JPH114638A

JPH114638A - トランスジェニック非ヒト動物からの高次転写複合体の精製

Info

Publication number: JPH114638A
Application number: JP10144743A
Authority: JP
Inventors: Bernd Dr Kirschbaum; ベルント、キルシュバウム; Erick Dr Berglund; エリック、ベルグルント; Michael Dr Meisterernst; ミヒャエル、マイスターエルンスト; Greg Polites; グレグ、ポリッツ
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1997-05-26
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 1999-01-12
Also published as: ID20397A; HUP9801188A2; US20050268350A1; HUP9801188A3; PL326482A1; PL197770B1; DE69841149D1; BR9801703A; HU9801188D0; AR012743A1; CZ160198A3; CA2232806A1; KR19980087337A; TR199800920A2; CN1200235A; AU748461B2; KR100607527B1; US20020157127A1; AU6806898A; ATE443132T1

Abstract

(57)【要約】【課題】全ての動物において、従って様々な異なる真
核生物組織および細胞型からの、新規な転写複合体およ
び転写因子であるＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子のア
フィニティー精製を可能とする「普遍的な系」の提供。【課題手段】エピトープ標識されたＴＡＴＡボックス
結合タンパク質（ＴＢＰ）をコードするＤＮＡを含んだ
トランスジーンを用いる。エピトープ標識されたＴＢＰ
を発現するトランスジェニック動物によれば、様々な真
核生物組織および細胞型の（新規）転写因子および転写
複合体の単離及び同定を行なうことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、エピトープ標識されたＴＡＴＡボックス結合
タンパク質（ＴＢＰ）をコードするＤＮＡを含んでなる
トランスジーン、エピトープ標識されたＴＢＰを発現す
るトランスジェニック動物の作製、そして様々な真核生
物組織および細胞型の（新規）転写因子および転写複合
体のアフィニティ精製のためのその用途に関する。

【０００２】背景技術真核生物転写現象の調節の中心は、開始前複合体（pre-
initiation conplex）の段階的形成およびその活性であ
る。これは、転写開始部位におけるＲＮＡポリメラーゼ
II酵素の正確な位置決めと開始に必要な、大きなマルチ
サブユニット複合体である。ＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦ
IIＤ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦおよびＴＦIIＨを包含する、
この複合体の普遍転写因子（ＧＴＦ）の多くは、真核生
物核から最近特徴付けられた（Zawel and Reinberg (19
95) Ann.Rev.Biochem.64,533-561；Serizawa et al.(19
94) In: Transcription: Mechanisms and regulation,4
5-66,Raven press）。ＴＡＴＡ含有プロモーターにおい
て、ＴＦIIＤはＴＡＴＡボックス配列に特異的なアフィ
ニティを有している。ＴＦIIＤが基礎ＲＮＡポリメラー
ゼII転写、ひいては核形成複合体の作成に際してプロモ
ーターと結合する第一要素であることは、この配列認識
のおかげである（Lewin,B.(1990) Cell 61:1161-116
4）。他のＧＴＦは所定どおり段階的に結合して、開始
前複合体を完成させる。その後、この大きな複合体は転
写開始部位にＲＮＡポリメラーゼII（ＰｏｌII）を補充
して正確に位置決めさせて、基礎転写を開始させる。そ
れ自体マルチサブユニット複合体であるＴＦIIＤは、転
写アクチベーターの存在下における高レベルのｍＲＮＡ
生産としておおまかに規定される「活性化転写」の調節
で重要な役割を果たすことが、明らかになってきた。こ
のようなアクチベーターには、Ｅボックス結合ＵＳＦの
ような自然エンハンサー結合決定基（Sawadogo and Roe
der (1985) Cell 43:165-175；Kirschbaum et al.(199
2) Mol.Cell.Biol.12:5094-5100）、またはＶＰ１６の
ようなウイルス因子（Stringer et al.(1990) Nature 3
45:783-786）がある。

【０００３】ＴＦIIＤはＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢ
Ｐ）といくつかのＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ_IIS）から構
成されている（本出願において、「ＴＡＦ_IIS」にはあ
らゆる種類の転写因子、転写アクチベーター、転写イン
ヒビターが包含される）。２０種もの異なるＴＡＦ_IIS
が現在まで特徴付けられ、ＴＡＦ_IISの異なる組合せを
含むＴＦIIＤ複合体が観察された（Zawel and Reinberg
(1995) Ann.Rev.Biochem.64,533-561；Hori,R and Car
ey,M.(1994) Curr.Opinion Gen.Dev.4:236-244）。しか
も、ＴＡＦ_IISの異なる組合せはＴＡIIＤ複合体に別個
な性質を付与する。例えばDrosophilaにおいて、パター
ン形成タンパク質 Hunchback（ＨＢ）およびBicoid（Ｂ
ＣＤ）はＴＦIIＤ複合体中でＴＡＦ_II６０、ＴＡＦ_II１
１０およびＴＡＦ_II２５０の存在に絶対的に依存してい
る（Sauer,F.et al.(1995) Science 270,1783-1788）。
これらのＴＦIIＤ成分は、上流エンハンサー結合ＨＢお
よびＢＣＤタンパク質へのコ‐アクチベーターとして作
用する。神経原性因子ＮＴＦ‐１は活性化された転写の
ためにＴＢＰ．ＴＡＦ_II１５０（それが結合する）およ
びＴＡＦ_II２５０の最小複合体を要することが示され、
一方ＳＰ１はその活性化のために追加因子ＴＡＦ_II１１
０を要する（Chen,J.L.et al.(1994) Cell79:93-10
5）。もう１つの研究ではＴＡＦ_II２８を同定したが、
その存在はエストロゲンおよびビタミンＤ３核レセプタ
ーによる転写活性化に必要である（May,M.et al.(1996)
EMBO 15:3093-3104）。ＴＡＦ_IISは転写アダプターと
して作用して、タンパク質‐タンパク質相互作用により
アクチベーター／リプレッサー因子からコア開始複合体
に調節情報を伝えるようである。

【０００４】調節された転写が現在検討されているが、
個別遺伝子および／または緊密関連遺伝子座の小さな群
の発現は規定しうる組数の転写複合体サブユニットによ
りコントロールされる。一部の因子、例えばＧＴＦはほ
とんどの転写現象下で偏在および存在しているが、現在
記載されている調節転写の遺伝子‐および細胞‐特異性
要素の数は増えている。転写因子を同定するために用い
られた、いくつかの証明済み方法がある。ＲＮＡＰｏ
ｌIIおよび７つのＧＴＦ（ＴＦIIＡ、ＴＦIIＢ、ＴＦII
Ｄ、ＴＦIIＥ、ＴＦIIＦ、ＴＦIIＨおよびＴＦIIＪ）を
取り出す初期の方法では、細胞系からの核調製物のカラ
ム分別を主に行った（Zawel and Reinberg (1995) ；Se
rizawa et al.(1994) ；Roeder,R.G.(1996) TIBS 21:32
7-335 ）。これらのフラクションは様々な量の転写能力
を有した半精製タンパク質を生じた。これらフラクショ
ンのほとんどは基礎転写に絶対必要であるようだった。
この点において、ＴＦIIＤフラクションはＴＡＴＡボッ
クス認識に関与することが知られていた。しかしなが
ら、ＴＡＴＡ結合能力を有した単一タンパク質を単離す
る試みは成功しなかった。酵母の単一成分が再構成基礎
転写アッセイでＴＦIIＤの代わりになって、２７ｋＤ
ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の単離およびクロー
ニングを行えることが示されたときに、進展が生じた
（Buratowski,S.et al.(1988) Nature 334:37-42；Cava
llini,B.et al.(1988) Proc.Nat.Acad.Sci.86:9803-980
9 ）。縮重プライマーの使用で、ヒト（Kao,C.C.et.al.
(1990) Science 248:1646-1649；Hoffmann,A.et al.(19
90) Nature 346:387-390；Petersonet.al.(1990) Scien
ce 248:1625-1630 ）、Drosophila（Hoey,T.et al.(199
0)Cell.61:1179-1186 ；Muhich,M.L.et al.(1990) Pro
c.Nat.Acad.Sci.87:9148-9152）およびマウスＴＦIIＤ
（Tamura,T.et al.(1991) Nuc.Acids Res.19:3861-386
5）のＴＢＰサブユニットについて遺伝子の同定を更に
行えた。

【０００５】異なる種からのＴＢＰについてｃＤＮＡの
入手は、細胞培養でこれらタンパク質の過剰発現を包含
する広範囲の研究を可能とした。そのアミノ末端に加え
られたＦＬＡＧ‐標識またはインフルエンザウイルス赤
血球凝集素（ＨＡ）エピトープ‐標識を有するＴＢＰタ
ンパク質を構成的に発現するＨｅＬａ細胞系が作られた
（Zhou,Q.et al.(1993) Genes & Development 7,180-18
7 ；Chiang et al.(1993) EMBO 12,2749-2762 ）。ＦＬ
ＡＧ‐標識は８アミノ酸の合成配列からなるエピトープ
である。ＨＡ‐標識はアミノ酸配列番号１「ＭＧＹＰＹ
ＤＶＰＤＹＡＶ」（１文字コード）の自然エピトープで
ある。

【０００６】自然ＨＡ標識からのもっと短いペプチド
（インフルエンザウイルス赤血球凝集素からの１０アミ
ノ酸）も、Drosophila細胞系でＴＢＰを含有する融合タ
ンパク質の発現に用いられた（Colgan and Manley (199
2) Genes Dev.6,304-331；Trivrdi et al.(1996) Mol.C
el.Biol.16,6909-6916）。

【０００７】２つのエピトープ、ＦＬＡＧ‐およびＨＡ
‐エピトープがアミノ末端に標識されたＴＢＰタンパク
質が細菌で発現されていた（Chiang et al.(1993) EMBO
12,2749-2762 ）。ＦＬＡＧ標識されたＴＢＰタンパク
質は、誘導性プロモーターのコントロール下でも発現さ
れた（Wu et al.(1996) BioTechniques 21:718-725）。
しかしながら、エピトープ／エピトープ類に対するモノ
クローナル抗体が核抽出物からＴＢＰ関連複合体を精製
し、ひいてはＴＦIIＤ複合体のＴＢＰ関連因子（ＴＡＦ
_IIS）を共精製するために用いられた（Zhou et al.(19
93) Genes Dev.7:180-187 ）。

【０００８】研究は多くの研究所でこれらのラインに沿
って続けられ、最近主流はＨｅＬａ核抽出物および酵母
から同定および特徴付けられた新たなＴＡＦおよびＴＡ
Ｆ相互作用因子に向けられている（Hori and Carey (19
94) Curr.Op.Gen.Dev.4:236-244 ；Zawel and Reinberg
(1995) Ann.Rev.Biochem.64,533-561；Roeder,R.G.(19
96) Trends Biochem.Sci.21:327-335 ）。

【０００９】ヒトからは、ＴＡＦ類のＴＡＦ_II６８、Ｔ
ＡＦ_II５５、ＴＡＦ_II３０、ＴＡＦ_II２８、ＴＡＦ_II２
０およびＴＡＦ_II１８が知られている（Mengus et al.
(1995) EMBO 14:1520-1531 ；Bertolotti et al.(1996)
EMBO 15:5022-5031 ；Wu etal.(1996) Biotechniques
21:718-725）。

