ES2962287T3

ES2962287T3 - Ratones con complejo principal de histocompatibilidad genéticamente modificados

Info

Publication number: ES2962287T3
Application number: ES19167619T
Authority: ES
Inventors: Lynn Macdonald; Andrew J Murphy; Cagan Gurer; John Mcwhirter; Vera Voronina; Faith Harris; Sean Stevens
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2024-03-18
Anticipated expiration: 2032-10-26
Also published as: IL252022A0; EP3563680B1; NZ719373A; AU2012324016B2; JP6574457B2; NZ734532A; CN107254480B; SI2770821T1; AU2012324016A1; KR20200013810A; MY178723A; EP4311833A3; AU2017279797B2; ES2741649T3; MX2020010763A; CN104039132A; JP2019068857A; CY1119657T1; EP2770821B1; SG10201603188SA

Abstract

La invención proporciona animales no humanos genéticamente modificados que expresan polipéptido quimérico MHC I humano/no humano y/o polipéptido beta2 microglobulina humano o humanizado, así como embriones, células y tejidos no humanos que comprenden los mismos. También se proporcionan construcciones para fabricar dichos animales genéticamente modificados y métodos para fabricarlos. Se proporcionan métodos para utilizar animales genéticamente modificados para estudiar diversos aspectos del sistema inmunológico humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Ratones con complejo principal de histocompatibilidad genéticamente modificados

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para identificar y evaluar péptidos en el contexto de un ratón o una rata genéticamente modificados.

Antecedentes de la invención

En la respuesta inmunitaria adaptativa, las moléculas receptoras en los linfocitos B (por ejemplo, inmunoglobulinas) y linfocitos T (por ejemplo, receptores de linfocitos T o TCR ["T cell receptor"]) reconocen antígenos extraños. Estos antígenos extraños se presentan sobre la superficie de células en forma de fragmentos peptídicos por medio de proteínas especializadas, denominadas genéricamente moléculas del complejo principal de histocompatibilidad ("major histocompatibility complex", MHC). Las moléculas de MHC son codificadas por múltiples loci que se encuentran como una agrupación vinculada de genes que abarcan aproximadamente 4 Mb. En ratones, los genes de MHC se encuentran en el cromosoma 17 y, por razones históricas, se denominan genes de histocompatibilidad 2 (H-2). En los seres humanos, los genes se encuentran en el cromosoma 6 y se denominan genes de antígeno leucocitario humano ("human leukocyte antigen", HLA). Los loci en ratones y seres humanos son poligénicos; incluyen tres clases altamente polimorfas de genes de MHC (de clase I, II y III) que muestran una organización similar en genomas humanos y murinos (véase la figura 2 y la figura 3, respectivamente).

Los loci de MHC muestran el polimorfismo más alto en el genoma; algunos genes están representados por >300 alelos (por ejemplo, HLA-DRp humano y HLA-B humano). Todos los genes de MHC de clase I y II pueden presentar fragmentos peptídicos, pero cada gen expresa una proteína con distintas características de unión, que refleja los polimorfismos y las variantes alélicas. Cualquier individuo concreto tiene una única gama de fragmentos peptídicos que puede presentarse sobre la superficie celular a linfocitos B y T durante una respuesta inmunitaria.

Tanto los seres humanos como los ratones tienen genes de MHC de clase I (véase, la figura 2 y la figura 3). En los seres humanos, los genes de clase I clásicos se denominan HLA-A, HLA-B y HLA-C, mientras que, en ratones, se denominan H-2K, H-2D y H-2L. Las moléculas de clase I están formadas por dos cadenas: una cadena a polimórfica (a veces denominada cadena pesada) y una cadena más pequeña denominada microglobulina p2 (también conocida como cadena ligera), que generalmente no es polimórfica (figura 1). Estas dos cadenas forman un heterodímero no covalente sobre la superficie celular. La cadena a contiene tres dominios (a1, a2 y a3). El exón 1 del gen de la cadena a codifica la secuencia líder, los exones 2 y 3 codifican los dominios a l y a2, el exón 4 codifica el dominio a3, el exón 5 codifica el dominio transmembrana y los exones 6 y 7 codifican la cola citoplásmica. La cadena a forma una hendidura de unión a péptidos que implica los dominios a1 y a2 (que se parecen a dominios similares a lg), seguida por el dominio a3, que es similar a la microglobulina p2.

La microglobulina p2 es una proteína de 12 kDa no glicosilada; una de sus funciones es estabilizar la cadena a de MHC de clase I. A diferencia de la cadena a, la microglobulina p2 no atraviesa la membrana. El locus de la microglobulina p2 humana se encuentra en el cromosoma 15, mientras que el locus de ratón se encuentra en el cromosoma 2. El gen de la microglobulina p2 está formado por 4 exones y 3 intrones. Las formas circulantes de la microglobulina p2 están presentes en el suero, la orina y otros líquidos corporales; por tanto, la microglobulina p2 no asociada covalentemente a MHC I pueden intercambiarse con microglobulina p2 circulante en condiciones fisiológicas.

Las moléculas de MHC de clase I se expresan en todas las células nucleadas, incluidas células tumorales. Se expresan específicamente sobre linfocitos T y B, macrófagos, células dendríticas y neutrófilos, entre otras células, y actúan presentando fragmentos peptídicos (generalmente de 8 a 10 aminoácidos de longitud) sobre la superficie de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL, "cytotoxic T lymphocytes"). Los CTL están especializados en destruir cualquier célula que porte un péptido unido a<m>H<c>I reconocido por su propio TCR unido a la membrana. Cuando una célula presenta péptidos derivados de proteínas celulares que no presenta normalmente (por ejemplo, de origen vírico, tumoral o de otro origen que no sea propio), tales péptidos son reconocidos por los CTL, que se activan y destruyen la célula que presenta el péptido.

Normalmente, la presentación de proteínas normales (es decir, propias) en el contexto de las moléculas de MHC I no desencadena la activación de los CTL debido a los mecanismos de tolerancia. Sin embargo, en algunas enfermedades (por ejemplo, cáncer, enfermedades autoinmunitarias), los péptidos derivados de algunas proteínas propias se convierten en la diana del componente celular del sistema inmunitario, lo que da como resultado la destrucción de las células que presentan tales péptidos. Aunque se ha avanzado en el reconocimiento de algunos antígenos derivados del organismo que desencadenan la respuesta inmunitaria celular (por ejemplo, antígenos asociados con diversos tipos de cáncer), para mejorar la identificación de péptidos reconocidos por los CTL humanos a través de las moléculas MHC de clase I, sigue existiendo la necesidad de sistemas tantoin vivocomoin vitroque imiten aspectos del sistema inmunitario celular humano. Los sistemas que imitan el sistema inmunitario celular humano pueden usarse para identificar antígenos asociados a enfermedades para desarrollar agentes terapéuticos humanos, por ejemplo, vacunas y otros agentes biológicos. Los sistemas para evaluar el reconocimiento de antígenos en el contexto del sistema inmunitario humano pueden ayudar a identificar poblaciones de CTL terapéuticamente útiles (por ejemplo, útiles para estudiar y combatir enfermedades humanas). Dichos sistemas también pueden ayudar a potenciar la actividad de las poblaciones de CTL humanos para combatir de manera más eficaz las infecciones y las entidades que portan antígenos extraños. Así pues, existe la necesidad de sistemas biológicos (por ejemplo, animales genéticamente modificados) que puedan generar un sistema inmunitario que presente componentes que imiten la función del sistema inmunitario humano.

El documento WO 03/006639 A1 divulga una célula animal aislada y un animal transgénico correspondiente que comprende un transgén que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido humano implicado en el reconocimiento y/o la activación antigénica de linfocitos T, en donde el gen animal endógeno homólogo que codifica el polipéptido animal correspondiente es inválido, y su uso en un método para seleccionar compuestos que modulan una respuesta inmunitaria en seres humanos.

Guessow D.et al.,"The human beta2-microglobulin gene primary structure and definition of the transcriptional unit", The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol. 139, n.° 9, 1 de noviembre de 1987, divulgan el aislamiento y la caracterización estructural del gen de la microglobulina beta2 humana.

Parnes J. R.et al.,"Structure of wild-type and mutant mouse beta2-microglobulin genes", Cell, Elsevier, Ámsterdam, Países Bajos, vol. 29, n.° 2, 1 de junio de 1982, divulgan la organización estructural del gen de la microglobulina beta2 de ratón.

Pascolo Steveet al.,"HLA-A2.1-restricted education and cytolytic activity of CD8+ T lymphocytes from beta-2 microglobulin (beta-2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2D-b beta-2m double knockout mice", The Journal of Experimental Medicine, Rockefeller University Press, US, vol. 185, n.° 12, 1 de enero de 1997, divulgan monocadenas HLA-A.2.1, en las que la microglobulina beta2 humana está unida al MHC I, y células y ratones que expresan dichas construcciones.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para determinar si un posible antígeno contiene un epítopo que generará una respuesta inmunitaria restringida por HLA de clase I que comprende exponer un roedor genéticamente modificado al antígeno o una porción del mismo, permitir que el roedor genere una respuesta inmunitaria, y detectar en el roedor una célula que se une específicamente a una célula presentadora de antígenos que expresa un complejo de MHC I humanizado que presenta una secuencia peptídica del antígeno o una porción del mismo; en donde el roedor expresa (i) un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor a partir de un locus endógeno del complejo principal de histocompatibilidad I (MHC I) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano unidos operativamente a dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido de MHC I de roedor, y (ii) un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado a partir de un locus endógeno de microglobulina p2 que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano; en donde el complejo de MHC I humanizado comprende el polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor y el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, y en donde el roedor es una rata o un ratón.

En una realización, el roedor (i) no expresa los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I endógeno de roedor a partir del locus de MHC I endógeno de roedor y/o (ii) no expresa un polipéptido de microglobulina p2 de roedor endógeno funcional a partir del locus de microglobulina p2 de roedor endógeno.

En una realización, (i) la secuencia de nucleótidos codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano unidos operativamente a dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido de m Hc I de roedor está unida operativamente a elementos reguladores de MHC I de roedor endógenos y/o (ii) la secuencia de ácido nucleico que comprende los exones 2, 3, y 4 de un gen de microglobulina p2 humano está operativamente unida a elementos reguladores de microglobulina p2 de roedor endógenos.

En una realización, (i) la porción humana del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende una secuencia líder humana y/o el polipéptido de MHC I humano se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B y HLA-C, y/o (ii) la secuencia de ácido nucleico comprende del exón 2 al exón 4 del gen de microglobulina p2 humano y/o la secuencia de ácido nucleico comprende además el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de roedor.

En una realización, el roedor es un ratón.

En otra realización, el locus endógeno es un locus H-2K de ratón.

En otra realización, el polipéptido de MHC I de roedor es un polipéptido H-2K de ratón y/o la porción humana del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido HLA-A2 y la porción de roedor del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido H-2K de ratón y el ratón expresa el polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K.

En otra realización, el polipéptido HLA-A2 es un polipéptido HLA-A2.1.

En otra realización, el locus de MHC de clase I endógeno es un locus H-2Kb de ratón.

En otra realización, el ratón comprende en su genoma: (i) la secuencia de nucleótidos, en un locus H-2K endógeno de ratón, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón, y en donde la porción humana del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón comprende los dominios a l, a2 y a3 de un polipéptido HLA-A2 y la porción de ratón del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido H-2K de ratón; y (ii) la secuencia de ácido nucleico, en un locus de microglobulina p2 endógeno de ratón, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido quimérico de microglobulina p2 humana/ratón, y en donde la secuencia de ácido nucleico comprende el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de ratón, en donde el ratón expresa el polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón y el polipéptido quimérico de microglobulina p2 humana/ratón.

En otra realización, el ratón no expresa polipéptidos endógenos de H-2K y microglobulina p2 de ratón a partir del locus H-2K endógeno de ratón y el locus de microglobulina p2 endógeno, respectivamente.

En otra realización, (i) la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a elementos reguladores de H-2K de ratón endógenos, y (ii) la secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a elementos reguladores de microglobulina p2 de ratón endógenos.

En otra realización, la secuencia de ácido nucleico comprende del exón 2 al exón 4 del gen de microglobulina p2 humano.

En otra realización, la expresión del polipéptido quimérico de microglobulina p2 humana/ratón aumenta la expresión del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón en comparación con la expresión del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón en ausencia de expresión del polipéptido quimérico de microglobulina p2 humana/ratón.

En el presente documento se describe un ratón (o una rata), que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor (por ejemplo, humano/ratón o humano/rata), en donde la porción humana del polipéptido quimérico comprende un dominio extracelular de un polipéptido de MHC I humano. La porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1, dominios a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano, y el ratón o la rata expresa el polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor. El ratón o la rata puede comprender dos copias del locus de MHC I que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor (por ejemplo, humano/ratón o humano/rata). El ratón o la rata pueden comprender una copia del locus de MHC I que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor. Así pues, el animal puede ser homocigoto o heterocigoto para el locus de MHC I que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor. La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de Mh C I humano/roedor puede estar comprendida en la línea germinal de la rata (o del ratón).

La secuencia de nucleótidos que codifica el MHC I quimérico humano/roedor puede estar unida operativamente a elementos reguladores endógenos de rata o ratón, por ejemplo, un promotor, un potenciador, un silenciador, etc. La porción humana del polipéptido quimérico comprende una secuencia líder humana. En la rata o el ratón, la porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1, a2 y a3 del polipéptido de MHC I humano. El polipéptido de MHC I humano puede seleccionarse del grupo que consiste en HLA-A,<h>LA-B y HLA-C. En una realización, el polipéptido de MHC I humano es un polipéptido HLA-A2, por ejemplo, un polipéptido HLA-A2.1.

El roedor divulgado en el presente documento es una rata o un ratón. Cuando el roedor es un ratón, el locus endógeno no humano es un locus de ratón, por ejemplo, un locus H-2K, H-2D o H-2L de ratón. En la rata o el ratón divulgados, la porción de roedor del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende dominios transmembrana y/o citoplásmicos del polipéptido de MHC I de roedor. Así pues, cuando el roedor divulgado en el presente documento es un ratón, el locus de m Hc I endógeno de roedor puede ser un locus H-2K (por ejemplo, locus H-2Kb) y el polipéptido de MHC I de roedor endógeno puede ser un polipéptido H-2K; por consiguiente, el polipéptido quimérico de MHC I humano/no humano puede comprender dominios transmembrana y citoplásmicos del polipéptido H-2K. Cuando el roedor divulgado en el presente documento es un ratón, el locus de MHC I endógeno no humano puede ser un locus H-2D de ratón y el polipéptido de MHC I no humano endógeno puede ser un polipéptido H-2D; por consiguiente, el polipéptido quimérico de MHC I humano/no humano puede comprender dominios transmembrana y citoplásmicos del polipéptido H-2D. De forma similar, el locus de MHC I endógeno no humano puede ser un locus H-2L de ratón y el polipéptido de MHC I no humano endógeno puede ser un polipéptido H-2L; por consiguiente, el polipéptido quimérico de MHC I humano/no humano puede comprender dominios transmembrana y citoplásmicos del polipéptido H-2L.

El ratón divulgado en el presente documento puede comprender, en un locus H-2K endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de<m>H<c>I humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a l, a2 y a3 de un polipéptido HLA-A humano (por ejemplo, HLA-A2) y una porción de ratón comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido H-2K de ratón. El ratón expresa el polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón. Es posible que el ratón no exprese un dominio extracelular del polipéptido H-2K de ratón a partir de un locus H-2K endógeno. La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón puede estar operativamente unida a elementos reguladores endógenos de ratón. La porción humana del polipéptido quimérico puede comprender una secuencia líder humana. Comprende los dominios a1, a2 y a3 del polipéptido de<m>H<c>I humano. El polipéptido de MHC I humano puede ser un polipéptido HLA-A, por ejemplo, el polipéptido HLA-A2.1. El locus H-2K de ratón puede ser un locus H-2Kb.

El ratón o la rata descritos en el presente documento comprenden en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. Así pues, en el presente documento se divulga un ratón o una rata que comprende, en un locus de microglobulina p2 endógeno de roedor, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, en donde el animal expresa el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. El animal puede no expresar un polipéptido de microglobulina p2 endógeno funcional a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno. La rata o el ratón pueden comprender dos copias del locus de microglobulina p2 que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado o una copia del locus de microglobulina p2 que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. Así pues, el roedor puede ser homocigoto o heterocigoto para el locus de microglobulina p2 que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede estar comprendida en la línea germinal de la rata o del ratón. La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de microglobulina p2 humana. En una realización, el polipéptido es capaz de unirse a una proteína de MHC I.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado está operativamente unida a elementos reguladores de microglobulina p2 no humanos. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede comprender una secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 2 al exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado comprende secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. La secuencia de nucleótidos también puede comprender una secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 1 de un gen de microglobulina p2 no humana. El roedor divulgado es un ratón o una rata; por tanto, el locus de microglobulina p2 no humano puede ser un locus de microglobulina p2 de ratón o de rata.

En el presente documento también se divulga un ratón que comprende, en un locus de microglobulina p2 endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, en donde el ratón expresa el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. El ratón puede no expresar una microglobulina p2 de ratón endógena funcional a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno. La secuencia de nucleótidos puede estar unida a elementos reguladores de ratón endógenos. La secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 2 al exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado comprende secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede comprender además una secuencia de nucleótidos del exón 1 de un gen de microglobulina p2 de ratón. La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de microglobulina p2 humana.

