JPH10201396A - Ｈ２−ｍ改変トランスジエニツク動物 - Google Patents

Ｈ２−ｍ改変トランスジエニツク動物

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JPH10201396A
JPH10201396A JP10014724A JP1472498A JPH10201396A JP H10201396 A JPH10201396 A JP H10201396A JP 10014724 A JP10014724 A JP 10014724A JP 1472498 A JP1472498 A JP 1472498A JP H10201396 A JPH10201396 A JP H10201396A
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mice
cell
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ウエイ−ピング・リユング
Lars Karlsson
ラース・カールソン
Lubing Zhou
ルビング・ゾー
Per A Peterson
パー・エイ・ピーターソン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、H2-Ma遺伝子が改変されたトラン
スジェニック 非ヒト動物に関し、機能的H2-Mが欠失し
ている動物を生産する。 【解決手段】 H2-Ma遺伝子に改変を有するトランスジ
ェニック動物は、改変されたH2-Ma遺伝子を宿主動物に
導入することにより調製される。生成したトランスジェ
ニック動物は、機能的H2-M分子を生産しない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、H2-Ma遺伝子が改
変されたトランスジェニック 非ヒト動物に関し、機能
的H2-Mを欠く動物を生産する。
【０００２】
【従来の技術】免疫系において、正常な組織の発育およ
び維持において、ならびに胚性および胎児性発生におい
て、H2-Mの正確な役割は現時点ではあまり知られていな
い。主要組織適合複合体(MHC)クラスII分子上での外来
性の免疫原性ペプチドの提示において、すでに知られて
いるH2-Mの関与の仕方から、H2-Mタンパク質は免疫応答
のモジュレーションに関する薬物の重要な標的である。
【０００３】H2-M改変トランスジェニック動物の作出
は、H2-Mの生物学的役割（１つ、または複数）を特定す
る上で役立ち、そしてH2-M活性を調整するための、化学
的および生物学的手段の設計および評価に使用するため
のH2-M欠失動物モデルを生産するであろう。そのような
H2-M改変トランスジェニック動物は、細胞培養用の細胞
源としても使用できる。
【０００４】ＭＨＣクラスII分子の機能は、外来の抗原
をＴリンパ球に提示することである。細胞表面でのＭＨ
ＣクラスII分子は、分解されたタンパク質に由来するペ
プチドと会合しているアルファおよびベータ鎖の三量体
複合体である。これらのペプチドは感染中に、侵襲した
生物体から誘導され、抗原−特異的なＴリンパ球の活性
化を導く。またＴリンパ球は、移植拒絶反応のもとにな
る非−自己ＭＨＣクラスII分子によっても活性化され
る。
【０００５】ＭＨＣクラスII分子は、骨髄に由来する抗
原提示細胞で主に発現される。３種類のヒトＭＨＣクラ
スII分子、HLA-DP、HLA-DQおよびHLA-DRがあるが、マウ
スは２種類のＭＨＣクラスII分子、H2-AおよびH2-Eを有
する。抗原分解、そしてＭＨＣクラスIIとペプチドの会
合のプロセスは、抗原提示細胞のエンドソーム系で起こ
る。細胞内でＭＨＣクラスII分子は第３の鎖、インバリ
アント鎖と会合する。このインバリアント鎖は幾つかの
機能を有する：このインバリアント鎖は、小胞体（ER）
中でペプチドおよびタンパク質がＭＨＣクラスIIと結合
することを遮断する：ＭＨＣクラスIIをERから輸送し易
くする：そしてＭＨＣクラスIIをペプチドの付加が起こ
るエンドソームに向ける。ペプチドのＭＨＣクラスIIへ
の付加が起こる前に、インバリアント鎖は除去されなけ
ればならない。タンパク質分解および酸性ｐＨはほとん
どのインバリアント鎖を分解を導き、そして除去する
が、CLIP(クラスII−会合インバリアント鎖ペプチド）
と呼ばれる最後の断片はタンパク質分解で除去できず、
この断片と抗原性ペプチドとの交換が、ＭＨＣクラスII
発現中の細胞内のエンドソームまたはリソソームにある
HLA-DM(ヒトで、マウスではH2-M）により触媒される。
機能的HLA-DMを欠く細胞株は抗原を十分にはプロセッシ
ングせずに提示するだけであり、そしてこれら細胞株の
細胞表面ではＭＨＣII分子の代わりにCLIPペプチドを含
む［Flingら、1994、HLA-DMAおよび-DMB遺伝子の両方
は、抗原-提示細胞でＭＨＣクラスII／ペプチド複合体
形成を必要とする(HLA-DMA and -DMB genes are both r
equired for MHC class II /peptide complex formatio
n in antigen-presenting cells.)、Nature 368,554-8;
Morrisら、1994、クラスII主要組織適合分子による抗原
提示におけるHLA-DMの本質的役割(An essential role f
or HLA-DM in antigen presentation by class II majo
r histocompatibility molecules.)、Nature 368,551-
4］。これらの細胞にHLA-DMを再導入すると、抗原をプ
ロセシングする能力を回復し、HLA-DMがＭＨＣクラスII
分子のペプチド内容物をモジュレーションするために重
要であることを示す。インビトロ実験では、精製したＭ
ＨＣクラスII分子中で精製したHLA-DMが直接ペプチド交
換を媒介できることが示され、CLIPまたは他の不十分な
ペプチドの適合性を、良く適合するペプチドへと交換す
る(DenzinおよびCresswell、1995、HLA-DMはＭＨＣクラ
スIIのαβ二量体からCLIPの解離を誘発し、ペプチドの
装入を容易にする(HLA-DM induces CLIP dissociation
from MHC class II αβ dimers and facilitates pept
ide loading.)、Cell 82,155-165;Sloanら、1995、HLA-
DRからペプチド解離のHLA-DMによる媒介(Mediation by
HLA-DM of dissociation of peptides from HLA-DR.)、
Nature 375,802-806)。ネズミの分子、H2-Mはヒトの細
胞株およびインビトロでHLA-DMと置き換わることができ
るが、H2-Mが欠失しているネズミの細胞株では報告され
ていない（Karlssonら、1994、非抗原提示細胞中の操作
できるＭＨＣクラスIIコンパートメントの再構成（Reco
nstitution of an operational MHC class II compartm
ent in nonantigen-presenting cell.)。Science 266,1
569-1573:Morrisら、1994、同上）。
【０００６】Ｔ細胞の活性化にはＭＨＣ分子の２つのク
ラスのいずれか１つが必要であるので、ＭＨＣクラスI
およびクラスII分子は、免疫系の機能に必須である。正
常な状況では免疫系は、感染源に対して、そしておそら
く腫瘍発生に対して良い保護を提供する。しかし、多く
の病的状況は、望ましくない免疫応答からももたらされ
る。リューマチ関節炎および全身性エリトマトーデスの
ような自己免疫疾患は、慢性的な炎症そして最終的には
標的器官の機能損失を導く調整能の解除された免疫系に
よる自己攻撃の典型例である。移植片の拒絶反応は、移
植における免疫系の望ましくない反応性の別の例であ
る。
【０００７】慢性の炎症疾患の処置について現在選択で
きるものは、炎症反応の影響を最小にすることを対象と
する。臓器移植のような重篤な症例には、患者を免疫抑
制剤を用いて処置する。これらの薬物は非−特異的であ
るが、免疫系のほとんどの反応性が減少するので、処置
された患者はあらゆる種類の感染にかかり易くなる。多
くの自己免疫疾患が、特定のＭＨＣクラスII対立遺伝子
と関連しているが、正確には、この関連がどのようにＭ
ＨＣクラスII−媒介抗原提示と相関しているのかは不明
である。ＭＨＣクラスII−媒介Ｔ細胞活性化のみをモジ
ュレートする能力で、ほとんどの望ましくない免疫反応
を制御できたが、ＭＨＣクラスI−制限Ｔリンパ球を介
する感染に対する保護は未だに放置されたままのようで
ある。
【０００８】
【発明の構成】本明細書では機能的H2-Mをもたないマウ
スを作出し、そして開示する。これらのマウスは、H2-M
の機能を理解するための、そしてヒト細胞中でのHLA-DM
の機能または発現をモジュレートする薬物の治療効果を
評価するための価値ある動物モデルを提供する。
【０００９】マウスで発現されるH2-Mは、アルファ(H2-
Ma)およびベータ(H2-Mb)鎖から成る。このアルファ鎖
は、H2-Ma遺伝子という名前の単一コピー遺伝子により
コードされており、一方、ベータ鎖は互いに高度に相同
的であり、しかも染色体上で隣に位置するH2-Mb1または
H2-Mb2遺伝子のいずれかの生成物であることができる(C
hoら、1991、ネズミの主要組織適合遺伝子複合体のPbお
よびOb遺伝子間の転写された配列のクラスター(A clust
er of transcribed sequences between the Pb and Ob
