野生型小鼠(用作阴性对照)中发现(图5)。转基因FcRnα链的分子量与B4牛乳腺上皮细胞系生成的重组蛋白一致，该细胞系已稳定转染bFcRn(Kacskovics et al.，2006a)。此外，该数据确证了Northern blot的结果，其表明表达5拷贝转基因bFcRn的#19小鼠样品比表达2个转基因拷贝的株系#14小鼠中检测到的bFcRn蛋白多得多(图5)。
这些数据证实，该102kb长的BAC克隆拥有bFcRnα链在生理水平的可重复性组织特异性表达所需的全部必需的遗传调节元件(图4A)，这强调，如果可能小鼠中牛转基因的性能应该可与牛组织中该基因的表达模式相比拟。
实施例4-分析牛BAC转基因小鼠中小鼠和人IgG半衰期的体内研究
为了分析Tg小鼠中bFcRnα链的表达并检测牛FcRnα链和小鼠β2m是否能够形成功能性受体，已经分析了小鼠和人IgG的清除率。研究人IgG是因为近来证实牛FcRn与人IgG的结合强于其与牛IgG的结合(Kacskovics et al.，2006a)。
预混合后，周龄、体重和性别(雄性)匹配的纯合子#14和对照小鼠(三至五只/组)静脉内微注射10mg/kg体重(BWkg)抗OVA小鼠IgGl(mAb，σ)或者20mg/BWkg人IgG(用于静脉内应用的Gammonativ为Octapharma，Stockholm，Sweden馈赠)(均溶于50mg/ml盐溶液中)，在接下来的216小时，从眶后血管丛周期性收集血液样品(50μl/次)。采用OVA(σ)作为捕获试剂、HRP-轭合的亲和纯化多克隆羊抗小鼠IgG(γ链特异性)(Southern BiotechAssociates Inc.，Birmingham，AL，USA)作为检测实验过程中抗OVA小鼠IgG1的血浆浓度。人IgG的血清浓度通过定量ELISA分析而测定，如之前所述(Kacskovics et al.，2006a)。采用卵清蛋白(σ)作为捕获试剂、HRP-轭合的亲和纯化多克隆羊抗小鼠IgG(γ链特异性)(Southern Biotech Associates Inc.，Birmingham，AL，USA)作为检测试剂的定量ELISA用来评价实验过程中抗卵清蛋白小鼠IgG1的血浆浓度。该过氧化物酶轭合的抗体利用TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；σ)作为底物而检测。样品平行分析。Ig浓度根据参考标准而报告。
通过采用WinNonLin professional，version 4.1(Pharsight，Mountain View，CA)将数据拟合于两个房室模型而分析最初十天内小鼠平均IgG浓度。
小鼠IgG的清除曲线为双相，第一相(α相)表示血管内和血管外房室之间的平衡，第二相(β相)表示缓慢清除。第一相和第二相直至216小时的数学建模已证实了与FcRn介导的IgG药物代谢动力学整体趋势(scheme)的良好关联性(Lobo et al.，2004)，因此我们计算了该时间范围内mIgG的α和β相半衰期。估计wt和Tg小鼠中各自α相半衰期均近似于5小时左右。相比之下，β相半衰期之间则存在显著性差异(p＜0.05)，例如根据两房室模型分析，wt中其为125.4±3.2小时(均值±SEM)，而Tg动物中则为165.1±7.8小时(表5A；图6A)。
在hIgG的情况下，类似于mIgG清除率数据，源于该研究的数据第一相和第二相直至216小时的数学建模已证实了与FcRn介导的IgG药物代谢动力学整体趋势的良好关联性，因此我们计算了该时间范围内hIgG的α和β相半衰期。根据两房室模型分析，野生型和转基因小鼠中α相均为10小时左右，而在10和20毫克每克的实验之间无差别。而在β相，我们则观察到wt和Tg小鼠之间存在显著性差异(p＜0.05)。注射10毫克每克时，wt和Tg小鼠中所计算出的β相分别为106±3.6和171.5±16.2小时，而注射20毫克每克时则分别为108.2±3.7和181±7.7小时(表5；图6B)。正如预期的，曲线下面积(AUC)值显著不同，因为与10毫克每克实验相比，当我们注射20毫克每克时其表现出大约两倍的值；另一方面，注射10或20μg hIgG每克时，则α或β相半衰期均不存在显著性差异。
当我们比较这些实验中的mIgG和hIgG清除率数据时(比较10毫克IgG每克的实验)，我们观察到hIgG从wt小鼠清除显著较快(p＜0.05)(人和小鼠IgG分别为106和125.5小时)，然而，在Tg动物中小鼠和人IgG清除率数据之间不存在差异(表5)。
表5.野生型和bFcRn转基因小鼠中小鼠和人IgG的药物代谢动力学参数。数值表示均值±SEM；MRT，平均存留时间；AUC，曲线下面积。
总之，这些BAC转基因小鼠中IgG清除率的研究确证了不存在β2m的大量缺失以及牛FcRnα链与小鼠β2m形成功能性复合体。Tg小鼠中mIgG1清除率显著降低，表明可用于保护所给予抗体的小鼠和杂合FcRn量促进了体内受保护免被清除的程度。此外，Tg动物中小鼠和人IgG清除数据之间不存在差异，表明杂合bFcRnα链mβ2m受体也可保护hIgG1。