【００１０】多くの因子がこれらの方法で見出された
が、研究では使用されている細胞系タイプまたは酵母株
に特有の転写複合体であるＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用
因子に限定されているということは過大に評価されては
ならない。

【００１１】

【発明の概要】本発明は、エピトープ標識されたＴＢＰ
が、全動物において、したがって様々な異なる真核生物
組織および細胞型からの、新規な転写複合体および転写
因子であるＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子のアフィニ
ティ精製に適用される、より「普遍的な系」に関するも
のである。

【００１２】本発明は、エピトープ標識されたＴＡＴＡ
ボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）を発現する能力を有
したトランスジェニック非ヒト動物に関する。別の面に
おいて、本発明は、好ましくは高次転写複合体の同定お
よび単離と、高次転写複合体で合体されたタンパク質
（ＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子、例えば転写因子）
の同定および単離における、トランスジェニック非ヒト
動物の用途に関する。もう一つの面において、本発明
は、好ましくは成長の特定段階で、非ヒトトランスジェ
ニック動物の生殖系および／または体細胞中にトランス
ジーンを導入することによる、非ヒトトランスジェニッ
ク動物の作製に関する。本発明は更にトランスジェニッ
ク非ヒト動物を作るために使用できるトランスジーンに
関する。

【００１３】

【発明の具体的説明】このように、本発明の一態様によ
ればエピトープ標識されたＴＢＰをコードするトランス
ジーンが提供される。好ましくは、そのトランスジーン
は１以上のエピトープ‐標識をコードする第一ＤＮＡ配
列と、ＴＢＰをコードする第二ＤＮＡ配列を含んでな
る。トランスジーンは、エピトープ‐標識をコードする
ＤＮＡ配列を更に含んでいてもよい。好ましくは、ＴＢ
ＰをコードするＤＮＡはｃＤＮＡである。ＴＢＰをコー
ドするＤＮＡは、いかなる自然ＤＮＡ、その誘導体また
は一部であってもよい。ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡ
は、例えば鳥類、両生類、爬虫類、酵母C.elegans 、哺
乳類などを含めた真核生物からでよい。例えば、げっ歯
類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタおよび霊長類ヒトまたは
それらの一部からのＴＢＰコードＤＮＡが使用できる。
ヒトＴＢＰ（ｈＴＢＰ）‐ｃＤＮＡの使用が好ましい。
本発明には、いかなる非自然発生ＤＮＡ、例えばＴＢＰ
‐ｃＤＮＡ誘導体の使用も含んでなる。ＤＮＡの誘導体
は、例えば、変異または修飾配列のような変更配列を有
しても、および／または修飾ヌクレオチドを含有してい
てもよい。ＤＮＡの誘導体は、塩、好ましくは生理上許
容しうる塩でもよい。

【００１４】トランスジーンは、１、２、３、４、５ま
たはそれ以上のエピトープ‐標識をコードする１以上の
ＤＮＡ配列を含んでなる。好ましくは、トランスジーン
は２つのエピトープ‐標識をコードしたＤＮＡを含んで
なる。個別のエピトープ‐標識をコードするＤＮＡは、
ＴＢＰをコードするＤＮＡの５′および／または３′末
端に、および／またはＴＢＰをコードするＤＮＡの配列
間のいずれか適切な部位に位置することができる。個別
のエピトープ‐標識をコードするＤＮＡは分離させるお
よび／またはタンデムに整列させるか、または各々直接
に隣接させることができる。

【００１５】エピトープ‐標識として、いかなる自然ま
たは合成ペプチドも使用できる。各エピトープ‐標識は
ＴＢＰとの融合タンパク質として発現され、エピトープ
標識は例えば直接ＴＢＰにまたはスペーサーペプチドに
より連結される。好ましくは、エピトープ‐標識は、Ｔ
ＢＰまたは融合タンパク質をアフニティ精製して、ＴＢ
Ｐまたは融合タンパク質と合体された、ＴＡＦおよびＴ
ＡＦ相互作用因子のようなタンパク質をアフニティ精製
する機会を付与するべきである。更に、エピトープ‐標
識は、ＴＢＰとの融合タンパク質として発現されたとき
に、ＴＢＰの機能活性を壊すべきでない。この目的のた
め、好ましくは短いペプチドがエピトープ‐標識として
用いられる。それらは約１〜５０またはそれ以上のアミ
ノ酸を含むことができ、特に５〜１５アミノ酸を含んで
なるペプチドが用いられる。エピトープ‐標識として使
用できるペプチドの非制限な例としては、ＦＬＡＧ‐エ
ピトープ、ＨＡ‐エピトープ、マルチヒスチジン残基
（６〜１０ヒスチジン残基またはそれ以上、好ましくは
６つのヒスチジン残基）（Ｈｉｓ標識）、Ｍｙｃ標識
（Stone et al.(1996) Nature 384:129-134 ）、ストレ
プトアビジン標識およびその他が挙げられる。自然ペプ
チドのより短いペプチドもこの目的のために使用でき
る。例えば、ＨＡ‐エピトープの使用には、エピトープ
「ＭＧＹＰＹＤＶＰＤＹＡ」（配列番号２）、「ＧＹＰ
ＹＤＶＰＤＹＡ」（配列番号３）、「ＹＰＹＤＶＰＤＹ
Ａ」（配列番号４）またはＨＡ‐エピトープから誘導さ
れる他のペプチドの使用も含有する。

【００１６】本発明の一態様において、トランスジーン
は、ヒトＴＢＰのｃＤＮＡと、エピトープ‐標識をコー
ドする２つのＤＮＡ配列とを含有する。好ましくは、第
一ＤＮＡ配列はＨＡ‐エピトープをコードしており、例
えば市販モノクローナル抗体との免疫反応用のエピトー
プとして働きうる（Kolodziej and Young (1991) Meth.
Enzym.194:508-519 ）。ＨＡ標識をコードする配列のち
ょうど３′側には、６ヒスチジン残基（Ｈｉｓ標識）の
ストレッチをコードするＤＮＡ配列が位置して、そのＨ
ｉｓ標識はＮｉ^２＋イオンとの非共有結合可逆的複合体
を形成させることができる。例えば、市販Ｎｉ^２＋アガ
ロースアフィニティカラム物質はＨｉｓ標識タンパク質
を精製するためにルーチンで用いられる（Hochuli,E.et
al.(1987) J.Chromatography 411:177-184 ；Janknech
t,R.et al.(1991) Proc.Nat.Acad.Sci.74:4835）。本発
明の具体的態様において、トランスジーンは配列番号１
３のＤＮＡ配列を含んでなる。配列番号１３は、二重標
識ｈＴＢＰからなる融合タンパク質をコードするトラン
スジーンを提供する。

【００１７】好ましい態様において、本発明は、エピト
ープ‐標識されたＴＢＰをコードして、融合タンパク質
発現用のプロモーターを含んでなるトランスジーンを提
供する。そのトランスジーンは、ＴＢＰをコードするＤ
ＮＡ（例えば、ＴＢＰのｃＤＮＡまたはその誘導体）
と、エピトープ‐標識をコードするＤＮＡ配列に加え
て、１以上の遺伝子調節配列を含むことができる。この
ような遺伝子調節配列は、例えば自然または合成プロモ
ーターまたはその一部および／またはシス作用要素（例
えば、エンハンサー、サイレンサー）である。この目的
のため、哺乳類プロモーター、例えばマウストランスフ
ェリン遺伝子のプロモーター、ニューロン特異性エノラ
ーゼ（ＮＳＥ）遺伝子のプロモーター（Forss-Petter,
S.et al.(1990) Neuron 5:187-197）またはチミジンキ
ナーゼ遺伝子のプロモーターが使用できる。例えばサイ
トメガロウイルス遺伝子またはＳＶ４０初期遺伝子のプ
ロモーターのようなウイルスプロモーターも使用でき
る。好ましくは、誘導性または構成性プロモーターまた
はその誘導体が用いられる。構成性プロモーターとし
て、例えばヒト延長因子‐１α遺伝子（ＥＦ）のプロモ
ーター（Uetsuki,T.et al.(1989) J.Biol.Chem.264:579
1-5798）が使用できる。誘導性プロモーターとしては、
例えば重金属と反応するいくつかのシス要素を有したメ
タロチオニンプロモーター（ＭＴ）（Palmiter,R.D.et
al.(1987) Experimentia Supplementus 52:63-80,Birkh
auser Verlag）が使用できる。加えて、例えば細胞周期
特異的、細胞型特異的または成長特異的に発現される遺
伝子のプロモーターがこの目的のために使用できる。

【００１８】本発明の具体的態様において、トランスジ
ーンはｈＴＢＰのｃＤＮＡ、ＨＡエピトープ（例えば、
自然ＨＡエピトープの９アミノ酸）およびＨｉｓエピト
ープ（例えば、６×ｈｉｓ標識）をコードするＤＮＡ配
列、および構成性プロモーターを含んでいる。例えば、
ＴＢＰ発現はヒト延長因子‐１α（ＥＦ）のプロモータ
ーによりコントロールされる（Uetsuki,T.et al.(1989)
J.Biol.Chem.264:5791-5798）。ＥＦ‐プロモーターと
は、マウスにおいて穏やかだが一定のレベルでトランス
ジーンを発現させるために用いられてきた、ＴＡＴＡ欠
失プロモーターである（Hanaoka,K.et al.(1991) Diffe
rentiation,183-189）。本発明の具体的態様において、
トランスジーンは、二重標識（ＨＡおよびＨｉｓエピト
ープ）ｈＴＢＰをコードするＤＮＡ配列と、ＥＦ‐プロ
モーターの配列とを含んでなり、特にトランスジーンは
配列番号１４のＤＮＡ配列を有してなる。

【００１９】本発明のもう１つの具体的態様において、
トランスジーンはＴＢＰをコードするＤＮＡ、好ましく
はｈＴＢＰのｃＤＮＡ、ＨＡ（例えば、自然ＨＡエピト
ープの９アミノ酸）およびＨｉｓエピトープ（例えば、
６×ｈｉｓ）をコードするＤＮＡ配列、および誘導性プ
ロモーターとを含んでいる。好ましくは、誘導性プロモ
ーターはメタロチオニンプロモーター（ＭＴ）である。
例えば、動物ゲノム中への追加ＴＢＰコード配列の導入
とその後のＴＢＰまたはＴＢＰ融合タンパク質の発現と
が各々有毒である場合に、本発明のこの態様ではＴＢＰ
融合タンパク質をコードするトランスジーンを動物に甘
受させておいて、プロモーターが導入されるまで沈黙さ
せておく。そのプロモーターは例えば動物が十分にまた
は興味あるいずれかの成長段階に発育したときに誘導す
ることができ、例えばＭＴプロモーターの場合にはＺｎ
^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋またはＣｄ^２＋のような二価
カチオンを含有した腹膜間注射により誘導する。他のモ
デルで示されたように、ＭＴ指示遺伝子は高レベルで発
現するであろう（Palmiter,R.D.et al.(1982) Cell29:7
01-710 ）。本発明の具体的態様において、トランスジ
ーンは、二重標識ｈＴＢＰ（ＨＡおよびＨｉｓエピトー
プ）をコードするＤＮＡ配列と、ＭＴ‐プロモーターと
を含んでなり、特にトランスジーンは配列番号１５のＤ
ＮＡ配列を有している。

