CN104994729B - 编码具有人独特型的啮齿动物抗体的多核苷酸以及包含所述多核苷酸的动物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用于在啮齿动物中优化产生具有人独特型的功能性免疫球蛋白的多核苷酸，尤其是嵌合多核苷酸。本发明还涉及包含此类多核苷酸的啮齿动物。

Description

编码具有人独特型的啮齿动物抗体的多核苷酸以及包含所述 多核苷酸的动物
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年12月14日提交的美国临时专利申请U.S.S.N.61/737,371的优先权。本申请明确地以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及可用于在啮齿动物中产生具有人独特型的免疫球蛋白的多核苷酸，尤其是嵌合多核苷酸。本发明还涉及包含此类多核苷酸的啮齿动物细胞。
参考序列表
在此专利文件中，以在2012年12月12日创建(大小3MB)并且命名为“189314-US_ST25.txt”的txt文件提供序列表。此文件的内容以全文引用的方式并入本文中。
发明背景
已证明人单克隆抗体在治疗应用中作为常规大小的IgG、单链或者结构域模块是无价的1,2。尽管成功，但在它们的产生中仍然存在着主要缺点，其依赖于可获得的人材料的特异性选择以及个体产物的后续修饰，或者转基因动物(主要是小鼠)的有限可用性的免疫3。靶抗原限制对转基因小鼠以及大的转基因动物(例如牛)的使用而言普遍是适当的，而新的特异性的开发是受公司控制的4-7。
在20多年前，通过在种系构型中稳定地插入重链基因，开创了在转基因小鼠中人免疫球蛋白(Ig)基因的DNA重排和表达8。虽然在这些早期动物中获得了人抗体库，但是导致人Ig的较高表达水平和专一产生的主要改进结合了两种新策略：在胚胎干(ES)细胞中基因敲除9以及在人工染色体上基因座延伸10。
通过在ES细胞中基因靶向，内源性Ig基因的沉默产生若干失活小鼠系，其没有重排它们的IgH和Igκ基因座的能力或者不产生完全功能性的IgH、Igκ或Igλ产物(总结于3)。近来设计锌指核酸酶(ZFN)用以在Ig基因中产生位点特异性双链断裂，其通过缺失和非同源的DNA修复使得基因破坏。将ZFN质粒注入受精卵产生Ig沉默的大鼠和具有IgH和IgL破坏的兔11-13。
抗体的有效表达需要免疫球蛋白基因座中在各种位置处的功能性调节元件。通过核酸酶消化和对降解的超敏性，已经在多个活性基因附近鉴定增强子序列。超敏位点可以在启动子序列之前，并且它们的活性强度与该DNA序列相关。如果增强子功能存在，则与报告基因的连锁显现出升高的转录(Mundt等人，J.Immunol.，，166,3315[2001]。在IgH基因座中，已经鉴定出两个重要的转录或表达调节子，即在基因座末端的Eμ和3’E(Pettersson等人，Nature，344，165[1990])。在小鼠中，整个3’调节区(包含hs3a、hs1,2、hs3b和hs4)的去除容许正常的早期B细胞发育但是消除了类别转换重组(Vincent-Fabert等人，Blood,116,1895[2010])并且可能防止体细胞超突变的优化(Pruzina等人，Protein Engineering,Design and Selection,1,[2011])。
当使用转基因的人IgH基因时，实现最佳的同种型表达的调节性功能是特别适合的。然而，在许多实验室中，通常仅仅提供hs1,2元件的具有不完全3’E区的转基因构建体，即使在内源性IgH基因座被敲除时，也导致在转基因小鼠中令人失望的表达水平。这可能是为什么迄今为止从基因工程小鼠产生抗原特异性完全人IgG效率低的一个原因。(Lonberg等人，Nature 368,856[1994]；Nicholson等人，J.Immunol.,163,6898[1999]；Davis等人，Cancer Metastasis Rev.18,421[1999]；Pruzina等人，Protein Engineering,Design andSelection,1,[2011]。
在大鼠中，仅对3’E区进行了欠佳地分析。小鼠和大鼠序列的比较不容许鉴定hs4，hs4为更下游的具有附加重要调节序列的关键第4E元件(Chatterjee等人，J.Biol.Chem.,286,29303[2011])。这可能意味着大鼠中并不存在该区，并且也许不如在小鼠中重要，或者在所分析的大鼠基因组序列中可能并不存在该区。
仍然需要使用转基因动物优化产生具有人独特型的免疫球蛋白或抗体的方法和材料，其可用于在范围广泛的疾病领域对人进行治疗。
发明内容
本文公开新型多核苷酸，其包含编码嵌合免疫球蛋白链特别是用于产生转基因动物的嵌合重链的核酸序列。因为缺乏3’增强子的转基因座导致受损的同种型转换和低IgG表达，所以本发明的多核苷酸至少部分地由于包含了此3’增强子而有利地提供优化的表达。因此,在优选的实施方案中，本发明提供包含大鼠3’增强子序列、Ig恒定区基因和至少一个人免疫球蛋白(Ig)连接(J)区基因的嵌合多核苷酸。在一个优选的实施方案中，大鼠3’增强子序列包括如SEQ ID NO:1所示的序列，或其部分。
本文所述的嵌合多核苷酸还可以包含至少一个人可变(V)基因、至少一个多样性(D)基因，或其组合。在一个实施方案中，嵌合多核苷酸的恒定区基因选自由人恒定区基因和大鼠恒定区基因组成的组。在一个优选的实施方案中，恒定区基因是大鼠恒定区基因。在另一个优选的实施方案中，恒定区基因选自由Cμ和Cγ组成的组。
在一个实施方案中，嵌合多核苷酸包含与本文公开的细菌人工染色体(BAC)Annabel(例如SEQ ID NO:10)或其部分基本同源的核酸序列，并且还可以任选地包含至少一个可从BAC6-VH3-11和BAC3分离的人可变Ig基因。在一个优选的实施方案中，本文涵盖的嵌合多核苷酸以5’至3’的顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人Ig可变区，其包含可从BAC6-VH3-11和/或BAC3分离的呈天然构型的人V基因，和(b)人Ig连接区，其包含可从BACAnnabel分离的呈天然构型的人J基因。在另一个实施方案中，如本文公开的嵌合多核苷酸的人Ig可变区、人Ig多样性区、人Ig连接区、Ig恒定区和大鼠3’增强子区中的每一个处于如图1a中所示的相对位置。在另一个实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包括如SEQ IDNO:2所示的序列或其部分或与其基本同源的序列。在另一个实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包括如SEQ ID NO:11所示的序列或其部分或与其基本同源的序列。在另一个实施方案中，如本文公开的嵌合多核苷酸包含重排的V-D-J区，其中所述重排的V-D-J区编码重链可变结构域外显子。
本文还公开编码人κ轻链基因的多核苷酸。在一个实施方案中，如本文公开的多核苷酸具有这样的核酸序列，其包括选自由RP11-1156D9(如SEQ ID NO:3所示)和RP11-1134E24(如SEQ ID NO:4所示)组成的组的核酸序列或者与其基本同源。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸以5’至3’的顺序包含核酸序列(a)和(b)：(a)人Ig可变区，其包含可从细菌人工染色体(BAC)RP11-156D9和/或RP11-1134E24分离的呈天然构型的人V基因；(b)人Ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(BAC)RP11-1134E24和/或RP11-344F17(如SEQ IDNO:5所示)分离的呈天然构型的人J基因。在一个优选的实施方案中，人Ig可变区、人Ig连接区和人Ig恒定区中的每一个处于如图1b中所示的相对位置。在另一个实施方案中，所公开的嵌合多核苷酸具有包括如SEQ ID NO:6所示的序列或其部分或与其基本同源的序列。
本文还提供啮齿动物细胞，其包含本发明的一种或多种多核苷酸。例如，本文提供啮齿动物细胞，其包含如本文公开的多核苷酸，优选包含编码嵌合重链的核酸序列，例如，编码大鼠3’增强子序列、Ig恒定区基因和至少一个人J区基因的核酸序列，并任选地包含与选自由RP11-1156D9、RP11-1134E24及其部分组成的组的核酸序列基本同源的核酸序列。本文涵盖的啮齿动物细胞还可以包含编码功能性轻链的多核苷酸，例如，具有如下核酸序列的多核苷酸，该核酸序列包括选自由图1b所示的序列(如SEQ ID NO:6所示)、图1c所示的序列(如SEQ ID NO:7所示)及其部分组成的组的核酸序列或者与其基本同源。在一个实施方案中，将所述多核苷酸中的一个或多个整合在啮齿动物细胞基因组中。
附图简述
图1：整合的人Ig基因座。(a)嵌合人-大鼠IgH区含有与22个不同且潜在功能性的人VH区段的3个重叠BAC。BAC6-3已经用VH3-11延伸以提供与BAC3的10.6kb重叠，其通过VH6-1与C区BAC Hu-大鼠Annabel重叠11.3kb。后者是嵌合的，并且含有所有的人D和JH区段，随后的具有完全增强子序列的大鼠C区。(b)具有12个Vk和所有Jk的人Igk BAC提供在该Vk区中的约14kb重叠和在Ck中的约40kb以包括KDE。(c)具有17个Vl和所有J-Cl的包括3’增强子的人Igl区，是来自YAC33。
图2：来自3月龄大鼠的淋巴细胞门控的骨髓和脾细胞的流式细胞术分析。对IgM和CD45R(B220)表面染色揭示在HC14和wt大鼠的骨髓和脾中相似数量的未成熟的和成熟的B细胞，而JKO/JKO动物表现出没有B细胞发育。以前向(FSC)对位点(SSC)散布(scatter)作图显示就尺寸和形状而论可比数量的淋巴细胞(门控性)群。将用抗IgG(G1、G2a、G2b、G2c同种型)对脾细胞的表面染色对细胞计数(x102)作图，揭示与wt相比在HC14大鼠中接近正常数量的IgG+表达子(expresser)。在骨髓中，A是指前(pro/pre)B细胞(CD45R+IgM-)，B是指未成熟的B细胞(CD45R+IgM+)。在脾中，A是指过渡型B细胞(CD45R+IgM-)，B是指滤泡性B细胞(CD45R+IgM+)，并且C是指边缘区B细胞(CD45RlowIgM+)。
图3：来自PBL的IgH和IgL转录体的突变变化。单一的(VHDJH)和VL是来自用V组特异性引物：IGHV1、2、3、4和6与通用γCH2反向引物、IGLV2、3和4及反向Cλ引物的组合；以及IGKV1、3、4和5与反向Cκ引物(补充表1)的扩增。鉴定突变的顺式转换(trans-switch)产物的人VH-大鼠Cγ2a(4)和人VH-大鼠Cγ2c(2)。
