WO2005085438A1 - ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents

ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 Download PDF

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WO2005085438A1
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human
swelling
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collagen
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Satoshi Kanazawa
Takashi Okamoto
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Nagoya Industrial Science Research Institute
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    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases

Definitions

  • Transgenic non-human mammal that reproduces the pathology of human rheumatoid arthritis
  • the present invention relates to a transgenic non-human mammal. More specifically, the present invention relates to a transgenic non-human mammal that reproduces the pathology of human rheumatoid arthritis.
  • H-2 q or H-2 1 "Nono professional type mice, 0.1 symptoms of rheumatoid rheumatism is induced by subcutaneous injection of type II collagen 0.2mg (collagen-induced arthritis, CIA ). It is frequently used and are H-2 q Nono typically a professional type mice, after the initial immunization, arthritis Ru observed by performing the second immunization.
  • Rheumatoid arthritis is a disease mainly due to inflammation, bone destruction, bone adhesion, deformity, etc. in the joints and generally has a strong tonicity.
  • Human rheumatoid arthritis frequently causes vasculitis, which causes myocarditis, interstitial pneumonia, vasculitis in the periphery, etc. These complications are intractable and have specific therapeutic approaches. Development is eagerly awaited.
  • H-2 q Nono arthritis in CIA using professional type mice is completed in a short period of time, chronic as occurs in human rheumatoid arthritis, persistent and progressive symptoms, especially gradually inflammation progresses It is difficult to keep track of changes in the state of the disease from the early stage to the middle to late stage of rheumatoid arthritis over time.
  • model mice with H-2 q Nono professional type, etc. can not be said to be sufficient as a model animal for human rheumatoid arthritis.
  • creation of a model animal that reproduces the pathology of human rheumatoid arthritis ie, an animal that exhibits symptoms closer to that of human rheumatoid arthritis
  • Non-Special Publication 1 Feldmann M. 2001.Pathogenesis of arthritis: recent researcn progress. Nat Immunol. 9: 771.
  • Non-Patent Document 2 Wooley, PH, HS Luthra, JM Stuart, and CS David. 1981.Type II collagen induced arthritis in mice.I. Major histocompatibility complex 0-region) linkage and antibody correlates. J. Exp. Med. 154 : 688.
  • MHC class II specific histocompatibility complex class II
  • CIITA gene CIITA gene
  • Nono back cloth professional type mice back exchange arrangement
  • the model mice develop arthritis frequently was successfully established.
  • a rheumatism-like condition can be obtained by subcutaneously injecting a type II collagen concentration that is 1/20 lower than the type II collagen concentration normally used in the CII-induced arthritis model (collagen-induced arthritis, CIA). Inflammation was observed. That is, it was found that the transgenic mouse had high sensitivity to an antigen such as type II collagen by the joint-specific ectopic expression of the MHC class II gene group.
  • control mice children with the same genetic knock ground or with the same litter but without the transgene
  • the symptoms of arthritis gradually progressed over a long period of several weeks and several months. Therefore, the use of the transgenic mouse enables more accurate observation of the inflammatory process associated with rheumatoid arthritis. This means that the transgenic mouse is extremely effective as a model for human rheumatoid arthritis.
  • the genetic modification so that the CIITA gene is expressed by the action of the type II collagen promoter can be used as a model to satisfactorily reproduce the pathology of human rheumatoid arthritis.
  • the knowledge that animals can be produced was obtained.
  • the present invention has been completed based on such findings and provides the following configurations.
  • MHC class II transcriptional activation gene active region of MHC class II transcriptional activation gene, and mutant of MHC class II transcriptional activation gene (provided that master switch that controls expression of MHC class II gene group)
  • transgenic non-human mammal according to [5], wherein the rheumatoid arthritis-like disease state further shows one or more of the following (8) to (10): ) Vascular inflammation is observed; (9) Interstitial pneumonia or pleurisy is observed; (10) Anemia is observed.
  • the species of the non-human mammal (genus) 1S a mouse, a rat, a guinea pig, a hamster, a penguin, a dog, a cat, a hidge, a pig, a penguin, and a pecan, which is any one selected from the group consisting of: 1]
  • transgenic non-human mammal according to any one of [1] to [8], wherein the species (genus) of the non-human mammal is a mouse.
  • MHC class II transcription activation gene an active region of the MHC class II transcription activation gene, and a mutant of the MHC class II transcription activation gene (provided that a master switch that controls the expression of the MHC class II gene group)
  • Introducing exogenous DNA which is placed under the control of a type II collagen promoter, into cells in the early stage of development, wherein the DNA selected from the group consisting of
  • a method for producing a transgenic non-human mammal comprising:
  • a DNA sequence located downstream of the type II collagen promoter comprising an MHC class II transcription activation gene, an active region of an MHC class II transcription activation gene, and a mutant of the MHC class II transcription activation gene.
  • An expression vector comprising a DNA sequence selected from the group having the ability to have a terswitch function) and a type I collagen enzyme.
  • a method for screening a drug for human rheumatoid arthritis comprising the following steps (a)-(c):
  • (1)-(10) is improved: ) Swelling of joints at three or more places in the whole body; (2) Swelling of symmetric joints; (3)-Swelling of joints lasting more than one week; ( 4) Destruction, adhesion, or deformation of bone in limbs; (5) Infiltration of lymphoid cells; (6) Destruction of cartilage layer and
  • a method for screening a drug for human rheumatoid arthritis comprising the following steps (A)-(D):
  • FIG. 1 shows an example of a transgene that can be used for preparing the transgenic mouse of the present invention (a vector in which the CIITA gene is placed under the control of a type II collagen promoter—pCol2fluCIITANeof).
  • a transgene that can be used for preparing the transgenic mouse of the present invention
  • a vector in which the CIITA gene is placed under the control of a type II collagen promoter—pCol2fluCIITANeof a vector in which the CIITA gene is placed under the control of a type II collagen promoter—pCol2fluCIITANeof).
  • FIG. 2 shows the results of monitoring redness, swelling, and the like after secondary immunization of the transgenic mouse produced by the method of the example. After the second immunization, redness and swelling are observed only in the transgenic mouse for several weeks. Symptoms are progressive and progressively worse. Left: CIA-induced control mouse. No redness and swelling. Right: CIA-induced CIITA transgenic mice, redness and swelling are observed.
  • Fig. 4 is a graph showing a time-dependent change of a clinical score. Tally scores were calculated based on the criteria shown in the table of FIG. The onset time is about one week after the booster immunization according to the conventional CIA method. In comparison, low-dose (1/20 of the conventional method) immunization and booster immunization using transgenic mice gradually progress their symptoms as late as 5-6 weeks. The duration of symptoms disappears around 100 days in the conventional CIA method, whereas it lasts more than 150 days in transgenic mice.
  • FIG. 5 is a hematoxylin and eosin stained image (secondary immunization) of a joint. Obedience In the next CIA method, infiltration of lymphoid cells and destruction of cartilage layer and bone tissue in the joint part progress in one week (A: control and B: CIA). On the other hand, in the transgenic mouse, destruction of the cartilage layer and bone tissue observed by CIA at 1 week was not observed (C: Tg, 1 week). After this, lymphocytic cells gradually infiltrate (D: Tg, 4 weeks).
  • FIG. 6 is a hematoxylin and eosin staining image (10 weeks after the second immunization) in the joint of a transgenic mouse. At this time, destruction of the cartilage layer and bone tissue progresses, and bone deformation is observed. In addition, nodule-like tissue (A) and granulation tissue (B) with cell necrosis in the center are also observed.
  • FIG. 7 shows the measurement of changes in bone mineral density over time after low concentration immunization and booster immunization using transgenic mice.
  • the conventional CIA method shows a change in bone mineral density after a week, and shows no significant change thereafter, whereas in transgenic mice, not only the progression of inflammation but also the change of bone mineral density gradually progresses.
  • the first aspect of the present invention relates to a transgenic non-human mammal into which a predetermined exogenous DNA has been introduced (hereinafter, a transgenic non-mammal is referred to as a "TG animal" in the present specification). Both).
  • Transgenic non-human mammal means that exogenous DNA is introduced in the early stages of development, and all cells that constitute it will carry the exogenous DNA. And non-human mammals or their progeny (provided that they carry the exogenous gene).
  • the species (genus) of the mammal is not particularly limited, and includes mice, rats, guinea pigs, hamsters, egrets, dogs, cats, sheep, pigs, lions, and lions.
  • a mouse e.g., H- 2 q mouse DBA / J strain and B10.Q system, or H- 2 "" Mouse R10.RIII strain (these mice one force Japan Charles Riva is et available)
  • Ya rats e.g. Lewis (Rt w), WFC ( Rt °), DA (Rt a) rats (these rats are available Ichiriki Japan Charles Riva)) and rodents such as, most preferably a mouse It is.
  • the exogenous DNA in the present invention includes a class I transcription activator gene (hereinafter also referred to as "CIITA gene”) as a gene (transgene) used for the purpose of expression in a TG animal.
  • CIITA gene is a master switch that controls the expression of MHC class II genes. It is known to function as a horn (Steimle V., Otten LA, Zufferey M., and Mach B. 1993. Complementation and loning of an MHC class II transactivator mutated in hereditary MHC class II deficiency. Cell. 75: 135 .). Human, mouse, rat, etc. CIITA genes can be used.
  • NM_007575 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • a mutant thereof may be used instead of the CIITA gene.
  • the term “mutant” refers to a mutant having a sequence identical or homologous to a part of the CIITA gene, wherein a difference is observed between the entire sequence and the CIITA gene when compared with the sequence of the CIITA gene.
  • Examples of the mutant of the CIITA gene include a DNA sequence containing substitution, deletion, insertion, Z or addition of one or more bases based on the DNA sequence of the CIITA gene.
  • the corresponding DNA sequence can be mentioned as a mutant of the CIITA gene. As long as it has a function specific to the CIITA gene, that is, a master switch that controls the expression of the CIITA gene group, any mutant can be used as long as it has a function.
  • the mutant may be naturally occurring or artificially constructed using genetic engineering techniques.
  • the copy number of the introduced gene is not particularly limited. One is one hundred.
  • the TG animal of the present invention may be homozygous or heterozygous for the transgene.
  • the exogenous DNA of the TG animal of the present invention contains a type II collagen promoter in addition to the CIITA gene.
  • the origin (species) of the type I collagen promoter is not particularly limited, and a mouse or rat type II collagen promoter, a human type II collagen promoter, or the like can be used.
  • the sequence of the human type II collagen promoter see Nunez AM, Kohno K., Martin GR and Yamada Y. 1986. Promoter region of the human pro-al (II) -collagen gene. Gene, 44: 11.) Is shown in SEQ ID NO: 3.
  • rats SEQ ID NO: 4 shows the sequence of the type I collagen promoter (see Kohno K., Sullivant M., and Yamada Y. 1985.