实施例5-用卵清蛋白进行免疫接种
将纯合子#14、半合子#19(分别编码4和5拷贝的bFCGRT)和周龄性别(雄性)匹配的wt小鼠(五只/组)用250μg卵清蛋白(OVA，σ-Aldrich，Budapest，Hungary)在完全福式佐剂(CFA)进行腹膜内免疫接种，14天后用250μgOVA与不完全福式佐剂(IFA，σ-Aldrich，Budapest，Hungary)一起再次刺激。
所有的实验步骤均得到了农业生物技术中心，Hungary的动物保护和伦理委员会批准。
抗原特异性IgM和IgG滴度
为了揭示bFcRn过表达除IgG保护之外的免疫学影响，用OVA免疫接种wt和Tg(#14和#19)小鼠并于两周后再次刺激，并测定其血清抗OVA的IgM和IgG滴度。从框后血管丛收集血液样品(50μl/次)达56天。分析血清的OVA和FITC特异性IgM和IgG。采用OVA和FITC白蛋白(σ-Aldrich，Budapest，Hungary)作为捕获试剂、HRP-轭合的亲和纯化多克隆羊抗小鼠IgM和羊抗小鼠IgG(μ和γ链特异性)(Southern Biotech Associates Inc.，Birmingham，AL，USA)作为检测试剂的定量ELISA用来评价实验过程中抗OVA和抗FITC的小鼠IgM和IgG的血浆浓度。该过氧化物酶轭合的抗体利用TMB(σ-Aldrich，Budapest，Hungary)作为底物而检测。采用系列稀释的每一种测试血清样品，并根据450nm的吸光值报告Ig浓度，该值从剂量-反应曲线的线性部分插入。样品进行平行测定。学生氏双尾t检验用来评价处理组平均值的统计学显著性。如果p＜0.05，则认为其具有显著性差异。
结果表明，初级免疫应答过程中wt和Tg动物之间不存在差异，然而，加强免疫后OVA特异性IgM和IgG滴度则显著不同。次级抗体应答过程中，因为与初级免疫应答相比，其中存在一个略低的IgM峰，IgM滴度在wt动物中表现为一种典型曲线。另一方面，在Tg小鼠中，次级免疫应答中IgM滴度高于初级免疫应答，且显著高于wt小鼠(图7A)。至于IgG梯度，次级免疫应答过程中，与wt动物相比，Tg小鼠中OVA特异性IgG滴度几乎达到3倍(图7B)。
IgG亚类分布(subclass profile)
接下来测定OVA特异性血清免疫球蛋白中的IgG亚类分布。免疫接种后32天，分析wt和Tg(#14)小鼠的血清中的OVA特异性IgG亚型。采用OVA作为捕获试剂、HRP-轭合的亲和纯化多克隆羊抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3(Southern BiotechAssociates Inc.，Birmingham，AL，USA)作为检测试剂的定量ELISA用来评价抗OVA IgG亚型的血浆浓度。过氧化物酶轭合的抗体利用TMB作为底物进行检测。采用系列稀释的每一种测试血清样品，并根据450nm的吸光值报告Ig浓度，该值从剂量-反应曲线的线性部分插入。样品进行平行测定。
我们发现，用OVA-CFA随后用OVA-IFA免疫接种的动物主要表现为IgG1亚类的抗OVA抗体。数据表明，Tg小鼠生成显著较高滴度的OVA特异性IgG1、IgG2a和IgG2b。尽管与wt小鼠相比，Tg小鼠生成稍高的IgG3，但由于结果中标准差较大因此差异不具有显著性。本发明的数据还表明，OVA特异性IgG亚型与wt小鼠的比例类似(图7C)。这表明除了量的差异，Tg小鼠中的bFcRn表达未改变OVA特异性免疫应答。
总IgG水平
采用未标记的亲和纯化羊抗小鼠多克隆抗体(羊抗小鼠IgG(H+L)；Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL，USA)作为捕获试剂、辣根过氧化物酶-轭合的亲和纯化多克隆羊抗小鼠IgG(γ链特异性；Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL，USA)作为检测试剂的定量ELISA用来评价实验过程中小鼠IgG的血浆浓度。过氧化物酶轭合的抗体利用TMB(σ)作为底物进行检测。样品进行平行测定。
分析总IgG水平表明，甚至在免疫接种前，与wt小鼠相比，Tg(#14)小鼠生成显著较高量的IgG(wt和Tg小鼠中分别为2.4±0.4和4.8±0.5mg/ml，均值±SEM；p＜0.01)。免疫接种后，wt和Tg动物中总IgG水平持续上升，分别于第28天和第36天达到其峰值。值得注意的是，我们发现在最高的IgG水平存在一个异常且显著的差异，wt和Tg小鼠中分别为14.8±2.6mg/ml(均值±SEM)和39.9±2.7mg/ml，均值±SEM(p＜0.001)(图7D)。
吞噬测定
