JP6154391B2

JP6154391B2 - 遺伝子改変された主要組織適合複合体マウス

Info

Publication number: JP6154391B2
Application number: JP2014539029A
Authority: JP
Inventors: リンマクドナルド，; アンドリュージェイ．マーフィー，; ケイガンギュラー，; ジョンミクウィルター，; ベラボロニナ，; フェイスハリス，; ショーンスティーブンズ，
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2017-06-28
Anticipated expiration: 2032-10-26
Also published as: CN104039132A; CY1119657T1; CN107254480A; HUE045879T2; EP4311833A2; WO2013063346A1; IL232097A; ES2741649T3; EP3262932B1; US9615550B2; ES2962287T3; NZ623456A; SG11201400933VA; EP4311833A3; AU2017279797A1; AU2012324016C1; JP2019068857A; KR20140089560A; AU2012324016A1; JP2014532412A

Description

関連出願の引用
本願は、いずれも２０１１年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／５５２，５８２号および同第６１／５５２，５８７号、ならびに２０１２年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７００，９０８号の優先権の利益を主張する。これらの出願はすべて、それらの全体が本明細書に参考として援用される。

発明の分野
本発明は、ヒトまたはヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）に関する。本発明はまた、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩタンパク質（例えば、ＭＨＣＩα鎖）および／またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラット、ならびに、これを発現する胚、組織および細胞にも関する。本発明はさらに、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＭＨＣＩα鎖）および／またはβ２ミクログロブリンを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法を提供する。また、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるヒト化細胞性免疫系に関連して、または遺伝子改変された非ヒト動物において、ペプチドを同定するためおよび評価するための方法、ならびに、非ヒト動物、例えばマウスまたはラットのＭＨＣＩ遺伝子座および／またはβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変し、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよび／またはβ２ミクログロブリンを発現する方法も提供する。

発明の背景
獲得免疫応答において、外来性抗原が、Ｂリンパ球（例えば、免疫グロブリン）およびＴリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体すなわちＴＣＲ）上の受容体分子によって認識される。これらの外来性抗原は、特殊文化したタンパク質、一般に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれるタンパク質によって、細胞の表面にペプチド断片として提示される。ＭＨＣ分子は、約４Ｍｂに及ぶ遺伝子の連結したクラスターとして見出される複数の遺伝子座によってコードされる。マウスにおいて、ＭＨＣ遺伝子は、第１７番染色体上に見出され、歴史的な理由から、組織適合性２（Ｈ−２）遺伝子と呼ばれる。ヒトにおいて、上記遺伝子は、第６染色体上に見出され、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。マウスおよびヒトにおける遺伝子座は、多遺伝子性である；これらは、ヒトゲノムとマウスゲノムとにおいて類似の構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）を示すＭＨＣ遺伝子の３つの高度多形性クラス（クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を含む（それぞれ、図２および図３を参照されたい）。

ＭＨＣ遺伝子座は、ゲノムにおいて最も高度の多形性を示す；いくつかの遺伝子は、３００を超える対立遺伝子によって表される（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲβおよびヒトＨＬＡ−Ｂ）。全てのクラスＩおよびＩＩＭＨＣ遺伝子は、ペプチド断片を提示し得るが、各々の遺伝子は、多形および対立遺伝子バリアントを反映して、異なる結合特性を有するタンパク質を発現する。任意の所定の個体は、免疫応答の過程においてＢ細胞およびＴ細胞に対する、細胞表面に提示され得る独特な範囲のペプチド断片を有する。

ヒトおよびマウスの両方とも、クラスＩＭＨＣ遺伝子を有する（図２および図３を参照されたい）。ヒトにおいて、古典的クラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃと呼ばれ、他方で、マウスにおいて、これらは、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２ＤおよびＨ−２Ｌである。クラスＩ分子は、２本の鎖からなる：多形性α鎖（時々、重鎖と呼ばれる）および、一般に多形性ではないβ２−ミクログロブリンと呼ばれるより短い鎖（軽鎖としても知られる）（図１）。これらの２本の鎖は、細胞表面で非共有結合ヘテロダイマーを形成する。α鎖は、３つのドメイン（α１、α２およびα３）を含む。α鎖遺伝子のエクソン１はリーダー配列をコードし、エクソン２および３はα１およびα２ドメインをコードし、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通ドメインをコードし、エクソン６および７は細胞質尾部（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｔａｉｌ）をコードする。α鎖は、α１ドメインおよびα２ドメイン（Ｉｇ様ドメインに似ている）を含むペプチド結合溝（ｃｌｅｆｔ）を形成し、その後に、β２−ミクログロブリンに類似するα３ドメインが続く。

β２ミクログロブリンは、非グリコシル化１２ｋＤａタンパク質である；その機能の１つは、ＭＨＣクラスＩα鎖を安定化させることである。α鎖とは異なり、β２ミクログロブリンは膜まで及ばない。ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座は、第１５番染色体上にあり、他方で、マウス遺伝子座は、第２番染色体上にある。β２ミクログロブリン遺伝子は、４つのエクソンおよび３つのイントロンからなる。β２ミクログロブリンの循環形態は、血清、尿および他の体液中に存在する；従って、非共有結合ＭＨＣＩ関連β２ミクログロブリンは、生理学的条件下で、循環β２ミクログロブリンと交換され得る。

クラスＩＭＨＣ分子は、腫瘍細胞を含む全ての有核細胞上に発現される。これらは、とりわけ、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞ならびに好中球において特異的に発現され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対し、その表面にペプチド断片（典型的には、８〜１０アミノ酸長）を提示するように機能する。ＣＴＬは、その自らの膜結合ＴＣＲによって認識されるＭＨＣＩ結合ペプチドを保有する任意の細胞を死滅させることに特殊分化される。細胞が細胞性タンパク質に由来するが通常は存在しない（例えば、ウイルス起源、腫瘍起源または他の非自己起源の）ペプチドを提示する場合、このようなペプチドは、ＣＴＬによって認識され、該ＣＴＬは、活性化されて、該ペプチドを提示する細胞を死滅させる。

典型的には、ＭＨＣＩ分子との関連で、正常の（すなわち、自己の）タンパク質の提示は、寛容機構ゆえに、ＣＴＬ活性化を惹起しない。しかし、いくつかの疾患（例えば、がん、自己免疫疾患）において、自己タンパク質に由来するペプチドが、免疫系の細胞構成要素の標的になり、このようなペプチドを提示する細胞の破壊をもたらす。ＭＨＣクラスＩ分子を介してヒトＣＴＬによって認識されるペプチドの同定を改善するために、細胞性免疫応答を惹起するいくつかの自己由来抗原（例えば、種々のがんに関連する抗原）を認識することにおいて進歩はあるが、ヒト細胞性免疫系の諸態様を模倣するｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏ両方の系についての必要性が依然としてある。ヒト細胞性免疫系を模倣する系は、ヒト治療剤、例えばワクチンおよび他の生物製剤を開発するための、疾患関連抗原を同定することにおいて使用され得る。ヒト免疫系との関連で、抗原認識を評価するための系は、治療的に有用な（例えば、ヒト疾患を研究し、これと闘うのに有用な）ＣＴＬ集団を同定することを補助し得る。このような系はまた、ヒトＣＴＬ集団の活性を、感染症および外来性抗原保有実体とより有効に闘うように、増強することをも補助し得る。従って、ヒト免疫系の機能を模倣する構成要素を提示する免疫系を生成し得る生物システム（例えば、遺伝子操作動物）についての必要性がある。

ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質およびそのキメラに関連し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合するペプチドを生成するかまたは同定するための生物系が提供される。細胞性免疫応答において機能するヒト分子またはヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物が提供される。ヒトまたはヒトまたはヒト化ＭＨＣＩタンパク質およびヒトまたはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンタンパク質をコードするヒト化げっ歯動物遺伝子座もまた提供される。ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞もまた提供される。１種または複数種のヒトまたはヒト化免疫系分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞を含む、ｉｎｖｉｖｏ系およびｉｎｖｉｔｒｏ系が提供される。

キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えば、ヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）であって、ここで、該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む非ヒト動物が本明細書中で提供される。具体的には、非ヒト動物であって、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座においてキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含むヌクレオチド配列を含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドを発現する非ヒト動物が本明細書中で提供される。１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座から内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない。本発明の１つの態様では、上記非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えばヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む２コピーのＭＨＣＩ遺伝子座を含む。本発明の別の態様では、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１コピーのＭＨＣＩ遺伝子座を含む。従って、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＭＨＣＩ遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。種々の実施形態において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウス）の生殖細胞系に含まれる。

１つの態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒト調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどに作動可能に連結している。１つの実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分はヒトリーダー配列を含む。さらなる実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２およびα３ドメインを含む。ヒトＭＨＣＩポリペプチドはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドである。

１つの態様では、遺伝子操作された非ヒト動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態では、上記げっ歯動物はマウスである。従って、１つの実施形態では、内在性非ヒト遺伝子座は、マウス遺伝子座、例えば、マウスＨ−２Ｋ、Ｈ−２ＤまたはＨ−２Ｌ遺伝子座である。１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。従って、上記非ヒト動物がマウスである実施形態では、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座）であってもよく、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｋポリペプチドであってもよい；従って、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。非ヒト動物がマウスである別の実施形態では、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｄ遺伝子座であってもよく、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｄポリペプチドであってもよい；従って、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。同様に、別の実施形態では、内在性非ＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｌ遺伝子座であってもよく、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｌポリペプチドであってもよい；従って、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｌポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。

また、マウスであって、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座においてキメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＨＬＡ−Ａ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、そのマウス部分がマウスＨ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むヌクレオチド配列を含み、該キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドを発現するマウスも本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、上記マウスは、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座からマウスＨ−２Ｋポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない。１つの態様では、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している。上記キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトリーダー配列を含み得る。これはまた、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２およびα３ドメインをも含み得る。上記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドであってもよい。１つの態様では、上記マウスＨ−２Ｋ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座である。

本発明の別の態様は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む、非ヒト動物、例えばげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）に関する。従って、非ヒト動物であって、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座においてヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する非ヒト動物が本明細書中で提供される。１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から機能的な内在性非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。１つの態様では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする２コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む；別の実施形態では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする１コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む。従って、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。種々の実施形態において、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウス）の生殖細胞系に含まれる。１つの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、上記ポリペプチドは、ＭＨＣＩタンパク質に結合可能である。

いくつかの実施形態では、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している。１つの態様では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む。別の態様では、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４に示されるヌクレオチド配列を含む。さらなる態様において、上記ヌクレオチド配列はまた、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列をも含む。いくつかの実施形態では、上記非ヒト動物は、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）である；従って、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座は、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）β２ミクログロブリン遺伝子座である。

ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を内在性β２ミクログロブリン遺伝子座において含むマウスであって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するマウスも提供される。いくつかの実施形態では、上記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的な内在性マウスβ２ミクログロブリンを発現しない。上記ヌクレオチド配列は内在性マウス調節エレメントに連結し得る。１つの態様では、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む。あるいは、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１のヌクレオチド配列をさらに含み得る。１つの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、上記ポリペプチドは、ＭＨＣＩタンパク質に結合可能である。

本発明は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）をさらに提供する。１つの実施形態では、本発明は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む該キメラポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列、ならびにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列をそのゲノムに含む非ヒト動物であって、該第１ヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座に位置し、該第２ヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置し、該動物は、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する非ヒト動物が提供される。１つの態様では、上記動物はマウスである。従って、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、およびＨ−２Ｌ遺伝子座からなる群より選択され得る。１つの実施形態では、内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座）である。１つの実施形態では、上記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃポリペプチドからなる群より選択される。１つの態様では、上記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、例えば、ＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）である。種々の実施形態では、上記第１ヌクレオチド配列および上記第２ヌクレオチド配列は、上記非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）の生殖細胞系に含まれる。

従って、本発明は、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分がヒトＨＬＡ−Ａ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）の細胞外ドメインを含み、マウス部分がマウスＨ−２Ｋの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む該キメラポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列、ならびにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列をそのゲノムに含むマウスであって、該第１ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座に位置し、該第２ヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置し、該マウスは、該キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するマウスを提供する。１つの実施形態では、上記キメラＭＨＣＩポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの両方を含む非ヒト動物（例えば、マウス）は、それらのそれぞれの内在性遺伝子座から、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチド（例えば、マウスＨ−２Ｋポリペプチド）の細胞外ドメインおよび／または機能的な内在性非ヒト（例えば、マウス）β２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。１つの態様では、上記動物（例えば、マウス）は、それぞれ２コピーの上記第１ヌクレオチド配列および上記第２ヌクレオチド配列を含む。別の態様では、上記動物（例えば、マウス）は、１コピーの上記第１ヌクレオチド配列および１コピーの上記第２ヌクレオチド配列を含む。従って、上記動物は、上記第１ヌクレオチド配列および上記第２ヌクレオチド配列の両方について、ホモ接合型であっても、またはヘテロ接合型であってもよい。

１つの態様では、上記第１ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト（例えば、マウス）ＭＨＣＩ調節エレメントに作動可能に連結しており、上記第２ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト（例えば、マウス）β２ミクログロブリンエレメントに作動可能に連結している。上記キメラポリペプチドのヒト部分は、上記ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２およびα３ドメインを含み得る。上記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、上記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様では、上記キメラＭＨＣＩポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの両方を含むマウスは、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの発現の非存在下における上記キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドの発現と比較して、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンの発現がキメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドの発現を増大させるものであってもよい。

本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えばマウスまたはラット）を作製する方法もまた、提供される。従って、１つの実施形態では、キメラヒト／げっ歯動物（例えば、ヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣＩポリペプチドを発現するようにげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）のＭＨＣＩ遺伝子座を改変する方法であって、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座において、げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法が提供される。別の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するようにげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）のβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変する方法であって、内在性げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）β２ミクログロブリン遺伝子座において、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法が提供される。このような方法では、上記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ得、該単一のＥＳ細胞は、胚を作製するために、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）に導入され得る。得られたげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）を交配して、二重ヒト化動物を生み出すことができる。

従って、本発明はまた、二重ヒト化動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）を作製する方法をも提供する。１つの実施形態では、遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、（ａ）第１マウスのＭＨＣＩ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドを発現するように改変する工程であって、内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座においてマウスＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程、（ｂ）第２マウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように改変する工程であって、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座においてマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；ならびに（ｃ）該第１マウスと該第２マウスとを交配させて、そのゲノムに、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスを生み出す工程を含み、該遺伝子改変されたマウスは、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記ＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、およびＨ−２Ｌから選択され；いくつかの実施形態では、上記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃから選択される。１つの実施形態では、上記ＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座であり、上記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）であり、上記マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチド）を発現する。１つの態様では、上記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドの細胞外ドメインならびにＨ−２Ｋポリペプチドの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。１つの態様では、上記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４（例えば、エクソン２〜エクソン４）に示されるヌクレオチド配列、ならびにマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列を含む。

本明細書中で記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来する細胞（例えば、単離された抗原提示細胞）もまた、本明細書中で提供される。本明細書中で記載される非ヒト動物に由来する組織および胚もまた提供される。

なお別の実施形態では、本発明は、免疫応答を惹起する抗原または抗原エピトープの同定のための方法、ワクチン候補を評価するための方法、ヒト病原体またはがん抗原に対する高親和性Ｔ細胞の同定のための方法を提供する。

