JPWO2007086382A1 - ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 - Google Patents
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Abstract
Description
H-2qハプロタイプのマウスを用いたCIAでは関節炎が短期間で完成し、ヒト関節リウマチで起こるような慢性的、持続的及び進行性の症状、特に徐々に炎症が進行する関節リウマチ初期のステージから中後期のステージへの病態変化を経時的に追う事が難しい。このようにH-2qハプロタイプ等を用いたモデルマウスはヒト関節リウマチのモデル動物として十分なものとは言えない。このような事情から、よりヒト関節リウマチの病態を再現するモデル動物(即ち、ヒト関節リウマチの病態により近い症状を呈する動物)の創出が待ち望まれていた。
このような状況下、本発明者らはヒト関節リウマチの病態を良好に再現するモデル動物の開発に成功したことを報告した(特許文献1)。
ヒト関節リウマチの病態を良好に再現するモデル動物はそれ自体、ヒト関節リウマチに関する研究や抗リウマチ薬の開発等に有用である。一方、ヒト関節リウマチの病態を良好に再現するモデル動物が新たに提供されることは、ヒト関節リウマチに関する研究等を行う際に利用可能なモデル動物の種類が増えることを意味する。即ち、モデル動物の選択の幅が広がり、目的・用途に合わせてより適切な実験系を構築することが可能となる。また、複数種類のモデル動物を用いた比較実験も可能となり、より価値の高いデータが得られることにもなる。このように、ヒト関節リウマチの病態を良好に再現するモデル動物を新たに提供することの意義は大きい。
ヒト関節リウマチは免疫異常を背景にした慢性かつ持続性の全身性炎症疾患であり、その免疫異常においてT細胞性免疫応答が重要な役割を果たしている。T細胞性免疫応答において休止期T細胞を活性化し、サイトカイン関連遺伝子発現や細胞増殖を誘導するためには少なくとも2つのシグナル伝達、即ちT細胞レセプターシグナルと共刺激分子による補助シグナルが必要であると考えられている。例えば、共刺激分子とは抗原提示細胞に発現しているB7.1やB7.2などである。これらの分子と、T細胞に発現している促進作用を持つCD28、または抑制作用を持つCytotoxic-T-Lymphocyte-associated-Antigen-4(CTLA4)が結合することによりT細胞の活性化が調節されている。本発明者らはT細胞性免疫応答に関与する共刺激分子の一つであるB7.1(CD80)遺伝子に注目し、関節軟骨特異的にB7.1遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製した。このトランスジェニックマウスを、II型コラーゲン誘導性関節リウマチに反応性の高いH-2qハプロタイプのマウスにバッククロス(戻し交配)することで、高頻度に関節炎を発症するモデルマウス(B7.1トランスジェニックマウス)を樹立することに成功した。このB7.1トランスジェニックマウスでは、CII誘導関節炎モデル(CIA)に通常用いられるII型コラーゲン濃度に比べ1/20の低い濃度のものを皮下注射することでも、充分にリウマチ様の炎症が観察された。すなわちB7.1トランスジェニックマウスは、B7.1遺伝子の関節特異的な異所性発現により、II型コラーゲン等の抗原に対して高い感受性を有することが判明した。この濃度では、コントロールマウス(同じ遺伝的バックグラウンドをもつ、または全く同じ一腹の子であるが導入遺伝子を有しないもの)では関節リウマチ様の症状を示さない。また通常のCIAと比較してB7.1トランスジェニックマウスでの発症は慢性かつ進行性で、末期においては著明な関節破壊も引き起こした。B7.1トランスジェニックマウスは病理組織学的にもヒト関節リウマチに酷似した表現型を示し、滑膜細胞の異常増殖、パンヌス形成、肉芽腫様病変等に加え、関節外病変も観察された。B7.1トランスジェニックマウスでは症状が慢性的に進むことから炎症の過程をより正確に把握できる。従って、B7.1トランスジェニックマウスは抗リウマチ薬のスクリーニングに有用であると考えられる。
一方、B7.1トランスジェニックマウスではある時期を境にして骨密度減少(海綿骨密度の減少)が急速に進む。換言すれば炎症過程と実質的な骨破壊の過程が明確に分かれ、しかも実質的な骨破壊の開始時期が比較的遅い。従来のモデルマウスには認められないこのような特徴を有するB7.1トランスジェニックマウスは、ヒト関節リウマチの発症過程の解析に極めて有効なモデルとなる。また、骨密度変化を指標とした抗リウマチ薬のスクリーニング試験において使い易いモデル動物であるともいえる。
以上の成果から、II型コラーゲンプロモーターの作用でB7.1遺伝子が発現するように遺伝子改変することによれば、ヒト関節リウマチの病態を良好に再現するモデル動物を作製できるとの知見が得られた。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものであって以下の構成を提供する。
[1]B7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列がII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置されてなる外来性DNAが導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[2]前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、[1]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[3]II型コラーゲンの投与によってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、[1]又は[2]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[4]1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することによってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、[1]〜[3]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[5]前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(8)の中の一つ以上を示す病態である、[1]〜[4]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:
