JP4308217B2 - トランスジェニック関節炎マウス - Google Patents
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Description
本発明は、関節炎を発症させるために遺伝子操作されたトランスジェニック非ヒト動物に関し、そしてそれ故慢性関節リュウマチのようなヒト関節炎疾患のための動物モデルを提供する。より詳細には、本発明は、トランスジェニック動物のT細胞レセプター(TCR)集団が、(a)TCRαおよびTCRβサブユニットをコードするトランスジーンを含み、そして(b)トランスジェニック動物においてT細胞を自己抗原と反応させるTCRのコピーから実質的になる、トランスジェニック動物に関する。さらに特定すると、本発明は、TCRをコードするトランスジーンから実質的になる限定されたTCRレパートリーが、トランスジェニック動物の発育の間に作用して、再現可能な、そしてそれ故予想可能な様式で重篤な関節炎症状が発症したトランスジェニック動物に至る一連の事象を開始させる、トランスジェニック動物に関する。
動物は、免疫系と総称される分子および細胞防御の複雑な系列を有する。この免疫系は、潜在的に有害な外来性細胞または内因性であるが異常な細胞(ぞれぞれは、例えば、細菌またはウイルスのような病原体、およびガン細胞または病原体に感染した細胞により代表される)を認識および攻撃するが、内因性の正常細胞は攻撃せず、むしろ許容する。免疫系は、外来性生体分子または異常な生体分子により刺激された場合、外来性生体分子または異常な生体分子が結合する病原体、あるいはガン細胞または病原体に感染した細胞を中和および破壊するように設計された一連の活性を受ける。総合して、免疫応答として知られているこれらの活性は、細胞性免疫応答、体液性(抗体仲介)免疫応答、または細胞性応答および体液性応答の要素を含む免疫応答からなり得る。
本発明は、例えば、以下を提供する。
(項目1)
1つまたはそれより多い滑膜性関節の慢性炎症および変形の表現型を有するトランスジェニック関節炎マウスであって、その表現型は、そのマウスの体細胞および生殖細胞に含有されるトランスジーンにより付与され、ここでそのトランスジーンが、機能的に再編成されたT細胞レセプターのαサブユニットおよびβサブユニットの発現を指向する、トランスジェニック関節炎マウス。
(項目2)
トランスジェニックマウスであって、そのマウスは、そのマウスの体細胞および生殖細胞に含有されるトランスジーンを有し、ここでそのトランスジーンが、T細胞レセプターのαサブユニットおよびβサブユニットの発現を指向し、そのαサブユニットおよびβサブユニットは結合して、以下の(a)、(b)、または(c)を認識するT細胞レセプターを形成する、トランスジェニックマウス:
(a)以下のアミノ酸配列を含むポリペプチド:
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1];
(b)1つまたはそれより多い内因性ポリペプチド関節炎生成性自己抗原を含むタンパク質;または
(c)(a)のポリペプチドと(b)のタンパク質との両方。
(項目3)
上記トランスジーンが以下の(a)、(b)、および(c)を含む、請求項2に記載のマウス:
(a)ハイブリドーマR28の機能的に再編成されたTCRα遺伝子由来の可変領域を含むT細胞レセプターαサブユニットをコードする第1のDNA配列;
(b)ハイブリドーマR28の機能的に再編成されたTCRβ遺伝子由来の可変領域を含むT細胞レセプターβサブユニットをコードする第2のDNA配列;および
(c)その第1のDNA配列およびその第2のDNA配列をインビボで発現する手段。
(項目4)
1つまたはそれより多い滑膜性関節の慢性炎症および変形の表現型を有するマウスであって、そのマウスが、以下の(a)、(b)、および(c)を含むウイルスベクターを導入することにより生成される、マウス:
(a)ハイブリドーマR28の機能的に再編成されたTCRα遺伝子由来の可変領域を含むT細胞レセプターαサブユニットをコードする第1のDNA配列;
(b)ハイブリドーマR28のTCRβ遺伝子由来の可変領域を含むT細胞レセプターβサブユニットをコードする第2のDNA配列;および
(c)その第1のDNA配列およびその第2のDNA配列をインビボで発現する手段。
(項目5)
請求項3または4のいずれかに記載のマウスであって、ここで
(a)上記第1のDNA配列が、配列番号2、配列番号4、およびそれらの等価物からなる群から選択され;
(b)上記第2のDNA配列が、配列番号3、配列番号5、およびそれらの等価物からなる群から選択され;
(c)上記第1のDNA配列を発現する上記手段が、ハイブリドーマR28の機能的に再編成されたTCRα遺伝子由来のTCRVαプロモーター領域から本質的になり、そして上記第2のDNA配列を発現する上記手段が、ハイブリドーマR28の機能的に再編成されたTCRβ遺伝子由来のTCR Vβプロモーター領域から本質的になる、
マウス。
(項目6)
上記マウスが、1つまたはそれより多い内因性ポリペプチド関節炎生成自己抗原を提示する主要組織適合性複合体分子をコードする主要組織適合性複合体遺伝子座をさらに含む、請求項3または4のいずれかに記載のマウス。
(項目7)
上記主要組織適合性複合体遺伝子座がNODマウス系統由来の主要組織適合性複合体遺伝子座である、請求項6に記載のマウス。
(項目8)
上記マウスが、1つまたはそれより多い内因性ポリペプチド関節炎生成自己抗原を提示する主要組織適合性複合体分子をコードする主要組織適合性複合体遺伝子座をさらに含む、請求項5に記載のマウス。
(項目9)
上記主要組織適合性複合体遺伝子座がNODマウス系統由来の主要組織適合性複合体遺伝子座である、請求項8に記載のマウス。
(項目10)
以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも1つのエピトープを共有するマウスタンパク質であって、