本明細書中で記載される実施形態および態様のいずれもが、他に指示がない限り、文脈から別段明らかでない限り、互いに共同して使用され得る。他の実施形態は、続く詳細な記載を精査して当業者に明らかになる。以下の詳細な記載は、特許請求される本発明を制限しない、本発明の種々の実施形態の代表例を含む。添付の図面は、本明細書の一部を構成し、記載と一緒に、実施形態を例証するためのみに働き、本発明を制限しない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内在性主要組織適合複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、
該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含み、
該非ヒト動物は、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドを発現する、非ヒト動物。
（項目２）
前記動物は、げっ歯動物であり、該げっ歯動物は、内在性主要組織適合複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）遺伝子座においてキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含み、
該げっ歯動物は、該キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドを発現する、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
内在性げっ歯動物ＭＨＣＩ遺伝子座から、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない、項目２に記載のげっ歯動物。
（項目４）
前記ヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物調節エレメントに作動可能に連結している、項目２に記載のげっ歯動物。
（項目５）
前記げっ歯動物はマウスである、項目２に記載のげっ歯動物。
（項目６）
前記内在性遺伝子座はマウスＨ−２Ｋ遺伝子座である、項目５に記載のマウス。
（項目７）
前記キメラポリペプチドの前記ヒト部分はヒトリーダー配列を含む、項目２に記載のげっ歯動物。
（項目８）
前記キメラポリペプチドの前記ヒト部分は、前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２、およびα３ドメインを含む、項目２に記載のげっ歯動物。
（項目９）
前記キメラポリペプチドのげっ歯動物部分は、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目２に記載のげっ歯動物。
（項目１０）
前記げっ歯動物はマウスであり、前記内在性げっ歯動物ＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座であり、前記内在性げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｋである、項目９に記載のげっ歯動物。
（項目１１）
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群より選択される、項目２に記載のげっ歯動物。
（項目１２）
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａポリペプチドである、項目１１に記載のげっ歯動物。
（項目１３）
内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、
該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
該マウスは、該キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドを発現する、マウス。
（項目１４）
内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座から前記マウスＨ−２Ｋポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない、項目１３に記載のマウス。
（項目１５）
前記キメラポリペプチドの前記ヒト部分は、ヒトリーダー配列を含む、項目１３に記載のマウス。
（項目１６）
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している、項目１３に記載のマウス。
（項目１７）
前記キメラポリペプチドの前記ヒト部分は、前記ヒトＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドのα１、α２、およびα３ドメインを含む、項目１３に記載のマウス。
（項目１８）
前記ヒトＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドである、項目１３に記載のマウス。
（項目１９）
前記マウスＨ−２Ｋ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座である、項目１３に記載のマウス。
（項目２０）
マウスのＭＨＣＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドを発現させる方法であって、該内在性ＭＨＣＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法。
（項目２１）
前記マウスは、内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座から、前記マウスＭＨＣＩポリペプチドの前記細胞外ドメインを発現しない、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記マウスＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座であり、前記マウスＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｋポリペプチドである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドはＨＬＡ−Ａポリペプチドである、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記マウスは、前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２、およびα３ドメインを発現する、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記マウスは、前記マウスＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを発現する、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
前記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ、該単一のＥＳ細胞は、マウス胚に導入されて、マウスを作製する、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座にヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、非ヒト動物。
（項目２８）
前記動物は、げっ歯動物であり、該げっ歯動物は、内在性げっ歯動物β２ミクログロブリン遺伝子座にヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、項目２７に記載の非ヒト動物。
（項目２９）
前記げっ歯動物は、内在性げっ歯動物β２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的な内在性げっ歯動物β２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない、項目２８に記載のげっ歯動物。
（項目３０）
前記ヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物β２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している、項目２８に記載のげっ歯動物。
（項目３１）
前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目２８に記載のげっ歯動物。
（項目３２）
前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目２８に記載のげっ歯動物。
（項目３３）
前記ヌクレオチド配列は、げっ歯動物β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列をさらに含む、項目３１に記載のげっ歯動物。
（項目３４）
前記ヌクレオチド配列は、げっ歯動物β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列をさらに含む、項目３２に記載のげっ歯動物。
（項目３５）
前記げっ歯動物はマウスである、項目２８に記載のげっ歯動物。
（項目３６）
内在性β２ミクログロブリン遺伝子座にヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、マウス。
（項目３７）
内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的な内在性マウスβ２ミクログロブリンを発現しない、項目３６に記載のマウス。
（項目３８）
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している、項目３６に記載のマウス。
（項目３９）
前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目３６に記載のマウス。
（項目４０）
前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目３６に記載のマウス。
（項目４１）
前記ヌクレオチド配列は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列をさらに含む、項目３９に記載のマウス。
（項目４２）
前記ヌクレオチド配列は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列をさらに含む、項目４０に記載のマウス。
（項目４３）
マウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変して、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現させる方法であって、該内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座において、マウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法。
（項目４４）
前記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記改変された遺伝子座は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１のヌクレオチド配列を保持する、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ、該単一のＥＳ細胞は、マウス胚に導入されてマウスを作製する、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
非ヒト動物であって、
そのゲノムに：
キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む、第１ヌクレオチド配列；および
ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列を含み、
該第１ヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座に位置し、該第２ヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置しており、
該非ヒト動物は、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、非ヒト動物。
（項目５０）
前記動物は、げっ歯動物であり、該げっ歯動物は、そのゲノムに：
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含む、第１ヌクレオチド配列；および
ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列を含み、
該第１ヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩ遺伝子座に位置し、該第２ヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物β２ミクログロブリン遺伝子座に位置し、
該げっ歯動物は、該キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、項目４９に記載の非ヒト動物。
（項目５１）
前記げっ歯動物は、その内在性げっ歯動物遺伝子座から、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインおよび機能的な内在性げっ歯動物β２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目５２）
前記第１ヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物ＭＨＣＩ調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２ヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物β２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目５３）
マウスである、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目５４）
前記内在性ＭＨＣＩ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋ遺伝子座である、項目５３に記載のマウス。
（項目５５）
前記キメラポリペプチドの前記ヒト部分は、前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２、およびα３ドメインを含む、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目５６）
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドのげっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣＩポリペプチドの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目５７）
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃから選択される、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目５８）
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａポリペプチドである、項目５７に記載のげっ歯動物。
（項目５９）
前記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目６０）
前記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目５０に記載のげっ歯動物。
（項目６１）
マウスであって、
そのゲノムに：
キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｋの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、第１ヌクレオチド配列；ならびに
ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列を含み、
該第１ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座に位置し、該第２ヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置し、
該マウスは、該キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、マウス。
（項目６２）
項目６１に記載のマウスであって、内在性マウスＨ−２Ｋポリペプチドおよびβ２ミクログロブリンポリペプチドをそれらの内在性遺伝子座から発現しない、マウス。
（項目６３）
前記第１ヌクレオチド配列は、内在性マウスＨ−２Ｋ調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２ヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している、項目６１に記載のマウス。
（項目６４）
前記キメラポリペプチドの前記ヒト部分は、前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１、α２、およびα３ドメインを含む、項目６１に記載のマウス。
（項目６５）
前記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目６１に記載のマウス。
（項目６６）
前記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目６１に記載のマウス。
（項目６７）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの発現は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの発現の非存在下での前記キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドの発現と比較して、該キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドの発現を増大する、項目６１に記載のマウス。
（項目６８）
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
第１マウスのＭＨＣＩ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドを発現するように改変する工程であって、該内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；
第２マウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように改変する工程であって、該内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座において、マウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；ならびに
該第１マウスおよび該第２マウスを交配して、そのゲノムに、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスを生み出す工程であって、該遺伝子改変されたマウスは、該キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する工程を含む、方法。
（項目６９）
前記ＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座であり、前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２であり、前記マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドを発現する、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、前記ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドの細胞外ドメインならびにＨ−２Ｋポリペプチドの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列およびマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列を含む、項目６８に記載の方法。

図１は、クラスＩＭＨＣ分子の４つのドメイン：α１、α２およびα３ドメインを含むα鎖および非共有結合した第４のドメインであるβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の概略図である。灰色の円は、ペプチド結合溝に結合したペプチドを表す。図２は、ヒトＨＬＡの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。図３は、マウスＭＨＣの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。図４は、キメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２ＫポリペプチドおよびＩＲＥＳ−ＧＦＰレポーターをコードするｃＤＮＡを含むウイルスベクター構築物（Ａ）；ならびに単独で（左）またはヒト化β２ミクログロブリンと共形質導入された（右）、ＨＬＡ−Ａ２によって形質導入された（破線）、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋによって形質導入された（点線）、または形質導入されていない（実線）ＭＧ８７細胞におけるヒトＨＬＡ−Ａ２の発現を比較するヒストグラム（Ｂ）を示す。（Ｂ）においてグラフで示される水平ゲートからのデータは、構築物を発現する細胞の百分率として（Ｃ）の表に示される。図５は、ヒトＨＬＡ−Ａ２タンパク質の細胞外領域を発現するキメラＨ−２Ｋ遺伝子座を作製するために使用される標的化戦略の概略図（原寸に比例しない）である。マウス配列は、黒で表され、ヒト配列は、白で表される。Ｌ＝リーダー、ＵＴＲ＝非翻訳領域、ＴＭ＝膜貫通ドメイン、ＣＹＴ＝細胞質ドメイン、ＨＹＧ＝ハイグロマイシン。図６Ａは、野生型（ＷＴ）マウスまたはキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２ＫＨＥＴ）を有するヘテロ接合型マウスのいずれかから単離された細胞におけるＨＬＡ−Ａ２（左）およびＨ−２Ｋ（右）の発現（％全細胞）を明示する。図６Ｂは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子座を有するヘテロ接合型マウスにおけるキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現のドットプロットである。図７は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子のヒト化についての標的化戦略（原寸に比例しない）を示す。マウス配列は黒であり、ヒト配列は、白である。ＮＥＯ＝ネオマイシン。図８は、野生型（ＷＴ）マウス、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋに対してヘテロ接合型マウス、およびキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋに対してヘテロ接合型かつヒト化β２ミクログロブリンに対してヘテロ接合型マウス（二重ヘテロ接合型；クラスＩ／β２ｍＨＥＴ）の血液から単離された細胞におけるＨＬＡクラスＩおよびヒトβ２ミクログロブリンの発現の代表的なドットプロットを示す。図９は、野生型（ＷＴ）、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋヘテロ接合型（クラスＩＨＥＴ）、およびキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋ／ヒト化β２ミクログロブリン二重ヘテロ接合型（クラスＩ／β２ｍＨＥＴ）マウスの血液から単離された細胞におけるヒトＨＬＡクラスＩ発現（Ｘ軸）の代表的なヒストグラムを示す。図１０は、ｆｌｕ（左）またはＥＢＶ（右）ペプチドの存在下で野生型マウス（ＷＴＡＰＣ）由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋおよびヒト化β２ミクログロブリンの両方に対してヘテロ接合型マウス由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）（二重ＨＥＴＡＰＣ）に曝露したヒトＴ細胞についてのＩＦＮγ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの結果を示す。統計学的分析を、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｐｏｓｔｔｅｓｔ）による一元配置ＡＮＯＶＡを用いて実施した。

発明の詳細な説明
定義
本発明は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドおよび／またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）；これらを含む胚、細胞および組織；これらを作製する方法；ならびにこれらを使用する方法を提供する。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての用語および語句は、反対のことが明らかに示されない限り、またはこの用語もしくは語句が使用される文脈から別段明らかにされない限り、この用語および語句が当該分野で果たしている意味を含む。

用語「保存的」は、保存的アミノ酸置換を記載するために使用される場合、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を改変することによって達成され得る。一般に、保存的アミノ酸置換は、対象のタンパク質の機能的特性、例えば、ＭＨＣＩが対象のペプチドを提示する能力を、実質的に変えない。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、脂肪族側鎖、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；脂肪族−ヒドロキシル側鎖、例えばセリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖、例えばアスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖、例えばフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；塩基性側鎖、例えばリジン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性側鎖、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに、硫黄含有側鎖、例えばシステインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発において使用されるように、タンパク質における任意の天然の残基のアラニンによる置換であってもよい。いくつかの実施形態では、保存的置換は、本明細書により参考として組み込まれる、Gonnetら（（１９９２年）Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database、Science ２５６巻：１４４３〜４５頁）において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するように行われる。いくつかの実施形態において、上記置換は、中程度に保存的な置換であり、ここで、該置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する。

従って、そのゲノムがヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドおよび／またはβ２ミクログロブリンポリペプチド（これらのポリペプチド（複数可）は、本明細書中で記載されるアミノ酸配列（複数可）の保存的アミノ酸置換を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。

当業者は、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドおよび／またはβ２ミクログロブリンをコードする核酸残基に加えて、遺伝コードの縮重に起因して、他の核酸が本発明のポリペプチド（複数可）をコードし得ることを理解する。従って、保存的アミノ酸置換を有するＭＨＣＩポリペプチド（複数可）および／またはβ２ミクログロブリンポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物に加えて、そのゲノムが上記遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載されるものとは異なるヌクレオチド配列（複数可）を含む非ヒト動物もまた、提供される。

用語「同一性」は、配列に関して使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列同一性を測定するために使用され得る当該分野で公知の多くの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を含む。本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１の伸長ギャップペナルティーを用いたＣｌｕｓｔａｌＷｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用し、かつＧｏｎｎｅｔ類似性行列（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒＩｎｃ．、２００８年）を使用して決定される。配列の同一性に関して比較される配列の長さは、特定の配列に依存する。種々の実施形態では、同一性は、成熟タンパク質の配列を、そのＮ−末端からそのＣ−末端まで比較することによって決定される。種々の実施形態では、キメラヒト／非ヒト配列をヒト配列と比較する場合、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分との間のレベルの同一性の確認を目的とした比較を行う（例えば、キメラヒト／マウスタンパク質のヒトエクトドメイン対ヒトタンパク質のヒトエクトドメインを比較する）ことにおいて、該キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分を使用する（しかし、非ヒト部分を使用しない）。

配列、例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸に関して、用語「相同性」または「相同な」は、最適アラインメントおよび比較における２つの配列は、少なくとも約７５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、少なくとも約８０％のヌクレオチドまたはアミノ酸、少なくとも約９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、９７％を超えるヌクレオチドまたはアミノ酸において、同一であることを意味する。最適な遺伝子ターゲティングのために、標的化構築物（ｔａｒｇｅｔｉｎｇｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）は、内在性ＤＮＡ配列に対して相同なアーム（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含むべきであることを、当業者は理解する；従って、相同組換えは、標的化構築物と標的にされた内在性配列との間に起こり得る。

用語「作動可能に連結している」は、記載された構成要素が、該要素の意図する様式で機能することを可能にする関係にある近位をいう。このように、タンパク質をコードする核酸配列は、正しい転写調節を有するように調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結し得る。さらに、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々の部分は、細胞内で、タンパク質の正しい折り畳み、プロセシング、標的、発現および他の機能的特性を保持するように作動可能に連結し得る。他に言及されない限り、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々のドメインは、互いに作動可能に連結している。

用語「ＭＨＣＩ複合体」などは、本明細書中で使用される場合、ＭＨＣＩα鎖ポリペプチドとβ２−ミクログロブリンポリペプチドとの間の複合体を含む。用語「ＭＨＣＩポリペプチド」などは、本明細書中で使用される場合、ＭＨＣＩα鎖ポリペプチドのみを含む。典型的には、用語「ヒトＭＨＣ」および「ＨＬＡ」は、相互交換可能に使用され得る。

遺伝子置き換えに関して用語「置き換え」は、内在性遺伝子の遺伝子座に外来性遺伝物質を置き、それによって、オルソロガスなまたは相同な核酸配列で内在性遺伝子の全てまたは一部を置き換えることをいう。以下の実施例において実証されるように、マウスＭＨＣＩポリペプチドおよびマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドの部分をコードする内在性遺伝子座の核酸配列を、それぞれ、ヒトＭＨＣＩポリペプチドおよびヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドの部分をコードするヌクレオチド配列によって置き換えた。

「機能的」は、例えば、機能的ポリペプチドについて本明細書中で使用される場合、通常天然のタンパク質に関連する少なくとも１つの生物学的活性を有するポリペプチドをいう。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、内在性遺伝子座における置き換え（例えば、内在性非ヒトＭＨＣＩおよび／またはβ２ミクログロブリン遺伝子座における置き換え）は、機能的内在性ポリペプチドを発現しない遺伝子座を生じる。

遺伝子改変されたＭＨＣＩ非ヒト動物について本明細書中以下で記載されるいくつかの態様、例えば、動物の種類；動物系統；細胞の種類；スクリーニング、検出および他の方法；使用の方法；などは、遺伝子操作されたβ２ミクログロブリン動物およびＭＨＣＩ／β２ミクログロブリン動物に対して適用可能である。

遺伝子改変されたＭＨＣＩ動物
種々の実施形態では、本発明は、一般に、そのゲノムにヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を提供する；従って、該動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドを発現する。

ＭＨＣ遺伝子は、３つのクラス：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分類され、これらの全ては、ヒト第６番染色体上またはマウス第１７番染色体上のいずれかにコードされる。ヒトおよびマウスのＭＨＣクラスの相対的構成の概略は、それぞれ図２および３に示される。ＭＨＣ遺伝子は、マウスおよびヒトのゲノムの最も多形な遺伝子の１つである。ＭＨＣ多形性は、進化的利点を提供する上で重要であると推定される；配列における変化はペプチド結合における差異をもたらし得、細胞傷害性Ｔ細胞に対し病原体をよりよく提示することを可能にする。

