JP4830139B2 - クローン胚の作製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、このような技術的背景の下になされたものであり、遺伝子改変を施した場合であっても、高確率でクローン胚を発生させることのできる新規な核ドナー細胞を提供することを目的とする。
〔1〕核ドナー細胞として平滑筋様細胞を用いることを特徴とするクローン胚の作製方法。
〔2〕平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする〔1〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔3〕平滑筋様細胞が、ブタ由来の細胞であることを特徴とする〔1〕又は〔2〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔4〕平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする〔1〕乃至〔3〕のいずれかに記載のクローン胚の作製方法。
〔5〕以下の(1)〜(4)の工程を含むクローン胚の作製方法、
(1)除核した卵を調製する工程、
(2)平滑筋様細胞を調製する工程、
(3)除核した卵と平滑筋様細胞を融合させる工程、
(4)融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
〔6〕平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする〔5〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔7〕平滑筋様細胞が、ブタ由来の細胞であることを特徴とする〔5〕又は〔6〕に記載のクローン胚の作製方法。
〔8〕平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする〔5〕乃至〔7〕のいずれかに記載のクローン胚の作製方法。
〔9〕〔1〕乃至〔8〕のいずれかに記載のクローン胚の作製方法によって作製されたクローン胚を仮親動物の卵管又は子宮に移植し、クローン動物を得ることを特徴とするクローン動物の作製方法。
本発明のクローン胚の作製方法は、核ドナー細胞として平滑筋様細胞(Myoid細胞)を用いることを特徴とするものである。
平滑筋様細胞は、精細管基底膜、血管壁などに存在する扁平状の細胞で、精細管を構成する細胞の中で低いアルカリフォスファターゼ活性を示すことを指標として生殖細胞など他の細胞と区別することができる。
精細管基底膜由来の平滑筋様細胞は、動物から精巣を摘出し、これをコラゲナーゼとトリプシンで処理することにより、採取することができる。
血管壁由来の平滑筋様細胞は、Leik CE らの報告(Leik CE, Willey A, Graham MF, Walsh SW) Isolation and culture of arterial smooth muscle cells from human placenta Hypertension. 2004 Apr;43(4):837-40. Epub 2004 Feb 16)に従い、胎盤組織から切除した動脈組織を細切して、10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ修正イーグル培地中で4〜5週間培養することで得られる。
また、活性化処理後の卵には、極体放出抑制処理を行うのが好ましい。極体放出抑制処理は、サイトカラシンなどを用いて行うことができる。
〔実施例1〕 平滑筋様細胞の採取
Ogawa T et al. (Ogawa T, Arechaga M J, Avarbock M R, Brinster R) Transplantation of testis germ cells into mouse seminiferous tubules. Int.J.Dev.Biol.41:111-122 (1997)に報告されている様に滅菌したろ紙の上で摘出した精巣から脂肪塊と白膜を除去した。抗生物質(ストレプトマイシンおよびペニシリン各100μ/ml)を含むPBS-で洗浄した後、37℃に加温したコラゲナーゼ溶液(5mg/ml)中で細切した精巣を培養した。この際、定期的に転倒混和することで精細管から間質細胞を分離した。試験管の底に沈澱した精細管を残してコラゲナーゼ溶液を捨て、精細管をハンクス液で2回洗浄した。次に、細精管の組織塊の10倍量の0.25%トリプシン溶液と2倍量のDNase I溶液(5mg/ml)を加えて37℃のインキュベータ内で培養した。培養後良くピペッテイングを加えて可能な限り細胞をバラバラにした。等量のハンクス液を加えて遠心(1,000 rpm)した後で、細胞を適当な濃度に調整しコラーゲン処理したスラントネックフラスコ(75 cm2)で1晩培養した後に付着細胞のみを分離し平滑筋様細胞として培養・継代を行なった。
平滑筋様細胞の写真を図1(付着状態)及び図2(浮遊状態)に示す。