(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
[6]前記ヒト関節リウマチ様の病態が、さらに以下の(8)〜(10)の中の一つ以上を示す病態である、[5]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(8)血管炎症が認められる;(9)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(10)貧血が認められる。
[7]前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(8)の全てを示す病態である、[1]〜[4]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
[8]前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(11)の全てを示す病態である、[1]〜[4]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三ヶ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する;(9)血管炎症が認められる;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(11)貧血が認められる。
[9]前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、[1]〜[8]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[10]前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、[1]〜[8]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
[11]B7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列がII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置されてなる外来性DNAを、発生初期の細胞に導入するステップ、
を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[12]前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、[11]に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
[13]II型コラーゲンプロモーターと、
前記II型コラーゲンプロモーターの下流に配置されたDNA配列であって、B7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列と、
II型コラーゲンエンハンサーと、を有する発現ベクター。
[14]以下の(a)〜(c)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(a)[1]〜[10]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物においてヒト関節リウマチ様の病態を誘導するステップ;
(b)前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与するステップ;
(c)ヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ。
[15]前記ステップcにおいて、以下の(1)〜(11)の中から選択される一つ以上について改善されるか否かを判定する、[14]に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(9)血管炎症が認められること;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(11)貧血が認められること。
[16]以下の(A)〜(D)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(A)ヒト関節リウマチ様の病態が誘導された[1]〜[10]のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物をそれぞれ1個体以上含む試験群及び対照群を用意するステップ;
(B)前記試験群の各個体に被験物質を投与するステップ;
(C)ヒト関節リウマチに特徴的な症状の程度を前記試験群と前記対照群との間で比較するステップ。
[17]前記ステップCにおいて、以下の(1)〜(11)の中から選択される一つ以上について、前記試験群と前記対照群との間で比較する、[16]に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(9)血管炎症が認められること;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(11)貧血が認められること。
「トランスジェニック非ヒト哺乳動物(TG動物)」とは、発生初期に外来性DNAが導入されることによって、それを構成するすべての細胞が当該外来性DNAを保有することとなる、ヒト以外の哺乳動物又はその子孫(但し、当該外来性遺伝子を保有するもの)をいう。ここでの哺乳動物の種(属)は特に限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びウマ等を含む。好ましくはマウス(例えばH-2qマウスDBA/J系統やB10.Q系統、又はH-2rマウスR10.RIII系統(これらのマウスは日本チャールズリバーから入手可能である))やラット(例えばLewis(Rtw)、WFC(Rte)、DA(Rta)ラット(これらのラットは日本チャールズリバーから入手可能である))などの齧歯目動物であり、最も好ましくはマウスである。