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]
ここで、そのタンパク質が、トランスジェニック関節炎マウス中のポリペプチド関節炎生成自己抗原を含む、タンパク質。
(項目11)
以下のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも1つのエピトープを共有する哺乳動物タンパク質であって、
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]
ここでそのタンパク質が、それが単離された哺乳動物種中のポリペプチド関節炎生成自己抗原を含み、そして請求項10に記載のタンパク質に由来するアミノ酸配列と少なくとも90%同一である、少なくとも15アミノ酸の連続した伸長部をさらに含む、タンパク質。
(項目12)
上記哺乳動物種がヒトである、請求項11に記載のタンパク質。
(項目13)
請求項10から12のいずれかに記載のタンパク質をコードする単離されたDNA配列。
(項目14)
1つまたはそれより多い滑膜性関節の慢性炎症および変形の表現型を有するマウスであって、そのマウスが、請求項10から12のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列に由来の1つまたはそれより多い合成オリゴペプチドを含む組成物で、幼齢時に免疫することにより生成される、マウス。
(項目15)
1つまたはそれより多い滑膜性関節の慢性炎症および変形の表現型を有するマウスであって、そのマウスが、請求項1から9、または14のいずれかに記載のマウス由来のリンパ球の移入により生成される、マウス。
(項目16)
タンパク質を生成する方法であって、発現ベクターを含有する微生物を培養する工程を包含し、その発現ベクターが、請求項13に記載の単離されたDNA配列およびそのDNA配列をその微生物で発現させる手段を含む、方法。
(項目17)
タンパク質を生成する方法であって、ウイルス発現ベクターを培養する工程を包含し、その発現ベクターが、請求項13に記載の単離されたDNA配列およびそのDNA配列をそのウイルス発現ベクターが複製され得る宿主細胞で発現させる手段を含む、方法。
(項目18)
不死化細胞とトランスジェニック関節炎マウスから単離された抗体産生細胞との融合により生成されるハイブリドーマ細胞であって、ここでその抗体産生細胞およびそのハイブリドーマ細胞が、請求項10から12のいずれかに記載のタンパク質を認識する抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞。
(項目19)
請求項18に記載のハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体。
(項目20)
トランスジェニック関節炎マウスの抗原提示細胞により提示されるオリゴペプチド抗原を認識する単一特異性抗体。
(項目21)
ヒトを包含する動物が慢性関節リウマチを発症させる強い危険性を有するか否かを決定する方法であって、その方法が、請求項19に記載のモノクローナル抗体または請求項20に記載の単一特異性抗体を用いて、その動物由来の生体液をイムノアッセイする工程を包含する、方法。
(項目22)
ヒトを包含する個々の動物が慢性関節リウマチを発症させる強い危険性を有するか否かを決定する方法であって、その方法が、請求項10から12のいずれかに記載のタンパク質に対するT細胞反応性について、個々の動物由来の単離されたT細胞を試験する工程を包含する、方法。
(項目23)
請求項19に記載のモノクローナル抗体または請求項20に記載の単一特異性抗体を含む、アフィニティーカラム。
(項目24)
請求項10から12のいずれかに記載のタンパク質を生成する方法であって、その方法は、ヒトを包含する動物由来の生体試料を請求項23に記載のアフィニティーカラムに通す工程を包含し、ここでそのタンパク質がそのカラムに保持される、方法。
(項目25)
以下の工程を包含する方法により生成されるタンパク質であって、その方法は、ヒトを包含する1つまたはそれより多い動物由来の生体試料を請求項23に記載のアフィニティーカラムに通す工程を包含し、ここでそのタンパク質が
(a)そのカラムに保持され;そして
(b)そのタンパク質が単離される動物種中のポリペプチド関節炎生成自己抗原を含む、
タンパク質。
(項目26)
上記動物種がヒトである、請求項25に記載のタンパク質。
(項目27)
組成物の抗関節炎能を決定する方法であって、以下の工程:
(a)炎症、不治の関節破壊、および肢節変形が生じる前に、既知用量のその組成物を第1のトランスジェニック関節炎マウスに投与する工程;
(b)その第1のトランスジェニック関節炎マウスにおいて不治の関節破壊および肢節変形の発生を検出する工程;および
(c)その第1のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間と、その組成物に曝されていない第2のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間とを比較する工程であって、
ここで、その第2のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間に対するその第1のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間の統計学的に有意な遅延が、その組成物の抗関節炎能を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目28)
組成物の抗関節炎能を決定する方法であって、以下の工程:
(a)不治の関節破壊および肢節変形が生じる前に、既知用量のその組成物を第1のトランスジェニック関節炎マウスに投与する工程;
(b)その第1のトランスジェニック関節炎マウスにおいて不治の関節破壊および肢節変形の程度をモニターする工程;および