  • the CIITA gene or its mutant (hereinafter referred to as “CIITA gene etc.”) is placed under the control of the type II collagen promoter.
  • “disposed under control” means that the CIITA gene is linked to the type II collagen promoter directly or via another sequence so that the type II collagen promoter acts to cause transcription of the CIITA gene and the like. The state that is being done.
  • the CIITA gene and the like are located downstream of and close to the type II collagen promoter.
  • Exogenous DNA Force It is preferable to include an enzyme that activates transcription of the CIITA gene and the like.
  • Enhancer refers to a sequence that acts directly or indirectly on a promoter to increase its transcriptional activity. In general, distant position forces also act on the promoter. The position of the enhancer in the foreign DNA may be upstream or downstream of the promoter.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can act on the type II collagen promoter used for exogenous DNA to enhance its transcription activity. For example, a type II collagen gene from human, mouse, rat and the like can be used. It is preferable that the origin of the type II collagen promoter and the origin of the enhancer are the same (for example, when a human-derived promoter is used, a human-derived enhancer is used).
  • rat type II coller as an example SEQ ID NO: 5 shows the sequence of Gengenhansa (AN: L48618). It goes without saying that the full length of the known sequence may be used as the type II collagen in the present invention, and only a partial region may be used as long as the action of the transcriptional activation is recognized. In addition, even if these known type II collagen enhancers are partially modified, they can be used as enhancers in exogenous DNA as long as the transcriptional activity is not significantly reduced.
  • partial modification refers to one or more bases (preferably one, one or two, 113, 114, 115, 115, 116, 7, 118 or 119) substitutions, deletions, insertions, and Z or additions. Such modifications may be made in multiple places.
  • the TG animal of the present invention exhibits a human rheumatoid arthritis-like disease state by administration of type II collagen.
  • the administration of type II collagen induces a human rheumatoid arthritis-like disease state.
  • type II collagen from humans, birds, birds, pigs, rats, deer, birds or mice can be used.
  • Type II collagen may be derived from the same species as the animal to which it is administered or from another species.
  • the TG animal of the present invention is not limited as long as it can be used for inducing a human rheumatoid arthritis-like disease state.
  • subcutaneous, intravenous, intraarterial, intramuscular, and intraperitoneal injection can be employed as a method of administering type II collagen (or other antigens that also induce the pathology of human rheumatoid arthritis).
  • two or more administrations at a time interval induce a human rheumatoid arthritis-like condition.
  • a single administration may be used.
  • the dose of type II collagen and the like should be set so as to be sufficient to induce a human rheumatoid arthritis-like disease state.
  • the dose per dose is O.OOlmg-0.05 mg, preferably O.Olmg-0.05 mg.
  • the H-2 q Nono professional type of mouse that is conventionally used as a model animal for human rheumatoid arthritis
  • TG animal of the present invention high! Compared to mice H-2 q Nono professional type used conventionally as a model for sensitive force human rheumatoid arthritis showing the human rheumatoid arthritis-like conditions.
  • Human rheumatoid arthritis is characterized by chronic, persistent and progressive symptoms.
  • CIA collagen-induced arthritis: CIA
  • the administration of type II collagen causes rapid progression of arthritis, and the chronic and persistent symptoms of human rheumatoid arthritis occur. And progressive symptoms were difficult to observe.
  • the rheumatoid arthritis-like symptoms gradually progress over a long period of time.
  • Rheumatoid arthritis changes to stage 1 (early), stage II (moderate), stage III (advanced), and stage IV (late).
  • stage I and stage II can be accurately grasped.
  • the TG animal of the present invention is selected from two or more of the above-mentioned (1)-(7) characteristics (for example, (1) and (2), (1)-(3), (1) It is preferable to have both (1) (4), (1) one (5), (4) and (5), (4) one (6)).
  • the TG animal of the present invention is most preferred and has all of the above-mentioned features (1) to (7) depending on the form.
  • (1)-(3) can be confirmed by evaluation of appearance (redness, swelling, etc. in limb joints), analysis by infrared thermodaraphy, and evaluation of follicular tissue by autopsy (see (3)). About the change over time).
  • (4) is appearance evaluation, X-ray image evaluation, nuclear magnetic resonance image evaluation It can be confirmed by titration, histological evaluation by necropsy, and the like.
  • (5)-(7) can be confirmed by time-lapse X-ray image evaluation, nuclear magnetic resonance image evaluation, histological evaluation by necropsy, etc.
  • Human rheumatoid arthritis generally involves the following complications. Therefore, accompanying such complications is an indicator that the condition of human rheumatoid arthritis is reproduced. That is, when the following complications are observed, it is considered that the TG animal reproduces human rheumatoid arthritis more.
  • TG animals of the present invention are selected from the above-mentioned (8)-(10) characteristics (for example, (8) and (9), (9) and (10), (8) And (10)).
  • the TG animal of the present invention is most preferably U, and has all of the above complications (8) to (10) depending on the form.
  • (8) and (9) can be confirmed by measurement of a blood inflammatory marker, etc., and mitotic evaluation. (10) can be confirmed by the hematocrit value, the average number of red blood cells, etc. in the blood cell count.
  • the method for producing a TG animal of the present invention includes a microinjection method in which DNA is directly injected into the pronucleus of a fertilized egg, a method using a retroviral vector, a method using ES cells, and the like. Can be used.
  • a microinjection method using a mouse will be described as a specific example.
  • a fertilized egg is first collected from the oviduct of a female mouse in which mating has been confirmed, and after culturing, a desired DNA construct (exogenous DNA) is injected into the pronucleus.
  • the form of the DNA construct is not particularly limited, but is preferably linear or circular from the viewpoint of introduction efficiency. Particularly preferably, a DNA construct prepared in a linear form is used. A DNA construct is prepared so that the gene to be introduced is efficiently integrated into the chromosome and that favorable expression can be ensured.
  • the DNA construct contains the CIITA gene and the like and the type II collagen promoter described above (if necessary, Enhancer sequences, selectable markers, replication origins, terminator sequences, etc.).
  • the fertilized egg after the injection operation is transplanted into the oviduct of a pseudopregnant mouse, and the transplanted mouse is bred for a predetermined period to obtain a pup mouse (F0).
  • force DNA such as the tail of the offspring mouse
  • Southern hybridization analysis slot plot (dot plot) analysis
  • PCR. Perform analysis, etc.
  • the identified transgenic individual is subjected to crossing with another mouse.
  • H- 2 q or H- 2 "" Nono professional type of mouse, MRL- 1 or sub-system MRL- lpr + mouse, NZB / KN mice, SKG mice, NOD mice, scid / scid mouse, RAG2-deficient mouse, Lewis rat, etc. (These mice can also be obtained from Charles River Japan, for example), or other transgenic animals obtained as a result of the above operation can do. Among them, it is preferable to use H- 2q haplotype mice.
  • H-2 q Nono professional type mice high to type II collagen, while indicating symptoms of human rheumatoid arthritis-like frequently, since it shows no sex difference, good human rheumatoid arthritis-like conditions Using this A TG mouse that reproduces the above is obtained.
  • H-2 q Roh, Purota Eve mice under normal breeding does not exhibit symptoms of human rheumatoid arthritis-like.
  • the TG animal of the present invention exhibits a human rheumatoid arthritis-like disease state.
  • the TG animal of the present invention is an effective means (model animal) for studying human rheumatoid arthritis.
  • the present invention provides, as a second aspect, a method for screening a drug for human rheumatoid arthritis using the above-mentioned TG animal.
  • the screening method of the present invention comprises the steps of inducing a human rheumatoid arthritis-like disease state in the TG animal of the present invention (step a), administering a test substance to the TG animal (step b), Examining whether the ability to improve the symptoms characteristic of rheumatoid arthritis is improved.
  • the term "drug for human rheumatoid arthritis” is intended to improve the symptoms (including preventing the occurrence of certain symptoms) of patients with rheumatoid arthritis.
  • drugs used prophylactically for those who may develop human rheumatoid arthritis, furthermore, the prevention of complications caused by human rheumatoid arthritis, or the evaluation of symptoms of complications It is used as a term that also includes drugs used for the purpose of improvement.
  • the drug obtained by using the screening method of the present invention can also be used for the purpose of preventing or treating complications of human rheumatoid arthritis.
  • step a typically, administration of type II collagen induces a human rheumatoid arthritis-like pathology.
  • CIITA CIITA introduced into the TG animal of the present invention to activate it, or CIITA is ectopically induced to produce in chondrocytes.
  • Any antigen that binds to the histocompatibility complex can be used to induce human rheumatoid arthritis-like pathology. That is, any antigenic substance that can cause the human rheumatoid arthritis or a substance capable of inducing the antigenic substance (inducing substance) can be used as the inducer.
  • the inducer include antigens such as type II collagen, proteoglycan, pristane (2,6,10,4-tetra
  • the dosage form (type of administration, dosage, etc.) of type II collagen and the like should be capable of inducing a human rheumatoid arthritis-like disease state in TG animals and not hindering subsequent operations.
  • an administration method for example, subcutaneous, intravenous, intraarterial, intramuscular, or intraperitoneal injection can be adopted.
  • the dose is, for example, O.OOlmg-0.05 mg, preferably O.Olmg-0.05 mg. If the dose is too small, a sufficient induction effect cannot be obtained. Conversely, if the dose is too large, undesired immunostimulation is added, which is not preferable. In order to reliably induce a rheumatoid arthritis-like disease state, it is preferable to administer type II collagen twice or more.
  • type II collagen for example, those derived from human, bird, mouse, pig, rat, or mouse can be used.
  • Type II collagen derived from various species is commercially available, and such commercially available collagen can be suitably used in the present invention.
  • type II collagen prepared by a biochemical method or a genetic engineering method according to a conventional method may be used.
  • Examples of the method of administering the test substance in step b include oral administration, intravenous, intraarterial, subcutaneous, intramuscular, and intraperitoneal injection.
  • Test compounds include organic compounds of various molecular sizes (nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphodalicerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, etc.)) )
  • lipids simple lipids, complex lipids (phosphodalicerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, etc.)
  • inorganic compounds can be used.
  • the test substance may be of natural origin or synthetic. In the latter case, an efficient screening system can be constructed using, for example, a combinatorial synthesis technique.
  • a cell extract, a culture supernatant, or the like may be used as a test substance.
  • Symptoms characteristic of human rheumatoid arthritis in step c include, for example, as described above: (1) swelling of joints at three or more places throughout the body; (2) swelling of symmetric joints (3) —Swelling of joints lasting more than one week is observed; (4) Destruction, adhesion, or deformation of bones in limbs; (5) Infiltration of lymphoid cells; (6) ) Destruction of cartilage layer and bone destruction due to granulation tissue formation. (7) Deformation of the joint progresses through early (stage I) and moderate (stage II). Typically, in step c, the change (improved power) of at least one of these symptoms is examined.