ＭＨＣクラスＩタンパク質は、細胞外ドメイン（３つのドメイン：α_１、α_２およびα_３を含む）、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含む。α_１およびα_２ドメインは、ペプチド結合溝を形成し、他方で、α_３は、β２−ミクログロブリンと相互作用する。

β２−ミクログロブリンとのその相互作用に加えて、α_３ドメインは、ＴＣＲ共受容体ＣＤ８と相互作用し、抗原特異的活性化を促進する。ＭＨＣクラスＩのＣＤ８に対する結合は、ＴＣＲのＭＨＣクラスＩに対する結合よりも約１００倍弱いが、ＣＤ８結合は、ＴＣＲ結合の親和性を増大する。Wooldridgeら（２０１０年）MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs、J. Immunol.１８４巻：３３５７〜３３６６頁。興味深いことに、ＭＨＣクラスＩのＣＤ８に対する結合の増大は、ＣＴＬ活性化における抗原特異性を抑制した。同上。

ＭＨＣクラスＩ分子に対するＣＤ８の結合は、種特異的である；ＣＤ８のマウスホモログであるＬｙｔ−２は、α３ドメインにおいてＨ−２Ｄ^ｄ分子に結合するが、ＨＬＡ−Ａ分子には結合しないことが示された。Connollyら（１９８８年）The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I α3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses、J. Exp. Med.１６８巻：３２５〜３４１頁。差次的結合は、おそらく、ヒトとマウスとの間で保存されていないＣＤ８におけるＣＤＲ様抗原決定基（ＣＤＲ１様およびＣＤＲ２様）に起因した。Sandersら（１９９１年）Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies、J. Exp. Med.１７４巻：３７１〜３７９頁；Vitielloら（１９９１年）Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex、J. Exp. Med.１７３巻：１００７〜１０１５頁；ならびにGaoら（１９９７年）Crystal structure of the complex between human CD8αα and HLA-A2、Nature ３８７巻：６３０〜６３４頁。ＣＤ８は、α３ドメインの保存的領域において（２２３〜２２９位において）ＨＬＡ−Ａ２に結合することが報告されている。ＨＬＡ−Ａにおける単一の置換（Ｖ２４５Ａ）が、ＣＤ８のＨＬＡ−Ａに対する結合を減少させ、同時に、Ｔ細胞媒介型溶解を大きく減少させた。Salterら（１９８９年）、Polymorphism in the α₃ domain of HLA-A molecules affects binding to CD8、Nature ３３８巻：３４５〜３４８頁。一般に、ＨＬＡ−Ａ分子のα３ドメインにおける多形性はまた、ＣＤ８に対する結合に影響を及ぼした。同上。マウスにおいて、Ｈ−２Ｄ^ｄにおける残基２２７でのアミノ酸置換は、マウスＬｙｔ−２のＨ−２Ｄ^ｄに対する結合に影響を及ぼし、変異体Ｈ−２Ｄ^ｄによってトランスフェクトされた細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって溶解されなかった。Potterら（１９８９年）Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8-independent, cytotoxic T lymphocytes、Nature ３３７巻：７３〜７５頁。

従って、ＭＨＣクラスＩα３ドメインとＣＤ８との間の相互作用の種特異性に起因して、Ｈ−２Ｋ α３ドメインのヒトＨＬＡ−Ａ２ α３ドメインによる置き換えを含むＭＨＣＩ複合体は、マウスにおいて（すなわち、ｉｎｖｉｖｏで）ヒトＣＤ８の非存在下で非機能的であった。ＨＬＡ−Ａ２についてトランスジェニックである動物において、マウスα３ドメインに代えてのヒトα３ドメインによる置換は、Ｔ細胞応答の回復をもたらした。Irwinら（１９８９年）Species-restricted interactions between CD8 and the α3 domain of class I influence the magnitude of the xenogeneic response、J. Exp. Med.１７０巻：１０９１〜１１０１頁；Vitielloら（１９９１年）、上掲。

マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部もまた、重要な機能を有する。ＭＨＣＩ膜貫通ドメインの機能の１つは、おそらくはＭＨＣ分子の表面の架橋（またはライゲーション）の結果として、ホモタイプな細胞接着のＨＬＡ−Ａ２による（接着を増強するかまたは阻害するための）モジュレーションを促進することである。Wagnerら（１９９４年）Ligation of MHC Class I and Class II Molecules Can Lead to Heterologous Desensitization of Signal Transduction Pathways That Regulate Homotypic Adhesion in Human Lymphocytes, J. Immunol.１５２巻：５２７５〜５２８７頁。細胞接着は、ＨＬＡ−Ａ２分子の多様なエピトープにおいて結合するｍＡｂｓによって影響を受け得、このことは、ホモタイプな細胞接着のモジュレーションに関係する複数の部位がＨＬＡ−Ａ２上に存在すること；結合したエピトープに依存して、その影響は、ＨＬＡ−Ａ２依存型接着を増強し得るか、または阻害し得ることを示唆する。同上。

ＭＨＣＩ遺伝子のエクソン６および７によってコードされる細胞質尾部は、細胞表面上の正しい発現のため、およびＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＬＩＲ１媒介型阻害のために必要であると報告される。Grudaら（２００７年）Intracellular Cysteine Residues in the Tail of MHC Class I Proteins Are Crucial for Extracellular Recognition by Leukocyte Ig-Like Receptor 1, J. Immunol.１７９巻：３６５５〜３６６１頁。細胞質尾部は、少なくともいくつかのＭＨＣＩ分子の、そのシステイン残基におけるジスルフィド結合の形成を介した多量体化のために必要であり、従って、クラスター形成において、およびＮＫ細胞による認識において役割を果たし得る。Lynchら（２００９年）Novel MHC Class I Structures on Exosomes, J. Immunol.１８３巻：１８８４〜１８９１頁。

ＨＬＡ−Ａ２の細胞質ドメインは、構成的にリン酸化されたセリン残基およびリン酸化可能なチロシンを含有するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞においては、細胞質ドメインを欠く変異体ＨＬＡ−Ａ２分子が、発現、細胞骨格会合、凝集およびエンドサイトーシス内部移行に関して正常であるようである。Gurら（１９９７年）Structural Analysis of Class I MHC Molecules: The Cytoplasmic Domain Is Not Required for Cytoskeletal Association, Aggregation, and Internalization、Mol. Immunol.３４巻（２号）：１２５〜１３２頁。細胞質ドメインを欠く短縮型ＨＬＡ−Ａ２分子は、明らかに正常に発現し、β２ミクログロブリンと正常に会合する。同上。

しかし、いくつかの研究は、細胞内輸送、樹状細胞（ＤＣ）媒介型抗原提示およびＣＴＬプライミングにおいて、細胞質尾部が重要であることを実証している。エクソン６によってコードされるチロシン残基は、エンドソームの区画を介したＭＨＣＩ輸送、外来性抗原の提示、およびＣＴＬプライミングに必要であることが示された；他方で、エクソン７の欠失は、抗ウイルス性ＣＴＬ応答の増強を引き起こした。Lizeeら（２００３年）Control of Dendritic Cross-Presentation by the Major Histocompatibility Complex Class I Cytoplasmic Domain、Nature Immunol.４巻：１０６５〜７３頁；Bashaら（２００８年）MHC Class I Endosomal and Lysosomal Trafficking Coincides with Exogenous Antigen Loading in Dendritic Cells、PLoS ONE ３巻：e3247；およびRodriguez-Cruzら（２０１１年）Natural Splice Variant of MHC Class I Cytoplasmic Tail Enhances Dendritic Cell-Induced CD8+ T-Cell Responses and Boosts Anti-Tumor Immunity、PLoS ONE ６巻：e22939。

種々の実施形態では、本発明は、そのゲノムにヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）を提供する。非ヒト動物、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドを発現する非ヒト動物は、そのゲノムに部分的にヒトであり部分的に非ヒトであるＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様では、非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチド、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドのみを発現し、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座から内在性非ヒトＭＨＣＩタンパク質を発現しない。

１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、そのヒト部分において、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのペプチド結合ドメインを含む。１つの態様では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩの細胞外ドメインを含む。この実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩのα鎖の細胞外ドメインを含む。１つの実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩのα１およびα２ドメインを含む。別の実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩのα１、α２、およびα３ドメインを含む。

ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｅ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｆ遺伝子座、またはＨＬＡ−Ｇ遺伝子座のいずれかによってコードされる機能的なヒトＨＬＡ分子に由来し得る。一般に使用されるＨＬＡ抗原のリストは、Shankarkumarら（（２００４年）The Human Leukocyte Antigen (HLA) System、Int. J. Hum. Genet.４巻（２号）：９１〜１０３頁）（本明細書中に参考によって組み込まれる）に記載される。Shankarkumarらはまた、当該分野で使用されるＨＬＡ命名法の簡潔な説明も提示する。ＨＬＡ命名法および種々のＨＬＡ対立遺伝子に関するさらなる情報は、Holdsworthら（２００９年）The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens、Tissue Antigens ７３巻：９５〜１７０頁において、ならびにMarshらによる最新の更新（２０１０年）Nomenclature for factors of the HLA system、２０１０年、Tissue Antigens ７５巻：２９１〜４５５頁によって見出され得る（両方とも、本明細書中で参考として組み込まれる）。従って、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドは、ここで記載される任意の機能的ヒトＨＬＡクラスＩ分子に由来し得る。

１つの特定の態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａに由来する。特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド（例えば、およびＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチド）である。１つの実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−Ａ^＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子によってコードされるポリペプチドである。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１対立遺伝子は、北米の集団の間で一般に使われている。本実施例は、この特定のＨＬＡ配列を記載するが、任意の好適なＨＬＡ−Ａ配列、例えば、ヒト集団において示されるＨＬＡ−Ａ２の多形バリアント、１つまたは複数の保存的または非保存的なアミノ酸改変を有する配列、遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載される配列とは異なる核酸配列などが、本明細書中に包含される。

１つの態様では、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列を発現する非ヒト動物であって、該ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、１つまたは複数の保存的または非保存的な改変を含む非ヒト動物が提供される。

１つの態様では、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列を発現する非ヒト動物であって、該ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、上記ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、実施例において記載されるヒトＨＬＡ−Ａ２配列に対し、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、１つまたは複数の保存的置換を含む。１つの実施形態では、上記ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、１つまたは複数の非保存的置換を含む。

別の特定の態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃから選択されるヒトＭＨＣＩに由来する。１つの態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩは、ＨＬＡ−Ｂ、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７に由来する。

１つの態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含む。１つの実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、およびＨ−２Ｌから選択される。１つの実施形態では、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｋ、例えば、Ｈ−２Ｋｂである。特定のＨ−２Ｋ配列は実施例において記載されるが、任意の好適なＨ−２Ｋ配列、例えば、多形バリアント、保存的／非保存的アミノ酸置換などが、本明細書中に包含される。

本明細書中で記載される非ヒト動物は、そのゲノムに、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチド、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、ここで、このようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ｋ遺伝子座）に位置する。１つの態様では、これは、内在性ＭＨＣＩ遺伝子またはその部分の、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、本明細書中で記載されるキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするキメラ遺伝子による置き換えをもたらす。１つの実施形態では、上記置き換えは、非ヒトＭＨＣＩペプチド結合ドメインまたは非ヒトＭＨＣＩ細胞外ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列の、非ヒトＭＨＣＩペプチド結合ドメインまたは非ヒトＭＨＣＩ細胞外ドメインをコードするヒトヌクレオチド配列（例えば、ＨＬＡ−Ａ２ヌクレオチド配列）による置き換えを含む。この実施形態では、上記置き換えは、非ヒトＭＨＣＩポリペプチド（例えば、Ｈ−２Ｋポリペプチド）の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインをコードするＭＨＣＩ配列の置き換えを含まない。従って、非ヒト動物は、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座においてキメラヒト／非ヒトヌクレオチド配列を含有し、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座から、キメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドを発現する。

キメラヒト／非ヒトポリペプチドは、ヒトまたは非ヒトリーダー（シグナル）配列を含むようなものであってもよい。１つの実施形態では、キメラポリペプチドは、内在性ＭＨＣＩタンパク質の非ヒトリーダー配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、ヒトＭＨＣＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−Ａ２タンパク質のリーダー配列（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１リーダー配列）を含む。従って、キメラＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣＩリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。

キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、そのヒト部分において、完全なまたは実質的に完全な、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを含み得る。従って、上記ヒト部分は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば、９５％以上の、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインをコードするアミノ酸（例えば、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド）を含み得る。１つの例では、ヒトＭＨＣＩポリペプチドの実質的に完全な細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩリーダー配列を欠く。別の例では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ヒトＭＨＣＩリーダー配列を含む。

さらに、キメラＭＨＣＩポリペプチドは、内在性非ヒト調節エレメントの制御下で発現され得る（例えば、げっ歯動物のＭＨＣＩ調節動物）。このような配置は、非ヒト動物において、例えば、非ヒト動物における免疫応答の間に、キメラＭＨＣＩポリペプチドの正しい発現を促進する。

遺伝子改変される非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群より選択され得る。非ヒト動物について、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手できない場合、他の方法が、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために使用される。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変する工程、および核移入を使用して好適な細胞、例えば、卵母細胞へ改変したゲノムを移植する工程、および胚を形成するために好適な条件下で、非ヒト動物において該改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を懐胎させる工程を含む。

１つの態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。１つの態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、トビネズミ上科（Dipodoidea）またはネズミ上科（Muroidea）の小哺乳動物である。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態では、げっ歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。１つの実施形態では、げっ歯動物は、上科ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＭｕｒｏｉｄａｅ）から選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、カンガルーハムスター科（Calomyscidae）（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（Cricetidae）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Muridae）（真のマウスおよびラット（true mice and rats）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ（crested rats））、アシナガマウス科（Nesomyidae）（キノボリマウス（climbing mice）、イワマウス（rock mice）、尾のあるラット（with-tailed rats）、マダガスカルラットおよびマウス（Malagasy rats and mice））、トゲヤマネ科（Platacanthomyidae）（例えば、トゲヤマネ（spiny dormice））、ならびにメクラネズミ科（Spalacidae）（例えば、デバネズミ（mole ratses）、タケネズミ（bamboo rats）、およびモグラネズミ（zokors））から選択される科に由来する。特定の実施形態では、上記遺伝子改変されたげっ歯動物は、真のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、ネズミ科のメンバー由来である。１つの実施形態では、上記動物は、げっ歯動物である。特定の実施形態では、上記げっ歯動物は、マウスおよびラットから選択される。１つの実施形態では、上記非ヒト動物は、マウスである。

特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである、げっ歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群より選択される１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）Revised nomenclature for strain 129 mice、Mammalian Genome １０巻：８３６頁を参照されたい、また、Auerbachら（２０００年）Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesも参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、上記の１２９系統と上記のＣ５７ＢＬ／６系統との混血である。別の特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混血であるか、または上記のＢＬ／６系統の混血である。特定の実施形態では、混血の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。なお別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記の系統との混血である。

１つの実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。１つの実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉから選択される。１つの実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋＡｇｏｕｔｉからなる群より選択される２以上の系統の混血である。

従って、１つの実施形態では、本発明は、そのゲノムにキメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩ（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１）のペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含むマウスに関する。いくつかの実施形態では、マウスは、その内在性マウス遺伝子座から、内在性マウスポリペプチドのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを発現しない。ヒトＭＨＣＩのペプチド結合ドメインは、α１ドメインおよびα２ドメインを含み得る。あるいは、ヒトＭＨＣＩのペプチド結合ドメインは、α１、α２、およびα３ドメインを含み得る。１つの態様では、ヒトＭＨＣＩの細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣＩα鎖の細胞外ドメインを含む。１つの実施形態では、内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）遺伝子座であり、キメラポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。

従って、１つの実施形態では、、内在性Ｈ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラポリペプチドのヒト部分はヒトＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）の細胞外ドメインポリペプチドを含み、マウス部分はマウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、マウスが提供される。１つの態様では、マウスは、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない。１つの実施形態では、マウスは、内在性Ｈ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）遺伝子座からキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ（例えば、キメラＨＬＡ−Ａ２．１／Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドを発現する。種々の実施形態では、キメラ遺伝子の発現は、内在性マウスＭＨＣクラスＩ調節エレメントの制御下にある。いくつかの態様では、マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む２コピーのキメラＭＨＣＩ遺伝子座を含み；他方、他の態様では、マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する１コピーのキメラＭＨＣＩ遺伝子座を含む。従って、マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。