En el presente documento se describe un ratón o una rata para su uso de acuerdo con un método de la presente invención que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. El ratón o la rata para su uso en un método según la presente invención comprende en su genoma una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, en donde una porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1, a2 y a3 del polipéptido de MHC I humano; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano, en donde la primera secuencia de nucleótidos está situada en un locus de MHC I endógeno, y la segunda secuencia de nucleótidos está situada en un locus de microglobulina p2 endógeno, y en donde el ratón o la rata expresa el polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor y el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. Cuando el roedor descrito es un ratón, el locus de MHC I endógeno puede seleccionarse de un grupo que consiste en el locus H-2K, H-2D y H-2L. Por ejemplo, el locus de ratón endógeno puede ser un locus H-2K (por ejemplo, el locus H-2Kb). El polipéptido de MHC I humano puede seleccionarse del grupo que consiste en el polipéptido HLA-A, HLA-B y HLA-C. El polipéptido de MHC I humano puede ser HLA-A, por ejemplo, HLA-A2 (por ejemplo, HlA-A2.1). La primera y la segunda secuencia de nucleótidos están comprendidas en la línea germinal del ratón.

Por consiguiente, en el presente documento se divulga, para su uso de acuerdo con un método de la presente invención, un ratón que comprende en su genoma una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a l, a2 y a3 de un HLA-A humano (por ejemplo, HLA-A2) y una porción de ratón comprenden dominios transmembrana y citoplásmicos de un H-2K de ratón; y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano, en donde la primera secuencia de nucleótidos está situada en un locus H-2K endógeno y la segunda secuencia de nucleótidos está situada en un locus de microglobulina p2 de ratón endógeno y en donde el ratón expresa el polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón y el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. La rata o el ratón que comprende tanto el polipéptido quimérico de MHC I como el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado no expresan un dominio extracelular de un polipéptido de MHC I endógeno (por ejemplo, el polipéptido H-2K de ratón) y/o polipéptidos de microglobulina p2 endógenos funcionales (por ejemplo, de ratón) a partir de sus respectivos loci endógenos. La rata o el ratón puede comprender dos copias de cada una de la primera y segunda secuencia de nucleótidos o puede comprender una copia de la primera y una copia de la segunda secuencia de nucleótidos. Así pues, la rata o el ratón puede ser homocigoto o heterocigoto tanto para la primera como para la segunda secuencia de nucleótidos.

La primera secuencia de nucleótidos puede estar unida operativamente a elementos reguladores de MHC I endógenos, y la segunda secuencia de nucleótidos puede estar unida operativamente a elementos de microglobulina p2 endógenos. La porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1, a2 y a3 del polipéptido de MHC I humano. La segunda secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 2 al exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. La segunda secuencia de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. El ratón que comprende tanto el polipéptido de MHC I quimérico como el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede ser tal que la expresión de la microglobulina p2 humana o humanizada aumente la expresión del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón en comparación con la expresión del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón en ausencia de expresión de polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado.

También se describen en el presente documento métodos para producir ratones o ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento. Un método para modificar un locus de MHC I de un ratón o una rata para que exprese un m Hc I humano/roedor quimérico (por ejemplo, humano/ratón o humano/rata) puede comprender reemplazar, en el locus de MHC I endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I de roedor por una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano. También se describe en el presente documento un método para modificar un locus de microglobulina p2 de un ratón o una rata para que exprese un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, en donde el método comprende reemplazar, en el locus de microglobulina p2 endógeno de roedor (por ejemplo, ratón o rata), una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 de roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, comprendiendo una secuencia de ácido nucleico los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. En dichos métodos, el reemplazo se puede realizar en una única célula ES de ratón o de rata, y la única célula ES se puede introducir en un roedor (por ejemplo, un ratón o una rata) para producir un embrión. El ratón o rata resultante se puede criar para generar un ratón o rata doblemente humanizado.

Así pues, también se describe en el presente documento un método para producir ratones o ratas con animales doblemente humanizados. Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para producir un ratón modificado genéticamente que comprende (a) modificar un locus de MHC I de un primer ratón para que exprese un polipéptido quimérico de m Hc I humano/ratón que comprende reemplazar, en el locus de MHC I endógeno de ratón, una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I de ratón por una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano, (b) modificar un locus de microglobulina p2 de un segundo ratón para expresar un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado que comprende reemplazar, en el locus de microglobulina p2 de ratón endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 de ratón por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano; y (c) cruzar el primer y el segundo ratón para generar un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, en donde el ratón genéticamente modificado expresa el polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón y el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. El locus de MHC I puede seleccionarse de H-2K, H-2D y H-2L; el polipéptido de MHC I humano puede seleccionarse de HLA-A, HLA-B y HLA-C. El locus de MHC I puede ser un locus H-2K, el polipéptido de Mh C I humano puede ser HLA-A (por ejemplo, HLA-A2), y el ratón puede expresar un polipéptido quimérico HLA-A/H-2K (por ejemplo, polipéptido HLA-A2/H-2K). El polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K puede comprender los dominios a1, a2 y a3 del polipéptido HLA-A2 y dominios citoplásmicos y transmembrana del polipéptido H-2K. La segunda secuencia de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 (por ejemplo, exón 2 a exón 4) de un gen de microglobulina p2 humano, y puede comprender una secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de ratón.

También se divulgan en el presente documento células, por ejemplo, células presentadoras de antígeno aisladas, derivadas de los ratones o ratas descritos en el presente documento. Se divulgan también tejidos y embriones derivados de los ratones o las ratas descritos en el presente documento.

También se describen en el presente documento métodos para la identificación de antígenos o epítopos de antígenos que provocan una respuesta inmunitaria, métodos para evaluar un candidato a vacuna, métodos para la identificación de linfocitos T de alta afinidad por patógenos humanos o antígenos del cáncer.

Cualquiera de las realizaciones y aspectos descritos en el presente documento pueden utilizarse junto con cualquiera de los demás, salvo que se indique otra cosa o sea evidente a partir del contexto. Otras realizaciones serán evidentes para un experto en la materia a partir de un análisis de la siguiente descripción detallada. La siguiente descripción detallada incluye representaciones ilustrativas de las diversas realizaciones de la invención que no son restrictivas de la invención tal como se reivindica. Las figuras adjuntas constituyen una parte de la presente memoria descriptiva y, junto con la descripción, sirven únicamente para ilustrar las realizaciones y no para limitar la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un dibujo esquemático de los cuatro dominios de una molécula de MHC de clase I: la cadena a que contiene los dominios a1, a2 y a3 y el cuarto dominio asociado no covalentemente, la microglobulina p2 (p2m). El círculo gris representa un péptido unido en las hendiduras de unión a péptidos.

La figura 2 es una representación esquemática (no está a escala) de la estructura genómica relativa del HLA humano, que muestra genes de clase I, II y III.

La figura 3 es una representación esquemática (que no está escala) de la estructura genómica relativa del MHC de ratón, que muestra genes de clase I, II y III.

La figura 4 ilustra una construcción de vector vírico que contiene un ADNc que codifica un polipéptido quimérico HLA-A/H-2K con un indicador IRES-GFP (A); e histogramas que comparan la expresión de HLA-A2 humano en células MG87 transducidas con HLA-A2 (línea discontinua), HLA-A2/H-2K (línea de puntos) o sin transducción (línea continua) bien solos (izquierda) o cotransducidos con microglobulina p2 humanizada (derecha) (B). Los datos de las ventanas de análisis horizontales presentadas gráficamente en (B) se ilustran como el porcentaje de células que expresan la construcción en la tabla en (C).

La figura 5 es un diagrama esquemático (no está a escala) de la estrategia dirigida usada para producir un locus de H-2K quimérico que expresa una región extracelular de una proteína de HLA-A2 humana. Las secuencias de ratón se representan en negro y las secuencias humanas se representan en blanco. L = líder, UTR = región no traducida, T<m>= dominio transmembrana, CIT = dominio citoplásmico, HIG = higromicina.

La figura 6A muestra la expresión (% de células totales) de HLA-A2 (izquierda) y H-2K (derecha) en células aisladas bien de un ratón de tipo salvaje (WT, "wild-type") o de un ratón heterocigoto que porta el locus quimérico HLA-A2/H-2K (HLA-A/H-2K HET).

La figura 6B es un gráfico de puntos de la expresiónin vivode la proteína quimérica HLA-A2/H-2K en un ratón heterocigoto que porta un locus quimérico HLA-A2/H-2K.

La figura 7 muestra una estrategia de localización (no está a escala) para la humanización de un gen de microglobulina p2 en un locus de microglobulina p2 de ratón. Las secuencias de ratón están en negro y las secuencias humanas están en blanco. NEO = neomicina.

La figura 8 muestra un diagrama de puntos representativo de la expresión de HLA de clase I y de microglobulina p2 humana en células aisladas de la sangre de ratones de tipo salvaje (WT), ratones heterocigotos para HLA-A2/H-2K quimérico y ratones heterocigotos para HLA-A2/H-2K quimérico y heterocigoto para microglobulina p2 humanizada (doble heterocigoto; HET clase I/p2m).

La figura 9 muestra un histograma representativo de la expresión de HLA de clase I humano (eje X) en células aisladas de la sangre de ratones de tipo salvaje (WT), ratones quiméricos HLA-A2/H-2K heterocigotos (HET clase I) y ratones quiméricos HLA-A2/H2K/microglobulina p2 humanizada doble heterocigotos (HET clase I/p2m).

La figura 10 muestra los resultados de los ensayos IFNy Elispot para linfocitos T humanos expuestos a células presentadoras de antígeno ("antigen-presenting cells", APC) de ratones de tipo salvaje (APC WT) o de ratones heterocigotos tanto para HLA-A2/H-2K quimérico como para microglobulina p2 humanizada (APC doble HET) en presencia de péptidos de la gripe (izquierda) o EBV (derecha). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional con una prueba posterior de comparación múltiple de Tukey.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

En el presente documento se describen ratones y ratas genéticamente modificados que expresan polipéptidos de MHC I y/o microglobulina p2 humanos o humanizados; embriones, células y tejidos que las comprenden; métodos para producir los mismos; así como métodos para utilizar los mismos. A menos que se definan de otro modo, todos los términos y expresiones utilizados en el presente documento incluyen los significados que los términos y las expresiones tienen en la técnica, a menos que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en el que se utiliza un término o una expresión.

El término "conservador", cuando se usa para describir una sustitución conservadora de aminoácidos, incluye la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). Se pueden conseguir sustituciones conservadoras de aminoácidos modificando una secuencia de nucleótidos con el fin de introducir un cambio de nucleótidos que codificará la sustitución conservadora. En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de interés de una proteína, por ejemplo, la capacidad del HCM I de presentar un péptido de interés. Algunos ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen cadenas laterales alifáticas, tales como glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; cadenas laterales de hidroxilo alifáticas, tales como serina y treonina; cadenas laterales que contienen amida, tales como asparagina y glutamina; cadenas laterales aromáticas, tales como fenilalanina, tirosina y triptófano; cadenas laterales básicas, tales como lisina, arginina e histidina; cadenas laterales ácidas, tales como ácido aspártico y ácido glutámico; y cadenas laterales que contienen, azufre tales como cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos conservadoras incluyen, por ejemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/arginina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato y asparagina/glutamina. Una sustitución de aminoácidos conservadora puede ser una sustitución de cualquier residuo natural en una proteína con alanina, tal como se usa, por ejemplo, en la mutagénesis por barrido de alanina. Se puede realizar una sustitución conservadora que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnetet al.(1992), "Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database", Science, 256:1443-1445). Una sustitución puede ser una sustitución moderadamente conservadora en donde la sustitución tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

Así pues, en el presente documento se divulga, para su uso de acuerdo con un método de la presente invención, un ratón o una rata genéticamente modificados cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor y un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, en donde el polipéptido o los polipéptidos comprenden sustituciones de aminoácidos conservadoras de la secuencia o secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento.

Un experto en la materia entenderá que, cuando se produce una adición a los residuos de los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de MHC I humano o humanizado y/o microglobulina p2 descritos en el presente documento, debido a la degeneración del código genético, otros ácidos nucleicos pueden codificar el polipéptido o polipéptidos descritos en el presente documento. Por consiguiente, además de una rata o un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido o polipéptidos de MHC I y microglobulina p2 con sustituciones de aminoácidos conservadoras, también se describe en el presente documento un ratón o rata cuyo genoma comprende una secuencia o secuencias de nucleótidos que difieren de las descritas en el presente documento debido a la degeneración del código genético para su uso de acuerdo con un método de la presente invención.

El término "identidad", cuando se usa junto con una secuencia, incluye la identidad determinada mediante una serie de algoritmos diferentes conocidos en la técnica que se pueden usar para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. Pueden determinarse las identidades usando una alineación ClustalW v. 1.83 (lenta) que emplea una penalización por apertura de hueco de 10,0, una penalización por extensión de hueco de 0,1, y que utiliza una matriz de similitud de Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). La longitud de las secuencias comparadas con respecto a la identidad de las secuencias dependerá de las secuencias concretas. La identidad puede determinarse comparando la secuencia de una proteína madura desde su extremo N-terminal a su extremo C-terminal. Cuando se compara una secuencia humana/no humana quimérica con una secuencia humana, la porción humana de la secuencia quimérica humana/no humana (pero no la porción no humana) puede usarse en la comparación con el fin de discernir un nivel de identidad entre una secuencia humana y una porción humana de una secuencia quimérica humana/no humana (por ejemplo, comparando un ectodominio humano de una proteína quimérica humana/ratón con un ectodominio humano de una proteína humana).

Los términos "homología" u "homólogo", en referencia a las secuencias, por ejemplo, secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, significan dos secuencias que, tras la alineación y la comparación óptimos, son idénticos en al menos aproximadamente el 75 % de nucleótidos o aminoácidos, al menos aproximadamente el 80 % de nucleótidos o aminoácidos, al menos aproximadamente el 90-95% de nucleótidos o aminoácidos, por ejemplo, más del 97 % de nucleótidos o aminoácidos. Un experto en la materia entenderá que, para la localización óptima de genes, la construcción de localización debe contener brazos homólogos a secuencias de ADN endógenas (es decir, "brazos de homología"); por tanto, se puede producir la recombinación homóloga entre la construcción de localización y la secuencia endógena diana.

La expresión "operativamente unido" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos de esta manera están en una relación que les permite actuar en su manera prevista. Así, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína puede estar unida operativamente a secuencias reguladoras (por ejemplo, un promotor, un potenciador, una secuencia silenciadora, etc.) con el fin de conservar la regulación de la transcripción adecuada. Además, diversas porciones de una proteína quimérica o humanizada pueden unirse operativamente para conservar el plegamiento, el procesamiento, la localización, la expresión y otras propiedades funcionales de la proteína en la célula. Salvo que se indique lo contrario, diversos dominios de las proteínas quiméricas o humanizadas de la invención se unen operativamente entre sí.

La expresión " complejo de MHC I" o similares, tal como se usan en el presente documento, incluye el complejo entre el polipéptido de cadena a de MHC I y el polipéptido de microglobulina p2. La expresión "polipéptido de MHC I" o similares, tal como se usan en el presente documento, incluye el polipéptido de cadena a de MHC I solo. Normalmente, las expresiones "MHC humano" y "HLA" se usan indistintamente.

El término "reemplazo", en referencia al reemplazo de genes, se refiere a situar material genético exógeno en un locus genético endógeno, reemplazando así la totalidad o una porción del gen endógeno por una secuencia del ácido nucleico ortóloga u homóloga. Tal como se demuestra en los ejemplos siguientes, las secuencias de los ácidos nucleicos de loci endógenos que codifican porciones de polipéptidos de MHC I y microglobulina p2 de ratón se reemplazaron por secuencias de nucleótidos que codifican porciones de polipéptidos de MHC I y microglobulina p2 humanos, respectivamente.

"Funcional", tal como se usa en el presente documento, por ejemplo, en referencia a un polipéptido funcional, se refiere a un polipéptido que conserva al menos una actividad biológica normalmente asociada con la proteína natural. Por ejemplo, un reemplazo en un locus endógeno (por ejemplo, un reemplazo en un locus de MHC I y/o de microglobulina p2 no humano endógeno) da como resultado un locus que no puede expresar un polipéptido endógeno funcional.

Varios aspectos descritos en el presente documento a continuación para los ratones y ratas con MHC I no humano genéticamente modificados descritos en el presente documento, por ejemplo, razas de animales; tipos celulares; métodos de selección, detección y otros métodos; métodos de uso; etc., serán aplicable a los ratones y ratas con MHC I/microglobulina p2 genéticamente modificados descritos en el presente documento para su uso de acuerdo con un método de la presente invención.

Animales con MHC I genéticamente modificados

En el presente documento se divulgan ratones y ratas genéticamente modificados que comprenden en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de MHC I humano o humanizado; por tanto, los ratones o ratas expresan un polipéptido de MHC I humano o humanizado. Los ratones y ratas para su uso de acuerdo con un método de la presente invención son como se definen en las reivindicaciones.

Los genes de MHC se clasifican en tres clases: clase I, clase II y clase III, las cuales son codificadas en el cromosoma 6 humano o en el cromosoma 17 de ratón. Un esquema de la organización relativa de las clases de MHC humano y de ratón se presenta en las figuras 2 y 3, respectivamente. Los genes de MHC se encuentran entre los genes más polimórficos de los genomas de ratón y humano. Se supone que los polimorfismos de MHC son importantes para proporcionar una ventaja evolutiva; los cambios en la secuencia pueden dar como resultado diferencias en la unión de péptidos que permite una mejor presentación de patógenos a linfocitos T citotóxicos.