  • the combination is arbitrary.
  • the combination of (1) and (2), (1) one (3) Combination, (1) one (4) combination, (1) one (5) combination, (1) one (6) combination, (1) one (7) combination, (2) — A combination of (4), a combination of (3)-(6), a combination of (7) and (8), a combination of (7)-(9), and the like can be adopted.
  • step c it is preferable to examine more symptoms in step c, since the more symptoms improved, the more likely the effectiveness of the test substance will be. However, if a certain level of correlation is observed between the two symptoms, it is also possible to examine only the difference between the two symptoms.
  • the test substance has a therapeutic effect (including a preventive effect) on human rheumatoid arthritis (or its complications) and is a potential drug candidate.
  • the effect of a test substance can be determined by using the progression delay of a specific symptom as an index. That is, if there is a delay in the progress of the symptom of the test subject in step c, the test substance may be determined to be a potential candidate for a therapeutic drug for human rheumatoid arthritis.
  • the delay in progress of a specific symptom is used as an index
  • the progress of the symptom (criterion) when the test substance is not administered is measured in advance, and the effect of the test substance is determined based on this standard. Do it.
  • a group consisting of a TG animal in which a human rheumatoid arthritis-like disease state is induced and to which a test substance is administered (test group), and a group (control group) having the same TG animal strength and no test substance being administered
  • test group a group consisting of a TG animal in which a human rheumatoid arthritis-like disease state is induced and to which a test substance is administered
  • test group a group having the same TG animal strength and no test substance being administered
  • the test substance is administered to the test group
  • the degree of symptoms characteristic of human rheumatoid arthritis is compared between the test group and the control group.
  • the test substance is considered to be a drug for human rheumatoid arthritis.
  • the efficacy of the test substance can be determined easily and with high reliability.
  • the prepared TG animals may be divided into a test group and a control group, and each group may be administered with type II collagen or the like to induce a human rheumatoid arthritis-like disease state, or A plurality of prepared TG animals may be administered with type II collagen or the like to induce a human rheumatoid arthritis-like disease state, and then divided into a test group and a control group.
  • the number of individuals included in the test group and the control group is not particularly limited. Generally, the more individuals used, the more reliable the results will be. Involves difficulties in securing and operating individuals (including breeding). Therefore, for example, the number of individuals included in each group is set at 1 to 50, preferably 2 to 30, and more preferably 5 to 20.
  • the compound selected by the screening method of the present invention has a sufficient drug effect on human rheumatoid arthritis (or a complication thereof)
  • the compound may be used as it is as an active ingredient of the drug. it can.
  • the compound does not have a sufficient drug effect
  • the compound can be used as an active ingredient of a drug for human rheumatoid arthritis after a drug such as a chemical modification is applied to enhance the drug effect.
  • a drug such as a chemical modification
  • the same modification may be performed for the purpose of further increasing the drug effect.
  • the genetic engineering operations in this specification include, for example, Molecular loning (Third Edition, old bpnng Harbor Laboratory Press, New York) or ⁇ [ma current protocols in molecular biology (edited by Frederick). M. Ausubel et al., 1987).
  • transgenic mice into which the CIITA gene had been introduced were prepared according to Manipulating the mouse embryo, a manual, second edition, Bngid Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • a vector pCol2fluCIITANeof (FIG. 1) in which an MHC class II transcriptionally active gene (CIITA gene) was placed under the control of a type II collagen promoter was constructed.
  • This vector has the following features. 1) There is a human globin splicing sequence downstream of the rat type II collagen promoter of about lkbp. 2) Immediately below this, human CIITA cDNA containing the human CIITA polyA site is inserted, and rat type II collagen enhancer is placed behind this. 3) Further downstream of this, a cassette in which a non-mammalian cell-resistant drug, the Magi-Neo gene and a poly-A signal, are located immediately below the PGK promoter.
  • recombination DNA used for ordinary closing using Escherichia coli can be used.
  • This vector has a drug resistance gene such as ampicillin PBR322 was used.
  • It has a Pvul restriction enzyme site so that the vector portion of the backbone derived from E. coli can be removed in advance.
  • the vector constructed in the above procedure was treated with Pvu restriction enzyme, and the linearized vector excluding the vector portion of the backbone derived from E. coli was purified using DNA-binding beads and the like. This was used as a transgene for injection.
  • the transgene thus obtained was transfected into MG615 cells, a mouse cartilage culture cell line, and it was confirmed that MHC class II protein was expressed on the cell surface. Adjust the DNA to 30-100 g / ml with 10 mM Tris / 0.2 mM EDTA buffer and store.
  • the mouse strain used to produce the chimeric mouse was the F1 generation obtained by SDB / DBA crossover. Fertilized eggs were prepared according to a conventional method and used for injection.
  • HCG is punched according to a conventional method, and a fertilized egg is obtained from the ovary of the female mouse after mating. After confirming pronuclei and granule in the fertilized egg, use it for microinjection.
  • Microinjection uses about 200 fertilized eggs at a time. Inject DNA using a micromanipulator. The DNA for injection is finally adjusted to 3 / z g / ml, and then filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and used.
  • a female mouse for a foster mother who has been pseudo-pregnantly examined is prepared in advance. Embryos into which DNA has been injected can be transferred directly into the oviduct of the foster mother, or after one day of culture, embryos can be confirmed for division and transferred. The transfer is to transfer 25 to 35 embryos per animal.
  • the obtained transgenic mice were identified by Southern blotting. After weaning, DNA extraction was performed using the mouse tail and analyzed.
  • the probe used for Southern blotting was the coding region at the C-terminus of CIITA (human CIITA DNA sequence (SEQ ID NO: 1)). 2978-3329th). In this case, a gene having a copy number of about 10 was used for backcross with a DBA mouse.
  • the gene introduced into the mouse was identified by Southern blotting and PCR.
  • the resulting transgenic mice were backcrossed with DBA mice. Knock crosses have a heritage background that is repeated over seven generations so that the genetic background is at least 99% DBA.
  • the resulting transgenic mice (CIITA transgenic mice) were used in the following experiments.
  • the CIITA transgenic mouse prepared in Example 1 was immunized according to the following procedure. Mice having the same litter but not having the transgene and having the DRB / lj background were used as wild-type controls (6 to 8 weeks old).
  • O.Olmg type II collagen was subcutaneously injected at several sites.
  • a type II collagen (purity: 99%, manufactured by Collagen Technology Workshop), which was also purified from the articular cartilage, was dissolved in 0.01 M acetic acid and mixed with an equal amount of complete adjuvant (manufactured by DIFCO). .
  • O.Olmg type II collagen was subcutaneously injected at several sites again as a secondary immunization.
  • type II collagen mixed with incomplete adjuvant was used for the second immunization.
  • tissue section of the joint at this time showed a disease state in the early stage of human rheumatoid arthritis, including the infiltration of lymphocyte cells into the periphery of the joint (Fig. 5).
  • swelling in the limbs was progressing further after about two months.
  • Some individuals show mild remission. Forces Basically, bone destruction progresses, and ultimately damage such as bone deformation occurs (Figure 6).
  • Transgenic mice were immunized at low concentrations and boosted, and changes in bone mineral density over time were measured (FIG. 7).
  • changes in bone density are seen after 5 weeks and do not show significant changes thereafter, whereas in transgenic mice, not only the progression of inflammation but also the change in bone density gradually progresses.
  • mice are bred and experimented in the SPF state, but they are transferred to a conventional breeding environment or inoculated with Listeria monocytogenes etc. in the breeding environment, and secondary hyperimmune reactions etc. are induced in the rheumatic state Make sure that Check the side effects of administering rheumatic drugs.
  • the transgenic non-human mammal (TG animal) of the present invention satisfactorily reproduces a human rheumatoid arthritis-like disease state.
  • the TG animal of the present invention can be used as a model for human rheumatoid arthritis, for the development of drugs for human rheumatoid arthritis, elucidation of the pathogenic mechanism of human rheumatoid arthritis, and the like. It can also be used for screening drugs and verifying their effects on complications caused by human rheumatoid arthritis (such as vascular inflammation and arthritis pneumonia). Furthermore, it can be used as a model for the development of regenerative medicine treatment for advanced rheumatoid arthritis.

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Abstract

　ヒト関節リウマチの病態を良好に再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAを、発生初期の細胞に導入し、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を得る。

Description

明 細 書
ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジエニック非ヒト哺乳動物 技術分野
[0001] 本発明はトランスジエニック非ヒト哺乳動物に関する。詳しくは、ヒト関節リウマチの 病態を再現するトランスジエニック非ヒト哺乳動物に関する。
背景技術
[0002] 従来、ヒトリウマチ様関節炎 (ヒト関節リウマチ）に対する薬剤 (抗リウマチ薬)の開発 にお 、て II型コラーゲン関節炎モデルマウス等が利用されてきた。 H-2q又は H-21"ノヽ プロタイプのマウスでは、 0.1— 0.2mgの II型コラーゲンの皮下注射によって関節リウマ チの症状が誘導される (collagen-induced arthritis, CIA)。繁用されている H-2qノヽプロ タイプのマウスでは通常、初回免疫の後、 2次免疫を行なうことで関節炎が観察され る。 2次免疫後数日で関節局所における急性期炎症が起こり、これに引き続き一連の 慢性炎症が惹起されるなどのリウマチ様の症状を呈する。ヒト関節リウマチは、関節部 における炎症、骨破壊、骨の癒着、変形等を主体とする疾病であり、一般に強い慢 性化傾向を示す。またヒト関節リウマチは血管炎をしばしば合併するため、心筋炎、 間質性肺炎、抹消における血管炎等を引き起こす。これらの合併症は難治性であり、 その特異的な治療法の開発が切望されている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] H-2qノヽプロタイプのマウスを用いた CIAでは関節炎が短期間で完成し、ヒト関節リウ マチで起こるような慢性的、持続的及び進行性の症状、特に徐々に炎症が進行する 関節リウマチ初期のステージから中後期のステージへの病態変化を経時的に追う事 が難し 、。このように H-2qノヽプロタイプ等を用いたモデルマウスはヒト関節リウマチの モデル動物として十分なものとは言えない。このような事情から、よりヒト関節リウマチ の病態を再現するモデル動物（即ち、ヒト関節リウマチの病態により近い症状を呈す る動物）の創出が待ち望まれていた。
[0004] 非特千文献 1 : Feldmann M. 2001. Pathogenesis of arthritis: recent researcn progress. Nat Immunol. 9:771.
非特許文献 2 :Wooley, P. H.， H. S. Luthra, J. M. Stuart, and C. S. David. 1981. Type II collagen induced arthritis in mice. I. Major histocompatibility complex 0- region) linkage and antibody correlates. J. Exp. Med. 154:688.