導入遺伝子のコピー数は特に限定されるものではないが、例えば1〜100である。また、本発明のTG動物は導入遺伝子に関してホモ接合体であってもヘテロ接合体であってもよい。
外来性DNA内においてB7.1遺伝子又はその変異体(以下、「B7.1遺伝子等」という)はII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置される。ここでの「制御下に配置される」とは、II型コラーゲンプロモーターが作用してB7.1遺伝子等の転写が生ずるように、B7.1遺伝子が直接又は他の配列を介してII型コラーゲンプロモーターに連結されている状態をいう。通常は、II型コラーゲンプロモーターの下流、かつ近接した位置にB7.1遺伝子等が配置される。
良好な免疫反応を引き起こす目的で、各回の投与を全身の複数箇所に分けて実施することが好ましい。
ここで、「ヒト関節リウマチ様の病態」を特徴づける具体的な症状ないし所見を以下に列挙する。
(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる。
(2)対称性の関節の腫れが認められる。
(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる。
(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる。
(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される。
(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められる。
(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる。
(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
以上の(1)〜(8)の特徴をより多く備えるほどヒト関節リウマチを再現した病態となる。従って、本発明のTG動物が上記(1)〜(8)の特徴の中から選択される二つ以上(例えば、(1)及び(2)、(1)〜(3)、(1)〜(4)、(1)〜(5)、(4)及び(5)、(4)〜(6))を併せ持つことが好ましい。本発明のTG動物は最も好ましい形態において上記(1)〜(8)の特徴の全てを併せ持つ。
尚、(1)〜(3)は外見(四肢関節における発赤、腫脹など)の評価、赤外線サーモグラフィーによる分析、剖検による組織学的評価等によって確認することができる((3)については経時的な変化を調べる)。(4)は外見評価、X線像評価、核磁気共鳴画像評価、剖検による組織学的評価等によって確認することができる。(5)〜(8)は経時的なX線像評価、核磁気共鳴画像評価、剖検による組織学的評価等によって確認することができる。
(9)血管炎症が認められる。
(10)間質性肺炎、胸膜炎等が認められる。
(11)貧血等が認められる。
以上の(9)〜(11)の合併症をより多く伴うほどヒト関節リウマチを再現した病態となる。従って、本発明のTG動物が上記(9)〜(11)の特徴の中から選択される二つ以上(例えば、(9)及び(10)、(10)及び(11)、(9)及び(11))を伴うことが好ましい。本発明のTG動物は最も好ましい形態において上記(9)〜(11)の合併症の全てを伴う。
尚、(9)および(10)は血中炎症系マーカー等の測定、組織学的評価等によって確認することができる。(11)は血球算定の際ヘマトクリット値、平均赤血球数等によって確認することができる。
マイクロインジェクション法では、まず交尾が確認された雌マウスの卵管より受精卵を採取し、そして培養した後にその前核に所望のDNAコンストラクト(外来性DNA)の注入を行う。DNAコンストラクトの形態は特に限定されないが、導入効率の点から直鎖状又は環状であることが好ましい。特に好ましくは、直鎖状に調製したDNAコンストラクトを使用する。導入目的の遺伝子が効率的に染色体に組み込まれ、且つその良好な発現が確保できるようにDNAコンストラクトを調製する。DNAコンストラクトは、上述のB7.1遺伝子等及びII型コラーゲンプロモーターを含む(必要に応じて適当なエンハンサー配列、選択マーカー、複製開始点、ターミネーター配列等を含む)。
注入操作を終了した受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、移植後のマウスを所定期間飼育して仔マウス(F0)を得る。仔マウスの染色体に導入遺伝子が適切に組込まれていることを確認するために、仔マウスの尾などからDNAを抽出し、サザンハイブリダイゼ−ション分析、スロットブロット(ドットブロット)分析、PCR分析等を実施する。
次に、同定されたトランスジェニック個体を他のマウスとの交配に供する。ここでの「他のマウス」としては、H-2q若しくはH-2rハプロタイプのマウス、MRL-1若しくは亜系MRL-lpr+マウス、NZB/KNマウス、SKGマウス、NODマウス、scid/scidマウス、RAG2-deficientマウス、又はLewisラット等(これらのマウスは例えば日本チャールズリバーから入手することが可能である)、或いは以上の操作の結果得られた他のトランスジェニック個体等を使用することができる。中でも、H-2qハプロタイプのマウスを使用することが好ましい。H-2qハプロタイプのマウスはII型コラーゲンに対し高い頻度でヒト関節リウマチ様の症状を示す一方、雌雄差を示さないことから、これを使用すればヒト関節リウマチ様の病態を良好に再現するTGマウスが得られる。尚、H-2qハプロタイプのマウスは、通常飼育下ではヒト関節リウマチ様の症状を示さない。また、本トランスジーン導入後も同様に誘導しない限りヒト関節リウマチ様の症状を示さない。
本発明のスクリーニング方法は、上記本発明のTG動物においてヒト関節リウマチ様の病態を誘導するステップ(ステップa)と、TG動物に被験物質を投与するステップ(ステップb)と、TG動物においてヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ(ステップc)とを含む。