genes of the murine major histocompatibility compl
ex.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,5197-5201)。マウス
のH2-Mの機能をノックアウトするために、H2-Ma遺伝子
は単一遺伝子として存在するので、崩壊のためのより良
い標的となり得る。本発明者らが作出したH2-M改変トラ
ンスジェニックマウスは、H2-Ma遺伝子が相同的組換え
（ＨＲ）により崩壊されたモデルを提供する。このノッ
クアウトマウスの作出法は、４つの基本的工程に分ける
ことができる： １．H2-Ma遺伝子のクローニング、および胚幹（ES）細
胞のトランスフェクション用のＤＮＡ構築物の調製； ２．H2-Ma遺伝子がＨＲによりノックアウトされた、ト
ランスフェクトされたＥＳ細胞の分離； ３．ノックアウトES細胞を注入したマウス胚からキメラ
マウスの作出；そして ４．キメラマウスを育種して、生殖系列の伝播を通して
ノックアウトマウスを得る。
【００１０】本発明は、H2-Ma遺伝子が改変されたトラ
ンスジェニック動物を作出するために、マウスH2-Ma遺
伝子クローンを利用する。自然に存在する遺伝子に対す
る改変は、修飾、欠失および置換であることができる。
修飾および欠失は、自然に存在する遺伝子を非機能的に
し、「ノックアウト」動物を生成する。自然に存在する
遺伝子を、第２の種に由来する遺伝子と置換すると、第
２の種の遺伝子産物を産生する動物を生じる。自然に存
在する遺伝子を、突然変異を有する遺伝子と置換する
と、突然変異した遺伝子産物を産生する動物を生じる。
これらのトランスジェニック動物は、薬物であるアンタ
ゴニストまたはアゴニストの研究、ヒトの疾患の動物モ
デルの作成、およびその結果としてヒトHLA-DM-媒介免
疫応答に付随する障害または疾患の処置に重要である。
H2-Ma遺伝子の「ノックアウト」を持つトランスジェニ
ック動物は、ヒトにおけるHLA-DMのような、H2-M均等物
が関与する疾患の非ヒトモデルの確立に有用である。
【００１１】マウスH2-Ma遺伝子の配列は知られている
(Pelerauxら、1996、H2-Mおよびlmp2遺伝子座を含むマ
ウスＭＨＣクラスII領域の遺伝組織（Genomic organiza
tion of a mouse MHC classIIregion including the H2
-M and lmp2 loci.)、Immunogenetics,43 204-214)。H2
-MaゲノムＤＮＡは、マウスゲノムライブラリーからク
ローン化し、そしてH2-Maタンパク質をコードするＤＮ
Ａの期待された特性を有する。崩壊されたH2-Ma遺伝子
を持つトランスジェニックマウスは、標的ＤＮＡ構築物
を染色体上の内因性の遺伝子と相同的に組換えることに
より作出される。崩壊されたH2-Ma遺伝子を持つトラン
スジェニックマウスは、機能的H2-M分子を発現せず、そ
してヒトのHLA-DM-媒介疾患のインビボモデルを確立す
るために有用である。
【００１２】用語「動物」とは、ヒトを除くすべての脊
椎動物を含むために本明細書で使用する。また「動物」
は、胚性および胎児性段階を初めとする、すべての発育
段階にある個々の動物も包含する。「トランスジェニッ
ク動物」とは、標的組換えまたは微量注入あるいは組換
えウイルスを用いた感染のような、細胞レベル（subcel
lular level)での計画的な遺伝子操作により、直接また
は間接的に遺伝情報の改変を持つ、または受けた1つ以
上の細胞を含む任意の動物である。用語「トランスジェ
ニック動物」は、古典的な交雑−育種または体外受精を
包含することを意図するのではなく、むしろ１つ以上の
細胞が組換えＤＮＡ分子により改変された、または組換
えＤＮＡ分子を受容した動物を包含することを意味す
る。この組換えＤＮＡ分子は、具体的には、定められた
遺伝子座を標的することができ、染色体内にランダムに
組み込まれることができ、または染色体外の複製性ＤＮ
Ａであることができる。用語「生殖系列のトランスジェ
ニック動物」とは、遺伝的改変または遺伝情報が生殖系
細胞に導入されたトランスジェニック動物を呼び、これ
により遺伝子情報を子孫に伝達する能力を付与する。も
しそのような子孫が実際にそのような改変または遺伝情
報の幾らか、またはすべてを保有するならば、それらも
トランスジェニック動物である。
【００１３】この改変または遺伝情報は、レシピエント
が属する動物種には外来であるか、または特定の個々の
レシピエントにのみ外来であるか、あるいはすでにレシ
ピエントによりすでに保有されている遺伝子情報であっ
てもよい。最後の場合では、改変された、または導入さ
れた遺伝子は天然の遺伝子とは異なるように発現できる
か、または全く発現できない。
【００１４】改変されたH2-Ma遺伝子は、一般的に宿主
動物に対して天然であるものと同じH2-Maを完全にコー
ドすべきではなく、そしてその発現産物は少々または大
きく変化しているはずであるか、または全く存在しな
い。しかしより穏やかに改変されたH2-Maは、本発明の
範囲内にあると考えられる。
【００１５】標的遺伝子を改変させるために使用する遺
伝子は、限定されるものでないが、ゲノム供給源からの
単離、単離したｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡの調製、直
接合成またはそれらの組合わせを包含する多種多様の技
法により得ることができる。
【００１６】導入遺伝子を導入するための標的細胞の種
類は、ＥＳ細胞である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養
され、そして胚と融合された、前−移植胚から得ること
ができる(M.J.Evansら、Nature 292:154-156(1981);M.
O.Bradleyら、Nature 309:255-258(1984);Gosslerら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 83:9065-9069(1986);Robertson
ら、Nature 322,445-448(1986);S.A.Woodら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 90;4582-4584(1993))。導入遺伝子は、
ＤＮＡトランスフェクションのような標準的技法によ
り、またはレトロウイルス−媒介形質導入により、ＥＳ
細胞中に効率的に導入できる。その後、生成した形質導
入されたＥＳ細胞を非−ヒト動物に由来する胚盤胞と合
同させることができる。その後、導入されたＥＳ細胞
は、胚のコロニーを形成し、そして得られるキメラ動物
の生殖系（列または生殖細胞株）の一因となる(R.Jaeni
sch、Science 240:1468-1474(1988))。
【００１７】H2-Mは複雑なメカニズムの独立した成分な
ので、H2-Ma ＤＮＡによりコードされるものを含むタン
パク質は、それらの免疫応答のメカニズムに対する貢献
を理解するならば個別にも、そして一群としても調べな
ければならない。個々の遺伝子の寄与およびそれらの発
現産物を決定するとの課題に対する１つの取り組み方は
単離された遺伝子を使用して、分化全能的ＥＳ細胞（本
明細書に記載されるような）中の天然の野生型遺伝子を
選択的に不活性化し、次いでトランスジェニックマウス
を作出することである。遺伝子−標的化されたＥＳ細胞
を、遺伝子−標的化されたトランスジェニックマウスの
作出に使用することは1987（Thomasら、Cell 51:503-51
2(1987))に記載され、そしていたるところで再研究され
ている(Frohmanら、Cell 56:145-147(1989);Capecchi,T
rends in Genet.5:70-76(1989):Baribaultら、Mol.Bio
l.Med.6:481-492(1989);Wagner,EMBO J.9:3025-3032(19
90);Bradleyら、Bio/Technology 10:534-539(1992))。
【００１８】特定の変化を染色体の対立遺伝子に挿入す
るために、選択相同的組換えを使用することにより、任
意の遺伝子領域を所望する任意の突然変異に改変する
か、または不活性化するための技法が利用できる。しか
し相同的なプラスミド−染色体組換えは、哺乳類の細胞
中で、10-6から10-3の間の頻度で検出されるだけであっ
た(Linら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82;1391-1395(198
5);Smithiesら、Nature 317;230-234(1985);Thomasら、
Cell 44:419-428(1986);Songら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 84:6820-6824(1987))。非相同的プラスミド−染色体
相互作用は、相同的挿入に比較すると、より頻度が高
く、105-倍のレベル(Linら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
2;1391-1395(1985))から102-倍のレベル(Thomasら、Cel
l 44:419-428(1986);Songら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:6820-6824(1987)の頻度で起こる。
【００１９】このネズミＥＳ細胞中での低い相同的組換
えの頻度を克服するために、稀な相同的組換え体を検出
または選択するための、種々の方法が開発された。相同
的な改変の事象を検出するための1つの取り組み方は、