为了评价Tg小鼠中所生成OVA特异性IgG的功能完整性，通过使OVA-FITC与量逐渐增加的Tg和wt小鼠血清(在OVA免疫接种后35天收集)一起孵育而生成OVA-抗-OVA抗体复合物，并利用小鼠巨噬细胞系P388D1进行吞噬测定。通过生产商说明书(Molecular Probes，Eugene，OR)所述的程序，用FITC标记OVA。P388D1细胞系的小鼠巨噬细胞于37℃在PRMI 1640培养基(σ-Aldrich，Budapest，Hungary)中培养，该培养基补充了5％胎牛血清(σ-Aldrich，Budapest，Hungary)和10μM 2-巯基乙醇(σ-Aldrich，Budapest，Hungary)。将2×105个细胞/孔于37℃用15ng豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯在24孔细胞培养板中处理60分钟(PMA，30ng/ml，σ-Aldrich，Budapest，Hungary)。为了生成OVA-抗-OVA抗体复合物，将50μg OVA-FITC(1μg/μl)与来自OVA免疫的Tg和wt小鼠(免疫接种后35天)的2.5、10和40μl血清37℃预孵育60分钟。通过将PMA处理的P388D1细胞与OVA-抗-OVA抗体复合物37℃孵育90分钟而开展吞噬实验。彻底洗涤去除未结合的蛋白后，利用流式细胞术(FACS)分析细胞。台盼蓝用来淬灭细胞外的FITC标记的OVA。
免疫复合物吸收效率利用FACS进行分析。与未受调理素作用的OVA-FITC吸收相比，采用2.5μl非Tg也非wt小鼠血清时未发现吞噬增强。然而，采用10μl Tg而非wt小鼠的血清时则观察到显著的增强。最后，与未受调理素作用的抗原相比，40μl Tg和wt小鼠血清均引起了等量的吞噬增强(图7E)。数据表明，免疫接种的第35天，Tg小鼠血清包含显著较多的OVA特异性抗体，且这是功能完整的。
实施例6-Tg和wt小鼠对FITC-葡聚糖免疫的反应类似
为了分析主要产生IgM的免疫应答，将Tg和wt小鼠用FITC-葡聚糖经腹膜内免疫接种，并在两周后对其进行类似的刺激。因为FITC-葡聚糖是一种半抗原(FITC)，轭合于典型T细胞非依赖性II型抗原(葡聚糖)(Mond et al.，1995)，因此血清中主要观察到FITC特异性IgM，FITC特异性IgG则极少。至于其FITC特异性免疫应答，则Tg和wt动物之间不存在差异。分析免疫过程中的免疫应答，我们注意到，次级免疫后Tg和wt小鼠中均出现IgM生成增加(图8)。
实施例7-bFcRn过表达对OVA特异性IgM和IgG生成细胞的影响
利用ELISPOT测定法分析OVA特异性B细胞
Tg小鼠中OVA特异性IgM滴度增加表明，除了促进IgG保护增加之外bFcRn过表达还在克隆性B细胞扩增水平改变了免疫应答。为了研究该观察结果，首先在免疫后第25天通过利用ELISPOT测定法的OVA特异性B细胞分析来分析脾脏中分泌抗-OVA IgG和抗-OVA IgM的浆细胞数量。纯合子#14和wt小鼠(三只/组)用250μg在CFA中的OVA进行腹膜内免疫接种，14天后用250μg在IFA中OVA的进行刺激。首次免疫后25天，处死动物并分析其脾细胞中的OVA特异性IgG和IgM细胞。为了进行ELISPOT，将MultiScreen-HTS板(Millipore，Bedford，MA)用5μg/ml的在PBS中的OVA室温包被3小时。该板随后用PBS洗涤六次，并用5％FCS和巯基乙醇(50μM)的RPMI培养基室温封闭30分钟。将系列稀释的脾细胞(从5×105个细胞/孔)加入孔内。板子用5％CO2于37℃孵育过夜，用PBS-Tween洗涤六次；随后每个孔内加入辣根过氧化物酶轭合的羊抗小鼠IgG(γ重链特异性；1∶4000倍稀释；SouthernBiotechnology)。室温孵育一小时后，板子用PBS-Tween洗涤六次。板子随后在色素原底物3-氨基-9-乙基咔唑(AEC；σ)和H2O2存在的情况下室温孵育，用水洗涤终止反应。在ImmunoScan ELIspotreader(Cellular Technology Ltd.，USA)中计数每孔中的spot-formingunit(SFU)，并通过ImmunoSpot software ver 3.2(Cellular TechnologyLtd.，USA)进行评价。
结果表明，脾脏内OVA特异性IgM生成细胞的数量达到两倍(p＜0.05)，而OVA特异性IgG细胞则达到三倍以上(p＜0.001)(图9A)。
免疫接种引起中性粒细胞大量流入脾脏内
OVA免疫接种引起脾脏重量(图9B)及其细胞数(图9C)的增加；还观察到周围淋巴结肿大。该现象出现在wt以及Tg小鼠中，然而，与wt对照相比，Tg动物中脾脏达到其两倍大小(p＜0.001)。