【００２０】本発明は、更に１以上のエピトープ‐標識
をコードするＤＮＡ配列を、ＴＢＰタンパク質をコード
するＤＮＡ配列に連結させることによる、トランスジー
ンの作製方法に関する。

【００２１】本発明は更にトランスジーンの用途に関す
る。例えば、トランスジーンは組換えベクターの作製に
用いることができる。本発明は、組換えベクターの作製
方法にも関する。この方法は、適切なベクター、例えば
調節配列を含有するベクター中へのトランスジーンの組
込みからなる。ベクターの例は、発現ベクターおよびレ
トロウイルスまたはそれらの誘導体である。

【００２２】本発明は、更にトランスジーンを含んだ組
換えベクターの用途に関する。特に、本発明は（例え
ば、ＴＢＰまたはその誘導体、特にｈＴＢＰのｃＤＮＡ
と、エピトープ‐標識をコードするＤＮＡ配列、例えば
ＨＡおよびＨｉｓエピトープコードＤＮＡ配列を含有す
る）トランスジーンを含んだ組換えベクターの用途に関
する。本発明は、真核細胞中にトランスジーンを導入す
るための、特に哺乳類細胞中への導入のための、ベクタ
ーの用途に関する。本発明は更に、細菌または真核細胞
中でトランスジェニックＤＮＡの増幅のためにこのよう
なトランスジーンを含んでなるベクターの用途に関す
る。トランスジーンを含有するベクターが導入された真
核細胞は、トランスジーンの異種／トランスジェニック
発現に用いることもできる。真核細胞（宿主細胞）はト
ランスジェニック動物の一部でもよい。

【００２３】本発明の主要態様において、トランスジー
ンはトランスジェニック非ヒト動物の作製に用いられ
る。そのためには、トランスジーンまたはトランスジー
ンを含んでなる組換えベクターが宿主細胞および／また
は動物中に導入される。もう１つの面において、本発明
は動物またはその細胞中にトランスジーンを導入するこ
とにより作製されたトランスジェニック非ヒト動物に関
する。本発明によるトランスジェニック動物は、ＴＢ
Ｐ、あるいはエピトープ‐標識されたＴＢＰを含んでな
るまたはからなる融合タンパク質を発現または過剰発現
しうる能力を有している。

【００２４】トランスジェニック動物の作製の場合に
は、非ヒト動物が宿主動物として用いられる。このよう
な非ヒト動物には、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、
ヤギ、イヌ、ウシ、ブタ、鳥類、両生類、爬虫類などの
ような脊椎動物がある。好ましい動物は、動物の非ヒト
哺乳類種、好ましくはラットおよびマウスを包含するげ
っ歯類からの動物、最も好ましくはマウスから選択され
る。

【００２５】本発明によるトランスジェニック非ヒト動
物には、ＴＢＰまたはその誘導体、例えばＴＢＰおよび
エピトープ‐標識からなるまたはそれらを含んでなる融
合タンパク質の発現を指示するかまたはそれをコードす
るトランスジーンの１以上のコピーがゲノム中に導入さ
れている、あらゆる動物を含んでなる。トランスジェニ
ック動物はエピトープ標識されたＴＢＰタンパク質を発
現しうる能力を有しているはずである。本発明の具体的
態様において、トランスジェニック動物は内在ＴＢＰ遺
伝子のトランスジェニック遮断または改変を有すること
がある（ノックアウト動物）。

【００２６】本発明によるトランスジェニック動物は、
非自然的手段により（即ち、人為的操作により）、動物
で自然には存在しない１以上のＴＢＰ遺伝子（本発明に
よるトランスジーン）、例えば遺伝子工学処理された内
在または外来ＴＢＰ遺伝子のような外来ＴＢＰ遺伝子ま
たはその誘導体が導入された動物である。非自然発生Ｔ
ＢＰ遺伝子はトランスジーンと称される。トランスジー
ンは動物として同種でもまたは異なる種に由来してもよ
いが、いずれの場合にもトランスジーンはトランスジー
ンによる付与される配置および／または染色体座で動物
には自然でみられない。

【００２７】トランスジーン（トランスジェニックＤＮ
Ａ）は、ＴＢＰをコードする外来遺伝子、即ち宿主動物
のゲノムに通常みられない配列、例えば異なる動物種か
ら得られるＴＢＰ遺伝子またはｃＤＮＡを含んでいても
よい。一方または加えて、トランスジーンはＴＢＰをコ
ードする内在遺伝子、例えばＴＢＰ遺伝子の発現の正常
in vivo パターンを変化させるか、あるいは内在ＴＢＰ
の生物活性を変化または消失させるようにin vitroで再
配列または変異されたという点で異常であるＤＮＡ配列
を含んでいてもよい。本発明は、トランスジーンを含ん
で、トランスジェニック動物を作製するために使用でき
る、発現ベクターにも関する。

【００２８】本発明は、更に本発明によるトランスジェ
ニック動物の作製方法に関する。本発明によるトランス
ジェニック動物は、非ヒト動物の各々生殖系または生殖
系細胞系中におよび／または体細胞中に、トランスジー
ンおよび／またはベクター、例えばトランスジーンを含
んでなる発現ベクターを導入することにより作製でき
る。例えば、様々な成長段階にある胚標的細胞が本発明
のトランスジーンを導入するために使用できる。異なる
方法が胚標的細胞の成長の段階に応じて適用できる。

【００２９】一部の諸例としては、以下のものがある。１．接合体のマイクロインジェクションが、本発明を実
施する過程で動物ゲノム中にトランスジーンを導入する
ために好ましい方法である。マイクロインジェクション
では単細胞段階で胚の単離を要する。したがって、接合
体、即ち前核融合またはその後で細胞分割をうけなかっ
た受精卵が、トランスジェニックＤＮＡ（トランスジー
ンのＤＮＡ）のマイクロインジェクション用に好ましい
標的細胞である。雄性ネズミ前核は直径約２０μｍのサ
イズに達して、その特徴によればトランスジェニックＤ
ＮＡを含有する溶液１〜２ｐｌの再現性注入を行える。
トランスジーンの導入における接合体の使用は、ほとん
どの場合において、注入されたトランスジェニックＤＮ
Ａが第一細胞分割前に宿主動物ゲノム中に取り込まれ
る、という利点を有している（Brinster,et al.(1985)
Proc.Natl.Acad.Sci.82:4438-4442 ）。結果として、得
られたトランスジェニック動物（創始動物）の全細胞
は、トランスジェニック対立遺伝子と称される特定の遺
伝子座に組込みトランスジーンを安定的に保有してい
る。トランスジェニック対立遺伝子はメンデル遺伝を証
明する：トランスジェニック動物と非トランスジェニッ
ク動物との交雑から得られる子孫の半分は、ランダム分
類のメンデル法則に従いトランスジェニック対立遺伝子
を受け継ぐ。

【００３０】胚の取扱いとトランスジェニックＤＮＡの
マイクロインジェクションに常用される操作は、「Tran
sgenic Animal Technology - A Laboratory Handboo
k」,Carl A.Pinkert 編集,Academic Press,Inc.(1994)
で詳細に記載されている。

【００３１】２．ウイルス組込みも、本発明によるトラ
ンスジーンを動物に導入するために使用できる。発育中
の胚が、胚盤胞として知られる成長段階までin vitroで
培養される。このとき、割球はトランスジーンを含有す
るベクター（トランスジェニックＤＮＡ／ＤＮＡ構築
物）で感染させてもよく、例えば適切なウイルスまたは
レトロウイルスベクターがこの目的のために使用できる
（Jaenich,R.(1976) Proc.Natl.Sci.(USA) 73:1260-126
4 ）。割球の形質転換または感染は、透明帯の酵素的除
去により高めることができる（Hogan,et al.(1986) Man
ipulating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Pres
s,Cold Spring Harbor,N.Y. ）。トランスジーンがウイ
ルスベクターにより割球中に導入されるならば、このよ
うなベクターは典型的には複製欠陥であるが、それらは
宿主動物ゲノム中へのベクター配列に連結されたトラン
スジェニックＤＮＡ配列の組込みには適格である（Jahn
er,et al.(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 82:6927-6
931 ；Van der Putten,et al.(1985) Proc.Natl.Acad.S
ci.(USA) 82:6148-6152 ）。トランスフェクションは、
トランスジーン含有ベクターを作製する細胞の単層上で
割球の培養により容易かつ効率的に行える（Van der Pu
tten,et al.(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:6148-
6152 ；Stewart et al.(1987) EMBO 6:383-388 ）。

【００３２】一方、感染は胞胚腔のような後の段階で行
ってもよい（Jahner,D.et al.(1982) Nature 298:623-6
28）。いずれにしても、ほとんどのトランスジェニック
創始動物は、トランスジェニック創始動物を形成させる
すべての細胞のサブセット中のみへのレトロウイルスま
たはウイルス組込みにより作製できた。更に、マルチ
（レトロ）ウイルス組込み現象は単一創始動物で行い、
子孫の将来の世代で分離するマルチトランスジェニック
対立遺伝子を形成させてもよい。この方法による生殖系
細胞中へのトランスジーンの導入は可能であるが、おそ
らく低頻度で生じるだろう（Jahner,D.et al.(1982) Na
ture 298:623-628）。しかしながら、トランスジーンが
この方法により生殖系細胞中に導入されたら、トランス
ジェニック対立遺伝子がすべての動物細胞、即ち体およ
び生殖系細胞の双方に存在する子孫が作製されるだろ
う。

【００３３】３．胚幹（ＥＳ）細胞も、動物中への本発
明によるトランスジーンの導入に際して標的細胞として
働く。ＥＳ細胞はin vitroで培養できる移植前胚から得
られる（Evens,M.J.et al.(1981) Nature 292:154-156
；Bradley,M.O.et al.(1984)Nature 309:255-258 ；Go
ssler,et al.(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 83:906
5-9069；Robertson et al.(1986) Nature 322:455-448
；Robertson,E.J.,inTeratocarcinomas and Embryonic
Stem Cells: A Practical Approach,Robertson,E.J.,e
d.,IRL Press,Oxford (1987),pages 71-112 ）。市販さ
れているＥＳ細胞（例えば、Genome Systems,Inc.,St.L
ouis,MO 製）は、確立された方法により１以上のトラン
スジーンで形質転換することができる（Lovell-Badge,
R.H.,in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:
A Practical Approach,Robertson,E.J.,ed.,IRL Pres
s,Oxford (1987),pages 153-182 ）。形質転換されたＥ
Ｓ細胞は動物胚盤胞と組み合わせることができ、その後
でＥＳ細胞は胚をコロニー形成させて、（２種以上の動
物に由来する細胞から構成されている）キメラである、
得られる動物の生殖系に寄与する（Jaenisch.R.(1988)
Science 240:1468-1474 ；Bradley,A.,in Teratocarcin
omas and Embryonic Stem Cells: A PracticalApproac
h,Robertson,E.J.,ed.,IRL Press,Oxford (1987),pages
113-151）。同様に、トランスジーンがこの方法により
生殖系細胞中に導入されたならば、トランスジェニック
対立遺伝子がすべての動物細胞、即ち体および生殖系細
胞の双方に存在する子孫が作製されるだろう。

