JP2017055680A - 関節症性乾癬モデル動物及び膿疱性乾癬モデル動物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インターロイキン36受容体アンタゴニストをコードするIL36RN遺伝子が欠損したトランスジェニック非ヒト動物に対してToll様受容体4のリガンドを投与し、関節症性乾癬又は膿疱性乾癬の病態を誘導する。
【選択図】なし
Description
以下の発明は上記の成果及び考察に基づく。
[1]インターロイキン36受容体アンタゴニストをコードするIL36RN遺伝子が欠損したトランスジェニック非ヒト動物に対してToll様受容体4のリガンドを投与するステップ、を含む、乾癬モデル動物の作製方法。
[2]前記トランスジェニック非ヒト動物が、インターロイキン36受容体アンタゴニストをコードするIL36RN遺伝子をホモ型に欠損している、[1]に記載の作製方法。
[3]前記トランスジェニック非ヒト動物が齧歯目動物である、[1]又は[2]に記載の作製方法。
[4]前記齧歯目動物がマウスである、[3]に記載の作製方法。
[5]前記リガンドがリポ多糖である、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の作製方法。
[6]前記トランスジェニック非ヒト動物の関節の近傍に前記リガンドが投与される、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の作製方法。
[7]前記リガンドの投与部位が足である、[6]に記載の作製方法。
[8]前記トランスジェニック非ヒト動物の皮下又は皮内に前記リガンドが投与される、[1]〜[5]のいずれか一項に記載の作製方法。
[9]前記リガンドの投与部位が背部又は腹部である、[8]に記載の作製方法。
[10][1]〜[5]のいずれか一項に記載の作製方法で得られる、乾癬モデル動物
[11][6]又は[7]の作製方法で得られる、関節症性乾癬の病態を呈する乾癬モデル動物。
[12][8]又は[9]の作製方法で得られる、膿疱性乾癬の病態を呈する乾癬モデル動物。
[13]以下の(1)及び(2)を含む、乾癬用薬剤のスクリーニング方法:
(1)[1]〜[12]のいずれか一項に記載の作製方法で得られる乾癬モデル動物に被験物質を投与するステップ;
(2)被験物質の予防又は治療効果を判定するステップ。
[14]ステップ(1)における前記被験物質の投与が、前記乾癬モデル動物を作製するためのToll様受容体4のリガンドの投与の前に行われる、[13]に記載のスクリーニング方法。
[15]対照群との比較に基づきステップ(2)の判定を行う、[13]又は[14]に記載のスクリーニング方法。
[16]前記乾癬用薬剤が、関節症性乾癬の予防又は治療、或いは膿疱性乾癬の予防又は治療用の薬剤である、[13]〜[15]のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
[17]前記乾癬用薬剤が、尋常性乾癬の予防又は治療用の薬剤である、[13]〜[15]のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
[18]以下の(i)及び(ii)を含む、膿疱性乾癬の予防又は治療用の薬剤のスクリーニング方法:
(i)野生型マウスにToll様受容体4のリガンドを投与するとともに、被験物質を投与するステップ;
(ii)被験物質の予防又は治療効果を判定するステップ。
本発明の第1の局面は、乾癬の病態を示す動物、即ち、乾癬モデル動物の作製方法に関する。本発明の作製方法では、「インターロイキン36受容体アンタゴニストをコードするIL36RN遺伝子が欠損したトランスジェニック非ヒト動物に対してToll様受容体4のリガンドを投与するステップ」が行われる。