実施例1で採取した平滑筋様細胞をFBS添加DMEM培地で培養した。平滑筋様細胞は、初代細胞としては高い増殖性を示し、2% FBS添加DMEM (37℃, 5%CO2)および15% FBS添加DMEMにおけるdoubling timeはそれぞれ48hおよび24hrであり、胎児繊維芽細胞の増殖速度を上回った。また、継代に対する染色体の安定性を調べたところ、3代継代時で80%以上の細胞が正常な染色体数(38+XY)を保持していることが確かめられた。
遺伝子導入試薬Superfect(QIAGEN)を用いて平滑筋様細胞に対する外来遺伝子の導入効率を調べた。遺伝子導入試薬に対するDNAの比率は、Superfect のprotocolに従って検討し、平滑筋様細胞で最も効果的であった比率2:1に設定した(繊維芽細胞でも同じ結果)。導入するレポーター遺伝子は、マーカー遺伝子としてGFP遺伝子とNeomycine耐性遺伝子が組み込まれたpGreen Lantern-1(GIBCO BRL)を用い、 6 well plate(1well当たりおよそ 1×105個の細胞)に播種した細胞に対してトランスフェクションを試みた。トランスフェクション後は、抗生物質G418(50〜100ng/ml)を添加したDMAM培地で2週間培養を行い、恒常的にGFPを発現する細胞を選択した。
トランスフェクションの結果、供試細胞のおよそ2%のGFP陽性細胞(図3)が得られた。さらに選択培養を行うことで、供試細胞のおよそ0.2%のGFP発現細胞(図4)が確保できた(表1)。この作出効率は、6x105個の平滑筋様細胞にトランスフェクションを行うことによって、1回の核移植実験に用いる遺伝子導入細胞(1〜5x102個)が得られる計算となる。
平滑筋様細胞の核ドナー細胞としての可能性を検討するために、平滑筋様細胞核と体外成熟卵を用いてクローン胚を作出し、体外培養における胚盤胞期胚への発生率を調べた。
核ドナーとなる平滑筋様細胞は、あらかじめ0.5%血清添加DMEM培地中で血清飢餓培養を行った(細胞周期のG0同調)。
IVM(体外成熟卵)をレシピエント細胞質に用いた。ドナー細胞は、あらかじめ0.5%血清添加DMEM培地中で血清飢餓培養を行った。(細胞周期のG0同調)続いて、トリプシン・遠心処理した後、Hepes-buffered NCSU23を加えて懸濁し、実験に使用した。囲卵腔に挿入したドナー細胞とレシピエント細胞質を、電気刺激(28V)により融合した。融合後1.0〜1.5時間で、再構築胚に電気的活性化を付与した。核移植胚はPZM-5(IFP, 0410P)を基礎とする培地にて7日間培養し、正常分割率、胚盤胞形成率を記録した。なお、実験に用いたIVM卵の成熟率は84.7%(211/249)であった。
核移植の結果、クローン胚のおよそ10%(胎児繊維芽細胞:16%)が胚盤胞期胚へ発達し(図5)、平滑筋様細胞核が発生能力を保持していることが確認された。
24 well plateの1well当たり8.2x103個の平滑筋様細胞を播種して血清を0、0.5%、1%および15%の各濃度で添加したDMEM培地で細胞を培養して増殖性を比較検討した。
平滑筋様細胞は培地中の血清を完全に除くと増殖を停止したが、低血清濃度(0.5%)培地においては、若干の増殖性を示した。一方、高濃度(15%)の血清を添加した培地中では良く増殖し, doubling timeは24hに短縮した。
Claims (7)
- 核ドナー細胞としてブタ由来の平滑筋様細胞(Myoid細胞)を用いることを特徴とし、平滑筋様細胞が、扁平状の細胞で、低いアルカリフォスファターゼ活性を示すことを指標として生殖細胞と区別することができる細胞であるブタクローン胚の作製方法。
- 平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする請求項1に記載のブタクローン胚の作製方法。
- 平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする請求項1又は2に記載のブタクローン胚の作製方法。
- 以下の(1)〜(4)の工程を含むブタクローン胚の作製方法、
(1)除核したブタ由来の卵を調製する工程、
(2)ブタ由来の扁平状の細胞で、低いアルカリフォスファターゼ活性を示すことを指標として生殖細胞と区別することができる平滑筋様細胞(Myoid細胞)を調製する工程、
(3)除核したブタ由来の卵と平滑筋様細胞を融合させる工程、
(4)融合卵を培養し、ブタクローン胚を得る工程、 - 平滑筋様細胞が、精細管基底膜由来の細胞、又は血管壁由来の細胞であることを特徴とする請求項4に記載のブタクローン胚の作製方法。
- 平滑筋様細胞の遺伝子が改変されていることを特徴とする請求項4又は5に記載のブタクローン胚の作製方法。
- 請求項1乃至6のいずれか一項に記載のブタクローン胚の作製方法によって作製されたブタクローン胚を仮親となるブタの卵管又は子宮に移植し、クローンブタを得ることを特徴とするクローンブタの作製方法。
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