本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座に位置するキメラＭＨＣＩ遺伝子座を含むマウスが提供される。上記キメラ遺伝子座は、ヒトＨＬＡ−Ａ２タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２遺伝子のα１、α２、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。上記キメラ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋタンパク質の細胞外ドメイン（例えば、マウスＨ−２Ｋのα１、α２、およびα３ドメイン）をコードするヌクレオチド配列を欠く。１つの態様では、上記キメラ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋのリーダーペプチド、α１、α２、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を欠き；ヒトＨＬＡ−Ａ２のリーダーペプチド、α１、α２、およびα３ドメインならびにマウスＨ−２Ｋの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。上記キメラ遺伝子座の種々のドメインは、キメラ遺伝子座が機能的なキメラヒト／マウスＭＨＣＩタンパク質を発現するように、互いに作動可能に連結している。

種々の実施形態では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣＩ遺伝子座から機能的なキメラＭＨＣＩタンパク質を発現する非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）は、細胞表面にキメラタンパク質を表す。１つの実施形態では、非ヒト動物は、ヒトにおいて観察されるのと同様に、細胞分布において、細胞表面にキメラＭＨＣＩタンパク質を発現した。１つの態様では、上記細胞は、キメラＭＨＣＩタンパク質の細胞外部分（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２細胞外部分）に結合したペプチド断片（抗原断片）を表面に表す。１つの実施形態では、このようなキメラタンパク質の細胞外部分は、前記細胞の表面上の他のタンパク質、例えば、β２−ミクログロブリンと相互作用する。

種々の実施形態では、キメラＭＨＣＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質を表面に表す細胞は、有核細胞である。種々の態様では、上記細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。体内のほとんどの細胞は、ＭＨＣＩに関して抗原を提示し得るが、抗原提示細胞のいくつかの非限定の例としては、マクロファージ、樹状細胞、およびＢ細胞が挙げられる。他の抗原提示細胞としては、プロフェッショナルＡＰＣおよび非プロフェッショナルＡＰＣが挙げられ、当該分野で公知であり、本明細書中に包含される。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣＩタンパク質を表面に表す細胞は、腫瘍細胞であり、該キメラタンパク質によって提示されるペプチド断片は、腫瘍に由来する。他の実施形態では、キメラＭＨＣＩタンパク質によって提示されるペプチド断片は、病原体、例えば、細菌またはウイルスに由来する。

本明細書中で記載されるキメラＭＨＣＩタンパク質は、同じ細胞または第２の細胞の表面上の他のタンパク質と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣＩタンパク質は、上記細胞の表面上の内在性非ヒトタンパク質と相互作用する。キメラＭＨＣＩタンパク質もまた、同じ細胞または第２の細胞の表面上のヒトまたはヒト化タンパク質と相互作用し得る。

同じ細胞上で、ＨＬＡクラスＩ分子は、非ヒト（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）およびヒトβ２−ミクログロブリンの両方と機能的に相互作用し得る。従って、１つの実施形態では、キメラＭＨＣＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質は、マウスβ２−ミクログロブリンと相互作用する。いくつかのヒトＨＬＡクラスＩ分子とマウスβ２−ミクログロブリンとの間の相互作用は起こり得るが、ヒトＨＬＡクラスＩとヒトβ２−ミクログロブリンとの間の相互作用と比較して、大いに低下する可能性がある。従って、ヒトβ２−ミクログロブリンの非存在下で、細胞表面上のヒトＭＨＣＩの発現は低下し得る。Perarnauら（１９８８年）Human β2-microglobulin Specifically Enhances Cell-Surface Expression of HLA Class I Molecules in Transfected Murine Cells、J. Immunol.１４１巻：１３８３〜８９頁。他のＨＬＡ分子、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７は、マウスβ２−ミクログロブリンと相互作用しない；例えば、Tishonら（２０００年）Transgenic Mice Expressing Human HLA and CD8 Molecules Generate HLA-Restricted Measles Virus Cytotoxic T Lymphocytes of the Same Specificity as Humans with Natural Measles Virus Infection, Virology ２７５巻：２８６〜２９３頁を参照されたい、これは、トランスジェニックマウスにおけるＨＬＡ−Ｂ２７機能は、ヒトβ２−ミクログロブリンとヒトＣＤ８との両方を必要とすることを報告する。従って、別の実施形態では、キメラＭＨＣＩタンパク質は、ヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリンと相互作用する。本明細書中で以下に記載されるいくつかのこのような実施形態では、非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）は、そのゲノムにヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリン遺伝子を含み、該動物は、機能的なヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリンポリペプチドを発現し；従って、キメラＭＨＣＩタンパク質は、ヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリンポリペプチドと相互作用する。

種々の態様では、キメラタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質）はまた、第２の細胞の表面におけるタンパク質とも、（その細胞外部分を介して）相互作用する。上記第２の細胞は、非ヒトの細胞、例えば、マウスの細胞であってもよく、またはヒト起源の細胞であってもよい。上記第２の細胞は、キメラＭＨＣＩポリペプチドを発現する細胞と同じ非ヒト動物に由来しても、または同じ非ヒト動物種に由来してもよい。キメラタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ）の細胞外部分が相互作用し得るタンパク質の非限定の例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその共受容体ＣＤ８が挙げられる。従って、第２の細胞は、Ｔ細胞であってもよい。さらに、キメラＭＨＣＩタンパク質の細胞外部分は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上のタンパク質、例えば、ＮＫ細胞の表面上のキラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）に結合し得る。

Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、キメラＭＨＣＩポリペプチドと表面に表れたそのペプチド断片との間で形成された複合体に結合し得る。このような結合は、Ｔ細胞活性化またはＮＫ媒介型細胞死滅化の阻害をそれぞれもたらし得る。１つの仮説は、ＮＫ細胞は、そのＭＨＣＩ複合体を下方制御することによってＴ細胞媒介型細胞傷害性を回避した感染細胞または腫瘍細胞のいずれかを死滅させるように進化しているというものである。しかし、ＭＨＣＩ複合体が細胞表面に発現される場合、ＮＫ細胞受容体はこれを認識し、ＮＫ媒介型細胞死滅化が阻害される。従って、いくつかの態様では、ＮＫ細胞がキメラＭＨＣＩポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチド）と感染細胞または腫瘍細胞の表面上に表れたペプチド断片との間に形成された複合体に結合する場合、ＮＫ媒介型細胞死滅化は、阻害される。

１例では、本明細書中で記載されるキメラＭＨＣＩポリペプチド、例えば、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、第２の細胞の表面上のＣＤ８タンパク質と相互作用する。１つの実施形態では、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、第２の細胞の表面上の内在性げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）ＣＤ８タンパク質と相互作用する。１つの実施形態では、第２の細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、第２の細胞は、ＣＤ８を発現するように工学的に作製される。ある特定の態様では、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、第２の細胞（例えば、ヒト細胞またはげっ歯動物細胞）の表面上のヒトＣＤ８と相互作用する。いくつかのこのような実施形態では、非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、ヒトＣＤ８トランスジーンを含み、該マウスまたはラットは、機能的ヒトＣＤ８タンパク質を発現する。

本明細書中で記載されるキメラＭＨＣＩポリペプチドはまた、第２の細胞上の非ヒト（例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲ、ヒトＴＣＲ、またはヒト化ＴＣＲと相互作用し得る。キメラＭＨＣＩポリペプチドは、第２の細胞の表面上の内在性ＴＣＲ（例えば、マウスまたはラットのＴＣＲ）と相互作用し得る。キメラＭＨＣＩポリペプチドはまた、第２の細胞の表面に発現されるヒトまたはヒト化ＴＣＲとも相互作用し得、ここで、該細胞は、キメラＭＨＣＩポリペプチドを発現する細胞と同じ動物または動物種（例えば、マウスまたはラット）に由来する。上記キメラＭＨＣＩポリペプチドは、ヒト細胞の表面に発現されるヒトＴＣＲと相互作用し得る。

遺伝子操作された非ヒト動物に加え、非ヒト胚（例えば、げっ歯動物胚、例えば、マウスまたはラットの胚）であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）由来のドナーＥＳ細胞を含む胚もまた提供される。１つの態様では、胚は、キメラＭＨＣＩ遺伝子を含むＥＳドナー細胞、および宿主胚細胞を含む。

また、組織であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）に由来し、キメラＭＨＣＩポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチド）を発現する組織もまた提供される。

さらに、本明細書中で記載されるように非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。１つの実施形態では、上記細胞はＥＳ細胞である。１つの実施形態では、上記細胞は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞である。１つの実施形態では、上記細胞は免疫細胞である。１つの実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。

また、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の染色体またはその断片を含む非ヒト細胞も提供される。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の核を含む。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、核移入の結果として、染色体またはその断片を含む。

１つの態様では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣＩポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチド）をコードする遺伝子を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。１つの実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来する。

１つの態様では、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマが提供される。１つの実施形態では、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。

本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作されたげっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法もまた提供される。遺伝子操作された非ヒト動物を作製するための方法は、そのゲノムがキメラＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む動物を生じる。１つの実施形態では、上記方法は、そのゲノムが、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座、例えば、Ｈ−２Ｋ遺伝子座において、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作されたマウスを生じ、ここで、該キメラＭＨＣＩポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｋの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、実施例において記載される通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製された構築物の標的化を利用して該構築物をＥＳ細胞へと導入する工程、および、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて標的化したＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する工程を含む。１つの実施形態では、ＥＳ細胞は、１２９マウス系統とＣ５７ＢＬ／６マウス系統との混血である；別の実施形態では、ＥＳ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統と１２９マウス系統との混血である。

従って、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物を作製するために使用されるヌクレオチド構築物も提供される。１つの態様では、上記ヌクレオチド構築物は以下を含む：５’および３’の非ヒトホモロジーアーム、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子配列を含むヒトＤＮＡ断片、および組換え部位が隣接する（ｆｌａｎｋｅｄ）選択カセット。１つの実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子のイントロンおよびエクソンの両方を含むゲノム断片である。１つの実施形態では、非ヒトホモロジーアームは、非ヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子座（例えば、マウスＨ−２Ｋ遺伝子座）に対して相同である。

１つの実施形態では、ゲノム断片は、ヒトＨＬＡ−Ａリーダー、α１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードする配列を含む。１つの実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、５’から３’へ：ＨＬＡ−Ａリーダー配列、ＨＬＡ−Ａリーダー／α１イントロン、ＨＬＡ−Ａ α１エクソン、ＨＬＡ−Ａ α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ａ α２エクソン、ＨＬＡ−Ａ α２−α３イントロン、およびＨＬＡ−Ａ α３エクソンを含む。

選択カセットは、対象の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするため、標的化構築物へと挿入されたヌクレオチド配列である。いくつかの好適な選択カセットが、当該分野で公知である。通常、選択カセットは、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃ、など）の存在下でのポジティブ選択を可能にする。さらに、選択カセットは、組換え部位が隣接していてもよく、それにより、リコンビナーゼ酵素による処理の際に選択カセットの切除を可能にする。一般に使用される組換え部位は、Ｃｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素によってそれぞれ認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他のものは当該分野で公知である。

１つの実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の５’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の３’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片内に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片のイントロン内に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、α２−α３イントロン内に位置する。

１つの実施形態では、５’および３’非ヒトホモロジーアームは、それぞれ、内在性非ヒト（例えば、マウス）ＭＨＣクラスＩ遺伝子遺伝子座の５’および３’位置にゲノム配列を含む（例えば、非ヒトＭＨＣＩ遺伝子の５’の第１リーダー配列および３’のα３エクソン）。１つの実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋ、Ｈ−２ＤおよびＨ−２Ｌから選択される。特定の実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋである。

１つの態様では、５’から３’へ以下を含むヌクレオチド構築物が提供される：内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座の５’のマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の第１ゲノム配列を含む第１のヒトＤＮＡ断片、５’組換え配列部位（例えば、ｌｏｘＰ）、選択カセット、３’組換え配列部位（例えば、ｌｏｘＰ）、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の第２ゲノム配列を含む第２ヒトＤＮＡ断片、および内在性Ｈ−２Ｋ α３エクソンの３’のマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド構築物は、５’から３’へ、以下を含む：内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座の５’のマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、ＨＬＡ−Ａリーダー、ＨＬＡ−Ａリーダー／α１イントロン配列、ＨＬＡ−Ａ α１エクソン、ＨＬＡ−Ａ α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ａα２エクソン、α２−α３イントロンの第１の５’部分、組換え部位が隣接する選択カセット、α２−α３イントロンの第２の３’部分、ＨＬＡ−Ａ α３エクソンを含むヒトゲノム配列、および内在性マウスＨ−２Ｋ α３エクソンの３’の非マウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム。１つの実施形態では、５’ホモロジーアーム配列は、配列番号１に示され、３’ホモロジーアーム配列は、配列番号２に示される。

遺伝子ターゲティングの完了の際、ＥＳ細胞または遺伝子改変された非ヒト動物をスクリーニングして、対象の外来性ヌクレオチド配列の成功裏の組み込みまたは外来性ポリペプチドの発現を確認する。多くの技術が当業者に公知であり、それらとしては、サザンブロッティング、長ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を用いたリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。１つの例では、対象の遺伝子改変を有する非ヒト動物（例えば、マウス）が、マウス対立遺伝子の欠失および／またはヒト対立遺伝子の獲得についての、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら（２００３年）High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech.２１巻（６号）：６５２〜６５９頁に記載される）の変形を用いるスクリーニングによって、同定され得る。遺伝子改変された動物において特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を同定する他のアッセイは、当業者に公知である。

本開示はまた、非ヒト動物のＭＨＣＩ遺伝子座を改変して、本明細書中で記載されるキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドを発現させる方法をも提供する。１つの実施形態では、本発明は、マウスのＭＨＣＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドを発現させる方法であって、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣポリペプチドのペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、マウスＭＨＣＩの細胞外ドメインのヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣＩの細胞外ドメインのヌクレオチド配列で置き換えられる。上記マウスは、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座からマウスＭＨＣＩのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを発現できない場合がある。いくつかの実施形態では、マウスＨ−２Ｋの細胞外ドメインのヌクレオチド配列がヒトＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインのヌクレオチド配列で置き換えられ、その結果、改変マウスＭＨＣＩ遺伝子座がキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドを発現する。

１つの態様では、キメラヒトＨＬＡクラスＩ／非ヒトＭＨＣクラスＩ分子を作製する方法であって、単一の細胞において、ヌクレオチド構築物からキメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋタンパク質を発現させる工程を含み、該ヌクレオチド構築物は、ＨＬＡ−Ａタンパク質のα１、α２、およびα３ドメイン、ならびに非ヒトＨ−２Ｋタンパク質、例えば、マウスＨ−２Ｋタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を含む方法が提供される。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド構築物はウイルスベクターであり；特定の実施形態では、該ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。

１つの態様では、キメラヒトＨＬＡクラスＩ／非ヒトＭＨＣＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋタンパク質）を発現する細胞が提供される。１つの実施形態では、細胞は、キメラＭＨＣクラスＩ遺伝子を含む発現ベクターを含み、ここで、該キメラＭＨＣクラスＩ遺伝子は、非ヒトＨ−２Ｋ遺伝子、例えば、マウスＨ−２Ｋ遺伝子の配列と作動可能な連結で融合した、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子の配列を含む。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子の配列は、ＨＬＡ−Ａタンパク質のα１、α２およびα３ドメインをコードするエクソンを含む。１つの実施形態では、非ヒトＨ−２Ｋ遺伝子の配列は、Ｈ−２Ｋタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするエクソンを含む。１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。

本明細書中で記載されるように非ヒト動物によって作製されたキメラＭＨＣクラスＩ分子もまた提供され、ここで、該キメラＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトＨＬＡ−Ａタンパク質からのα１、α２、およびα３ドメイン、ならびに非ヒト、例えば、マウス、Ｈ−２Ｋタンパク質からの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。本明細書中で記載されるキメラＭＨＣＩポリペプチドは、抗ＨＬＡ−Ａ抗体によって検出され得る。従って、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドを表面に表す細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ抗体を用いて検出され得るかおよび／または選択され得る。いくつかの場合では、本明細書中で記載されるキメラＭＨＣＩポリペプチドは、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体によって検出され得る。

以下の実施例は、そのゲノムが、内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｋポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の、ヒトＨＬＡ−Ａの細胞外ドメインをコードする配列による置き換えを含む、遺伝子操作された動物を記載するが、類似の戦略を使用して、他のマウスＭＨＣＩ遺伝子座（Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌなど）を、その対応するヒトＨＬＡ遺伝子座（ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃなど）で置き換え得ることを、当業者は理解する。従って、そのゲノムにキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドのヒト部分が、別のＨＬＡクラスＩタンパク質に由来する非ヒト動物もまた提供される。複数のＭＨＣＩ遺伝子座の置き換えも企図される。