本発明の第2の局面は、本発明の作製方法で得られる乾癬モデル動物(以下、「本発明の乾癬モデル動物」とも呼ぶ)の用途に関する。典型的な用途として、乾癬の予防又は治療(改善)に有効な物質、即ち、乾癬用薬剤のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法では以下のステップが行われる。尚、本明細書において「乾癬用薬剤」とは、乾癬を発症している患者に対してその症状の改善や治癒などを目的として使用される薬剤はもとより、乾癬を発症するおそれのある者に対して予防的に(再発防止の目的も含む)使用される薬剤も含む用語として用いられる。このように、本発明のスクリーニング方法を利用して選抜される薬剤は、乾癬の予防又は治療(改善)を目的として使用され得る。
(1)本発明の作製方法で得られる乾癬モデル動物に被験物質を投与するステップ
(2)被験物質の予防又は治療効果を判定するステップ
(i)被験物質の投与によって、腫脹・肥厚が認められなくなった場合、又は腫脹・肥厚の程度が低下した場合(腫脹・肥厚が抑制された又は改善した場合)、被験物質に予防効果又は治療効果があると判定する。
(ii)被験物質の投与によって、腫脹・肥厚が認められる時期が遅延した場合、被験物質に予防効果があると判定する。
(i)被験物質の投与によって、膿の形成が認められなくなった場合、又は膿の程度が低下した場合、被験物質に予防効果又は治療効果があると判定する。
(ii)被験物質の投与によって、膿の形成が認められる時期が遅延した場合、被験物質に予防効果があると判定する。
(iii)被験物質の投与によって、紅斑の形成が認められなくなった場合、又は紅斑の程度が低下した場合、被験物質に予防効果又は治療効果があると判定する。
(iv)被験物質の投与によって、紅斑の形成が認められる時期が遅延した場合、被験物質に予防効果があると判定する。
(i)野生型マウスにToll様受容体4のリガンドを投与するとともに、被験物質を投与するステップ
(ii)被験物質の予防又は治療効果を判定するステップ
(1)IL36RN(Il1f5)遺伝子ノックアウトマウスの作製
ES細胞を用いてコンベンショナルなIl1f5(ヒトのIL36RN遺伝子に相当)遺伝子ノックアウトマウスを作製する。ES細胞にはHK3i細胞(C57BL/6N系統)を使用した。使用したプラスミド(ターゲティングベクター)の構成及び標的部位を図1に示す。Il1f5遺伝子のエクソン1(Ex1)の一部からエクソン3(Ex3)の一部にまたがる領域(配列番号3)をPr Neo pA(配列番号4)に置換した。
本実験ではリポ多糖(LPS)(製品名Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4、SIGMA-ALDRICH社)を使用した。
本実験ではC57BL/6N系統のマウスを使用した。
関節炎/膿疱の誘発のために、IL36RN(Il1f5)遺伝子ホモ欠損マウスの関節近傍又は後足の足裏にLPSを下記の通り投与する。
(投与量)
関節炎:2μg/ml〜2mg/mlの濃度で20μl
膿疱:2μg/ml〜2mg/mlの濃度で50μl
(投与スケジュール)
関節炎:1日1回、3日間
膿疱:1日1回、1〜5日間
(1)関節炎の誘導
複数のオスマウスを同ケージで飼育するとファイティングすることが多い。IL36RN遺伝子ホモ欠損マウス及びヘテロ欠損マウスではファイティングにより関節炎が起こった(WTマウスではこのような現象は認めていない)。この現象の機序として、外傷に伴う感染から自然免疫が賦活化し、関節症性乾癬と同様の関節炎が起こっている可能性を考え、TLR4アゴニストをIL36RN遺伝子ホモ欠損マウスの関節近傍に局所投与することにより関節炎を誘導することを試みた。まず、8〜12週齢、オスの野生型(WT)マウス及びIL36RN遺伝子ホモ欠損マウスの後足の関節近傍に、TLR4リガンド(アゴニスト)であるLPSを40ng〜40μg(容量20μl)の投与量で1日1回、3日間皮下注射した。そして、最終投与6時間後に後足の厚さを測定した。その結果、LPS 300ng以上で、IL36RN遺伝子ホモ欠損マウスにおいてWTマウスより優位に後足の腫脹・肥厚がみられた(図2、3)。
8〜12週齢、オスの野生型(WT)マウス及びIL36RN遺伝子ホモ欠損マウスの除毛した背部皮膚に、LPSを100ng〜100μg(容量50μl)の投与量で1日1回、1〜5日間皮下注射し、皮膚の状態を観察した。50μg投与した群では、5日間投与後においてWTマウス、IL36RN遺伝子ホモ欠損マウスいずれにおいても著しい紅斑・膿疱がみられた(図4)。尚、3μg投与した群においても、Il36RN遺伝子欠損マウスでは著しい紅斑・膿疱が、また野生型においても軽度ではあるものの、紅斑・膿疱が観察された。