图4：具有人独特型的大鼠Ig的纯化以及与人和正常大鼠Ig水平的比较。将OmniRat血清和人或大鼠wt对照血清，各100μl，用于IgM/G纯化。(a)用抗IgM基质捕获IgM，在wt大鼠中鉴定出14μg，在OmniRat[HC14(a)和HC14(c)]中鉴定出30μg和10μg。(b)将IgG在蛋白A和蛋白G柱上纯化，其中对于OmniRat产率高达约3mg/ml(蛋白A：HC14(a)1000μg/ml；HC14(b)350μg/ml；wt大鼠350μg/ml；蛋白G：HC14(a)2970μg/ml；HC14(b)280μg/ml；wt大鼠1010μg/ml)。(c)人Igκ和(d)人Igλ分别在抗Igκ和抗Igλ基质上纯化。使用wt大鼠血清，没有获得纯化产物(未示出)。将纯化的Ig，约3μg(通过nano drop测定的浓度)，在4-15％SDS-PAGE上在还原条件下进行分离。将个体OmniRat(8531、8322、8199、8486、8055)、人和wt大鼠血清中的(e)人Igκ和(f)人Igλ水平通过ELISA滴定进行比较。将血清稀释度(1:10、1:100、1:1,000、1:10,000)对通过在492nm下的吸收测得的结合进行作图。匹配的名称/数量是指来自相同大鼠的样本。
详述
本文提供编码重组或人工免疫球蛋白链或基因座的嵌合多核苷酸。如上所述，本文公开的嵌合多核苷酸用于转化啮齿动物以包括人Ig基因，并用于利用此类啮齿动物产生具有人独特型的免疫球蛋白或抗体。
多核苷酸
免疫球蛋白是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。已公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd，或者214个氨基酸)通常包含：由包含一个或多个可变区基因和在NH2-末端的一个或多个连接区基因的外显子编码的可变结构域(约110个氨基酸)，以及由在COOH-末端的κ或λ恒定区基因编码的恒定结构域。全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd，或者446个氨基酸)，相似地包含(1)由包含一个或多个可变区基因、一个或多个多样性区基因和一个或多个连接区基因的外显子编码的可变结构域(约116个氨基酸)，以及(2)上述恒定结构域之一，其包含一个或多个恒定区基因，例如，α、γ、δ、ε或μ(编码约330个氨基酸)。免疫球蛋白重链恒定区基因编码抗体类别即同种型(例如，IgM或IgG1)。
如本文使用的，术语“抗体”是指包含至少一个且优选为两个重(H)链可变结构域(在此缩写为VH)和至少一个且优选为两个轻(L)链可变结构域(在此缩写为VL)的蛋白质。普通技术人员将认识到免疫链的可变结构域在基因区段中被编码，该基因区段必须首先进行体细胞重组以形成编码该可变结构域的完整外显子。进行重排以形成可变结构域的区或基因区段有三种类型：包含可变基因的可变区、包含多样性基因的多样性区(在免疫球蛋白重链的情况中)，以及包含连接基因的连接区。可以将VH和VL结构域进一步细分为被称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区，其中穿插有被称为“骨架区”(“FR”)的更保守区。已经精确确定FR和CDR的范围(参见，Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242；和Chothia等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-17，所述文献在此以引用的方式并入)。每个VH和VL结构域通常由按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文使用的，抗体的抗原结合片段(或者简单地说，“抗体部分”或“片段”)是指全长抗体的保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段(例如，CD3)。
涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341:544-46)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由分开的基因编码，但是可以利用重组方法通过使它们得以制成单个蛋白链的合成连接子将它们连接，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science 242:423-26；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-83)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内。利用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式对片段进行实用性筛选。
抗体还可以包括重和/或轻链恒定结构域，从而分别形成重和轻免疫球蛋白链。在一个实施方案中，抗体是两条重免疫球蛋白链和两条轻免疫球蛋白链的四聚体，其中该重和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键互相连接。重链恒定结构域由三个基因区段CH1、CH2和CH3组成。轻链恒定结构域由一个基因CL组成。重链和/或轻链的可变结构域含有与抗原相互作用的结合结构域。该抗体的恒定结构域通常介导抗体与包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)在内的宿主组织或因子的结合。
所谓编码人工免疫球蛋白基因座或人工免疫球蛋白链的多核苷酸是指重组多核苷酸，其包含多个免疫球蛋白区，例如，包含V基因的可变(V)区或基因区段、包含J基因的连接(J)基因区或基因区段、在重链基因座的情况中包含D基因的多样性(D)区或基因区段，和/或包含至少一个C基因的至少一个恒定(C)区。优选地，可变结构域的每个区，例如，V、D或J区，包含或跨越至少两个相同类型的基因。例如，如本文使用的可变区包含至少两个可变基因，连接区包含至少两个连接基因，并且多样性区包含两个多样性基因。恒定区可以包含仅仅一个恒定基因，例如κ基因或λ基因，或者多个基因，例如，CH1、CH2和CH3。
如本文使用的，“增强子序列”或“增强子”是指通过核酸酶消化和对降解的超敏性，已经在多个活性基因附近鉴定的序列。超敏位点可以在启动子序列之前，并且它们的活性强度与该DNA序列相关。如果增强子功能存在，则与报告基因的连锁显现出升高的转录(Mundt等人，J.Immunol.,166,3315[2001])。在IgH基因座中，已经鉴定出两个重要的转录或表达调节物，即在基因座末端的Eμ和3’E(Pettersson等人，Nature,344,165[1990])。在小鼠中，整个3’调节区(含有hs3a、hs1,2、hs3b和hs4)的去除容许正常的早期B细胞发育但是消除了类别转换重组(Vincent-Fabert等人，Blood,116,1895[2010])并且可能阻碍体细胞超突变的优化(Pruzina等人，Protein Engineering,Design and Selection,1,[2011])。当使用转基因的人IgH基因时，实现最佳的同种型表达的调节功能性是特别适合的。具有不完全3’E区的通常仅提供hs1,2元件的转基因构建体，即使在内源性IgH基因座被敲除时，也导致在转基因小鼠中令人失望的表达水平。因此，从在过去20年中生产的构建体中已经分离出仅仅几个抗原特异性完全人IgG(Lonberg等人，Nature 368,856[1994]；Nicholson等人，J.Immunol.,163,6898[1999]；Davis等人，Cancer Metastasis Rev.18,421[1999]；Pruzina等人，Protein Engineering,Design and Selection,1,[2011])。在大鼠IgH基因座中，仅对3’E区进行了欠佳地分析。小鼠和大鼠序列的比较不容许鉴定hs4，hs4为更下游的具有附加重要调节序列的关键第4元件(Chatterjee等人，J.Biol.Chem.,286,29303[2011])。因为缺乏3’增强子的嵌合多核苷酸导致受损的同种型转换和低IgG表达，所述本发明的多核苷酸至少部分地由于包含了此大鼠3’增强子而有利地提供优化的表达。在一个实施方案中，大鼠3’增强子具有包含如SEQ ID NO:1所示的序列或其部分或与其基本同源的序列。
如本文使用的，具有包含第二序列(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2等)的一部分(例如小于整体)或与其基本同源的序列的多核苷酸优选地保留该第二序列的生物活性(例如，保留3’增强子的生物活性以提供免疫球蛋白的优化表达和/或同种型转换，能够重排以提供人源化嵌合重链等)。在一个实施方案中，包含含有SEQ ID NO:1的一部分或与其基本同源的序列的核酸包含至少8kB，优选至少10kB的与SEQ ID NO:1基本同源的连续核酸。
如本文使用的，“人工Ig基因座”可以指未重排、部分重排或者重排的多核苷酸(例如，在重链的情况中包含V-、D-和/或J区的序列，或者在轻链的情况中包含V-和/或J区的序列，以及对于重链和轻链之一或两者，任选地包含恒定区的序列)。人工Ig基因座包括人工Ig轻链基因座和人工Ig重链基因座。在一个实施方案中，本发明的人工免疫球蛋白基因座是功能性的并且能够重排并产生免疫球蛋白链的库。在一个优选的实施方案中，本文公开的多核苷酸的可变结构域或其部分包含呈天然构型的基因，即，人Ig基因区段的天然存在的序列、人Ig基因区段的天然存在的序列的简并形式，以及编码与由人Ig基因区段的天然存在的序列编码的多肽基本相同的多肽序列的合成序列。在另一个优选的实施方案中，该多核苷酸包含在人中发现的呈天然构型的可变结构域或其部分。例如，编码如本文公开的人工Ig重链的多核苷酸可以包含呈天然构型的至少两个人V基因、至少两个D基因、至少两个J基因或其组合。
在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含非人C区基因并且能够产生包括具有非人C区的嵌合免疫球蛋白的免疫球蛋白库。在一个实施方案中，人工Ig基因座包含人C区基因并且能够产生包括具有人C区的免疫球蛋白的免疫球蛋白库。在一个实施方案中，人工Ig基因座包含“人工恒定区基因”，其是指组成源于人和非人恒定区基因的核苷酸序列的恒定区基因。例如，示例性人工C恒定区基因是编码人IgG CH1结构域和大鼠IgG CH2和CH3结构域的恒定区基因。
在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含3’增强子序列，其包括hs1,2、hs3a、hs3b以及hs3b的下游序列(500-2500nt)。在转基因动物中，包含从Calpha至3’hs3b的全长约30kb 3’E区的人工基因座导致高水平IgG表达、广泛超突变以及大量的具有高(pM)亲和力的抗原特异性杂交瘤。然而，较短的增强子序列减低Ig表达。