相同的挿入のための形質転換体細胞のプールをスクリー
ニングするために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を
利用し、続いて個々のクローンをスクリーニングする
（Kimら、Nucleic AcidsRes.16;8887-8903(1988)；Kim
ら、Gene 103:227-233(1991))。あるいは、相同的挿入
が起こった時にのみ活性になるマーカー遺伝子が構築さ
れている、陽性の遺伝的選択法が開発され、そしてこれ
らの組換え体を直接選択できる（Sedivyら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 86;227-231(1989)。相同的組換え体を選
択するための最も有力な取り組み方の１つは、改変の直
接的選択が存在しない遺伝子（H2-Maのような)用に開発
された、陽性−陰性選択（positive-negative selectio
n:PNS)法である(Mansourら、Nature 336:348-352:(198
8);Capcchi,Science 244:1288-1292,(1989);Capcchi,Tr
ends in Genet,5:70-76(1989))。このPNS法は、マーカ
ー遺伝子がそれ自身のプロモーターを有するので、高レ
ベルで発現しない遺伝子を標的化するために、より効率
的な方法である。非相同的組換え体は、単純ヘルペスウ
イルスのチミジンキナーゼ(HSV-TK)を使用することによ
り選択され、そしてガンシクロビア（GANC)またはFIAU
(1-(2-デオキシ 2-フルオロ-B-D-アラビノフラノシル)-
5-ヨードウラシル)のようなヘルペス薬物を用いてその
非相同的挿入に対して選択する。この対抗選択により、
生存する形質転換体中の相同的組換え体の数を増加させ
ることができる。
【００２０】本明細書で使用する場合、「標的化された
遺伝子」または「ノックアウト」(KO)は、限定されるも
のではないが本明細書に記載の方法を含むヒトの介入に
より、非−ヒト動物の生殖系列に導入されたＤＮＡ配列
である。本発明の標的化された遺伝子は、コグネイト内
因性対立遺伝子を特異的に改変させるように設計されて
いるＤＮＡ配列を含む。
【００２１】ＭＨＣクラスII分子は、外来性のタンパク
質に由来するペプチドに結合し、そしてＴ細胞により認
識されることができる細胞表面で、これらのペプチドを
提示する。ＭＨＣクラスII分子の提示機能をモディファ
イするための２つの様式を想定することができる。ＭＨ
ＣクラスII分子自体の発現を遮断するか、あるいは新た
に合成されたＭＨＣクラスII分子へのペプチドの装入プ
ロセスを遮断する、いずれかを行うことができる。ＭＨ
ＣクラスII分子を欠失しているマウスが作出された（Co
sgroveら、1991、ＭＨＣクラスII分子を欠いているマウ
ス(Mice lacking MHC classII molecules.)、Cell 66,1
051-66)。それらは、低数のＭＨＣクラスII−反応性Ｔ
細胞のみで免疫系の機能が減少し、そしてＢ細胞の数は
正常であるが、それらがある一定の抗体を産生する能力
に影響をうけている。それらのウイルス感染に対する抵
抗能は、正常であると思われる（Bodmerら、1993、細胞
毒性Ｔ細胞の自律性の環境的モジュレーション(Environ
mental modulation of theautonomy of cytotoxic T ly
mphocytes.)、Eur.J.Immunol.23,1649-54;Lauferら、19
93、自己免疫糖尿病は、トランスジェニック 主要組織
適合複合体クラスII−欠失マウスに誘導できる（Autoim
mune diabetes can be induced in transgenic major h
istocompatibility complex classII-deficient mic
e.)、J.Exp.Med.178,589-96)。ＭＨＣクラスII発現の調
節は大変複雑なので、どの転写因子が有力な薬物により
標的とされるべきかは、完全に明らかではない。最近の
データでは、HLA-DMがＭＨＣクラスII分子上で、低親和
性ペプチドの高親和性ペプチドへの交換を触媒する酵素
として作用することが証明されたので、ペプチド装入の
制御は容易に行える可能性がある。しかしすべての抗原
が等しくHLA-DMの不在に影響されるわけでなく、そして
HLA-DMの不在はＭＨＣII分子の完全な不在よりは知られ
ている効果が少ない。HLA-DMの発現レベルは、ＭＨＣク
ラスII分子およびインバリアント鎖の発現レベルよりも
少なくとも10倍低い。他のＭＨＣクラスII要素に比べ
て、比較的少量のHLA-DMは、その触媒機能と矛盾しな
い。ＭＨＣクラスIIまたはインバリアント鎖とは異な
り、HLA-DMは低分子薬物により容易に接近できるエンド
ソーム区分に主として位置する。H2-Mの少量および細胞
内の位置で、これは魅力的な薬物標的となる。HLA-DMの
機能を遮断できる薬物は有用な治療薬であり、したがっ
てH2-MノックアウトマウスはH2-Mのインビボ機能および
ＭＨＣクラスII機能に及ぼす効果を証明するために有用
であると思われる。この細胞のデータに基づき、H2-Mノ
ックアウトマウスでは多くの（しかし全てではない）抗
原がＭＨＣクラスII分子によりうまく提示されないと予
想できる（Brooksら、1994、欠失または突然変異したHL
A-DM遺伝子を含むヒトAPCにおける、マウスI-AKクラスI
I分子による抗原提示および集成（Antigen presentatio
n and assemblyby mouse I-AK class II molecules in
human APC containing deleted or mutated HLA DM gen
e.)、J.Immunol.153,5382-92;Mellinsら、1990、正常HL
AクラスII遺伝子を用いた突然変異体における外来性抗
原の欠陥プロセッシングおよび提示（Defective proces
sing and presentation of exogenous antigens in mut
ants with normal HLA class II gene)、Nature 343,71
-4)。抗原提示の低下は、ほとんど感染に対する感受性
を増すようであり、そしてこの効果の程度をH2-Mノック
アウトマウスで研究することができる。
【００２２】H2-Mノックアウトマウスは、Ｔ細胞の胸腺
発生に関するＭＨＣクラスIIおよびペプチドの役割を定
めるために役立つだろう。ＭＨＣクラスII−制限Ｔ細胞
の発生には、胸腺でのＭＨＣクラスII分子の発現が必要
である。しかし発生しているＴ細胞がどのようにＭＨＣ
クラスII分子を認識し、そして胸腺中のＭＨＣクラスII
分子がペプチドを装入しているどうかは明らかではな
い。H2-Mノックアウトマウスでは、細胞表面でのＭＨＣ
クラスIIレベルは普通であるが、ほとんどのＭＨＣクラ
スII分子がインバリアント鎖ペプチドを担持している。
H2-Mノックアウトマウスは、正常数のＭＨＣクラスII−
制限Ｔ細胞数よりは低く発生し、これらの細胞の発生
に、胸腺中のＭＨＣIIと会合したペプチドの多様性が必
要であることを示唆している。Ｔ細胞の発生にはH2-Mの
存在が必要であることが示されているので、ヒト細胞中
でHLA-DMの発現または機能を遮断する薬物は、若い個体
でＴ細胞のレパートリー（repertoire)を損ねる副作用
を有するかもしれない。H2-Mノックアウトマウスで胸腺
細胞選択法をさらに分析するために、これらのマウスを
Ｔ細胞レセプターのトランスジェニックマウスとともに
育種する。これらのマウスのＴ細胞レセプターはすべて
同じ特異性を有するので、既知の反応性を用いて、H2-M
が特異的Ｔ細胞レセプターの発生に及ぼす効果の研究が
可能となる。
【００２３】H2-Mが慢性の炎症疾患および移植拒絶反応
の進行に及ぼす効果も、H2-Mノックアウトマウスで研究
する。H2-Mの不在でのＭＨＣクラスII分子の低レベルお
よび劣る抗原提示の可能性は、ＭＨＣクラスII−制限Ｔ
細胞の活性化およびエフェクター機能が影響を受けるこ
とを示している。HLA-DMの機能を標的とする薬物は、自
己免疫疾患の進行を遅らせ、そして移植拒絶反応を防止
する治療効果を有する。ＭＨＣクラスII分子の不在の効
果は、自己免疫疾患の幾つかのマウスモデルで分析さ
れ、そしてほとんどの場合で疾患の重症度が減少したこ
とを示した(GrusbyおよびGlimcher,1995、ＭＨＣクラス
II−欠失マウスにおける免疫応答（Immuneresponses in
MHC class II-deficient mice.)、Annu.Rev.Immunol.1
3,417-35)。本明細書に開示したこのH2-Mノックアウト
マウスは、自己免疫疾患の進行に及ぼすH2-Mの効果を研
究するために、異なる自己免疫疾患マウスモデルと交雑
させる。同様に移植におけるH2-Mの関与を、H2-Mノック
アウトマウスで研究する。
【００２４】H2-Mノックアウトマウスに由来する細胞
を、特定の抗原性ペプチドを提示するために使用する。
正常なマウスに由来する抗原提示細胞は、ペプチドが安
定に結合しているＭＨＣクラスII分子を有する。正常細
胞上のＭＨＣクラスII分子は、外来性のペプチドを装入
できるが、ＭＨＣクラスII分子の小さい部分だけでも加
えられたペプチドに結合する。対照的に、H2-Mを欠くマ
ウスに由来する抗原提示細胞はインバリアント鎖ペプチ
ドを相当な程度まで含むＭＨＣクラスII分子を有する。
これらのペプチドは、ｐＨを下げることにより、そして
組換えH2-Mを細胞の外側に加えることにより、外部から