【００３４】しかしながら、トランスジーンの初期導入
は非メンデル現象である。ところが、本発明のトランス
ジーンは生殖系細胞中に安定的に組み込まれて、メンデ
ル座としてトランスジェニック動物の子孫に伝達され
る。生殖系組込みは、メンデル方式でそれらの子孫に遺
伝情報を伝達できるトランスジェニック動物の作製と、
永続的動物モデルとしてこれらのトランスジェニック動
物を利用するために必須である。

【００３５】他のトランスジェニック技術では、一部の
細胞がトランスジーンを保有して、他の細胞が有しな
い、モザイクトランスジェニック動物を生じてしまう。
生殖系細胞がトランスジーンを有しないモザイクトラン
スジェニック動物では、子孫へのトランスジーンの伝達
が生じない。それにもかかわらず、モザイクトランスジ
ェニック動物はトランスジーンに関連した表現型を証明
することができて、特定転写複合体、ＴＡＦおよびＴＡ
Ｆ相互作用因子のアフィニティ精製に用いられる。本発
明は、記載された本発明のトランスジーンを含有するモ
ザイクトランスジェニック動物に関する。

【００３６】本発明は更にトランスジーンで導入される
変異に関し、これは種特異的ＴＢＰをコードするＤＮＡ
配列が欠失されている、および／または、選択されたプ
ロモーター／エンハンサーのコントロール下で同種また
は異種の遺伝的変更ＴＢＰ配列（例えば、本発明による
トランスジーン）により置換されている、ヌル（「ノッ
クアウト」）対立遺伝子を含んでいる。

【００３７】本発明は、必要ならば構成または誘導性プ
ロモーターと関連させて、エピトープ標識ＴＢＰをコー
ドするＤＮＡを含んだトランスジーンが導入された、ト
ランスジェニック動物に関する。特に、本発明は、ＨＡ
およびＨｉｓエピトープ標識ｈＴＢＰをコードするＤＮ
ＡとＥＦプロモーターのＤＮＡ配列とを含んでなるトラ
ンスジーンが導入された、トランスジェニック動物に関
する。もう１つの具体的態様において、本発明は、ＨＡ
およびＨｉｓエピトープ標識ｈＴＢＰをコードするＤＮ
ＡとＭＴプロモーターのＤＮＡ配列とを含んでなるトラ
ンスジーンが導入された、トランスジェニック動物に関
する。本発明の具体的態様において、トランスジェニッ
ク動物は配列番号１３のトランスジーンを含有する。本
発明のもう１つのトランスジェニック動物は、配列番号
１４のトランスジーンを含有する。本発明のもう１つの
トランスジェニック動物は、配列番号１５のトランスジ
ーンを含有する。特に、本発明は、トランスジーン、例
えば配列番号１３、配列番号１４および／または配列番
号１５のＤＮＡ配列をそのゲノム中に安定的に組み込ん
だトランスジェニック動物に関する。

【００３８】トランスジーンを受け継いだ子孫は、トラ
ンスジーンの配列に相当するかまたはそれによりコード
されたユニークな配列を含んでなる生体分子の存在につ
いて子孫からの遺伝物質の分析により、トランスジーン
を受け継がなかった同腹子から区別することができる。
したがって、例えば、本発明によるトランスジーンで唯
一コードされたポリペプチド（例えば、エピトープ標識
されたＴＢＰ）を含有した生物学的液体が、トランスジ
ーンによりコードされたポリペプチド、例えばエピトー
プ標識ＴＢＰの存在についてイムノアッセイされる。ト
ランスジェニック子孫を同定する更に簡単で信頼しうる
手段は、動物の末端、例えば尾から組織サンプルを得
て、本発明のトランスジーンの部分またはユニーク部分
のＤＮＡ配列に相当する核酸配列の存在についてサンプ
ルを分析することからなる。このような核酸配列の存在
は、例えばトランスジーンのユニーク部分に相当するＤ
ＮＡ配列とのハイブリッド形成（「サザン」、「ノーザ
ン」）分析、トランスジーンのＤＮＡ配列に由来する基
質およびオリゴヌクレオチドとしてサンプル中のＤＮＡ
配列を用いたＰＣＲ反応の産物の分析により調べられ
る。

【００３９】したがって、本発明は、生じうる第一世代
トランスジェニック動物（Ｇｏ）とすべてのその後の世
代のトランスジェニック動物（Ｇ_１、Ｇ_２、Ｇ_３、Ｇ_４
…）またはトランスジェニック動物系の動物が、例えば
標準ＰＣＲ反応で、トランスジーンの存在について調べ
られる、試験にも関する。この目的のために、ゲノムＤ
ＮＡは Proteinase ＫおよびＲＮＡｓｅ処理後に動物組
織から、例えば尾組織から抽出できる。このようなＰＣ
Ｒ反応の場合、プライマーの配列は、例えばプロモータ
ー領域、エピトープ‐標識をコードするＤＮＡ領域およ
び／または特定ＴＢＰ構築物に特有なＤＮＡ領域内にあ
る、トランスジーンの配列の一部に対応させるべきであ
る。マウスのこのようなＰＣＲ反応で、例えば注入卵の
約２５％において、対応ＰＣＲ産物が検出でき、即ちマ
ウスの約２５％が陽性子孫を生じる。

【００４０】動物がトランスジーンを有するかどうかを
確かめるもう１つの方法は、生じうるトランスジェニッ
ク動物／トランスジェニック動物系におけるトランスジ
ェニックｍＲＮＡの存在についての試験に関する。初期
試験は、例えば、低レベルのｍＲＮＡにも非常に敏感な
Ｓ１分析で行える（Berk,A.J.and Sharp,P.A.(1977),Ce
ll 12,721 ）。この目的のため、標識されたアンチセン
スオリゴヌクレオチドが、動物の組織から単離された全
ＲＮＡとハイブリッド形成される。その後Ｓ１ヌクレア
ーゼによる処理で、すべての一本鎖核酸、ＤＮＡおよび
ＲＮＡを切断させる。二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ‐ＲＮ
Ａハイブリッドはそのままに残される。トランスジーン
ｍＲＮＡが存在しているならば、それはアンチセンスオ
リゴヌクレオチドとハイブリッド形成して、Ｓ１ヌクレ
アーゼ切断からそれを「保護する」。

【００４１】本発明では、トランスジェニックｍＲＮＡ
の存在がＳ１保護アッセイにより組織調製物で、例えば
全肝臓ｍＲＮＡの調製物で検出される。トランスジェニ
ックｍＲＮＡ（例えば、エピトープ標識ＴＢＰのＤＮＡ
配列に対応するｍＲＮＡ）の一部と相補的なアンチセン
スオリゴヌクレオチドが合成できる。オリゴヌクレオチ
ドは、例えば^３２Ｓ、^３３Ｐ、^３５Ｐ、^３Ｈまたは^１４
Ｃにより放射能で、あるいは蛍光マーカーまたは他タイ
プのマーカー、例えばビオチンまたはジゴキシゲニンで
標識、例えば５′末端標識される。標識されたオリゴヌ
クレオチドは、標準プロトコール（Sambrook et al.,19
89）に従い選択ハイブリッド形成条件下でトランスジェ
ニックマウスからのｍＲＮＡと混合される。次いで、混
合物はＳ１ヌクレアーゼで処理される。非適合配列の短
い領域は、例えばそのオリゴヌクレオチドの３′末端で
常に切断されるはずであり、Ｓ１ヌクレアーゼが実際に
すべての利用しうる一本鎖核酸を切断したことを示せる
内部コントロールを提供する。トランスジェニックｍＲ
ＮＡの存在下で、標識されたオリゴヌクレオチドは切断
から保護されるはずであり、その存在およびサイズは例
えば配列決定スタイル変性ゲル（例えば、８Ｍ尿素ＰＡ
ＧＥ）電気泳動により容易に決定することができる。そ
のときに、未切断の標識オリゴヌクレオチドの存在は、
例えばゲルをフィルムに露出することにより検出でき
る。トランスジェニックｍＲＮＡの不在は、未保護オリ
ゴヌクレオチドがＳ１ヌクレアーゼにより切断されるこ
とからまったく、バンドを与えることはない。本発明に
は、異なる細胞型に関する異なる組織および細胞が動物
から作製され、トランスジェニックｍＲＮＡの存在につ
いて試験されることも包含する。

【００４２】本発明のもう１つの態様は、ノーザン分析
でトランスジェニック動物を試験することに関する。最
も好ましくは、ＰＣＲまたはＳ１ヌクレアーゼマッピン
グによりトランスジェニックｍＲＮＡについて陽性であ
るとわかったトランスジェニック動物は、ノーザン分析
で更に試験された（McMaster,G.K.and Carmichael (197
7) Proc.Nat.Acad.Sci.74:4835）。この目的のため、異
なる組織および／または細胞型からの全ＲＮＡが、例え
ばアガロースゲル上において変性条件下で、単離および
サイズ分離される。次いでＲＮＡが、例えばキャピラリ
ートランスファーおよびＵＶ架橋を用いて、例えば膜ま
たはフィルター上に結合される。結合されたＲＮＡは、
トランスジーンまたはその一部のコード領域に対応する
標識プローブ、例えば配列番号１３によるトランスジー
ンの５′末端に対応するＤＮＡプローブで、慣用的ノー
ザンブロット条件を用いてプロービングできる。このよ
うなＤＮＡ‐プローブは、好ましくは約２０〜１０００
塩基対（ｂｐ）の鎖長を有している。最も好ましくは、
それらは約１００、２００、３００、４００および５０
０ｂｐの鎖長を有している。必要であれば、過剰の標識
プローブが洗い落とされて、膜がフィルムに露出され
る。プローブはオリゴヌクレオチドについて上記された
ように標識することができる。オリゴヌクレオチドも、
ときにはそれらのノーザンブロット実験に用いてよい。

【００４３】トランスジェニック動物、好ましくはいず
れか他の分子生物学試験で陽性であったこのようなトラ
ンスジェニック動物は、特異的免疫反応で、例えばウエ
スタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡで、トランスジ
ェニックＴＢＰタンパク質の存在について試験されてい
る。そのときに、動物の組織または特定細胞からの、好
ましくは肝臓組織またはいずれか他の軟組織から、核が
例えば超遠心スクロース勾配で標準操作により単離され
る。このような核から、全核タンパク質が、例えば高塩
条件（例えば、４００ｍＭＫＣｌ）および非イオン界
面活性剤（例えば、ＮＰ‐４０）で核を処理することに
より集められる。その後、核タンパク質は、例えば適切
な変性ゲル電気泳動、好ましくはＳＤＳ‐ＰＡＧＥによ
りサイズ分離できる。このようなゲルは、固体表面、例
えば膜またはフィルター、好ましくはニトロセルロース
膜上にトランスファー、例えばエレクトロトランスファ
ーされる。次いで膜またはフィルターは標準プロトコー
ルに従い適切な抗体で前ブロックおよびプロービングさ
れる（Sambrook et al."Molecular Cloning" Second Ed
ition (1989),Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s）。