在一个优选的实施方案中,人工Ig基因座包含图1a中所示的3’增强子序列。此序列源于大鼠Ig重链基因座并且含有从Calapha至3’hs3b的3’区的约30kb。大鼠3’增强子序列的序列如SEQ ID NO:1所示。在另一个实施方案中，人工Ig基因座包含含有如SEQ ID NO:1所示的序列或其一部分或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，人工Ig重链基因座缺乏CH1或者容许所得的免疫球蛋白包围典型的免疫球蛋白的等效序列：分子伴侣联合。此类人工基因座在缺乏功能性Ig轻链基因座的转基因动物中提供仅重链抗体的产生，并因此不表达功能性Ig轻链。将此类人工Ig重链基因座用于在本文涵盖的方法中以产生缺乏功能性Ig轻链基因座并且包含人工Ig重链基因座的转基因动物，该动物能够产生仅重链抗体。或者，可以将人工Ig基因座原位操作以破坏CH1或等效区，并产生人工Ig重链基因座，其提供仅重链抗体的产生。关于在轻链缺陷小鼠中仅重链抗体的产生，参见例如Zou等人，JEM,204:3271-3283,2007。
所谓“人独特型”是指存在于由免疫球蛋白V-基因区段编码的人抗体上的多肽序列。如本文使用的，术语“人独特型”包括人抗体的天然存在的序列，以及与在天然存在的人抗体中发现的多肽基本相同的合成序列。所谓“基本”是指氨基酸序列同一性的程度是至少约85％-95％。优选地，氨基酸序列同一性的程度大于90％，更优选大于95％。
所谓“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”是指包含人免疫球蛋白多肽序列的一部分(或者由人Ig基因区段编码的多肽序列)和非人免疫球蛋白多肽序列的一部分的免疫球蛋白分子。本发明的嵌合免疫球蛋白分子是具有非人Fc-区或者人工Fc-区和人独特型的免疫球蛋白。可从已经被工程化以产生嵌合免疫球蛋白分子的本发明的动物中分离此类免疫球蛋白。
所谓“人工Fc-区”是指由人工恒定区基因编码的Fc-区。
如本文使用的，术语“Ig基因区段”是指编码Ig分子的各个部分的DNA的区，其存在于非人动物和人的种系中，并且使其在B细胞中结合在一起以形成重排的Ig基因。因此，如本文使用的Ig基因区段包括V基因区段、D基因区段、J基因区段和C基因区段。
如本文使用的，术语“人Ig基因区段”包括：人Ig基因区段的天然存在的序列、人Ig基因区段的天然存在的序列的简并形式，以及合成序列，该合成序列编码与由人Ig基因区段的天然存在的序列编码的多肽基本相同的多肽序列。所谓“基本”是指氨基酸序列同一性的程度是至少约85％-95％。优选地，氨基酸序列同一性的程度大于90％，更优选大于95％。
本发明涉及的多核苷酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分地合成的。除非上下文另外要求，提及如本文所述的核苷酸序列涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵盖具有其中U取代T的指定序列的RNA分子。
对两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(术语在此可互换地使用)的计算按如下进行。为了最佳的比较目的，将序列比对(例如，为了最佳的比对，可以将空位引入第一和第二氨基酸或核酸序列之一或二者中，并且为了比较目的可以不考虑非同源性序列)。在一个优选的实施方案中，为比较目的而比对的参考序列的长度是该参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少60％，并且甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则在该位置处分子是相同的(如在此使用的，氨基酸或核酸“同一性”相当于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑为了两个序列的最佳比对需要引入的空位的数量以及每个空位的长度。
两个序列之间的序列比较以及序列同一性百分比的确定可以利用数学算法完成。在一个优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比是利用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-53)算法进行确定的，所述算法已经被并入GCG软件包中的GAP程序中(在gcg.com可在线获得)，该程序使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一个优选的实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是利用GCG软件包中的GAP程序进行确定(可在www.gcg.com获得)的，该程序使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组(并且若操作者不确定应该应用什么参数来确定分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制内，则应采用该参数组)是具有空位罚分12、空位延伸罚分4以及移码空位罚分5的Blossum 62记分矩阵。两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比还可以利用Meyers和Miller的算法((1989)CABIOS 4:11-17)进行确定，所述算法其已经被并入ALIGN程序(2.0版)中，该程序利用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。
人工Ig基因座
本发明还涉及人工Ig基因座以及它们在制备能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物中的用途。每个人工Ig基因座包含多个免疫球蛋白基因区段，其包括至少一个V区基因区段、一个或多个J基因区段、在重链基因座的情况中一个或多个D基因区段，以及一个或多个恒定区基因。在本发明中，V基因区段中的至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列。因此，此类转基因动物具有产生包括具有人独特型的抗体的免疫球蛋白分子的多样化库的能力。在重链基因座中，可以将人或非人源的D-基因区段包括在人工Ig基因座中。此类基因座中的基因区段在未重排的构型(或者“种系构型”)中或者在部分或完全重排的构型中相对于彼此并置。人工Ig基因座具有在受试动物中进行基因重排(若该基因区段没有完全重排)的能力，由此产生具有人独特型的免疫球蛋白的多样化库。
调节元件如启动子、增强子、转换区、重组信号等可以为人或非人起源。为了赋予人工基因座功能性，需要的是该元件在相关的动物物种中可操作。本文更详细地描述优选的调节元件。
在一个方面，本发明提供转基因构建体，其含有能够在宿主动物中进行基因重排的人工重链基因座，由此产生具有人独特型的重链的多样化库。该转基因的人工重链基因座含有具有至少一个人V基因区段的V-区。优选地，该V-区包括至少约5-100个人重链V(或者“VH”)基因区段。如上所述，人VH区段涵盖：人VH基因区段的天然存在的序列、人VH基因区段的天然存在的序列的简并形式，以及编码与人重链V结构域域多肽基本(即，至少约85％-95％)相同的多肽序列的合成序列。
在一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有至少一个或几个大鼠恒定区基因，例如，Cδ、Cμ和Cγ(包括Cγ子类中的任一个)。
在另一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有人工恒定区基因。在一个优选的实施方案中，此类人工恒定区基因编码人CH1结构域和大鼠CH2CH3结构域，或者人CH1和大鼠CH2、CH3和CH4结构域。具有人CH1结构域的杂交重链与完全人轻链有效地配对。
在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含3’增强子序列，包括hs1,2、hs3a、hs3b以及介于大鼠Calpha和3’hs3b之间的序列。
在另一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有缺乏CH1结构域的人工恒定区基因。在一个优选的实施方案中，此类人工恒定区基因编码缺乏CH1结构域但是包含CH2和CH3或者CH1、CH2、CH3和CH4结构域的截短的IgM和/或IgG。缺乏CH1结构域的重链不能与Ig轻链有效地配对并形成仅重链抗体。
在另一方面，本发明提供转基因构建体，其含有能够在宿主动物中进行基因重排的人工轻链基因座，由此产生具有人独特型的轻链的多样化库。转基因的人工轻链基因座含有具有至少一个人V基因区段的V-区，例如，具有至少一个人VL基因和/或至少一个重排的人VJ区段的V-区。优选地，该V-区包括至少约5-100个人轻链V(或“VL”)基因区段。一致地，人VL区段涵盖：人VL基因区段的天然存在的序列、人VL基因区段的天然存在的序列的简并形式以及编码与人轻链V结构域多肽基本(即，至少约85％-95％)相同的多肽序列的合成序列。在一个实施方案中，人工轻链Ig基因座具有C-区，其具有至少一个大鼠C基因(例如，大鼠Cλ或Cκ)。
本发明的另一方面涉及制备含有人工Ig基因座的转基因载体的方法。此类方法包括：分离Ig基因座或其片段，并将所述基因座或其片段与包含编码人V区元件的序列的一个或几个DNA片段组合。按照保留该基因座在受试动物中进行有效的基因重排的能力这样的方式，通过连接或同源性重组而将Ig基因区段插入人工Ig基因座或其部分中。
优选地，通过筛选从质粒、粘粒、YAC或BAC等的基因组DNA制备的质粒、粘粒、YAC或BAC等的文库来分离非人Ig基因座。YAC克隆可以携带多达2兆碱基的DNA片段，因此整个动物重链基因座或其大部分可以在一个YAC克隆中进行分离，或者进行重建以被包含在一个YAC克隆中。BAC克隆能够携带较小尺寸(约50-500kb)的DNA片段。然而，可以将含有Ig基因座的重叠片段的多个BAC克隆单独改变，并随后一起注入动物受体细胞中，其中重叠片段在受体动物细胞中重组以产生连续的Ig基因座。
通过多种方法，包括DNA片段的连接或者通过同源性重组的DNA片段的插入，可以将人Ig基因区段整合到载体(例如，BAC克隆)上的Ig基因座中。以这样一种方式进行人Ig基因区段的整合，即将该人Ig基因区段可操作地连接到转基因中的宿主动物序列，以产生功能性人源化Ig基因座，即，能够进行导致产生具有人独特型的抗体的多样化库的基因重排的Ig基因座。同源性重组可以在细菌、酵母以及其他具有高频率同源性重组事件的细胞中进行。可以容易地从细胞中分离工程化的YAC和BAC，并将其用于制备转基因动物
包含人工Ig基因座并能够产生具有人独特型的抗体的啮齿动物卵母细胞和转基因动物
在一个方面，本发明提供能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，以及制备所述转基因动物的方法。
所用的转基因动物选自啮齿动物(例如，大鼠、仓鼠、小鼠和豚鼠)。