課題を解決するための手段
以上の課題に鑑みて本発明者らは、遺伝子工学的手法によってヒト関節リウマチの モデル動物を作製することを試みた。ヒト関節リウマチでは、特定の組織適合性複合 体クラス II (本明細書にぉ 、て「MHCクラス II」とも 、う）が発症と有意に相関する。この ため異所的な MHCクラス II発現を介した抗原提示に基づく免疫反応がリウマチ発症 機序に深く関与すると考えられている。この点に着目し、関節軟骨特異的な発現を示 す、 II型コラーゲンのプロモーター領域を用い、 MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子 (class II transactivator gene,本明細書において「CIITA遺伝子」ともいう）を発現するトラン スジエニックマウスを作製した。この CIITAトランスジエニックマウスを、 II型コラーゲン 誘導性関節リウマチに反応性の高い H-2qノヽプロタイプのマウスにバッククロス (戻し交 配)することで、高頻度に関節炎を発症するモデルマウスを榭立することに成功した。 この CIITAトランスジエニックマウスでは、 CII誘導関節炎モデル (collagen-induced arthritis, CIA)に通常用いられる II型コラーゲン濃度に比べ 1/20の低い濃度のものを 皮下注射することでも、充分にリウマチ様の炎症が観察された。すなわち当該トランス ジェニックマウスは、 MHCクラス II遺伝子群の関節特異的な異所性発現により、 II型コ ラーゲン等の抗原に対して高い感受性を有することが判明した。この濃度では、コン トロールマウス（同じ遺伝的ノックグラウンドをもつ、または全く同じ一腹の子であるが 導入遺伝子を有しないもの)では関節リウマチ様の症状を示さない。一方、関節炎の 症状は数週間一数力月間と長い時間をかけ徐々に進行した。従って、当該トランスジ エニックマウスを用いれば関節リウマチに伴う炎症の過程をより正確に観察できる。こ のことはヒト関節リウマチのモデルとして当該トランスジエニックマウスが極めて有効で あることを意味する。
以上の成果から、 II型コラーゲンプロモーターの作用で CIITA遺伝子が発現するよ うに遺伝子改変することによれば、ヒト関節リウマチの病態を良好に再現するモデル 動物を作製できるとの知見が得られた。本発明はカゝかる知見に基づいて完成された ものであって以下の構成を提供する。
[1] MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子、 MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子の活性領域、 及び MHCクラス II転写活性化遺伝子の変異体 (但し、 MHCクラス II遺伝子群の発現を 制御するマスタースィッチ機能を有する）からなる群より選択される DNAが II型コラー ゲンプロモーターの制御下に配置された外来性 DNAが導入されたトランスジエニック 非ヒト哺乳動物。
[2] 前記外来性 DNA力 ¾型コラーゲンェンノヽンサ一を含む、 [1]に記載のトランスジ エニック非ヒト哺乳動物。
[3] II型コラーゲンの投与によってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、 [1]又は [2] に記載のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物。
[4] 1回あたりの II型コラーゲンの投与量を O.Olmg— 0.05mgとして 2回以上 II型コラ 一ゲンを投与することによってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、 [1]一 [3]のいず れかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[5] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の (1)一 (7)の中の一つ以上を示す病態 である、 [1]一 [4]の 、ずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物：
(1)全身にお ヽて三力所以上の関節の腫れが認められる； (2)対称性の関節の腫れ が認められる； (3)—週間以上継続する関節の腫れが認められる； (4)四肢にぉ 、て骨 の破壊、癒着、又は変形が認められる； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる； (6)肉 芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる; (7)関節の変形が初期 (ス テージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行する。
[6] 前記ヒト関節リウマチ様の病態力 さらに以下の (8)— (10)の中の一つ以上を示 す病態である、 [5]に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物: (8)血管炎症が認めら れる; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる; (10)貧血が認められる。
[7] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の (1)一 (7)の全てを示す病態である、 [1 ]一 [4]の 、ずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物： (1)全身にぉ 、て三力 所以上の関節の腫れが認められる; (2)対称性の関節の腫れが認められる; (3)—週間 以上継続する関節の腫れが認められる； (4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形 が認められる； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる； (6)肉芽組織形成による軟骨 層の破壊及び骨破壊が認められる; (7)関節の変形が初期 (ステージ I)及び中程度（ ステージ Π)を経て進行する。
[8] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の (1)一 (10)の全てを示す病態である、 [ 1]一 [4]の 、ずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物：（1)全身にぉ 、て三 ケ所以上の関節の腫れが認められる； (2)対称性の関節の腫れが認められる； (3)—週 間以上継続する関節の腫れが認められる； (4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変 形が認められる； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる； (6)肉芽組織形成による軟 骨層の破壊及び骨破壊が認められる; (7)関節の変形が初期 (ステージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行する; (8)血管炎症が認められる; (9)間質性肺炎又は胸膜炎 が認められる； (10)貧血が認められる。
[9] 前記非ヒト哺乳動物の種 (属） 1S マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ゥサギ 、ィヌ、ネコ、ヒッジ、ブタ、ゥシ及びゥマカもなる群より選択されるいずれかである、 [1 ]一 [8]の 、ずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[10] 前記非ヒト哺乳動物の種 (属）がマウスである、 [1]一 [8]のいずれかに記載の トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[11] MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子、 MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子の活性領域 、及び MHCクラス II転写活性化遺伝子の変異体 (但し、 MHCクラス II遺伝子群の発現 を制御するマスタースィッチ機能を有する）からなる群より選択される DNAが II型コラ 一ゲンプロモーターの制御下に配置された外来性 DNAを、発生初期の細胞に導入 するステップ、
を含むことを特徴とする、トランスジエニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[12] 前記外来性 DNA力 ¾型コラーゲンェンノヽンサ一を含む、 [11]に記載のトラン スジエニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[13] II型コラーゲンプロモーターと、
前記 II型コラーゲンプロモーターの下流に配置された DNA配列であって、 MHCクラ ス II転写活性化遺伝子、 MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子の活性領域、及び MHCクラ ス II転写活性化遺伝子の変異体 (但し、 MHCクラス II遺伝子群の発現を制御するマス タースィッチ機能を有する）力もなる群より選択される DNA配列と、 Π型コラーゲンェン ハンサ一と、を有する発現ベクター。
[14] 以下の (a)— (c)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方 法：
(a) [ 1]— [ 10]の 、ずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物にお 、てヒト関 節リウマチ様の病態を誘導するステップ；
(b)前記トランスジ ニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与するステップ；
(c)ヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ。
[15] 前記ステップ cにおいて、以下の (1)一 (10)の中から選択される一つ以上につ いて改善される力否かを判定する、 [14]に記載のスクリーニング方法: (1)全身にお いて三力所以上の関節の腫れが認められること; (2)対称性の関節の腫れが認められ ること; (3)—週間以上継続する関節の腫れが認められること; (4)四肢において骨の破 壊、癒着、又は変形が認められること; (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められること; (6) 肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること; (7)関節の変形が初 期 (ステージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行すること; (8)血管炎症が認められ ること; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること; (10)貧血が認められること。
[16] 以下の (A)— (D)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方 法：
(A)ヒト関節リウマチ様の病態が誘導された [1]一 [10]のいずれかに記載のトランス ジ ニック非ヒト哺乳動物をそれぞれ 1個体以上含む試験群及び対照群を用意する ステップ；
(B)前記試験群の各個体に被験物質を投与するステップ；
(C)ヒト関節リウマチに特徴的な症状の程度を前記試験群と前記対照群との間で比 較するステップ。
[17] 前記ステップ Cにおいて、以下の (1)一 (10)の中力 選択される一つ以上につ いて、前記試験群と前記対照群との間で比較する、 [16]に記載のスクリーニング方 法：（1)全身にぉ ヽて三力所以上の関節の腫れが認められること； (2)対称性の関節の 腫れが認められること； (3)—週間以上継続する関節の腫れが認められること； (4)四肢 において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること; (5)リンパ球系細胞の浸潤が認 められること； (6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること； (7) 関節の変形が初期 (ステージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行すること； (8)血管 炎症が認められること; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること; (10)貧血が認め られること。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、本発明のトランスジエニックマウス作成に用いることのできるトランスジー ンの一例（II型コラーゲンプロモーターの制御下に CIITA遺伝子が配置されたべクタ 一 pCol2fluCIITANeof)を示す。 1)約 lkbpのラット II型コラーゲンプロモーター部の下 流にヒトグロビンスプライシング配列がある。 2)この直下にヒト CIITAポリ Aサイトを含む ヒト CIITA cDNA(fluCIITA)が挿入され、この後方にラット II型コラーゲンェンハンサー が配置されている。 3)さらにこの下流に PGKプロモーター直下にほ乳類細胞非耐性 の薬剤マーカー Neo遺伝子およびポリ Aシグナルを配置したカセットが配置されて!ヽ る。 4)ノックボーンのベクターは、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を有する pBR322 である。
[図 2]図 2は、実施例の方法で作製したトランスジエニックマウスを 2次免疫した後、発 赤、腫脹等のモニターリングを行った結果を示す。 2次免疫後、トランスジエニックマウ スのみに数週間に渡り発赤、腫脹が観察される。症状は、進行性で序々に悪化する 。左： CIA誘導のコントロールマウス。発赤および腫脹が見られない。右： CIA誘導の CIITAトランスジヱニックマウス、発赤、腫脹が観察される。