La proteína de MHC de clase I comprende un dominio extracelular (que comprende tres dominios: a-i, a<2>y a<3>), un dominio transmembrana y una cola citoplásmica. Los dominios ai y a<2>forman la hendidura de unión a péptidos, mientras que a<3>interactúa con la microglobulina p2.

Además a su interacción con la microglobulina p2, el dominio a<3>interactúa con el correceptor TCR de CD8, facilitando la activación específica de antígeno. Aunque la unión de MHC de clase I al CD8 es de aproximadamente 100 veces más débil que la unión del TCR a MHC de clase I, la unión de CD8 potencia la afinidad de la unión de TCR. Wooldridgeet al.(2010), MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs, J. Immunol., 184:3357-3366. De manera interesante, al aumentar la unión de MHC de clase I a CD8 se anuló la especificad de antígeno en la activación de CTL.Id.

La unión de CD8 a moléculas de MHC de clase I es específica de especie; se ha demostrado que el homólogo de ratón de CD8, Lyt-2, se une a moléculas H-2Dd en el dominio a3, pero no se unió a moléculas HLA-A. Connollyet al.(1988), The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I a3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses, J. Exp. Med., 168:325-341. La unión diferencial se debió supuestamente a determinantes similares a CDR (similares a CDR1 y CDR2) sobre CD8 que no se habían conservado entre seres humanos y ratones. Sanderset al.(1991), Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies, J. Exp. Med., 174:371-379; Vitielloet al.(1991), Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex, J. Exp. Med., 173:1007-1015; y Gaoet al.(1997), Crystal structure of the complex between human CD8aa and HLA-A2, Nature, 387:630-634. Se ha indicado que CD8 se une a HLA-A2 en una región conservada en el dominio a3 (en la posición 223-229). Una única sustitución (V245A) en HLA-A redujo la unión de CD8 a HLA-A, con una reducción grande concomitante en la lisis mediada por linfocitos T. Salteret al.(1989), Polymorphism in the a3 domain of HLA-A molecules affects binding to CD8, Nature, 338:345-348. En general, el polimorfismo en el dominio a3 de las moléculas HLA-A también afectó la unión a CD8.Id.En ratones, la sustitución de aminoácidos en el resto 227 en H-2Dd afectó a la unión de Lyt-2 de ratón a H-2Dd, y las células transfectadas con un H-2Dd mutante no fueron lisadas por los linfocitos T CD8+. Potteret al.(1989), Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8-independent, cytotoxic T lymphocytes, Nature, 337:73-75.

Por consiguiente, debido a la especificidad de especie de la interacción entre el dominio a3 de MHC de clase I y CD8, un complejo de MHC I que comprende una sustitución de un dominio a3 de H-2K por un dominio a3 de HLA-A2 humano no fue funcional en un ratón (es decir,in vivo)en la ausencia de un CD8 humano. En animales transgénicos para HLA-A2, la sustitución del dominio a3 humano por el dominio a3 de ratón dio como resultado en el restablecimiento de la respuesta de linfocitos T. Irwinet al.(1989), Species-restricted interactions between CD8 and the a3 domain of class I influence the magnitude of the xenogeneic response, J. Exp. Med., 170:1091-1101; Vitielloet al.(1991),supra.

El dominio transmembrana y la cola citoplásmica de las proteínas de MHC de clase I de ratón también tienen funciones importantes. Una función del dominio transmembrana de MHC I es facilitar la modulación por HLA-A2 de la adhesión de células homotípicas (para potenciar o inhibir la adhesión), supuestamente como resultado de la reticulación (o unión) de moléculas de MHC de superficie. Wagneret al.(1994), Ligation of MHC Class I and Class II Molecules Can Lead to Heterologous Desensitization of Signal Transduction Pathways That Regulate Homotypic Adhesion in Human Lymphocytes, J. Immunol., 152:5275-5287. La adhesión celular puede verse afectada por mAb que se unen en diversos epítopos de la molécula de HLA-A2, lo que sugiere que existen múltiples sitios sobre HLA-A2 implicados en la modulación de la adhesión de células homotípicas; en función del epítopo unido, el efecto puede ser potenciar o inhibir la adhesión dependiente de HLA-A2.Id.

La cola citoplásmica, codificada por los exones 6 y 7 del gen de MHC I, es supuestamente necesaria para la expresión adecuada sobre la superficie celular y para la inhibición mediada por LIR1 de la citotoxicidad de linfocitos NK. Grudaet al.(2007), Intracellular Cysteine Residues in the Tail of m Hc Class I Proteins Are Crucial for Extracellular Recognition by Leukocyte Ig-Like Receptor 1, J. Immunol., 179:3655-3661. Se requiere una cola citoplásmica para la multimerización de al menos algunas moléculas de MHC I mediante la formación de enlaces disulfuro en sus residuos de cisteína y, de este modo, puede desempeñar un papel en la agrupación y reconocimiento por los linfocitos NK. Lynchet al.(2009), Novel MHC Class I Structures on Exosomes, J. Immunol., 183:1884-1891.

El dominio citoplásmico de HLA-A2 contiene un residuo de serina constitutivamente fosforilado y una tirosina fosforilable, aunque las moléculas de HLA-A2 mutantes en células Jurkat que carecen de un dominio citoplásmico parecen normales en cuanto a la expresión, la asociación citoesquelética, la agregación y la internalización endocítica. Guret al.(1997),Structural Analysis of Class I MHC Molecules: The Cytoplasmic Domain Is Not Required for Cytoskeletal Association, Aggregation, and Internalization, Mol. Immunol., 34(2):125-132. Las moléculas de HLA-A2 truncadas que carecen del dominio citoplásmico son aparentemente expresadas de forma normal y se asocian con la microglobulina p2.Id.

Sin embargo, varios estudios han demostrado que la cola citoplásmica es crítica en el tráfico intracelular, la presentación de antígenos mediada por células dendríticas ("dendritic cell", DC) y cebado de CTL. Se demostró que un residuo de tirosina codificado por el exón 6 era necesario para el tráfico de MHC I a través de compartimentos endosómicos, la presentación de antígenos exógenos y el cebado de CTL; mientras que la eliminación del exón 7 causó la potenciación de las respuestas de CTL antivíricas. Lizeeet al.(2003)m Control of Dendritic Cross-Presentation by the Major Histocompatibility Complex Class I Cytoplasmic Domain, Nature Immunol., 4:1065-1073; Bashaet al.(2008), MHC Class I Endosomal and Lysosomal Trafficking Coincides with Exogenous Antigen Loading in Dendritic Cells, PLoS ONE, 3: e3247; y Rodríguez-Cruzet al.(2011), Natural Splice Variant of MHC Class I Cytoplasmic Tail Enhances Dendritic Cell-Induced CD8+ T-Cell Responses and Boosts Anti-Tumor Immunity, PLoS ONE, 6:e22939.

En el presente documento se divulga un ratón o rata genéticamente modificado que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de MHC de clase I humano o humanizado. El ratón o la rata expresa un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor. El ratón o la rata sólo pueden expresar el polipéptido de MHC I humano o humanizado, por ejemplo, un polipéptido quimérico de MHC I humano/no humano, y no expresan una proteína de MHC I endógena no humana a partir de un locus de MHC I endógeno.

El polipéptido quimérico de MHC I humano/no humano comprende, en su porción humana, un dominio de unión a péptidos de un polipéptido de MHC I humano. La porción humana del polipéptido quimérico comprende un dominio extracelular de una cadena a de un MHC I humano. La porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1 y a2 de un MHC I humano. La porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1, a2 y a3 de un MHC I humano. En el ratón o la rata divulgados en el presente documento para su uso de acuerdo con un método de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, la porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a l, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano.

El polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor puede derivarse de una molécula de HLA humana funcional codificada por cualquiera de los loci HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F o HLA-G. Una lista de antígenos y alelos de HLA utilizados habitualmente se describe en Shankarkumaret al.(2004), The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Pharm. Genet., 4(2):91-103). Shankarkumaret al.también presentan una breve explicación de la nomenclatura de HLA utilizada en la técnica. Se puede encontrar más información con respecto a la nomenclatura de HLA y diversos alelos de HLA en Holdsworthet al.(2009), The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens, 73:95-170, y una reciente actualización de Marshet al.(2010), Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens, 75:291-455. Así pues, el polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor puede derivar de cualquiera de las moléculas de HLA de clase I funcionales humanas descritas en dichas referencias.

El polipéptido de MHC I humano o humanizado puede derivar de HLA-A humano. Por ejemplo, el polipéptido de HLA-A puede ser un polipéptido HLA-A2 (por ejemplo, un polipéptido HLA-A2.1). El polipéptido HLA-A puede ser un polipéptido codificado por un alelo HlA-A*0201, por ejemplo, alelo HLA-A*02:01 :01 :01 El alelo HLA-A*0201 se usa habitualmente entre la población norteamericana. Aunque los presentes ejemplos describen esta secuencia de HLA concreta, cualquier secuencia de HLA-A adecuada se incluye en el presente documento, por ejemplo, las variantes polimórficas de HLA-A2 presentes en la población humana, secuencias con una o más modificaciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, secuencias de ácidos nucleicos que difieren de la secuencia descrita en el presente documento debido a la degeneración del código genético, etc.

En el presente documento se divulga un ratón o una rata que expresa una secuencia de HLA-A2 humana, en donde la secuencia de HLA-A2 humana comprende una o más modificaciones conservadoras o no conservadoras.

En el presente documento se describe un ratón o una rata que expresa una secuencia de HLA-A2 humana en la que la secuencia de HLA-A2 humana es al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a la secuencia de HLA-A2 humana. Por ejemplo, la secuencia de HLA-A2 humana puede ser al menos aproximadamente un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a la secuencia de HLA-A2 humana descrita en los ejemplos. La secuencia de HLA-A2 human puede comprender una o más sustituciones conservadoras. La secuencia de HLA-A2 humana puede comprender una o más sustituciones no conservadoras.

El polipéptido de MHC I humano o humanizado puede derivar del MHC I humano seleccionado entre HLA-B y HLA-C. Por ejemplo, el MHC I humano o humanizado puede derivar de HLA-B, por ejemplo, HLA-B27.

La porción de roedor del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende dominios transmembrana y/o citoplásmicos del polipéptido de MHC I de roedor. Cuando el roedor es un ratón, los polipéptidos de MHC I no humanos pueden seleccionarse de H-2K, H-2D y H-2L. El polipéptido de MHC I de roedor puede ser H-2K, por ejemplo, H-2Kb. Aunque se describen secuencias de H-2K específicas en los ejemplos, cualquier secuencia de H-2K adecuada, por ejemplo, las variantes polimórficas, las sustituciones de aminoácidos conservadoras/no conservadoras, etc., se incluyen en el presente documento.

La rata o el ratón descritos en el presente documento comprenden en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido está situada en un locus de MHC I endógeno de roedor (por ejemplo, locus H-2K). Esto puede dar como resultado el reemplazo de un gen de MHC I endógeno o una porción del mismo por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, por ejemplo, un gen quimérico que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor descrito en el presente documento. El reemplazo puede comprender el reemplazo de una secuencia de nucleótidos endógena que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I de roedor por una secuencia de nucleótidos humana (por ejemplo, secuencia de nucleótidos de HLA-A2) que codifica el mismo. En este caso, el reemplazo no comprende el reemplazo de una secuencia de MHC I que codifica dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido de MHC I de roedor (por ejemplo, polipéptido H-2K). Así pues, la rata o el ratón contiene una secuencia de nucleótidos quimérica humana/roedor en un locus de MHC I endógeno, y expresa un polipéptido quimérico de MHC humano/roedor a partir del locus de MHC I endógeno.

Un polipéptido quimérico humano/roedor puede ser tal que comprende una secuencia líder (señal) humana o de roedor. El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia líder de roedor de una proteína de MHC I endógena. El polipéptido quimérico puede comprender una secuencia líder de una proteína de MHC I humana, por ejemplo, la proteína HLA-A2 (por ejemplo, secuencia líder de HLA-A2.1). Así pues, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de MHC I quimérico puede estar operativamente unida a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder de MHC I humana.

Un polipéptido de MHC I quimérico humano/no humano puede comprender en su porción humana un dominio extracelular completo o sustancialmente completo de un polipéptido de MHC I humano. Así pues, la porción humana puede comprender al menos el 80 %, preferentemente al menos el 85 %, más preferentemente al menos el 90 %, por ejemplo, el 95 % o más de los aminoácidos que codifican un dominio extracelular de un polipéptido de MHC I humano (por ejemplo el polipéptido HLA-2A). En un ejemplo, el dominio extracelular sustancialmente completo del polipéptido de MHC I humano carece de una secuencia líder de MHC I humana. En otro ejemplo, el polipéptido quimérico de MHC I humano/no humano comprende una secuencia líder de MHC I humana.

El polipéptido quimérico de MHC I puede expresarse bajo el control de elementos reguladores de roedor endógenos, por ejemplo, elementos reguladores de MHC I de roedor. Tal disposición facilitará la expresión adecuada del polipéptido quimérico de MHC I en el ratón o la rata, por ejemplo, durante la respuesta inmunitaria en el ratón o la rata.

El animal no humano genéticamente modificado para su uso de acuerdo con un método de la presente invención es un ratón o una rata. Cuando no se dispone fácilmente de células ES genéticamente modificables adecuadas, se emplean otros métodos para producir un ratón o una rata que comprenda la modificación genética. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, modificar el genoma de una célula no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un ratón o rata en condiciones adecuadas para formar un embrión.

El roedor se selecciona entre un ratón y una rata. En una realización, el animal no humano es un ratón.

En una realización específica, el ratón para su uso de acuerdo con un método de la presente invención es de una raza C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En otra realización, el ratón es de una raza 129 seleccionada entre el grupo que consiste en una raza que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (véase, por ejemplo, Festinget al.(1999), Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome, 10:836, véase también, Auerbachet al.(2000), Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En una realización específica, el ratón genéticamente modificado es una mezcla de una raza 129 anteriormente mencionada y una raza C57BL/6 anteriormente mencionada. En otra realización específica, el ratón es una mezcla de las razas 129 anteriormente mencionadas, o una mezcla de las razas BL/6 anteriormente mencionadas. En una realización específica, la raza 129 de la mezcla es una raza 129S6 (129/SvEvTac). En otra realización, el ratón es de una raza BALB, por ejemplo, raza BALB/c. En otra realización, el ratón es una mezcla de una raza BALB y otra raza anteriormente mencionada.

En una realización, la rata para su uso de acuerdo con un método de la presente invención se selecciona de una rata Wistar, una raza LEA, una raza Sprague Dawley, una raza Fischer, F344, F6 y Dark Agouti. En una realización, la raza de la rata es una mezcla de dos o más razas seleccionadas entre el grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 y Dark Agouti.

Así pues, en el presente documento se divulga, para su uso de acuerdo con un método de la presente invención, un ratón genéticamente modificado que comprende en su genoma, además de una secuencia que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano como se establece en las reivindicaciones, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1, a2 y a3 de un MHC I humano (por ejemplo, HLA-A humano, por ejemplo, HLA-A2 humano, por ejemplo, HLA-A2.1 humano). En algunas realizaciones, el ratón no expresa los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido endógeno de ratón a partir de su locus endógeno de ratón. En una realización, el locus endógeno de ratón es un locus H-2K (por ejemplo, H-2Kb) y la porción de ratón del polipéptido quimérico comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido H-2K de ratón (por ejemplo, H-2Kb).

Así pues, en el presente documento se divulga, para su uso de acuerdo con un método de la presente invención, un ratón genéticamente modificado, en donde, además de comprender una secuencia que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano como se establece en las reivindicaciones, el ratón comprende, en su locus H-2K endógeno (por ejemplo, H-2Kb), una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón, en donde una porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido HLA-A2 humano (por ejemplo, HLA-A2.1) y una porción de ratón comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido H-2K de ratón (por ejemplo, H-2Kb). En un aspecto, el ratón no expresa los dominios a1, a2 y a3 del polipéptido H-2K de ratón (por ejemplo, H-2Kb) a partir de un locus de MHC I endógeno. En una realización, el ratón expresa un polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K (por ejemplo, un polipéptido quimérico HLA-A2.1/H-2Kb) a partir de un locus H-2K endógeno (por ejemplo, H-2Kb). En diversas realizaciones, la expresión del gen quimérico está bajo el control de los elementos reguladores de MHC de clase I endógenos de ratón. En algunos aspectos, el ratón comprende dos copias del locus de MHC I quimérico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K; mientras que, en otros aspectos, el ratón comprende una copia del locus de MHC I quimérico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico h LA-A2/H-2K. Así pues, el ratón puede ser homocigoto o heterocigoto para la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K.

En el presente documento se divulga, para su uso de acuerdo con un método de la presente invención, un ratón que, además de comprender una secuencia que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humana como se establece en las reivindicaciones, comprende un locus de MHC I quimérico situado en un locus H-2K de ratón endógeno. El locus quimérico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a l, a2 y a3 de un gen HLA-A2 humano. El locus quimérico carece de una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 del H-2K de ratón. En un aspecto, el locus quimérico carece de una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido líder, los dominios a1, a2 y a3 de un H-2K de ratón; y comprende un péptido líder, los dominios a1, a2 y a3 de un HLA-A2 humano y dominios transmembrana y citoplasmáticos de un H-2k de ratón. Los diversos dominios del locus quimérico están operativamente unidos entre sí de manera que el locus quimérico expresa una proteína de MHC I quimérica humana/ratón funcional.