在本发明中用于人源化抗体产生的转基因动物在内源性Ig基因座中携带种系突变。在一个优选的实施方案中，对于突变的内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链基因，转基因动物是纯合的。此外，这些动物携带至少一个人工Ig基因座，所述人工Ig基因座是功能性的并且能够在转基因动物中产生免疫球蛋白分子的库。在本发明中所用的人工Ig基因座包括至少一个人V基因区段。
在一个优选的实施方案中，转基因动物携带至少一个人工Ig重链基因座和至少一个人工Ig轻链基因座，其每个都是功能性的并且能够在转基因动物中产生免疫球蛋白分子的库，该免疫球蛋白分子的库包括具有人独特型的抗体。在一个实施方案中，使用包括至少一个非人C基因的人工基因座，并且提供能够产生具有人独特型和非人恒定区的嵌合抗体的动物。在一个实施方案中，使用包括至少一个人C基因的人工基因座，并且提供能够产生具有人独特型和人恒定区的抗体的动物。
在另一个优选的实施方案中，转基因动物携带至少一个人工Ig重链基因座，并且缺乏功能性Ig轻链基因座。此类动物可用于产生仅重链抗体。
此类转基因动物的产生包括将一个或多个人工重链Ig基因座和一个或多个人工轻链Ig基因座整合到具有至少一个内源性Ig基因座的转基因动物的基因组中，通过一个或多个大范围核酸酶的作用，已经或将会使所述内源性Ig基因座失活。优选地，对于内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链，转基因动物是无合子的(nullizygous)，因此不能产生内源性免疫球蛋白。无论染色体位置如何，本发明的人工Ig基因座具有进行基因重排并由此产生免疫球蛋白分子的多样化库的能力。具有进行基因重排的能力的Ig基因座在本文也被称为“功能性”Ig基因座，并且具有由功能性Ig基因座产生的多样性的抗体在本文也被称为“功能性”抗体或者抗体的“功能性”库。
用来产生此类转基因动物的人工基因座各包括多个免疫球蛋白基因区段，其包括至少一个V区基因区段、一个或多个J基因区段、在重链基因座的情况中一个或多个D基因区段，以及一个或多个恒定区基因。在本发明中，V基因区段中的至少一个编码种系或超突变的人V-区氨基酸序列。因此，此类转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样化库的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型的抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个非人C区基因区段。因此，此类转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样化库的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型的嵌合抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个人C区基因区段。因此，此类转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样化库的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型和人恒定区的抗体。
在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个人工恒定区基因。例如，示例性的人工C恒定区基因是编码人IgG CH1结构域和大鼠IgG CH2和CH3结构域的恒定区基因。因此，此类转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样性库的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型以及包含人和非人组分两者的人工恒定区的抗体。
将含有人工Ig基因座的转基因载体引入受体细胞或细胞中，然后通过随机整合或者通过靶向整合，整合到该受体细胞或细胞的基因组中。
对于随机整合，可通过标准的转基因技术将含有人工Ig基因座的转基因载体引入受体细胞中。例如，可以将转基因载体直接注入受精卵母细胞的原核中。也可以通过在卵母细胞受精之前精子与转基因载体的共孵育，将转基因载体引入。转基因动物可以从受精的卵母细胞发育。引入转基因载体的另一种方式是通过转染胚胎干细胞或其他多能细胞(例如原始生殖细胞)而后将经基因修饰的细胞注入发育中的胚胎中。或者，可以将转基因载体(裸露的或者与促进剂(facilitating reagent)结合)直接注入发育中的胚胎中。最后，从该胚胎产生嵌合转基因动物，该胚胎含有被整合在转基因动物的至少一些体细胞的基因组中的人工Ig转基因。在另一个实施方案中，将转基因载体引入细胞的基因组中并通过核移植克隆从转染的细胞获得动物。
在一个优选的实施方案中，将含有人工Ig基因座的转基因随机地整合到受体细胞(例如受精的卵母细胞或者发育中的胚胎)的基因组中。在一个优选的实施方案中，获得这样的后代，其对于内源性Ig重链和/或Ig轻链是无合子的，因此不能产生内源性免疫球蛋白而能够产生转基因免疫球蛋白。
对于靶向整合，可以将转基因载体引入适当的受体细胞中，例如胚胎干细胞、其他多能细胞或者已经分化的体细胞。而后，可以通过标准方法对已将转基因整合到动物基因组中的细胞进行选择。然后可以将选定的细胞与去核的核移植单位细胞(例如卵母细胞或胚胎干细胞)进行融合，所述核移植单位细胞是全能的并能够形成功能性新生儿。融合是按照得到确认的常规技术进行的。参见，例如，Cibelli等人，Science(1998)280:1256；Zhou等人Science(2003)301:1179。卵母细胞的去核和核移植还可以利用注射吸量管通过显微外科手术实施。(参见，例如，Wakayama等人，Nature(1998)394:369。)然后将所得的细胞在适当的培养基中培养，并且移植到同步受体中以产生转基因动物。或者，可以将选定的经基因修饰的细胞注入到发育中的胚胎中，所述发育中的胚胎随后发育成嵌合动物。
在一个实施方案中，大范围核酸酶用来使在靶点通过双链DNA裂解进行的同源性重组的频率升高。为了整合到特异性位点中，可以使用位点特异性大范围核酸酶。在一个实施方案中，靶向内源性Ig基因座的大范围核酸酶用来使同源性重组和用人工Ig基因座或其部分替代内源性Ig基因座或其部分的频率升高。在一个实施方案中，转基因动物缺乏功能性Ig轻链基因座并且包含人工Ig重链基因座。
具有人独特型的免疫球蛋白
一旦制得能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，通过用抗原使动物免疫，可以容易地获得针对该抗原的免疫球蛋白和抗体制剂。如本文使用的，“多克隆抗血清组合物”包括亲和纯化的多克隆抗体制剂。
多种抗原可以用来使转基因动物免疫。此类抗原包括但不限于活的、减毒的或死亡的微生物，例如病毒和单细胞生物(例如细菌和真菌)，微生物的片段，或者从微生物分离的抗原性分子。
用于使动物免疫的优选的细菌抗原包括：从金黄色葡萄球菌纯化的抗原例如荚膜多糖类型5和8、毒力因子的重组形式例如α-毒素、粘连素结合蛋白、胶原结合蛋白以及纤连蛋白结合蛋白。优选的细菌抗原还包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的减毒形式，或者来自这些细菌细胞的培养上清液。可用于免疫的其他细菌抗原包括：纯化的脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖和/或外膜蛋白的重组形式、纤连蛋白结合蛋白、内毒素以及来自铜绿假单胞菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯菌的外毒素。
用于产生针对真菌的抗体的优选的抗原包括真菌或其外膜蛋白的减毒形式，所述真菌包括但不限于白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和新型隐球菌。
用于免疫以产生针对病毒的抗体的优选的抗原包括包膜蛋白以及病毒的减毒形式，所述病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(特别是F-蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。
通过用分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系以及肿瘤相关的抗原使转基因动物免疫，可以产生对癌症特异的抗体，所述肿瘤相关的抗原包括但不限于，Her-2-neu抗原(针对该抗原的抗体用于治疗乳腺癌)；CD20、CD22和CD53抗原(针对该抗原的抗体用于治疗B细胞淋巴瘤)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)(针对该抗原的抗体用于治疗前列腺癌)，以及17-1A分子(针对该分子的抗体用于治疗结肠癌)。
可以将抗原以任何方便的方式在有或没有佐剂的情况下施用至转基因动物，并且可以按照预定的时间表进行施用。
为了制备单克隆抗体，将脾细胞从免疫的转基因动物中分离并用在与转化细胞系的细胞融合中以用于产生杂交瘤，或者将编码抗体的cDNA通过标准分子生物学技术克隆并在转染细胞中表达。制备单克隆抗体的方法在本领域中是得到确认的。参见，例如，欧洲专利申请0 583 980 A1(“Method For Generating Monoclonal Antibodies FromRabbits”)、美国专利号4,977,081(“Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And SecretionProducts Thereof”)、WO 97/16537(“Stable Chicken B-cell Line And Method of UseThereof”)以及EP 0 491 057 B1(“Hybridoma Which Produces Avian SpecificImmunoglobulin G”)，所述专利的公开内容以引用的方式并入本文中。对于从克隆的cDNA分子体外产生单克隆抗体，Andris-Widhopf等人，“Methods for the generation ofchicken monoclonal antibody fragments by phage display”,J Immunol Methods242:159(2000)和Burton,D.R.,“Phage display”,Immunotechnology1:87(1995)已经进行了描述。
一旦已经产生具有人独特型的嵌合单克隆抗体，利用标准的分子生物学技术，可以容易地将此类嵌合抗体转变成完全人抗体。完全人单克隆抗体在人中不是免疫原性的，并且适合用于人受试者的治疗性治疗。
本发明的抗体包括仅重链抗体
在一个实施方案中，用抗原使缺乏功能性Ig轻链基因座并包含人工重链基因座的转基因动物免疫以产生与抗原特异性结合的仅重链抗体。