(c)その第1のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度と、その組成物に曝されていない第2のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度とを比較する工程であって、
ここで、その第2のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度に対するその第1のトランスジェニック関節炎マウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度の統計学的に有意な減少が、その組成物の抗関節炎能を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目29)
組成物の関節炎生成能を決定する方法であって、以下の工程:
(a)不治の関節破壊および肢節変形が生じる前に、既知用量のその組成物を第1のKRNトランスジェニックマウスに投与する工程;
(b)その第1のKRNトランスジェニックマウスにおいて不治の関節破壊および肢節変形の発生を検出する工程;および
(c)その第1のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間と、その組成物に曝されていない第2のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間とを比較する工程であって、
ここで、その第1のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間に対するその第2のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の発生時間の統計学的に有意な遅延が、その組成物の関節炎生成能を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目30)
組成物の関節炎生成能を決定する方法であって、以下の工程:
(a)不治の関節破壊および肢節変形が生じる前に、既知用量のその組成物を第1のKRNトランスジェニックマウスに投与する工程;
(b)その第1のKRNトランスジェニックマウスにおいて不治の関節破壊および肢節変形の程度をモニターする工程;および
(c)その第1のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度と、その組成物に曝されていない第2のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度とを比較する工程であって、
ここで、その第2のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度に対するその第1のKRNトランスジェニックマウスにおける不治の関節破壊および肢節変形の程度の統計学的に有意な増加が、その組成物の関節炎生成能を示す、工程、
を包含する、方法。
(項目31)
上記組成物が、循環系注入または経口摂取により投与される化合物を含む、請求項27から30のいずれかに記載の方法。
(項目32)
上記組成物が、生または弱毒化の単離されたまたは組換え細菌またはウイルスの循環系注入により投与されるポリペプチドを含み、ここで、そのポリペプチドが、注入前に、その細菌またはウイルスの表面に存在する、請求項27から30のいずれかに記載の方法。
(項目33)
上記組成物が、マウス内で複製可能な単離されたまたは組換え細菌またはウイルスの循環系注入により投与されるポリペプチドを含み、そしてそのポリペプチドが、そのポリペプチドをコードするDNA配列の遺伝子発現によりマウス内で産生される、請求項27から30のいずれかに記載の方法。
(項目34)
上記組成物が、抗炎症性が期待される組成物、抗炎症性が活性な組成物、およびそれ自体は炎症に対して効果を有さないが炎症事象から生じる組織破壊を制限する組成物からなる群から選択される、請求項27から30のいずれかに記載の方法。
(項目35)
上記第1のKRNトランスジェニックマウスがKRNトランスジェニックNODマウスである、そして上記第2のKRNトランスジェニックマウスがKRNトランスジェニックNODマウスである、請求項29または30に記載の方法。
(項目36)
慢性関節リウマチの初期徴候を示す個体において慢性関節リウマチに関連した重篤な症状の発生を遅延させる方法であって、請求項10から12のいずれかに記載のタンパク質に由来する合成オリゴペプチドを、経口摂取を介して投与する工程を包含する、方法。
(項目37)
配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む可変領域を含むT細胞レセプターのαサブユニットをコードする、単離されたDNA配列。
(項目38)
配列番号7に記載のアミノ酸配列を含む可変領域を含むT細胞レセプターのβサブユニットをコードする、単離されたDNA配列。
(項目39)
配列番号5に記載のアミノ酸配列に由来する少なくとも5つの連続したアミノ酸を含む、合成オリゴペプチド。
(項目40)
配列番号7に記載のアミノ酸配列に由来する少なくとも5つの連続したアミノ酸を含む、合成オリゴペプチド。
(項目41)
請求項13に記載の単離されたDNA配列およびそのDNA配列をインビボで発現させる手段を含む発現ベクター。
(項目42)
請求項37または38に記載の単離されたDNA配列およびそのDNA配列をインビボで発現させる手段を含む発現ベクター。
(項目43)
上記DNA配列をインビボで発現させる上記手段が、ハイブリドーマR28の機能的に再編成されたTCRα遺伝子由来のTCRVαプロモーター領域またはハイブリドーマR28の機能的に再編成されたTCRβ遺伝子由来のVβプロモーター領域を含む、請求項42に記載の発現ベクター。
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]
を有するオリゴヌクレオチドの1つ以上のエピトープおよび/またはBPR由来オリゴペプチドの抗原と実質的に交差反応性である、内因性ポリペプチド関節炎生成自己抗原の1つ以上のエピトープを含む抗原を認識する。