Un ratón o una rata que expresa una proteína de MHC I quimérica funcional a partir de un locus de MHC I quimérico como se describe en el presente documento, puede presentar la proteína quimérica en una superficie celular. El ratón o la rata puede expresar la proteína de MHC I quimérica en una superficie celular en una distribución celular que es la misma que la observada en un ser humano. La célula puede presentar un fragmento de péptido (un fragmento de antígeno) unido a una porción extracelular (por ejemplo, porción extracelular de HLA-A2 humano) de la proteína de MHC I quimérica. La porción extracelular de dicha proteína quimérica puede interactuar con otras proteínas en la superficie de dicha célula, por ejemplo, microglobulina p2.

Una célula que presenta la proteína de MHC I quimérica, por ejemplo, la proteína HLA-A2/H-2K, puede ser una célula nucleada. La célula puede ser una célula presentadora de antígenos (APC). Aunque la mayoría de las células del cuerpo pueden presentar un antígeno en el contexto del MHC I, algunos ejemplos no limitantes de células presentadoras de antígenos incluyen macrófagos, células dendríticas y linfocitos B. Otras células presentadoras de antígenos, que incluyen APC profesionales y no profesionales, se conocen en la técnica. La célula que presenta la proteína de MHC I quimérica puede ser una célula tumoral, y un fragmento peptídico presentado por la proteína quimérica puede derivarse de un tumor. El fragmento peptídico presentado por la proteína de MHC I quimérica puede derivarse de un patógeno, por ejemplo, una bacteria o un virus.

La proteína de MHC I quimérica I descrita en el presente documento puede interactuar con otras proteínas en la superficie de la misma célula o de una segunda célula. La proteína de MHC I quimérica puede interactuar con proteínas endógenas de ratón o de rata en la superficie de dicha célula. La proteína de MHC I quimérica también puede interactuar con proteínas humanas o humanizadas en la superficie de la misma célula o de una segunda célula.

En la misma célula, las moléculas de HLA de clase I pueden interactuar funcionalmente con la microglobulina p2 humana y de ratón o rata. Así pues, la proteína de MHC I quimérica, por ejemplo, la proteína HLA-A2/H-2K, puede interactuar con una microglobulina p2 de ratón. Aunque es posible la interacción entre algunas moléculas de HLA de clase I humanas y la microglobulina p2 de ratón, no obstante, esto puede reducirse en gran medida en comparación con la interacción entre el HLA de clase I humano y la microglobulina p2 humana. Así pues, en ausencia de microglobulina p2 humana, se puede reducir la expresión de MHC I humano en la superficie celular. Perarnauet al.(1988), Human p2-microglobulin Specifically Enhances Cell-Surface Expression of HLA Class I Molecules in Transfected Murine Cells, J. Immunol., 141:1383-1389. Otras moléculas de HLA, por ejemplo, HLA-B27, no interactúan con la microglobulina p2 de ratón; véase, por ejemplo, Tishonet al.(2000), Transgenic Mice Expressing Human HLA and CD8 Molecules Generate HLA-Restricted Measles Virus Cytotoxic T Lymphocytes of the Same Specificity as Humans with Natural Measles Virus Infection, Virology, 275:286-293, que notifica que la función de HLA-B27 en ratones transgénicos requiere tanto la microglobulina p2 humana como c D8 humano. Por consiguiente, la proteína de MHC I quimérica interactúa con una microglobulina p2 humana o humanizada. En tal caso, el ratón o la rata puede comprender en su genoma un gen de microglobulina p2 humano o humanizado, y el ratón o la rata puede expresar un polipéptido de microglobulina p2 funcional humano o humanizado; por consiguiente, la proteína de MHC I quimérica interactúa con un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado.

La proteína quimérica (por ejemplo, la proteína HLA-A2/H-2K) también puede interactuar con proteínas en la superficie de una segunda célula (a través de su porción extracelular). La segunda célula puede ser una célula de ratón, rata o de origen humano. La segunda célula puede derivar del mismo ratón o rata o de la misma especie de ratón o rata que la célula que expresa el polipéptido de MHC I quimérico. Algunos ejemplos no limitantes de proteínas con las que la porción extracelular de una proteína quimérica (por ejemplo, HLA-A2/H-2K) puede interactuar incluyen el receptor de linfocitos T (TCR) y su correceptor<c>D8. Así pues, una segunda célula puede ser un linfocito T. Además, la porción extracelular de la proteína de MHC I quimérica puede unirse a una proteína en la superficie de los linfocitos citolíticos naturales ("Natural Killer", NK), por ejemplo, los receptores de inmunoglobulina de los linfocitos NK ("killer immunoglobulin receptors", KIR) en la superficie de los linfocitos NK.

Un linfocito T o linfocito NK puede unirse a un complejo formado entre el polipéptido de MHC I quimérico y su fragmento peptídico presentado. Dicha unión puede dar como resultado la activación de linfocitos T o la inhibición de la muerte celular mediada por NK, respectivamente. Una hipótesis es que los linfocitos NK han evolucionado para destruir células infectadas o tumorales que han eludido la citotoxicidad mediada por linfocitos T al regular a la baja su complejo MHC I. Sin embargo, cuando el complejo MHC I se expresa en la superficie celular, los receptores de linfocitos NK lo reconocen y se inhibe la destrucción celular mediada por NK. Así pues, en algunos casos, cuando un linfocito NK se une a un complejo formado entre el polipéptido de MHC I quimérico (por ejemplo, el polipéptido HLA-A2/H-2K) y un fragmento peptídico presentado en la superficie de la célula infectada o tumoral, se inhibe la destrucción celular mediada por NK.

El polipéptido de MHC I quimérico descrito en el presente documento, por ejemplo, un polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K, puede interactuar con la proteína CD8 en la superficie de una segunda célula. El polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K puede interactuar con la proteína CD8 endógena de ratón o rata en la superficie de una segunda célula. La segunda célula puede ser un linfocito T. La segunda célula puede diseñarse para expresar CD8. El polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K puede interactuar con un CD8 humano en la superficie de la segunda célula (por ejemplo, una célula humana o una célula de ratón o rata). El ratón o la rata pueden comprender un transgén CD8 humano y una proteína CD8 humana funcional.

El polipéptido de MHC I quimérico descrito en el presente documento también puede interactuar con un TCR de ratón o rata, con un TCR humano o con un TCR humanizado en una segunda célula. El polipéptido de MHC I quimérico puede interactuar con un TCR endógeno de ratón o de rata en la superficie de una segunda célula. El polipéptido de MHC I quimérico también puede interactuar con un TCR humano o humanizado expresado en la superficie de una segunda célula, en donde la célula deriva del mismo ratón o rata o especie de ratón o de rata que la célula que expresa el polipéptido de MHC I quimérico. El polipéptido de MHC I quimérico también puede interactuar con un TCR humano expresado en la superficie de una célula humana.

También se describe en el presente documento un embrión de ratón o de rata en donde el embrión comprende una célula ES donante que deriva de un ratón o una rata como se describe en el presente documento. El embrión puede comprender una célula donante ES que comprende el gen de MHC I quimérico y las células embrionarias del hospedador.

En el presente documento también se describe un tejido, en donde el tejido deriva de un ratón o una rata como se describe en el presente documento, y expresa el polipéptido quimérico de MHC I (por ejemplo, polipéptido HLA-A2/H-2K).

También se describe en el presente documento una célula de rata o ratón aislada de una rata o ratón como se describe en el presente documento. La célula puede ser una célula ES. La célula puede ser una célula presentadora de antígenos, por ejemplo, una célula dendrítica, un macrófago, un linfocito B. La célula puede ser una célula inmunitaria, tal como un linfocito.

También se describe en el presente documento un ratón o rata que comprende un cromosoma o un fragmento del mismo de un ratón o rata como se describe en el presente documento. La célula de ratón o rata puede comprender un núcleo de un ratón o rata como se describe en el presente documento. La célula de ratón o rata puede comprender el cromosoma o un fragmento del mismo como resultado de una transferencia nuclear.

También se describe en el presente documento una célula pluripotente inducida de ratón o rata que comprende un gen que codifica un polipéptido quimérico de MHC I (por ejemplo, el polipéptido HLA-A2/H-2K) como se describe en el presente documento. La célula pluripotente inducida puede derivarse como se describe en el presente documento.

También se divulgada en el presente documento un hibridoma o cuadroma, derivado de una célula de un ratón o rata como se describe en el presente documento.

También se describe en el presente documento un método para producir un ratón o una rata genéticamente modificado descrito en el presente documento. El método para producir un ratón o una rata genéticamente modificado da como resultado un ratón o una rata cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de MHC I quimérico. El método puede dar como resultado un ratón genéticamente modificado, cuyo genoma comprende un locus de MHC I endógeno, por ejemplo, un locus H-2K, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón, en donde la porción humana del polipéptido de MHC I quimérico comprende los dominios a l, a2 y a3 de un HLA-A2 humano, y la porción de ratón comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un H-2K de ratón. El método puede utilizar una construcción de localización preparada utilizando la tecnología VELOCIGENE®, introduciendo la construcción en células ES, e introduciendo los clones de células ES de localización en un embrión de ratón utilizando la tecnología VELOCIMOUSE®, como se describe en los ejemplos. Las células ES pueden ser una mezcla de razas de ratón 129 y C57BL/6 o una mezcla de razas de ratón BALB/c y 129.

También se describe en el presente documento una construcción de nucleótidos utilizada para generar ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento. La construcción de nucleótidos puede comprender: brazos de homología 5' y 3' no humanos, un fragmento de ADN humano que comprende secuencias del gen HLA-A humano y un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación. El fragmento de ADN humano puede ser un fragmento genómico que comprende tanto intrones como exones de un gen HLA-A humano. Los brazos de homología de roedores pueden ser homólogos a un locus de MHC de clase I de roedor (por ejemplo, un locus H-2K de ratón).

El fragmento genómico puede comprender un líder de HLA-A humano, y una secuencia codificante de un dominio a l, un dominio a2 y un dominio a3. El fragmento de ADN humano puede comprender, de 5 'a 3': una secuencia líder de HLA-A, un líder/intrón a l de HLA-A, un exón a l de HLA-A, un intrón a1-a2 de HLA-A, un exón a2 de HLA-A, un intrón a2-a3 de HLA-Ay un exón a3 de HLA-A.

Un casete de selección es una secuencia de nucleótidos insertada en una construcción de localización para facilitar la selección de células (por ejemplo, células ES) que han integrado la construcción de interés. Un serie de casetes de selección adecuados son conocidos en la técnica. Habitualmente, un casete de selección permite la selección positiva en presencia de un antibiótico concreto (por ejemplo, Neo, Hig, Pur, CM, Spec, etc.). Además, un casete de selección puede estar flanqueado por sitios de recombinación que permiten la deleción del casete de selección tras el tratamiento con enzimas recombinasas. Los sitios de recombinación utilizados habitualmente sonloxPyFrt,reconocidos por las enzimas Cre y Flp, respectivamente, pero se conocen otros en la técnica.

El casete de selección puede estar situado en el extremo 5' del fragmento de ADN humano. El casete de selección puede estar situado en el extremo 3' del fragmento de ADN humano. El casete de selección puede estar situado dentro del fragmento de ADN humano. El casete de selección puede estar situado dentro de un intrón del fragmento de ADN humano. El casete de selección puede estar ubicado dentro del intrón a2-a3.

Los brazos de homología no humanos 5 'y 3' pueden comprender una secuencia genómica en ubicaciones 5' y 3' de un locus del gen de MHC de clase I endógeno de roedor (por ejemplo, murino), respectivamente (por ejemplo, 5' de la primera secuencia líder y 3' del exón a3 del gen de MHC I no humano). El locus del MHC de clase I endógeno puede seleccionarse entre H-2K, H-2D y H-2L. El locus del MHC de clase I endógeno puede ser H-2K de ratón.

Una construcción de nucleótidos puede comprender, de 5' a 3': un brazo de homología 5' que contiene la secuencia genómica de ratón 5' del locus H-2K de ratón endógeno, un primer fragmento de ADN humano que comprende una primera secuencia genómica de un gen HLA-A, un sitio de secuencia de recombinación 5' (por ejemplo,loxP),un casete de selección, un sitio de secuencia de recombinación 3' (por ejemplo,loxP),un segundo fragmento de ADN humano que comprende una segunda secuencia genómica de un gen HLA-A y un brazo de homología 3' que contiene la secuencia genómica de ratón 3' de un exón a3 de H-2K endógeno. La construcción de nucleótidos puede comprender, de 5 'a 3': un brazo de homología 5' que contiene la secuencia genómica de ratón 5' del locus H-2K de ratón endógeno, una secuencia genómica humana que incluye un líder de HLA-A, una secuencia líder/intrón a l de HLA-A, un exón a l de HLA-A, un intrón a1-a2 de HLA-A, un exón a2 de HLA-A, una primera porción 5' de un intrón a2-a3, un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación, una segunda porción 3' de un intrón a2-a3, un exón a3 de HLA-A y un brazo de homología 3' que contiene la secuencia genómica no de ratón 3' del exón a3 de H-2K de ratón endógeno. Un ejemplo de una secuencia de brazo de homología 5' se expone en la SEQ ID NO: 1, y un ejemplo de una secuencia de brazo de homología 3' se expone en la SEQ ID NO: 2.

Tras completar la localización del gen, las células ES o los ratones o ratas genéticamente modificados se seleccionaron para confirmar la incorporación correcta de la secuencia de nucleótidos exógena de interés o la expresión del polipéptido exógeno. Los expertos en la materia conocen numerosas técnicas que incluyen, entre otras, la transferencia Southern, PCR larga, PCT cuantitativa (por ejemplo, PCR en tiempo real usando TAQMAN®), hibridaciónin situcon fluorescencia, transferencia Northern, citometría de flujo, análisis por transferencia Western, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, etc. En un ejemplo, los ratones que portan la modificación genética de interés pueden identificarse mediante selección para la pérdida de alelos del ratón y/o la ganancia de alelos humanos utilizando una modificación del ensayo de alelos descrito en Valenzuelaet al.(2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech., 21(6):652-659. Los expertos en la materia conocen otros ensayos que identifican una secuencia de nucleótidos o aminoácidos específica en los animales modificados genéticamente.

También se describe en el presente documento un método para modificar un locus de MHC I de un ratón o rata para expresar un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor descrito en el presente documento. Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para modificar un locus de MHC I de un ratón para expresar un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón, en donde el método puede comprender reemplazar, en un locus de MHC I endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC de ratón por una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano. Es posible que el ratón no pueda expresar los dominios a1, a2 y a3 del MHC I de ratón a partir de un locus de MHC I endógeno. Una secuencia de nucleótidos de los dominios a1, a2 y a3 de un H-2K de ratón pueden reemplazarse por una secuencia de nucleótidos de los dominios a1, a2 y a3 de un HLA-A2 humano, de modo que el locus de MHC I de ratón modificado exprese un polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K.

También se describe en el presente documento un método para preparar una molécula quimérica de HLA de clase I humano/MHC de clase I de roedor, que comprende expresar en una sola célula una proteína quimérica HLA-A/H-2K a partir de una construcción de nucleótidos, en donde la construcción de nucleótidos comprende una secuencia de ADNc que codifica un dominio a1, a2 y a3 de una proteína HLA-A y un dominio transmembrana y citoplásmico de una proteína H-2K de roedor, por ejemplo, una proteína H-2K de ratón. La construcción de nucleótidos puede ser un vector viral, tal como un vector lentiviral. La célula puede seleccionarse entre una célula CHO, COS, 293, HeLa y una célula retiniana que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).

También se describe en el presente documento una célula que expresa una proteína quimérica de HLA de clase I humano/MHC I de roedor (por ejemplo, proteína HLA-A/H-2K). La célula puede comprender un vector de expresión que comprende un gen quimérico de MHC de clase I, en donde el gen quimérico de MHC de clase I comprende una secuencia de un gen HLA-A humano fusionado en unión operativa con una secuencia de un gen H-2K de roedor, por ejemplo, un gen H-2K de ratón. La secuencia del gen HLA-A humano comprende los exones que codifican los dominios a l, a2 y a3 de una proteína HLA-A. La secuencia del gen H-2K no humano comprende los exones que codifican los dominios transmembrana y citoplásmicos de una proteína H-2K. La célula se selecciona entre células CHO, COS, 293, HeLa y una célula retiniana que expresa una secuencia de ácido nucleico viral (por ejemplo, una célula PERC.6™).

También se describe en el presente documento una molécula quimérica de MHC de clase I producida por una rata o un ratón, en donde la molécula quimérica de MHC de clase I comprende los dominios a1, a2 y a3 de una proteína HLA-A humana y dominios transmembrana y citoplásmicos de un roedor, por ejemplo, ratón, proteína H-2K. El polipéptido quimérico de MHC I divulgado en el presente documento puede detectarse mediante anticuerpos anti-HLA-A. Así pues, una célula que presente un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor puede detectarse y/o seleccionarse usando anticuerpo anti-HLA-A. En algunos casos, el polipéptido quimérico de MHC I descrito en el presente documento puede detectarse mediante un anticuerpo anti-HLA-A2.

Aunque los siguientes ejemplos describen un animal genéticamente modificado cuyo genoma comprende el reemplazo de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular del polipéptido H-2K de ratón por la secuencia que codifica un dominio extracelular de un HLA-A humano en el locus H-2K de ratón endógeno, un experto en la técnica entendería que se puede usar una estrategia similar para reemplazar otros loci de MHC I de ratón (H-2D, H-2L, etc.) por sus correspondientes loci de HLA humanos (HLA-B, HLA-C, etc.). Así pues, en el presente documento se divulga también una rata o un ratón que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor en donde una porción humana del polipéptido deriva de otra proteína de HLA de clase I. También se contempla el reemplazo de múltiples loci de MHC I.