随后我们通过流式细胞术表征了脾脏的细胞类型分布。为了进行FACS，分离脾细胞，首先将其与抗-CD32/CD16(克隆2.4G2)一起孵育30分钟。然后这些细胞用荧光染料轭合的特异性Abs在染色缓冲液(含0.1％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS)中于4℃孵育50分钟，洗涤两次，然后利用装有CellQuest软件(BD Biosciences，San Jose，CA)的FACSCalibur进行分析。轭合的mAbs，CD45R/B220-PECy5，I-A/I-E-PE，GR-1(Ly-6G)-PE和CDllb-A647获自BD Pharmingen(San Diego，CA)。CD3-A647，CD86-PE，CD1lc-A647和CD11b-PE分别从Caltag(Burlingame，CA)，eBioscience(San Diego，CA)，Serotec(Dusseldorf,Germany)和ImmunoToolsGmbH(Friesoythe，Germany)购买。同型对照则获自BD Pharmingen或Serotec。
结果表明，免疫接种后，携带CD45R/B220(B淋巴细胞)和I-A/I-E(MHC II类)抗原的细胞比值显著降低(p＜0.05)。wt和Tg小鼠中，携带CD3标志物(T淋巴细胞)的细胞分别为无差异或下降不那么彻底。这些现象在wt和Tg小鼠中均出现，然而，在Tg动物中更明显(图10)。
免疫接种后，wt和Tg小鼠中携带CD11b和Gr-1标志物的细胞比值显著提高(p＜0.001)。至于该增加的强度，我们发现wt小鼠中增加约五倍，Tg小鼠中则增加约九倍。根据前向角/侧向角散射(FCS/SSC)参数，我们还发现，大多数表达Gr-1的细胞为Gr-1high，且具有典型的粒细胞定位(图11A)，表明它们是中性粒细胞(数据未示出)。而且在Tg小鼠中该增加更强烈(图11A)。与其wt对照相比，Tg小鼠中携带CD11b和MHC II类抗原(巨噬细胞、树突状细胞)(图11B)以及CD11b和CD11c抗原(树突状细胞)(图11C-阳性细胞)的细胞比例显著增加(分别为p＜0.05和p＜0.01)。该结果解释了携带B220和MHC II类的细胞比例的减小，然而，这并不意味着细胞总数下降，因为脾脏及其细胞数免疫接种后都有所增大(图9C)。根据这些分析，我们推测，免疫接种25天后流入脾脏内的细胞大多数是中性粒细胞，然而树突状细胞的数量也出现增加。
实施例8-bFcRn在腹膜渗出液的中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞中强烈表达
小鼠用刀豆素A(ConA，100μg/小鼠，溶于PBS中；σ-Aldrich，Budapest，Hungary经腹膜内处理后两天，首先分析其腹膜渗出液细胞中的bFcRnα链的表达。为了得到中性粒细胞富集的细胞制备物，小鼠腹腔注射2ml 5％(w/v)无菌盐水中的酪蛋白(σ-Aldrich，Budapest，Hungary)，注射后6小时分离腹膜细胞。然后利用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)离心(400×g，室温，30分钟)纯化中性粒细胞。中性粒细胞的纯度为约80％，如通过流式细胞术采用抗CD11b和抗Gr-1试剂而测定的(图12)。
采用Trizol Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取这些细胞的总RNA，其中2mg RNA采用莫洛尼(氏)鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(Promega)和(dT)17-接头引物通过标准流程进行逆转录。利用引物对B3 5′- CGCAGCARTAYCTGASCTACAA-3′(SEQ.ID.NO.：37其中R可为G或A，Y可为T或C，S可为G或C)、B4 5′-GGCTCCTTCCACTCCAGGTT-3′(SEQ.ID.NO.：38)实施PCR，得到一个422bp长的bFcRnα链特异扩增产物(AF139106的289-711bp)。所扩增的节段通过在1％琼脂糖凝胶上电泳而分离并用溴化乙锭进行染色。
用ConA处理后，首先分析Tg和wt小鼠腹膜渗出液细胞中的bFcRn表达。中性粒细胞和巨噬细胞富集的细胞群中也出现了bFcRn的表达，因为该纯化细胞～78％为CD11bhigh/Gr-1high，为～20％CD11bhigh/Gr-l-(图12)。
一个更近期的研究表明，FcRn在多核淋巴细胞和单核细胞中IgG介导的吞噬中发挥主要作用(Vidarsson et al.，2006)，这表明FcRn与抗原提呈有关。根据我们的数据，可假设这些细胞中bFcRn过表达能够介导抗原吞噬增强甚至抗原提呈，随后引起次级淋巴器官中抗原特异性IgM和IgG生成性浆细胞增多。如果该理论正确，则一旦IgG产生且并非早期产生，这种增强即应该很明显。的确，IgM滴度仅在OVA特异性IgG出现后有所增加，主要是在次级免疫应答中。
实施例9-免疫小鼠(immune mice)脾脏内存在携带OVA的B-淋巴细胞、中性粒细胞和树突状细胞