在一个实施方案中，本发明提供源于此类动物的产生单克隆抗体的细胞，以及从中获得的核酸。还提供从中获得的杂交瘤。还提供从中获得的完全仅人重链抗体以及编码核酸。
关于仅重链抗体的教义可在现有技术找到。例如，参见PCT公布WO02085944、WO02085945、WO2006008548和WO2007096779。还参见US 5,840,526；US 5,874,541；US 6,005,079；US 6,765,087；US 5,800,988；EP 1589107；WO 9734103；和US 6,015,695。
药物组合物
在本发明的进一步的实施方案中，将经纯化的单克隆或多克隆抗体与适合于向患者施用的适当的药物载体混合，从而提供药物组合物。
用本发明的药物组合物治疗的患者优选为哺乳动物，更优选为人，但是兽医用途也涵盖在内。
可用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体可以是任何及所有的溶剂、分散介质、等渗剂等。除非对受体或对包含在其中的抗体的治疗有效性有损，任何常规的介质、试剂、稀释剂或载体在本发明的药物组合物中的使用是适当的。
所述载体可以是液体、半固体(例如糊剂)或者固体载体。载体的实例包括油类、水、盐溶液、醇、糖、凝胶、脂类、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、填充剂、包衣、防腐剂等，或其组合。
治疗方法
在本发明的另一方面，提供用于治疗脊椎动物，优选为哺乳动物，优选为灵长类动物的疾病的方法，其中人受试者为一个特别优选的实施方案，所述方法是通过施用适合于治疗所述疾病的本发明的纯化的抗体组合物进行的。
所述抗体组合物可以用来结合并且中和或调节人体组织中的抗原性实体，该抗原性实体造成或导致疾病或者引起不期望的或异常的免疫应答。本文将“抗原性实体”定义为涵盖任何可溶的或者细胞表面结合的分子，包括蛋白质以及细胞或者引起传染性疾病的生物，或者至少能够与抗体结合并且优选地也能够刺激免疫应答的试剂。
作为单一疗法或者与化疗法联合，针对传染物的抗体组合物的施用导致传染性颗粒的消除。抗体的单次施用使传染性颗粒的数量通常降低10至100倍，更普遍地大于1000倍。相似地，在患有恶性疾病的患者中，作为单一疗法或者与化疗法联合使用的抗体疗法使恶性细胞的数量通常降低10至100倍，或者大于1000倍。治疗可以在延长的时间量中重复以确保传染性颗粒、恶性细胞等的完全消除。在一些情况中，在不存在可检测量的传染性颗粒或不期望的细胞的情况下，用抗体制剂治疗可以继续延长的时间。
相似地，对于免疫应答的调节，抗体疗法的使用可以由治疗性抗体的单次或多次施用组成。在不存在任何疾病症状的情况下，治疗可以继续延长的时间。
本主题治疗可以以足以抑制传染性疾病或恶性疾病的剂量与化疗法联用。在自身免疫性疾病患者或移植受者中，抗体疗法可以以足以抑制免疫反应的剂量与免疫抑制疗法联用。
实施例
在对人免疫球蛋白(Ig)基因座为转基因的小鼠中，完全人抗体的递送的次优效能已归因于人膜IgH链的恒定区和小鼠细胞信号传导机制之间不完善的相互作用。为了避免此问题，我们在此描述人源化大鼠株(OmniRatTM)，其携带嵌合人/大鼠IgH基因座[包含22个人VH、全部的人D和JH区段，呈天然构型但连接到大鼠CH基因座]连同完全人轻链基因座[12个连接至Jκ-Cκ的Vκ和16个连接至Jλ-Cλ的Vλ]。通过设计者锌指核酸酶使内源性大鼠Ig基因座沉默。在免疫后，在产生高亲和血清IgG方面，OmniRat与正常大鼠同样有效地表现。包含具有亚纳摩尔(sub-nanomolar)抗原亲和力的完全人可变区并且携带广泛的体细胞突变的单克隆抗体可以容易地获得–与来自正常大鼠的常规抗体的产量相似。
材料和方法
在YAC和BAC上修饰的人Ig基因座的构建
a)IgH基因座
人IgH V基因被2个BAC覆盖：含有跨越从VH4-39至VH3-23随后VH3-11的真实区(authentic region)的BAC6-VH3-11(从可商购获得的BAC克隆3054M17CITB进行修饰)以及含有跨越从VH3-11至VH6-1的真实区的BAC3(811L16RPCI-11)。被称为Annabel的BAC是通过将大鼠CH区基因紧邻连接到人VH6-1-Ds-JHs区的下游进行构建的(图1)。含有人或大鼠IgH基因座的部分的所有BAC克隆购自Invitrogen。
将BAC6-VH3-11和Annabel二者最初在酿酒酵母中构建为环形YAC(cYAC)并进一步核查并作为BAC在大肠杆菌中供养。构建细节可以在www.ratltd.net查到。
不同于YAC，BAC质粒制备物产生大量期望的DNA。为了将线性的YAC转变成cYAC或者用重叠端将DNA片段组装成酿酒酵母中的单个cYAC，其还可以作为BAC在大肠杆菌中供养，构建了两个自我复制的酿酒酵母/大肠杆菌穿梭载体pBelo-CEN-URA和pBelo-CEN-HYG。简言之，将酿酒酵母CEN4作为AvrII片段从pYAC-RC39切出并连接到SpeI–线性化pAP59940。所得的质粒含有克隆在酿酒酵母URA3和潮霉素抗性表达盒(HygR)之间的CEN4。从该质粒，将含有URA3随后CEN4的ApaLI–BamHI片段或者含有CEN4随后HygR的PmlI–SphI片段切出，并连接到ApaLI和BamHI或者HpaI和SphI双重消化的pBACBelo11(New England Biolabs)从而得到pBelo-CEN-URA和pBelo-CEN-HYG。
为了构建BAC6-VH3-11，首先将两个片段115kb NotI-PmeI和110kb RsrII-SgrAI从BAC克隆3054M17CITB切出。前一片段的3’端与后者的5’端重叠22kb。将NotI-PmeI片段连接到含有来自pYAC-RC的酿酒酵母CEN4以及TRP1/ARS1的NotI-BamHI YAC臂，并将RsrII-SgrAI片段连接到含有也来自pYAC-RC的酿酒酵母URA3的SgrAI-BamHI YAC臂。随后，通过原生质球转化，将连接混合物转化到酿酒酵母AB1380细胞41，并且选择URA+TRP+酵母克隆。含有从人VH4-39至VH3-23的线性区的被称为YAC6的克隆，通过Southern印迹分析进行确认。通过在VH3-23的3’添加10.6kb片段并转变成cYAC，将YAC6进一步延伸。该10.6kb延伸含有人VH3-11并且也发生在BAC3的5’端。为了YAC6的修饰，我们构建了pBeloHYG-YAC6+BAC3(5’)。简言之，通过PCR制备具有重叠端的3个片段：1)‘填充(stuff)’片段，其含有由HpaI位点侧接的酿酒酵母TRP1-ARS1，其中在YAC6中5’尾匹配VH4-39的上游序列并且3’尾匹配VH3-23的下游(利用长寡核苷酸561和562以及pYAC-RC作为模板)，2)10.6kb延伸片段，其具有如上所述的匹配VH3-23的下游序列的5’尾和在它的3’端的单一AscI位点(利用长寡核苷酸570和412以及人基因组DNA作为模板)，以及3)pBelo-CEN-HYG载体，其具有下游与匹配10.6延伸片段的3’端的同源尾连接的CEN4以及上游与匹配如上所述的VH4-39的上游序列的尾连接的HygR(利用长寡核苷酸414和566以及pBelo-CEN-HYG作为模板)。随后，通过与原生质球转化相关的同源性重组，将3个PCR片段组装进在酿酒酵母中赋予HYGR和TRP+的小cYAC，并将此cYAC进一步转变成BAC pBeloHYG-YAC6+BAC3(5’)。最后，将HpaI消化的pBeloHYG-YAC6+BAC3(5’)用来转化携带YAC6的酵母细胞，并通过同源性重组产生仅赋予HYGR的cYAC BAC6-VH3-11。通过转化，参见以下，将此cYAC作为BAC引入大肠杆菌中。将BAC6-VH3-11中的人VH基因切出为约182kb AsiSI(天然存在于HygR中)–AscI片段，并将BAC3中的VH基因切出为约173kb NotI-片段(图1顶部)。
对于C区与VH重叠的组装，必须将人VH6-1-D-JH区紧邻随后为大鼠C的最后JH的下游的大鼠基因组序列连接从而得到cYAC/BAC。为了实现这一点，制备5个重叠限制和PCR片段；人VH6-15’的6.1kb片段(利用寡核苷酸383和384以及人基因组DNA作为模板)；含有从BAC1(RP11645E6)切出的人VH6-1-D-JH区的约78kb PvuI-PacI片段；将人JH6与紧邻最后JH的下游的大鼠基因组序列连接并含有大鼠μ编码序列的部分(利用寡核苷酸488和346以及大鼠基因组DNA作为模板)的8.7kb片段；约52kb NotI-PmeI片段，该片段含有从BAC M5(CH230-408M5)切出的真实大鼠μ、δ和γ2c区；以及具有在下游与匹配大鼠γ2c区的3’端的同源尾连接的URA3以及在上游与匹配所述人VH6-1的5’区的尾连接的CEN4的pBelo-CEN-URA载体(利用长寡核苷酸385和550以及pBelo-CEN-URA作为模板)。在酿酒酵母中通过同源性重组的正确组装是通过PCR进行分析的，并将来自正确克隆的纯化的cYAC转变成大肠杆菌中的BAC。
对于Annabel的组装，使用以上含有人VH6-1-D-JH、随后的真实大鼠μ、δ和γ2c区的cYAC/BAC的部分，以及PCR片段。五个重叠片段含有如上所述的在人VH6-1的5’端处的6.1kb片段；包含人VH6-1-D-JH且其后紧随最后JH的下游大鼠基因组序列并含有大鼠Cμ的部分的约83kb SpeI片段；将大鼠μ的3’端与大鼠γ1的5’端连接的5.2kb片段(利用寡核苷酸490和534以及大鼠基因组DNA作为模板)；含有从BAC I8(CH230-162I08)切出的真实大鼠γ1、γ2b、ε、α和3’E IgH增强子区的约118kb NotI-SgrAI片段；以及具有在下游与匹配大鼠3’E的3’端的同源尾连接的URA3以及在上游与匹配上述人VH6-1的5’端的尾连接的CEN4的pBelo-CEN-URA载体。在BAC3和Annabel中的人VH6-1区之间有10.3kb重叠。可以将随后为大鼠CH区的人VH6-1-D-JH与Annabel中的酿酒酵母URA3一起切出为单个约183kb NotI-片段(参见图1顶部)。
通过限制分析和部分测序对BAC6-VH3-11、BAC3和Annabel全面检查它们的真实性。
b)IgL基因座