Animales con p2 microglobulina genéticamente modificados

En el presente documento se divulgan ratas y ratones genéticamente modificados que comprenden en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado; por tanto, las ratas y los ratones expresan un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado.

La microglobulina p2 o la cadena ligera del complejo MHC de clase I (también abreviada "p2M") es una proteína pequeña (12 kDa) no glicosilada, que actúa principalmente para estabilizar la cadena a de MHC I. El gen de microglobulina p2 humano codifica una proteína de 119 aminoácidos, con 20 aminoácidos N-terminales que codifican una secuencia líder. La proteína madura comprende 99 aminoácidos. El gen contiene 4 exones, en el que el primer exón contiene la región no traducida 5', la secuencia líder completa y los primeros dos aminoácidos del polipéptido maduro; el segundo exón codifica la mayoría de la proteína madura; el tercer exón codifica los últimos cuatro aminoácidos de la proteína madura y un codón de terminación; y el cuarto exón contiene la región 3' no traducida. Gussowet al.(1987), The p2-Microglobulin Gene. Primary Structure and Definition of the Transcriptional Unit, J. Immunol., 139:3131-3138. La microglobulina p2 se asocia de forma no covalente con el MHC I. La microglobulina p2 no unida se encuentra en los líquidos corporales, tales como el plasma, y se transporta al riñón para su excreción. La disfunción renal provoca la acumulación de microglobulina p2, que puede ser patógena (por ejemplo, amiloidosis relacionada con la diálisis); la proteína acumulada forma fibrillas filamentosas que se asemejan a las placas amiloides en las articulaciones y los tejidos conjuntivos.

Además de la amiloidosis relacionada con la diálisis, la microglobulina p2 está implicada en varios trastornos diferentes. Se detectaron niveles elevados de microglobulina p2 en neoplasias linfocíticas, por ejemplo, linfoma no hodgkiniano y mieloma múltiple. Véase, por ejemplo, Shiet al.(2009), p2 Microglobulin: Emerging as a Promising Cancer Therapeutic Target, Drug Discovery Today, 14:25-30. Algunas otras neoplasias malignas con niveles elevados de microglobulina p2 incluyen cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer renal, cánceres gastrointestinal y nasofaríngeo. Se ha sugerido que la sobreexpresión de la microglobulina p2 tiene efectos estimuladores del crecimiento tumoral.Id.También se ha demostrado recientemente que la microglobulina p2 impulsa la transición epitelial a mesenquimatosa, favoreciendo la metástasis de huesos y tejidos blandos en el cáncer de mama, próstata, pulmón y riñón. Jossonet al.(2011), p2 microglobulin Induces Epitelial to Mesenchymal Transition and Confers Cancer Lethality and Bone Metastasis in Human Cancer Cells. Cancer Res., 71(7): 1-11. La microglobulina p2 interactúa con un miembro no clásico de MHC I, la proteína de hemocromatosis (HFE) y con el receptor de transferrina, y modula la homeostasia del hierro.Id.La participación de la microglobulina p2 en otros signos distintivos de neoplasia (autorrenovación, potenciación de la angiogénesis, resistencia al tratamiento) está ampliamente documentada en la técnica.

Se han notificado ratones deficientes en microglobulina p2. Véase, Kolleret al.(1990), Normal development of mice deficient in p2m, MHC class I proteins, and CD8+ T cells, Science, 248: 1227-1230. Tal como se indica en Kolleret al.,estos ratones parecían sanos, aunque no se detectó la expresión de MHC de clase I. Además, la mayoría de las poblaciones de linfocitos T parecían normales en algunos tejidos, mientras que en otros se observó una marcada disminución de los linfocitos T CD8+. Esta supuesta falta de expresión de MHC I no está de acuerdo con los resultados anteriores obtenidos por Allenet al.((1986) p2 microglobulin Is Not Required for Cell Surface Expression of the Murine Class I Histocompatibility Antigen H-2Db or of a Truncated H-2Db, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7447-7451). Allenet al.notificaron que la microglobulina p2 no era absolutamente necesaria para la expresión en la superficie celular de todos los complejos de MHC I, porque las células que carecían de microglobulina p2 fueron capaces de expresar H-2Db. Sin embargo, supuestamente, la función de H-2Db en estas células estaba comprometida, y la conformación de H-2Db era diferente de la proteína natural, lo que explica la incapacidad de Koller y sus colegas para detectar esta proteína utilizando anticuerpos contra H-2Db natural. Sin embargo, según se notificó, las células que carecían de microglobulina p2 podían presentar antígenos endógenos a los linfocitos T CD8 (incluidos los linfocitos T CD8 exógenos de ratones normales) y, según se notificó, no se requería la microglobulina p2 para desarrollar altos niveles de CTL CD8+ restringidos por MCH de clase I H-2d en respuesta a la exposición al antígeno en ratones, aunque era necesaria para mantener una respuesta inmunitaria eficaz. Quinnet al.(1997), Virus-Specific, CD8+ Major Histocompatibility Complex Class I-Restricted Cytotoxic T Lymphocytes in Lymphocytic Choriomeningitis Virus-Infected p2-Microglobulin-Deficient Mice, J. Virol., 71:8392-8396. Cabe destacar que la capacidad de generar altos niveles de tales linfocitos T en ausencia de microglobulina p2 está limitada, según se ha notificado, a una respuesta restringida por MHC de clase I H-2d. Se ha notificado que los ratones deficientes en microglobulina p2 tienen una serie de características notables, tales como, por ejemplo, una mayor susceptibilidad a algunas enfermedades parasitarias, una mayor susceptibilidad a las infecciones de hepatitis, una deficiencia en el metabolismo del hierro y un fenotipo reproductivo alterado. Cooperet al.(2007), An impaired breeding phenotype in mice with a genetic deletion of Beta-2 microglobulin and diminished MHC class I expression: Role in reproductive fitness, Biol. Reprod., 77:274-279.

Se han notificado ratones que expresan microglobulina p2 humana, así como moléculas de HLA de clase I humanas (es decir, HLA-B7) en un transgén insertado aleatoriamente. Chamberlainet al.(1988), Tissue-specific and cell surface expression of human major histocompatibility complex class I heavy (HLA-B7) and light (p2-microglobulin) chain genes in transgenic mice, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , 85:7690-7694. La expresión de HLA de clase I humano fue coherente con la de la clase I endógena con una disminución marcada en el hígado.Id.La expresión de la microglobulina p2 humana también fue coherente con la microglobulina p2 endógena, mientras que la expresión de la molécula HLA de clase I humana aumentó de 10 a 17 veces en ratones dobles transgénicos. Id. Sin embargo, los autores no intentaron un reemplazo de un locus de microglobulina p2 endógeno de ratón por un locus de microglobulina p2 humana.

Por consiguiente, en el presente documento se divulga un roedor modificado genéticamente, (por ejemplo, un ratón o una rata) cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. La rata o el ratón pueden no expresar una microglobulina p2 endógena de roedor a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno de roedor. La secuencia de nucleótidos puede codificar un polipéptido de microglobulina que es parcialmente humano y parcialmente de no humano, por ejemplo, contiene algunos aminoácidos que corresponden a la microglobulina p2 humana y algunos aminoácidos que corresponden a microglobulina p2 no humana. La rata o el ratón pueden no expresar un polipéptido de microglobulina p2 de roedor endógeno a partir de un locus de roedor endógeno, y solo expresar el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. El roedor puede no expresar un polipéptido de microglobulina p2 endógeno de roedor completo, sino que sólo expresa una porción de un polipéptido de microglobulina p2 endógeno de roedor a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno. Así pues, la rata o el ratón pueden no expresar un polipéptido de microglobulina p2 no humano funcional a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno de roedor. En un ejemplo específico, la secuencia de nucleótidos que codifica la microglobulina p2 humana o humanizada se sitúa en un locus de microglobulina p2 de roedor endógeno. La rata o el ratón pueden comprender dos copias del locus de microglobulina p2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. La rata o el ratón pueden comprender una copia del locus de microglobulina p2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. Así pues, la rata o el ratón pueden ser homocigoto o heterocigoto para el locus de microglobulina p2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. La secuencia de nucleótidos de la microglobulina p2 humana o humanizada puede derivar de una colección de secuencias de microglobulina p2 que se encuentran de modo natural en poblaciones humanas. La rata o el ratón descritos en el presente documento pueden ser modificados genéticamente. La rata o el ratón descritos en el presente documento pueden comprender en su línea germinal una secuencia de nucleótidos que codifica una microglobulina p2 humana o humanizada. La secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de microglobulina p2 humana. El polipéptido puede ser capaz de unirse a una proteína de MHC I.

La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede comprender residuos de ácido nucleico correspondientes al gen de microglobulina p2 humano completo. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede comprender residuos de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 21-119 de una proteína de microglobulina p2 humana (es decir, residuos de aminoácidos correspondientes a la microglobulina p2 humana madura). Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede comprender residuos de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 23-115 de una proteína microglobulina p2 humana, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 23-119 de una proteína microglobulina p2 humana. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la microglobulina p2 humana se describen en Gussowet al., supra.

Así pues, el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede comprender la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 23-115 de un polipéptido de microglobulina p2 humano, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 23-119 de un polipéptido de microglobulina p2 humano, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos expuesta en los aminoácidos 21-119 de un polipéptido de microglobulina p2 humano. Como alternativa, la microglobulina p2 humana puede comprender los aminoácidos 1-119 de un polipéptido de microglobulina p2 humano.

La secuencia de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. Las secuencias de nucleótidos establecidas en los exones 2, 3 y 4 están operativamente unidas para permitir la transcripción y traducción normales del gen. Así pues, en un caso, la secuencia humana comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde con el exón 2 al exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. Por ejemplo, la secuencia humana comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde con el exón 2 a aproximadamente 267 pb después del exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. Por ejemplo, la secuencia humana comprende aproximadamente 2,8 kb de un gen de microglobulina p2 humano.

Así pues, el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 2 al exón 4 de una microglobulina p2 humana, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que corresponde con el exón 2 al exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. En un ejemplo específico, el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado es codificado por una secuencia de nucleótidos que corresponde con el exón 2 a aproximadamente 267 pb después del exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. Otro ejemplo específico del polipéptido humano o humanizado es codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende aproximadamente 2,8 kb de un gen de microglobulina p2 humano. El exón 4 del gen de la microglobulina p2 contiene la región no traducida 5'.

Los expertos en la materia entenderán que, aunque las secuencias específicas de ácidos nucleicos y aminoácidos para generar animales genéticamente modificados se describen en los presentes ejemplos, también se divulgan las secuencias de una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o secuencias diferentes de las descritas en el presente documento debido a la degeneración del código genético.

Por consiguiente, en el presente documento se describe una rata o un ratón que expresa una secuencia de microglobulina p2 humana, en donde la secuencia de microglobulina p2 es al menos aproximadamente un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a la secuencia de microglobulina p2 humana. Por ejemplo, la secuencia de microglobulina p2 puede ser al menos aproximadamente un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % idéntica a la secuencia de microglobulina p2 humana descrita en los ejemplos. Por ejemplo, la secuencia de microglobulina p2 humana puede comprender una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la secuencia de microglobulina p2 humana puede comprender una o más sustituciones no conservadoras.

Además, en el presente documento se describen ratas y ratones en donde la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína microglobulina p2 humana o humanizada también comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de roedor. Así pues, la rata o el ratón pueden comprender en su genoma una secuencia de nucleótidos que codifica una microglobulina p2 humana o humanizada en donde la secuencia de nucleótidos comprende el exón 1 de una microglobulina p2 de roedor y los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. Así pues, el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede ser codificado por el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de roedor y los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano (por ejemplo, exones 2 y 3 de un gen de microglobulina p2 humano).

La rata o el ratón que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una microglobulina p2 humana o humanizada puede ser.

Así pues, en el presente documento se describe un ratón modificado genéticamente en el que el ratón comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado como se describe en el presente documento. En el presente documento se describe un ratón genéticamente modificado en donde el ratón comprende, en su locus endógeno de microglobulina p2, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado (por ejemplo, un polipéptido de microglobulina p2 humano o sustancialmente humano). El ratón puede no expresar un polipéptido de microglobulina p2 endógeno (por ejemplo, un polipéptido de microglobulina p2 endógeno funcional) a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno.

El ratón genéticamente modificado puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de ratón y los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano. El ratón expresa el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado.

En el presente documento se describe un locus de microglobulina p2 de rata o ratón modificado que comprende una secuencia de microglobulina p2 heteróloga, en donde la secuencia de microglobulina p2 heteróloga es una secuencia humana o humanizada.

El locus modificado es un locus de ratón o rata. El locus de ratón o rata se modifica con al menos una secuencia codificante de microglobulina p2 humana.

La secuencia de microglobulina p2 heteróloga puede estar operativamente unida a elementos reguladores endógenos, por ejemplo, un promotor y/o una secuencia de control de la expresión endógenos. En un ejemplo, la secuencia de microglobulina p2 heteróloga es una secuencia humana y la secuencia humana está operativamente unida a un promotor y/o una secuencia de control de la expresión endógenos.

En el presente documento se describe un locus de microglobulina p2 de rata o ratón modificado que comprende una secuencia humana unida operativamente a un promotor y/o una secuencia de control de la expresión endógenos.

La microglobulina p2 humana o humanizada expresada por un ratón o rata genéticamente modificado, o células, embriones o tejidos derivados de una rata o un ratón, puede conservar todos los aspectos funcionales de la microglobulina p2 endógena y/o humana. Por ejemplo, se prefiere que la microglobulina p2 humana o humanizada se una a la cadena a del polipéptido de MHC I (por ejemplo, polipéptido de MHC I humano o de ratón o de rata endógeno). El polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede unirse, reclutar o asociarse de cualquier otra forma con cualquier otra molécula, por ejemplo, un receptor, moléculas de anclaje o transducción de señales que se asocian con la microglobulina p2 endógena de rata o ratón y/o humana (por ejemplo, HFE, etc.).

Además de ratones o ratas genéticamente modificados, en el presente documento también se describe un tejido o una célula, en donde el tejido o la célula deriva de un ratón o rata como se describe en el presente documento, y comprende un gen de microglobulina p2 o una secuencia de microglobulina p2 heterólogos, es decir, una secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos. El gen de microglobulina p2 o la secuencia de microglobulina p2 heterólogos es un gen de microglobulina p2 humano o humanizado o una secuencia de microglobulina p2 humana o humanizada. Preferentemente, la célula es una célula nucleada. La célula puede ser cualquier célula conocida por expresar el complejo MHC I, por ejemplo, una célula presentadora de antígenos. El polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado expresado por dicha célula puede interactuar con MHC I endógeno de roedor para formar un complejo MHC I funcional. El complejo MHC I resultante puede ser capaz de interactuar con un linfocito T, por ejemplo, un linfocito T citotóxico. Así pues, en el presente documento también se describe un complejoin vitrode una célula procedentes de un ratón o rata como se describe en el presente documento y un linfocito T.

Las células de ratón o rata que comprenden el gen o la secuencia de microglobulina p2 humanos o humanizados también comprenden una secuencia humana o humanizada adicional que es el polipéptido quimérico de MHC I descrito en el presente documento. El polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado puede interactuar con el polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, y puede formarse un complejo MHC I funcional. Dicho complejo puede ser capaz de interactuar con un TCR en un linfocito T, por ejemplo, un linfocito T humano o uno no humano. Así pues, también se proporciona un complejoin vitrode una célula procedente de un ratón o rata como se describe en el presente documento y un linfocito T humano o no humano.

También se describe en el presente documento un embrión de ratón o de rata que comprende un gen de microglobulina p2 o una secuencia de microglobulina p2 heterólogos como se describe en el presente documento. El embrión puede comprender una célula donante ES que comprende el gen de microglobulina p2 o la secuencia de microglobulina p2 heterólogos y células embrionarias hospedadoras. El gen de microglobulina p2 o la secuencia de microglobulina p2 heterólogos es un gen de microglobulina p2 o una secuencia de microglobulina p2 humanos o humanizados.

En el presente documento también se describe divulga una célula de ratón o rata que comprende un cromosoma o un fragmento del mismo de un ratón o rata como se describe en el presente documento (por ejemplo, en donde el cromosoma o un fragmento del mismo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado). La célula de ratón o rata puede comprender un núcleo de un ratón o rata como se describe en el presente documento. La célula de ratón o de rata puede comprender el cromosoma o un fragmento del mismo como resultado de una transferencia nuclear.

También se describe en el presente documento una célula pluripotente inducida de ratón o rata que comprende un gen de microglobulina p2 o una secuencia de microglobulina p2 heterólogos derivada de un ratón o rata como se describe en el presente documento. El gen de microglobulina p2 o la secuencia de microglobulina p2 heterólogos es un gen o secuencia humanos o humanizados.

También se describe un hibridoma o cuadroma, derivado de una célula de un ratón o rata como se describe en el presente documento.

También se describen en el presente documento métodos para preparar un ratón o una rata genéticamente modificados descritos en el presente documento. Los métodos dan como resultado un ratón o rata cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado.