[図 3]タリ-カルスコアの算定基準を示す。
[図 4]図 4はタリ-カルスコア（Clinical score)の経時的変化を示すグラフである。図 3 の表に示した基準でタリ-カルスコアを算出した。発症時期は、従来の CIA法では追 加免疫後約 1週である。これに比較して、トランスジエニックマウスを用いた低濃度 (従 来法の 1/20)の免疫および追加免疫では 5— 6週と遅ぐ徐々に症状が進行していく。 また症状の持続期間は従来法の CIA法では 100日前後で消退するのに対し、トランス ジエニックマウスでは 150日以上も持続する。
[図 5]図 5は、関節部分におけるへマトキシリン'ェォジン染色像（2次免疫）である。従 来の CIA法では 1週間で関節部分におけるリンパ球系細胞の浸潤、軟骨層および骨 組織の破壊が進んで 、る (A:コントロールおよび B： CIA)。一方トランスジエニックマウ スでは 1週間の時点で CIAで見られる軟骨層および骨組織の破壊等は見られな ヽ（C ： Tg、 1週）。この後、徐々にリンパ球系細胞の浸潤がおこる（D :Tg、 4週）。
[図 6]図 6は、トランスジエニックマウスの関節部分におけるへマトキシリン'ェォジン染 色像（2次免疫 10週間後）である。この時期軟骨層および骨組織の破壊が進行し、 骨変形が観察される。また合わせて中心部に細胞壊死が見られる結節様組織 (A)や 肉芽組織 (B)が観察される。
[図 7]図 7は、トランスジエニックマウスを用いた低濃度の免疫および追加免疫後にお ける、経時的な骨密度の変化を測定したものである。従来の CIA法では、骨密度変化 力 週間後に見られ、その後大きな変動を示さないが、一方トランスジ ニックマウス では、炎症の進行のみならず、骨密度変化も徐々に進行して行く。
発明を実施するための最良の形態
[0007] 本発明の第 1の局面は、所定の外来性 DNAが導入されたトランスジエニック非ヒト哺 乳動物（以下、トランスジヱニック非哺乳動物のことを本明細書では「TG動物」とも 、う )に関する。
「トランスジヱニック非ヒト哺乳動物 (TG動物）」とは、発生初期に外来性 DNAが導入 されること〖こよって、それを構成するすべての細胞が当該外来性 DNAを保有すること となる、ヒト以外の哺乳動物又はその子孫 (但し、当該外来性遺伝子を保有するもの） をいう。ここでの哺乳動物の種 (属）は特に限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハ ムスター、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、及びゥマ等を含む。好ましくはマウス (例えば H- 2qマウス DBA/J系統や B10.Q系統、又は H- 2""マウス R10.RIII系統（これらの マウスは日本チャールズリバ一力、ら入手可能である） )やラット（例えば Lewis(Rtw)、 WFC(Rt°)、 DA(Rta)ラット（これらのラットは日本チャールズリバ一力 入手可能である ) )などの齧歯目動物であり、最も好ましくはマウスである。
[0008] 本発明における外来性 DNAは、 TG動物内での発現を目的として使用される遺伝 子 (導入遺伝子）としてクラス Π転写ァクチべ一ター遺伝子（以下、「CIITA遺伝子」とも いう）を含む。 CIITA遺伝子は、 MHCクラス II遺伝子群の発現を制御するマスタースィ ツチとして機能することが知られている（Steimle V., Otten L.A., Zufferey M., and Mach B. 1993. Complementationし loning of an MHC class II transactivator mutated in hereditary MHC class II deficiency. Cell. 75:135.)。ヒト、マウス、ラットなどの CIITA遺伝子を使用することができる。尚、ヒトの CIITA遺伝子の配列（Genbank( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenDank/index.html) Accession No. (以" h、 AN)： X74301)を配列番号 1に示す。同様に、マウスの CIITA遺伝子の配列（AN:
NM_007575)を配列番号 2に示す。 CIITA遺伝子の代わりに、その変異体を使用して もよい。ここでの「変異体」とは、 CIITA遺伝子の一部と同一又は相同な配列を有する 力 その全配列を CIITA遺伝子の配列に比較した場合に両者の間に相違が認めら れるものをいう。 CIITA遺伝子の変異体として、 CIITA遺伝子の DNA配列を基準とした 場合に 1若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入、及び Z又は付加を含むことになる DNA配列を例示することができる。具体的には、 MHCクラス II転写活性ィ匕因子の活性 化領域（activation domain)をコードする DNA配列や、 MHCクラス II転写活性化遺伝 子が発現する際に選択的スプライシングによって生ずる特定の mRNAに対応する DNA配列を CIITA遺伝子の変異体として挙げることができる。 CIITA遺伝子に特異的 な機能、即ち CIITA遺伝子群の発現を制御するマスタースィッチとして働くと 、う機能 を有する限り、任意の変異体を使用することができる。尚、変異体は天然に存在する ものであっても、遺伝子工学的手法を用いて人工的に構築されたものであってもよい 導入遺伝子のコピー数は特に限定されるものではないが、例えば 1一 100である。ま た、本発明の TG動物は導入遺伝子に関してホモ接合体であってもへテロ接合体で あってもよい。
本発明の TG動物が保有する外来性 DNAは、 CIITA遺伝子にカ卩えて、 II型コラーゲ ンプロモーターを含む。 Π型コラーゲンプロモーターの由来 (種）は特に限定されず、 マウスやラットの II型コラーゲンプロモーター、或 、はヒトの II型コラーゲンプロモータ 一などを使用することができる。尚、ヒトの II型コラーゲンプロモーターの配列 (参照： Nunez A.M., Kohno K., Martin G.R. and Yamada Y. 1986. Promoter region of the human pro- al (II)- collagen gene. Gene, 44: 11.)を配列番号 3に示す。同様に、ラット の Π型コラーゲンプロモーターの配列 (参照： Kohno K., Sullivant M., and Yamada Y. 1985. Structure of the promoter of the rat type II procollagen gene. JBC, 260:4441.) を配列番号 4に示す。本発明における II型コラーゲンプロモーターとして、これら既知 の配列の全長を使用してよいことは言うまでもないが、プロモーター活性が認められ る限りにおいて一部の領域のみを使用してもよい。また、これら既知の II型コラーゲン プロモーターの一部を改変したものであっても、プロモーター活性の大幅な低下がな い限り、外来性 DNAにおけるプロモーターとして使用できる。ここでの「一部の改変」 とは、 1若しくは複数の塩基 (好ましくは 1個、 1若しくは 2個、 1一 3個、 1一 4個、 1-5 個、 1一 6個、 1一 7個、 1一 8個、又は 1一 9個））の置換、欠失、挿入、及び Z又は付 加が生ずることを 、う。複数の箇所でこのような改変が行われて 、てもよ!/、。
外来性 DNA内にぉ 、て CIITA遺伝子又はその変異体 (以下、「CIITA遺伝子等」と いう）は II型コラーゲンプロモーターの制御下に配置される。ここでの「制御下に配置 される」とは、 II型コラーゲンプロモーターが作用して CIITA遺伝子等の転写が生ずる ように、 CIITA遺伝子が直接又は他の配列を介して II型コラーゲンプロモーターに連 結されている状態をいう。通常は、 II型コラーゲンプロモーターの下流、かつ近接した 位置に CIITA遺伝子等が配置される。
外来性 DNA力 CIITA遺伝子等の転写を活性ィ匕するェンノヽンサ一を含むことが好 ましい。「ェンハンサー」とは、プロモーターに直接的又は間接的に作用してその転 写活性を高める配列をいう。ェンノヽンサ一は、一般に離れた位置力もプロモーターに 作用する。外来 DNA内におけるェンハンサ一の位置はプロモーターの上流側であつ ても下流側であってもよい。ェンノヽンサ一は、外来性 DNAに使用される II型コラーゲ ンプロモーターに作用してその転写活性を高めることができるものであれば特に限定 されない。例えばヒト、マウス、ラット等の II型コラーゲンェンノヽンサ一を使用することが できる。 II型コラーゲンプロモーターの由来と、ェンハンサ一の由来とを同一にするこ とが好ましいが（例えば、ヒト由来のプロモーターを使用する場合にはヒト由来のェン ハンサーを使用する）必ずしもその限りではない。このようなプロモーターとェンハン サ一の組み合わせを採用することによって高い転写活性が得られる力 これをさらに 異種の動物に使用する事も可能である。ェンノ、ンサ一の一例としてラットの II型コラー ゲンェンハンサ一の配列 (AN: L48618)を配列番号 5に示す。本発明における II型コラ 一ゲンェンハンサ一として、既知の配列の全長を使用してよいことは言うまでもない 力 転写活性ィ匕作用が認められる限りにおいて一部の領域のみを使用してもよい。ま た、これら既知の II型コラーゲンェンハンサ一の一部を改変したものであっても、転写 活性ィ匕作用の大幅な低下がない限り、外来性 DNAにおけるェンハンサ一として使用 できる。ここでの「一部の改変」とは、 1若しくは複数の塩基 (好ましくは 1個、 1若しくは 2個、 1一 3個、 1一 4個、 1一 5個、 1一 6個、 1一 7個、 1一 8個、又は 1一 9個））の置換 、欠失、挿入、及び Z又は付加が生ずることをいう。複数の箇所でこのような改変が 行われていてもよい。
本発明の TG動物はその特徴の一つとして、 II型コラーゲンの投与によってヒト関節 リウマチ様の病態を呈する。換言すれば、本発明の TG動物では II型コラーゲンの投 与の結果としてヒト関節リウマチ様の病態が誘導される。例えば、ヒト、トリ、ゥシ、ブタ 、ラット、シカ、 -ヮトリ又はマウス由来等の II型コラーゲンを使用することができる。 II 型コラーゲンは、それを投与する動物と同種由来のものであっても他の種由来のもの であってもよい。尚、 II型コラーゲン以外であっても、本発明の TG動物においてヒト関 節リウマチ様の病態の誘導に使用できるものであればその限りではない。 II型コラー ゲン (又は同様にヒト関節リウマチの病態を誘導させるその他の抗原)の投与方法とし ては皮下、静脈内、動脈内、筋肉、腹腔内注射などを採用できる。典型的には、時間 的間隔を置いた二回以上の投与によってヒト関節リウマチ様の病態が誘導される。伹 し、十分な誘導作用が認められる限り、一回の投与であってもよい。また、ヒト関節リウ マチ様の病態を誘導するのに十分な量なるように II型コラーゲン等の投与量を設定 する。具体的には例えば、 TG動物がマウスであって II型コラーゲンを投与する場合に は例えば 1回あたりの投与量を O.OOlmg— 0.05mg、好ましくは O.Olmg— 0.05mgとする 。尚、ヒト関節リウマチのモデル動物として従来使用されている H-2qノヽプロタイプのマ ウスでは一般に、このような少量の II型コラーゲンの投与ではヒト関節リウマチ様の病 態を良好に誘導することはできない。換言すれば、本発明の TG動物は、ヒト関節リウ マチ様の病態を示す感受性力 ヒト関節リウマチのモデルとして従来使用されている H-2qノヽプロタイプのマウスに比較して高!、。 良好な免疫反応を引き起こす目的で、各回の投与を全身の複数箇所に分けて実 施することが好ましい。
ヒト関節リウマチは慢性的、持続的及び進行性の症状によって特徴づけられる。こ れまでに開発された、ヒト関節リウマチの症状を示すモデルマウス（collagen-induced arthritis: CIA)では、 II型コラーゲンの投与によって関節炎が急激に進行し、ヒト関節 リウマチでおこる慢性的、持続的及び進行性の症状を観察し難いものであった。これ に対して本発明の TG動物では、ヒト関節リウマチ様の症状が長い時間をかけて徐々 に進行する。ヒト関節リウマチは、ステージ 1 (初期）、ステージ II (中程度）、ステージ III (高度）、及びステージ IV (末期）へと変化する。本発明の TG動物では、このようなヒト 関節リウマチに類似した症状の変化が認められる。特に、ステージ I及びステージ IIの 状態を正確に把握することができる。
ここで、 「ヒト関節リウマチ様の病態」を特徴づける具体的な症状ないし所見を以下 に列挙する。
(1)全身にお 、て三力所以上の関節の腫れが認められる。
(2)対称性の関節の腫れが認められる。
(3)—週間以上継続する関節の腫れが認められる。
(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる。
(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる。
(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる。
(7)関節の変形が初期 (ステージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行する。
以上の (1)一 (7)の特徴をより多く備えるほどヒト関節リウマチを再現した病態となる。 従って、本発明の TG動物が上記 (1)一 (7)の特徴の中から選択される二つ以上 (例え ば、（1)及び (2)、（1)一 (3)、（1)一 (4)、（1)一 (5)、（4)及び (5)、（4)一 (6))を併せ持つことが 好ま 、。本発明の TG動物は最も好ま 、形態にぉ 、て上記 (1)一 (7)の特徴の全て を併せ持つ。
尚、（1)一 (3)は外見（四肢関節における発赤、腫脹など)の評価、赤外線サーモダラ フィ一による分析、剖検による糸且織学的評価等によって確認することができる（(3)に ついては経時的な変化を調べる)。（4)は外見評価、 X線像評価、核磁気共鳴画像評 価、剖検による組織学的評価等によって確認することができる。（5)— (7)は経時的な X 線像評価、核磁気共鳴画像評価、剖検による組織学的評価等によって確認すること ができる。
