JPWO2005085438A1 - ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents
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Abstract
Description
以上の成果から、II型コラーゲンプロモーターの作用でCIITA遺伝子が発現するように遺伝子改変することによれば、ヒト関節リウマチの病態を良好に再現するモデル動物を作製できるとの知見が得られた。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであって以下の構成を提供する。
[1] MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAが導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[2] 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、[1]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[3] II型コラーゲンの投与によってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、[1]又は[2]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[4] 1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することによってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、[1]〜[3]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[5] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(7)の中の一つ以上を示す病態である、[1]〜[4]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:
(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
[6] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、さらに以下の(8)〜(10)の中の一つ以上を示す病態である、[5]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(8)血管炎症が認められる;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(10)貧血が認められる。
[7] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(7)の全てを示す病態である、[1]〜[4]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
[8] 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(10)の全てを示す病態である、[1]〜[4]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三ヶ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する;(8)血管炎症が認められる;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(10)貧血が認められる。
[9] 前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、[1]〜[8]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[10] 前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、[1]〜[8]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[11] MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAを、発生初期の細胞に導入するステップ、
を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[12] 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、[11]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[13] II型コラーゲンプロモーターと、
前記II型コラーゲンプロモーターの下流に配置されたDNA配列であって、MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列と、II型コラーゲンエンハンサーと、を有する発現ベクター。
[14] 以下の(a)〜(c)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(a)[1]〜[10]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物においてヒト関節リウマチ様の病態を誘導するステップ;
(b)前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与するステップ;
(c)ヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ。
[15] 前記ステップcにおいて、以下の(1)〜(10)の中から選択される一つ以上について改善されるか否かを判定する、[14]に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(8)血管炎症が認められること;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(10)貧血が認められること。
[16] 以下の(A)〜(D)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(A)ヒト関節リウマチ様の病態が誘導された[1]〜[10]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物をそれぞれ1個体以上含む試験群及び対照群を用意するステップ;
(B)前記試験群の各個体に被験物質を投与するステップ;
(C)ヒト関節リウマチに特徴的な症状の程度を前記試験群と前記対照群との間で比較するステップ。
[17] 前記ステップCにおいて、以下の(1)〜(10)の中から選択される一つ以上について、前記試験群と前記対照群との間で比較する、[16]に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(8)血管炎症が認められること;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(10)貧血が認められること。