加えたペプチドと交換することができる。この効果を、
抗原提示細胞がH2-Mノックアウトマウスから集められ、
そして選択したペプチドをインビトロで装入する状況下
で利用する。このように抗原性ペプチドを装入された細
胞は、次に抗原提示細胞として使用され、インビトロで
Ｔ細胞を刺激するために、またはインビボ刺激用に動物
に注入する、いずれかのために装入したペプチドを効率
的に提示する。同様に、HLA-DMブロッキング剤は、特定
の抗原に対する免疫系の反応性が不十分である場合（例
えば、ガン患者）の疾患の処置に、同様に使用される。
この場合、抗原提示細胞を患者から集め、そしてペプチ
ド−含有ＭＨＣクラスII分子が細胞表面でインバリアン
ト鎖ペプチド−含有ＭＨＣクラスII分子と置き換わるの
に十分長い時間、細胞を培養物中に維持して、HLA-DMを
遮断する薬物を用いて処理する。次にこれらの細胞は上
記のように腫瘍−由来ペプチドを効率的に装入し、そし
て次に患者に戻して投与することができ、このように患
者自身のＴ細胞に対して効率的な抗原提示を提供する。
抗原特異的なＴ細胞寛容性は、Ｔ細胞を特異的な抗原性
ペプチドの高用量を装入した抗原提供細胞に提示するこ
とにより誘導できる。Ｔ細胞寛容性の誘導は、これは長
期の薬物処置を必要としないことを意味するので、臨床
的には理想的な状況である。反応性Ｔ細胞の抗原特異性
が知られている自己免疫疾患の場合は、抗原提示細胞に
特定の抗原性ペプチドを効率的に装入することが、Ｔ細
胞寛容性を誘導するために使用される。
【００２５】以下の実施例は、本発明を具体的に説明す
る目的のために提供されるものであって、本発明の範囲
を限定することを意図するものではない。
【００２６】
【実施例】実施例１ マウスH2-Maゲノムクローンの単離： 相同的組換えによ
り特定の遺伝子を崩壊させるためには、崩壊した遺伝子
を含むＤＮＡ構築物が、ＥＳ細胞のトランスフェクショ
ンに必要である。まず最初に、マウスH2-Ma遺伝子がＤ
ＮＡ構築物を作成するために必要である。マウスH2-Ma
遺伝子は、H2-Mb2遺伝子の5'近位領域に位置することが
知られていた(Choら、1991、ネズミの主要組織適合遺伝
子複合体のPbおよびOb遺伝子間の転写された配列のクラ
スター(A cluster of transcribed sequences between
the Pb and Ob genes of the murine major histocompa
tibility complex.)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,5197
-5201)。H2-Ma遺伝子を含むマウスのゲノムＤＮＡをク
ローン化するために、マウスH2-Mb2 cDNA（Peleraux
ら、1995、H2-Mおよびlmp2遺伝子座を含むマウスＭＨＣ
クラスII領域の遺伝組織（Genomic organization of a
mouseMHC classIIregion including the H2-M and lmp2
loci.)、Immunogenetics、印刷中)を32-P放射性同位体
を用いて標識し、そして129 SV マウスゲノムライブラ
リーから調製した4×105ファージプラークをスクリーニ
ングするためのプローブとして使用した。７つのファー
ジクローンがプローブとハイブリダイズし、そして特性
を決定するために分離された。２つのクローンが完全な
H2-Ma遺伝子を含むことが分かり、それらの１つ(クロー
ン２)がさらなる分析に選択された。図１はクローン２
によりカバーされるH2-Ma遺伝子の領域を表す。H2-Ma遺
伝子の制限地図は、クローン２の分析から得た。
【００２７】実施例２ 遺伝子標的構築物の調製； ＤＮＡ構築物は、pUCプラス
ミドベクターで作成した。エキソン1およびイントロン
１の部分を除くほとんどのH2-Ma遺伝子を包含する6.7Kb
のゲノム断片を、クローン２から得、そして組換え用の
相同的領域として構築で使用した（図１のＡ）。ネオマ
イシン耐性遺伝子を含むneoカセットを、H2-Ma遺伝子の
第２エキソンに配置した。neoカセットがH2-Ma遺伝子と
同じまたは逆方向の２種類の構築物を作成した。エキソ
ン２中の61bpの欠失も、neoカセットが置かれた場所に
作成した。１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ
（HSV tk)遺伝子を、相同的領域の3'末端に配置した。
【００２８】実施例３ 遺伝子−標的化されたＥＳ細胞株の分離： ＥＳ細胞のトランスフェクション ＤＮＡ構築物を、NotI、SfiIまたは２つの制限酵素の組
み合わせを用いて完全消化することにより直線化した。
次にＤＮＡを２容量の氷冷エタノール（−20℃で）によ
り、１時間沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心により集
め、0.5mlの70％エタノールで１回すすぎ、風乾し、そ
して次に１mg/mlのリン酸緩衝化生理食塩液(ギブコ:Gib
co)に溶解した。
【００２９】ＥＳ細胞E14(Hooperら、1987、培養した細
胞による生殖系裂のコロニー化に由来するHPRT-欠失(Le
sch-Nyhan)マウスの胚(HPRT-deficient(Lesch-Nyhan) m
ouseembryos derived from germline colonization by
cultured cell)、Nature 326,292-295)を、未分化段階
で胚性繊維芽細胞(EF)と同時培養することにより、しか
も1000U/mlの白血病阻害因子(leukemia inhibitory fac
tor:LIF、ギブコ）を含有する培養基（15％ FCS、1mM
ピルビン酸ナトリウム、0.1mM b-メルカプトエタノー
ル、2mM L-グルタミン、100U ペニシリンおよび100U ス
トレプトマイシン)中に維持した。EF細胞は、Robertson
により記載された方法(Robertson、1987、胚-由来幹細
胞株(Embryo-derived stem cell lines.)、第４章、
「奇形ガンおよび胚幹細胞。実践的な手法（Teratocarc
inomas and embryonic stem cells.A practical approa
ch)」から、Robertson，E.J.,編集、IRL出版、オックス
フォード、ワシントンDC）に従い、15−17日のマウス胎
児から調製した第１代繊維芽培養物であった。EFを、培
養基中で10μg/mlのマイトマイシンＣ(シグマ:Sigma)を
用いて２時間処理し、供給細胞として使用する前に細胞
分裂を止めた。ＤＮＡトランスフェクションに関して
は、ＥＳ細胞をトリプシン処理により回収し、そして6.
25×106細胞/mlで培養基に再懸濁した。Gene Pulser
（バイオラッド：BioRad)を使用する250uFおよび340ボ
ルトでの電気穿孔のために、20μgのDNA構築物を、0.8m
lのＥＳ細胞懸濁液に加えた。
【００３０】トランスフェクトしたES細胞を、EF-被覆9
0mmプレート上に、2.5×106/90mmプレート(培養基中)で
まいた。２日後、細胞を培地中（400μg/ml G418(Genet
icin、ギブコ）および２μM GANC(Cytosin、シンテック
ス(Syntex)を含む)で薬物選択に供した。培養基を毎日
交換した。約４日目に始まる大量の細胞死は明らかであ
り、そして約８日目までに、毎日の培地交換を通してほ
とんどの死んだ細胞を除去した。生存している細胞コロ
ニーは、約７日まで顕微鏡により観察できた。
【００３１】ＥＳ細胞での相同的組換えのためのＰＣＲ
スクリーニング トランスフェクション後、11日目のＥＳコロニーの大き
さは、ＰＣＲスクリーニングのために十分な大きさであ
った。細胞コロニーを集めるために、90mmプレート中の
培養基を吸引し、そして10mlのPBSを加えた。個々の細
胞コロニーは、立体顕微鏡により位置を確認し、20μl
容量で集め、そして96-ウェルプレートに移した。ＥＳ
コロニーの単一細胞懸濁液を調製するために、25μlの
0.25％トリプシン（ギブコ）を、96ウェル-プレートの
ウェル毎に加えた。37℃で８分間トリプシン処理した
後、25μlの培養基を加えた。すべてのＥＳコロニーは
カルチャー中でマスタープレートとして維持され、その
間、相同的組換えが起こったことをＰＣＲによりスクリ
ーニングした。マスタープレートを調製するために、60
μlの各細胞試料は、EF細胞を被覆し、そしてG418およ
びGANCを含む培養基を180μl/ウェルで含んでいる96ウ
ェル-プレートに移した。
【００３２】第１回のＰＣＲスクリーニングについて、
各細胞溶解試料は96ウェル-プレート中に１列の試料と
して並んだ12細胞コロニーから調製した。マスタープレ
ートを調製した後、プレートの各列について約90μl/ウ
ェルの残りの細胞試料をプールし、そして細胞をペレッ
ト化した。すべての培地を排出した後、細胞は30μlの
蒸留水を加え、そして軽くボルテックス処理することに
より溶解した。細胞溶解物は、初めに95℃で10分間加熱
し、続いて１μlのプロティナーゼＫ(10mg/ml、水中）
を軽くボルテックス処理しながら加え、プロティナーゼ
Ｋ消化のために50℃で90分間インキューベーションし、
そして次にプロティナーゼＫの不活性化のために95℃で
10分間加熱することにより調製した。
【００３３】ＰＣＲは、9600GeneAmpシステム(パーキン
エルマー:Perkin Elmer)を使用して行った。反応混合
物は、５μlの細胞溶解物、４μMの各２種類のオリゴヌ
クレオチドプライマー、200μMの各dATP、dTTP、dCTPお