尚、本明細書において「ヒト関節リウマチ用薬剤」とは、ヒト関節リウマチを発症している患者に対してその症状の改善(ある症状の発生を予防することも含む)などを目的として使用される薬剤はもとより、ヒト関節リウマチを発症するおそれのある者に対して予防的に使用される薬剤、さらにはヒト関節リウマチに起因する合併症の予防、又は合併症の症状の改善を目的として使用される薬剤をも含む用語として用いられる。このように、本発明のスクリーニング方法を利用して得られる薬剤は、ヒト関節リウマチの合併症の予防又は治療を目的として使用することもできる。
以下にII型コラーゲンの投与によるヒト関節リウマチ様病態の誘導方法の具体例(TG動物がマウスである場合の一例)を示す。まず、初回免疫として0.01mgのII型コラーゲン(例えばウシ関節軟骨から常法に従って抽出・精製した高純度(例えば純度99%)のII型コラーゲンを0.01M酢酸に溶解し、等量の完全アジュバントと混合したもの)を数カ所に分けてTGマウスに皮下注射する。3週間飼育した後、二次免疫として再度0.01mgのII型コラーゲン(不完全アジュバントを用いる以外は初回免疫の場合と同様に調製したもの)を数カ所に分けてTGマウスに皮下注射する。二次免疫の後、四肢関節における発赤、腫脹等をモニターし、ヒト関節リウマチ様症状が誘導されたことを確認する。必要に応じて剖検により合併症の有無を調べる。
被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物(核酸、ペプチド、タンパク質、脂質(単純脂質、複合脂質(ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等)、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド等))又は無機化合物を用いることができる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。尚、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。
これらの症状に加えて又はこれらの症状の代わりに、ヒト関節リウマチの合併症(例えば、上述したように(9)血管炎症が認められる;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(11)貧血が認められる)を調べることにしてもよい。複数の症状等について調べる場合におけるその組合せは任意であって、例えば(1)と(2)の組合せ、(1)〜(3)の組合せ、(1)〜(4)の組合せ、(1)〜(5)の組合せ、(1)〜(6)の組合せ、(1)〜(7)の組合せ、(1)〜(8)の組合せ、(2)〜(4)の組合せ、(3)〜(6)の組合せ、(7)及び(8)の組合せ、(7)〜(9)の組合せなどを採用できる。一般には改善される症状が多くなればそれだけ被験物質の有効性が高まると考えられることから、ステップcにおいてより多くの症状を調べることが好ましい。但し、二つの症状の間で一定以上の相関が認められる場合には、当該二つの症状のいずれかのみを調べることとしてもよい。
試験群及び対照群に含まれる個体数は特に限定されない。一般に使用する個体数が多くなるほど信頼性の高い結果が得られるが、多数の個体を同時に取り扱うことは使用する個体の確保や操作(飼育を含む)の面で困難を伴う。そこで例えば各群に含まれる個体数を1〜50、好ましくは2〜30、さらに好ましくは5〜20とする。
以下に示すように、B7.1遺伝子を導入したトランスジェニックマウスをManipulating the mouse embryo, a laboratory manual, second edition, Brigid Hogan et al., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに従って作製した。
1.遺伝子導入用ベクター(外来性DNA)の調製
以下の手順で、II型コラーゲンプロモーターの制御下にマウスB7.1遺伝子(配列番号1)が配置されたベクターpCol2B7.1(図1)を構築した。本ベクターは以下の特徴を有する。1)約1kbpのラットII型コラーゲンプロモーター部の下流にヒトグロビンスプライシング配列がある。2)この直下にポリAサイトを含むマウスB7.1遺伝子(cDNA)が挿入され、この後方にラットII型コラーゲンエンハンサーが配置されている。3)バックボーンのベクターは、アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を有するpBR322を用いた。
最終的には、以上の手順で構築したベクターをPvuI制限酵素処理し、大腸菌由来のバックボーンのベクター部分を除き線状化したものを、DNA結合性を示すビーズ等を用いて精製し、これをインジェクション用のトランスジーンとした。尚、得られたトランスジーンをマウス軟骨培養細胞株であるMC615細胞に遺伝子導入し、その発現をFACSで確認した。DNAは、10mM Tris/0.2mM EDTA緩衝液にて30〜100μg/mlに調節し保存しておく。
直鎖状化したトランスジーンを、FVB/NJとDBA/1マウス(Charles River Laboratories, Davis, CA)からのF1胚盤胞に注入した。その結果生まれた遺伝子導入マウスをD1CBマウスと名付けた。D1CBマウスではサザンブロット法によって約10コピーのB7.1遺伝子が検出された。
系統維持とDBA/1遺伝的背景の純化のためD1CBマウスをDBA/1マウスと15回以上戻し交配した。その結果得られたトランスジェニックマウス(B7.1トランスジェニックマウス)を以下の実験に用いた。
1.免疫誘導
実施例1で作製したB7.1トランスジェニックマウスに以下の手順で免疫した。尚、全く同じ一腹の子であるが導入遺伝子を有しないもの、DRB/1jバックグランドを有するマウスを野生型コントロール(6〜8週齢)として用いた。
まず初回免疫として0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分けて皮下注射した。尚、ウシ関節軟骨から精製したII型コラーゲン(純度99%、コラーゲン技術研修会製)を0.01M酢酸に容解し、等量の完全アジュバント(DIFCO社製)と混合したものを使用した。