通过重组组装VλYAC与含有粘粒的3Cλ，获得在约410kb YAC上的人Igλ基因座25。重排和表达在源于含有完全人IgλYAC的一个拷贝的ES细胞的转基因小鼠中进行验证38。除去Vλ3-275’的约100kb区，通过产生环形YAC，将此IgλYAC缩短。将载体pYAC-RC用ClaI和BspEI消化以除去URA3，并与来自含有HYG的pAP 599的ClaI/NgoMIV片段连接。含有来自新载体(pYAC-RC-HYG)的酵母着丝粒和潮霉素标记基因的区的PCR是用具有与Vλ3-27的5’区同源的5’端(引物276)并在YAC臂中的ADE2标记基因内(引物275)的引物实施的。利用高效乙酸锂转化方法42并在含有潮霉素的YPD板上选择，将PCR片段(3.8kb)整合到IgλYAC中。从克隆(Epicentre MasterPure酵母DNA纯化试剂盒)制备DNA，并利用以下寡核苷酸：243+278和Hyg端R+238，通过PCR分析正确的连接。制备塞子(Plug)43，并通过PFGE(0.8％琼脂糖(PFC)(Biorad)凝胶[6V/cm，60秒持续10小时和10秒持续10小时的脉冲时间,8℃)除去酵母染色体，使环形酵母人工染色体困留在琼脂糖块中44。将块除去并用NruI消化。简言之，将块用过量的限制酶缓冲液以1X最终浓度在冰上预孵育1小时。将过量的缓冲液除去，只留下足够覆盖塞子的缓冲液，将限制酶添加至100U/ml的最终浓度，并将试管在37℃下孵育4-5小时。通过PFGE使线性化的YAC跑出块，从凝胶中以条带切出，并如下所述进行纯化。
对于人Igκ基因座，选择3个BAC(RP11-344F17、RP11-1134E24和RP11-156D9，Invitrogen)，其覆盖从5’Vκ1-17至3’KDE45大于300kb的区。在消化和序列分析中，鉴定三个重叠片段：从Vκ1-17至Vκ3-7(150kb NotI有约14kb重叠)，从Vκ3-7至Cκ的3’(158kb NotI有约40kb重叠)以及从Cκ至KDE的3’(55kb PacI有40kb重叠)。重叠区在被共注入卵母细胞中时通常可有利于连接整合24。
凝胶分析和DNA纯化
通过限制消化和在常规0.7％琼脂糖凝胶上分离，对纯化的YAC和BAC DNA进行分析46。利用在0.5％TBE中的0.8％PFC Agaraose，以2-20秒转换时间持续16h，6V/cm，10mA，在80C通过PFGE(Biorad Chef MapperTM)分离较大的50-200kb片段。纯化使所得片段与从序列分析获得的预测大小得以直接比较。通过PCR和测序对改变进行分析。
线性YAC、环形YAC和BAC片段在消化后，利用ElutrapTM(Schleicher和Schuell)47从由常规操作的0.8％琼脂糖凝胶或者由脉冲场凝胶电泳(PFGE)切下的条带通过电洗脱进行纯化。DNA浓度通常是在约100μl体积中几ng/μl。对于多达约200kb的片段，使DNA沉淀并再溶解于显微注射缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5、100mM EDTA pH 8和100mM NaCl但没有精胺/亚精胺)达到期望的浓度。
从酵母纯化环形YAC是利用Nucleobond AX基于二氧化硅的阴离子交换树脂(Macherey-Nagel，Germany)进行的。简言之，利用裂解酶(zymolyase)或溶细胞酶(lyticase)制备原生质球并制成颗粒20。然后使细胞进行碱裂解，结合至AX100柱，并按照在Nucleobond方法中所述洗脱低拷贝数质粒。利用Plamid–SafeTM ATP依赖性DNA酶(Epicentre Biotechnologies)将污染的酵母染色体的DNA水解，随后利用SureClean(Bioline)的进行最终清除步骤。然后用环形YAC转化DH10电感受态(electrocompetent)细胞(Invitrogen)的等分试样以获得BAC克隆。对于显微注射，利用Sepharose 4B-CL过滤步骤48，将插入DNA(150-200kb)从BAC载体DNA(约10kb)中分离。
大鼠的来源和育种
将编码重组免疫球蛋白基因座的纯化的DNA再混悬于含有10mM精胺和10mM亚精胺的显微注射缓冲液中。将DNA以从0.5至3ng/μl的各种浓度注入受精的卵母细胞中。
将编码对大鼠免疫球蛋白基因特异的ZFN的质粒DNA或mRNA以0.5至10ng/ul的各种浓度注入受精的卵母细胞中。
显微注射在Caliper Life Sciences设施上进行。在国际实验动物评估和认可委员会(AAALAC)认可的动物设施中，在经批准的动物关照协议下，将远系杂交种SD/Hsd(WT)株动物在标准微隔离器(microisolator)笼中饲养。按照14-10小时亮/暗循环，随意进食和饮水，饲养大鼠。在与远系杂交种SD/Hsd雄性育种之前，对4至5周龄的SD/Hsd雌性大鼠注射20-25IU PMSG(Sigma-Aldrich)，接着在48小时后注射20-25IU hCG(Sigma-Aldrich)。将受精的1-细胞阶段胚胎收集用于随后显微注射。将经处理的胚胎移植到假妊娠的SD/Hsd雌性大鼠从而携带至分娩。
在10–18周龄，对多特征(Multi-feature)人Ig大鼠(人IgH、Igκ和Igλ与大鼠J KO、κKO和λKO组合)和作为对照的WT进行分析。将动物在无特定病原体的条件下在CharlesRiver饲养。
PCR和RT-PCR
利用基因组DNA小试剂盒(Genomic DNA Mini Kid)(Bioline)，通过来自尾或耳夹DNA的PCR，对转基因大鼠进行鉴定。对于IgH PCR<1kb，在以下条件下使用GoTaq GreenMaster混合物(Promega)：94℃ 2分钟，32x(94℃ 30秒，54-670C(关于引物和具体的退火温度，参见补充表1)30秒，72℃ 1分钟)，72℃ 2分钟。对于IgH PCR>1kb，在以下条件下使用KOD聚合酶(Novagen)：95℃2分钟，32x(95℃ 20秒，56-620C(补充表1)20秒，70℃ 90秒)，70℃ 2分钟。对于Igκ和IgλPCR，全部<1kb，除了在72℃延伸50秒之外使用以上条件。
使用RiboPure血液试剂盒(Ambion)从血液提取RNA，并使用RNASpin小试剂盒从脾、骨髓或淋巴结中提取RNA。(GE Healthcare)。使用Oligo dT和Promega反转录酶在42℃持续1小时制备cDNA。GAPDH PCR反应(寡核苷酸429-430)测定浓度。
使用具有大鼠μCH2的VH前导引物或者大鼠γCH2引物(补充表1)，设置RT-PCR。用GoTaq Green Master混合物扩增是94℃ 2分钟，34x(94℃ 30秒,55-65℃ 30秒,72℃ 50-60秒)，72℃ 2分钟。将具有预期大小的PCR产物通过凝胶或者QuickClean(Bioline)纯化，并直接测序或者克隆到pGemT(Promega)中。
蛋白质纯化
按照操协议所描述的，在抗IgM亲和基质(BAC B.V.，荷兰，CaptureSelect#2890.05)上纯化IgM。相似地，按照协议，在抗L链亲和基质(CaptureSelect抗Igκ#0833和抗Igλ#0849)上纯化人Igκ和Igλ。
对于大鼠IgG纯化29，使用蛋白A和蛋白G琼脂糖(Innova,Cambridge,UK,#851-0024和#895-0024)。将血清与树脂一起孵育，并在温和的混合下在0.1M磷酸钠(对于蛋白G pH 7和对于蛋白A pH 8)下促进结合。用该混合物填充Poly-prep柱(Bio-Rad)，并用PBS pH7.4充分地洗涤。洗脱缓冲液是0.1M柠檬酸钠pH 2.5，中和缓冲液是1M Tris-HCl pH 9
在4-15％SDS-PAGE上进行电泳，并且利用考马斯亮蓝进行染色。MW标准是HyperPage预染蛋白质分子量标准(HyperPage Prestained Protein Marker)(#BIO-33066,Bioline)。
流式细胞术分析和FISH
将细胞悬液清洗并在PBS-1％BSA-0.1％叠氮化物中调节至5x105个细胞/100μl。利用小鼠抗大鼠IgM FITC-标记的mAb(MARM4,Jackson Immunoresearch Laboratories)与抗B细胞CD45R(大鼠B220)-PE-缀合的mAb(His 24,BD biosciences)或者抗IgD-PE-缀合的mAb(MARD-3,Abd Serotec)组合，鉴定不同的B细胞子集。利用FACS CantoII流式细胞仪和FlowJo软件(Becton Dickinson,Pont de Claix,法国)进行分析。
利用所述纯化的IgH和IgL C-区BAC，在固定的血液淋巴细胞上实施荧光原位杂交。49
免疫、细胞融合和亲和力测定
用在CFA中的125μg PG、在CFA中的150μg hGHR、在CFA中的200μg Tau/KLH、在CFA中的150μg HEL、在CFA中的150μg OVA，在尾根处进行免疫，并如所述在22天后将髂内侧淋巴结细胞与小鼠P3X63Ag8.653骨髓瘤细胞融合 50 。为了多重免疫，将蛋白125μg PG或HEL、或者100μg hGHR或CD14在GERBU佐剂(www.Gerbu.com)中按如下进行腹膜内施用：第0天、第14天、第28天和第41天没有佐剂，然后在4天后使脾细胞与P3x63Ag8.653细胞融合。 49
按照所述使用Biacore 2000，抗原直接被固定，通过表面等离子共振对结合动力学进行分析 23 。
补充表1
检测人IgH和IgL整合和表达的PCR*和RT-PCR**条件
Igκ 引物 退火温度(Tm-5) 片段大小
KDE 313-314 66℃ 约600bp
cκ 307-308 64℃ 约600bp
V4-1 333-334 60℃ 约300bp
V1-5 329-330 64℃ 约400bp
V1-6 331-332 60℃ 约300bp
V3-7 309-310 66℃ 约700bp
V3-15 311-312 66℃ 约500bp
Igλ 引物 退火温度(Tm-5) 片段大小
V3-27 215-216 67℃ 约400bp
V3-19 213-214 67℃ 约700bp
V2-14 211-212 67℃ 约400bp
V中间 168-169 65℃ 约500bp
Jλ 162-163 67℃ 约800bp
cλ 170-171 67℃ 约500bp
增强子 172-173 67℃ 约400bp
*对于从耳和尾夹提取DNA，使用基因组DNA小试剂盒(Bioline)。对于1kb或尺寸更小的PCR，在以下条件下使用GoTaq Green Master混合物(Promega)：94℃2分钟，32x(94℃30秒，Tm-5(以下)30秒，72℃1分钟[对于Igκ/λ为50秒])，72℃2分钟。将退火温度设定在最低引物Tm-5℃(www.sigmagenosys.com/calc/DNACalc.asp)。对于PCR＞1kb，在以下条件下使用KOD聚合酶(Novagen)：95℃2分钟，32x(95℃20秒，Tm-520秒，70℃90秒)，70℃2分钟。
IgH 引物 退火温度(Tm-5) 片段大小
VH1前导 390 65℃ ↓
VH2前导 391 65℃ ↓
VH3前导 392 65℃ ↓
VH4前导 393 60℃ ↓
VH6前导 394 65℃ ↓
VH4-39前导 761 55℃ ↓
大鼠μCH2 345 ↑ 约1kb
大鼠7CH2 682 ↑ 约800bp
Igκ 引物 退火温度(Tm-5) 片段大小
HuVK1前导 400/474 63℃ ↓
HuVK3前导 401/475 63℃ ↓
HuVK4前导 476 63℃ ↓
HuVK5前导 477 63℃ ↓