遺伝子改変されたβ２ミクログロブリン動物
本発明は、一般に、遺伝子改変された非ヒト動物であって、そのゲノムにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；従って、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、非ヒト動物を提供する。

β２ミクログロブリンすなわちＭＨＣクラスＩ複合体の軽鎖（「β２Ｍ」とも略される）は、低分子の（１２ｋＤａ）非グリコシル化タンパク質であり、主に、ＭＨＣＩα鎖を安定化するために機能する。ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子は、リーダー配列をコードする２０のＮ末端アミノ酸を有する、１１９アミノ酸のタンパク質をコードする。成熟タンパク質は９９アミノ酸を含む。上記遺伝子は、４つのエクソンを含有し、第１のエクソンは、５’非翻訳領域、完全なリーダー配列および成熟ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸を含有し；第２のエクソンは、成熟タンパク質の大半をコードし；第３のエクソンは、成熟タンパク質の最後の４つのアミノ酸および停止コドンをコードし；第４のエクソンは、３’非翻訳領域を含有する。Gussowら（１９８７年）The β2-Microglobulin Gene. Primary Structure and Definition of the Transcriptional Unit、J. Immunol.１３９巻：３１３１〜３８頁。β２ミクログロブリンは、ＭＨＣＩと非共有結合する。未結合のβ２ミクログロブリンは、体液、例えば血漿中に見出され、排泄のために腎臓に運ばれる。腎不全は、β２ミクログロブリンの蓄積を引き起こし、これは病原性であり得る（例えば、透析関連アミロイド症）；蓄積したタンパク質は、関節および結合組織において、アミロイド斑に似た糸状の細線維を形成する。

透析関連アミロイド症に加えて、β２ミクログロブリンは、多くの他の障害に関与している。β２ミクログロブリンの上昇したレベルを、リンパ性悪性腫瘍、例えば、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫において検出した。例えば、Shiら（２００９年）β2 Microglobulin: Emerging as a Promising Cancer Therapeutic Target, Drug Discovery Today １４巻：２５〜３０頁を参照されたい。β２ミクログロブリンのレベルの上昇を伴ういくつかの他の悪性腫瘍としては、乳がん、前立腺がん、肺がん、腎がん、消化器がんおよび鼻咽頭がんが挙げられる。β２ミクログロブリンの過剰発現は、腫瘍増殖促進作用を有することが示唆されている。同上。β２ミクログロブリンは、上皮を間葉に移行させ、乳がん、前立腺がん、肺がんおよび腎がんにおいて骨および軟組織へのがんの転移を促進することが、近年示されている。Jossonら（２０１１年）β2 microglobulin Induces Epitelial to Mesenchymal Transition and Confers Cancer Lethality and Bone Metastasis in Human Cancer Cells. Cancer Res.７１巻（７号）：１〜１１頁。β２ミクログロブリンは、非古典的ＭＨＣＩメンバーであるヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質と相互作用し、トランスフェリン受容体と相互作用し、鉄ホメオスタシスを調整する。同上。悪性腫瘍の他の特徴（自己再生、新脈管形成の強化、処置に対する抵抗性）におけるβ２ミクログロブリンの関与は、当該分野で広範に記載される。

β２ミクログロブリン欠損のマウスが報告されている。Kollerら（１９９０年）Normal development of mice deficient in β2m, MHC class I proteins, and CD8+ T cells, Science 248巻: １２２７〜１２３０頁を参照されたい。Kollerらにおいて報告されるように、これらのマウスは、健康であるように見えるが、ＭＨＣクラスＩ発現は検出されなかった。さらに、いくつかの組織では、Ｔ細胞集団がほとんど正常であるように見えたが、他においては、ＣＤ８＋Ｔ細胞の顕著な低下が観察された。これは、ＭＨＣＩ発現の欠損は、Allenら（（１９８６年）β2 microglobulin Is Not Required for Cell Surface Expression of the Murine Class I Histocompatibility Antigen H-2D^b or of a Truncated H-2D^b、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８３巻：７４４７〜７４５１頁）によって得られた以前の結果と一致しないことを意味した。Allenらは、β２ミクログロブリンが、全てのＭＨＣＩ複合体の細胞表面発現に絶対的に必要ではないと報告した。何故なら、β２ミクログロブリンを欠く細胞が、Ｈ−２Ｄ^ｂを発現可能であったからである。しかし、これらの細胞におけるＨ−２Ｄ^ｂの機能は、おそらく損なわれており、Ｈ−２Ｄ^ｂのコンフォーメーションは、天然のタンパク質と異なっていた。このことは、Ｋｏｌｌｅｒおよび共同研究者らが、天然のＨ−２Ｄ^ｂに対する抗体を用いて上記タンパク質を検出できなかったことを説明する。しかし、β_２ミクログロブリンを欠く細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（正常マウス由来の外来性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）に対して内在性抗原提示できると報告され、β２ミクログロブリンは、マウスにおける抗原チャレンジに対する応答において、高レベルのＨ−２^ｄＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬの発達のために必要ではないが、有効な免疫応答を維持するために必要とされると報告される。Quinnら（１９９７年）Virus-Specific, CD8+ Major Histocompatibility Complex Class I-Restricted Cytotoxic T Lymphocytes in Lymphocytic Choriomeningitis Virus-Infected β2-Microglobulin-Deficient Mice、J. Virol.７１巻：８３９２〜８３９６頁。β２ミクログロブリンの非存在下で高レベルのそのようなＴ細胞を生成する能力は、Ｈ−２^ｄＭＨＣクラスＩ拘束応答に限定されることが報告されていることに留意されたい。β２ミクログロブリン欠損マウスは、多くの劇的な特徴、例えば、いくつかの寄生虫症に対する感受性の増大、肝炎感染症に対する感受性の増大、鉄代謝の欠損、および繁殖不全表現型を有することが報告されている。Cooperら（２００７年）An impaired breeding phenotype in mice with a genetic deletion of Beta-2 microglobulin and diminished MHC class I expression: Role in reproductive fitness、Biol. Reprod.７７巻：２７４〜２７９頁。

無作為に挿入されたトランスジーンにおいてヒトβ２ミクログロブリンならびにヒトＨＬＡクラスＩ分子（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７）を発現するマウスが報告されている。Chamberlainら（１９８８年）Tissue-specific and cell surface expression of human major histocompatibility complex class I heavy (HLA-B7) and light (β2-microglobulin) chain genes in transgenic mice、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５巻：７６９０〜７６９４頁。ヒトＨＬＡクラスＩの発現は内在性クラスＩの発現と一致し、肝臓において顕著に減少していた。同上。ヒトβ２ミクログロブリンの発現はまた、内在性β２ミクログロブリンと一致し、他方で、ヒトＨＬＡクラスＩ分子の発現は、二重トランスジェニックマウスにおいて、１０倍〜１７倍増大した。同上。しかし、著者らは、マウス内在性β２ミクログロブリン遺伝子座のヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座による置き換えを企図しなかった。

従って、そのゲノムが、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）が、本明細書中で開示される。１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から内在性非ヒトβ２ミクログロブリンを発現しない。いくつかの実施形態では、β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、部分的にヒトであり、部分的に非ヒトである。例えば該ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンに対応するいくつかのアミノ酸と、非ヒトβ２ミクログロブリンに対応するいくつかのアミノ酸とを含有する。１つの態様では、非ヒト動物は、内在性非ヒト遺伝子座から内在性非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現せず、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドのみを発現する。１つの例では、非ヒト動物は、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、完全な内在性非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しないが、非ヒト内在性β２ミクログロブリンポリペプチドの部分のみを発現する。従って、種々の実施形態では、上記動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的な非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。特定の態様では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置する。１つの態様では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む２コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む。別の態様では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む。従って、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むβ２ミクログロブリン遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンのヌクレオチド配列は、ヒト集団において天然に見出されるβ２ミクログロブリン配列の集合に由来し得る。種々の実施形態では、本発明の遺伝子操作された非ヒト動物は、その生殖細胞系に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、上記ポリペプチドは、ＭＨＣＩタンパク質に結合可能である。

ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、完全なヒトβ２ミクログロブリン遺伝子に対応する核酸残基を含み得る。あるいは、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２１〜１１９に示されるアミノ酸配列（すなわち、成熟ヒトβ２ミクログロブリンに対応するアミノ酸残基）をコードする核酸残基を含み得る。代替の実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３〜１１５に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３〜１１９に示されるアミノ酸配列をコードする核酸残基を含み得る。ヒトβ２ミクログロブリンの核酸配列およびアミノ酸配列は、本明細書中に参考として組み込まれるGussowら（上掲）に記載される。

従って、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３〜１１５に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３〜１１９に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２１〜１１９に示されるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、ヒトβ２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸１〜１１９を含み得る。

いくつかの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む。あるいは、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む。この実施形態では、エクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列は、遺伝子の正常な転写および翻訳を可能にするように、作動可能に連結している。従って、１つの実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４の約２６７ｂｐ後ろに対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の約２．８ｋｂを含む。

従って、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンのエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に対応するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。あるいは、上記ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４の約２６７ｂｐ後ろに対応するヌクレオチド配列によってコードされる。別の特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の約２．８ｋｂを含むヌクレオチド配列によってコードされる。β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン４は、５’非翻訳領域を含有するので、ヒトまたはヒト化ポリペプチドは、β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２および３を含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。

遺伝子操作された動物を作製するための特定の核酸配列およびアミノ酸配列が、本実施例に記載されるが、１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸置換の配列、または遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載されるものとは異なっている配列もまた、提供されることが、当業者には理解される。

従って、ヒトβ２ミクログロブリン配列を発現する非ヒト動物が提供され、ここで、該β２ミクログロブリン配列は、ヒトβ２ミクログロブリン配列に対し、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態では、β２ミクログロブリン配列は、本実施例において記載されるヒトβ２ミクログロブリン配列に対し、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。１つの実施形態では、ヒトβ２ミクログロブリン配列は、１つまたは複数の保存的置換を含む。１つの実施形態では、ヒトβ２ミクログロブリン配列は、１つまたは複数の非保存的置換を含む。

さらに、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列をも含む非ヒト動物が提供される。従って、特定の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノムにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列であって、非ヒトβ２ミクログロブリンのエクソン１およびヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４を含むヌクレオチド配列を含む。従って、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１およびヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４（例えば、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２および３）によってコードされる。

キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物と同様に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群より選択され得る。本発明のいくつかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、非ヒト動物は、ネズミ、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）である。１つの実施形態では、上記動物は、マウスである。

従って、いくつかの態様では、遺伝子操作されたマウスであって、本明細書中で記載されるようにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスが提供される。遺伝子操作されたマウスであって、その内在性β２ミクログロブリン遺伝子座において、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチド（例えば、ヒトまたは実質的にヒトβ２ミクログロブリンポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含むマウスが提供される。いくつかの実施形態では、上記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、内在性β２ミクログロブリンポリペプチド（例えば、機能的な内在性β２ミクログロブリンポリペプチド）を発現しない。いくつかの実施形態では、上記遺伝子操作されたマウスは、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１およびヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記マウスは、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する。

１つの態様では、異種β２ミクログロブリン配列を含む改変非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座が提供される。１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化配列である。

１つの実施形態では、改変遺伝子座は、げっ歯動物遺伝子座である。特定の実施形態では、げっ歯動物遺伝子座は、マウス遺伝子座またはラット遺伝子座から選択される。１つの実施形態では、非ヒト遺伝子座は、少なくとも１つのヒトβ２ミクログロブリンをコードする配列によって改変される。

１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン配列は、内在性調節エレメント、例えば、内在性プロモーターおよび／または発現制御配列に作動可能に連結している。特定の実施形態では、異種β２ミクログロブリン配列はヒト配列であり、該ヒト配列は、内在性プロモーターおよび／または発現制御配列に作動可能に連結している。

１つの態様では、内在性プロモーターおよび／または発現制御配列に作動可能に連結しているヒト配列を含む改変非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座が提供される。

種々の態様では、遺伝子改変された非ヒト動物または非ヒト動物に由来する細胞、胚、または組織によって発現されたヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンは、内在性β２ミクログロブリンおよび／または内在性ヒトβ２ミクログロブリンの全ての機能的態様を保存している。例えば、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンが、ＭＨＣＩポリペプチド（例えば、内在性非ヒトまたはヒトＭＨＣＩポリペプチド）のα鎖に結合することが好ましい。ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、任意の他の分子、例えば、内在性非ヒトβ２ミクログロブリンおよび／または内在性ヒトβ２ミクログロブリンと会合する受容体、アンカーまたはシグナル伝達分子（例えば、ＨＦＥなど）に結合し得、これらを動員し得、または別の方法でこれらと会合し得る。

遺伝子改変された動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に加えて、組織または細胞であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来し、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列、すなわち、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を含む組織または細胞もまた提供される。１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列である。好ましくは、上記細胞は有核細胞である。上記細胞は、ＭＨＣＩ複合体を発現することが公知である任意の細胞、例えば、抗原提示細胞であってもよい。前記細胞によって発現されるヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、内在性非ヒトＭＨＣＩ（例えば、げっ歯動物ＭＨＣＩ）と相互作用して、機能的なＭＨＣＩ複合体を形成し得る。得られたＭＨＣＩ複合体は、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用可能であり得る。従って、本明細書中で記載されるように非ヒト動物由来の細胞とＴ細胞とのｉｎｖｉｔｒｏ複合体もまた提供される。

また、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列、ならびにさらなるヒトまたはヒト化配列、例えば、ここで開示されるキメラＭＨＣＩポリペプチドを含む非ヒト細胞も提供される。このような場合、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドと相互作用し得、機能的ＭＨＣＩ複合体が形成され得る。いくつかの態様では、このような複合体は、Ｔ細胞、例えば、ヒトまたは非ヒトＴ細胞上のＴＣＲと相互作用可能である。従って、本明細書中で記載されるように非ヒト動物由来の細胞とヒトまたは非ヒトＴ細胞とのｉｎｖｉｔｒｏ複合体もまた提供される。

本開示の別の態様は、本明細書中で記載されるように、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列を含むげっ歯動物胚（例えば、マウスまたはラットの胚）である。１つの実施形態では、上記胚は、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列を含むＥＳドナー細胞および宿主胚細胞を含む。異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列である。

本発明はまた、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の染色体またはその断片を含む（例えば、染色体またはその断片が、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）非ヒト細胞を包含する。非ヒト細胞は、本明細書中で記載されるように、非ヒト動物の核を含み得る。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、核移入の結果として、染色体またはその断片を含む。

１つの態様では、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。１つの実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来する。１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン遺伝子また異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化遺伝子またはヒトまたはヒト化配列である。

また、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマも提供される。１つの実施形態では、非ヒト動物はマウスまたはラットである。

本開示はまた、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作されたげっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法も提供する。上記方法は、そのゲノムがヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む動物を生じる。１つの態様では、上記方法は、そのゲノムが、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座において、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子操作されたマウスを生じる。いくつかの場合では、上記マウスは、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なマウスβ２ミクログロブリンを発現しない。いくつかの態様では、上記方法は、実施例において記載されるように、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製した標的化構築物を使用し、該構築物をＥＳ細胞へと導入し、標的とされたＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いてマウス胚へと導入する。１つの実施形態では、上記ＥＳ細胞は、１２９マウス系統およびＣ５７ＢＬ／６マウス系統の混血であり；別の実施形態では、上記ＥＳ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統および１２９マウス系統の混血である。

また、遺伝子操作された非ヒト動物を作製するために使用されるヌクレオチド構築物も提供される。上記ヌクレオチド構築物は、以下を含み得る：５’および３’の非ヒトホモロジーアーム、ヒトβ２ミクログロブリン配列を含むヒトＤＮＡ断片、および組換え部位が隣接する選択カセット。１つの実施形態では、上記ヒトＤＮＡ断片は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のイントロンおよびエクソンの両方を含むゲノム断片である。１つの実施形態では、上記非ヒトホモロジーアームは、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に対して相同である。上記ゲノム断片は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４を含み得る。１つの場合では、上記ゲノム断片は、５’から３’へ、エクソン２、イントロン、エクソン３、イントロン、およびエクソン４、ヒトβ２ミクログロブリン配列の全てを含む。上記選択カセットは、上記構築物内で、β２ミクログロブリンコード領域の外側のどこに位置してもよく、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンのエクソン４の３’に位置してもよい。上記５’および３’の非ヒトホモロジーアームは、それぞれ、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の５’および３’のゲノム配列を含み得る。別の実施形態では、５’および３’の非ヒトホモロジーアームは、それぞれ、内在性非ヒト遺伝子のエクソン２の５’およびエクソン４の３’のゲノム配列を含む。

