JP2012125235A - 間質性肺炎モデル及びその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物からなる、間質性肺炎モデル動物が提供される。
【選択図】なし
Description
このような状況下、本発明は間質性肺炎の病態を良好に再現するモデル動物(即ち、間質性肺炎の病態により近い症状を呈する動物)、その作出方法、及びその用途を提供することを課題とする。間質性肺炎の病態を良好に再現するモデル動物には、新規間質性肺炎治療薬の探索はもとより、新規間質性肺炎マーカーの探索や間質性肺炎発症のメカニズムの解明などにおいても多大な貢献を期待できる。このように、間質性肺炎の病態を良好に再現するモデル動物を提供することの意義は極めて大きい。
以上の考察を踏まえて本願発明者らは、安定的にD1CCマウスを維持する目的でホモ型マウスを樹立することにした。樹立に成功したホモ型D1CCマウスの関節部における表現型について検討した結果、ヘテロ型D1CCマウスと比較して関節炎の病態が重篤化することが判明した。間質性肺炎の症状に注目して更に検討したところ、ホモ型D1CCマウスは、(1)症状は慢性的であり、病態も進行性で肺炎の状態は経時的に悪化すること、(2)ヘテロ型D1CCマウスに比較して間質性肺炎をより鮮明に再現すること、(3)追加免疫(3次免疫)を行うと、効率良く間質性肺炎を誘導できること、(4)血清肺サーファクタントプロテインD(SP-D)値の測定によって間質性肺炎の進行を詳細に把握できること(ヘテロ型D1CCマウスと比較してホモ型D1CCマウスの血清SP-D値は顕著な上昇を示す)が明らかとなった。要約すれば、間質性肺炎のモデルとしてホモ型D1CCマウスが極めて優れていることが示された。
[1]MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物からなる、間質性肺炎モデル動物。
[2]前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、[1]に記載の間質性肺炎モデル動物。
[3]II型コラーゲンの投与によって慢性性且つ進行性の間質性肺炎を発症する、[1]又は[2]に記載の間質性肺炎モデル動物。
[4]1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することによって慢性性且つ進行性の間質性肺炎を発症する、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物。
[5]II型コラーゲンを3回投与すると、2回投与した場合に比較して、間質性肺炎の発症率が上昇するとともに、症状がより重篤化する、[3]又は[4]に記載の間質性肺炎モデル動物。
[6]前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物。
[7]前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物。
[8]遺伝的な背景が99%以上DBAである、[7]に記載の間質性肺炎モデル動物。
[9]以下の(a)〜(c)のステップを含む、間質性肺炎用薬剤のスクリーニング方法:
(a)[1]〜[8]のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物に対して、間質性肺炎を誘導する処置を施すステップ;
(b)前記間質性肺炎モデル動物に被験物質を投与するステップ;
(c)被験物質の治療効果又は予防効果を判定するステップ。
[10]間質性肺炎の発症頻度、間質性肺炎の発症時期、間質性肺炎の進行又は重篤化、間質性肺炎の改善、及び血清肺サーファクタントプロテインD値(SP-D)値からなる群より選択される一以上の指標に基づき、ステップ(c)の判定を行う、[9]に記載のスクリーニング方法。
[11]対照群との比較に基づきステップ(c)の判定を行う、[9]又は[10]に記載のスクリーニング方法。
(i)被験物質の投与によって、間質性肺炎の発症頻度が低下した場合、被験物質に予防効果があると判定する。
(ii)被験物質の投与によって、間質性肺炎の発症時期が遅延した場合、被験物質に予防効果があると判定する。
(iii)被験物質の投与によって、間質性肺炎の進行が又は重篤化が抑制された場合、被験物質に治療効果があると判定する。
(iv)被験物質の投与によって、間質性肺炎が改善した場合、被験物質に治療効果があると判定する。
(v)被験物質の投与によって、血清SP-D値の上昇抑制又は低下を認めた場合、被験物質に予防効果又は治療効果があると判定する。