IL36RN遺伝子ホモ欠損マウスの関節近傍にTLR4リガンドを局所投与することによって、関節症性乾癬と同様の関節炎を誘導すること、即ち、関節症性乾癬モデルの作製に成功した。また、IL36RN遺伝子ホモ欠損マウスの皮膚にTLR4リガンドを局所投与することによって、膿疱の病変を再現すること、即ち膿疱性乾癬モデルの作製にも成功した。これらの乾癬モデルは、関節症性乾癬と膿疱性乾癬の病態解明、或いは治療薬の開発のための有用な実験動物となる。一方、上記の実験によって、従来の関節炎モデルで立証されてきた定説と異なり、関節症性乾癬の病態形成にIL-36が関与することが明らかとなった。この事実は、今後の治療戦略において重要な意義を持つ。また、作製に成功したモデル動物の活用を図る上でも重要である。
Claims (18)
- インターロイキン36受容体アンタゴニストをコードするIL36RN遺伝子が欠損したトランスジェニック非ヒト動物に対してToll様受容体4のリガンドを投与するステップ、を含む、乾癬モデル動物の作製方法。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が、インターロイキン36受容体アンタゴニストをコードするIL36RN遺伝子をホモ型に欠損している、請求項1に記載の作製方法。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物が齧歯目動物である、請求項1又は2に記載の作製方法。
- 前記齧歯目動物がマウスである、請求項3に記載の作製方法。
- 前記リガンドがリポ多糖である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物の関節の近傍に前記リガンドが投与される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記リガンドの投与部位が足である、請求項6に記載の作製方法。
- 前記トランスジェニック非ヒト動物の皮下又は皮内に前記リガンドが投与される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の作製方法。
- 前記リガンドの投与部位が背部又は腹部である、請求項8に記載の作製方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の作製方法で得られる、乾癬モデル動物。
- 請求項6又は7の作製方法で得られる、関節症性乾癬の病態を呈する乾癬モデル動物。
- 請求項8又は9の作製方法で得られる、膿疱性乾癬の病態を呈する乾癬モデル動物。
- 以下の(1)及び(2)を含む、乾癬用薬剤のスクリーニング方法:
(1)請求項1〜12のいずれか一項に記載の作製方法で得られる乾癬モデル動物に被験物質を投与するステップ;
(2)被験物質の予防又は治療効果を判定するステップ。 - ステップ(1)における前記被験物質の投与が、前記乾癬モデル動物を作製するためのToll様受容体4のリガンドの投与の前に行われる、請求項13に記載のスクリーニング方法。
- 対照群との比較に基づきステップ(2)の判定を行う、請求項13又は14に記載のスクリーニング方法。
- 前記乾癬用薬剤が、関節症性乾癬の予防又は治療、或いは膿疱性乾癬の予防又は治療用の薬剤である、請求項13〜15のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 前記乾癬用薬剤が、尋常性乾癬の予防又は治療用の薬剤である、請求項13〜15のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
- 以下の(i)及び(ii)を含む、膿疱性乾癬の予防又は治療用の薬剤のスクリーニング方法:
(i)野生型マウスにToll様受容体4のリガンドを投与するとともに、被験物質を投与するステップ;
(ii)被験物質の予防又は治療効果を判定するステップ。
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