【００４４】このような目的のため、ポリクローナルお
よび／またはモノクローナル抗体が適用でき、例えばマ
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウマ、鳥類など
で生産される。検出は、酵素またはマーカー、例えばア
ルカリホスファターゼ、蛍光マーカー、ビオチン、ジゴ
キシゲニンまたは放射線標識とカップリングされた、Ｔ
ＢＰ融合タンパク質を認識する抗体で直接行える。検出
は、一次抗体の保存領域を認識する第二抗体を用いて間
接的に行うこともでき、例えば第一抗体がマウスで生産
されたとき、第二抗体は例えばヒツジで生産された抗マ
ウス抗体でなければならない。このような第二抗体も、
検出用に酵素または他のマーカーにカップリングさせる
ことができる。

【００４５】本発明は、更にトランスジーンによりコー
ドされたエピトープ標識ＴＢＰと結合する抗体の生産の
ための、トランスジーンまたはその一部、あるいはコー
ドされた融合タンパク質またはその一部の用途、例えば
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の作製に関す
る。

【００４６】本発明による抗体は、ＴＢＰ融合タンパク
質の１以上のエピトープを認識する抗体である。このよ
うな抗体はＴＢＰに属する個別エピトープに対する、お
よび／またはエピトープ‐標識に対して向けられたもの
である。本発明の１態様は、ＴＢＰ融合タンパク質のア
ミノ末端領域を認識する抗体に関する。本発明のもう１
つの態様は、ＴＢＰ融合タンパク質のカルボキシ末端領
域を認識する抗体に関する。本発明のもう１つの態様
は、ＴＢＰおよびエピトープ‐標識および／または２つ
のエピトープ‐標識が一緒に連結されたアミノ酸配列の
部分に近いエピトープを認識する抗体に関する。

【００４７】本発明の１態様は、ｈＴＢＰおよび２つの
エピトープ‐標識からなる融合タンパク質のエピトープ
を認識する抗体に関する。特に、その抗体はＨｉｓ‐お
よびＨＡ‐標識とｈＴＢＰからなる融合タンパク質のエ
ピトープを認識する。最も好ましくは、抗体はＨＡ‐お
よびＨｉｓ‐標識ＴＢＰのアミノ末端でエピトープを認
識する。本発明の具体的態様は、配列番号１６のアミノ
酸配列、配列番号１６のアミノ酸配列を有する正しく折
りたたまれた融合タンパク質のエピトープ、またはそれ
らの一部を認識する抗体に関する。本発明は、好ましく
はＴＢＰ融合タンパク質に関連した、配列番号１７のア
ミノ酸配列またはその正しく折りたたまれたエピトープ
を認識する抗体（抗ＴＢＰ抗体）に関する。

【００４８】本発明の抗体は、ポリクローナルでも、ま
たはモノクローナルでもよい。抗体は、非ヒト動物のす
べての種で、好ましくはマウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、ヤギ、ウマ、鳥類（例えば、それらの卵）から生産
できる。このような抗体は標準プロトコールに従い生産
できる（Hurlow and Lane "Antibodies: A Laboratory
Manual" (1988),Cold Spring Harbor Press ）。抗体
は、必要であれば、オリジナル免疫ペプチド（エピトー
プ）を用いてアフィニティ精製できる。本発明の具体的
態様は、（例えば、適切なキャリアタンパク質にカップ
リングされた）配列番号１７の配列を有するペプチドに
よるウサギの免疫で発生される、ウサギで生産されたポ
リクローナル抗体に関する。ポリクローナル抗体（抗Ｔ
ＢＰ抗体）はｈＴＢＰ融合タンパク質（ＨＡ‐およびＨ
ｉｓ‐標識）を認識する。

【００４９】本発明による抗体は、ウエスタンブロット
分析と、ＴＢＰ融合タンパク質およびＴＢＰ融合タンパ
ク質と合体された高次転写複合体のアフィニティ精製に
適用できる。高次複合体は、ＴＢＰ融合タンパク質と合
体されたＴＡＦ、およびＴＡＦ相互作用因子を含んでな
る。

【００５０】本発明はトランスジェニック動物の用途に
関する。本発明によるトランスジェニック動物は、トラ
ンスジェニック動物の組織および／またはトランスジェ
ニック動物の培養細胞からの高次転写複合体、ＴＡＦお
よびＴＡＦ相互作用因子のアフィニティ共精製に用いる
ことができる。このような高次転写複合体は、様々な異
なる組織および／または細胞型から単離および精製でき
る。好ましくは、このような組織／細胞型から、最も好
ましくはホモゲナイズされた細胞から、標準プロトコー
ルに従い核調製が行われる（Dignam et al.(1983) Nuc.
Acids Res.11:1575 ；Lichtenstein et al.(1987) Cell
51:963-973 ；Gorsky et al.(1986) Cell 47:767-776
）。必要であれば、核タンパク質は標準方法で蓄積す
ることができる。したがって、本発明は、トランスジェ
ニック動物からの高次転写複合体、ＴＡＦおよびＴＡＦ
相互作用因子のアフィニティ共精製法にも関する。

【００５１】例えば、本発明は、エピトープ特異性抗体
または荷電（正または負荷電）物質を用いることによ
る、高次転写複合体、ＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子
のアフィニティ精製に関する。例えば、既に詳細に記載
された抗体がこの目的に使用できる。ＨＡおよびＨｉｓ
エピトープ標識されたＴＢＰ、好ましくはｈＴＢＰを含
んでなる高次転写複合体について最も好ましい共精製方
法の１つには、Ｎｉ^２＋および／または抗ＨＡ抗体（例
えば、市販抗体）および／または配列番号１７によるエ
ピトープを認識する抗体を用いたアフィニティ精製が挙
げられる。このような抗体またはＮｉ^２＋は、アフィニ
ティ精製が例えばＮｉ^２＋カラム、または特異的抗体、
例えば抗ＨＡ抗体もしくは抗ＴＢＰ抗体のカラムを用い
ることにより行われるように、適切なカラム物質にカッ
プリングされる。

【００５２】もう１つの態様において、本発明はＴＢＰ
融合タンパク質、エピトープ標識されたＴＢＰに関す
る。好ましくは、ＴＢＰ融合タンパク質はトランスジェ
ニック動物で発現される。特に、本発明はｈＴＢＰ融合
タンパク質に関する。ＴＢＰ融合タンパク質はトランス
ジェニック動物から単離および精製できる。本発明の一
態様はＨＡおよびＨｉｓ標識されたＴＢＰタンパク質、
特にＨＡおよびＨｉｓ標識されたｈＴＢＰタンパク質で
ある。本発明の他の態様は、アミノ酸配列番号１６を有
するタンパク質に関する。本発明のもう１つの態様にお
いて、ＴＢＰ融合タンパク質はプロテイナーゼ／ペプチ
ダーゼによる１以上の開裂部位、例えばトロンビン開裂
部位を含んでいる。好ましくは、融合タンパク質のアミ
ノ酸配列内にある開裂部位は、エピトープ‐標識とＴＢ
Ｐタンパク質との間に位置する。

【００５３】本発明は、本発明によるトランスジーンが
好ましくはトランスジェニック動物の一部である適切な
宿主細胞で発現される、ＴＢＰ融合タンパク質の作製法
に関する。

【００５４】トランスジェニックｍＲＮＡおよび／また
はトランスジーンによりコードされたＴＢＰ融合タンパ
ク質および／またはＴＢＰ融合タンパク質と合体された
高次転写複合体は、トランスジェニック動物でみられる
異なる型の組織および／または細胞型、例えば脳、心
臓、腎臓、肝臓、肺臓、神経系、筋肉、腺、骨髄、免疫
系に属する細胞、皮膚などから単離することができる。

【００５５】本発明は、特にトランスジェニック動物か
らの高次転写複合体の単離のための、ＴＢＰ融合タンパ
ク質の用途と、異なる種、異なる組織および／または異
なる細胞型から得られる単離された高次転写複合体の特
徴付けに関する。したがって、本発明によるＴＢＰ融合
タンパク質およびトランスジェニック動物は、異なる高
次複合体で合体されたＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子
のような個別タンパク質の単離および特徴付けに使用で
きる。例えば、特定の高次転写複合体で合体されたタン
パク質は、個別のＴＡＦおよびＴＡＦ関連因子が同定し
うるように解離および分離させることができる。ＴＡＦ
およびＴＡＦ相互作用因子の組成は、組織型および／ま
たは細胞型および／または成長段階および／または発現
されるトランスジーンに応じて、異なる高次複合体で少
くともある程度異なっている。

【００５６】ＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子、特に既
に特徴付けられて、抗体が既に存在している組織特異性
因子は、転写複合体との合体度について迅速に確認およ
び評価することができる。この例は、Ｂ細胞限定活性化
に関与する組織特異性コアクチベーターであると思われ
ているＢｏｂ‐ｌ／ＯＣＡ‐Ｂ因子である（Gstaiger,M
et al.(1996) EMBO 15:2781-2790 ）。固有のＤＮＡ結
合能およびほぼ偏在性のＯｃｔ因子の要求はないが、こ
の因子の組織限定的出現はタンパク質‐タンパク質メカ
ニズムによりＢ細胞特異性転写活性化を付与する。

【００５７】更に、新規ＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因
子、特に組織および／または細胞型特異性および／また
は成長（段階）特異性および／または細胞周期特異性Ｔ
ＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子は、高次転写複合体で同
定することができる。上記のように、多くのエンハンサ
ー結合組織特異性因子が影響、ひいては遺伝子の転写活
性で組織特異性を発揮しうることを強く示唆するデータ
が豊富にある。したがって、遺伝子の特異的発現を調節
する「ユニークな」、組織特異性、細胞型特異性、細胞
周期特異性、成長段階特異性因子が同定されるかもしれ
ない。

【００５８】「普遍的」トランスジェニック系は、この
ようなＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子（例えば、コア
クチベーター）が組織および細胞型の範囲でＴＢＰおよ
び／またはＴＡＦおよび転写複合体と合体されている程
度を調べる上で、強力な手段を更に提供する。

【００５９】本発明は、高次転写複合体が合体されたエ
ピトープ標識ＴＢＰがトランスジェニック動物から単離
される、異なる高次転写複合体の同定および特徴付け方
法にも関する。異なる高次転写複合体の組成を特徴付け
る方法は、例えば、ａ）非ヒト動物への本発明によるト
ランスジーンの導入、ｂ）場合により動物の異なる成長
段階で、異なる動物組織および／または動物の異なる細
胞型からエピトープ標識ＴＢＰの単離、およびｃ）高次
転写複合体の組成の決定、を含んでなる。