我们的细胞分析表明，免疫接种后流入脾脏内的主要细胞类型是中性粒细胞。根据另一个近期报道，中性粒细胞在次级淋巴器官中构成了携带抗原的主要细胞群；一旦出现特异性免疫应答，则形成IgG-抗原免疫复合物，并提供已建立的次级免疫应答的质量(Maletto et al.，2006)。为了检测中性粒细胞流入是否的确依赖于抗原特异性免疫应答以及我们实验中所携带的抗原，OVA免疫接种后56天(当时OVA特异性IgG水平仍然较高-图7B)以及未进行免疫接种的腹膜内FITC-OVA处理。在该实验中，小鼠(纯合子#14)经腹膜内OVA-FITC处理(7.4mg/ml，100μl/小鼠)。OVA-FITC注射后5小时，切除小鼠脾脏并通过流式细胞术和共聚焦显微镜分析其细胞。为了进行流式细胞术，细胞如所述进行处理，采用下列试剂：CD45R/B220-PECy5、GR-I(Ly-6G)-PE、CDllc-A647、CDllb-A647和CDllb-PE。为了进行共聚焦分析，细胞用细胞可透过性DRAQ5红色荧光荧光DNA探针(Biostatus Ltd.，United Kingdom)室温染色10分钟。洗涤步骤后，用Olympus FLUOView500激光扫描共聚焦显微镜以较高的放大倍数(物镜：63×)(Hamburg，Gemany)记录荧光和DIC图像(512×512像素)。488nm的氩激光和632He-Ne激光线用来激发FITC和DRAQ5染料。
我们的细胞流式分析表明，在OVA免疫的动物中，OVA-FITC阳性细胞(15.1±1.4％)中61.2±5.4％为B220阳性(B-淋巴细胞)，18.5±0.6％为CD11bhigh和Gr-1high(中性粒细胞)，而13.5±2.1％是CD11b和CD11c阳性(树突状)细胞。在OVA-FITC内化入含多叶状核的典型中性粒细胞中。在未免疫接种的小鼠中，则未发现相当数量的OVA-FITC阳性细胞(2.1±0.3％)(图13A和13B)。我们关于OVA-FITC阳性中性粒细胞和B淋巴细胞的流失细胞分析数据得到共聚焦分析的确证。我们发现具有多核及内化OVA-FITC的典型中性粒细胞，而其他细胞，可能是B-淋巴细胞(含大圆形核和薄层胞质)则被OVA-FITC包被(图13C)。我们未发现免疫和未免疫动物之间脾脏大小和细胞数量存在显著性差异(数据未示出)。该结果与我们发现的其他结果符合非常好，且解释了为什么在免疫接种后25天，我们的wt和Tg小鼠中有明显的CD11b和Gr-1阳性中性粒细胞流入。考虑到Tg小鼠产生多得多的OVA特异性IgG(图7B)且这些细胞中过表达FcRn(图12)，我们还可以解释为什么Tg小鼠表现为这些细胞流入脾脏增多、抗原特异性B细胞克隆性扩增较大以及因此出现强有效的抗体应答。
实施例10-用慢病毒转基因生成bFcRn转基因小鼠
最近，采用HIV和EIAV来源的慢病毒载体在小鼠(Pfeifer et al.，2002)、大鼠(Lois et al.，2002)、鸡(McGrew et al.，2004)、猪(Hofmann et al.，2003；Whitelaw et al.，2004)和牛(Hofmann et al.，2004)中获得可重复型的高转基因。WPRE-P2_bFcRn转移载体通过用人工结合2950bp长的牛FcRn(bFcRn)α链基因的启动子片段与该相同基因的编码序列来取代转移载体pWPTS-EGFP(Boviaet al.，2003)中最初的EF1σ-EGFP片段而得到。所述FcRn启动子片段利用Deep Vent聚合酶(New England Biolab，Beverly，MA，USA)从携带bFcRnα链的BAC克隆#128 E04经PCR扩增而来，且已用来制备bFcRn转基因小鼠(见实施例2)。正向引物包含XbaI位点(斜体)(lenti-BORE20：5-GGG TCT AGA ACA CCA AGG GCGGCA TCA-3，SEQ.ID.NO.：39)反向引物包含EcoRI位点(lenti-BORE18：5-GGG GAA TTC CGG CTC CCG TGA CTG GAGAC-3，SEQ.ID.NO.：40)。PCR生成的扩增产物为2950bp长的bFCGRT调节序列(GenBank：NW001493624.1克隆/Bt18WGA21323/牛染色体18的基因组重叠群核苷酸765455-762510个碱基对，参考组件(根据Btau_3.1))。bFcRn重链的编码区段利用Deep Vent聚合酶从一个携带bFcRn Cdna(GenBank AF139106)的克隆经PCR扩增而来，之前在我们实验室已用于制备稳定转染的细胞(Kacskovics et al.，2006a)。正向引物包含EcoRI位点(BORE10：5-GGG GAA TTC TGG GGC CGC AGA GGG AAG G-3，SEQ.ID.NO.：41)反向引物包含MulI位点(lenti-BORE19：5-GGGACG CGT GAG GCA GAT CAC AGG AGG AGA AAT-3，SEQ.ID.NO.：42)。PCR生成的扩增产物为1285bp长的bFcRnα链cDNA(GenBank：bFcRn的NM_176657参照序列的核苷酸64-1344)。