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]
を有するオリゴヌクレオチドの1つ以上のエピトープおよび/または内因性ポリペプチド関節炎生成自己抗原の1つ以上のエピトープを含む抗原を認識する。本発明のTCR可変領域のアミノ酸配列に由来するオリゴペプチドは、治療用組成物を設計するために使用される。
(用語および記号)
本開示の目的のために、特に記載しない限り、本明細書中では以下の略語、定義、遺伝学的名称、および制限酵素認識配列を使用する。
タンパク質:機能的な、3次元形態に編成された1つ以上のポリペプチドを含む生体分子。
本発明は、T細胞レセプターの実質的に制限されたレパートリーを有する非ヒト動物が、慢性関節リュウマチの重篤な古典的症状を選択的に含む表現型を示すという予期しない発見に基づく。関節炎動物のTCRレパートリーは(例え、制限されていても)、機能的に存続可能である。関節炎動物の制限されたTCRレパートリーはTCRの実質的部分に存在し、TCRは内因性ポリペプチド性関節炎生成自己抗原の1つ以上のエピトープを認識する。好ましい実施態様において、TCRのαサブユニットおよびβサブユニットをコードするトランスジーンの動物のゲノムへの挿入の結果、関節炎動物の制限されたTCRレパートリーを生ずる。TCRのαサブユニットおよびβサブユニットは、得られるトランスジェニック動物のT細胞中で組み合わされてTCRを形成する。TCRは、ウシ膵臓リボヌクレアーゼ(BPR)のアミノ酸41〜61に相当し、そしてアミノ酸配列
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]
を有するオリゴペプチドの1つ以上のエピトープ、および/またはBPR由来オリゴペプチドの抗原と実質的に交差反応性である、内因性ポリペプチド関節炎生成自己抗原を含有するタンパク質の1つ以上のエピトープを含む抗原に結合する。
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]
を有するオリゴペプチドの1つ以上のエピトープ、および/またはBPR由来オリゴペプチドのエピトープと実質的に交差反応性である、内因性ポリペプチド関節炎生成自己抗原を含有するタンパク質の1つ以上のエピトープを含む抗原に結合する可変領域を構成する。
本実施例は、R28細胞によって提示されるT細胞レセプターのαおよびβサブユニットをコードする単離されたDNA配列ならびにこれに由来するトランスジーン構築物の産生を記述する。
R28(非公式にはRNAse37ともいう)は、ウシ膵臓RNAse(BPR)のアミノ酸41位〜61位に対応するオリゴペプチドを注射されたB10.A(4R)マウスに由来するマウスT細胞ハイブリドーマである。Peccoud,J.ら、EMBO Journal 9:4215-4223(1990)。インビトロにおいて、R28に提示されるTCRは、MHC Ak分子を提示するAPCによって提示される場合、BPR由来オリゴペプチドに応答する。変異体MHCAk分子を提示するAPCを使用する場合、R28は、特徴づけられていないペプチド抗原を、交差反応的に認識する。このペプチド抗原はウシ胎児血清中に存在するか、またはその合成がウシ胎児血清によって促進されるかのいずれかである。しかし、このペプチド抗原はBPRでもBPR由来オリゴペプチドでもない。Dellabona,P.ら、Eur.J.Immunol.21:209-213(1991)。
2つのDNAフラグメント(プラスミドpaKRNおよびpbKRN由来)を使用してKRNトランスジェニック株を作成した。両方のプラスミドは、ハイブリドーマR28から最初に誘導されたDNA配列を含む。Peccoud,J.ら、EMBO Journal 9:4215-4223(1990)。TCRのα鎖およびβ鎖の両方の機能的に再編成された可変および連結領域を、カセットベクターの適切な部位に挿入した。このカセットベクターは、機能的に再編成されたTCR可変領域のTCRサブユニット遺伝子への適切な挿入を可能にするよう設計される。TCRサブユニット遺伝子は、トランスジェニックマウスへの導入の際に、マウス発現配列に作動可能に連結される。
本実施例はトランスジェニックマウスの構築を記述する。このトランスジェニックマウスは、実質的に、KRNトランスジェニック対立遺伝子によりコードされるTCRαサブユニットとTCRβサブユニットとからなるTCR集団(population)を有する。KRNトランスジェニックマウスは、機能的に生存可能ではあるが制限されたTCRレパートリーを有する。
マイクロインジェクションにおける使用に適したDNA分子を作成するために、原核宿主細胞におけるプラスミドpaKRNおよびpbKRNの維持のためだけに必要なこれらプラスミドのDNA配列を除去することが必要であった。このことを、制限エンドヌクレアーゼSalI(paKRN)またはKpnI(pbKRN)でこれらのプラスミドを処理すること、および予備的なアガロースゲル電気泳動および電気溶出によって、それぞれ、関連するSalIまたはKpnI制限フラグメント(図1)を単離することによって達成した。制限フラグメントをフェノール−クロロホルムで2回抽出し、エタノールで沈澱させ、そして再懸濁した。