[0013] ヒト関節リウマチでは一般に、以下に示す合併症を伴う。従って、このような合併症 を伴うことは、ヒト関節リウマチ様の病態を再現していることの指標となる。即ち、以下 の合併症が認められる場合には、よりヒト関節リウマチを再現した TG動物であると ヽ える。
(8)血管炎症が認められる。
(9)間質性肺炎、胸膜炎等が認められる。
(10)貧血等が認められる。
以上の (8)— (10)の合併症をより多く伴うほどヒト関節リウマチを再現した病態となる。 従って、本発明の TG動物が上記 (8)— (10)の特徴の中から選択される二つ以上 (例え ば、（8)及び (9)、（9)及び (10)、（8)及び (10))を伴うことが好ましい。本発明の TG動物は 最も好ま U、形態にぉ 、て上記 (8)— (10)の合併症の全てを伴う。
尚、（8)および (9)は血中炎症系マーカー等の測定、糸且織学的評価等によって確認 することができる。（10)は血球算定の際へマトクリット値、平均赤血球数等によって確 認することができる。
[0014] 本発明の TG動物の作出方法としては、受精卵の前核に直接 DNAの注入を行うマイ クロインジヱクシヨン法、レトロウイルスベクターを利用する方法、 ES細胞を利用する方 法などを用いることができる。以下では、本発明の TG動物の作出方法として、マウス を用いたマイクロインジェクション法を具体例として説明する。
マイクロインジェクション法では、まず交尾が確認された雌マウスの卵管より受精卵 を採取し、そして培養した後にその前核に所望の DNAコンストラクト（外来性 DNA)の 注入を行う。 DNAコンストラクトの形態は特に限定されないが、導入効率の点から直 鎖状又は環状であることが好ましい。特に好ましくは、直鎖状に調製した DNAコンスト ラクトを使用する。導入目的の遺伝子が効率的に染色体に組み込まれ、且つその良 好な発現が確保できるように DNAコンストラクトを調製する。 DNAコンストラクトは、上 述の CIITA遺伝子等及び II型コラーゲンプロモーターを含む (必要に応じて適当なェ ンハンサー配列、選択マーカー、複製開始点、ターミネータ一配列等を含む)。 注入操作を終了した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、移植後のマウスを所 定期間飼育して仔マウス (F0)を得る。仔マウスの染色体に導入遺伝子が適切に組 込まれていることを確認するために、仔マウスの尾など力 DNAを抽出し、サザンハイ ブリダィゼーシヨン分析、スロットプロット（ドットプロット)分析、 PCR分析等を実施する。 次に、同定されたトランスジエニック個体を他のマウスとの交配に供する。ここでの「 他のマウス」としては、 H- 2q若しくは H- 2" "ノヽプロタイプのマウス、 MRL- 1若しくは亜系 MRL— lpr+マウス、 NZB/KNマウス、 SKGマウス、 NODマウス、 scid/scidマウス、 RAG2- deficientマウス、又は Lewisラット等（これらのマウスは例えば日本チャールズ リバ一力も入手することが可能である）、或いは以上の操作の結果得られた他のトラン スジエニック個体等を使用することができる。中でも、 H-2qハプロタイプのマウスを使 用することが好ま U 、。 H-2qノヽプロタイプのマウスは II型コラーゲンに対し高 、頻度で ヒト関節リウマチ様の症状を示す一方、雌雄差を示さないことから、これを使用すれば ヒト関節リウマチ様の病態を良好に再現する TGマウスが得られる。尚、 H-2qノ、プロタ イブのマウスは、通常飼育下ではヒト関節リウマチ様の症状を示さない。また、本トラ ンスジーン導入後も同様に誘導しない限りヒト関節リウマチ様の症状を示さない。 上記の通り、本発明の TG動物はヒト関節リウマチ様の病態を呈する。従って、本発 明の TG動物は、ヒト関節リウマチを研究する上で有効な手段 (モデル動物）となる。特 に、本発明の TG動物を用いることによって、ヒト関節リウマチ用の薬剤の探索及び効 果の検証などを行え、ひいてはヒト関節リウマチの治療法の確立を図ることができる。 そこで本発明は第 2の局面として、上記の TG動物を用いたヒト関節リウマチ用薬剤の スクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は、上記本発明の TG動物においてヒト関節リウマチ様 の病態を誘導するステップ (ステップ a)と、 TG動物に被験物質を投与するステップ (ス テツプ b)と、 TG動物においてヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善される力否かを 調べるステップ (ステップ とを含む。
尚、本明細書において「ヒト関節リウマチ用薬剤」とは、ヒト関節リウマチを発症して V、る患者に対してその症状の改善 (ある症状の発生を予防することも含む)などを目 的として使用される薬剤はもとより、ヒト関節リウマチを発症するおそれのある者に対し て予防的に使用される薬剤、さらにはヒト関節リウマチに起因する合併症の予防、又 は合併症の症状の改善を目的として使用される薬剤をも含む用語として用いられる。 このように、本発明のスクリーニング方法を利用して得られる薬剤は、ヒト関節リウマチ の合併症の予防又は治療を目的として使用することもできる。
[0016] ステップ aでは、典型的には II型コラーゲンの投与によってヒト関節リウマチ様の病態 が誘導される。但し、 II型コラーゲン以外であっても、本発明の TG動物に導入された CIITAに直接または関節的に作用してこれを活性ィ匕するもの、又は CIITAが異所的 に軟骨細胞において産生誘導した組織適合性複合体に結合するような抗原であれ ばヒト関節リウマチ様の病態の誘導に使用できる。すなわち、ヒト関節リウマチにおい てその原因となり得る任意の抗原物質またはその抗原物質を誘導できる物質 (誘導 物質)を誘導剤として使用することができる。ここでの誘導剤の具体例としては、 II型コ ラーゲン等の抗原の他、プロテオグリカン、プリスタン（2,6,10,4-tetra
methylpentodecan),カチォニック抗原、超音波処理済スタフイロコッカル細胞壁、リポ ポリサッカライドを挙げることができる。 II型コラーゲン等の投与形態 (投与方法、投与 量など）は、 TG動物においてヒト関節リウマチ様の病態を誘導でき、且つ以降の操作 に支障のないものとする。投与方法としては例えば皮下、静脈内、動脈内、筋肉、又 は腹腔内注射を採用することができる。また投与量は、 TG動物がマウスであって II型 コラーゲンを投与する場合には例えば 1回あたりの投与量を O.OOlmg— 0.05mg、好ま しくは O.Olmg— 0.05mgとする。投与量が少なすぎる場合には十分な誘導効果が得ら れない。これとは逆に投与量が多すぎる場合には必要以上の免疫刺激が加わり好ま しくない。ヒト関節リウマチ様の病態を確実に誘導するため、 II型コラーゲンの投与を 2 回以上実施することが好まし 、。
[0017] II型コラーゲンは例えばヒト、トリ、ゥシ、ブタ、ラット、又はマウス由来のものを使用で きる。様々な種由来の II型コラーゲンが市販されており、本発明ではこのような市販の ものを好適に使用することができる。勿論のこと、常法に従い生化学的手法や遺伝子 工学的手法などを用いて調製した II型コラーゲンを使用してもよい。
以下に Π型コラーゲンの投与によるヒト関節リウマチ様病態の誘導方法の具体例（ TG動物がマウスである場合の一例）を示す。まず、初回免疫として O.Olmgの II型コラ 一ゲン (例えばゥシ関節軟骨から常法に従って抽出 ·精製した高純度 (例えば純度 99 %)の II型コラーゲンを 0.01M酢酸に溶解し、等量の完全アジュバントと混合したもの） を数力所に分けて TGマウスに皮下注射する。 3週間飼育した後、二次免疫として再 度 O.Olmgの II型コラーゲン (不完全アジュバントを用いる以外は初回免疫の場合と同 様に調製したもの）を数力所に分けて TGマウスに皮下注射する。二次免疫の後、四 肢関節における発赤、腫脹等をモニターし、ヒト関節リウマチ様症状が誘導されたこと を確認する。必要に応じて剖検により合併症の有無を調べる。
[0018] ステップ bにおける被験物質の投与方法としては経口投与や静脈内、動脈内、皮下 、筋肉、又は腹腔内注射等を例示することができる。
被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物 (核酸、ペプチド、タンパク質、 脂質 (単純脂質、複合脂質 (ホスホダリセリド、スフインゴ脂質、グリコシルグリセリド、セ レブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等））又は無 機化合物を用いることができる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によ るものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用し て効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清など を被験物質として用いてもょ 、。
[0019] ステップ cにおけるヒト関節リウマチに特徴的な症状とは例えば、上述したように (1)全 身において三力所以上の関節の腫れが認められる； (2)対称性の関節の腫れが認め られる； (3)—週間以上継続する関節の腫れが認められる； (4)四肢において骨の破壊 、癒着、又は変形が認められる； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる； (6)肉芽組織 形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる； (7)関節の変形が初期 (ステージ I )及び中程度 (ステージ II)を経て進行する；である。典型的には、ステップ cではこれら の症状の少なくとも一つについてその変化（改善される力否力 が調べられる。
これらの症状に加えて又はこれらの症状の代わりに、ヒト関節リウマチの合併症 (例 えば、上述したように (8)血管炎症が認められる; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が認めら れる； (10)貧血が認められる）を調べることにしてもよい。複数の症状等について調べ る場合におけるその組合わせは任意であって、例えば (1)と (2)の組合わせ、（1)一 (3) の組合わせ、（1)一 (4)の組合わせ、（1)一 (5)の組合せ、（1)一 (6)の組合わせ、（1)一 (7) の組合せ、（2)— (4)の組合せ、（3)— (6)の組合せ、（7)及び (8)の組合せ、（7)— (9)の組 合せなどを採用できる。一般には改善される症状が多くなればそれだけ被験物質の 有効性が高まると考えられることから、ステップ cにおいてより多くの症状を調べること が好ましい。但し、二つの症状の間で一定以上の相関が認められる場合には、当該 二つの症状の 、ずれかのみを調べることとしてもよ 、。
[0020] ステップ cにおいて検査対象の症状の改善が認められれば、被験物質がヒト関節リ ゥマチ (又はその合併症）に対する治療効果 (予防効果を含む)を有し、有力な薬剤 候補であると判定できる。また、特定の症状の進行遅延を指標として被験物質の効 果を判定することもできる。即ち、ステップ cにおいて検査対象の症状の進行に遅延 が認められれば、被験物質がヒト関節リウマチ用治療薬の有力な候補であると判定し てもよい。このように特定の症状の進行遅延を指標とする場合には、被験物質を投与 しない場合の当該症状の進行推移 (基準)を予め測定しておき、この基準に照らして 被験物質の効果を判定すればょ 、。
[0021] 好ましくは、ヒト関節リウマチ様の病態を誘導した TG動物からなり被験物質が投与さ れる群 (試験群)と、同様の TG動物力 なり被験物質が投与されな 、群 (対照群)を 用意し、試験群に被験物質を投与した後にヒト関節リウマチに特徴的な症状の程度 を試験群と対照群との間で比較する。比較の結果、例えば試験群では対照群よりも 検査対象の症状が改善されて 、ること又は症状の進行が遅延して 、ることが認めら れれば、被験物質がヒト関節リウマチ用薬剤の有力な候補であると判定できる。この ように被験物質を投与する群 (試験群)と投与しな 、群 (対照群)とを比較することによ れば、被験物質の有効性を容易に且つ高い信頼性で判定することができる。尚、用 意した複数の TG動物をまず試験群と対照群とに分け、そして各群に対して II型コラー ゲン等の投与を行いヒト関節リウマチ様の病態を誘導することにしても、或いは用意し た複数の TG動物に対して II型コラーゲン等の投与を行ってヒト関節リウマチ様の病態 を誘導した後に試験群と対照群とに分けることにしてもよい。
試験群及び対照群に含まれる個体数は特に限定されない。一般に使用する個体 数が多くなるほど信頼性の高い結果が得られるが、多数の個体を同時に取り扱うこと は使用する個体の確保や操作 (飼育を含む)の面で困難を伴う。そこで例えば各群 に含まれる個体数を 1一 50、好ましくは 2— 30、さらに好ましくは 5— 20とする。
[0022] 本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物がヒト関節リウマチ (又はそ の合併症）に対して十分な薬効を有する場合には、当該化合物をそのまま薬剤の有 効成分として使用することができる。一方で十分な薬効を有しない場合には化学的 修飾などの改変を施してその薬効を高めた上で、ヒト関節リウマチ用薬剤の有効成分 として当該化合物を使用することができる。勿論、十分な薬効を有する場合であって も、更なる薬効の増大を目的として同様の改変を施してもよい。
[0023] 特に記載のな 、限り、本明細書における遺伝子工学的操作は例えば Molecular し loning (Third Edition, し old bpnng Harbor Laboratory Press, New York)或 ヽ【ま Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987 )を参考にして行うことができる。
実施例 1