初回免疫から3週間後、2次免疫として再度0.01mgのII型コラーゲンを数カ所に分け皮下注射した。尚、2次免疫には、不完全アジュバントと混合したII型コラーゲンを使用した。
2次免疫後、四肢関節における発赤、腫脹等のモニターリングを行った。臨床的所見を図2に示した基準でスコア化した。モニターリングの結果、2次免疫後通常のCIAでは数日で四肢関節における強い発赤および腫脹が観察されるが、本トランスジェニックマウスでは四肢における発赤、腫脹が数週間以上に渡り見られた。コントロールマウスにおいてはほとんどその様な症状を観察できなかった(図3、4)。
一方、赤外線サーモグラフィー等によるモニターリングによって本トランスジェニックマウスでは関節炎が進行していることが明らかであった。すなわち関節炎が長期間に渡り徐々に進行する事が分かった。またこの時期の関節における組織切片を見るとリンパ球系の細胞の関節周辺への浸潤が見られるなど、ヒト関節リウマチの初期における疾病状態が観察された(図5)。モニターリングをさらに継続すると2ヶ月程度を経て四肢における腫脹がさらに進行していた。一方、骨破壊の指標としてX線解析およびX線CTによる画像解析を行った(図6)。図4と図6の比較から重度の腫脹の寛解が起こり、この後骨密度(海綿骨密度)の急激な減少が起こることが示唆された。このように本トランスジェニックマウスでは、炎症時期と関節リウマチ由来の骨粗鬆症時期が明確に区別された。加えて本トランスジェニックマウスでは、骨破壊の進行により、最終的には骨変形などの障害が起きていた。一方、本トランスジェニックマウスでは関節外病変として間質性肺炎が観察された(図7)。
この他、剖検および血液検査により全体の合併症を検索する。例えば、リウマチによる1次的な呼吸器病変、血管炎、赤血球数の減少等を確認する。また通常マウスはSPF状態で飼育および実験を行なっているがこれをコンベンショナルな飼育環境に移す、または飼育環境下でリステリア菌等を接種し、リウマチ状態において2次的な過剰免疫反応等が誘発さることを確認する。加えて、リウマチ治療薬の投与に対する副作用を確認する。
(1)一般的に関節リウマチが慢性的、進行的に進むのに対し、CIAでは炎症が急激に起こり炎症過程と骨破壊の過程が混然と起こる為、発症過程の解析が困難である。
(2)急激な炎症の結果、骨破壊の過程で強いリバウウンド様の症状が観察され、結果的に骨過形成がみられる。加えて関節リウマチに伴う骨粗鬆症の病変が弱いため、関節リウマチの動物モデルとしては十分とは言えない。
(3)関節リウマチに伴う関節外症状も確認されていない。
B7.1トランスジェニックマウスではこれらの問題点が全て解消されている。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (17)
- B7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列がII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置されてなる外来性DNAが導入されたトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、請求項1に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- II型コラーゲンの投与によってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、請求項1又は2に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 1回あたりのII型コラーゲンの投与量を0.01mg〜0.05mgとして2回以上II型コラーゲンを投与することによってヒト関節リウマチ様の病態を呈する、請求項1〜3のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(8)の中の一つ以上を示す病態である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:
(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。 - 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、さらに以下の(9)〜(11)の中の一つ以上を示す病態である、請求項5に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(9)血管炎症が認められる;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(11)貧血が認められる。
- 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(8)の全てを示す病態である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する。
- 前記ヒト関節リウマチ様の病態が、以下の(1)〜(11)の全てを示す病態である、請求項1〜4のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物:(1)全身において三ヶ所以上の関節の腫れが認められる;(2)対称性の関節の腫れが認められる;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められる;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められる;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められる;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められる;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行する;(9)血管炎症が認められる;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められる;(11)貧血が認められる。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマからなる群より選択されるいずれかである、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物の種(属)がマウスである、請求項1〜8のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