Por ejemplo, los métodos dan como resultado un ratón genéticamente modificado, cuyo genoma comprende en un locus de microglobulina p2 endógeno y una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. En algunos casos, el ratón no expresa una microglobulina p2 de ratón funcional a partir de un locus de microglobulina p2 de ratón endógeno. En algunos casos, los métodos utilizan una construcción de localización preparada utilizando la tecnología VELOCIGENE®, introduciendo la construcción en células ES, e introduciendo los clones de células ES de localización en un embrión de ratón utilizando la tecnología VELOCIMOUSE®, como se describe en los ejemplos. En un ejemplo, las células ES son mezcla de razas 129 y C57BL/6 de ratón; en otro ejemplo, las células ES son una mezcla de razas BALB/c y 129 de ratón.

También se describe en el presente documento una construcción de nucleótidos utilizada para generar ratones y ratas genéticamente modificados. La construcción de nucleótidos puede comprender: brazos de homología de roedores 5' y 3', un fragmento de ADN humano que comprende secuencias de microglobulina p2 humana y un casete de selección flanqueado por sitios de recombinación. El fragmento de ADN humano es un fragmento genómico que comprende tanto intrones como exones de un gen de microglobulina p2 humano. Los brazos de homología no humanos pueden ser homólogos a un locus de microglobulina p2 no humana. El fragmento genómico puede comprender los exones 2, 3 y 4 del gen de microglobulina p2 humano. En un caso, el fragmento genómico comprende, de 5 'a 3': el exón 2, un intrón, el exón 3, un intrón y el exón 4, todos de secuencia de microglobulina p2 humana. El casete de selección puede situarse en cualquier lugar de la construcción fuera de la región codificante de microglobulina p2, por ejemplo, puede situarse 3' del exón 4 de la microglobulina p2 humana. Los brazos de homología 5' y 3' de roedor pueden comprender la secuencia genómica 5' y 3' del gen de microglobulina p2 de roedor endógeno, respectivamente. En otro ejemplo, los brazos de homología 5' y 3' de roedor comprenden la secuencia genómica 5' del exón 2 y 3' del exón 4 del gen de roedor endógeno, respectivamente.

También se describe en el presente documento un método para modificar un locus de microglobulina p2 de un ratón o una rata para expresar un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado descrito en el presente documento. Un método de modificación de un locus de microglobulina p2 de un ratón para que exprese un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado comprende reemplazar, en un locus de microglobulina p2 endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica una microglobulina p2 de ratón por una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. En un ejemplo de tal método, el ratón no expresa un polipéptido de microglobulina p2 funcional a partir de un locus de microglobulina p2 de ratón endógeno. En algunos ejemplos específicos, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en los exones 2 a 4 de un gen de microglobulina p2 humano. La secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado comprende secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 del gen de microglobulina p2 humano.

Animales con MHC I/microglobulina p2 genéticamente modificados

En el presente documento se describen para su uso de acuerdo con la presente invención ratones y ratas genéticamente modificados que comprenden en su genoma secuencias de nucleótidos que codifican tanto polipéptidos quiméricos de MHC I humano/roedor como polipéptidos de microglobulina p2 humana o humanizada; por tanto, los animales expresan polipéptidos quiméricos de MHC I humano/roedor y polipéptidos de microglobulina p2 humana o humanizada.

Cuando se usar componentes de sistemas mixtos humanos/roedor, surgen diferencias funcionales. El HLA de clase I se une a la microglobulina p2 con más fuerza que la clase I de ratón. Bernabeu (1984), p2-microgobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells, Nature, 308:642-645. Los intentos de anular las diferencias funcionales se reflejan en la construcción de ratones MHC humanizados concretos. Se desarrollaron ratones con genes de H-2 de clase I y clase 2 inactivados (en un trasfondo KO ["knockout"] de microglobulina p2 de ratón) que expresan un transgén quimérico HLA-A2.1/HLA-DR1 humano integrado aleatoriamente con un a l y un a2 de HLA-A2.1 humano y un a3 del ratón H-2Db, unidos en su extremo N-terminal a través de un conector al extremo C-terminal de la microglobulina p2 humana. Véase, por ejemplo, Pajotet al.(2004), A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I-/class II-knockout mice, Eur. J. Immunol., 34:3060-3069. Según se ha notificado, estos ratones generan anticuerpos específicos de antígeno y respuestas de CTL contra el virus de la hepatitis B, mientras que los ratones simplemente transgénicos para ratones con HLA-A2.1 o H-2 de clase I/clase II inactivados no lo hacen. La deficiencia de ratones que son simplemente transgénicos para los genes se debe probablemente a la capacidad de dichos ratones para emplear genes de clase I y/o de clase II endógenos para eludir cualquier transgén, una opción que no está disponible para ratones con genes de MHC inactivados. Sin embargo, los ratones pueden expresar al menos H-2Db, probablemente debido a las reproducciones con ratones con fondo de genes inactivados de microglobulina p2 de ratón (véase, Pajotet al.,supra;que aparentemente comprendían un locus de clase I y de clase II endógeno intacto).

Según se ha notificado, la expresión en la superficie celular de la fusión quimérica con microglobulina p2 humana es más baja que la expresión de MHC endógeno, pero no se notificado la supervivencia/tasa de destrucción por NK ni la tasa de autodestrucción por NK. Pajotet al., supra.Se observó una cierta mejora en el número de linfocitos T CD8+ en ratones con genes inactivados de microglobulina p2 deficientes en m Hc de clase I (el 2-3 % del total de esplenocitos, frente al 0,6-1 % en los ratones KO para p2). Sin embargo, el uso de la región variable de linfocitos T mostró perfiles alterados para los segmentos de genes BV 5.1, BV 5.2 y BV 11. Según se ha notificado, las respuestas de los linfocitos T CD8+ y CD4+ se restringieron al antígeno de hepatitis B apropiado utilizado para inmunizar a los ratones, aunque al menos dos ratones destruyeron las células que portaban cualquiera de los antígenos, cuando los ratones se inmunizaron con un solo antígeno, lo que podría deberse a falta de inhibición de linfocitos NK o falta de selectividad de linfocitos NK.

Tal como se mencionó anteriormente, los ratones transgénicos tanto para el MHC I humano como para la microglobulina p2 humana comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica de MHC I/microglobulina p2, en donde las porciones de MHC I y microglobulina p2 están contenidas dentro de una única cadena polipeptídica, dando como resultado que la cadena a de MHC I y la microglobulina p2 estén covalentemente unidas entre sí y, por lo tanto, ancladas a la superficie celular. En el presente documento se describe, para su uso de acuerdo con el método de la presente invención, un ratón que comprende en su genoma dos secuencias de nucleótidos independientes, una que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor y otra que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. Este ratón expresaría un complejo<m>H<c>I que se asemeja más a un complejo MHC I presente en la naturaleza, en donde la cadena a de MHC I y la microglobulina p2 se proporcionan en dos cadenas polipeptídicas separadas y la microglobulina p2 se asocia de forma no covalente con la cadena a de MHC I.

Un ratón o rata descrito en el presente documento para su uso de acuerdo con el método de la presente invención comprende en su genoma: una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado. En un aspecto, el ratón o la rata comprende en su genoma: (a) una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, en donde la porción humana del polipéptido quimérico comprende un dominio de unión a péptidos o un dominio extracelular de un MHC I humano (por ejemplo, HLA-A, HLA-B o HLA-C; por ejemplo, HLA-A2), y (b) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado.

La primera secuencia de nucleótidos puede situarse en un locus MHC I de roedor endógeno de manera que el ratón 0 la rata comprende en su genoma un reemplazo en el locus de MHC I de la totalidad o una porción del gen de MHC 1 endógeno (por ejemplo, una porción que codifica un dominio de unión a péptidos o un dominio extracelular) por la secuencia de MHC I humano correspondiente. Así pues, el ratón o la rata puede comprender, en un locus de MHC I endógeno, una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a1, a2 y a3 de un MHC I humano (por ejemplo, HLA-A, HLA-B o HLA-C; por ejemplo, HLA-A2) y dominios transmembrana y citoplásmicos de MHC I endógeno de roedor (por ejemplo, H-2K, H-2D, etc., por ejemplo, H-2Kb). En un ejemplo, el animal es un ratón, y la primera secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio extracelular de un HLA-A2 humano (por ejemplo, HLA-A2.1) y dominios transmembrana y citoplásmicos de H-2K de ratón (por ejemplo, H-2Kb).

La segunda secuencia de nucleótidos puede situarse en un locus de microglobulina p2 de roedor endógeno de modo que el animal comprenda en su genoma un reemplazo en el locus de microglobulina p2 de la totalidad o una porción del gen de microglobulina p2 endógeno por la secuencia de microglobulina p2 humana correspondiente. La segunda secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos expuesta en el exón 2 al exón 4 de un gen de microglobulina p2 humano. La secuencia de nucleótidos comprende secuencias de nucleótidos expuestas en los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano, en donde las secuencias de nucleótidos están operativamente unidas entre sí. La segunda secuencia de nucleótidos puede comprender además la secuencia del exón 1 de un gen de microglobulina p2 de roedor.

En un aspecto, el ratón o la rata no expresa un MHC I funcional a partir de un locus de MHC I endógeno de roedor (por ejemplo, no expresa ni un dominio de unión a péptidos ni un dominio extracelular del MHC I endógeno), y el ratón 0 la rata no expresa un polipéptido de microglobulina p2 funcional a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno de roedor. En algunos aspectos, el animal es homocigoto tanto para un locus de MHC I que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, como para un locus de microglobulina p2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una microglobulina p2 humana o humanizada. En otros aspectos, el animal es heterocigoto tanto para un locus de MHC I que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor, como para un locus de microglobulina p2 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una microglobulina p2 humana o humanizada.

Preferentemente, la primera y la segunda secuencia de nucleótidos están operativamente unidas a elementos de control de la expresión endógenos (por ejemplo, promotores, potenciadores, silenciadores, etc.).

Diversas características diferentes de la primera y segunda secuencias de nucleótidos (y los polipéptidos que codifican) descritas en el presente documento pueden entenderse fácilmente a partir de las características descritas a lo largo de la memoria descriptiva, por ejemplo, las descritas en las secciones relacionadas con animales con MHC 1 genéticamente modificados y animales con microglobulina p2 genéticamente modificados.

En el presente documento se describe, para su uso de acuerdo con la presente invención, un ratón que comprende en su genoma (a) una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón (específicamente, polipéptido HLA-A2/H-2K), en donde la porción humana del polipéptido quimérico comprende los dominios a l, a2 y a3 de un HLA-A2 humano y la porción de ratón comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un H-2K de ratón, y (b) una segunda secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, en donde la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos establecida en los exones 2, 3 y 4 del gen de microglobulina p2 humano, en donde la primera secuencia de nucleótidos se sitúa en un locus H-2K endógeno, y la segunda secuencia se sitúa en un locus de microglobulina p2 endógeno. El ratón puede no expresar los polipéptidos H-2K y de microglobulina p2 de ratón funcionales a partir de sus respectivos loci endógenos. El ratón puede expresar el polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón y el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado.

Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, los roedores genéticamente modificados para coexpresar tanto el MHC I como la microglobulina p2 humanos o humanizados presentaron una mayor expresión de MHC clase I quimérico en la superficie celular en comparación con los animales humanizados sólo para m Hc I. La coexpresión de MHC I y microglobulina p2 humanos o humanizados puede aumentar la expresión en la superficie celular de MHC I quimérico humano/roedor en más de aproximadamente un 10 %, por ejemplo, más de aproximadamente un 20 %, por ejemplo, aproximadamente un 50 % o más, por ejemplo, aproximadamente un 70 %, sobre la expresión de MHC I quimérico humano/roedor en ausencia de microglobulina p2 humana o humanizada.

En el presente documento se describe un método para producir ratas o ratones genéticamente modificados cuyo genoma comprende una primera y una segunda secuencia de nucleótidos como se describe en el presente documento. El método generalmente comprende generar un primer ratón o rata genéticamente modificado cuyo genoma comprende una primera secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento (es decir, una secuencia de MHC I quimérico humano/roedor), generar un segundo ratón o rata genéticamente modificado cuyo genoma comprende una segunda secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento (es decir, una secuencia de microglobulina p2 humana o humanizada), y cruzar el primer y el segundo ratón o rata para obtener una progenie cuyo genoma contiene ambas secuencias de nucleótidos. En un ejemplo, el primer y el segundo ratón o rata son heterocigotos para la primera y la segunda secuencia de nucleótidos, respectivamente. En un ejemplo, el primer y el segundo ratón o rata son homocigotos para la primera y la segunda secuencia de nucleótidos, respectivamente. En un ejemplo, el primer y segundo ratón o rata se generan mediante el reemplazo de loci de roedor endógenos por la primera y la segunda secuencia de nucleótidos, respectivamente. En un aspecto, la primera y la segunda rata o ratón se generan mediante la utilización de construcciones generadas mediante la tecnología v ElOCIGENE®, y la introducción de clones de células ES de localización que contienen dichas construcciones en un embrión (por ejemplo, un embrión de ratón o de rata) mediante el método VELOCIMOUSE®.

Uso de animales genéticamente modificados

Diversos ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento producen APC con MHC I quimérico humano/roedor y/o microglobulina p2 humana o humanizada en la superficie celular y, como resultado, presentan péptidos derivados de proteínas citosólicas como epítopos para los CTL de una manera similar a la que se produce en el organismo humano, ya que, sustancialmente, todos los componentes del complejo son humanos o humanizados. Los ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento se pueden usar para estudiar la función del sistema inmunológico humano en ratones o ratas; para la identificación de antígenos y epítopos de antígenos que desencadenan la respuesta inmunitaria (por ejemplo, epítopos de linfocitos T, por ejemplo, epítopos distintivos de cáncer humano), por ejemplo, para su uso en el desarrollo de vacunas; para la identificación de linfocitos T de alta afinidad por patógenos humanos o antígenos del cáncer (es decir, linfocitos T que se unen a antígenos en el contexto del complejo MHC I humano con alta avidez), por ejemplo, para su uso en terapias con linfocitos T adaptativos; para evaluar candidatos a vacunas y otras estrategias de vacunas; para estudiar la autoinmunidad humana; para estudiar enfermedades infecciosas humanas; y, por lo demás, para elaborar mejores estrategias terapéuticas basadas en la expresión del MHC humano. El método de la invención es como se establece en las reivindicaciones.

El complejo MHC I se une a péptidos y los presenta sobre la superficie celular. Una vez presentados sobre la superficie en el contexto de dicho complejo, los péptidos pueden ser reconocidos por los linfocitosis T. Por ejemplo, cuando el péptido deriva de un patógeno u otro antígeno de interés (por ejemplo, un antígeno tumoral), el reconocimiento de los linfocitos T puede dar como resultado la activación de los linfocitos T, la destrucción por los macrófagos de las células que portan la secuencia peptídica presentada y la activación de linfocitos B para que produzcan anticuerpos que se unen a la secuencia presentada.

Los linfocitos T interactúan con las células que expresan el complejo MHC I a través del ectodominio de MHC de clase I unido a péptidos y el ectodominio de CD8 de linfocitos T. Los linfocitos T CD8+ que encuentran con APC que tienen antígenos adecuados unidos a la molécula de MHC de clase I se convertirán en linfocitos T citotóxicos. Así pues, los antígenos que, en el contexto del MHC clase I, se unen con alta avidez a un receptor de linfocitos T son potencialmente importantes en el desarrollo de tratamientos para patologías humanas. Sin embargo, la presentación de antígenos en el contexto del MHC I de ratón no es muy importante para enfermedades humanas, ya que los complejos MHC humanos y de ratón reconocen los antígenos de manera diferente, por ejemplo, un MHC I de ratón puede no reconocer los mismos antígenos o puede presentar epítopos diferentes que un MHC I humano. Por consiguiente, los datos más importantes para las patologías humanas se obtienen a través del estudio de la presentación de epítopos de antígenos por el MHC I humano.

Así pues, los ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento son útiles, entre otras cuestiones, para evaluar la capacidad de un antígeno para iniciar una respuesta inmunitaria en un ser humano, y para generar una diversidad de antígenos e identificar un antígeno específico que puede usarse en el desarrollo de vacunas humanas.

Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para determinar la antigenicidad en un ser humano de una secuencia peptídica, que comprende exponer un ratón o rata genéticamente modificado como se describe en el presente documento a una molécula que comprende la secuencia peptídica, permitir que el ratón o rata desarrolle una respuesta inmunitaria, y detectar en el ratón o rata una célula que se une a una secuencia del péptido presentada por un MHC I quimérico humano/roedor, o un complejo MHC I humanizado (que comprende un MHC I quimérico humano/roedor y una microglobulina p2 humana o humanizada ) como se describe en el presente documento.

Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para determinar si un péptido provocará una respuesta inmunitaria celular en un ser humano, que comprende exponer un ratón o rata genéticamente modificado como se describe en el presente documento al péptido, permitir que el ratón o rata desarrolle una respuesta inmunitaria, y detectar en el ratón o rata una célula que se une a una secuencia del péptido presentada por una molécula de MHC I quimérico humana/roedor como se describe en el presente documento. La rata o el ratón, después de la exposición, puede comprender un linfocito T citotóxico CD8+ (CTL) restringido por MHC de clase I que se une al péptido. El CTL puede destruir una célula que porta el péptido.

Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para identificar un epítopo de CTL humano, que comprende exponer un ratón o rata como se describe en el presente documento a un antígeno que comprende un posible epítopo de CTL, permitir que la rata o el ratón desarrolle una respuesta inmunitaria, aislar del ratón o rata un CTL CD8+ restringido por MHC de clase I que se une al epítopo e identificar el epítopo unido al CTL CD8+ restringido por MHC de clase I.

Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para identificar un péptido restringido por HLA de clase I cuya presentación por una célula humana y su unión a un linfocito humano (por ejemplo, linfocito T humano) dará como resultado la citotoxicidad de la célula portadora del péptido, que comprende exponer un ratón o rata (o la célula que expresa MHC de clase I del mismo) como se describe en el presente documento a una molécula que comprende un péptido de interés, aislar una célula del ratón o rata que expresa una molécula de clase I quimérica humana/roedor que se une al péptido de interés, exponer la célula a un linfocito humano que es capaz de llevar a cabo la citotoxicidad restringida por HLA de clase I y medir la citotoxicidad inducida por el péptido.

Por ejemplo, en el presente documento se describe un método para identificar un antígeno que genera una respuesta de linfocitos T citotóxicos en un ser humano, que comprende exponer un posible antígeno a un ratón como se describe en el presente documento, permitir que el ratón genere una respuesta inmunitaria e identificar el antígeno unido por la molécula restringida por HLA-A.

El antígeno puede comprender una proteína de la superficie o de la envoltura bacteriana o vírica, un antígeno en la superficie de una célula tumoral humana, una supuesta vacuna para su uso en seres humanos, un epítopo humano que genera anticuerpos en un ser humano, o un epítopo humano que genera CTL de alta afinidad que se dirigen al complejo MHC I/epítopo.

También se describe en el presente documento un método para determinar si un posible antígeno contiene un epítopo que, tras la exposición a un sistema inmunitario humano, generará una respuesta inmunitaria restringida por HLA-A (por ejemplo, respuesta restringida por HLA-A2), que comprende exponer un ratón como se describe en el presente documento al posible antígeno y medir una respuesta inmunitaria específica de antígeno restringida por HLA-A (por ejemplo, restringida por HLA-A2) en el ratón.

El posible antígeno puede seleccionarse de un agente biofarmacéutico o un fragmento del mismo, una proteína no propia, un antígeno de superficie de una célula no propia, un antígeno de superficie de una célula tumoral, un antígeno de superficie de una célula bacteriana o de levadura o fúngica, un antígeno de superficie o proteína de envoltura de un virus.

Además, los ratones y las ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento pueden ser útiles para la identificación de receptores de linfocitos T, por ejemplo, receptores de linfocitos T de alta avidez, que reconozcan un antígeno de interés, por ejemplo, un antígeno tumoral u otro antígeno de enfermedad. El método puede comprender: exponer el ratón o la rata descritos en el presente documento a un antígeno, permitir que el ratón o la rata genere una respuesta inmunitaria al antígeno, aislar del ratón o rata un linfocito T que comprende un receptor de linfocitos T que se une al antígeno presentado por un MCH I quimérico humano/roedor y determinar la secuencia de dicho receptor de linfocitos T.

También se describe en el presente documento un método para identificar un dominio variable del receptor de linfocitos T que tiene alta afinidad por un antígeno tumoral humano, que comprende exponer un ratón que comprende los dominios a1, a2 y a3 de MHC I humanizado (por ejemplo, los dominios a1, a2 y a3 de HLA-A2) a un antígeno tumoral humano; permitir que el ratón genere una respuesta inmunitaria; y, aislar del ratón una secuencia del ácido nucleico que codifica un dominio variable del receptor de linfocitos T, en donde el dominio variable del receptor de linfocitos T se une al antígeno tumoral humano con una K<d>de no más de aproximadamente 1 nanomolar.

El ratón puede comprender además un reemplazo en el locus del gen de la región variable del receptor de linfocitos T de ratón endógeno por una pluralidad de segmentos del gen de la región variable del receptor de linfocitos T humano no reordenados, en donde los segmentos del gen de la región variable del receptor de linfocitos T humano no reordenados se recombinan para codificar un gen del receptor de linfocitos T quimérico humano-ratón que comprende una región variable humana y una región constante de ratón. En un ejemplo, el ratón comprende un transgén de CD8 humano, y el ratón expresa una proteína de CD8 humana funcional.

Los receptores de linfocitos T que tienen una gran avidez por los antígenos tumorales son útiles en las terapias con células. Se han preparado poblaciones de linfocitos T con alta avidez por los antígenos tumorales humanos exponiendo linfocitos T humanos a HLA-A2 que se ha mutado para minimizar la unión de CD8 a la subunidad a3, para seleccionar solo aquellos linfocitos T con avidez extremadamente alta por el antígeno tumoral (es decir, clones de linfocitos T que reconocen el antígeno a pesar de la incapacidad de CD8 para unirse a a3). Véase, Pittetet al.(2003), a3 Domain Mutants of Peptide/MHC Class I Multimers Allow the Selective Isolation of High Avidity Tumor-Reactive CD8 T Cells, J. Immunol., 171:1844-1849. Los ratones y las ratas, y las células de los ratones y las ratas, son útiles para identificar péptidos que formarán un complejo con HLA de clase I humano que se unirá con gran avidez a un receptor de linfocitos T o activará un linfocito que porta un receptor de linfocitos T.

La unión de antígeno/HLA de clase I a un linfocito T, o la activación de un linfocitos T, se puede medir mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. La unión y activación de linfocitos T-APC específicas de péptido pueden medirse. Por ejemplo, según se ha notificado, la unión de los linfocitos T a células presentadoras de antígeno que expresan HLA-A2 hace que PIP2 se acumule en la inmunosinapsis, mientras que la reticulación de las moléculas de MHC de clase I no. Véase, Fooksmanet al.(2009), Cutting Edge: Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Concentration at the APC Side of the Immunological Synapse Is Required for Effector T Cell Function, J. Immunol., 182:5179-5182.

Las consecuencias funcionales de la interacción de un linfocito que porta un TCR y una APC que expresa la clase I también pueden medirse e incluyen la destrucción celular por el linfocito. Por ejemplo, según se ha notificado, los puntos de contacto en la subunidad a2 de HLA-A2 por CTL CD8+ generan una señal para la destrucción independiente de Fas. Las células Jurkat que expresan HLA-A2 sufren apoptosis cuando se ponen en contacto (por anticuerpos) con epítopos en la molécula HLA-A2 conocida (por estudios cristalográficos) por ponerse en contacto con CD8, sin que el dominio citoplásmico parezca estar implicado. Véase, Pettersenet al.(1998), The TCR-Binding Region of the HLA Class I a2 Domain Signals Rapid Fas-Independent Cell Death: A Direct Pathway for T Cell-Mediated Killing of Target Cells? J. Immunol., 160:4343-4352. Se ha postulado que la destrucción rápida inducida por el contacto de a2 de HLA-A2 con un CD8 de un CTL CD8+ puede deberse principalmente a esta vía mediada por HLA-A2 independiente de Fas(id.),a diferencia de la destrucción mediada por el dominio a3 independiente de TCR, que por sí sola puede inducir la apoptosis (véase Woodleet al.(1997), Antihuman class I MHC antibodies induce apoptosis by a pathway that is distinct from the Fas antigen-mediated pathway, J. Immunol., 158:2156-2164).

La consecuencia de la interacción entre un linfocito T y una APC que presenta un péptido en el contexto de MHC I también se puede medir mediante un ensayo de proliferación de linfocitos T. Como alternativa, se puede determinar midiendo la liberación de citocinas asociadas habitualmente con la activación de la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede utilizar IFNy ELISPOT para controlar y cuantificar la activación de linfocitos T CD8+.

Tal como se describe en el presente documento, la activación de linfocitos T CD8+ puede verse obstaculizada en los ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento debido a la unión específica de especie de CD8 a MHC I. Cuando se desea una interacción de c D8 específica de especie, se expone una célula de un ratón o rata como se describe en el presente documento (por ejemplo,in vitro)a una célula humana, por ejemplo, una célula humana que porta CD8, por ejemplo, un linfocito T humano. Por ejemplo, una célula de un ratón que expresa MHC de clase I como se describe en el presente documento se exponein vitroa un linfocito T que comprende un CD8 humano y un receptor de linfocitos T. El linfocito T puede ser un linfocito T humano. En un ejemplo, la célula del ratón que expresa MHC de clase I comprende un péptido unido a un MHC I quimérico humano/ratón o a un complejo de MHC I humanizado (que incluye microglobulina p2 humana), el linfocito T es un linfocito T humano, y se determina la capacidad del linfocito T para unirse a la célula de ratón que presenta el péptido. Puede determinarse la activación del linfocito T humano por la célula de ratón que presenta el péptido. En el presente documento se describe un métodoin vitropara medir la activación de un linfocito T humano por la célula que presenta el péptido, que comprende exponer un ratón o una célula de ratón como se describe en el presente documento a un antígeno de interés, exponer una célula de dicho ratón o dicha célula de ratón (que supuestamente porta un péptido derivado del antígeno en complejo con MHC I quimérico humano/roedor) a un linfocito T humano, y medir la activación del linfocito T humano. El método puede utilizarse para identificar un epítopo de linfocitos T de un patógeno humano o una neoplasia humana. El método puede utilizarse para identificar un epítopo para una vacuna.

En el presente documento se describe un método que determina la activación de los linfocitos T mediante un posible agente terapéutico humano, que comprende exponer un ratón o rata genéticamente modificado como se describe en el presente documento a un posible agente terapéutico humano (o, por ejemplo, exponer una célula que expresa un m Hc I quimérico humano/roedor de dicho animal a una secuencia peptídica del posible agente terapéutico), exponer una célula del ratón o rata genéticamente modificado que presenta un complejo MHC I humano o humanizado/péptido a un linfocito T que comprende un receptor de linfocitos T humanos y un CD8 capaz de unirse a la célula del ratón o rata genéticamente modificado, y medir la activación del linfocito T humano que es inducida por la célula que presenta el péptido del ratón o rata genéticamente modificado.

Puede prepararse un complejo formado entre una célula que expresa MHC de clase I quimérico humano/roedor de un animal como se describe en el presente documento y un linfocito T que comprende una secuencia de CD8 humano, por ejemplo, un linfocito T humano o un linfocito T de un ratón o rata que comprende un transgén que codifica un CD8 humano. Se conocen en la técnica ratones transgénicos para CD8 humano. Tishonet al.(2000), Trangenic Mice Expressing Human HLA and CD8 Molecules Generate HLA-Restricted Measles Virus Cytotoxic T Lymphocytes of the Same Specificity as Humans with Natural Measles Virus Infection, Virology, 275(2):286-293; también, LaFaceet al.(1995), Human CD8 Transgene Regulation of HLA Recognition by Murine T Cells, J. Exp. Med., 182:1315-1325.

Además de la capacidad de identificar antígenos y epítopos de antígenos de patógenos o neoplasmas humanos, los ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento pueden usarse para identificar autoantígenos importantes para enfermedades autoinmunitarias humanas, por ejemplo, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, etc. Por ejemplo, Takakiet al.((2006), HLA-A*0201-Restricted T Cells from Humanized NOD Mice Recognize Autoantigens of Potential Clinical Relevance to Type 1 Diabetes, J. Immunol., 176:3257-3265) describen la utilidad de los ratones NOD que portan monocadenas de HLA/microglobulina p2 en la identificación de autoantígenos de la diabetes de tipo 1. Además, los ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento se pueden utilizar para estudiar diversos aspectos de las enfermedades autoinmunitarias humanas. Como se sabe que algunos alelos polimorfos de MHC I humano están asociados con el desarrollo de determinadas enfermedades, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, enfermedad de Graves, miastenia grave, psoriasis, etc.; véase Bakkeret al.(2006), A high-resolution HLA and<s>N<p>haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics, 38:1166-1172, y la información suplementaria; e International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009), Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106:18680-85), un ratón o rata genéticamente modificado de la invención que comprenda un locus de MHC I quimérico humano/roedor que incluya dicho alelo puede ser útil como modelo de enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, el alelo de la enfermedad puede ser HLA-B27 y la enfermedad puede ser espondilitis anquilosante o artritis reactiva; por tanto, el animal usado para el estudio de estas enfermedades comprende un HLA-B27 quimérico humano/roedor.

Otros aspectos de la inmunidad celular que implican complejos de MHC I son conocidos en la técnica; por consiguiente, los ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento pueden usarse para estudiar estos aspectos de la biología inmunitaria. Por ejemplo, la unión de TCR a MHC clase I se modulain vivopor factores adicionales. El miembro B de la subfamilia de los receptores leucocitarios similares a inmunoglobulina (LILRB1 o LIR-1) se expresa en CTL restringidos por MHC de clase I y regula a la baja la estimulación de linfocitos T mediante la unión de un determinante específico en la subunidad a3 de las moléculas de MHC de clase I sobre las APC. Los estudios estructurales demuestran que el sitio de unión para LIR-1 y CD8 se solapan, lo que sugiere que el LIR-1 inhibidor compite con el CD8 estimulador para unirse con moléculas de MHC de clase I. Willcoxet al.(2003), Crystal structure of HLA-A2 bound to LIR-1, a host and viral major histocompatibility complex receptor, Nature Immunology.

4(9):913-919; también, Shirioshiet al.(2003), Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2 (ILT2) and ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind preferentially to HlA-G, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(15):8856-8861. El LIR-1 transduce señales inhibidoras a través de su motivo de inhibición (intracelular) de inmunorreceptores basado en tirosina ("immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif', ITIM). En los linfocitos NK, los estudios han demostrado que los KIR (receptores similares a Ig inhibidores de células citolíticas) que carecen de ITIM (normalmente incapaces de inhibición) pueden inhibir en presencia de LIR-1 (supuestamente a través del ITIM de LIR-1) unidos al dominio a3 de una molécula de MHC de clase I (véase, Kirwinet al.(2005), Killer Cell Ig-Like Receptor-Dealing Signaling by Ig-Like Transcript 2 (ILT2/CD85j/LILRB1/lIR-1), J. Immunol., 175:5006-5015), lo que sugiere la cooperación entre LIR-1 unido a MHC de clase I y KIR y, por lo tanto, un papel para la unión del dominio a3 de HLA en la modulación de la inhibición de linfocitos<n>K.

Tal como se ha descrito anteriormente, las moléculas de MHC interactúan con las células que no expresan un TCR. Entre estas células están los linfocitos NK. Los linfocitos NK son linfocitos citotóxicos (que se distinguen de los CTL o linfocitos T citotóxicos) que desempeñan un papel central en la respuesta inmunitaria celular y, en concreto, en la inmunidad innata. Los linfocitos NK son la primera línea de defensa contra microorganismos invasores, virus y otras entidades no propias (por ejemplo, tumores). Los linfocitos NK se activan o inhiben a través de receptores de superficie, y expresan CD8 pero no expresan TCR. Los linfocitos NK pueden interactuar con células que expresan MHC de clase I, pero la interacción se realiza a través del dominio a3 de unión a CD8 en lugar de la unión a los dominios a<1>y a<2>en péptidos, que se unen a TCR. Una función principal de los linfocitos NK consiste en destruir las células que carecen de suficientes proteínas de superficie de MHC de clase I.

La reticulación de las moléculas de MHC de clase I en la superficie de los linfocitos citolíticos naturales (NK) da como resultado la fosforilación intracelular de tirosina, la migración de la molécula de MHC de clase I desde la inmunosinapsis y la regulación a la baja de la destrucción de células tumorales. Rubioet al.(2004), Cross-linking of MHC class I molecules on human NK cells inhibits NK cell function, segregates MHC I from the NK cell synapse, and induces intracellular phosphotyrosines, J. Leukocyte Biol., 76:116-124.

Al parecer, otra función del MHC de clase I en los linfocitos NK es evitar la autodestrucción. Los linfocitos NK portan tanto el receptor de activación 2B4 como el ligando de 2B4 CD48; el MHC de clase I parece unirse a 2B4 y evitar su activación por CD48. Betser-Cohen (2010), The Association of MHC Class I Proteins with the 2B4 Receptor Inhibits Self-Killing of Human NK Cells, J. Immunol., 184:2761-2768.

Así pues, los ratones y ratas genéticamente modificados descritos en el presente documento pueden usarse para estudiar estos procesos no mediados por TCR ni por CTL y para diseñar enfoques para su modulación.

Ejemplos

La invención se ilustrará con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Estos ejemplos se exponen para ayudar en la comprensión de la invención, pero no pretenden limitar su alcance en modo alguno y no deben interpretarse de esta manera. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales que serían bien conocidos por los expertos en la materia (técnicas de clonación molecular, etc.). A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura se indica en grados Celsius y la presión es la atmosférica o casi atmosférica.

Ejemplo 1. Construcción y caracterización de ratones con HLA-A2 genéticamente modificados

Ejemplo 1.1: Expresión de HLA-A2/H-2K en células MG87.

Se preparó una construcción vírica que contenía una secuencia génica quimérica HLA-A2/H-2K (figura 4A) usando técnicas de clonación molecular convencionales conocidas por un experto en la materia para analizar la expresión de MHC I quimérico humano/ratón en células transfectadas.

Brevemente, se preparó una construcción viral quimérica HLA-A humano/H-2K de ratón utilizando las secuencias de exones que codifican los dominios a1, a2 y a3 de la cadena a y se clonaron en marco con las secuencias codificantes de ratón para los dominios transmembrana y citoplásmicos del gen H-2K (figura 4A, pMIG-HLA-A2/H2K). Tal como se ilustra en la figura 4, la construcción contenía una secuencia indicadora IRES-GFP, que permitió determinar si la construcción podía expresarse en células tras la transfección.