よびdGTP、および５U AmpliTaq DNA ポリメラーゼをＰ
ＣＲ緩衝液(10mM Tris-Cl、pH8.3、50mM KClおよび1.5m
M MgCl2)中に含んだ。反応条件は、94℃で2'、60℃で2'
そして次に72℃で2'を３サイクル、次に94℃で15"、60
℃で15"そして72℃で1'を40サイクル、続いて72℃で7'
であった。neo遺伝子およびH2-Ma遺伝子が同じ方向であ
るＤＮＡ構築物には、相同的組換えを増幅するために使
用したＰＣＲプライマーは:ＭＡ３Ｓ（５’−ＧＧＡＴ
ＴＣＣＴＧＴＣＡＧＧＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧ−３’）
［配列番号１］Ｎｅｏ−１３４Ｒ（５’−ＡＡＧＣＧＣ
ＡＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＣＣＴＴ−３’）［配列番
号２］であり、そして増幅したＤＮＡの大きさは約１kb
と予想される。
【００３４】neo遺伝子およびH2-Ma遺伝子が逆方向であ
るＤＮＡ構築物には、プライマーは:MA3Sおよびｎｅｏ
−１８５８（５’−ＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴＡＡＴＴＣＣ
ＡＴＣＡＧ−３’）［配列番号３］であり、そして増幅
したＤＮＡの大きさは約0.98kbと予想される。
【００３５】ＰＣＲにより増幅した特定のＤＮＡ断片を
検出するために、20μlのＰＣＲ試料を１％アガロース
ゲル電気泳動により大きさに従い分離し、そしてナイロ
ン膜（Hybond、アマシャム：Amersham)にブロットし、
そして32Ｐ-標識オリゴヌクレオチドプローブＡ(５’−
ＣＣＡＧＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＣＴＧＧ
ＡＧＴＧＴＴＴＡＧＧＴ−３’）［配列番号４］とハイ
ブリダイズさせた。オリゴプローブにより検出された期
待された大きさのＤＮＡバンドを含むＰＣＲ試料は、さ
らにスクリーニングするために推定上の陽性群と考え
た。
【００３６】約３−４日培養した後のマスタープレート
中のＥＳ細胞は、スプリッティング用に準備された。陽
性群中の細胞コロニーは、陽性コロニーを確認するため
に第２回目のＰＣＲにより個別にスクリーニングした。
培養物中に陽性群を維持するために、ウェル中の細胞は
最初に培養基を除去し、50μlのPBSを用いて１回すす
ぎ、40μlの0.25％トリプシンを用いて37℃で５分間処
理し、続いて90μlの培養基を加えることによりトリプ
シン処理した。次に細胞を再懸濁し、そしてそれらの20
μlを、ＥＦを用いて被覆し、そして200μlの培養基(G4
18およびGANCを含む)で満たしたマスタープレートに移
した。残りの細胞（110μl/ウェル)をエッペンドルフ試
験管中に別個に集めた。細胞溶解物を調製し、そして相
同的組換えのシグナルをＰＣＲにより増幅し、そして上
記のオリゴヌクレオチドプローブを使用してハイブリダ
イゼーションにより検出した。
【００３７】ゲノムサザンハイブリダイゼーションによ
る遺伝子−標的化されたＥＳ細胞の確認 ＰＣＲスクリーニングで陽性コロニーから派生したＥＳ
細胞を培養で増やし、そしてＤＮＡを細胞から精製し
た。ゲノムＤＮＡをApaIで消化し、１％アガロースゲル
で分離し、Hybond-N＋膜(アマシャム)上にブロットし、
そして32P-標識化ＤＮＡ断片に図１に示すようにハイブ
リダイズさせた。プローブは、正常H2-Ma遺伝子中の2.8
Kb ApaI断片、および標的構築物で相同的組換えを受け
たH2-Ma遺伝子中の1.8Kb ApaI断片にハイブリダイズす
る0.6Kb EcoRI/BamHI断片(EcoRI部位はラムダベクター
に由来し、そしてこのベクター配列は全プローブ中の８
bp未満を構成した）であった。相同的組換えによるH2-M
a遺伝子の崩壊を図１のＡに示す。野生型H2-Ma遺伝子の
制限地図（Ａ−ApaI、Ｈ−HindIII、Ｎ−NotI、Ｓ−Stu
I、Sf−SfiI)を示し、番号を付した黒塗りの箱はエキソ
ンである。H2-Ma遺伝子の遺伝子標的化構築物を、H2-Ma
遺伝子の第二エキソン中に配置されたネオマイシンカセ
ット(neo)と共に示し、そして61塩基対の欠失もneoを配
置したエキソン２に作成した。１型単純ヘルペスウイル
スのチミジンキナーゼ(HSV-TK)遺伝子を、構築物の3'末
端に配置した。標的化構築物と内因性H2-Ma遺伝子との
間の相同的組換え後の、崩壊されたH2-Ma遺伝子の構造
も示す。
【００３８】実施例４ ドナーの胚盤胞中への遺伝子−標的化されたＥＳクロー
ンの注入 崩壊したH2-Ma遺伝子を持つ遺伝子−標的化されたＥＳ
細胞株を、ＰＣＲにより特性決定し、そしてサザンハイ
ブリダイゼーション分析により確認した。次にＥＳ細胞
は、細胞培養物をトリプシンで処理し、供給細胞を30−
45分間接着させ、そして非接着のＥＳ細胞を除去するこ
とにより、それら供給細胞から分けた。このＥＳ細胞を
C57BL/6J レシピエント胚盤胞に、すでに記載された技
法（Bradley,A.“キメラマウスの生産および分析。奇形
ガンおよび胚幹細胞において：実験的手法(Production
and analysis of chimeric mice.In Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach)"、
E.J.Robertson,編集、オックスフォード、IRL出版、(19
87)、第113−151頁)を使用して注入した。
【００３９】約3.5日の妊娠段階のマウスの胚を、過剰
排卵したC57BL/6Jマウスの子宮から集めた。約10−15個
のＥＳ細胞を、胚の胚盤胞腔中に注入した。注入した胚
を、約2.5日の偽妊娠CD1マウスの子宮に移し、そしてこ
れらの胚から発生したマウスが17日後に誕生した。全16
匹のキメラマウスを、H2-Maノックアウト細胞株を注入
した胚から得た。本発明者らが使用したＥＳ細胞E14
は、優性な野ネズミ色（agouti:A)の被毛色遺伝子につ
いてホモ接合性の129 Olaマウス株から派生しているの
で、ＥＳ細胞株E14が野ネズミ色（Ａ)の被毛色遺伝子に
ついてホモ接合性である時、ＥＳ細胞の注入した(黒色
の被毛色)C57BL/6胚盤胞中への浸透は、キメラ被毛色の
マウスを生じる。
【００４０】実施例５ キメラマウスの育種 キメラのオスのマウスを、野生型C57BL/6(黒色の被毛)
のメスのマウスと交配させた。キメラXC57BL/6交雑に由
来する幾つかの子孫は、もしキメラのオスがその生殖細
胞株に包含されたＥＳ細胞遺伝物質(黒色の被毛色に対
して野ネズミ色が優性である)を有するならば、野ネズ
ミ色になることが期待される。このような交雑を行い、
崩壊したH2-Ma遺伝子を含む、ＥＳ細胞遺伝情報のその
子孫への伝達について試験する。
【００４１】H2-Ma遺伝子型を決定するために、ゲノム
ＤＮＡを離乳後の各マウスの約１cmの尾から精製した。
ゲノムＤＮＡを記載されているように単離し（Laird
ら、同上)、続いてフェノールおよびフェノール:クロロ
ホルム抽出、そしてエタノール沈殿を行った。サザンハ
イブリダイゼーション分析（本明細書に記載のように）
を使用して、崩壊したH2-Ma遺伝子を含む子孫を同定し
た。これらのトランスジェニック子孫は、H2-Ma遺伝子
の崩壊に関してヘテロ接合性である。トランスジェニッ
ク ヘテロ接合性および非トランスジェニックマウス
(尾)の両方のゲノムＤＮＡを、ApaIで消化し、１％アガ
ロースゲルで分離し、Hybond-N＋膜にブロットし、そし
て3'フランキングＤＮＡプローブとハイブリダイズし
て、トランスジェニックH2-Ma遺伝子構造を確認した。
サザンハイブリダイゼーション分析では、改変したH2-M
a遺伝子は予想され、そしてすでにH2-Ma-標的化された
ＥＳクローンで特性決定したものと同一であることが確
認された。図４、図５、図６および図７は、サザンブロ
ットによるマウスの尾のＤＮＡ分析を示し、野生型（＋
／＋）、ヘテロ接合性（＋／−）およびホモ接合性（−
／−）マウスのハイブリダイゼーションプロフィールを
表す。
【００４２】実施例６ ヘテロ接合性マウスの育種およびホモ接合性H2-Ma欠失
マウスの作成 各々が１コピーの改変されたH2-Ma遺伝子を含むオスお
よびメスのトランスジェニックマウス（ヘテロ接合性マ
ウス）を互いにかけ合わせて、H2-Ma遺伝子の両コピー
が標的化された改変されたトランスジェニックH2-Ma遺
伝子のマウスを作成した。1/4のマウスの胚が、改変さ
れたH2-Ma遺伝子についてホモ接合性となることが予想
された。生存している子孫を、上記のようにサザンハイ
ブリダイゼーションにより遺伝型を決定した。ホモ接合
性の突然変異体マウスは、もし欠失遺伝子が胚発生に影
響しなければ４匹の子のうち１匹の割合で生まれる。ホ
モ接合性の突然変異体マウスは、尾のＤＮＡ試料の分析
により同定され、この試料中、完全なH2-Ma遺伝子に由
来する2.8KbのDNAバンドではなく、崩壊した遺伝子に由
来する1.8Kb ApaI切断ＤＮＡバンドだけが、0.6Kbのフ
ランキングプローブにハイブリダイズする(図１の
Ｂ）。全45匹の子孫マウスの中の33％（15マウス)が、
崩壊H2-Ma遺伝子についてホモ接合性（−／−）であ
り、35.5％(16マウス)がH2-Ma遺伝子についてヘテロ接
合性であり、そして31.1％(14マウス）が野生型（＋／
＋）であると決定される。
【００４３】実施例７ ホモ接合性H2-Ma欠失マウスの特性決定 H2-M+/+（野生型）およびH2-M-/-（欠失）マウスに由来
する脾細胞を、間接免疫蛍光法を使用してH2-M発現に関
して分析した。脾臓細胞を、Cell-Tak(コラボラティブ