HuκC区 402 ↑ 约600bp
Igλ 引物 退火温度(Tm-5) 片段大小
HuVL2前导 388/478 58℃ ↓
HuVL3前导 398/479/480/482/483/481/484 58℃ ↓
HuVL4前导 485 58℃ ↓
HuλC区 387 ↑ 约600bp
＊＊使用RiboPure血液试剂盒(Ambion)从血液中提取RNA。使用RNASpin小试剂盒(GE Healthcare)从脾、骨髓或淋巴结中提取RNA。使用寡核苷酸dT和Promega反转录酶在42℃持续1小时下制备cDNA。对使用GoTaq Green Master混合物的PCR设定如下：94℃2分钟，34x(94℃30秒，Tm-5 30秒，72℃1分钟[对于Igκ/λ为50秒])，72℃2分钟。
引物
结果
人IgH和IgL基因座
人Ig基因座的构建采用已确立的技术来使用YAC和BAC组装大DNA区段16,19,24-26。如同在大肠杆菌中的多重BAC修饰，频繁缺失重复区例如转换序列和增强子，开发了一种方法用以将酿酒酵母中具有重叠端的序列组装为环形YAC(cYAC)并随后将此类cYAC转变成BAC。YAC的优点包括它们的大尺寸、易于在酵母宿主中同源改变以及序列稳定性，而在大肠杆菌中繁殖的BAC提供易于制备和高收率的优点。此外，与在YAC中相比，在BAC中可以更好地实现详细的限制性内切酶图谱和测序分析。
序列分析和消化鉴定所关注的基因簇并确保基因座完整性和功能性，以保证DNA重排并在广泛的区中转换。人IgH(随后为大鼠C基因的人VH、D和JH区段)、Igκ和Igλ基因座的布局在图1a-c中示出。如前所示，重叠区在被共注入卵母细胞中时通常可有利于连接整合24。因此，BAC6-VH3-11、182kb AsiSI-AscI片段、BAC3、173kb NotI片段和BAC3-1N12M5I8(Hu-大鼠Annabel)、193kb NotI片段的插入，导致完全功能性转基因IgH基因座在大鼠基因组中的重建。相似地，将人Igκ基因座通过同源重叠进行整合。将人Igλ基因座完整分离作为约300kb YAC，并完全插入到大鼠染色体中。通过转录分析来鉴定整合成功，此表明从注射的基因座的最5’至最3’端的V(D)J-C重组。通过qPCR(未示出)鉴定出多个拷贝，并且可能发生首至尾整合。在所有情况中，通过育种产生具有单-位点整合的转基因动物。
育种为纯合性
通过DNA显微注射到卵母细胞中衍生出转基因大鼠，它们的育种和免疫与小鼠相似。但是，仅是最近才报道了获得基因敲除的ZFN技术 11 , 13 。利用ZFN KO技术通过JH缺失使大鼠IgH基因座沉默已经有描述 12 并且描述大鼠IgL基因座的沉默、Cκ的靶向和J-Cλ基因的缺失的原稿正在准备中。我们获得具有整合的人Ig基因座和沉默的内源性Ig产生的多个建立者(founder)；对全部建立者通过PCR和FISH进行分析，对完全转基因座整合进行选择和品种间杂交(表2)。几个建立者大鼠携带低转基因座拷贝数；根据Cμ和Cα产物的qPCR(未示出)确定OmniRat中的大鼠C-基因BAC可能以5个拷贝被完全整合。通过在许多种系中单一位置插入的FISH鉴定，证实BAC混合物的散布或多重整合是罕见的；实现了育种为纯合性的优点。
表2：产生的大鼠系：转基因整合、敲除和基因使用
使携带个体人转基因座-IgH、Igκ和Igλ–的大鼠与Ig基因座KO大鼠成功杂交为纯合性。这样产生出高效的新型多特征系(OmniRatsTM)，其具有大于400kb的人VH-D-JH区，所述人VH-D-JH区含有22个功能性VH和约116kb的大鼠C区。DNA重排、表达水平、类型转换和超突变在不同的建立者之间非常相似，并且与wt大鼠相似。这大概由于相关的大鼠恒定区容纳几个C，并且3’E(增强子控制)区呈真实构型。
在敲除背景下的B细胞发育
为了评价引入的人Ig基因座是否能够重建正常的B细胞发育，进行流式细胞术分析。在脾和骨髓淋巴细胞中，对特定的分化阶段进行分析(图2)，这之前显示在JKO/JKO大鼠中缺乏B细胞发育 12 ，并且在κKO/κKO中以及在λKO/λKO动物中没有相应的IgL表达(数据未示出)。最突出的是，与wt动物相比，在OmniRat中B细胞发育的完全恢复，其中在骨髓和脾中有相似数量的B220(CD45R)+淋巴细胞。在大比例的CD45R+B细胞中的IgM表达标志着完全重建的免疫系统。在OmniRat和wt动物之间，脾细胞的尺寸和形状分离不能区别，因此在用大鼠C区表达人独特型的转基因大鼠中得到成功恢复。此外，小sIgG+淋巴细胞群存在于OmniRat中(图2右侧)。
对其他OmniRat淋巴细胞组织的分析表明它们与wt对照不能区别，例如，T-细胞子集完全得以保留(数据未示出)，这进一步支持最佳免疫功能已经完全恢复的观点。
多样性人H-和L-链转录体
使用来自具有功能性内源Ig基因座的转基因大鼠的血液淋巴细胞或脾细胞，实施全面转录分析。从特定的人VH组正向至Cμ或Cγ反向引物的RT-PCR表明人VHDJH的使用。对于L-链分析组，特定的人Vκ或Vλ正向引物与Cκ或Cλ反向引物一起使用。结果(表3)显示视为功能性的全部整合的人VH基因的使用 27 与D区段和全部JH区段的多样性使用相结合。
在JKO/JKO背景下的类型转换和超突变的分析(图3)表明，这些必需的并且高度适合的机制在OmniRat中完全可操作。来自PBL的IgG转换产物的扩增揭示在大多数细胞(约80％)中并且在近乎相等数量的γ1和γ2b H-链中，有广泛的突变率(>2个aa改变)。还鉴定出小百分比的转换序列γ2a和2c(图3)，这支持了以人(VH-D-JH)为条件的转基因座与内源性IgH基因座活性相似的看法 28 。突变的人Igγ和IgκL-链序列的数量是约30％，因此相当大地低于IgG H-链。原因是来自全部产生细胞而非来自IgG+或分化的浆细胞的L-链的总扩增。
血清中的Ig水平
为了获得关于抗体产生的明确信息，我们比较了来自OmniRat和正常wt动物的血清Ig的质量和数量。在还原条件下，在SDS-PAGE上分离的IgM和IgG的纯化(图4)表明，预期的尺寸，对于μ是-约75kDa，对于γH-链是约55kDa，并且对于L-链是约25kDa–这在OmniRat和wt动物之间看起来不能区别。针对两个、几个OmniRat和wt动物，测定从血清获得的Ig，对于IgM为100-300μg/ml，而对于IgG为1-3mg/ml。但是，因为在蛋白A或G上的大鼠IgG纯化被视为次优的 29 ，因此大鼠Ig水平可能表现偏低。考虑到这些年轻的(约3月龄)大鼠在无病原体的设施中饲养并且尚未受到免疫，这与对在开放设施中饲养的大鼠报道的0.5-1mg/ml的IgM水平和几mg/ml的IgG水平比较吻合 30 , 31 。有意思的是，如在单克隆中所证实的 29 ，我们能够使大鼠IgG同种型在SDS-PAGE上的类型特异性迁移率可见。在IgG分离中(图4b)，在wt而非OmniRat Ig中，可见到显著更低的γH-链带。已将此带归因于γ2a H-链，其在OmniRat(HC14)转基因座中不存在。因为IgG水平在OmniRat和wt动物之间是相似的，我们假定类型转换相似地有效。在OmniRat中缺乏Cγ2a的原因没有限制性，可能是转基因基因座的若干拷贝有利地提高转换产物的水平。通过用抗L-链捕获来纯化人Igκ和Igλ也是成功的(图4c和4d)并且预测H-和L-链带具有预期的尺寸。通过ELISA还获得了IgM/G效价的确认，所述ELISA测定wt和OmniRat同种型分布并鉴定IgG1和IgG2b的相似数量(未示出)。
在固相滴定(solid phase titration)中人Ig L-链效价的直接比较(图4e和4f)表明，在OmniRat中的水平比人血清中的水平低5-10倍。但是，这是预期的，因为与儿童到青少年中的Ig水平相比，来自成熟成人的人对照血清有时可以包含超过10倍高的Ig水平 32 ，这可能与在年轻大鼠中的人Igκ和Igλ效价相似。有意思的是，wt大鼠产生非常少的内源性Igλ而转基因大鼠可以有效表达两种类型的人L-链Igκ和Igλ。
完全人抗原特异性IgG
使用快速一次免疫方案并收集淋巴结，或者使用加强免疫和脾细胞，实施若干次细胞融合(表2)。例如，在用人颗粒蛋白前体(PG)一次免疫并在22天后骨髓瘤融合之后，获得相当大量的稳定的杂交瘤。在SD对照和OmniRat杂交瘤克隆中，分别在约3,520和约1,600个孔中观察到细胞生长。由生物传感器测量表征的抗颗粒蛋白前体特异性IgG是由148个OmniRat克隆产生的。有限的稀释以排除混合的孔并重复亲和力测定，揭示OmniRat克隆保留它们的抗原特异性。抗体从SD和OmniRat克隆结合和解离的速率的比较显示出介于0.3和74nM之间的相似亲和力(表4并且数据未示出)。用人生长激素受体(hGHR)、与匙孔血蓝蛋白偶联的TAU受体(TAU/KLH)、鸡蛋溶菌酶(HEL)或卵白蛋白(OVA)进行单次免疫，随后进行淋巴结融合，也产生出通常与wt相比具有相似数量的许多高亲和力人抗体。
此外，用人PG、hGHR、人CD14和HEL的常规加强免疫产生具有人独特型的IgG的高亲和力(pM范围)。OmniRat通常表现出抗原特异性血清IgG的预期4-至5-log的效价增长，这与wt大鼠相似并且一样显著(表4a)。虽然结果可能随着动物不同而变化，但是从wt动物(SD及其他株)和OmniRat获得了相似数量的产生具有相似高亲和力的抗原特异性抗体的杂交瘤。在表4b中呈现出产生个体IgG的淋巴结和脾细胞融合克隆的总结，示出了它们的多样性人VH-D-JH、人Vκ-Jκ或Vλ-Jγ的特征和亲和力。免疫和融合结果表明，从用PG、CD14、τ、HEL和OVA抗原免疫的OmniRat通常获得远低于1nM的亲和力(通过生物传感器分析测定)。总之，可以与从wt动物中一样容易地从OmniRat中产生抗原特异性杂交瘤，其中即使在单次免疫后也产生具有亚纳摩尔的亲和力的多种mAb。
表4a具有完全人独特型的多样性抗原特异性大鼠IgG杂交瘤a
*细胞数为3-9x 107/融合
**经生物传感器分析确认的抗原特异性
***5个最高亲和力的范围
#8种mAb对于τ-多肽为特异的
表4b
a用人颗粒蛋白前体(PG)、人生长激素受体(hGHR)、人CD14、τ-多肽(TAU-KLH)、鸡蛋溶菌酶(HEL)、卵白蛋白(OVA)或β-半乳糖苷酶(β-gal)对OmniRat(HC14/Huκ和/或Huλ/JKOJKO/KKOKKO)和对照SD大鼠进行免疫。*在单次或多次分别施用抗原后，融合淋巴结(LN)或脾细胞(SP)。
讨论
人和大鼠基因组合以组装新型IgH基因座产生了具有人独特型的抗体的接近正常的高效表达。此外，人Igκ和Igλ基因座的整合揭示，容易地产生出具有完全人特异性的嵌合Ig，并且大鼠C-区与人L-链的缔合没有不利影响。使用大鼠IgH基因座的部分的优点在于，物种特异性C区和增强子控制元件保持它们的天然构型，其中基本上仅仅移植多样化人VHD JH区。此外，具有大鼠Fc-区的抗体的表达使正常B细胞受体得以组装并且最佳地激活引发高效免疫应答必要的下游信号传导途径。具体地，对抗原激发的免疫应答的质量依赖于许多与信号传导相关的受体和调节剂组分的联合作用(参见：www.biocarta.com/pathfiles/h_bcrpathway.asp)。