「トランスジェニック非ヒト哺乳動物(TG動物)」とは、発生初期に外来性DNAが導入されることによって、それを構成するすべての細胞が当該外来性DNAを保有することとなる、ヒト以外の哺乳動物又はその子孫(但し、当該外来性遺伝子を保有するもの)をいう。ここでの哺乳動物の種(属)は特に限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びウマ等を含む。好ましくはマウス(例えばH-2qマウスDBA/J系統やB10.Q系統、又はH-2rマウスR10.RIII系統(これらのマウスは日本チャールズリバーから入手可能である))やラット(例えばLewis(Rtw)、WFC(Rte)、DA(Rta)ラット(これらのラットは日本チャールズリバーから入手可能である))などの齧歯目動物であり、最も好ましくはマウスである。
導入遺伝子のコピー数は特に限定されるものではないが、例えば1〜100である。また、本発明のTG動物は導入遺伝子に関してホモ接合体であってもヘテロ接合体であってもよい。
外来性DNA内においてCIITA遺伝子又はその変異体(以下、「CIITA遺伝子等」という)はII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置される。ここでの「制御下に配置される」とは、II型コラーゲンプロモーターが作用してCIITA遺伝子等の転写が生ずるように、CIITA遺伝子が直接又は他の配列を介してII型コラーゲンプロモーターに連結されている状態をいう。通常は、II型コラーゲンプロモーターの下流、かつ近接した位置にCIITA遺伝子等が配置される。
良好な免疫反応を引き起こす目的で、各回の投与を全身の複数箇所に分けて実施することが好ましい。
ここで、「ヒト関節リウマチ様の病態」を特徴づける具体的な症状ないし所見を以下に列挙する。
(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる。
(2)対称性の関節の腫れが認められる。
(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる。
(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる。
(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる。
(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる。
(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
以上の(1)〜(7)の特徴をより多く備えるほどヒト関節リウマチを再現した病態となる。従って、本発明のTG動物が上記(1)〜(7)の特徴の中から選択される二つ以上(例えば、(1)及び(2)、(1)〜(3)、(1)〜(4)、(1)〜(5)、(4)及び(5)、(4)〜(6))を併せ持つことが好ましい。本発明のTG動物は最も好ましい形態において上記(1)〜(7)の特徴の全てを併せ持つ。
尚、(1)〜(3)は外見(四肢関節における発赤、腫脹など)の評価、赤外線サーモグラフィーによる分析、剖検による組織学的評価等によって確認することができる((3)については経時的な変化を調べる)。(4)は外見評価、X線像評価、核磁気共鳴画像評価、剖検による組織学的評価等によって確認することができる。(5)〜(7)は経時的なX線像評価、核磁気共鳴画像評価、剖検による組織学的評価等によって確認することができる。
(8)血管炎症が認められる。
(9)間質性肺炎、胸膜炎等が認められる。
(10)貧血等が認められる。
以上の(8)〜(10)の合併症をより多く伴うほどヒト関節リウマチを再現した病態となる。従って、本発明のTG動物が上記(8)〜(10)の特徴の中から選択される二つ以上(例えば、(8)及び(9)、(9)及び(10)、(8)及び(10))を伴うことが好ましい。本発明のTG動物は最も好ましい形態において上記(8)〜(10)の合併症の全てを伴う。
尚、(8)および(9)は血中炎症系マーカー等の測定、組織学的評価等によって確認することができる。(10)は血球算定の際ヘマトクリット値、平均赤血球数等によって確認することができる。
マイクロインジェクション法では、まず交尾が確認された雌マウスの卵管より受精卵を採取し、そして培養した後にその前核に所望のDNAコンストラクト(外来性DNA)の注入を行う。DNAコンストラクトの形態は特に限定されないが、導入効率の点から直鎖状又は環状であることが好ましい。特に好ましくは、直鎖状に調製したDNAコンストラクトを使用する。導入目的の遺伝子が効率的に染色体に組み込まれ、且つその良好な発現が確保できるようにDNAコンストラクトを調製する。DNAコンストラクトは、上述のCIITA遺伝子等及びII型コラーゲンプロモーターを含む(必要に応じて適当なエンハンサー配列、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター配列等を含む)。
注入操作を終了した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、移植後のマウスを所定期間飼育して仔マウス(F0)を得る。仔マウスの染色体に導入遺伝子が適切に組込まれていることを確認するために、仔マウスの尾などからDNAを抽出し、サザンハイブリダイゼ−ション分析、スロットブロット(ドットブロット)分析、PCR分析等を実施する。
次に、同定されたトランスジェニック個体を他のマウスとの交配に供する。ここでの「他のマウス」としては、H-2q若しくはH-2rハプロタイプのマウス、MRL-1若しくは亜系MRL-lpr+マウス、NZB/KNマウス、SKGマウス、NODマウス、scid/scidマウス、RAG2-deficient マウス、又はLewis ラット等(これらのマウスは例えば日本チャールズリバーから入手することが可能である)、或いは以上の操作の結果得られた他のトランスジェニック個体等を使用することができる。中でも、H-2qハプロタイプのマウスを使用することが好ましい。H-2qハプロタイプのマウスはII型コラーゲンに対し高い頻度でヒト関節リウマチ様の症状を示す一方、雌雄差を示さないことから、これを使用すればヒト関節リウマチ様の病態を良好に再現するTGマウスが得られる。尚、H-2qハプロタイプのマウスは、通常飼育下ではヒト関節リウマチ様の症状を示さない。また、本トランスジーン導入後も同様に誘導しない限りヒト関節リウマチ様の症状を示さない。
本発明のスクリーニング方法は、上記本発明のTG動物においてヒト関節リウマチ様の病態を誘導するステップ(ステップa)と、TG動物に被験物質を投与するステップ(ステップb)と、TG動物においてヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ(ステップc)とを含む。
尚、本明細書において「ヒト関節リウマチ用薬剤」とは、ヒト関節リウマチを発症している患者に対してその症状の改善(ある症状の発生を予防することも含む)などを目的として使用される薬剤はもとより、ヒト関節リウマチを発症するおそれのある者に対して予防的に使用される薬剤、さらにはヒト関節リウマチに起因する合併症の予防、又は合併症の症状の改善を目的として使用される薬剤をも含む用語として用いられる。このように、本発明のスクリーニング方法を利用して得られる薬剤は、ヒト関節リウマチの合併症の予防又は治療を目的として使用することもできる。