本発明の別の態様は、非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）のβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変し、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現させる方法に関する。マウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変してヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現させる１つの方法は、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座にて、マウスβ２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む。このような方法の１つの実施形態では、上記マウスは、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。いくつかの特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜４に示されるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む。

遺伝子改変されたＭＨＣＩ／β２ミクログロブリン動物
種々の実施形態では、本発明は、一般に、そのゲノムにヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよびβ２ミクログロブリンポリペプチドの両方をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって；従って、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドおよびβ２ミクログロブリンポリペプチドの両方を発現する、非ヒト動物を提供する。

ヒト／非ヒト系の構成要素を混合して使用する場合、機能的差異が生じる。ＨＬＡクラスＩは、β２ミクログロブリンにマウスクラスＩよりも強固に結合する。Bernabeu（１９８４年）β2-microgobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells、Nature ３０８巻：６４２〜６４５頁。機能的差異をなくす試みは、特定のヒト化ＭＨＣマウスの構築において反映される。そのＮ末端がヒトβ２−ミクログロブリンのＣ末端にリンカーを介して結合した、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１のα１およびα２およびマウスＨ−２Ｄ^ｂのα３を有する、無作為に組み込まれたヒトＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１キメラトランスジーンを発現する、Ｈ−２クラスＩおよびクラス２ノックアウトマウス（β２ミクログロブリンＫＯバックグラウンドのマウスにおいて）が、開発されている。例えば、Pajotら（２００４年）A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic H-2 class I-/class II-knockout mice、Eur. J. Immunol.３４巻：３０６０〜３０６９頁を参照されたい。これらのマウスは、Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗原特異的抗体を生成し、ＣＴＬ応答を惹起するが、ＨＬＡ−Ａ２．１についてのみトランスジェニックであるマウスまたはＨ−２クラスＩ／クラスＩＩノックアウトマウスは生成しないことが報告されている。上記遺伝子についてのみトランスジェニックであるマウスの欠損は、おそらく、このようなマウスが内在性クラスＩおよび／またはクラスＩＩ遺伝子を用いて任意のトランスジーンを回避する能力から生じるものであり、ＭＨＣノックアウトマウスに利用不能である選択肢である。しかし、上記マウスは、少なくともＨ−２Ｄ^ｂを発現し得、マウスβ２ミクログロブリンノックアウトマウスバックグラウンドへの交配に起因すると推定される（Pajotら上掲を参照されたい；これは、インタクトな内在性クラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子座を明らかに含む）。

ヒトβ２ミクログロブリンとのキメラ融合物の細胞表面発現は、内在性ＭＨＣ発現よりも低いと報告されているが、ＮＫ死滅化（ＮＫｋｉｌｌｉｎｇ）の生存性／生存率は報告されておらず、ＮＫ自己死滅化（ＮＫｓｅｌｆ−ｋｉｌｌｉｎｇ）の割合も報告されていない。Pajotら、上掲。ＣＤ８＋Ｔ細胞数におけるいくらかの改善が、ＭＨＣクラスＩ欠損β２−ミクログロブリンノックアウトマウスに対して観察されている（全脾細胞の２〜３％対β２ＫＯマウスにおける０．６〜１％）。しかし、Ｔ細胞可変領域利用は、ＢＶ５．１、ＢＶ５．２、およびＢＶ１１の遺伝子セグメントについて変更されたプロフィールを示した。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の両方が、マウスを免疫するために使用した適切なＢ型肝炎抗原に対して拘束されたが、少なくとも２匹のマウスが、いずれかの抗原を有する細胞を死滅させたことが報告されている（該マウスは、１つの抗原のみで免疫されていて、このことは、ＮＫ細胞阻害の欠如またはＮＫ細胞選択性の欠如に起因し得る）。

上で述べられた通り、ヒトＭＨＣＩおよびヒトβ２ミクログロブリンの両方についてトランスジェニックであるマウスは、キメラＭＨＣＩ／β２ミクログロブリンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該ＭＨＣＩ部分およびβ２ミクログロブリン部分は、１本のポリペプチド鎖内に含まれ、その結果、ＭＨＣＩα鎖とβ２ミクログロブリンとは互いに共有結合することにより、細胞表面において繋ぎ止められている。そのゲノムに２つの独立したヌクレオチド配列（ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドをコードするものおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするもの）を含むマウスが提供される。本明細書中で提供されるマウスは、天然に存在するＭＨＣＩ複合体に非常に似ているＭＨＣＩ複合体を発現し、ここで、ＭＨＣＩα鎖およびβ２ミクログロブリンは、ＭＨＣＩα鎖に非共有結合しているβ２ミクログロブリンを有する２つの別個のポリペプチド鎖上に提供される。

従って、本開示は、そのゲノムに以下を含む非ヒト動物を提供する：ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列。１つの態様では、そのゲノムに以下を含む非ヒト動物が提供される：（ａ）キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ；例えば、ＨＬＡ−Ａ２）のペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含む、ヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列。

第１ヌクレオチド配列は、上記動物が、そのゲノムにおいて、ＭＨＣＩ遺伝子座での、内在性ＭＨＣＩ遺伝子の全てまたは部分（例えば、ペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインをコードする部分）の、対応するヒトＭＨＣＩ配列による置き換えを含むように、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座に位置してもよい。従って、上記動物は、内在性ＭＨＣＩ遺伝子座において、ヒトＭＨＣＩ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ；例えば、ＨＬＡ−Ａ２）の細胞外ドメインならびに内在性非ヒトＭＨＣＩ（例えば、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、など、例えば、Ｈ−２Ｋｂ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様では、上記動物はマウスであり、第１ヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）の細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。

第２ヌクレオチド配列は、上記動物が、そのゲノムにおいて、β２ミクログロブリン遺伝子座での、内在性β２ミクログロブリン遺伝子の全てまたは部分の、対応するヒトβ２ミクログロブリン配列による置き換えを含むように、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置してもよい。第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。この実施形態では、ヌクレオチド配列は、互いに作動可能に連結している。第２ヌクレオチド配列は、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１の配列を、さらに含み得る。

１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座から、機能的なＭＨＣＩを発現せず（例えば、内在性ＭＨＣＩのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインのどちらも発現しない）、該動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。いくつかの態様では、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＭＨＣＩ遺伝子座およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含むβ２ミクログロブリン遺伝子座の両方について、ホモ接合型である。他の態様では、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＭＨＣＩ遺伝子座ならびにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含むβ２ミクログロブリン遺伝子座の両方について、ヘテロ接合型である。

好ましくは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、内在性発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）に作動可能に連結している。

本明細書中に包含される第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列（およびこれらがコードするポリペプチド）の種々の他の実施形態は、明細書を通して記載された実施形態（例えば、遺伝子操作されたＭＨＣＩ動物および遺伝子操作されたβ２ミクログロブリン動物に関連する節において記載されたもの）から、容易に理解され得る。

１つの態様では、本開示は、そのゲノムに、（ａ）キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチド（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチド）をコードし、該キメラポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインを含み、そのマウス部分が、マウスＨ−２Ｋの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、第１ヌクレオチド配列、および（ｂ）ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列（例えば、該ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列、またはヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む）を含むマウスであって、ここで、該第１ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座に位置し、該第２配列は、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座に位置するマウスを提供する。１つの実施形態では、上記マウスは、機能的なＨ−２Ｋおよびマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドを、そのそれぞれの内在性遺伝子座から発現しない。１つの実施形態では、上記マウスは、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの両方を発現する。

以下の実施例で示されるように、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩとβ２ミクログロブリンとの両方を共発現するように遺伝子操作された動物は、ＭＨＣＩのみについてヒト化した動物と比較して、細胞表面にキメラＭＨＣクラスＩの増大した発現を示した。いくつかの実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩとβ２ミクログロブリンとの共発現は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩの細胞表面発現を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンの非存在下でのヒトまたはヒト化ＭＨＣＩの発現よりも、約１０％を超えて、例えば、約２０％を超えて、例えば、約５０％以上、例えば、約７０％増大する。

本開示はまた、そのゲノムが本明細書中で記載されるように第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法も提供する。上記方法は、一般に、そのゲノムが本明細書中で記載される第１のヌクレオチド配列（すなわち、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩ配列）を含む、第１の遺伝子操作された非ヒト動物を生み出す工程、そのゲノムが本明細書中で記載される第２のヌクレオチド配列（すなわち、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列）を含む、第２の遺伝子操作された非ヒト動物を生み出す工程、ならびに、第１動物および第２動物を交配させて、そのゲノムが両ヌクレオチド配列を含有する子孫を得る工程を、含む。１つの実施形態では、第１動物および第２動物は、それぞれ第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列について、ヘテロ接合型である。１つの実施形態では、第１動物および第２動物は、それぞれ第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列について、ホモ接合型である。１つの実施形態では、第１動物および第２動物は、内在性非ヒト遺伝子座を、それぞれ第１ヌクレオチド配列および第２ヌクレオチド配列で置き換えることを介して生み出される。１つの態様では、第１動物および第２動物は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を介して生成した構築物の利用し、このような構築物を有する標的とされたＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介して、胚（例えば、げっ歯動物胚、例えば、マウスまたはラット胚）へと導入することによって生み出される。

遺伝子改変された動物の使用
種々の実施形態では、本明細書中で記載される遺伝子改変された非ヒト動物は、その細胞表面にヒトまたはヒト化ＭＨＣＩおよび／またはβ２ミクログロブリンを有するＡＰＣを作製し、結果として、サイトゾルタンパク質に由来するペプチドを、ＣＴＬに対するエピトープとしてヒト様の様式で提示する（何故なら、その複合体の構成要素の実質的に全てが、ヒトまたはヒト化であるからである）。本発明の遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒト化動物においてヒト免疫系の機能を研究するため；免疫応答を惹起する抗原および抗原エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ、例えば、独特なヒトがんエピトープ）を同定するため、例えば、ワクチン開発に使用するため；ヒト病原体またはがん抗原に対する高親和性Ｔ細胞（すなわち、高いアビディティを有して、ヒトＭＨＣＩ複合体との関連で抗原に結合するＴ細胞）の同定のため、例えば、適応Ｔ細胞治療において使用するため；ワクチン候補の評価および他のワクチン戦略のため；ヒト自己免疫を研究するため；ヒト感染症を研究するため；および別の方法で、ヒトＭＨＣ発現に基づくより良い治療戦略を案出するために、使用され得る。

ＭＨＣＩ複合体は、ペプチドに結合し、それらを細胞表面に提示する。そのような複合体との関連で、一旦、表面に提示されると、上記ペプチドは、Ｔ細胞によって認識可能である。例えば、上記ペプチドが病原体または他の対象の抗原（例えば、腫瘍抗原）に由来する場合、Ｔ細胞認識は、Ｔ細胞活性化、提示されたペプチド配列を有する細胞のマクロファージによる死滅化、および提示された配列に結合する抗体のＢ細胞活性化をもたらし得る。

Ｔ細胞は、ペプチド結合ＭＨＣクラスＩエクトドメインおよびＴ細胞のＣＤ８エクトドメインを介して、ＭＨＣＩ複合体を発現する細胞と相互作用する。ＭＨＣクラスＩ分子に結合した好適な抗原を有するＡＰＣに遭遇した、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞になる。従って、ＭＨＣクラスＩとの関連で、Ｔ細胞受容体に対し高いアビディティで結合する抗原は、ヒト病変に対する処置の開発において、潜在的に重要である。しかし、ヒトおよびマウスのＭＨＣ複合体は、抗原を異なって認識する（例えば、マウスＭＨＣＩは、ヒトＭＨＣＩと同じ抗原を認識しない場合があるか、または、ヒトＭＨＣＩとは異なるエピトープを提示し得る）ので、マウスＭＨＣＩとの関連で、抗原の提示は、ヒト疾患にいくぶん関係があるだけである。従って、ヒト病変について最も関係するデータは、ヒトＭＨＣＩによる抗原エピトープの提示の研究を通して得られる。

従って、種々の実施形態では、本発明の遺伝子操作された動物は、ヒトにおいて免疫応答を開始する抗原の能力を評価するため、および、多様な抗原を生成し、ヒトワクチン開発において使用され得る特定の抗原を同定するために、とりわけ有用である。

１つの態様では、ペプチド配列のヒトにおける抗原性を決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を、該ペプチド配列を含む分子に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を惹起させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるようにキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩ複合体またはヒト化ＭＨＣＩ複合体（キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンを含む）によって提示されるペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。

１つの態様では、ペプチドが、ヒトにおいて細胞性免疫応答を引き起こすかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を該ペプチドに曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を惹起させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるようにキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩ分子によって該ペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、曝露後の上記非ヒト動物は、上記ペプチドに結合する、ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。１つの実施形態では、ＣＴＬは、上記ペプチドを有する細胞を死滅させる。

１つの態様では、ヒトＣＴＬエピトープを同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物を、推定ＣＴＬエピトープを含む抗原に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を惹起させる工程、該非ヒト動物から、該エピトープに結合したＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬを単離する工程、および、該ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬによって結合された該エピトープを同定する工程を含む方法が提供される。

１つの態様では、ヒト細胞によるその提示およびヒトリンパ球（例えば、ヒトＴ細胞）による結合がペプチド保有細胞の細胞傷害性をもたらす、ＨＬＡクラスＩ−拘束ペプチドを同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（またはそのＭＨＣクラスＩ発現細胞）を対象のペプチドを含む分子に曝露する工程、該対象のペプチドに結合するキメラヒト／非ヒトクラスＩ分子を発現する該非ヒト動物の細胞を単離する工程、ＨＬＡクラスＩ拘束細胞傷害性を導き得るヒトリンパ球に対して該細胞を曝露する工程、および、ペプチド誘導型細胞傷害性を測定する工程を含む方法が提供される。

１つの態様では、細胞傷害性Ｔ細胞応答をヒトにおいて起こす抗原を同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスに対して推定抗原を曝露する工程、該マウスに免疫応答を起こさせる工程、および、ＨＬＡ−Ａ拘束分子により結合した抗原を同定する工程を含む方法が提供される。

１つの実施形態では、抗原は、細菌表面抗原またはウイルス表面抗原またはエンベロープタンパク質を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒト腫瘍細胞の表面の抗原を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおける使用のための推定ワクチンを含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおいて抗体を生み出すヒトエピトープを含む。別の実施形態では、抗原は、エピトープ／ＭＨＣＩ複合体を標的とする高親和性ＣＴＬを生み出すヒトエピトープを含む。

１つの態様では、推定抗原が、ヒト免疫系に対する曝露の際に、ＨＬＡ−Ａ拘束免疫応答（例えば、ＨＬＡ−Ａ２拘束応答）を起こすエピトープを含有するかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスを推定抗原に曝露する工程、および、該マウスにおける抗原特異的ＨＬＡ−Ａ拘束（例えば、ＨＬＡ−Ａ２拘束）免疫応答を測定する工程を含む方法が提供される。

１つの実施形態では、推定抗原は、生物製剤またはその断片、非自己タンパク質、非自己細胞の表面抗原、腫瘍細胞の表面抗原、細菌細胞または酵母細胞または真菌細胞の表面抗原、ウイルスの表面抗原またはエンベロープタンパク質から選択される。

さらに、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物は、対象の抗原（例えば、腫瘍抗原または別の疾患抗原）を認識するＴ細胞受容体、例えば、高アビディティＴ細胞受容体の同定のために有用であり得る。上記方法は以下を含み得る：本明細書中で記載される非ヒト動物を抗原に曝露する工程、該非ヒト動物に該抗原に対する免疫応答を惹起させる工程、該非ヒト動物から、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩによって提示された抗原に結合するＴ細胞受容体を含むＴ細胞を単離する工程、および、該Ｔ細胞受容体の配列を決定する工程。

１つの態様では、ヒト腫瘍抗原に対して高い親和性を有するＴ細胞受容体可変ドメインを同定するための方法であって、ヒト化ＭＨＣＩα１、α２、およびα３ドメイン（例えば、ＨＬＡ−Ａ２ α１、α２、およびα３ドメイン）を含むマウスをヒト腫瘍抗原に曝露する工程；該マウスに免疫応答を起こさせる工程；および、該マウスから、Ｔ細胞受容体可変ドメインをコードする核酸配列を単離する工程を含み、ここで、該Ｔ細胞受容体可変ドメインは、約１ナノモル濃度以下のＫ_Ｄでヒト腫瘍抗原に結合する方法が提供される。