【００６０】トランスジェニック非ヒト動物から高次転
写複合体を単離する１つの方法は、ＴＢＰに標識された
エピトープの少くとも１つを用いることによるアフィニ
ティ精製を含んでなる。好ましくは、高次転写複合体と
この複合体で合体されたＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因
子は、エピトープ標識ＴＢＰが単離されるときに共精製
される。例えば、エピトープが特異的に結合する物質へ
のエピトープの一つ、好ましくはエピトープ‐標識の結
合の一つによりエピトープ標識ＴＢＰが精製されるとき
に、高次転写複合体が単離できる。この物質には、例え
ばＮｉ^２＋カラム（それにＨｉｓ‐エピトープが結合す
る）または抗体、例えば抗ＨＡ抗体（ＨＡエピトープと
結合する）、あるいは配列番号１７またはその一部の配
列を有するエピトープ標識ＴＢＰのエピトープ（例え
ば、配列番号１７のエピトープ）と結合する抗体があ
る。

【００６１】本発明は、新規および／または特異的ＴＡ
Ｆおよび／またはＴＡＦ相互作用因子を同定する方法に
も関する。好ましくは、高次転写複合体は本発明による
トランスジェニック動物から単離される。このような方
法は、例えば、ａ）非ヒト動物への本発明によるトラン
スジーンの導入、ｂ）場合により動物の特定成長段階
で、特定動物組織および／または動物の特定細胞型から
エピトープ標識ＴＢＰの単離、ｃ）高次転写複合体でエ
ピトープ標識ＴＢＰと合体されたＴＡＦおよび／または
ＴＡＦ相互作用因子の解離および分離、およびｄ）必要
ならば、ＴＡＦおよび／またはＴＡＦ相互作用因子のア
ミノ酸配列の決定、を含んでなる。

【００６２】既知メカニズムの確認に加えて、トランス
ジェニックモデルは新規ＴＡＦまたはＴＡＦ関連因子を
発見して特徴付ける上で現行細胞培養系よりも利点を有
している。上記のように、現在までアフィニティ共精製
されたＴＡＦタンパク質は、ＨｅＬａおよび酵母の研究
に由来している。他生物のＴＡＦｃＤＮＡもみつけら
れたが、時間のかかる相互作用ライブラリースクリーニ
ング方法を要した。トランスジェニックモデルの「全体
生物」面は、転写の真のin vivo プロセスに非常に「近
付ける」ことにより、この普遍的トランスジェニック系
を新規組織特異性活性化要素の認識に特に応じやすくさ
せる。

【００６３】このような標識ＴＢＰ発現トランスジェニ
ック動物、例えばマウスが薬物開発分野に寄与しうるこ
とは明らかである。顕著な薬学的関心が、特にそれが疾
患関連遺伝子であれば、所定遺伝子転写複合体のいずれ
か「ユニークな」組織特異性、細胞型特異性、細胞周期
特異性、成長段階特異性因子（ＴＡＦ、ＴＡＦ相互作用
因子）に向けられる。１つまたはいくつかの疾患関連遺
伝子の転写コントロールに関与する「主要な」ＴＡＦお
よびＴＡＦ相互作用因子の同定および特徴付けが、この
ような遺伝疾患を軽減する治療化合物を開発する上で健
全な方法である。このようなＴＡＦまたはＴＡＦ相互作
用因子が特徴付けられてクローニングされたら、いくつ
かのスクリーニング操作がＴＡＦまたはＴＡＦ関連因子
と特異的に相互作用する分子種／物質を同定するために
行われる。薬学上有用な種／物質は、in vitroおよび／
またはin vivo でＴＡＦまたはＴＡＦ相互作用因子の自
然活性を増強または抑制して、関連遺伝子の治療処置を
可能にするものである。

【００６４】同定されたＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因
子は生化学および分子生物学で手段として適用してもよ
く、例えばトランスジェニック非ヒト動物からのこのよ
うなタンパク質は対応ヒトＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用
因子またはそれらのｃＤＮＡの単離用のプローブとして
用いてもよい。ヒトＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子
は、高度に特異的な新規薬物についてスクリーニングす
るために適用してもよい。

【００６５】本発明は下記の非制限例で更に詳細に記載
されている。例１：トランスジェニック動物の構築可能な動物源：トランスジェニック実験に適した動物
は、標準市販元、Charles River (Wilmington,MA) 、Ta
conic (Germantown,NY) およびThe Jackson Laboratory
(Bar Harbor,Maine) から得た。Ｂ６ＳＪＬ／Ｆ１マウ
スを胚再生およびトランスファーに用いた。雄性Ｂ６Ｓ
ＪＬ／Ｆ１は交配に使用でき、精管切除Swiss Webster
雄ウマは偽妊娠を刺激するために使用できる。

【００６６】トランスジェニックマウス：６週齢の雌性
マウスを、妊娠雌ウマ血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；
例えばSigma,Saint Louis,Missouri,USA）の５ＩＵ注入
（０．１ｃｃ腹腔内）、その４８時間後にヒト絨毛性ゴ
ナドトロピン（ｈＣＧ；例えば Sigma）の５ＩＵ注入
（０．１ｃｃ腹腔内）で、過排卵するように誘導する。
メスをｈＣＧ注入直後にオスと一緒にする。ｈＣＧから
２１時間後、交配したメスをＣＯ_２窒息または頸部脱臼
により屠殺し、胚を摘出卵管から回収し、Ｍ２倍地（例
えば Sigma）にいれる。周辺の丘細胞をヒアルロニダー
ゼ（１ mg/ml）で除去する。次いで前核胚を洗浄してＭ
１６培地（例えば Sigma）にいれ、その後注入時まで湿
気雰囲気下５％ＣＯ_２、Ｏ_２および９０％Ｎ_２で３７℃
インキュベーターにいれる。

【００６７】例２：トランスフェクションおよびマイク
ロインジェクション用構築物の作製マイクロインジェクション用のＤＮＡクローンを適切な
酵素ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩで開裂させた（ＤＮＡクロ
ーンは、ＭＴ‐ｈＴＢＰトランスジーン（表３の配列に
従い二重標識されている）とＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ
またはＥＦ‐ｈＴＢＰトランスジーン（表２の配列に従
い二重標識されている）とを含んでいる）、適切なサイ
ズのＤＮＡ断片をＴＢＥ緩衝液中１％アガロースゲル上
で電気泳動に付した（Sambrook et al.(1989) ）。ＤＮ
Ａバンドを臭化エチジウムで染色することにより視覚化
させ、切り出して、ｐＨ７．０で０．３Ｍ酢酸ナトリウ
ムを含有した透析バッグにいれる。ＤＮＡを透析バッグ
中に電気溶出させ、フェノール‐クロロホルム（１：
１）で抽出し、２倍容量のエタノールにより沈降させ
る。ＤＮＡをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス，ｐＨ７．４
および１ｍＭＥＤＴＡ）に再溶解し、ＤＥＡＥセファ
ロース（例えば、Pharmacia,Uppsala,Schweden）カラム
で精製する。カラムは最初に高塩緩衝液（１．５ＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭトリス，ｐＨ７．４および１ｍＭＥ
ＤＴＡ）０．５ｍｌで処理して、その後低塩緩衝液
（０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス，ｐＨ８．０
および１ｍＭＥＤＴＡ）３ｍｌで洗浄する。ＤＮＡ溶液
を塩で０．１５ＭＮａＣｌに調整し、その後カラムに
通して、ＤＮＡをカラムマトリックスに結合させる。低
塩緩衝液３ｍｌで３回洗浄後、ＤＮＡを高塩緩衝液４×
０．３ｍｌで分割して溶出させ、２倍容量のエタノール
により沈降させる。フラクションをＴＥ２００μｌに溶
解させてプールし、フェノール：クロロホルムで１回抽
出し、クロロホルムで２回抽出し、その後ＤＮＡをエタ
ノールで一夜沈降させた。ＤＮＡをマイクロインジェク
ション緩衝液ＴＥ（１０ｍＭトリス，ｐＨ７．４、０．
１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁し、ＤＮＡ濃縮液を２ng／
μｌに調整し、アガロースゲル上で電気泳動に付すこと
により既知ＤＮＡ標準に対して視覚化させた。

【００６８】マイクロインジェクション：ＤＥＡＥ精製
トランスジーンＤＮＡ（ＭＴ‐ｈＴＢＰまたはＥＦ‐ｈ
ＴＢＰ）をマイクロインジェクション緩衝液に２ng／μ
ｌで溶解させた。マイクロニードルおよびホールディン
グピペットをFlaming Brown マイクロピペットプラー、
例えばModel Ｐ８７（Sutter Inst.Co. ）で吸引した。
次いでホールディングピペットを離して、deFonbrune型
マイクロフォージ（microforge）（例えば、technical
Product Inst.Inc. ）上にファイヤーポイシュ（fire p
oish）した。ピペットをZeiss Axiovert１３５顕微鏡に
接続されたマイクロマニピュレーター（例えば、Leitz
）にのせた。空気充填注入ピペット（例えば、Medical
System Corp.）を先端からＤＮＡ溶液で満たした。胚
を４０〜５０のグループで顕微操作のためシリコーン油
の下でＭ２倍地２００μｌにいれた。胚をホールディン
グピペットで配向させて保持し、その後注入ピペットを
注入ピペットに最も近い前核中に挿入した。注入は前核
の膨潤によりモニターした。注入後、胚のグループをレ
シピエントメスへの移入までＭ１６倍地にいれた。

【００６９】例３：マイクロインジェクションによる胚
移入ランダムに循環する成熟雌性マウスを精管切除オスとペ
アにする。Swiss Webster または他の匹敵する系がこの
目的に使用できる。レシピエントメスをドナーメスと同
時に交配させる。胚移入時に、レシピエントメスを体重
ｇ当たり２．５％アベルチン０．０１５ｍｌの腹腔内注
入で麻酔する。卵管を単一中線背面切開により露出させ
る。次いで切開を直接に卵管で体壁から行う。その後卵
巣嚢を時計製造業者の鉗子で裂く。移入される胚をＭ１
６に置き、その後トランスファーピペットの先端に入れ
る（約１０〜１２個の胚）。ピペット先端を漏斗管中に
挿入して、胚を移入させる。移入後、切開部を２回の縫
合で閉じ、皮膚をステープルで留める。次いで加温トレ
ー上３時間で回復したレシピエントをデリバリーのため
コロニーに入れた。

【００７０】全部で４６９個の前核胚をＭＴ‐ｈＴＢＰ
の場合にマイクロインジェクトすると、１７０匹が生ま
れ、ＥＦ‐ｈＴＢＰの場合には全部で４０７個の前核胚
が７６匹を生じた。