トランスジーンのメンデルの法則による伝達(Mendelian transmission)を、トランスジェニックマウスを非トランスジェニックマウスと交配することにより達成する。代表的には、C57B1/6マウスとの戻し交配であるが、他の系統も使用する。トランスジーン陽性子孫を、Vβ6セグメントに対する試薬を用いる末梢血リンパ球のサイトフルオリメトリック分析(下記参照)、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって、型どおりに同定する。ハイブリダイゼーションアッセイには、それぞれの同腹子からの生物学的サンプルを得る(代表的には、そのマウスの尾の末端0.5〜1.0cmを物理的に分離することによる)工程、尾のサンプルをホモジェナイズまたは抽出する工程、それらに由来するDNA分子を精製または増幅する工程、得られたDNA分子をEcoRV制限エンドヌクレアーゼで消化する工程、制限されたDNA配列を電気泳動的に分離する工程、制限され、分離されたDNA配列をフィルターに移し結合させる工程、およびフィルターに結合したDNA配列を、検出可能に標識した核酸プローブでハイブリダイズする工程が含まれる。ここで、この核酸プローブは、paKRN由来の約0.7kbのXmaI-NotIフラグメントからなる(図1A)。さらに、またはあるいは、pbKRN由来の約0.5kbのXhoI制限フラグメントを、検出可能に標識し、そしてトランスジェニック子孫のためのプローブとして使用し得る。
いくつかの種類(line)の証拠により、αトランスジーンおよびβトランスジーンが、ともに、トランスジェニックマウスのリンパ球において高い比率で発現すること、およびトランスジーンによりコードされたTCRサブユニットからなるT細胞レセプターが、トランスジェニック動物において、圧倒的な数の制限されたTCRレパートリーであることが示される。
TTTGTTGGTATTGGAAGGGGCCAGAGCACAGAAGTACACG [配列番号8]。
TCRαのcDNAクローンの中で、トランスジーンがコードする転写物に対応するクローンを、検出可能に標識した、トランスジーンに特異的な核酸プローブを用いるハイブリダイゼーションによって検出した。このトランスジーンに特異的な核酸プローブは、paKRN(図1A)に由来する約0.7kbのXmaI-NotIフラグメントからなり、そしてpaKRNに含まれる機能的に再編成されたV-J連結領域に対応し、TCRα可変領域をコードするトランスジーンに由来するcDNA配列と特異的にハイブリダイズする。Cαに特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションによって検出されたクローンのうち、97%はまた、トランスジーンに特異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションによって検出された。この結果は、トランスジーンがコードするTCRαサブユニットに対応するmRNA配列が、トランスジェニック動物における大多数のTCRα転写物を説明することを示す。
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]。
本明細書中で記載する関節炎の新規なトランスジェニックモデルは、この目標に対して行われた努力の結果ではなかった。T細胞レパートリーの選択に付随する根本的な免疫学の問題に取り組むために、トランスジェニックマウスのKRN株を、マウスに、遺伝子を導入することによって構築した。この遺伝子は、ウシ膵臓RNAaseに反応性のマウスT細胞ハイブリドーマ由来の抗原に対するT細胞レセプター(TCR)のαサブユニットおよびβサブユニットをコードする。KRNトランスジーンを最初に導入されるマウスの系統C57B1/6の遺伝的背景において、このトランスジーンは異常な表現型を与えなかった。もちろん、それらの制限されたTCRレパートリーのために、これらマウスは、少なくとも、研究室環境において低い頻度で遭遇する病原体に対して適切な免疫応答を高める能力が減少し得る。
関節炎遺伝子型の浸透度に必要とされるKRNトランスジーンおよびNOD由来MHC遺伝子を有するマウスにおける関節炎の進展(下記参照)を、関節炎動物の足首関節の太さのカリパス測定(calliper measurement)、すなわち、炎症プロセスの開始および展開(evolution)と良く相関する測定値を与える簡単なアッセイによって追跡した。トランスジェニック関節炎マウスは関節の炎症の徴候を示す。この徴候は、3週齢と4週齢との間で鮮明に始まり、この時期以前には、臨床徴候は明らかではない(図4B)。遠位関節(distaljoint)は、膝または肘より影響されるようである。この関節は、赤く腫れ上がる;変形は2〜3週間後に始まり、肢の運動性が減少するという予想される結果を伴う(図4A参照)。この状態は数週間持続する。10〜12週間後、炎症の症状はいくらか治まるが、主要な後遺症である変形は持続する。
ラジオグラフィー(x線像影)を、個々のNODKRNトランスジェニック動物および非トランスジェニック同腹子について、トランスジェニック動物における疾患の発生後種々の時間に実施した。骨および軟骨の侵食は、膝および足首で明瞭に見える(図6)。これは、外部から見ることが可能なひどい変形を反映する(図4のパネルAと比較せよ)。骨腫症(osteophytosis)を伴う骨接合が広がっている。より高齢の動物では、関節の顕著な再編成が存在する。これは外部から見ることが可能な変形に一致する。x線写真では、脊柱もまたいくらか影響を受けているようである。
正常なマウスまたは関節炎(KRNトランスジェニックNOD)マウスの関節を、標準的で通常の病理学技術に従いヘマトキシリン−エオシンを用いて染色した後、脊椎、膝または足の関節の脱石灰化パラフィン切片の組織学的検査によって検査した。Stevens,A.、Theory and Practice of Histological Techniques, Bancroft,J.D.およびStevens,A.編、第3版、Churchill Livingstone, Edinburgh, New York、107〜118頁(1990)。トランスジェニック関節炎マウスには、RA患者において平行して発症する関節の炎症の非常に明らかな徴候がある:関節における、大きな滑膜細胞(synoviocyte)の数重にも重ね合わさった層を伴う滑膜過形成、多形性細胞の浸潤(顆粒球、リンパ球、形質細胞)、フィブリン性滲出物。軟骨の侵食、破壊および再吸収は、疾患の2〜3週間後に優勢である。また、病変は遠位関節で支配的であり、膝では明らかであるがより低い活性であり、そして臀部では非常に離散的である。脊椎もまた、炎症性浸潤物によって影響されるが、その影響は穏やかである。3週齢前には組織学的病変は存在しない。