以下に示すように、CIITA遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスをManipulating the mouse embryo, a laboratory manual, second edition, Brigid Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って作製した。
以下の手順で、II型コラーゲンプロモーターの制御下にMHCクラスII転写活性化遺伝子(CIITA遺伝子)が配置されたベクター pCol2fluCIITANeof(図1)を構築した。本ベクターは以下の特徴を有する。1)約1kbpのラットII型コラーゲンプロモーター部の下流にヒトグロビンスプライシング配列がある。2)この直下にヒトCIITAポリAサイトを含むヒトCIITA cDNAが挿入され、この後方にラットII型コラーゲンエンハンサーが配置されている。3)さらにこの下流にPGKプロモーター直下にほ乳類細胞非耐性の薬剤マーカーNeo遺伝子 およびポリAシグナルを配置したカセットが配置されている。4)バックボーンのベクターは、大腸菌を用いた通常のクローニングに用いられる組換え用のDNAを使用出来る。本ベクターでは、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を有するpBR322を用いた。5)予め大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除けるようPvuI制限酵素サイトを有する。最終的には、以上の手順で構築したベクターをPvuI制限酵素処理し、大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除き直鎖状としたものを、DNA結合性を示すビーズ等を用いて精製し、これをインジェクション用のトランスジーンとした。尚、得られたトランスジーンをマウス軟骨培養細胞株であるMG615細胞に遺伝子導入し、細胞表面上にMHCクラスIIタンパク質が発現する事を確認している。DNAは、10mM Tris/0.2mM EDTA 緩衝液にて30〜100μg/mlに調整し保存しておく。
(2−1)マウスの準備
キメラマウスを作製するために用いられるマウスの系統は、FVB/NJとDBA/1の掛け合わせにより得られるF1世代とした。常法に従い受精卵を調製してインジェクションに用いた。
常法に従いHCGを打ち、交配後のメスマウス卵巣より受精卵を得る。受精卵内pronucleiおよびgranuleを確認後、マイクロインジェクションに用いる。
マイクロインジェクションは、一回当たり200個程の受精卵を用いる。マイクロマニピュレーターを用いDNAを注入する。注入用のDNAは、最終的に3μg/mlに調整後、0.22μmのフィルター濾過し、これを用いる。
予め偽妊診した仮親用のメスマウスを準備する。DNAを注入した胚は、直接仮親の卵管に移植するか、または一日培養後、胚の分裂を確認しこれを移植する。移植は、一匹当たり25〜35個の胚を移植する。
得られたトランスジェニックマウスは、サザンブロッティング法により同定した。離乳後、マウスの尾を用いDNA抽出を行い、これを解析した。サザンブロッティングに用いるプローブは、CIITAのC末端のコーディング領域(ヒトCIITA DNA配列(配列番号1)中2978〜3329番目)を用いた。またこの際遺伝子のコピー数を約10程度のものをDBAマウスとのバッククロスに用いた。マウスに導入された遺伝子は、サザンブロッティング法およびPCR法により同定した。
得られたトランスジェニックマウスをDBA/1マウスとバッククロスさせた。バッククロスは、遺伝的な背景が99%以上DBAとなるように7世代以上に渡り繰り返す事で系統を遺伝的なバックグランドを純化した。このようにして、ヘテロ型トランスジェニックマウス(ヘテロ型D1CCマウス)を得た。
得られたヘテロ型D1CCマウスはII型コラーゲンに対して高い感受性を示し、少量のII型コラーゲンの接種によって関節リウマチ様の病態(関節炎、炎症性細胞の浸潤、関節破壊等)を呈した。関節外病変として間質性肺炎も観察されたが、解剖後の外見的所見および組織学的解析から、その発症頻度は約20%と比較的低いことが分かった(図2、3)。また、発症時期や病態進行については少量のII型コラーゲンの接種後6カ月以降と推定されたものの、解剖し、組織学的に解析する他には確認する手段がないことから、詳細は不明であった。
以上の考察を踏まえ、安定的にD1CCマウスを維持する目的でホモ型D1CCマウスを樹立することにした。ヘテロ型D1CCマウスのオスとメスを交配し、25%の確立でホモ型D1CCマウスを得た。ホモ型であることの確認にはリアルタイムPCR法を利用した。同一量のゲノムDNAを用いてリアルタイムPCRを行うと、ヘテロ型に対してホモ型では1サイクル分ずれた状態でPCR反応が先に進む(図4)。