纯化后，将两个扩增产物(bFcRn的启动子和编码序列)用EcoRI(Promega)消化，并用T4连接酶(Promega)连接，而生成编码一个bFcRn重链启动子2950bp片段以及一个bFcRn重链cDNA的1285bp片段(SEQ.ID.NO.：43)的P2-bFcRn构建体。然后将该bFcRn启动子-cDNA片段插入转移载体质粒pWPTS中。该载体通过瞬时转染扩增入293T细胞内，如前所述(Bovia et al.，2003)。用来产生慢病毒的载体获自Tronolab，Cantonal MedicalUniversity，Geneva，Switzerland。采用了下列载体：pMD.G(被膜构建体，6kbp)、pCMV R8.91(包装构建体，12kbp)、pWPTS(转移构建体，12.7kbp，其中FcRn启动子(P2)-FcRn cDNA序列插入ClaI和SalI位点之间)。慢病毒通过用评选制备的系列稀释病毒原种上清转导Jurkat细胞而估计。该病毒携带pWPRE-EGFP转移载体。GFP+细胞通过荧光激活的细胞分选器(FACS)进行计数。滴度为107-108个转导单位/ml。转基因小鼠通过将慢病毒HIV-P2-FcRn注射入单细胞期受精卵的卵周隙内而生成。微注射在FVB/N和Balb/c遗传背景上进行。所注射受精卵随后转移入受体雌性小鼠体内(表6)。转基因首建者通过用下列引物进行PCR而鉴定：bFcSuf5′CTCCTTTGTCTTGGGCACTT 3′(SEQ.ID.NO.：9)和bFcL 5′GCCGCGGATCCCTTCCCTCTG 3′(SEQ.ID.NO.：10)。
表6.慢病毒注射的小鼠胚胎数据
    FVB/N     Balb/c
  注射并转移的胚胎     37     38
  受体雌性小鼠的个数     2     3
  成功转移次数     2     1
  新生小鼠个数     17或18     4
  新生小鼠存活个数     13     4
   PCR+(转基因)     5     1
为了检测转基因表达，对来自新生HIV-P2-FcRn小鼠的肝、脾、肺和肠道分离的RNA样品实施了RT-PCR，如图14中所示。还包括了设计用于P2启动子的引物(FcRnprf：CGGCCACCTCTATCACATTT，SEQ.ID.NO.：3；FcRnprr：TGCATTGACCACACTTGGTT，SEQ.ID.NO.：4；预期片段大小：579bp)，以排除RNA样品中包含基因组DNA的可能性，转基因特异性mRNA通过计划用于牛FcRn第4外显子的引物(bFcRnex4f：CCAAGTTTGCCCTGAACG，SEQ.ID.NO.：19；bFcRnex4r：GAGGCAGATCACAGGAGGAG，SEQ.ID.NO.：44，预期片段大小：161bp)进行检测。结果清楚的示出了bFcRn mRNA的表达。
转基因首建者通过与野生型小鼠交配而单独饲养，已建立转基因株系。
实施例11-白蛋白水平在Tg小鼠血清中也有所增加
由于转基因小鼠过表达bFcRn，因此我们研究了两点：(1)bFcRn是否与小鼠白蛋白相互作用，以及(2)白蛋白代谢是否受影响。因此，通过采用白蛋白特异性夹心ELISA测定了不表达FcRn(FcRn KO---从Jackson Laboratory，USA购买)的小鼠、wt动物、纯合型#14和#19)(分别表达4和10拷贝的bFcRn)的白蛋白水平。根据该研究，我们发现bFcRn结合白蛋白而且严重影响其血清水平(图15)。我们还测定了转基因小鼠乳汁中的白蛋白含量，发现其所含浓度显著高于其野生型对照(数据未示出)。因此，这些数据表明，除了FcRn过表达对体液免疫应答的有利影响之外，白蛋白浓度也有所提高，这可能是有害的，因为这可能造成血液中渗透压水平高于正常，尽管甚至拷贝数10也未发现什么可查觉的有害影响，且Tg动物健康存活较长时间可达14个月。
实施例12-分析小鼠FcRn KO-牛BAC转基因小鼠中兔IgG半衰期的体内研究
为了分析bFcRn是否结合兔IgG并保护其不被快速清除，我们分析了小鼠FcRn KO-牛BAC转基因小鼠中兔IgG的半衰期。牛FcRn转基因、无小鼠FcRnα链的小鼠(bFcRn/mFcRn-/-)通过使携带4拷贝128E04 BAC转基因的bFcRn纯合子小鼠(#14)(Benderet al.，2007)与mFcRn等位基因敲除的小鼠株系纯合子杂交育种而生成。该小鼠株系购自Jackson Laboratories(USA)，名称为B6.129x1-Fcgrt tm1Dcr/Dcr。具有预期基因型(bFcRn/mFcRn-/-)的双转基因小鼠利用以下引物通过多重PCR进行筛选：NEO-F：GGAATT CCC AGT GAA GGG C(SEQ.ID.NO.：45)；NEO-R：CGA GCCTGA GAT TGT CAA GTG TAT T(SEQ.ID.NO.：46)；FcRn wt-F：GGGATG CCA CTG CCC TG(SEQ.ID.NO.：47)；bFcSuF：CTC CTT TGTCTT GGG CAC TT(SEQ.ID.NO.：9)；bFcL：GCC GCG GAT CCCTTC CCT CTG(SEQ.ID.NO.：10)，恰当的F2小鼠如图16A所示进行鉴定。