[0024] MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子 (CIITA遺伝子）を導入したトランスジエニックマウス の作製
以下に示すように、 CIITA遺伝子を導入したトランスジエニックマウスを Manipulating the mouse embryo, a laooratory manual, second edition, Bngid Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って作製した。
1.遺伝子導入用ベクター (外来性 DNA)の調製
以下の手順で、 II型コラーゲンプロモーターの制御下に MHCクラス II転写活性ィ匕遺 伝子（CIITA遺伝子）が配置されたベクター pCol2fluCIITANeof (図 1)を構築した。本 ベクターは以下の特徴を有する。 1)約 lkbpのラット II型コラーゲンプロモーター部の 下流にヒトグロビンスプライシング配列がある。 2)この直下にヒト CIITAポリ Aサイトを含 むヒト CIITA cDNAが挿入され、この後方にラット II型コラーゲンェンハンサ一が配置さ れている。 3)さらにこの下流に PGKプロモーター直下にほ乳類細胞非耐性の薬剤マ 一力一 Neo遺伝子およびポリ Aシグナルを配置したカセットが配置されている。 4)バ ックボーンのベクターは、大腸菌を用いた通常のクローユングに用いられる組換え用 の DNAを使用出来る。本ベクターでは、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を有する PBR322を用いた。 5)予め大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除けるよう Pvul制限酵素サイトを有する。
最終的には、以上の手順で構築したベクターを Pvu淛限酵素処理し、大腸菌由来 のバックボーンのベクター部分を除き直鎖状としたものを、 DNA結合性を示すビーズ 等を用いて精製し、これをインジェクション用のトランスジーンとした。尚、得られたトラ ンスジーンをマウス軟骨培養細胞株である MG615細胞に遺伝子導入し、細胞表面上 に MHCクラス IIタンパク質が発現する事を確認している。 DNAは、 10mM Tris/0.2mM EDTA緩衝液にて 30— 100 g/mlに調節し保存しておく。
[0025] 2.外来性 DNAの導入
2-1.マウスの準備
キメラマウスを作製するために用いられるマウスの系統は、 SDB/DBAの掛け合わ せにより得られる F1世代とした。常法に従い受精卵を調製してインジェクションに用い た。
[0026] 2-2.受精卵の準備
常法に従い HCGを打ち、交配後のメスマウス卵巣より受精卵を得る。受精卵内 pronucleiおよび granuleを確認後、マイクロインジェクションに用いる。
[0027] 2-3.受精卵前核へのマイクロインジヱクシヨン
マイクロインジェクションは、一回当たり 200個程の受精卵を用いる。マイクロマ二ピュ レーターを用い DNAを注入する。注入用の DNAは、最終的に 3 /z g/mlに調節後、 0.22 μ mのフィルター濾過し、これを用いる。
[0028] 2-4.卵管内移植
予め偽妊診した仮親用のメスマウスを準備する。 DNAを注入した胚は、直接仮親の 卵管に移植するか、または一日培養後、胚の分裂を確認しこれを移植する。移植は 、一匹当たり 25— 35個の胚を移植する。
[0029] 3. トランスジエニックマウスの同定
得られたトランスジエニックマウスは、サザンブロッテイング法により同定した。離乳後 、マウスの尾を用い DNA抽出を行い、これを解析した。サザンブロッテイングに用い るプローブは、 CIITAの C末端のコーディング領域（ヒト CIITA DNA配列（配列番号 1) 中 2978— 3329番目）を用いた。またこの際遺伝子のコピー数を約 10程度のものを DBAマウスとのバッククロスに用いた。マウスに導入された遺伝子は、サザンブロッテ イング法および PCR法により同定した。
[0030] 4.交配
得られたトランスジエニックマウスを DBAマウスとバッククロスさせた。ノ ッククロスは、 遺伝的な背景が 99%以上 DBAとなるように 7世代以上に渡り繰り返す事で系統を遺 伝的なバックグランドを純ィ匕した。その結果得られたトランスジエニックマウス（CIITAト ランスジェニックマウス）を以下の実験に用いた。
実施例 2
[0031] トランスジエニックマウスを用いた関節リウマチの誘導試験
1.免疫誘導
実施例 1で作製した CIITAトランスジエニックマウスに以下の手順で免疫した。尚、 全く同じ一腹の子であるが導入遺伝子を有しな 、もの、 DRB/ljバックグランドを有す るマウスを野生型コントロール (6— 8週齢）として用いた。
まず初回免疫として O.Olmgの II型コラーゲンを数力所に分けて皮下注射した。尚、 ゥシ関節軟骨力も精製した II型コラーゲン (純度 99%、コラーゲン技術研修会製)を 0.01M酢酸に容解し、等量の完全アジュバント (DIFCO社製）と混合したものを使用し た。
初回免疫から 3週間後、 2次免疫として再度 O.Olmgの II型コラーゲンを数力所に分け 皮下注射した。尚、 2次免疫には、不完全アジュバントと混合した II型コラーゲンを使 用した。
[0032] 2.関節リウマチ様症状の確認
2次免疫後、四肢関節における発赤、腫脹等のモニターリングを行った。その結果 、 2次免疫後通常の CIAでは数日で四肢関節における強い発赤および腫脹が観察さ れるが、本トランスジエニックマウスでは四肢における発赤、腫脹が数週間以上に渡り 見られた（図 2)。コントロールマウスにおいてはほとんどその様な症状を観察できなか つた。尚、図 3に示した基準でタリ-カルスコアを計算し、その結果を図 4に示す。 一方、赤外線サーモグラフィ一等によるモニターリングによって本トランスジエニック マウスでは関節炎が進行していることが明らかであった。すなわち関節炎が長期間に 渡り序々に進行する事が分力つた。またこの時期の関節における組織切片を見るとリ ンパ球系の細胞の関節周辺への浸潤が見られるなど、ヒト関節リウマチの初期におけ る疾病状態が観察された（図 5)。モニターリングをさらに継続すると 2ヶ月程度を経て 四肢における腫脹がさらに進行していた。個体によっては、軽度の寛解を示すものも ある力 基本的には骨破壊が進むために最終的には骨変形などの障害が起きてい た（図 6)。
トランスジヱニックマウスに対して低濃度の免疫及び追加免疫を施し、経時的な骨 密度の変化を測定した (図 7)。従来の CIA法では、骨密度変化が 5週間後に見られ、 その後大きな変動を示さないが、一方トランスジエニックマウスでは、炎症の進行のみ ならず、骨密度変化も徐々に進行して行く。
この他、剖検および血液検査により全体の合併症を検索する。例えば、リウマチに よる 1次的な呼吸器病変、血管炎、赤血球数の減少を確認する。また通常マウスは SPF状態で飼育および実験を行なっているがこれをコンベンショナルな飼育環境に 移す、または飼育環境下でリステリア菌等を接種し、リウマチ状態において 2次的な 過剰免疫反応等が誘発さることを確認する。力 tlえて、リウマチ治療薬の投与に対する 副作用を確認する。
産業上の利用可能性
[0033] 本発明のトランスジエニック非ヒト哺乳動物 (TG動物）はヒト関節リウマチ様の病態を 良好に再現する。本発明の TG動物は、ヒト関節リウマチのモデルとして、ヒト関節リウ マチに対する薬剤の開発ゃヒト関節リウマチの発症機構の解明などに利用され得る。 また、ヒト関節リウマチに起因する合併症 (血管炎症や関節性肺炎など）に対する薬 剤のスクリーニングやその効果の検証にも利用され得る。更には、進行した関節リウ マチに対する再生医学的治療法の開発のためのモデルとしても利用され得る。
[0034] この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものでは ない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々 の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その 全ての内容を援用によって引用することとする c

Claims

請求の範囲
[1] MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子、 MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子の活性領域、及 び MHCクラス II転写活性化遺伝子の変異体 (但し、 MHCクラス II遺伝子群の発現を制 御するマスタースィッチ機能を有する）力もなる群より選択される DNA力 ¾型コラーゲ ンプロモーターの制御下に配置された外来性 DNAが導入されたトランスジエニック非 ヒト哺乳動物。
[2] 前記外来性 DNA力 ¾型コラーゲンェンノ、ンサ一を含む、請求項 1に記載のトランス ジエニック非ヒト哺乳動物。
[3] II型コラーゲンの投与によってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、請求項 1又は 2 に記載のトランスジヱニック非ヒト哺乳動物。
[4] 1回あたりの II型コラーゲンの投与量を O.Olmg— 0.05mgとして 2回以上 II型コラーゲ ンを投与することによってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、請求項 1一 3のいずれ かに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[5] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の (1)一 (7)の中の一つ以上を示す病態であ る、請求項 1一 4のいずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物：
(1)全身にお ヽて三力所以上の関節の腫れが認められる； (2)対称性の関節の腫れ が認められる； (3)—週間以上継続する関節の腫れが認められる； (4)四肢にぉ 、て骨 の破壊、癒着、又は変形が認められる； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる； (6)肉 芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる; (7)関節の変形が初期 (ス テージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行する。
[6] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、さらに以下の (8)— (10)の中の一つ以上を示す病 態である、請求項 5に記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物: (8)血管炎症が認めら れる; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる; (10)貧血が認められる。
[7] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の (1)一 (7)の全てを示す病態である、請求項 1一 4の 、ずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物： (1)全身にぉ 、て三力所 以上の関節の腫れが認められる； (2)対称性の関節の腫れが認められる； (3)—週間以 上継続する関節の腫れが認められる； (4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が 認められる； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる； (6)肉芽組織形成による軟骨層 の破壊及び骨破壊が認められる; (7)関節の変形が初期 (ステージ I)及び中程度 (ス テージ II)を経て進行する。
[8] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の (1)一 (10)の全てを示す病態である、請求 項 1一 4の 、ずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物：（1)全身にぉ 、て三ケ 所以上の関節の腫れが認められる; (2)対称性の関節の腫れが認められる; (3)—週間 以上継続する関節の腫れが認められる； (4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形 が認められる； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる； (6)肉芽組織形成による軟骨 層の破壊及び骨破壊が認められる; (7)関節の変形が初期 (ステージ I)及び中程度（ ステージ II)を経て進行する; (8)血管炎症が認められる; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が 認められる；（10)貧血が認められる。
[9] 前記非ヒト哺乳動物の種 (属） 1S マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ゥサギ、ィ ヌ、ネコ、ヒッジ、ブタ、ゥシ及びゥマカもなる群より選択されるいずれかである、請求 項 1一 8のいずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物。
[10] 前記非ヒト哺乳動物の種 (属）がマウスである、請求項 1一 8のいずれかに記載のトラ ンスジヱニック非ヒト哺乳動物。
[11] MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子、 MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子の活性領域、及 び MHCクラス II転写活性化遺伝子の変異体 (但し、 MHCクラス II遺伝子群の発現を制 御するマスタースィッチ機能を有する）力もなる群より選択される DNA力 ¾型コラーゲ ンプロモーターの制御下に配置された外来性 DNAを、発生初期の細胞に導入するス テツプ、