トランスジェニック関節炎の最初の観察は、F1マウスにおいてなされた。このF1マウスは、C57B1/6背景にKRNトランスジェニック対立遺伝子を有するマウスと同系交配NOD/Ltマウスとの間での交配から生ずる。得られたKRNトランスジェニックNOD動物は、ゲノム中の各遺伝子座に混ざり合った対立遺伝子を有する。この混ざり合った対立遺伝子は、等しく寄与するNOD/Lt親からの対立遺伝子とC57B1/6親からの対立遺伝子とからなる。KRNトランスジェニック対立遺伝子は、C57B1/6背景に存在する場合、いかなる関節炎の症状も生じさせないので、NODゲノム由来の遺伝要素(すなわち、1またはそれ以上の対立遺伝子)は、KRNトランスジェニック対立遺伝子による関節炎の誘導に寄与する。
KRNトランスジェニックNODマウスにおいて関節炎を導くトランスジェニック対立遺伝子の真の性質は、この疾患および(類推による拡張によって)RAにおけるTリンパ球の決定的役割を暗示する。確かに、トランスジェニック関節炎マウスの中枢T細胞集団および末梢T細胞集団の拡大したクローン排除が、この動物の発育の間に生じる。クローン排除のメカニズムは、誕生の頃非常に活性である;CD4+T細胞およびCD8+T細胞は、この時期の末梢リンパ様器官には、もしあっても、ほとんどない。年齢と共にT細胞の脱落は、いくらか和らぐ傾向があり、そしてCD4+リンパ球は、約3週齢の動物において脾臓およびリンパ節に現れる。
本発明のトランスジェニック関節炎マウスにおける関節炎の信頼できそして再現性の性質、およびヒト慢性関節リュウマチに対するその明らかな関係のために、本発明のトランスジェニック動物は、開発途中の抗関節炎組成物の安全性および効力を推測するために使用される。抗関節炎組成物は、臨床発現の開始に先立って、またはこの疾患は進展しているが治療不可能な関節の破壊および変形は起きる前に投与される。
KRNトランスジェニックNOD関節炎マウスを、抗CD4抗体(ヒトにおいてRAの症状を軽減する見込みがいくらかあると示されている組成物)で処置した。Moreland,L.W.ら、Arthritis Rheum. 36:307-319(1993)。処置された動物および非処置コントロール動物における関節炎の進展を、3日ごとにマウスを臨床的に検査することによってモニターした。図7に示されるように、トランスジェニック関節炎マウスを2週齢からの抗CD4抗体で処置することにより、病理学的発現の出現が予防された。
抗関節炎の可能性がある遺伝子産物(ポリペプチドを含む)をコードするDNA配列を含有するトランスジーンを、マウスのゲノムに導入する。抗関節炎トランスジェニック創始体動物の子孫を、抗CD4または別の抗関節炎剤で処置したトランスジェニック関節炎マウスと交尾させることによって、本発明のトランスジェニック抗関節炎動物モデルに、候補となる抗関節炎トランスジーンを導入する。このことによって、トランスジェニック関節炎マウスに、活発に交尾プロセスを企てるに十分な運動性を与える。あるいは、候補となる抗関節炎トランスジーンを、NOD系統のマウス個体のゲノムに導入し、そしてNOD創始体の子孫を、非関節炎KRNトランスジェニックマウスと交尾させ、そして一重トランスジェニック子孫および二重トランスジェニック子孫における関節炎症状の発症をモニターし、そして比較する。抗関節炎性DNA配列は、抗関節炎性DNA配列の非存在下で関節炎を発症するトランスジェニック関節炎動物において発現した場合、炎症を減少させるか、遅らせるか、または生じさせないものであるか、または炎症に続く続発性の組織破壊を制限または排除するものである。
マウスのNOD系統由来のMHC遺伝子座を有するKRNトランスジェニックマウスでは、全てのトランスジェニックマウスが関節炎になる。KRNトランスジェニック対立遺伝子が関節炎を誘導できないマウスの系統由来のMHC遺伝子座を有するKRNトランスジェニックマウスを用いて、関節炎生成能について組成物を評価した。KRNトランスジェニック対立遺伝子の関節炎の可能性を増大する組成物は、本発明の動物モデルにおいて関節炎生成性である。このような組成物は、グルココルチコイド、リンホカイン、インターフェロン、サイトトキシンと抗体との結合物、CDタンパク質、MHCタンパク質、CDタンパク質およびMHCタンパク質の誘導体、およびMHC分子による抗原提示、MHC提示抗原のTCR認識、および/またはMHC分子とCDタンパク質との間の相互作用に影響する合成化合物または単離されたエフェクター生体分子を包含するが、これらに限定されない。ヒトの雌においてより優勢であり得、したがってそこでRAの増加した発病率に関係することが示唆されている(Fox,H.S.ら,J.Immunol. 146: 4362-4367 (1991))単離されたエフェクター生体分子(例えば、γ−インターフェロン)を、他の性差に起因する影響を除去するために、本発明の雄および雌の両方のトランスジェニック非ヒト動物において試験する。
本実施例は、本発明のトランスジェニック関節炎マウスにおいてトランスジーンにコードされたTCRにより認識されるペプチド抗原を単離する方法を記載する。これらのポリペプチドは、本発明のトランスジェニック関節炎動物の免疫系から、ポリペプチド性関節炎生成自己抗原(PASA)を含有するマウスタンパク質の1つ以上のエピトープと特異的に結合する細胞およびエフェクター生体分子を単離するために用いられる。単離された細胞およびエフェクター生体分子は、PASA含有タンパク質をヒトを含む他の動物種から単離するために用いられる(実施例7)。