兔IgG半衰期基本如实施例4所述进行分析。简单而言，预混合后，周龄、体重和性别(雄性)匹配的mFcRn-/-和bFcRn+/+/mFcRn-/-小鼠(三只/组)静脉内微注射150μg兔IgG(σ(溶于50mg/ml盐溶液中)，在接下来的216小时，从眶后血管丛周期性收集血液样品(50μl/次)。采用羊抗兔IgG(H+L特异性)(Caltag)作为捕获试剂、HRP-轭合的羊抗兔IgG(H+L特异性)(Vector Laboratories)作为检测试剂的定量ELISA用来评价实验过程中兔IgG的血浆浓度。该过氧化物酶轭合的抗体利用TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；σ)作为底物进行检测。样品平行分析，兔IgG的浓度根据参考标准而报告。兔IgG在FcRn-/-小鼠中清除迅速(半衰期：15小时)，但其在bFcRn/FcRn-/-小鼠中受到保护(半衰期：67小时)(图16B)。关于FcRn-/-动物以及由于缺乏β-2-微球蛋白而缺乏功能性FcRn的动物(Ghetie et al.，1996；Israel et al.，1996；Junghans and Anderson，1996)中IgG快速清除已有记载(Roopenian et al.，2003)。在我们的实验中，bFcRn/FcRn-/-中由于bFcRn活性，兔IgG清除率显著下降(p＜0.0001)。然而，这些动物中的兔IgG半衰期仍然短于兔中兔IgG的半衰期(半衰期：132-153小时(Andersen and Bjorneboe，1964；Dima et al.，1983；Sabiston and Rose，1976))或小鼠中的兔IgG半衰期(半衰期：106小时)(Dima et al.，1983)，表明兔IgG与bFcRn/小鼠β-2-微球蛋白复合物的相互作用相对较弱。的确，前期数据检测到种属之间的IgG-FcRn相互作用的差异(Ober et al.，2001)，强调了需要通过实验选择恰当FcRn，以增加IgG半衰期从而在免疫接种后增加其水平。
实施例13-通过杂交创建可产生人源化免疫球蛋白和过表达牛FcRn的双转基因兔
可产生人IgG和牛FcRn的双转基因兔株系是改善血清免疫球蛋白水平的良好候选。已经证实了过表达的牛FcRn对人IgG半衰期的影响，因此，这些双转基因兔株系对于生产多克隆抗血清是有用的，或者可以作为产生兔单克隆抗体的一个起始点。
双Tg兔可以通过标准杂交产生，尽管以前的实验显示与兔IgG结合方面bFcRn并不是最好的候选，但生成bFcRn转基因兔仍将是创建既产生人IgG又产生牛FcRn的双转基因兔过程中所需的一个中间步骤。在稍后的步骤中，两种Tg兔株系，每种携带其中一种转基因，可经杂交产生最终的动物。
利用原核显微注射将128E04牛BAC克隆导入兔受精卵，从而产生转基因首建者。利用设计用于从牛FCGRT第4外显子扩增一个160bp片段的引物，通过PCR检测牛FcRn基因的存在(bFcRnex4F：5’-CCAAGTTTGCCCTGAACG-3’(SEQ.ID.NO.：19)和bFcRnex4R：5’-GTGTGGGCAGGAGTAGAGGA-3’(SEQ.ID.NO.：20))。图17示出了预期片段的存在。
首建兔的F1仔将适于与经遗传改造可产生人源化免疫球蛋白的兔进行杂交(Thorey et al.，2006)以获得适于用来增强人源化多克隆抗体生产水平的双转基因动物。
实施例14-创建既产生人源化免疫球蛋白又过表达牛FcRn的双转基因兔
作为实施例13的一种备选方案，双转基因兔可以利用产生人源化免疫球蛋白的转基因兔(Thorey et al.，2006)在与实施例3中所述相似的转基因实验中作为受体动物产生。利用128E04牛BAC克隆，通过原核显微注射(pronuclear microinjection)产生转基因兔系。利用特异于牛BAC克隆的特异引物和探针，通过Southern blot和/或PCR鉴定转基因兔，并评价所注射人IgG的半衰期。在兔血清中半衰期的大大增长表明，导入的牛FcRn保护了转基因兔生产的人免疫球蛋白免于被降解。
实施例15-一个携带兔FcRnα-链基因的BAC克隆的分离和鉴定
如同许多利用兔作为模型动物开展的关于FcRn活性的早期研究，我们预测兔FcRn由其他组织中的内皮细胞表达，并参与维持IgG的内环境稳态。因此，加入额外拷贝的兔FcRn基因会引起IgG半衰期的增加。因此，克隆了兔FcRn并将其测序。(SEQ.ID.NO.：48)。