使用YAC和BAC并在二者之间相互交换的方法，在通过重叠同源性制备具有大区的构建体时，具有速度和检查完整性的能力两方面的优点。几种建立者大鼠携带低转基因座拷贝数；如通过Cμ和Cα产物的qPCR(未示出)测定，在OmniRat中大鼠C-基因BAC可能被完全整合在5个拷贝中。通过在许多种系中单一位置插入的FISH鉴定(参见表1d)，证实了BAC混合物的散布或多重整合是罕见的；实现了育种为纯合性的优点。人们对于广泛重叠区是否可整合知之甚少，例如为了维持完全功能性，对DNA重排是必需的。之前，已报道了重叠整合，但是针对小得多的区(<100kb) 24 , 33 ，并且我们的结果表明通过同源性或串联的期望的整合是频发事件。这大大方便了转基因技术，因为不必费力地将大YAC整合到干细胞中并随后从中衍生动物 18 , 19 。此外，同样通过DNA注射进行的ZFN技术 11 , 12 ，容易地产生Ig KO株，并且很可能是选择用于基因破坏和替代的未来技术。在OmniRat中沉默的内源性Ig基因表达，含有人-大鼠IgH和人IgL基因座，优点是没有干扰性或不期望的大鼠Ig可以产生混合的产物。有意思的是，在仍然产生wt Ig的OmniRat中免疫和杂交瘤生成揭示尽管是不完全的Ig KO，但许多产物是完全人、人-大鼠IgH和人IgL。在此，尽管有大量的wt V基因，值得注意的是，引入的人基因容易地扩增，因此表明为有效表达竞争物。这与所有的我们所整合的转基因的普遍良好的表达水平的观察一致，这有利于与内源性基因座竞争。之前，因为在释放wtIg时发现人产物的少量表达 8 , 18 ，所以在表达人抗体库的小鼠中，Ig KO是必需的。
因为株特异性顺式作用序列是高水平表达所需的，可能即使在Ig KO小鼠中完全人Ig基因座的产生是次优的。在小鼠中，Cα下游的增强子区在类别转换重组中起到重要作用 34 ，并且该区中的元件可能促进超突变 23 。这可能是为什么在即使携带大的完全人基因座的小鼠中在高频率下免疫应答和多样性杂交瘤的生成可能困难的原因 35 , 36 。因为在OmniRat中，嵌合人-大鼠IgH基因座促成接近wt的分化和表达水平，可得出结论，内源性大鼠C区和真正的Cα3’的约30kb增强子序列提供对表达和成熟人VH基因的最佳基因座控制。因为IgD的沉默或缺乏似乎不降低免疫功能37及其中参考文献，因此已经将另一个区，具有其3’控制基序簇 26 的Cδ，从嵌合C-区BAC中除去。通常，在抗原接触时，成熟IgM+IgD+B细胞下调IgD，这引发类别转换重组 37 。因此，在没有IgD控制的情况下，转换可能升高，这得到了我们的研究结果的支持，即当将Cδ区保留在转基因构建体中时，IgG转录体和血清水平显著较低(数据未示出)。
因为我们发现在各种免疫中在序列和表位中具有多样性的mAb，与在wt对照中产生的那些相似，可以通过脾和淋巴结融合进行分离，在OmniRat中特异性IgG的产生特别令人鼓舞。V-基因、D和J多样性正如预期，并且发现几乎所有的区段的使用如预测得富有成效 27 。这与携带完全人转基因座的小鼠是鲜明的对照，其中从数个前体B细胞克隆扩增产生少量的多样性 23 。因为移植的V-基因数量仅是在人中使用的大约一半，我们预期在将OmniRat与wt动物比较时观察到限制的免疫应答和有限的多样性。然而，并非如此，并且在超过1000个克隆(可以提供序列)中的CDR3多样性的比较显示，在OmniRat中与在wt动物中有相同广泛的连接差异。通过在VH至D和/或D至JH连接处的N-序列增加或缺失和还通过超突变，使数个相同基因-区段组合进一步多样化。因此，显然，在控制DNA重排和人VHDJH的表达方面，大鼠C区序列是高效的。与之前已经在小鼠中显示的相似 22 , 23 , 38 ，对于引入的人Igκ和Igλ基因座，也观察到广泛的多样性。因此，在从小鼠产生人抗体方面显著降低的效率 7 ，已经在OmniRat中得到克服，其通过类别转换和超突变可靠且广泛地使重排的H-链多样化，从而大量地而非偶然地得到高亲和力抗体。转基因IgG的收率和超突变的水平，令人难忘地是应用于抗原特异性mAb中，表明了克隆多样化和产生水平在OmniRat与wt动物之间是相似的。通过不同的单次免疫甚至实现了在亚纳摩尔范围内的高亲和力特异性的常规产生，并且与wt动物相比是有利的；在从完整人基因座中产生人抗体库的转基因小鼠方面的结果尚未显示 18 。
总之，为了最大化人抗体产生，对于抗体特异性使用人基因而为了控制分化和高表达使用啮齿动物基因的IgH基因座应被视为是必需的。L-链柔韧性是额外的好处，因为即使在存在wt Ig时，它也允许高效的人IgH/IgL组装。对于治疗应用，通过C-基因替代而不损及特异性的情况下，可以将嵌合H-链容易地转变成完全人Ab。
本文提及的所有专利和专利公布以引用的方式并入本文中。
本领域技术人员在阅读以上说明时可想到某些修改和改进。应当理解，为了简洁和可读性，所有此类修改和改进本文已被删除，但是合理地在以下权利要求书的范围内。
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Claims (31)

1.一种嵌合多核苷酸，其包含至少一个人免疫球蛋白(Ig)连接(J)区基因、Ig恒定区基因和大鼠3’增强子，其中所述大鼠3’增强子包括如SEQ ID NO:1所示的序列。
2.如权利要求1所述的嵌合多核苷酸，其还包含至少一个人Ig可变(V)区基因和/或人Ig多样性(D)区基因。
3.如权利要求1或2所述的嵌合多核苷酸，其中所述恒定区基因选自由人恒定区基因和大鼠恒定区基因组成的组。
4.如权利要求3所述的嵌合多核苷酸，其中所述恒定区基因包括大鼠恒定区基因。
5.如权利要求3所述的嵌合多核苷酸，其中所述恒定区基因包括选自由Cμ和Cγ组成的组的恒定区基因。
6.如权利要求1或2所述的嵌合多核苷酸，其包含与细菌人工染色体(BAC)Annabel或其部分基本同源的核酸序列。
7.如权利要求2所述的嵌合多核苷酸，其中所述人Ig V区包含至少一个可从BAC6-VH3-11和/或BAC3分离的人V区基因。
8.如权利要求1或2所述的嵌合多核苷酸，其以5’至3’的顺序包含核酸序列(a)和(b)：
(a)人Ig可变区，其包含可从BAC6-VH3-11和/或BAC3分离的呈天然构型的人V区基因；和
(b)人Ig连接区，其包含可从细菌人工染色体(BAC)Annabel分离的呈天然构型的人J区基因。
9.如权利要求2所述的嵌合多核苷酸，其以5’至3’的顺序包含以下的(a)-(e)：
(a)人免疫球蛋白可变区，
(b)人免疫球蛋白多样性区，
(c)人免疫球蛋白连接区，
(d)免疫球蛋白恒定区，和
(e)大鼠3’增强子。
10.如权利要求9所述的嵌合多核苷酸，其包含与如SEQ ID NO:2所示的核酸序列基本同源的核酸序列。
11.如权利要求9所述的嵌合多核苷酸，其包含与如SEQ ID NO:11所示的核酸序列基本同源的核酸序列。
12.如权利要求2所述的嵌合多核苷酸，其中所述V、D、J区基因重排并形成编码重链可变结构域的完整外显子。
13.一种啮齿动物细胞，其包含如前述权利要求中任一项所述的嵌合多核苷酸。
14.如权利要求13所述的啮齿动物细胞，其还包含编码功能性免疫球蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸包含V、J和恒定区基因以及与选自由SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7组成的组的核酸序列基本同源的核酸序列。
15.一种产生转基因啮齿动物的方法，其包括从活的啮齿动物生殖细胞衍生出转基因啮齿动物，所述啮齿动物生殖细胞具有重链免疫球蛋白基因座，所述重链免疫球蛋白基因座包含与编码啮齿动物重链恒定区和大鼠3’增强子的DNA连接的人未重排的重链可变区基因区段，所述大鼠3’增强子包括如SEQ ID NO:1所示的序列，其中所述重链免疫球蛋白基因座不包含人免疫球蛋白恒定区基因，并且其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述人未重排的重链可变区基因区段包含在大于170kb的DNA片段上。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述人未重排的重链可变区基因区段包含在大于180kb的DNA片段上。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述人未重排的重链可变区基因区段包含在大于350kb的DNA片段上。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述人未重排的重链可变区基因区段能够重排以形成功能性重链可变区基因。
20.如权利要求19所述的方法，其中在重排之后，所述啮齿动物表达由重排的人基因区段编码的功能性抗原结合分子。
21.如权利要求15所述的方法，其中所述啮齿动物产生包含人可变区和啮齿动物恒定区的抗体。
22.如权利要求15所述的方法，其中所述啮齿动物是大鼠。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述啮齿动物重链恒定区是啮齿动物Fc区。
24.一种产生具有人可变区和啮齿动物恒定区的抗体的方法，包括将转基因啮齿动物暴露于抗原，所述啮齿动物在其种系中包含重链免疫球蛋白基因座，所述重链免疫球蛋白基因座包含与编码啮齿动物重链恒定区和大鼠3’增强子的DNA连接的人未重排的重链可变区基因区段，所述大鼠3’增强子包括如SEQ ID NO:1所示的序列，其中所述重链免疫球蛋白基因座不包含人免疫球蛋白恒定区基因，其中暴露于抗原使得转基因啮齿动物产生针对所述抗原的抗体，所述抗体具有人重链可变区和啮齿动物重链恒定区，并且其中所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述人未重排的重链可变区基因区段包含在大于170kb的DNA片段上。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述人未重排的重链可变区基因区段包含在大于180kb的DNA片段上。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述人未重排的重链可变区基因区段包含在大于350kb的DNA片段上。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述啮齿动物是大鼠。
29.如权利要求24所述的方法，其中所述啮齿动物重链恒定区是啮齿动物Fc区。
30.如权利要求24所述的方法，还包括从所述转基因啮齿动物制备杂交瘤的步骤，所述杂交瘤包含编码所述抗体的DNA。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述杂交瘤从所述转基因啮齿动物的脾制备。
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