以下にII型コラーゲンの投与によるヒト関節リウマチ様病態の誘導方法の具体例(TG動物がマウスである場合の一例)を示す。まず、初回免疫として0.01mgのII型コラーゲン(例えばウシ関節軟骨から常法に従って抽出・精製した高純度(例えば純度99%)のII型コラーゲンを0.01M酢酸に溶解し、等量の完全アジュバントと混合したもの)を数カ所に分けてTGマウスに皮下注射する。3週間飼育した後、二次免疫として再度0.01mgのII型コラーゲン(不完全アジュバントを用いる以外は初回免疫の場合と同様に調製したもの)を数カ所に分けてTGマウスに皮下注射する。二次免疫の後、四肢関節における発赤、腫脹等をモニターし、ヒト関節リウマチ様症状が誘導されたことを確認する。必要に応じて剖検により合併症の有無を調べる。
被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物(核酸、ペプチド、タンパク質、脂質(単純脂質、複合脂質(ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等)、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等))又は無機化合物を用いることができる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。
これらの症状に加えて又はこれらの症状の代わりに、ヒト関節リウマチの合併症(例えば、上述したように(8)血管炎症が認められる;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(10)貧血が認められる)を調べることにしてもよい。複数の症状等について調べる場合におけるその組合わせは任意であって、例えば(1)と(2)の組合わせ、(1)〜(3)の組合わせ、(1)〜(4)の組合わせ、(1)〜(5)の組合せ、(1)〜(6)の組合わせ、(1)〜(7)の組合せ、(2)〜(4)の組合せ、(3)〜(6)の組合せ、(7)及び(8)の組合せ、(7)〜(9)の組合せなどを採用できる。一般には改善される症状が多くなればそれだけ被験物質の有効性が高まると考えられることから、ステップcにおいてより多くの症状を調べることが好ましい。但し、二つの症状の間で一定以上の相関が認められる場合には、当該二つの症状のいずれかのみを調べることとしてもよい。
試験群及び対照群に含まれる個体数は特に限定されない。一般に使用する個体数が多くなるほど信頼性の高い結果が得られるが、多数の個体を同時に取り扱うことは使用する個体の確保や操作(飼育を含む)の面で困難を伴う。そこで例えば各群に含まれる個体数を1〜50、好ましくは2〜30、さらに好ましくは5〜20とする。
以下に示すように、CIITA遺伝子を導入したトランスジェニックマウスをManipulating the mouse embryo, a laboratory manual, second edition, Brigid Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って作製した。
1.遺伝子導入用ベクター(外来性DNA)の調製
以下の手順で、II型コラーゲンプロモーターの制御下にMHCクラスII転写活性化遺伝子(CIITA遺伝子)が配置されたベクター pCol2fluCIITANeof(図1)を構築した。本ベクターは以下の特徴を有する。1)約1kbpのラットII型コラーゲンプロモーター部の下流にヒトグロビンスプライシング配列がある。2)この直下にヒトCIITAポリAサイトを含むヒトCIITA cDNAが挿入され、この後方にラットII型コラーゲンエンハンサーが配置されている。3)さらにこの下流にPGKプロモーター直下にほ乳類細胞非耐性の薬剤マーカーNeo遺伝子 およびポリA シグナルを配置したカセットが配置されている。4)バックボーンのベクターは、大腸菌を用いた通常のクローニングに用いられる組換え用のDNAを使用出来る。本ベクターでは、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を有するpBR322を用いた。5)予め大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除けるよう PvuI 制限酵素サイトを有する。
最終的には、以上の手順で構築したベクターをPvuI制限酵素処理し、大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除き直鎖状としたものを、DNA結合性を示すビーズ等を用いて精製し、これをインジェクション用のトランスジーンとした。尚、得られたトランスジーンをマウス軟骨培養細胞株であるMG615細胞に遺伝子導入し、細胞表面上にMHCクラスIIタンパク質が発現する事を確認している。DNAは、10mM Tris/0.2mM EDTA 緩衝液にて30〜100μg/mlに調節し保存しておく。
2−1.マウスの準備
キメラマウスを作製するために用いられるマウスの系統は、SDB/DBA の掛け合わせにより得られるF1世代とした。常法に従い受精卵を調製してインジェクションに用いた。
常法に従いHCGを打ち、交配後のメスマウス卵巣より受精卵を得る。受精卵内 pronuclei および granule を確認後、マイクロインジェクションに用いる。
マイクロインジェクションは、一回当たり200個程の受精卵を用いる。マイクロマニピュレーターを用いDNAを注入する。注入用のDNAは、最終的に3μg/mlに調節後、0.22μmのフィルター濾過し、これを用いる。
予め偽妊診した仮親用のメスマウスを準備する。DNAを注入した胚は、直接仮親の卵管に移植するか、または一日培養後、胚の分裂を確認しこれを移植する。移植は、一匹当たり25〜35個の胚を移植する。
得られたトランスジェニックマウスは、サザンブロッティング法により同定した。離乳後、マウスの尾を用い DNA 抽出を行い、これを解析した。サザンブロッティングに用いるプローブは、CIITAのC末端のコーディング領域(ヒトCIITA DNA配列(配列番号1)中2978〜3329番目)を用いた。またこの際遺伝子のコピー数を約10程度のものをDBAマウスとのバッククロスに用いた。マウスに導入された遺伝子は、サザンブロッティング法およびPCR法により同定した。
得られたトランスジェニックマウスをDBAマウスとバッククロスさせた。バッククロスは、遺伝的な背景が99%以上DBAとなるように7世代以上に渡り繰り返す事で系統を遺伝的なバックグランドを純化した。その結果得られたトランスジェニックマウス(CIITAトランスジェニックマウス)を以下の実験に用いた。
1.免疫誘導
実施例1で作製したCIITAトランスジェニックマウスに以下の手順で免疫した。尚、全く同じ一腹の子であるが導入遺伝子を有しないもの、DRB/1jバックグランドを有するマウスを野生型コントロール(6〜8週齢)として用いた。
まず初回免疫として0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分けて皮下注射した。尚、ウシ関節軟骨から精製したII型コラーゲン(純度99%、コラーゲン技術研修会製)を0.01M酢酸に容解し、等量の完全アジュバント(DIFCO社製)と混合したものを使用した。
初回免疫から3週間後、2次免疫として再度0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分け皮下注射した。尚、2次免疫には、不完全アジュバントと混合したII型コラーゲンを使用した。
2次免疫後、四肢関節における発赤、腫脹等のモニターリングを行った。その結果、2次免疫後通常のCIAでは数日で四肢関節における強い発赤および腫脹が観察されるが、本トランスジェニックマウスでは四肢における発赤、腫脹が数週間以上に渡り見られた(図2)。コントロールマウスにおいてはほとんどその様な症状を観察できなかった。尚、図3に示した基準でクリニカルスコアを計算し、その結果を図4に示す。