在平行试验中，从兔BAC文库中分离兔BAC克隆262E02(Rogel-Gaillard et al.，2001)。该BAC文库在pBeloBAC11载体中构建，此高分子量DNA从新西兰兔的白细胞中制备得到。该兔BAC库由INRA家养动物资源中心管理，并且可以共享。兔FCGRT基因特异引物：OCU_FCGRT-F：GGGACTCCCTCCTTCTTTGT(SEQ.ID.NO.：49)和OCU_FCGRT_R：AGCACTTCGAGAGCTTCCAG(SEQ.ID.NO.：50)是由Primer 3程序(http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/iccare/cgi-bin/primer3_aTg.cg i.pl)在兔表达序列标签(EST)上设计的。利用Iccare程序(http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/Iccare/cgi-bin/.)通过与人FCGRT基因上比对而鉴定(EST)EB377775(GeneBankNM_004107)。EB377775 EST序列与兔FcRn cDNA(SEQ.ID.NO.：55)的对应部位相同。根据正向同源的牛染色体，分析了262E02兔BAC克隆中候选基因的存在。在FCGRT基因5’和3’方向上50kb附近，使用针对Oryctolagus cuniculus ESTs设计的引物或牛基因特异引物。在262E02 BAC克隆上鉴定出以下兔基因：RPL13A；RPS11；FCGRT；RCN3；PRRG2(见图18)。
表7.在兔BAC克隆262E02中评价正向同源牛基因存在的引物及PCR条件
公认基因 引物 Tm(℃) 产物(bp)
PRRG PRRG2L：5′-GTTGTTCACACCAGGGAACC-3′(SEQ.ID.NO.：25)PRRG2_R：5′-CCTTTGCCATTGTAGATGTAGC-3′(SEQ.ID.NO.：26) 61 295
RCN3 RCN3_L：5′-GACGCCGAGACCTACAAGAA-3′(SEQ.ID.NO.：5 1)RCN3_R：5′-CATGTGCGGGAACTCCTC-3′(SEQ.ID.NO.：52) 61 168
FCGRT FCGRT_L：5′-CTGAACGGTGAGGACTTCAT-3′(SEQ.ID.NO.：53)FCGRT_R：5′-GCTCCTTCCACTCCAGGTT-3′(SEQ.ID.NO.：54) 61 210
RPS11 RPS1 I_L：5′-AGATCGGCGACATCGTCA-3′(SEQ.ID.NO.：55)RPS11_R：5′-TCTGGAACTGCTTCTTGGTG-3′(SEQ.ID.NO.：56) 61 108
RPL13A RPL13A_L：5′-CATGAGGTGGGCTGGAAGTA-3′(SEQ.ID.NO.：57)RPL13A_R：5′-TCCGGTAGTGGATCTTAGCC-3′(SEQ.ID.NO.：58) 61 82
基于槽印迹分析，还检测到了FLT3LG基因的存在，当将利用引物FLT3LG_L：5’-TCGGAGATGGAGAAACTGCT-3’(SEQ.ID.NO.：15)和FLT3LG_R：5’-CTGGACGAAGCGAAGACAG-3’(SEQ.ID.NO.：16)扩增的一个长度为547bp牛FLT3LG PCR产物与262E02兔BAC杂交时，在高度严谨条件下可出现强阳性信号。
兔BAC克隆262E02的结构与牛128E04牛BAC克隆的结果很相似，因此，预期其可能会在转基因实验中提供相似的良好结果。
实施例16-创建过表达兔FcRn的转基因兔以及分析兔IgG半衰期的体内研究
将一个携带在之前实施例中表征的兔BAC克隆262E02的遗传构建体或者一个包含兔FcRn cDNA(SEQ.ID.NO.：48)的构建体(该cDNA被已鉴定好的bFcRn启动子驱动且在兔FcRn cDNA下游补充有一个异源内含子和一个商品化SV40 polyA区域)通过原核显微注射导入兔受精卵。可替代地，转基因兔可通过将P2-兔FcRncDNA插入实施例10所述慢病毒转移载体中，并注射入兔胚胎的卵黄周空间来构建。转基因兔利用特异的引物/探针，通过Southernblot和/或PCR来鉴定。过表达兔FcRn的转基因兔体内的IgG半衰期将通过标准方法进行评价，例如上文列举的那些方法。
这样生成的过表达兔FcRnα-链的转基因兔可方便地被用来增强多克隆抗血清的产生。
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Claims (1)

1.一种包含提供增强的FcRn活性的遗传构建体的非人类转基因哺乳动物在用于生产免疫球蛋白的非治疗性方法中的应用，所述方法包括使非人类转基因哺乳动物与感兴趣的抗原接触的步骤，所述非人类转基因哺乳动物包含遗传构建体，其中所述遗传构建体提供编码FcRn蛋白α链的核酸序列的表达，并且其中所述编码FcRn蛋白α链的核酸序列过表达，由此与相同种属的非转基因对照动物相比，所述遗传构建体提供针对抗原的增强的体液免疫应答，所述增强的体液免疫应答包括抗原特异性B细胞克隆扩增增强，其中所述哺乳动物为啮齿类动物，所述遗传构建体提供编码牛FcRn蛋白α链的核酸序列的表达。
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