脾臓および胸腺を関節炎トランスジェニックマウス(例えば、KRN-トランスジェニックNODマウス)から死後に単離する。リンパ球(TまたはB細胞)を、関節炎の進展中の種々の時点で1つ以上のトランスジェニック動物の単離された脾臓または胸腺から調製する。個々の抗体産生TまたはB細胞を、インビボで不死細胞と融合する。得られる安定に増殖する融合細胞株(ハイブリドーマ)(これらはそれぞれ、独特な抗原結合(可変)領域を有するTCR(T細胞)または抗体(B細胞)を発現する)を、標準的なリンパ球培養技術により培養する。Harlow,E.およびLane,D.,Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laoratories, Cold Spring Harbor,N.Y.,139-281頁 (1988); Ausubel,F.M.ら,編, Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,11.4.1-11.11.5頁 (1993)。
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]
あるいは、T細胞ハイブリドーマを、BPR由来オリゴペプチドおよびAPCの存在下で、野生型または調節可能なAk MHC遺伝子を用いたトランスフェクトに起因する変異型AkMHC分子を示す活性化についてスクリーニングする。Dellabona,P.ら, Eur.J.Immunol. 21: 209-213 (1991)。いずれのタイプのAPCも、PASA含有タンパク質に由来する粗オリゴペプチドまたは合成オリゴペプチドと二者択一で用いられる(上記を参照のこと)。いずれの場合でも、R28ハイブリドーマ細胞を、ポジティブコントロールとして用いる。この方法で同定および単離されたT細胞ハイブリドーマはTCRサブユニットを発現し、このTCRサブユニットは、本発明のトランスジーンにコードされるものと同一であるか、またはトランスジェニック関節炎マウスにおいて産生されそして変化した結合特性を有するその変異体のいずれかである。
内因性PASA含有タンパク質に由来する粗オリゴペプチドまたは合成オリゴペプチド(上記を参照のこと)を用いて、単一特異性抗体を生成し、次の実施例で用いる。
本発明のトランスジェニック関節炎マウスの発育中に、再現可能なしたがって予測し得る方法で、伝授される免疫学的事象が、重篤な関節炎症状に進展するトランスジェニック動物で最高潮に達する免疫学的事象のカスケードの引き金となる。KRNトランスジェニック対立遺伝子は、特定のTCRを有する個体マウスにおいて大部分のT細胞にあり、そして特定の系統のマウスに由来する抗原提示MHCタンパク質が、発現されるトランスジェニック表現型に必要であるため、関節炎の比較的初期に生じる重要な免疫学的事象が、T細胞による内因性自己抗原の認識である可能性がある。これらの内因性自己抗原を、本明細書では一般に内因性ポリペプチド関節炎生成自己抗原(PASA)という。これらのPASAを含有するマウスタンパク質は、ヒトRAの発生に根源的に重要なヒトタンパク質に相当すると考えられる。ヒトPASA含有タンパク質、ならびにヒトPASA含有タンパク質に由来する合成化合物および誘導体化合物は、ヒトにおける関節炎の診断、予防、または治療に有用である(後の実施例を参照のこと)。本発明のトランスジェニック関節炎動物は、PASA含有タンパク質またはこのようなタンパク質をコードするDNA配列をヒトを含む多くの動物供給源から単離され得る手段を提供する。
前述の実施例のモノクローナル抗体または単一特異性抗体を、正常マウスおよび関節炎マウス、ならびにタンパク質精製に十分な材料がより容易に得られるより大きな動物(例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ウマなど)におけるPASA含有タンパク質の身体内分布を同定するために、標準的方法にしたがって公知の免疫組織学的技術でプローブとして用いる。必要であれば、発育の種々の段階の動物をこのように検査する。Ausubel,F.M.ら,編,Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons,14.0.1-14.6.13頁 (1993)。
APCに結合するPASA由来オリゴペプチドのアミノ酸配列、またはPASA含有タンパク質のアミノ酸配列、あるいはその両方を、遺伝コード(表2)とともに用いて、PASA含有タンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズし得る合成オリゴヌクレオチドの構築のために対応するDNA配列を設計する。Lathe,R.,J.Mol.Biol.183: 1-12 (1985)。オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、PASA含有タンパク質アミノ酸配列をコードするDNA制限フラグメントを検出する;次いで制限フラグメントを適切なベクターにクローン化する。Ruter,W.J.ら、米国特許第4,440,859号(1984年4月3日)。あるいは、オリゴヌクレオチドをPCR反応におけるプライマーとして用いて、PASA含有タンパク質をコードするDNA配列を増幅する。Mullis,K.B.ら、米国特許第4,965,188号(1990年10月23日)。特に、逆PCRを用いて、最少量のアミノ酸配列情報から最大量のPASA含有タンパク質コード配列情報を生成する。Ochman,H.ら,PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich,H.A.編,Stockton Press, London, 105-111頁 (1989)。次いでPCR産物を、適切なベクターにクローン化してから配列決定するか、または直接配列決定する。Gyllensten,U.PCR Techmnology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich,H.A.編,Stockton Press, London, 45-60頁 (1989)。PASA含有タンパク質を産生するために、このタンパク質をコードするDNA配列を適切な発現ベクターにクローン化し、次いでこれをそれらの同起源の宿主細胞に導入し、ここでPASA含有タンパク質の指示された生合成が行われる。Rutter,W.J.ら、米国特許第4,440,859号(1984年4月3日)。