Los virus que contienen la construcción quimérica descrita anteriormente se prepararon y propagaron en células de riñón embrionario humano 293 (293T). Las células 293T se sembraron en placas de 10 cm y se dejaron crecer hasta un 95 % de confluencia. Se preparó una mezcla de transfección de ADN con 25 |jg de pMIG-HLA-A2/H2K, pMIG-HLA-A2 humano o pMIG-microglobulina p2 humanizada, y 5 jg de pMDG (plásmido de la envoltura), 15 jg de pCL-Eco (construcción de encapsulación sin señal de encapsulación ^ ), 1 ml de Opti-MEM (Invitrogen). A esta mezcla de ADN de 1 ml se le añadieron 80 pl de Lipofectamine-2000 (Invitrogen) en 1 ml de Opti-MEM, que previamente se habían mezclado e incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos. La mezcla de Lipofectamine/ADN se incubó durante 20 minutos más a temperatura ambiente, y después se añadió a placas de 10 cm, y las placas se incubaron a 37 °C. Se recogió el medio de las células después de 24 horas y se añadieron a las células 10 ml nuevos de medio R10 (RPMI 1640 FBS al 10 %). Este cambio de medio se repitió dos veces. Después de un total de cuatro días, los medios recogidos se agruparon, se centrifugaron y se hicieron pasar a través de un filtro estéril para eliminar los residuos celulares.

Los virus propagados producidos anteriormente se usaron para transducir células MG87 (fibroblastos de ratón). Las células MG87 de un único matraz T-75 se lavaron una vez con PBS. se añadieron 3 ml de tripsina al 0,25 % EDTA a las células y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante tres minutos. Se añadieron 7 ml de D10 (DMEM con alto contenido de glucosa; suero bovino fetal al 10 %) a la mezcla de células/tripsina y se transfirió a un tubo de 15 ml para centrifugar a 1300 rpm durante cinco minutos. Después de centrifugar las células, se aspiró el medio y las células se resuspendieron en 5 ml de D10. Se contaron las células y se situaron aproximadamente 3,0 x 105 células por pocillo en una placa de 6 pocillos. Se añadieron a los pocillos pMIG-HLA-A2 humano o pMIG-HLA-A2/H-2K bien solos o con el virus con pMIG-microglobulina p2 humanizada, con células no transducidas como control. Las células se incubaron a 37 °C con CO<2>al 5 % durante 2 días. Las células se prepararon para el análisis FACS (usando el anticuerpo anti-HLA-A2, clon BB7.2) para la expresión de HLA-A2 con o sin microglobulina p2.

Los gráficos (figura 4B), así como la tabla que resume los datos obtenidos de los gráficos (figura 4C), demuestran que la cotransducción con microglobulina p2 humanizada aumenta la expresión de HLA-A2 humano o HLA-A2/H-2K quimérico humano/no humano, como lo demuestra el desplazamiento de las curvas hacia la derecha.

Ejemplo 1.2. Modificación de un locus quimérico HLA-A2/H-2K.

El gen H-2K de ratón se humanizó en una única etapa mediante la construcción de un vector de localización exclusivo a partir de ADN de cromosoma artificial bacteriano ("bacterial artificial chromosome", BAC) humano y de ratón utilizando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6586251 y Valenzuelaet al.(2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat. Biotech., 21(6): 652-659). Se modificó ADN de clon BAC de ratón RP23-173k21 (Invitrogen) mediante recombinación homóloga para sustituir el ADN genómico que codifica los dominios a l, a2 y a3 del gen H-2K de ratón por ADN genómico humano que codifica las subunidades a1, a2 y a3 del gen HLA-A humano (figura 5).

Brevemente, la secuencia genómica que codifica las subunidades a1, a2 y a3 de ratón del gen H-2K se reemplaza por el ADN genómico humano que codifica los dominios a1, a2 y a3 del gen HLA-A*0201 humano en un único evento de localización usando un vector de localización que comprende un casete de higromicina flanqueado por sitiosloxPcon un brazo de homología 5' de ratón que contiene la secuencia 5' del locus H-2K de ratón que incluye la región no traducida 5' (UTR; el brazo de homología 5' se expone en la SEQ ID NO: 1) y un brazo de homología 3' de ratón que contiene la secuencia genómica 3' de la secuencia codificante de a3 de H-2K de ratón (el brazo de homología 3' se expone en la SEQ ID NO: 2).

La construcción final para localizar el locus de gen de H-2K endógeno de 5' a 3' incluía (1) un brazo de homología 5' que contenía aproximadamente 200 pb de la secuencia genómica de ratón 5' de ratón del gen H-2K endógeno que incluye la UTR 5', (2) aproximadamente 1339 pb de la secuencia genómica humana que incluye la secuencia líder de HLA-A*0201, el líder/intrón a1 de HLA-A*0201, el exón a1 de HLA-A*0201, el intrón a1-a2 de HLA-A*0201, el exón a2 de HLA-A*0201, aproximadamente 316 pb del extremo 5' del intrón a2-a3, (3) un sitioIoxP5', (4) un casete de higromicina, (5) un sitioIoxP3', (6) aproximadamente 580 pb de la secuencia genómica humana que incluye aproximadamente 304 pb del extremo 3' del intrón a2-a3, el exón a3 de HLA-A*0201 y (7) un brazo de homología 3' que contiene aproximadamente 200 pb de secuencia genómica de ratón que incluye el intrón entre las secuencias codificantes de a3 de H-2K de ratón y de transmembrana (véase la figura 5 para la representación esquemática del vector de localización de H-2K). La secuencia de 149 nucleótidos en el punto de unión de las secuencias de ratón/humana en el 5' del vector de localización se expone en la SEQ ID NO: 3 y la secuencia de 159 nucleótidos en el punto de unión de las secuencias humana/ratón en el 3' del vector de localización se expone en la SEQ ID NO: 4. La recombinación homóloga con este vector de localización creó un locus H-2K de ratón modificado que contenía ADN genómico humano que codifica los dominios a1, a2 y a3 del gen HLA-A*0201 operativamente unidos a las secuencias codificantes de dominios transmembrana y citoplásmicos de H-2K de ratón endógenas que, tras su traducción, conduce a la formación de una proteína de MHC de clase I quimérica humana/ratón.

El ADN de BAC de localización se usó para electroporar células ES de F1H4 de ratón para crear células Es modificadas para generar ratones que expresan una proteína quimérica de MHC de clase I sobre la superficie de células nucleadas (por ejemplo, linfocitos T y B, macrófagos, neutrófilos). Las células ES que contienen una inserción de secuencias HLA humanas se identificaron mediante ensayo TAQMAN™ cuantitativo. Se diseñaron sondas y conjuntos de cebadores específicos para detectar la inserción de secuencias de HLA humanas y casetes de selección asociados (ganancia de alelo, "gain of allele", GOA) y pérdida de secuencias de ratón endógenas (pérdida de alelo, "loss of allele", LOA). La tabla 1 identifica los nombres y localizaciones detectados para cada una de las sondas usadas en los ensayos de PCR cuantitativa.

T l 1: n r l n i

El casete de selección puede eliminarse mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, las células ES que portan el locus del MHC de clase I quimérico humano/ratón puede transfectarse con una construcción que expresa Cre para eliminar el casete de higromicina "con sitioIoX'introducido mediante la inserción de la construcción de localización que contiene secuencias del gen de HLA-A*0201 humano (véase la figura 5). El casete de higromicina puede eliminarse opcionalmente cruzando los ratones que expresan la Cre recombinasa. Opcionalmente, el casete de higromicina se conserva en los ratones.

Las células ES de localización anteriormente descritas se utilizaron como células ES donantes y se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7294754 y Poueymirouet al.(2007), F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech., 25(1):91-99). Se identificaron los ratones VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ES donante) que portaban independientemente un gen de MHC de clase I quimérico mediante genotipado usando un ensayo de modificación de alelo (Valenzuelaet al., supra)que detecta la presencia de las secuencias de gen de HLA-A*0201 humanas distintivas.

Ejemplo 1.3. Expresión in vivo de HLA-A/H-2K quimérico en ratones genéticamente modificados.

En un ratón heterocigoto que portaba un locus H-2K genéticamente modificado como se describe en el ejemplo 1.2. se analizó la expresión de la proteína quimérica HLA-A/H-2K en las células del animal.

Se obtuvo sangre por separado de un ratón de tipo salvaje y un ratón heterocigoto (A21H2K) con HLA-A/H-2K quimérico. Las células se tiñeron para HLA-A2 humano con un anticuerpo anti-HLA-A conjugado con ficoeritrina ("phycoerythrin", PE) y se expusieron a un anticuerpo anti-H-2Kb conjugado con aloficocianina durante una hora a 4 °C. Se analizaron las células para determinar la expresión mediante citometría de flujo usando anticuerpos específicos para HLA-A y H-2Kb. La figura 6A muestra la expresión de H-2Kb y HLA-A2 en el de tipo salvaje y en el heterocigoto quimérico que expresa ambas proteínas. La figura 6B muestra la expresión tanto de H-2Kb como de HLA-A2/H2K quimérico en el ratón heterocigoto.

Ejemplo 2: Construcción y caracterización de ratones con p2 microglobulina genéticamente modificados

Ejemplo 2.1: Modificación de un locus de microglobulina ¡52 humanizado

El gen de microglobulina p2 de ratón (p2m) se humanizó en una única etapa mediante la construcción de un vector de localización exclusivo a partir de ADN de cromosoma artificial bacteriano humano (BAC) y de ratón utilizando la tecnología VELOCIGENE® (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6586251 y Valenzuelaet al., supra).

Brevemente, se generó un vector de localización mediante recombinación homóloga bacteriana que contenía brazos de homología de p2m de ratón cadena arriba y cadena abajo del clon BAC 89C24 del banco RPCI-23 (Invitrogen). Los brazos de homología de ratón se modificaron para flanquear un fragmento de ADN de p2m humana de 2,8 kb que se extiende desde el exón 2 hasta aproximadamente 267 nucleótidos cadena abajo del exón 4 no codificante (figura 7). Se introdujo un casete de selección de fármacos (neomicina) flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasas (por ejemplo, sitiosloxP)en el vector de localización para permitir la selección posterior. El vector de localización final se linealizó y se electroporó en una línea de células E<s>F1H4 de ratón (Valenzuelaet al., supra).

Los clones de células ES de localización con el casete de fármacos eliminado (mediante la introducción de la Cre recombinasa) se introdujeron en un embrión de ratón en la fase de 8 células mediante el método VELOCIMOUSE® (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. 7294754 y Poueymirouet al., supra).Se identificaron los ratones VELOCIMICE® (ratones F0 completamente derivados de la célula ES donante) que portaban el gen de p2m humanizada por selección para la determinación de la pérdida de alelo de ratón y ganancia de alelo humano utilizando una modificación del ensayo de alelos (Valenzuelaet al., supra).

Ejemplo 2.2: Caracterización de ratones con microglobulina 52 humanizada

Se evaluaron ratones heterocigotos para un gen de microglobulina p2 (p2m) humanizada para determinar la expresión usando citometría de flujo (Figuras 8 y 9).

Brevemente, se aisló sangre de grupos (n = 4 por grupo) de tipo salvaje, p2m humanizada, MHC humanizado (es decir, HLA humano) de clase I, y ratones p2m y MHC de clase I humanizados dobles usando técnicas conocidas en la técnica. La sangre de cada uno de los ratones de cada grupo se trató con tampón de lisis ACK (Lonza Walkersville) para eliminar los glóbulos rojos. Las células restantes se tiñeron usando anticuerpos anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), anti-CD11b (M1/70), anti-HLA de clase I humano y antimicroglobulina p2 humana (2M2) conjugados con fluorocromos. La citometría de flujo se realizó con BD-FACSCANTO™ (BD Biosciences).

La expresión de HLA de clase I humano se detectó en células de animales con una humanización y doblemente humanizados, mientras que la expresión de microglobulina p2 solo se detectó en células de ratones doblemente humanizados (figura 8). La coexpresión de p2m humana y HLA de clase I humano dio como resultado un aumento de la cantidad detectable de HLA de clase I humano en la superficie celular en comparación con la expresión de HLA de clase I humano en ausencia de p2m humana (figura 9; intensidad fluorescente media de 2370 frente a 1387).

Ejemplo 3. Respuesta Inmunitaria a péptidos de los virus de la gripe y de Epstein-Barr (EBV) presentados por APC de ratones genéticamente modificados que expresan HLA-A2/H-2K y microglobulina p2 humanizada.

Las PBMC de varios donantes humanos se seleccionaron tanto para determinar la expresión de HLA-A2 como su capacidad para generar una respuesta a péptidos de la gripe y de EBV. Se seleccionó un único donante para experimentos posteriores.

Los linfocitos T humanos se aíslan de las PBMC del donante seleccionado usando selección negativa. Las células esplénicas no T se aislaron de un ratón heterocigoto para un HLA-A2/H-2K quimérico y heterocigótico para un gen de microglobulina p2 humanizada, y de un ratón de tipo salvaje. Se agregaron aproximadamente 50000 células esplénicas no T de los ratones a una placa Elispot recubierta con anticuerpo anti-IFNY humano. Se añadió péptido de la gripe (10 micromolar) o un grupo de péptidos de EBV (5 micromolar cada uno). Se añadió poli IC a 25 microgramos/pocillo, y los pocillos se incubaron durante tres horas a 37 °C con 5 % de CO<2>. Se añadieron linfocitos T humanos (50000) y anti-CD28 humano a las células esplénicas no T y a los péptidos, y los pocillos se incubaron durante 40 horas a 37 °C con 5 % de CO2, después de lo cual se realizó un ensayo IFN<y>Elispot.

Tal como se muestra en la figura 10, los linfocitos T humanos fueron capaces de generar una respuesta a los péptidos de la gripe y de EBV cuando fueron presentados por APC de ratón que expresaban el HLA-A2/H-2K quimérico y la microglobulina p2 humanizada en su superficie.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si un posible antígeno contiene un epítopo que generará una respuesta inmunitaria restringida por HLA clase I que comprende:

exponer un roedor genéticamente modificado al antígeno o una porción del mismo,

permitir que el roedor genere una respuesta inmunitaria, y

detectar en el roedor una célula que se une específicamente a una célula presentadora de antígenos que expresa un complejo MHC I humanizado que presenta una secuencia peptídica del antígeno o una porción del mismo; en donde el roedor expresa:

(i) un polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor a partir de un locus endógeno del complejo principal de histocompatibilidad I (MHC I) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica los dominios a l, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano unidos operativamente a dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido de MHC I de roedor, y

(ii) un polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado a partir de un locus de microglobulina p2 endógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano;

en donde el complejo MHC I humanizado comprende el polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor y el polipéptido de microglobulina p2 humano o humanizado, y

en donde el roedor es una rata o un ratón.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el roedor:

(i) no expresa los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I de roedor endógeno a partir del locus de MHC I de roedor endógeno y/o

(ii) no expresa un polipéptido de microglobulina p2 de roedor endógeno funcional a partir del locus de microglobulina p2 de roedor endógeno.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde:

(i) la secuencia de nucleótidos codifica los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido de MHC I humano unidos operativamente a dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido de MHC I de roedor está operativamente unida a elementos reguladores de<m>H<c>I de roedor endógenos y/o

(ii) la secuencia de ácido nucleico que comprende los exones 2, 3 y 4 de un gen de microglobulina p2 humano está operativamente unida a elementos reguladores de microglobulina p2 de roedor endógenos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(i) la porción humana del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende una secuencia líder humana y/o el polipéptido de MHC I humano se selecciona del grupo que consiste en HLA-A, HLA-B y HLA-C y/o (ii) la secuencia de ácido nucleico comprende del exón 2 al exón 4 del gen de microglobulina p2 humano y/o la secuencia de ácido nucleico comprende además el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de roedor.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el roedor es un ratón.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el locus endógeno es un locus H-2K de ratón.

7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde el polipéptido de MHC I de roedor es un polipéptido H-2K de ratón y/o en donde la porción humana del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido HLA-A2 y la porción de roedor del polipéptido quimérico de MHC I humano/roedor comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido H-2K de ratón y el ratón expresa el polipéptido quimérico HLA-A2/H-2K.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el polipéptido HLA-A2 es un polipéptido HLA-A2.1.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el locus de MHC I endógeno es un locus H-2Kb de ratón.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en donde el ratón comprende en su genoma:

(i) la secuencia de nucleótidos, en un locus H-2K endógeno de ratón, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón, y en donde la porción humana del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón comprende los dominios a1, a2 y a3 de un polipéptido HLA-A2 y la porción de ratón del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón comprende dominios transmembrana y citoplásmicos de un polipéptido H-2K de ratón; y

(ii) la secuencia de ácido nucleico, en un locus de microglobulina p2 endógeno de ratón, en donde la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido quimérico de microglobulina p2 humana/ratón, y en donde la secuencia de ácido nucleico comprende el exón 1 de un gen de microglobulina p2 de ratón,

en donde el ratón expresa el polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón y el polipéptido quimérico de microglobulina p2 humana/ratón.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el ratón no expresa polipéptidos de H-2K y microglobulina p2 endógenos de ratón a partir del locus H-2K de ratón endógeno y del locus de microglobulina p2 endógeno, respectivamente.

12. El método de la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde:

(i) la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a elementos reguladores de H-2K de ratón endógenos, y

(ii) la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a elementos reguladores de microglobulina p2 de ratón endógenos.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende del exón 2 al exón 4 del gen de microglobulina p2 humano.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la expresión del polipéptido quimérico de microglobulina p2 humano/ratón aumenta la expresión del polipéptido quimérico de MHC I humano/ratón en comparación con la expresión del polipéptido quimérico de Mh C I humano/ratón en ausencia de expresión del polipéptido quimérico de microglobulina p2 humano/ratón.