バイオメディカル リサーチ:Collaborative Biomedical
Research)で被覆したカバースリップ上で培養し、その
後、４％ホルムアルデヒド-PBSを用いて固定した。固定
後、細胞を50mM NH4ClおよびPBSを用いて洗浄した。抗
体のインキューベーションは、透過性化(permeabilizat
ion)のために0.6％魚皮ゼラチンおよび0.2％サポニンを
含むPBS中で行った。免疫グロブリンＧ(IgG)に対するTe
xas-Red-標識化ウサギ抗体(モレキュラープローブズ：M
olecular Probes)、およびIgGに対する蛍光イソチオシ
アネート(FITC)-標識化ラット抗体(カッペル:Cappel)
を、第二試薬として使用した。蛍光細胞を、バイオラッ
ドの共焦点顕微鏡の使用により影像した。H2-M+/+マウ
スでは、H2-M染色が小胞構造に位置し（図２のＣ、
赤）、一方、H2-M-/-マウスに由来する細胞中にH2-M染
色は検出されなかった（図２のＤ、赤）。抗−H2-Abモ
ノクローナル抗体（mAb)M5/114を用いた同時染色では、
２つの細胞型の間に明らかに異なる染色はなかった（図
２のＣおよびＤ、緑を比較されたい）。突然変異体マウ
ス中に正常H2-Mタンパク質の不在が、代謝的に標識され
た脾細胞に由来する免疫沈降したH2-Mの２次元ゲル電気
泳動により確認された。野生型の細胞に由来する沈殿物
はH2-MaおよびH2-Mbの両方を含んだが、H2-M-/-細胞に
由来する沈殿物中にはH2-Mタンパク質は検出されなかっ
た（図３）。
【００４４】H2-MがＭＨＣクラスIIの細胞表面発現に及
ぼす効果を決定するために、野生型およびH2-M欠失マウ
スに由来するリンパ節細胞を、H2-Ab-反応性mAbのパネ
ルとインキューベーションし、そしてフローサイトメト
リー(FACS)により分析した。幾つかのmAb(M5/114、図
４、Y3PおよびAF6-120.1)で、野生型および突然変異体
細胞が等しい強度で染色され、これはH2-Abの細胞表面
レベルが同等であることを示している(図４）。これら
のmAbとは対照的に、他の２つの抗-H2-Ab mAbでは異な
る染色が観察された：BP107は突然変異体細胞を全く染
色しなかったが、KH74は突然変異体細胞を低い強度で染
色した(図４）。これらの知見は、H2-M-/-細胞上のH2-A
bの配置が、野生型対照細胞とは異なることを示唆して
いる。よく報告されている知見の観点では、DMをクラス
II分子からCLIPの除去と関連させている(Sloanら、199
5、Nature 375,802.DenzinおよびCresswell,1995,Cell
82, 155.Shermanら、1995,Immunity 3,197)。H2-M-/-細
胞への幾つかの抗-H2-Ab mAbの結合低下は、CLIPが他の
ペプチドに交換できなかったことを反映しているらし
い。この可能性を調べるために、突然変異体細胞をCLIP
-会合H2-Abと反応するmAb30-2で染色した(Morkowski
ら、1995,J.Exp.Med.182,1403)。野生型細胞との弱い反
応性とは対照的に、H2-M-/-細胞はmAb 30-2で強く染ま
った（図４）。さらにmAb 30-2とのプレインキューベー
ションで、突然変異体細胞に対する抗-H2-Ab mAb KH74
の反応性は完全に遮断されたが、同じ処理がH-2M+/+対
照細胞のKH74染色には効果がなかった(図４）。すなわ
ちほとんど全てのクラスII分子がCLIPを含むようであ
る。
【００４５】H2-M-/-マウスに由来する組織切片の免疫
組織化学的分析では、FACS分析の知見が確認された。胸
腺の低温保持切片をH2-Mについて、ウサギ抗血清K553、
続いてIgGに対するビオチン化ウサギ抗体（ジャクソン
イムノリサーチ:Jackson ImmunoResearch)を使用して染
色した：H2-Abについて、ビオチン化 30-2mAbを使用し
た。結合した抗体をアルカリホスファターゼ−結合スト
レプトアビジン（ジャクソン イムノリサーチ)、続いて
発色基質を用いて検出した。このように突然変異体マウ
スのリンパ組織中のH-2M発現は検出できず、野生型マウ
スでは、H-2M発現が脾臓およびリンパ節中のＢ細胞、マ
クロファージおよび樹状細胞で観察された。正常な胸腺
では、H-2Mは皮質上皮細胞中および髄質中で発現した
が、H2-M-/-胸腺では全く検出できなかった(図５）。突
然変異体マウスの胸腺中のクラスII発現は、mAb M5/114
により分析すると、野生型対照に匹敵するが、mAb BP10
7での染色では突然変異体の胸腺に検出できなかった(図
５）。リンパ節のＢ細胞中のクラスII分子と同様に、上
皮細胞および骨髄−由来APCの両方がmAb 30-2で強く染
色されるので、H2-M-/-胸腺中のクラスII分子は主にCLI
Pを含むと考えられる。対照的に、この抗体は野生型胸
腺の髄質では幾つかの散乱（scattered)細胞を染色する
だけであった(図５)。
【００４６】穏やかな変性条件下で、良く適合する(fit
ting)ペプチドを含むクラスII分子は、SDS-PAGEゲル中
で二量体として移動することが多い(SternおよびWiley,
1992,Cell 68,465.Sadegh-Nasseriand Germian,1991,Na
ture 353,167.Nelsonら、1994,Nature 371,250)が、良
く適合しないペプチドを含むクラスII単量体は解離し、
そして単一のαおよびβ鎖として移動する。野生型また
は突然変異体マウスからのこのH2-Ab分子のSDS安定性
は、パルス チェイス実験で分析した。M5/114との免疫
沈降後、試料は煮沸せずにSDS-PAGEにより分析し、これ
により安定なクラスII二量体を完全になままとした。図
６は、H2-M+/+ マウスに由来する脾細胞中で、SDS-安定
二量体(αβ）が添加（chase)の１時間以内で形成さ
れ、そして添加24時間後にも優勢に存在することを示し
た。少量のSDS-不安定クラスII分子が見られただけであ
った。また驚くべきことには、H2-M-/-脾細胞から沈殿
したこのH2-Ab分子は、SDS-安定性二量体としても移動
するが、それらの移動は野生型細胞に由来する二量体の
移動よりもわずかに遅かった（図２のＣ、αβ）。幾つ
かのクラスII分子も見られ、そしてさらにCLIPを表す低
分子量のバンドが顕著であった。H2-M-/-に由来するH2-
Ab分子は、フロッピー（floppy）よりはむしろコンパク
トな性質であると思われ(Vivilleら、1993,Cell 72,63
5.Bikoffら、1993,J.Exp.Med.177,1699.Dommairら、198
9,Cold spring Harbor Symp.Quant.Biol.54,409)、野生
型の沈殿物に見られる拡散した二量体バンドとは対照的
に、明らかなバンドとして移動した。この結果は、限ら
れた数のペプチド（ほとんどがCLIPのように)が、二量
体バンドの要因であることを示唆している。SDS-安定性
DR1-CLIP複合体は報告され（Bijlmakersら、1994,EMBO
J.13,2699)、そしてCLIPバンドはH2-Abに強力に結合す
るので(Setteら、1995,J.Exp.Med.181,677)、SDS-安定
性二量体の形成は、期待できないが想定される。クラス
IIバンドの強度が、24時間の添加期間中に有意に減少し
なかったことは、突然変異体マウス中でのH2-Abの半減
期が野生型マウスの半減期と同様であることを示してい
る。煮沸した(そして還元した)試料(図７）では、クラ
スIIは単量体として移動し、そして野生型と突然変異体
の沈殿物の間の変化は、突然変異体試料中に存在する大
量のCLIPだけであった。インバリアント鎖と反応性(し
かしCLIPとは反応しない)のmAb In-1との免疫沈降物
は、煮沸または非煮沸試料のいずれにおいても突然変異
体と野生型細胞との間にいかなる変化を示めさなかっ
た。 CLIP-会合クラスII分子が、CD4+Ｔ細胞の正常な選択を
媒介できるのかどうかを決定することは興味深い。図８
のＡに図示されるように、H2-M-/-マウス中でリンパ節
(および脾臓)CD4+細胞の比率は、正常のおよそ30−50％
減少した。このCD4+細胞の減少は、程度は低いが胸腺中
でも見られた。これにもかかわらず、リンパ節組織は正
常に現れ、そして有意な数のCD4+細胞が発生したという
知見は、H2-Ab分子を介した陽性の選択がH2-M-/-マウス
中で起こったことを示す。このようなマウス中に生成し
たCD4+細胞の表現型は、H2-M+/+ マウスの表現型と同様
であった。したがって、胸腺外（extrathymic)CD4+細胞
の多くが、天然の表現型（図８のＢ）を示し、そしてＶ
β使用の分析では、細胞がポリクローナルであることが
示唆された。
【００４７】H2-M-/-CD4+細胞が機能的であるかどうか
を決定するために、それらのアロ抗原に反応して増殖す
る能力を分析した。突然変異体マウスに由来するCD4+細
胞は、それら自身の脾臓APCに反応することができず、
正常な自己トレランス誘導に一致した。対照的に、これ
らの細胞はＭＨＣ−が合った野生型の同腹子（litterma
tes)(および正常なC57BL/6）に由来するAPCとは強く反
応した。この過反応性(hyperreactivity)は、培養物中
ではやくも２日目に現れ、そしてそして３−４日には最
大となった。反応体CD4+細胞のカ価測定では、H2-M+/+
細胞が正常な野生型マウスに由来するCD4+細胞よりも、
H2-Abに10−100倍反応性であることを示した。異常に強
い増殖反応は、H2-M-/-CD4+細胞を種々のＭＨＣ−同種
異系株（B10.D2(H2-Ad)、B10.BR(H2-Ak)およびB6.bm12