- B7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列がII型コラーゲンプロモーターの制御下に配置されてなる外来性DNAを、発生初期の細胞に導入するステップ、
を含むことを特徴とする、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。 - 前記外来性DNAがII型コラーゲンエンハンサーを含む、請求項11に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の作出方法。
- II型コラーゲンプロモーターと、
前記II型コラーゲンプロモーターの下流に配置されたDNA配列であって、B7.1遺伝子、及びB7.1遺伝子の変異体(但し、T細胞の活性化に関してB7.1遺伝子と同等の機能を有する)からなる群より選択されるDNA配列と、
II型コラーゲンエンハンサーと、を有する発現ベクター。 - 以下の(a)〜(c)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(a)請求項1〜10のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物においてヒト関節リウマチ様の病態を誘導するステップ;
(b)前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与するステップ;
(c)ヒト関節リウマチに特徴的な症状が改善されるか否かを調べるステップ。 - 前記ステップcにおいて、以下の(1)〜(11)の中から選択される一つ以上について改善されるか否かを判定する、請求項14に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(9)血管炎症が認められること;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(11)貧血が認められること。
- 以下の(A)〜(D)のステップを含む、ヒト関節リウマチ用薬剤のスクリーニング方法:
(A)ヒト関節リウマチ様の病態が誘導された請求項1〜10のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物をそれぞれ1個体以上含む試験群及び対照群を用意するステップ;
(B)前記試験群の各個体に被験物質を投与するステップ;
(C)ヒト関節リウマチに特徴的な症状の程度を前記試験群と前記対照群との間で比較するステップ。 - 前記ステップCにおいて、以下の(1)〜(11)の中から選択される一つ以上について、前記試験群と前記対照群との間で比較する、請求項16に記載のスクリーニング方法:(1)全身において三カ所以上の関節の腫れが認められること;(2)対称性の関節の腫れが認められること;(3)一週間以上継続する関節の腫れが認められること;(4)四肢において骨の破壊、癒着、又は変形が認められること;(5)炎症時期と骨粗鬆症時期が区別される;(6)リンパ球系細胞の浸潤が認められること;(7)肉芽組織形成による軟骨層の破壊及び骨破壊が認められること;(8)関節の変形が初期(ステージI)及び中程度(ステージII)を経て進行すること;(9)血管炎症が認められること;(10)間質性肺炎又は胸膜炎が認められること;(11)貧血が認められること。
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH114638A (ja) * | 1997-05-26 | 1999-01-12 | Hoechst Ag | トランスジェニック非ヒト動物からの高次転写複合体の精製 |
WO2001032860A1 (fr) * | 1999-11-04 | 2001-05-10 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Activateurs transcriptionnels |
WO2003091427A1 (fr) * | 2002-04-24 | 2003-11-06 | Kansai Technology Licensing Organization Co., Ltd. | Genes associes a une nephropathie exprimes dans le tube contourne proximal |
WO2005085438A1 (ja) * | 2004-03-09 | 2005-09-15 | Nagoya Industrial Science Research Institute | ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物 |
Non-Patent Citations (3)
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ARTHRITIS & RHEUMATISM, vol. 37, no. 11, JPN6012035074, 1994, pages 1637 - 1646, ISSN: 0002269906 * |
PROC.NATL.ACAD.SCI.USA, vol. 95, no. 18, JPN6012035076, 1998, pages 10746 - 10750, ISSN: 0002269908 * |
THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 153, no. 3, JPN6012035075, 1994, pages 1378 - 1385, ISSN: 0002269907 * |
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