【００７１】例４：創始マウスにおけるトランスジェニ
ックＤＮＡの検出４ａ）ＤＮＡ抽出生じうる創始マウスのゲノムＤＮＡを、２〜４週齢の子
孫から切り取られた尾組織の小片（約１ｃｍ）から抽出
した。尾セクションをシェーカー上５４℃の尾緩衝液
（尾緩衝液：１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、３０
μg/mlプロテイナーゼＫ）５００〜７５０μｌ中で一夜
インキュベートした。その後、各尾サンプルに等容量の
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２
５：２４：１）を加えた。サンプルを手でまたはVortex
ミキサーで自動的に低くセッティングして穏やかに振盪
した。サンプルは１０分間にわたり卓上遠心機ですべて
遠心した。水相を５ｍｌポリプロピレンチューブ（例え
ば、falcon tube ）に移した。等容量のエタノールをそ
のチューブにゆっくり加えて（滴下）、ＤＮＡを徐々に
沈降させた。第二容量のエタノールを強制的に加えて、
チューブの内容物を混合させた。次いでチューブを数回
反転させて、混合を確かにする。次いでゲノムＤＮＡを
平らなピペット先端（シークエンシング‐ゲルチップ）
に巻き取り、微量滴定皿の個別ウェルに移した。次いで
ＤＮＡを皿で４時間風乾させた。次いで１×ＴＥ（１×
ＴＥ：１０ｍＭトリスｐＨ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ）
２００μｌを各ウェルに加えた。次いでゲノムＤＮＡを
室温で１５〜３０分間かけて溶解させ、その後慎重にピ
ペットを上下させて穏やかに混合した。微量滴定プレー
トをしばしば−２０℃で貯蔵させてから、ＰＣＲ試験し
た。試験前に１０μｌを取り出し、ＥｃｏＲＩ（例え
ば、ゲノムＤＮＡ１０μｌ、１０×ＥｃｏＲＩ緩衝液２
μｌ、Ｈ_２Ｏ７μｌ、ＥｃｏＲＩ１μｌ；酵素およ
び緩衝液Boehringer-Mannheim,Mannheim,Germany製）で
切断した。

【００７２】４ｂ）ＰＣＲ反応：切断されたゲノムＤＮ
Ａを水で１：３希釈した。次いでサンプルを加熱ブロッ
ク上で１０分間かけて１００℃に加熱した。次いで２μ
ｌをＰＣＲ反応に用いた。反応は、２μｌのゲノムＤＮ
Ａ、１×反応緩衝液、１．５ｍＭＭｇＣｌ、０．８μ
Ｍフォワードオリゴヌクレオチドプライマー、０．８μ
Ｍリバースオリゴヌクレオチドプライマー、０．２ｍＭ
の各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよ
びｄＧＴＰ）を含有したヌクレオチド混合液８μｌ、お
よび２．５単位のＴａｑポリメラーゼからなる５０μｌ
容量中で行った。ＰＣＲは、例えばAmpliTaq酵素および
Perkin Elmer（Perkin Elmer Norwalk,Conneticut,USA
）製の緩衝液を用いて行った。

【００７３】ＭＴ‐ｈＴＢＰトランスジーンの検出は、
フォワードプライマーオリゴヌクレオチド（センスプラ
イマー）５′ＧＧＡＧＣＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣ
ＴＧＧＧＴＧＣ３′（配列番号５）およびリバー
スプライマーオリゴヌクレオチド（アンチセンスプライ
マー）５′ＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＴＧ
ＧＧＡＣＧ３′（配列番号６）を用いて行った。

【００７４】ＥＦ‐ｈＴＢＰトランスジーンの検出は、
フォワードオリゴヌクレオチドプライマー５′ＧＧＡ
ＧＡＣＴＧＡＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＣ
３′（配列番号７）で行った。ＭＴ‐ｈＴＢＰ検出と同
様のリバースプライマー（５′ＣＣＴＧＴＧＴＴＧ
ＣＣＴＧＣＴＧＧＧＡＣＧ３′）を用いた。

【００７５】温度サイクリングはロボット温度サイクラ
ー（例えば、Stratagene,La Jolla,CA,USA製）を用いて
行った。

【００７６】サイクリング温度は以下であった：サイクル１：９４℃５分間６０℃３分間７２℃２分間；サイクル２〜２５：９４℃１分間６０℃２分間７２℃３分間；サイクル２６：９４℃１分間６０℃２分間７２℃５分間またはサイクル１〜４０：９５℃２分間５５℃１分間７２℃１分間増幅産物の存在は、標準アガロースゲル電気泳動（例え
ば、１．２〜１．５％アガロース）を行い、ＵＶ光でＤ
ＮＡの視覚化のためにそのゲルを臭化エチジウムで染色
することにより検出した。

【００７７】陽性ＭＴ‐ｈＴＢＰサンプルは約５８０ｂ
ｐ増幅ＤＮＡ産物の存在により見分けた。陽性ＥＦ‐ｈ
ＴＢＰサンプルは約５００ｂｐ増幅ＤＮＡ断片を生じ
た。

【００７８】ＰＣＲ反応によるＭＴ‐ｈＴＢＰについて
１７０匹からのＤＮＡ分析では、３５のゲノムＤＮＡサ
ンプルがトランスジーンについて陽性であることを示し
た。ＰＣＲ分析によるＥＦ‐ｈＴＢＰ７６匹のゲノムＤ
ＮＡの分析では、ＥＦ‐ｈＴＢＰトランスジーンがマウ
ス９匹に含まれていることを示した。

【００７９】４ｄ）トランスジェニックモデル拡張：Ｄ
ＮＡ陽性Ｇｏ創始体を非トランスジェニックＢ６ＳＪＬ
オスと共に飼育して、得られた同腹子をＰＣＲで遺伝子
型分類した。Ｇ_１子孫を個別系統の継続的飼育および維
持と、更にｍＲＮＡおよびタンパク質発現分析に用い
た。

【００８０】例５：Ｓ１ヌクレアーゼ保護アッセイによ
るトランスジェニックｍＲＮＡの検出：５ａ）特徴：ト
ランスジェニック転写物の５′末端および３′末端と相
補的なオリゴヌクレオチド（オリゴ）を作製した：５′
オリゴの配列（センスプライマー）（配列番号８）：
５′ＧＣＧＧＣＡＣＣＡＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡ
ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡ
ＴＧＡＣＴＧＣＧＴＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＴＧＡＣＧＣ
ＴＴＴ３′

【００８１】３′オリゴの配列（アンチセンスプライマ
ー）（配列番号９）：５′ＧＡＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ
ＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＴＡＣＡＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＴ
ＡＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＴＴＴＡＧ
ＣＣＧＣＴＴＴＧＣＴＣＧ３′ 下線領域は非ハイブリッド形成配列である。オリゴ４０
ｎｇを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと、例えば Boe
hringer-Mannheim（Mannheim）製の緩衝液を用いて、（
^３２Ｐガンマ）ＡＴＰ（５０００cpm/mM）で５′標識し
た。反応は３０℃で１時間にわたり５０μｌ反応容量中
で行った。標識されたオリゴは、サイズ排除クロマトグ
ラフィー（例えば、Push-Columns,Stratagene,La Joll
a,CA,USA）を用いて、未取込み（^３２Ｐガンマ）ＡＴＰ
から単離した。

【００８２】５ｂ）プロモーター誘導：プロモーターは
Ｚｎ^２＋の存在下で活性化されることから、ＲＮＡ分析
前にＭＴ‐ｈＴＢＰマウスを誘導しておくことが必要で
あった。各ＭＴ‐ｈＴＢＰマウスには、Ｈ_２Ｏ中ＺｎＳ
Ｏ_４の２回の腹膜間注入を肝臓摘出の１８時間および再
び４時間前に行った（用量は０．１ｍｇＺｎＳＯ_４／
１０ｇマウス重量であった）。

【００８３】５ｃ）ＲＮＡ抽出：全ＲＮＡを市販Trizol
試薬（例えば、Gibco-BRL,Paisly,UK ）を用いて組織１
〜５ｇから抽出した。組織を１２ｍｌポリプロピレンチ
ューブ（例えば、falcontube ）内でTrizol溶液５ｍｌ
中Ultra-Turraxでホモゲナイズした。クロロホルム１ｍ
ｌを加え、チューブをふたして、手で１５秒間激しく振
盪した。溶液をＲＴで３分間インキュベートし、その後
Sorvall SS-34 ローターで４℃、１２，０００×ｇで１
５分間遠心した。上澄を新しいチューブに移し、イソプ
ロパノール２．５ｍｌを加えて混合した。インキュベー
トをＲＴで１０分間続けた。サンプルを４℃、１２，０
００×ｇで１０分間遠心した。上澄を除去し、ＲＮＡペ
レットを７５％エタノール５ｍｌで洗浄した。サンプル
を混合して、７５００×ｇで１０分間遠心した。ＲＮＡ
ペレットを無ＲＮＡｓｅ水に再懸濁し、その後２６０ｎ
ｍの吸光度をモニターして定量した。

【００８４】５ｄ）Ｓ１ヌクレアーゼ保護：均一量のＲ
ＮＡ（１０〜２０μｇ）を無ＲＮＡｓｅ水で１００μｌ
に調整した。５０，０００〜１５０，０００ｄｐｍの標
識されたオリゴを加えた（０．１〜１ｎｇ、標識効力に
応じる）。ＲＮＡ／オリゴ混合物を０．３Ｍ酢酸ナトリ
ウムおよびエタノールで沈降させた。ＲＮＡ／オリゴペ
レットを洗浄および風乾した。ハイブリッド形成溶液２
３μｌを加えた（８０％ホルムアミド、１０ｍＭＰＩ
ＰＥＳｐＨ６．４（Sambrook et al.(1989) ）、１ｍ
ＭＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳ）。反応液を混合
し、６５℃で２０分間かけて変性させ、その後５ＭＮ
ａＣｌ２μｌを６５℃で各サンプルに加えた。サンプ
ルをＨ_２Ｏ浴中６５℃で更に１時間インキュベートし、
その後浴の温度を３７℃にリセットした。６５℃から３
７℃への徐々の温度低下（一夜）で、特異的オリゴ‐ｍ
ＲＮＡハイブリッド形成を促進させた。翌日、Ｓ１緩衝
液３００μｌを各サンプルに加えた（Ｓ１緩衝液：１６
７Ｕ／ｍｌＳ１ヌクレアーゼ（例えば、Gibco BRL,Pa
isly,UK ）、０．３ＭＮａＣｌ、３０ｍＭＮａＯＡ
ｃ（ｐＨ４．５）、３ｍＭＺｎＳＯ_４）。サンプルを室
温で１時間インキュベートし、その後エタノール１ｍｌ
を（冷時）加えてすべての核酸を沈降させた。ペレット
を遠心し、洗浄して、Speed-Vac で簡単に乾燥させた。
次いでペレットをＳ１担持用緩衝液（８５％ホルムアミ
ド、０．０１％ブロムフェノールブルー、０．０１％キ
シレンシアノール、１×ＴＢＥ）１２μｌに再懸濁し
た。サンプルを７０℃に５分間加熱してから担持させ、
変性（６Ｍ尿素）薄ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
用いてサイズ分離した。乾燥されたゲルのオートラジオ
グラフィーは、保護された未切断バンドの検出を容易に
した。

【００８５】ＭＴ‐ｈＴＢＰの創始体３５例中、７例の
創始体が、Ｓ１保護アッセイによる分析で検出しうるｍ
ＲＮＡレベルを示した。ＥＦ‐ｈＴＢＰの場合には、３
例の創始体がＳ１分析から検出しうるｍＲＮＡを示し
た。