(H2-Abm12を含む)に由来するAPCに暴露した後にも見ら
れた。H2-M-/-クラスII分子の限定されたペプチドレパ
ートリーの観点からは驚くべきことではないが、H2-M
-/-マウスに由来するAPCはＭＨＣ-同種異系Ｔ細胞を刺
激できなかった（図９のＢ）。H2-M-/-APCは、コンカナ
バリンＡと同様に抗-CD3抗体にもCD4+細胞応答に関する
正常な同時刺激を提供できたので、増殖性のＴ細胞応答
を表すことができないことは、悪い同時刺激を反映する
ものではなかった。さらにこれらの細胞を正常なAPCと
培養に加えても、反応を有意に変化させないので、H2-M
-/-APCは非特異的に抑制的ではなかった。
【００４８】これらの知見は、制限されたペプチドのレ
パートリー（主にCLIPから成る)が、有意な数の機能的C
D4+Ｔ細胞の陽性選択を支持できるという概念と一致す
る。にもかかわらず、これらのマウス中でのCD4+細胞数
の減少は、胸腺上皮細胞上の正常な密度のクラスII分子
が、陽性選択の最大レベルを達成するには十分ではない
が、ペプチドの多様性がこのプロセスの効率に貢献して
いるという証拠となる。
【００４９】このH2-M-/-マウスは、明白な自己免疫性
を表さず、CLIP−会合クラスII分子に対するトラレンス
が正常であることを示している。しかしH2-M-/-CD4+細
胞の、正常マウスに由来するH2-Ab APCに対する過反応
性は、クラスII−会合ペプチドの多様性がH2-M-/-マウ
ス中で大変限られているので、CLIP以外の自己のペプチ
ドに対する陰性選択を誘導できないことを示唆してい
る。
【００５０】HLA-DR3-CLIPの３次元構造(Ghoshら、199
5、Nature 378,457)は、クラスII−CLIP複合体が定性的
に他のクラスII−ペプチド複合体と異なることはないこ
とを示唆している。したがって、同種異系CD4+Ｔ細胞が
H2-M-/-APCに反応できないことは、おそらくＴ細胞レセ
プター結合を破壊するクラスII分子中の配置的変化を反
映するものではないだろう。反応の欠失は、ほとんどの
H2-M-/-APC上のクラスII分子がCLIPを含むという事実の
反映らしい。H2-M-/-APC上の高密度のこの複合体にもか
かわらず、単一のクラスII−ペプチド複合体（すなわち
同種異系MHC-CLIP）を認識できるＴ細胞の前駆体頻度は
恐らく低く、しかもこれら細胞の反応性は増殖的反応の
アッセイでは検出できない。
【００５１】本明細書で与えたデータは、H2-MがCD4+Ｔ
細胞の正常なレパートリーを生成するために、ならびに
ペプチド抗原の正常な配列（array)を与えるために必須
であることを明らかに示している。
【００５２】本発明の主な態様および特徴は、次の通り
である。
【００５３】１． 体細胞および生殖細胞が改変された
形態のＨ２−Ｍａ遺伝子をコードする遺伝子を含み、こ
の改変された遺伝子が胚幹細胞を用いて胚性段階におけ
る動物または動物の祖先の野生型Ｈ２−Ｍａ遺伝子と置
き換わるように標的化されたものである、トランスジェ
ニック動物。
【００５４】２．前記の動物がマウスであり、そして前
記の野生型H2-Ma遺伝子がH2-Ma遺伝子である、上記１に
記載のトランスジェニック動物。
【００５５】３．前記のマウスに繁殖力があり、そして
改変されたH2-Ma遺伝子をその子孫に伝達できる、上記
２に記載のマウス。
【００５６】４．改変されたH2-Mアルファ鎖遺伝子が、
胚性段階で、改変された胚幹細胞をマウスの胚盤胞に微
量注入することによりマウスの祖先に導入されたもので
ある、上記２に記載のマウス。
【００５７】５．改変されたH2-M遺伝子が、胚性段階
で、改変された胚幹細胞をマウスの胚盤胞に微量注入す
ることにより、または改変された胚幹細胞を受精卵また
は桑実胚と同時にインキューベーションすることのいず
れかによりマウスに導入されたものである、上記２に記
載のマウス。
【００５８】６．H2-M改変トランスジェニックマウスと
命名された、上記２に記載のマウス。 ７．前記の動物がマウスであり、そして前記の改変され
た形態のH2-Maが非機能的であるか、または該マウス以
外の種に由来する、いずれかである上記１に記載のトラ
ンスジェニック動物。
【００５９】８．前記の改変された形態のH2-MaがヒトH
2-Maである、上記７に記載のマウス。
【００６０】９．体細胞および生殖細胞が改変された形
態のＨ２−Ｍａアルファ鎖をコードする遺伝子を含み、
この改変された遺伝子が胚幹細胞を用いて胚性段階にお
けるマウスまたはマウスの祖先の野生型Ｈ２−Ｍａ遺伝
子と置き換わるように標的化されたものである、トラン
スジェニックマウスの生産方法であって、マウスの作出
法であって： （ａ）H2-Ma遺伝子を標的とするように設計された、改
変された形態のH2-Maをコード する遺伝子をマウス胚
幹細胞に導入し； （ｂ）改変されたH2-Ma遺伝子を含む胚幹細胞を、マウ
スの胚盤胞に注入し； （ｃ）注入した胚盤胞をレシピエントマウスに移植し；
そして （ｄ）胚が発生して創始トランスジェニックマウスを生
産する、工程を含んで成る、上記マウスの生産法。
【００６１】１０．工程（ａ）の導入がマイクロインジ
ェクションによる、上記９に記載の方法。
【００６２】１１．さらに； （ｅ）キメラトランスジェニックマウスを野生型マウス
と育種して、ヘテロ接合性（F1）マウスを得；そして （ｆ）ヘテロ接合性（F1）マウスを育種して、ホモ接合
性(F2)H2-Ma欠失トランスジェニックマウスを作出す
る、工程を含んで成る、上記９に記載の方法。
【００６３】１２．上記１のトランスジェニック動物に
由来する細胞株。
【図面の簡単な説明】
【図１】マウスH2-Ma遺伝子の崩壊に関する情報を示す
図である。パネル（Ａ）の地図は、標的化構築物（中
央）を用いて相同的組換えを行う前（上）および後
（下）のH2-Ma遺伝子の構成を示す。エキソン１および
イントロン１の部分を除いて、ほとんどのH2-Ma遺伝子
を含む129/Svマウスのゲノムクローンに由来する6.7kb
のＤＮＡ断片を、組換えの相同的領域として標的構築物
中に使用した。ネオマイシン耐性遺伝子(neo)を含むカ
セットを、H2-Ma遺伝子のエキソン２中の第２のHindIII
部位にクローン化した。エキソン２中のneoカセット挿
入部位に対して5'に61bpの欠失も構築物中に作成した。
単純ヘルペスのチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を、構築物
の3'に配置した。制限部位は、ApaI(A)、HindIII(H)、N
otI(N)、StuI(S)およびSfi(Sf)である。番号を付けた黒
塗りの箱はエキソンである。Ｓはサザンハイブリダイゼ
ーションに使用したプローブの位置である。パネル
（Ｂ）は、崩壊されたH2-Ma遺伝子について、野生型(+/
+)、ヘテロ接合性(+/-)およびホモ接合性(-/-)マウスに
由来する尾のＤＮＡをApaI消化したゲノムサザン分析
（電気泳動を含む）の結果を示す図に代わる写真であ
る。このＤＮＡの大きさは、内因性の対立遺伝子からは
2.8kbであり、そして崩壊された対立遺伝子からは1.8kb
である。
【図２】マウスH2-Ma遺伝子の崩壊に関する情報を示す
図である。（ＣおよびＤ）K553(抗-H2-M)(赤)((Karlsso
nら、1994、非抗原提示細胞中の操作できるＭＨＣクラ
スIIコンパートメントの再構成(Resconstitution of an
operational MHC class II compartment in nonantige
n-presenting cells.)、Science 266,1569-1573)、なら
びにM5/114(抗-H-2Ad(緑)(Bhattacharyaら、1981,J.Imm
unol.127,2488)で染色したH2-M+/+（Ｃ）またはH2-M-/-
（Ｄ）脾細胞の共焦点画像の写真である。K553染色はＣ
で小胞構造に存在するが、Ｄには存在しない。M5/114染
色は、両方の場合で、細胞表面および細胞内の両方に位
置する。
【図３】マウスH2-Ma遺伝子の崩壊に関する情報を示す
図である。（Ｅ）35S-標識化脾臓細胞からの免疫沈降。
H2-M+/+（上）またはH2-M-/-（下）の脾細胞を、35S-シ
ステインで記載されているように(Karlssonら、1994,Sc
ience 266,1569-1573)、３時間標識し、その後１％ Tri
ton X-100、PBSおよび完全なプロティナーゼインヒビタ
ーカクテル(ベーリンガーマンハイム:Boehringer Mannh
eim)中で溶解した。H2-Mは、H2-M αβ二量体と反応性
のmAb 2E5Aと免疫沈降した。免疫沈降物をプロテイン-G
-sepharoseで回収し、洗浄、そして等電点電気泳動用試
料緩衝液中に再懸濁した。試料は二次元ゲル電気泳動に
より分析した結果を示す図に代わる写真である。試料を
7.5−12.5％ポリアクリルアミドゲルでIEF後に分離した
（pH５−７）。次にゲルを固定、乾燥し、そしてオート
ラジオグラフィーに供した。オートラジオグラフは、Ag
fa ArcusIIスキャナーで走査した。複合物をKodak XLS
8600プリンターで印刷した。略号は次の通りである：
ａ、アクチン；α、H2-Ma;β、H2-Mb。酸性タンパク質
は右に位置する。
【図４】H2-M-/-およびH2-M+/+同腹子のリンパ系組織に
おけるH2-Aの発現情報に関する図である。リンパ節細胞
を、H2-Abと反応性の抗体(M5/114、BP107、KH74)、また
はCLIP-付加H2-Ab(30-2)に対する抗体のいずれかを用い
て染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した