前述の実施例のPASA含有タンパク質および本発明のトランスジーンのTCRサブユニットの可変領域を用いて、ヒトを含む関節炎動物の処置に有用ないくつかの組成物を作成する。
機構は不明確なままであるが、TCRサブユニットの可変領域に相当する合成オリゴペプチドを用いた免疫は、実験的なアレルギー性脳髄膜炎(EAE)を予防または好転させることが示されている。EAEは、MBPを用いた動物の自己免疫により誘導され、そしてMSの臨床的症状(例えば、髄鞘脱落および麻痺)を生成する。Howell,W.M.ら,Science 246: 668-670 (1989); Vanderbarkら, Nature 341: 541-544 (1989)。TCR由来オリゴペプチドを用いたMSを患うヒトの処置の試験的な試みが、現在進行中である。Oksenberg,J.R.ら,J.Neurol.Sci. 115(補遺): S29-S37 (1993)。
自己免疫は、例えば皮下注射により動物に自己抗原を直接提示することによりもたらされ得るが、トレランスは、経口摂取により動物に抗原を提示することにより達成され得る。このプロセス(経口トレランス治療と呼ばれる)は、いくつかの自己免疫応答影響を攻撃するサイトカインを分泌するT細胞を活性化するようである。Strobel,S.ら, Immunology 56: 577-564 (1985); Mowat,A.M., Immunology 56: 253-260 (1985); Mowat,A.M.ら, Adv.Exp.Med.Biol. 216A: 709-720(1987);Lamont,A.G.ら, Immunology 63: 737-739 (1988); Mowat,A.M.ら, Immunology 64:141-145 (1988)。抗原の増強されたトレランスをもたらす経口摂取により提示される抗原は、トレロジェンと呼ばれる。Thompson,H.S.ら,Clin.Exp.Immunol. 72: 20-25 (1988); Thompson,H.S.G.およびStaines,N.A.,Clin.Exp.Immunol. 64: 581-586 (1985); Thompson,H.S.およびStaines,N.A.,Immunol.Today 11: 396-399 (1991)。
EAEにおいて、人工的に導入された「自己」抗原とそれに由来する合成オリゴペプチドとの間のインビボの競合が、自己免疫応答の誘導を調節するために用いられ得る。これらのMHCアンタゴニストは、明らかにAPCのMHC分子により結合され、そしてT細胞に対して提示されるが、当初の抗原からの化学変化のため、T細胞を活性化するためにそれらに対して十分に刺激的ではない。Zamvil,S.S.およびSteinman,L.Annu.Rev.Immunol. 8: 579-621 (1990);Steinman,L. Adv.Immunol. 49: 357-379。関節炎において最高潮に達する後の免疫学的事象の原因となるT細胞の活性化は、疾患の経過に対してそれと並行した効果で遅延または阻害される。
上記の本発明の実施態様は、単独で、または互いに組み合わせて、あるいは他の補足的な方法および/または組成物と組み合わせて、以下に列挙されるような目的に用いられ得る。
Claims (8)
- 実質的に以下のアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、自己抗原に対する免疫原性反応を誘導するための組成物:
Lys-Pro-Val-Asn-Thr-Phe-Val-His-Glu-Ser-Leu-Ala-
Asp-Val-Gln-Ala-Val-Cys-Ser-Gln-Lys[配列番号1]、または
配列番号1において1個の置換、付加もしくは欠失を含む配列。 - 前記タンパク質がヒト由来である、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1から2のいずれかに記載のタンパク質をコードする単離されたDNAを含む、自己抗原に対する免疫原性反応を誘導するための組成物。
- 滑膜性関節の慢性炎症および変形の表現型を有する、関節炎モデルマウスであって、該マウスが、請求項1から2のいずれかに記載の組成物中のタンパク質のアミノ酸配列に由来の合成オリゴペプチドを含む組成物で免疫されたマウス由来のリンパ球を移植することにより生成される、関節炎モデルマウス。
- 滑膜性関節の慢性炎症および変形の表現型を有する、関節炎モデルマウスであって、該関節炎モデルマウスが、請求項4に記載の関節炎モデルマウス由来のリンパ球の移入により生成される、関節炎モデルマウス。
- タンパク質を含む、自己抗原に対する免疫原性反応を誘導するための組成物を生成するための方法であって、該方法は発現ベクターを含有する微生物を培養することを包含し、該発現ベクターが、請求項3に記載の単離されたDNA配列および該DNA配列を該微生物で発現させる手段を含む、方法。
- タンパク質を含む、自己抗原に対する免疫原性反応を誘導するための組成物を生成するための方法であって、該方法はウイルス発現ベクターを培養することを包含し、該発現ベクターが、請求項3に記載の単離されたDNA配列および該DNA配列を該ウイルス発現ベクターが複製され得る宿主細胞で発現させる手段を含む、方法。
- ヒトを包含する個々の動物が慢性関節リウマチを発症させる強い危険性を有するか否かを決定するためのキットであって、該キットが、請求項1から2のいずれかに記載の組成物、陽性コントロール、T細胞反応性を検出するための手段、および指示書を含み、該タンパク質に対するT細胞反応性について、個々の動物由来の単離されたT細胞が試験される、キット。
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