１つの実施形態では、上記マウスは、内在性マウスＴ細胞受容体可変領域遺伝子遺伝子座において、複数の再配列されていないヒトＴ細胞受容体可変領域遺伝子セグメントによる置き換えであって、ここで、該再配列されていないヒトＴ細胞受容体可変領域遺伝子セグメントは、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含むキメラヒト−マウスＴ細胞受容体遺伝子をコードするように組み換える置き換えをさらに含む。１つの実施形態では、上記マウスは、ヒトＣＤ８トランスジーンを含み、該マウスは、機能的なヒトＣＤ８タンパク質を発現する。

腫瘍抗原に対して高いアビディティを有するＴ細胞受容体は、細胞ベースの治療において有用である。ヒト腫瘍抗原に対し高いアビディティを有するＴ細胞集団は、腫瘍抗原に対し非常に高いアビディティを有するＴ細胞（すなわち、ＣＤ８のα３に対する結合不能性にもかかわらず該抗原を認識するＴ細胞クローン）のみを選択するために、α３サブユニットに対するＣＤ８の結合性を最小化するように変異しているＨＬＡ−Ａ２にヒトＴ細胞を曝露することによって、調製されている。Pittetら（２００３年）α3 Domain Mutants of Peptide/MHC Class I Multimers Allow the Selective Isolation of High Avidity Tumor-Reactive CD8 T Cells、J. Immunol.１７１巻：１８４４〜１８４９頁を参照されたい。非ヒト動物、および該非ヒト動物の細胞は、ヒトＨＬＡクラスＩと、Ｔ細胞受容体に対する高いアビディティで結合するか、またはＴ細胞受容体を有するリンパ球を活性化する複合体を形成するペプチドを同定するために有用である。

Ｔ細胞に対する抗原／ＨＬＡクラスＩ結合、またはＴ細胞の活性化は、当該分野で公知の任意の好適な方法によって測定され得る。ペプチド特異的ＡＰＣ−Ｔ細胞結合および活性化は、測定可能である。例えば、ＨＬＡ−Ａ２を発現する抗原提示細胞のＴ細胞会合は、ＰＩＰ２を生じて、免疫シナプスにおいて蓄積するが、他方で、架橋ＭＨＣクラスＩ分子はそれを起こさないことが、報告されている。Fooksmanら（２００９年）Cutting Edge: Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Concentration at the APC Side of the Immunological Synapse Is Required for Effector T Cell Function、J. Immunol.１８２巻：５１７９〜５１８２頁を参照されたい。

ＴＣＲを有するリンパ球およびクラスＩ発現ＡＰＣの相互作用の機能的帰結もまた、測定可能であり、リンパ球による細胞死滅化を含む。例えば、ＣＤ８＋ＣＴＬによるＨＬＡ−Ａ２のα２サブユニットにおける接触点は、Ｆａｓ非依存型死滅化についてのシグナルを生成することが報告されている。ＨＬＡ−Ａ２発現Ｊｕｒｋａｔ細胞は、細胞質ドメイン上に何ら明らかな確実性なしにＣＤ８と接触することが（結晶学的研究から）公知であるＨＬＡ−Ａ２分子上のエピトープに（抗体によって）接触した場合、アポトーシスがおこる。Pettersenら（１９９８年）The TCR-Binding Region of the HLA Class I α2 Domain Signals Rapid Fas-Independent Cell Death: A Direct Pathway for T Cell-Mediated Killing of Target Cells? J. Immunol.１６０巻：４３４３〜４３５２頁を参照されたい。ＣＤ８＋ＣＴＬのＣＤ８と接触したＨＬＡ−Ａ２ α２によって誘導された迅速な死滅化は、主に、このＦａｓ非依存型ＨＬＡ−Ａ２媒介型経路に起因し得ると仮定され（同上）、それ自身がアポトーシスを誘導し得るＴＣＲ非依存型α３ドメイン媒介型死滅化とは区別される（Woodleら（１９９７年）Anti-human class I MHC antibodies induce apoptosis by a pathway that is distinct from the Fas antigen-mediated pathway、J. Immunol.１５８巻：２１５６〜２１６４頁を参照されたい）。

Ｔ細胞とＭＨＣＩとの関連でペプチドを表面に表すＡＰＣとの間の相互作用の結果はまた、Ｔ細胞増殖アッセイによって測定され得る。あるいは、これは、一般に免疫応答の活性化と関連するサイトカイン放出の測定によって、決定され得る。１つの実施形態では、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴが、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化をモニタリングして定量化するために使用され得る。

本明細書中で記載されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、本明細書中で記載される遺伝子改変された非ヒト動物において、ＭＨＣＩに対するＣＤ８の種特異的結合性に起因して、妨害され得る。種特異的ＣＤ８相互作用が所望される実施形態について、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）の細胞は、（例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで）ヒト細胞、例えば、ヒトＣＤ８保有細胞、例えば、ヒトＴ細胞に曝露される。１つの実施形態では、本明細書中で記載されるようにマウスのＭＨＣクラスＩ発現細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでヒトＣＤ８およびＴ細胞受容体を含むＴ細胞に曝露される。特定の実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。１つの実施形態では、マウスのＭＨＣクラスＩ発現細胞は、キメラヒト／マウスＭＨＣＩまたはヒト化ＭＨＣＩ複合体（ヒトβ２ミクログロブリンを含む）に結合するペプチドを含み、上記Ｔ細胞はヒトＴ細胞であり、ペプチドを表面に表すマウス細胞に結合するＴ細胞の能力が決定される。１つの実施形態では、ペプチドを表面に表すマウス細胞によるヒトＴ細胞の活性化が決定される。１つの実施形態では、ペプチドを表面に表す細胞によるヒトＴ細胞の活性化を測定するためのｉｎｖｉｔｒｏ方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスまたはマウス細胞を対象の抗原に曝露する工程、該マウス由来の細胞または該マウス細胞（ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩとの複合体における該抗原に由来するペプチドを有すると推定される）を、ヒトＴ細胞に曝露する工程、および、該ヒトＴ細胞の活性化を測定する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、上記方法は、ヒト病原体またはヒト新生物のＴ細胞エピトープを同定するために使用される。１つの実施形態では、上記方法は、ワクチンのためのエピトープを同定するために使用される。

１つの実施形態では、推定ヒト治療薬によるＴ細胞活性化を決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された動物を推定ヒト治療薬に曝露する工程（または、例えば、そのような動物のヒトまたはヒト化ＭＨＣＩ発現細胞を推定治療薬のペプチド配列に曝露する工程）、ヒトまたはヒト化ＭＨＣＩ／ペプチド複合体を表面に表す遺伝子改変された動物の細胞を、該遺伝子改変された動物の細胞に結合可能なヒトＴ細胞受容体およびＣＤ８を含むＴ細胞に曝露する工程、および、該遺伝子改変された動物の、該ペプチドを表面に表す細胞によって誘導されるヒトＴ細胞の活性化を測定する工程を含む方法が提供される。

種々の実施形態では、本明細書中で記載されるように動物由来のヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩ発現細胞間に形成される複合体は、ヒトＣＤ８配列を含むＴ細胞、例えば、ヒトＴ細胞、またはヒトＣＤ８をコードするトランスジーンを含む非ヒト動物のＴ細胞によって作製される。ヒトＣＤ８についてトランスジェニックであるマウスは、当該分野で公知である。Tishonら（２０００年）Trangenic Mice Expressing Human HLA and CD8 Molecules Generate HLA-Restricted Measles Virus Cytotoxic T Lymphocytes of the Same Specificity as Humans with Natural Measles Virus Infection、Virology ２７５巻（２号）：２８６〜２９３頁；また、LaFaceら（１９９５年）Human CD8 Transgene Regulation of HLA Recognition by Murine T Cells、J. Exp. Med.１８２巻：１３１５〜１３２５頁。

ヒト病原体または新生物からの抗原および抗原エピトープを同定する能力に加え、本発明の遺伝子改変された動物が、ヒト自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症などに関連する自己抗原を同定するために使用され得る。例えば、Takakiら（（２００６年）HLA-A^*0201-Restricted T Cells from Humanized NOD Mice Recognize Autoantigens of Potential Clinical Relevance to Type 1 Diabetes、J. Immunol.１７６巻：３２５７〜６５頁）は、ＨＬＡ／β２ミクログロブリン単鎖を有するＮＯＤマウスの、１型糖尿病自己抗原を同定する上での使用を記載する。また、本発明の遺伝子改変された動物は、ヒト自己免疫疾患の種々の態様を研究するために使用され得る。ヒトＭＨＣＩのいくつかの多形対立遺伝子は、ある特定の疾患、例えば、自己免疫疾患（例えば、グレーヴス病、重症筋無力症、乾癬など）の発症に関連することが公知である;Bakkerら（２００６年）A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC、Nature Genetics ３８巻：１１６６〜７２頁および補遺情報、ならびにInternational MHC and Autoimmunity Genetics Network（２００９年）Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA １０６巻：１８６８０〜８５頁、両方とも参考として本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。ヒト化ＭＨＣＩ遺伝子座を含む本発明の遺伝子改変された動物は、自己免疫疾患モデルとして有用であり得るような対立遺伝子を含む。１つの実施形態では、疾患対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ｂ２７であり、上記疾患は、硬直性脊椎炎または反応性関節炎であり；従って、１つの実施形態では、これらの疾患の研究のために使用される動物は、ヒトまたはヒト化ＨＬＡ−Ｂ２７を含む。

ＭＨＣＩ複合体を包含する細胞性免疫の他の態様は、当該分野で公知である；従って、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物は、免疫生物学のこれらの態様を研究するために使用され得る。例えば、ＴＣＲのＭＨＣクラスＩに対する結合性は、さらなる因子によって、ｉｎｖｉｖｏで調整される。白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー（ＬＩＬＲＢ１、またはＬＩＲ−１）は、ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＴＬにおいて発現され、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子のα３サブユニットにおける特定の抗原決定基の結合によって、Ｔ細胞刺激を下方制御する。構造研究は、ＬＩＲ−１およびＣＤ８についての結合部位が重複することを示し、このことは、ＭＨＣクラスＩ分子との結合について、阻害性ＬＩＲ−１が刺激性ＣＤ８と競合することを示唆する。Willcoxら（２００３年）Crystal structure of HLA-A2 bound to LIR-1, a host and viral major histocompatibility complex receptor、Nature Immunology ４巻（９号）：９１３〜９１９頁；また、Shirioshiら（２００３年）Human inhibitory receptors Ig-like transcript 2 (ILT2) and ILT4 compete with CD8 for MHC class I binding and bind preferentially to HLA-G、Proc. Natl. Acad. Sci. USA １００巻（１５号）：８８５６〜８８６１頁。ＬＩＲ−１は、阻害シグナルを、その（細胞内）免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を介して伝達する。ＮＫ細胞では、研究は、ＩＴＩＭを欠く（通常、阻害不可能である）ＫＩＲ（阻害性キラー細胞Ｉｇ様受容体）が、ＬＩＲ−１の存在下で（おそらく、ＬＩＲ−１ＩＴＩＭを介して）ＭＨＣクラスＩ分子のα３ドメインへの結合を阻害し得ることを示している（Kirwinら（２００５年）Killer Cell Ig-Like Receptor-Dependent Signaling by Ig-Like Transcript 2 (ILT2/CD85j/LILRB1/LIR-1) J. Immunol.１７５巻：５００６〜５０１５頁を参照されたい）。このことは、ＭＨＣクラスＩに結合したＬＩＲ−１とＫＩＲとの間の協調を示唆し、従って、ＮＫ細胞阻害の調節におけるＨＬＡα３ドメイン結合の役割を示唆している。

上で記載されるように、ＭＨＣ分子は、ＴＣＲを発現しない細胞と相互作用する。ＮＫ細胞はＴＣＲを発現しない細胞である。ＮＫ細胞は、細胞性免疫応答において、および特に先天免疫において、中心的役割を果たす細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球とは区別される）である。ＮＫ細胞は、侵入性の微生物、ウイルス、および他の非自己（例えば、腫瘍）実体に対する防御の第１線である。ＮＫ細胞は、表面受容体を介して活性化されるかまたは阻害され、これらは、ＣＤ８を発現するが、ＴＣＲは発現しない。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩを発現する細胞と相互作用し得るが、相互作用は、ＴＣＲ結合、ペプチド保有α_１およびα_２ドメインではなくＣＤ８結合α３ドメインを介する。ＮＫ細胞の主な機能は、充分なＭＨＣクラスＩ表面タンパク質を欠く細胞を破壊することである。

ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面の架橋ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞内チロシンリン酸化、ＭＨＣクラスＩ分子の免疫シナプスからの移動、および腫瘍細胞死滅化の下方制御をもたらす。Rubioら（２００４年）Cross-linking of MHC class I molecules on human NK cells inhibits NK cell function, segregates MHC I from the NK cell synapse, and induces intracellular phosphotyrosines、J. Leukocyte Biol.７６巻：１１６〜１２４頁。

ＮＫ細胞におけるＭＨＣクラスＩの別の機能は、明らかに自己死滅化を防ぐ。ＮＫ細胞は、活性化受容体２Ｂ４および２Ｂ４リガンドＣＤ４８の両方を有し；ＭＨＣクラスＩは、２Ｂ４に結合し、ＣＤ４８によるその活性化を妨げるようである。Betser-Cohen（２０１０年）The Association of MHC Class I Proteins with the 2B4 Receptor Inhibits Self-Killing of Human NK Cells, J. Immunol.１８４巻：２７６１〜２７６８頁。

従って、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物は、これらの非ＴＣＲまたは非ＣＴＬ媒介型プロセスを研究するため、およびその調整のためのアプローチを設計するために、使用され得る。

本発明は、以下の非限定の実施例によって、さらに例証される。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために示されるが、本発明の範囲を制限することを何ら企図せず、また何らそのように解釈されるべきではない。本実施例は、当業者に周知の慣用的方法（分子クローニング技術など）の詳細な記載を含まない。そうでないと示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏（Ｃｅｌｓｉｕｓ）で示され、圧力は大気圧付近である。

（実施例１．遺伝子改変されたＨＬＡ−Ａ２マウスの構築および性質決定）
（実施例１．１：ＭＧ８７細胞におけるＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋの発現）
キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子配列を含むウイルス構築物（図４Ａ）を、トランスフェクトした細胞におけるキメラヒト／マウスＭＨＣＩ発現を分析するために、当業者に公知の標準的分子クローニング技術を用いて作製した。

簡潔には、キメラヒトＨＬＡ−Ａ／マウスＨ−２Ｋウイルス構築物を、α鎖のα１、α２およびα３ドメインをコードするエクソン配列を用いて作製し、これらを、Ｈ−２Ｋ遺伝子由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインについて、マウスコード配列にインフレームげクローニングした（図４Ａ、ｐＭＩＧ−ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋ）。図４に示される通り、上記構築物は、ＩＲＥＳ−ＧＦＰレポーター配列を含み、これは、該構築物が、トランスフェクションによって細胞内で発現できるかどうかを決定することを可能にした。

上記のキメラ構築物を含むウイルスを作製し、ヒト胚性腎２９３（２９３Ｔ）細胞内で増やした。２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍディッシュにまいて、９５％コンフルーエンシーまで増殖させた。ＤＮＡトランスフェクション混合物を、２５μｇのｐＭＩＧ−ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋ、ｐＭＩＧ−ヒトＨＬＡ−Ａ２またはｐＭＩＧ−ヒト化β２ミクログロブリン、および５μｇのｐＭＤＧ（エンベローププラスミド）、１５μｇのｐＣＬ−Ｅｃｏ（パッケージングシグナルΨなしのパッケージング構築物）、１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。この１ｍＬのＤＮＡ混合物に、１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の８０μＬのリポフェクタミン−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、これを先に一緒に混合し、室温で５分間インキュベートさせた。リポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を、さらに２０分間室温でインキュベートし、次いで、１０ｃｍディッシュに加え、この平板培養物（ｐｌａｔｅ）を、３７℃でインキュベートした。この細胞からの培地を、２４時間後に回収し、新鮮な１０ｍＬのＲ１０（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）培地を、この細胞に添加した。この培地交換を、２回繰り返した。計４日間の後、回収した培地をプールし、遠心分離し、滅菌フィルターを通して、細胞屑を除去した。