結果を示す図である。H2-M-/-細胞に対するKH74の結合
は、30-2との事前のインキューベーションにより遮断さ
れたが、無関係なマウスIgG（MuIgG)では遮断されなか
ったことを示す。
【図５】H2-M-/-およびH2-M+/+同腹子のリンパ系組織に
おけるH2-Aの発現情報に関する図である。（Ｂ）胸腺切
片を、H2-Mと反応性のK553、mAbsと反応性の抗-H2-Ab(M
5/114、BP107)、または抗-CLIPmAb(30-2)のいずれかを
用いて染色したさいぼうの図に代わる写真である。
【図６】H2-M-/-およびH2-M+/+同腹子のリンパ系組織に
おけるH2-Aの発現情報に関する図である。H2-M+/+およ
びH2-M-/-の脾細胞を、30分間標識し、その直後(0)、ま
たは示すように非標識媒体との種々のインキューベーシ
ョン時間の後（時間)、分析した。H2-Ab分子はM5/114と
免疫沈降した。免疫沈降物をプロテイン-G-sepharoseで
回収、洗浄し、そしてSDS-PAGE試料緩衝液(２％ SDSを
含み、ジチオスレイトール無しに再懸濁した。試料を室
温で20分間静置した（Ｃ）。こうして得られた試料を7.
5−12.5％ポリアクリルアミドゲルで直接分離した結果
を示す図に代わる写真である。略号は次の通りである：
α、H2-Abα；β、H2-Abβ；αβおよびαβ★、H2-Ab
二量体。サイズマーカーはキロダルトンである：lip3
1、インバリアント鎖p31。
【図７】H2-M-/-およびH2-M+/+同腹子のリンパ系組織に
おけるH2-Aの発現情報に関する図である。H2-M+/+およ
びH2-M-/-の脾細胞を、30分間標識し、その直後(0)、ま
たは示すように非標識媒体との種々のインキューベーシ
ョン時間の後（時間)、分析した。H2-Ab分子はM5/114と
免疫沈降した。免疫沈降物をプロテイン-G-sepharoseで
回収、洗浄し、そしてSDS-PAGE試料緩衝液(２％ SDSを
含み、そして１０ｍＭのジチオスレイトールを含むに再
懸濁した。試料を５分間煮沸した。こうして得られた試
料を7.5−12.5％ポリアクリルアミドゲルで直接分離し
た結果を示す図に代わる写真である。略号は次の通りで
ある：α、H2-Abα；β、H2-Abβ；αβおよびαβ★、
H2-Ab二量体。サイズマーカーはキロダルトンである：l
ip31、インバリアント鎖p31。
【図８】H2-M-/-およびH2-M+/+マウスのＴ細胞マーカー
の分析結果を示す図である。パネル（Ａ）はリンパ節細
胞または胸腺細胞はCD4およびCD8と反応性の抗体で染色
し、そしてフローサイトメトリーで分析した結果を示す
図に代わる写真である。パネル（Ｂ）はCD45RB(左)およ
びL-セレクチン(右)を使用した活性化マーカーに関する
リンパ節CD4+Ｔ細胞の分析は、自然の表現型を示した。
H2-M-/-snf H2-M+/+マウス由来のCD4+Ｔ細胞は、L-セレ
クチンhi、CD44loおよびCD45RBhiであり、そして幾つか
の発現したマーカーは、活性化に関連した。例えばCD69
またはインターロイキン２受容体。
【図９】CD4+Ｔ細胞機能および抗原提示能を示す図であ
る。パネル（Ａ）は異なるマウス株に由来するAPCに対
するH2-M-/-（左）またはH2-M+/+（右）マウスに由来す
るCD4+Ｔ細胞の反応性を示すグラフである。パネル
（Ｂ）はH2-M-/-およびH2-M+/+APCが、同種異系CD4+Ｔ
細胞を刺激する能力を示すグラフである。反応は、培養
の３、４および５日後に分析した。反応体細胞群は、Ｂ
細胞、ＭＨＣクラスII−発現細胞およびCD8+細胞に特異
的な抗体のカクテルで記載されているように(Webbおよ
びSprent、1990、Science 248,1643)、補体とともに用
いて処理することにより、CD4+細胞が濃縮されたプール
されたリンパ節細胞であった。Ｔ細胞がCD4(RL172)に対
する抗体、抗-CD8(3.16.8)、抗−Thy-1(J1J)および補体
を用いて処理することにより消費された脾臓細胞を、マ
イトマイシンＣで処理し、そしてAPCの供給源として使
用した。反応体細胞（1.5×105)を5×105のAPCと、終容
量200μlの3H-チミジン中で約１８時間培養した後、回
収し、そしてカウントした。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ラース・カールソン アメリカ合衆国カリフオルニア州92037ラ ジヨラ・ローズモントストリート554 (72)発明者 ルビング・ゾー アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08816 イーストブランズウイツク・ラルーレイン 87 (72)発明者 パー・エイ・ピーターソン アメリカ合衆国カリフオルニア州92067ラ ンチヨサンタフエ・ピーオーボツクス2323

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 体細胞および生殖細胞が改変された形態
    のＨ２−Ｍａ遺伝子をコードする遺伝子を含み、この改
    変された遺伝子が胚幹細胞を用いて胚性段階における動
    物または動物の祖先の野生型Ｈ２−Ｍａ遺伝子と置き換
    わるように標的化されたものである、トランスジェニッ
    ク動物。
  2. 【請求項２】 体細胞および生殖細胞が改変された形態
    のＨ２−Ｍａアルファ鎖をコードする遺伝子を含み、こ
    の改変された遺伝子が胚幹細胞を用いて胚性段階におけ
    るマウスまたはマウスの祖先の野生型Ｈ２−Ｍａ遺伝子
    と置き換わるように標的化されたものである、トランス
    ジェニックマウスの生産方法であって、マウスの作出法
    であって： （ａ）H2-Ma遺伝子を標的とするように設計された、改
    変された形態のH2-Maをコード する遺伝子をマウス胚
    幹細胞に導入し； （ｂ）改変されたH2-Ma遺伝子を含む胚幹細胞を、マウ
    スの胚盤胞に注入し； （ｃ）注入した胚盤胞をレシピエントマウスに移植し；
    そして （ｄ）胚が発生して創始トランスジェニックマウスを生
    産する、工程を含んで成る、上記マウスの生産法。
  3. 【請求項３】 請求項１のトランスジェニック動物に由
    来する細胞系。
JP10014724A 1997-01-10 1998-01-12 Ｈ２−ｍ改変トランスジエニツク動物 Pending JPH10201396A (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6609748B1 (en) * 2000-09-25 2003-08-26 Ford Global Technologies, Llc Forward facing rear door assembly for motor vehicles
US20030013081A1 (en) 2001-06-26 2003-01-16 Olson William C. Uses of DC-SIGN and DC-SIGNR for inhibiting hepatitis C virus infection
US9591835B2 (en) 2011-10-28 2017-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
MX355725B (es) 2011-10-28 2018-04-27 Regeneron Pharma Ratones con complejo principal de histocompatibilidad modificado geneticamente.
US9043996B2 (en) 2011-10-28 2015-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
RU2660564C2 (ru) 2011-10-28 2018-07-06 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Генетически модифицированные мыши, экспрессирующие химерные молекулы главного комплекса гистосовместимости
SI2958938T1 (sl) 2013-02-20 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki izražajo humanizirane koreceptorje za celice T
RS57963B1 (sr) 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharma Miševi koji eksprimiraju humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
WO2016164492A2 (en) 2015-04-06 2016-10-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized t cell mediated immune responses in non-human animals

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK0900002T3 (da) * 1996-01-16 2004-07-26 Ortho Mcneil Pharm Inc H2-M-modificerede transgene dyr

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