を含むことを特徴とする、トランスジエニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[12] 前記外来性 DNA力 ¾型コラーゲンェンノ、ンサ一を含む、請求項 11に記載のトランス ジエニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[13] II型コラーゲンプロモーターと、
前記 II型コラーゲンプロモーターの下流に配置された DNA配列であって、 MHCクラ ス II転写活性化遺伝子、 MHCクラス II転写活性ィ匕遺伝子の活性領域、及び MHCクラ ス II転写活性化遺伝子の変異体 (但し、 MHCクラス II遺伝子群の発現を制御するマス タースィッチ機能を有する）力もなる群より選択される DNA配列と、 Π型コラーゲンェン ハンサ一と、を有する発現ベクター。
[14] 以下の (a)— (c)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法：
(a)請求項 1一 10のいずれかに記載のトランスジエニック非ヒト哺乳動物においてヒト 関節リウマチ様の病態を誘導するステップ；
(b)前記トランスジ ニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与するステップ；
(c)ヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ。
[15] 前記ステップ cにおいて、以下の (1)一 (10)の中力も選択される一つ以上について改 善される力否かを判定する、請求項 14に記載のスクリーニング方法: (1)全身におい て三力所以上の関節の腫れが認められること; (2)対称性の関節の腫れが認められる こと; (3)—週間以上継続する関節の腫れが認められること; (4)四肢において骨の破 壊、癒着、又は変形が認められること; (5)リンパ球系細胞の浸潤が認められること; (6) 肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること; (7)関節の変形が初 期 (ステージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行すること; (8)血管炎症が認められ ること; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること; (10)貧血が認められること。
[16] 以下の (A)— (D)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法：
(A)ヒト関節リウマチ様の病態が誘導された請求項 1一 10のいずれかに記載のトラン スジ ニック非ヒト哺乳動物をそれぞれ 1個体以上含む試験群及び対照群を用意す るステップ；
(B)前記試験群の各個体に被験物質を投与するステップ；
(C)ヒト関節リウマチに特徴的な症状の程度を前記試験群と前記対照群との間で比 較するステップ。
[17] 前記ステップ Cにおいて、以下の (1)一 (10)の中力も選択される一つ以上について、 前記試験群と前記対照群との間で比較する、請求項 16に記載のスクリ一ユング方法 ： (1)全身にぉ 、て三力所以上の関節の腫れが認められること； (2)対称性の関節の腫 れが認められること； (3)—週間以上継続する関節の腫れが認められること； (4)四肢に おいて骨の破壊、癒着、又は変形が認められること； (5)リンパ球系細胞の浸潤が認め られること; (6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること; (7)関 節の変形が初期 (ステージ I)及び中程度 (ステージ II)を経て進行すること； (8)血管炎 症が認められること; (9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること; (10)貧血が認めら れること。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007086382A1 (ja) * 2006-01-24 2007-08-02 Nagoya City University ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物
JP2012125235A (ja) * 2010-11-25 2012-07-05 Nagoya City Univ 間質性肺炎モデル及びその用途
EP4223786A2 (en) 2015-03-06 2023-08-09 Public University Corporation Yokohama City University Novel anti-pad4 antibodies

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9591835B2 (en) 2011-10-28 2017-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
US9043996B2 (en) 2011-10-28 2015-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
MY164836A (en) 2011-10-28 2018-01-30 Regeneron Pharma Genetically modified major histocompatibility complex mice
LT3590332T (lt) 2011-10-28 2022-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetiškai modifikuotos pelės, ekspresuojančios chimerines pagrindinio audinių dermės komplekso (mhc) ii molekules
PL2958938T3 (pl) 2013-02-20 2019-11-29 Regeneron Pharma Myszy eksprymujące humanizowane ko-receptory komórek t
PL2958937T3 (pl) 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy ekspresjonujące humanizowany główny układ zgodności tkankowej
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
RU2732628C2 (ru) 2015-04-06 2020-09-21 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Опосредованные гуманизированными т-клетками иммунные ответы у не относящихся к человеку животных

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998015626A2 (en) * 1996-10-08 1998-04-16 Institute Of Child Health Mutant ciita molecule and uses thereof

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAKIMOTO K. ET AL: "Tokushu II MAnsei Kansetsu Rheumatism (RA) ni Okeru Saikin to Topics Collagen Yudo Kansetsuen to T-saibo Kogen Juyotai.", CLINICAL IMMUNOLLGY., vol. 26, no. 2, 1994, pages 171 - 177, XP002994258 *
KIM H. ET AL: "Thyrotropin.mediated repression of class II trans-activator expression in thyroid cells: involvement of STAT3 and suppressor of cytokine signaling.", J.IMMUNOL., vol. 171, no. 2, 2003, pages 616 - 627, XP002994252 *
LEFEBVRE V. ET AL: "An 18-base-pair sequence in the mouse proalpha(II), collagen gene is sufficient for expression in cartilage and binds nuclear proteins that are selectively expressed in chondocytes.", MOL.CELL BIOL., vol. 16, no. 8, 1996, pages 4512 - 4523, XP002994255 *
NAVARRETE S.A. ET AL: "Constitutive expression of HLA class II mRNA in synovial fibroblast-like cells from patients with rheumatoid arthritis.", IMMUNOL. LETTERS., vol. 58, no. 1, 1997, pages 53 - 58, XP002994253 *
NAVARRETE S.A. ET AL: "Regulation by transforming growth factor-betal of class II mRNA and protein expression in fibroblast-like cynoviocytes from patients with rheumatoid arthritis.", INT.IMMUNOL., vol. 10, no. 5, 1998, pages 601 - 607, XP002994254 *
SARTORIS S. ET AL: "Analysis of CIITA encoding AIR-1 gene promoters in insulin dependent diabetes mellitus and rheumatoid arthritis patients from the northeast of Italy: absence of sequence variability.", HUM.IMMUNOL., vol. 61, no. 6, 2000, pages 599 - 604, XP002322241 *
STUVE O. ET AL: "The role of the MHC class II tansactivator in class II expression and antigen presentation by astrocytes and in susceptibility to central nervous system autoimmune disease.", J.IMMUNOL., vol. 169, no. 12, 2002, pages 6720 - 6732, XP002994260 *
ZHOU G. ET AL: "A182 bp fragment of the mouse pro alpha 1(II) collagen gene is sufficient to direct chondocyte expression in transgenic mice.", J.CELL SCI., vol. 108, no. 12, 1995, pages 3677 - 3684, XP002994257 *
ZHOU G. ET AL: "Three high mobility group-like sequences within a 48-base pair enhancer for the Co12al gene are required for cartilage-specific expression in vivo.", J.BIOL.CHEM., vol. 273, no. 24, 1998, pages 14989 - 14997, XP002994256 *
ZHU X.S. ET AL: "A 36-amino-acid region of CIITA is an effective inhibitor of CBP: novel mechanism of gamma interferon-mediated suppression of collagen alpha(2) (I) and other promoters.", MOL.CELL BIOL., vol. 21, no. 20, 2001, pages 7078 - 7088, XP002994259 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007086382A1 (ja) * 2006-01-24 2007-08-02 Nagoya City University ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物
JPWO2007086382A1 (ja) * 2006-01-24 2009-09-10 公立大学法人名古屋市立大学 ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物
JP5099550B2 (ja) * 2006-01-24 2012-12-19 公立大学法人名古屋市立大学 ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物
JP2012125235A (ja) * 2010-11-25 2012-07-05 Nagoya City Univ 間質性肺炎モデル及びその用途
EP4223786A2 (en) 2015-03-06 2023-08-09 Public University Corporation Yokohama City University Novel anti-pad4 antibodies

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