上記のように増やしたウイルスを、ＭＧ８７（マウス線維芽細胞）細胞を変換するために使用した。単一のＴ−７５フラスコからのＭＧ８７細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。３ｍＬの０．２５％トリプシン＋ＥＤＴＡを細胞に加え、室温で３分間インキュベートした。７ｍＬのＤ１０（高グルコースＤＭＥＭ；１０％ウシ胎仔血清）をこの細胞／トリプシン混合物に加え、１５ｍＬチューブに移して、１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を遠心分離した後、培地を吸引し、細胞を、５ｍＬＤ１０中に再度懸濁させた。細胞を計数し、６ウェルプレート中の１ウェルあたり約３．０×１０^５細胞を入れた。ｐＭＩＧ−ヒトＨＬＡ−Ａ２またはｐＭＩＧ−ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋは、単独で、またはｐＭＩＧ−ヒト化β２ミクログロブリンウイルスとともにウェルに加え、対照として非変換細胞を用いた。細胞を、３７℃にて５％ＣＯ_２と共に２日間インキュベートした。β２ミクログロブリンを有するかまたは有さないＨＬＡ−Ａ２発現について、ＦＡＣＳ分析（抗ＨＬＡ−Ａ２抗体、クローンＢＢ７．２を用いた）のために、細胞を調製した。

グラフ（図４Ｂ）ならびに該グラフから得られたデータをまとめた表（図４Ｃ）は、ヒト化β２ミクログロブリンとの共変換は、右方へシフトする曲線によって実証されるように、ヒトＨＬＡ−Ａ２またはキメラヒト／非ヒトＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋの発現を増大することを実証する。

（実施例１．２．キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子座の操作）
マウスＨ−２Ｋ遺伝子を、独自のターゲッティングベクターを、ヒトおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて構築することにより、一工程でヒト化した（例えば、米国特許第６、５８６、２５１号およびValenzuelaら（２００３年）High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis、Nat. Biotech.２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）。マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１７３ｋ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＤＮＡを、相同組換えによって改変し、マウスＨ−２Ｋ遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするゲノムＤＮＡを、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子のα１、α２およびα３サブユニットをコードするヒトゲノムＤＮＡで置き換えた（図５）。

簡潔には、ｌｏｘＰ部位が隣接するハイグロマイシンカセットおよび５’非翻訳領域を含むマウスＨ−２Ｋ遺伝子座の５’の配列を含有する５’マウスホモロジーアーム（ＵＴＲ；５’ホモロジーアームは、配列番号１に示される）およびマウスＨ−２Ｋ α３をコードする配列の３’のゲノム配列を含有する３’マウスホモロジーアーム（３’ホモロジーアームは、配列番号２に示される）を含むターゲッティングベクターを用いる、単一のターゲティング事象で、Ｈ−２Ｋ遺伝子のマウスα１、α２およびα３サブユニットをコードするゲノム配列を、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡで置き換える。

内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子遺伝子座を標的とするための最終構築物は、５’から３’へ、以下を含む：（１）内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子の５’の約２００ｂｐのマウスゲノム配列（５’ＵＴＲを含む）を含有する５’ホモロジーアーム、（２）ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１リーダー配列、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１リーダー／α１イントロン、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１α１エクソン、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１α２エクソン、α２−α３イントロンの約３１６ｂｐの５’末端を含む約１３３９ｂｐのヒトゲノム配列、（３）５’ｌｏｘＰ部位、（４）ハイグロマイシンカセット、（５）３’ｌｏｘＰ部位、（６）α２−α３イントロンの約３０４ｂｐの３’末端、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ α３エクソンを含む約５８０ｂｐのヒトゲノム配列、ならびに（７）マウスＨ−２Ｋ α３と膜貫通をコードする配列との間のイントロンを含む約２００ｂｐのマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム（Ｈ−２Ｋターゲッティングベクターの概略的表示については、図５を参照されたい）。ターゲッティングベクターの５’におけるマウス／ヒト配列の接合部における１４９ヌクレオチドの配列は、配列番号３に示され、ターゲッティングベクターの３’におけるヒト／マウス配列の接合部における１５９ヌクレオチドの配列は、配列番号４に示される。このターゲッティングベクターによる相同組換えは、内在性マウスＨ−２Ｋ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列に作動可能に連結している、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する改変マウスＨ−２Ｋ遺伝子座を生成した。この遺伝子座は、翻訳されるとキメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の形成を導く。

ターゲッティングされたＢＡＣＤＮＡを使用して、マウスＦ１Ｈ４ＥＳ細胞をエレクトロポレーションし、有核細胞（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、好中球）の表面にキメラＭＨＣクラスＩタンパク質を発現するマウスを生み出すための改変ＥＳ細胞を作製した。ヒトＨＬＡ配列の挿入物を含有するＥＳ細胞を、定量的ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイによって同定した。特異的プライマーセットおよびプローブを、ヒトＨＬＡ配列および付随する選択カセットの挿入（対立遺伝子の獲得、ＧＯＡ）ならびに内在性マウス配列の欠失（対立遺伝子の欠失、ＬＯＡ）を検出するために設計した。表１は、定量的ＰＣＲアッセイにおいて使用されるプローブそれぞれについて検出される名称および位置を同定する。

選択カセットは、当業者に公知の方法によって除去され得る。例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩ遺伝子座を有するＥＳ細胞は、ヒトＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子配列を含有する標的化構築物の挿入によって導入された「ｌｏｘｅｄ」ハイグロマイシンカセットを除去するために、Ｃｒｅを発現する構築物によってトランスフェクトされ得る（図５を参照されたい）。ハイグロマイシンカセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに交配させることによって、必要に応じて除去され得る。必要に応じて、ハイグロマイシンカセットは、そのマウスに保持される。

標的とした上記のＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって、８細胞段階のマウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびPoueymirouら（２００７年）F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。独立してキメラＭＨＣクラスＩ遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、独自のヒトＨＬＡ−Ａ^＊０２０１遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上掲）を改変して用いたゲノタイピングによって同定した。

（実施例１．３．遺伝子改変されたマウスにおけるキメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋのｉｎｖｉｖｏ発現）
実施例１．２に記載されるように遺伝子改変されたＨ−２Ｋ遺伝子座を有するヘテロ接合型マウスを、この動物の細胞におけるキメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋタンパク質の発現について分析した。

血液を、野生型マウスおよびＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋキメラヘテロ接合型（Ａ２／Ｈ２Ｋ）マウスから別個に得た。細胞を、フィコエリトリンコンジュゲート（ＰＥ）抗ＨＬＡ−Ａ抗体によってヒトＨＬＡ−Ａ２について染色し、アロフィコシアニンコンジュゲート抗Ｈ−２Ｋ^ｂ抗体に１時間４℃にて曝露した。細胞を、ＨＬＡ−ＡおよびＨ−２Ｋ^ｂについて特異的な抗体を用いたフローサイトメトリーによって、発現について分析した。図６Ａは、野生型およびキメラヘテロ接合型において、Ｈ−２Ｋ^ｂおよびＨＬＡ−Ａ２の発現を示す（キメラヘテロ接合体は、両方のタンパク質を発現する）。図６Ｂは、ヘテロ接合体マウスにおいて、Ｈ−２Ｋ^ｂおよびキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋの両方の発現を示す。

（実施例２：遺伝子改変されたβ２ミクログロブリンマウスの構築および性質決定）
（実施例２．１：ヒト化β２ミクログロブリン遺伝子座を操作する）
マウスβ２ミクログロブリン（β２ｍ）遺伝子を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用い、ヒトおよびマウスの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの独自のターゲッティングベクターを構築することによって、１工程でヒト化した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら、上掲を参照されたい）。

簡潔には、ターゲッティングベクターを、ＲＰＣＩ−２３ライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＢＡＣクローン８９Ｃ２４からのマウスβ２ｍの上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを含有する細菌相同組換えによって生成した。このマウスホモロジーアームを、エクソン２から非コードエクソン４の約２６７ヌクレオチド下流へ延びる２．８ｋｂのヒトβ２ｍＤＮＡ断片が隣接するように工学的に作製した（図７）。リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）が隣接する薬物選択カセット（ネオマイシン）を、ターゲッティングベクター内に工学的に作製し、その後の選択を可能にした。最終ターゲッティングベクターを、直鎖状にし、Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞系内にエレクトロポレーションした（Valenzuela、上掲）。

薬物カセットを（Ｃｒｅリコンビナーゼの導入によって）除去した標的とされたＥＳ細胞クローンを、８細胞段階のマウス胚へと、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、上掲を参照されたい）。ヒト化β２ｍ遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、マウス対立遺伝子の欠失およびヒト対立遺伝子の獲得について、対立遺伝子アッセイを改変して用いてスクリーニングすることによって、同定した（Valenzuelaら、上掲）。

（実施例２．２：ヒト化β２ミクログロブリンマウスの性質決定）
ヒト化β２ミクログロブリン（β２ｍ）遺伝子についてのヘテロ接合型のマウスを、フローサイトメトリーを使用して、発現について評価した（図８および図９）。

簡潔には、当該分野で公知の技術を使用して、血液を、野生型、ヒト化β２ｍ、ヒト化ＭＨＣ（すなわち、ヒトＨＬＡ）クラスＩ、およびβ２ｍとＭＨＣクラスＩとの二重ヒト化マウスの群（１群あたりｎ＝４）から単離した。各群におけるマウスそれぞれに由来する血液を、ＡＣＫ溶解緩衝液（ＬｏｎｚａＷａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で処理し、赤血球を除去した。残った細胞を、蛍光色素をコンジュゲートした抗ＣＤ３（１７Ａ２）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗ヒトＨＬＡクラスＩ、および抗ヒトβ２ミクログロブリン（２Ｍ２）抗体を用いて染色した。フローサイトメトリーを、ＢＤ−ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。

ヒトＨＬＡクラスＩの発現を、一重ヒト化動物および二重ヒト化動物由来の細胞において検出し、他方で、β２ミクログロブリンの発現を、二重ヒト化マウス由来の細胞のみにおいて検出した（図８）。ヒトβ２ｍおよびヒトＨＬＡクラスＩの共発現は、ヒトβ２ｍの非存在下でのヒトＨＬＡクラスＩ発現と比較して、細胞表面のヒトＨＬＡクラスＩの検出可能な量の増大をもたらした（図９；平均蛍光強度２３７０対１３８７）。

（実施例３．ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋおよびヒト化β２ミクログロブリンを発現する遺伝子改変されたマウス由来のＡＰＣによって提示されたＦｌｕペプチドおよびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ペプチドに対する免疫応答）
数人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２発現ならびにｆｌｕペプチドおよびＥＢＶペプチドに対する応答を惹起するその能力の両方について、スクリーニングした。単一のドナーを、その後の実験のために選択した。

選択されたドナーのＰＢＭＣから、ネガティブセレクションを用いてヒトＴ細胞を単離する。脾性非Ｔ細胞を、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋについてヘテロ接合型でありヒト化β２−ミクログロブリン遺伝子についてヘテロ接合型であるマウスおよび野生型マウスから単離した。マウス由来の約５０，０００の脾性非Ｔ細胞を、抗ヒトＩＦＮγ抗体でコーティングしたＥｌｉｓｐｏｔプレートに添加した。Ｆｌｕペプチド（１０マイクロモル濃度）またはＥＢＶペプチドのプール（各５マイクロモル濃度）を、添加した。ＰｏｌｙＩＣを、２５マイクログラム／ウェルで添加し、ウェルを、３７℃にて５％ＣＯ_２において３時間インキュベートした。ヒトＴ細胞（５０，０００）および抗ヒトＣＤ２８を、脾性非Ｔ細胞および上記ペプチドに添加し、ウェルを、４０時間３７℃にて５％ＣＯ２においてインキュベートし、その後、ＩＦＮγ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを実施した。

図１０に示されるように、ヒトＴ細胞は、その表面にキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋおよびヒト化β２ミクログロブリンを発現したマウスＡＰＣによって提示された場合、ｆｌｕペプチドおよびＥＢＶペプチドに対する応答を惹起し得た。

均等物
当業者は、慣用的実験以上のものを用いることなく、本明細書中で記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確かめることができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが企図される。

本出願を通して挙げられた全ての非特許文献、特許出願および特許の全内容は、その全体が、本明細書中で参考として組み込まれる。

Claims

内在性主要組織適合複合体Ｉ（ＭＨＣＩ）遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、
該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含み、
該キメラポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
該非ヒト動物は、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドを発現する、非ヒト動物。
内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座から、内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない、請求項１に記載の非ヒト動物。
前記ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト調節エレメントに作動可能に連結している、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
前記キメラポリペプチドの前記ヒト部分はヒトリーダー配列を含む、請求項１または請求項２に記載の非ヒト動物。
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドである、請求項６に記載の非ヒト動物。
前記ヒトＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドである、請求項７に記載の非ヒト動物。
前記非ヒト動物は、げっ歯動物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
前記非ヒト動物は、マウスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
前記非ヒト動物はマウスであり、前記内在性非ヒトＭＨＣＩ遺伝子座はマウスＨ−２Ｋ遺伝子座であり、前記内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドはＨ−２Ｋである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
前記非ヒト動物はマウスであり、前記Ｈ−２Ｋ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座であり、前記内在性非ヒトＭＨＣＩポリペプチドはＨ−２Ｋｂである、請求項１１に記載の非ヒト動物。
マウスのＭＨＣＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドを発現させる方法であって、該内在性ＭＨＣＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含み、該マウスは、該マウスＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを発現する、方法。
前記マウスは、内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座から、前記マウスＭＨＣＩポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない、請求項１３に記載の方法。
前記マウスＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座であり、前記マウスＭＨＣＩポリペプチドは、Ｈ−２Ｋポリペプチドである、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドはＨＬＡ−Ａポリペプチドである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ、該単一のＥＳ細胞は、マウス胚に導入されて、マウスを作製する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座にヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物であって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、非ヒト動物。
前記非ヒト動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的な内在性非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない、請求項１８に記載の非ヒト動物。
前記ヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している、請求項１８または請求項１９に記載の非ヒト動物。
前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
前記ヌクレオチド配列は、げっ歯動物β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
マウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変して、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現させることをさらに含む請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法であって、該内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座において、マウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法。
前記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない、請求項２４に記載の方法。
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
前記改変された遺伝子座は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１のヌクレオチド配列を保持する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
第１マウスのＭＨＣＩ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドを発現するように改変する工程であって、該内在性マウスＭＨＣＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含み、
該キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドのマウス部分は、内在性マウスＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、工程；
第２マウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように改変する工程であって、該内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座において、マウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；ならびに
該第１マウスおよび該第２マウスを交配して、そのゲノムに、キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドをコードする第１ヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスを生み出す工程であって、該遺伝子改変されたマウスは、該キメラヒト／マウスＭＨＣＩポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する工程を含む、方法。
前記ＭＨＣＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座であり、前記ヒトＭＨＣＩポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２であり、前記マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドを発現する、請求項２９に記載の方法。
前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、前記ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドの細胞外ドメインならびにＨ−２Ｋポリペプチドの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項３０に記載の方法。
前記第２ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列およびマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
キメラヒト／非ヒトＭＨＣＩポリペプチドをコードする配列を含むことによって特徴付けられる、核酸であって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含み、該キメラポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、核酸。
キメラヒト／非ヒト動物ＭＨＣＩポリペプチドであって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含み、該キメラポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒト動物ＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、ポリペプチド。
前記ＭＨＣＩポリペプチドは、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンに非共有結合的に結合している、請求項３４に記載のキメラヒト／非ヒト動物ＭＨＣＩポリペプチド。
ヒトＣＴＬエピトープを同定するための方法であって、
請求項１〜１２および１８〜２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、推定ＣＴＬエピトープを含む抗原に曝露する工程、
該非ヒト動物に免疫応答を惹起させる工程、
該エピトープに結合するＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬを該非ヒト動物から単離する工程、ならびに
該ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬによって結合された該エピトープを同定する工程
を含むことにより特徴付けられる、方法。
ヒト細胞によるその提示およびヒトリンパ球による結合がペプチド保有細胞の細胞傷害性をもたらす、ＨＬＡクラスＩ拘束ペプチドを同定するための方法であって、
請求項１〜１２および１８〜２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物を、目的のペプチドを含む分子に曝露する工程、
該目的のペプチドに結合するキメラヒト／非ヒトクラスＩ分子を発現する該非ヒト動物の細胞を単離する工程、
ＨＬＡクラスＩ拘束細胞傷害性を導き得るヒトリンパ球に対して該細胞を曝露する工程、および
ペプチド誘導型細胞傷害性を測定する工程
を含むことにより特徴付けられる、方法。
キメラヒト／非ヒト動物ＭＨＣＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことにより特徴付けられる単離された細胞であって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣＩポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含み、該キメラポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＭＨＣＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、細胞。
請求項１〜１２および１８〜２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する組織。