一方、赤外線サーモグラフィー等によるモニターリングによって本トランスジェニックマウスでは関節炎が進行していることが明らかであった。すなわち関節炎が長期間に渡り序々に進行する事が分かった。またこの時期の関節における組織切片を見るとリンパ球系の細胞の関節周辺への浸潤が見られるなど、ヒト関節リウマチの初期における疾病状態が観察された(図5)。モニターリングをさらに継続すると2ヶ月程度を経て四肢における腫脹がさらに進行していた。個体によっては、軽度の寛解を示すものもあるが、基本的には骨破壊が進むために最終的には骨変形などの障害が起きていた(図6)。
トランスジェニックマウスに対して低濃度の免疫及び追加免疫を施し、経時的な骨密度の変化を測定した(図7)。従来のCIA法では、骨密度変化が5週間後に見られ、その後大きな変動を示さないが、一方トランスジェニックマウスでは、炎症の進行のみならず、骨密度変化も徐々に進行して行く。
この他、剖検および血液検査により全体の合併症を検索する。例えば、リウマチによる1次的な呼吸器病変、血管炎、赤血球数の減少を確認する。また通常マウスはSPF状態で飼育および実験を行なっているがこれをコンベンショナルな飼育環境に移す、または飼育環境下でリステリア菌等を接種し、リウマチ状態において2次的な過剰免疫反応等が誘発さることを確認する。加えて、リウマチ治療薬の投与に対する副作用を確認する。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (17)
- MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAが導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- II型コラーゲンの投与によってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、請求項1又は2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することによってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(7)の中の一つ以上を示す病態である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:
(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。 - 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、さらに以下の(8)〜(10)の中の一つ以上を示す病態である、請求項5に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(8)血管炎症が認められる;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(10)貧血が認められる。
- 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(7)の全てを示す病態である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
- 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(10)の全てを示す病態である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三ヶ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する;(8)血管炎症が認められる;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(10)貧血が認められる。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNAがII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置された外来性DNAを、発生初期の細胞に導入するステップ、
を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。 - 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、請求項11に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
- II型コラーゲンプロモーターと、
前記II型コラーゲンプロモーターの下流に配置されたDNA配列であって、MHCクラスII転写活性化遺伝子、MHCクラスII転写活性化遺伝子の活性領域、及びMHCクラスII転写活性化遺伝子の変異体(但し、MHCクラスII遺伝子群の発現を制御するマスタースイッチ機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列と、II型コラーゲンエンハンサーと、を有する発現ベクター。 - 以下の(a)〜(c)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(a)請求項1〜10のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物においてヒト関節リウマチ様の病態を誘導するステップ;
(b)前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与するステップ;
(c)ヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ。 - 前記ステップcにおいて、以下の(1)〜(10)の中から選択される一つ以上について改善されるか否かを判定する、請求項14に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(8)血管炎症が認められること;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(10)貧血が認められること。
- 以下の(A)〜(D)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(A)ヒト関節リウマチ様の病態が誘導された請求項1〜10のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物をそれぞれ1個体以上含む試験群及び対照群を用意するステップ;
(B)前記試験群の各個体に被験物質を投与するステップ;
(C)ヒト関節リウマチに特徴的な症状の程度を前記試験群と前記対照群との間で比較するステップ。 - 前記ステップCにおいて、以下の(1)〜(10)の中から選択される一つ以上について、前記試験群と前記対照群との間で比較する、請求項16に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(6)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(7)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(8)血管炎症が認められること;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(10)貧血が認められること。
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