樹立に成功したホモ型D1CCマウスに以下の手順で免疫した。ヘテロ型D1CCマウスをコントロールとして用いた。まず初回免疫として0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分けて皮下注射した。尚、ウシ関節軟骨から精製したII型コラーゲン(純度99%、コラーゲン技術研修会製)を0.01M酢酸に溶解し、等量の完全アジュバント(DIFCO社製)と混合したものを使用した。初回免疫から3週間後、2次免疫として再度0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分け皮下注射した。2次免疫には、不完全アジュバントと混合したII型コラーゲンを使用した。
ホモ型D1CCマウスを用いてピルフェニドンの効果を評価した。ピルフェニドンは抗線維化薬として認可された薬剤であり、間質性肺炎の治療薬として使用されている。
(1)実験方法
ホモ型D1CCマウスに1次免疫後、2次免疫及び3次免疫(免疫方法は4.の欄に記載の通りである)を行い、関節リウマチ様の病態を誘導した。2次免疫後、関節炎が徐々に観察されるが、さらに3次免疫を行い、間質性肺炎をより効果的に誘導することにした。3次免疫後に血清SP-D値のモニタリングを開始した。抗線維化薬ピルフェニドンをホモ型D1CCマウスに経口投与し、間質性肺炎を抑制するか検討した。ピルフェニドンの投与量は、人に対する標準投与量(600mg/50kg)を基準とし、マウス体重当り同量(x1)、10倍量(x10)の2群を設定し実験を行った。定期的な採血を行い血清SP-D値をモニタリングすることで病態進行を把握した。原末を1%メチルセルロース等に懸濁し、隔日の連続経口投与を行った。少なくとも6カ月以上に渡りモニタリングを継続した。各群におけるマウスの数は7匹以上とした。
上記の実験方法に従い、ホモ型D1CCマウスを用いてピルフェニドンの効果を評価した。尚、図6に示すように、ホモ型D1CCマウスでは37週を過ぎた時点で血清SP-D値は著しく上昇する。ここには示していないが、この後も継続してモニタリングすると、血清SP-D値の平均的な値は170ng/ml以上となる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (11)
- MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAをホモ型で保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物からなる、間質性肺炎モデル動物。
- 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、請求項1に記載の間質性肺炎モデル動物。
- II型コラーゲンの投与によって慢性性且つ進行性の間質性肺炎を発症する、請求項1又は2に記載の間質性肺炎モデル動物。
- 1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することによって慢性性且つ進行性の間質性肺炎を発症する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物。
- II型コラーゲンを3回投与すると、2回投与した場合に比較して、間質性肺炎の発症率が上昇するとともに、症状がより重篤化する、請求項3又は4に記載の間質性肺炎モデル動物。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物。
- 遺伝的な背景が99%以上DBAである、請求項7に記載の間質性肺炎モデル動物。
- 以下の(a)〜(c)のステップを含む、間質性肺炎用薬剤のスクリーニング方法:
(a)請求項1〜8のいずれか一項に記載の間質性肺炎モデル動物に対して、間質性肺炎を誘導する処置を施すステップ;
(b)前記間質性肺炎モデル動物に被験物質を投与するステップ;
(c)被験物質の治療効果又は予防効果を判定するステップ。 - 間質性肺炎の発症頻度、間質性肺炎の発症時期、間質性肺炎の進行又は重篤化、間質性肺炎の改善、及び血清肺サーファクタントプロテインD(SP-D)値からなる群より選択される一以上の指標に基づき、ステップ(c)の判定を行う、請求項9に記載のスクリーニング方法。
- 対照群との比較に基づきステップ(c)の判定を行う、請求項9又は10に記載のスクリーニング方法。
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