【００８６】例６：トランスジェニックｍＲＮＡのノー
ザンブロット検出６ａ）ＴＢＰのＰＣＲ増幅によるハイブリッド形成プロ
ーブの合成およびＴＢＰプローブの標識：二重標識され
たｈＴＢＰ構築物の４９８ｂｐ断片を一括したオリゴヌ
クレオチド／プライマーをデザインおよび合成した。

【００８７】フォワードオリゴは「ＡＵＧ」開始部位
（表１のＡＴＧ部位）の１０塩基下流から始まった。セ
ンスプライマーの配列は以下であった：配列番号１０：
５′ＣＣＣＴＡＴＧＡＣＧＴＣＣＣＧＧＡＴＴＡＣＧ
３′ リバースプライマーは「ＡＵＧ」開始部位（表１のＡＴ
Ｇ部位）の５０７ｂｐ下流で終った。アンチセンスプラ
イマーの配列は以下であった：配列番号１１：５′ＧＴ
ＧＧＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧ３′ ＰＣＲ反応を０．２μｇｐＡＧ‐１７、０．５ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、０．８μＭの各プライマー、１×ＰＣＲ緩
衝液（Perkin Elmer）、０．２ｍＭｄＡＴＰ、ｄＴＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび２．５ＵのAmpliTaq酵素
（Perkin ElmerNorwalk,Conneticut,USA ）で行った。

【００８８】サ−モサイクラープログラム：サイクル１〜３５：９４℃１分間５５℃１分間７２℃１分間；次いで７２℃で１０分間、その後４℃貯蔵。増幅された
バンドは０．７％アガロースゲルから精製した。

【００８９】ＴＢＰ‐ＤＮＡ‐プローブを、ランダムプ
ライマーと、Megaprime 標識キット（Amersham,UK ）の
Klenow断片酵素で標識した。プローブＤＮＡ２５〜５０
ｎｇをランダムヘキサマープライマー（例えば、Amersh
am）５μｌおよびＨ_２Ｏ２０μｌと混合した。ＤＮＡ
を１００℃で５分間変性させた。標識混合物を１×反応
緩衝液、１×ｄＡＴＰ、１×ｄＴＴＰ、１×ｄＧＴＰ、
３０００Ｃｉ／mmolα‐^３２ＰｄＣＴＰ（例えば、Am
ersham）４μｌおよび２Ｕ Klenow 酵素で最終容量５０
μｌまで加えた。反応をＲＴで１時間進行させた。標識
されたＤＮＡは、サイズ排除クロマトグラフィー（例え
ば、Push-Columns）を用いて、未取込みヌクレオチドか
ら単離した。

【００９０】６ｂ）ゲル電気泳動およびトランスファ
ー：全ＲＮＡ１０〜２０μｇをエタノール沈降させ、ペ
レットをＲＮＡ担持緩衝液（６５％ホルムアミド、２０
％ホルムアルデヒド（３７％溶液）、１×ＭＯＰＳ緩衝
液（Sambrook et al.(1989) ）、５％グリセロール、
０．０１％ブロムフェノールブルー、０．０１％キシレ
ンシアノール、０．１mg/ml 臭化エチジウム）中６５℃
で１０分間かけて変性させた。ＲＮＡを１８％ホルムア
ルデヒド（３７％溶液）および１×ＭＯＰＳランニング
緩衝液（４０ｍＭＭＯＰＳｐＨ７．０、１０ｍＭ酢
酸ナトリウム，１ｍＭＥＤＴＡ）を含有した１％アガ
ロースゲルでサイズ分別した。ゲルは、１８％ホルムア
ルデヒド（３７％溶液）を含有した１×ＭＯＰＳランニ
ング緩衝液中で、１Ｖ／ｃｍで一夜かけてゆっくりラン
させた。次いでゲルを０．０５ＭＮａＯＨ／１．５Ｍ
ＮａＣｌで３０分間、その後０．５Ｍトリス（ｐＨ
７．４）／１．５ＭＮａＣｌで２０分間処理した。Ｒ
ＮＡはキャピラリー技術を用いてナイロン膜（例えば、
Hybond- Ｎ＋,Amersham,UK）上に移した。膜結合ＲＮＡ
は架橋、例えばStratalinker（Stratagene,LaJolla,CA,
USA）を用いてＵＶ架橋させた。

【００９１】６ｃ）ハイブリッド形成および洗浄：前ハ
イブリッド形成は、例えば６５℃で１〜２時間にわたり
回転式ハイブリッド形成オーブン（例えば、Hybaid）内
において「Rapid-Hyb 」緩衝液（Amersham,UK ）中で行
った。ハイブリッド形成は、例えば６５℃で２〜３時間
にわたり１０^６〜１０×１０^６ｃｐｍの変性プローブを
含有した「Rapid-Hyb 」緩衝液６〜１０ｍｌ中で行っ
た。膜を２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（１×ＳＳＣ：１
５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸Ｎａ_３，ｐＨ
７．０）でＲＴで２回洗浄した（１０分間／洗浄）。膜
を更に１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で２回洗浄
した（１５分間／洗浄）。次の２回の洗浄は０．５×
ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で１５分間行い、その
後０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６５℃で１５分間
／洗浄にわたり（必要であれば）１または２回最終洗浄
した。洗浄された膜のオートラジオグラフィー

【００９２】例７：標識されたｈＴＢＰに特異的なポリ
クローナル抗体の作製：一般的方法：有意量の配列相同性がマウスおよびヒトＴ
ＢＰ間に存在している。したがって、ほとんどの市販抗
体は交差反応して、内在およびトランスジェニックＴＢ
Ｐ双方を検出する。二者間を区別するために、ポリクロ
ーナル抗体をトランスジェニックＴＢＰの標識領域（標
識されたｈＴＢＰのトロンビン開裂部位およびＨｉｓ標
識に相当する）に対して作製した：配列番号１２：Ｈ_２
Ｎ‐ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＣ‐ＣＯＯ
Ｈこのペプチドをキャリアタンパク質にカップリングさ
せ、標準プロトコールを用いてウサギに注入した。血清
を規則的間隔で集め、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて抗ｈ
ＴＢＰ力価について試験した。

【００９３】例８：トランスジェニックタンパク質のウ
エスタンブロット検出：８ａ）肝臓核抽出物の調製：ＭＴ‐ｈＴＢＰマウスをＺ
ｎＳＯ_４の２回の腹膜内注入に付した（５ｂ）参照）。
マウスを頸部脱臼で屠殺し、肝臓を摘出した。肝臓をホ
モゲナイズ緩衝液（１．８Ｍスクロース、１０ｍＭＨ
ＥＰＥＳｐＨ７．４（Sambrook et al.(1989) ）、２
５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５％グリセロー
ル、０．１５Ｍスペルミン、０．５ｍＭスペルミジン、
０．４ｍＭＰＭＳＦ）１０ｍｌ中で直ちにホモゲナイ
ズした。ホモゲナイズ後に、容量を同様の緩衝液で２５
ｍｌに増加させた。ホモゲネートを遠心管、例えばUltr
a-Clear ＳＷ‐２８チューブ（Beckman,Palo Alto,CA,U
SA）でホモゲナイズ緩衝液７ｍｌ上に慎重にのせた。サ
ンプルをＳＷ‐２８ローターで１時間にわたり２５，０
００ｒｐｍ（４℃）で遠心した。上澄を慎重に除去し、
ペレット化された核をＮＥＸＢ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰ
ＥＳｐＨ７．９、４００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰ
ＭＳＦ、１０％グルセロール、２μg/mlアプロチニン、
２μg/mlロイペプチン、２μg/mlペプスタチン‐Ａ）２
００μｌに再懸濁させた。再懸濁核をしばしば混合して
ピペットで上下させながら１５〜３０分間にわたり氷上
でインキュベートした。サンプルをドライアイス／エタ
ノール浴および３７℃ Ｈ_２Ｏ浴で５回の凍結／解凍サ
イクルに付した。サンプルを高速で３０秒間遠心し、上
澄を例えばタンパク質アッセイ試薬（例えば、Bio-Rad,
Hercules,CA,USA ）でタンパク質内容物について測定し
た。

【００９４】８ｂ）電気泳動およびトランスファー：抽
出物２０〜７５μｇを変性ゲル電気泳動によりサイズ分
離した。分解ゲル：１０％アクリルアミド（１：３７比
アクリルアミド：ビスアクリルアミド）、０．１％ＳＤ
Ｓ、３７５ｍＭトリスｐＨ８．８。濃縮用ゲル：５％ア
クリルアミド、０．１％ＳＤＳ、１２５ｍＭトリスｐＨ
８．３。ランニング緩衝液：２５ｍＭトリスｐＨ８．
３、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ。タンパク質
は修正Bjerrum トランスファー緩衝液（４８ｍＭトリ
ス、３９ｍＭグリシン、１０％メタノール、０．０３７
５％ＳＤＳ，ｐＨ９．２）を用いて半乾燥ブロッター
（例えば、Hoefer,San Francisco,CA,USA ）で純粋ニト
ロセルロース膜（例えば、Bio-Rad ）上に移した。トラ
ンスファーは０．８mA/cm で２〜４時間ランさせた。８ｃ）免疫検出：膜を３％ゼラチン（例えば、Bio-Rad
）含有１×ＴＢＳ（２０ｍＭトリスｐＨ７．５、５０
０ｍＭＮａＣｌ）中で揺動表面上室温で１〜２時間か
けてブロックした。膜をＲＴで１０分間かけて１×ＴＴ
ＢＳ（０．０５％Tween-２０含有１×ＴＢＳ）で洗浄し
た。１％ゼラチン／１×ＴＴＢＳ中で一次抗体とのハイ
ブリッド形成は、揺動表面上ＲＴで４時間から一夜かけ
て行った。膜を１×ＴＴＢＳで２〜３回洗浄した（５分
間／洗浄）。１％ゼラチン／１×ＴＴＢＳ中においてア
ルカリホスファターゼ（ＡＰ）とカップリングされた二
次抗体とのハイブリッド形成は、２〜３時間かけて行っ
た。膜をＲＴで１×ＴＴＢＳで再び２〜３回洗浄し（５
分間／洗浄）、その後１×ＴＢＳ緩衝液で５分間洗浄し
た。次いで、バンドの十分な出現が起きるまで、膜をＮ
ＢＴ／ＢＣＩＰ試薬含有の１×展開緩衝液（例えば、Bi
o-Rad ）中ＲＴでインキュベートした。ＡＰ反応はＨ_２
Ｏ洗浄により停止させた。

【００９５】表１は配列番号１３に対応し、表２は配列
番号１４に対応し、表４は配列番号１６に対応するもの
である。

【００９６】

【配列表】

配列番号:1 配列の長さ:12 配列の形: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: ペプチド配列の特徴: 特徴を表す記号: peptid 存在位置: 1..12 配列 Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val 1 5 10

【００９７】配列番号: 2 配列の長さ:11 配列の形: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: ペプチド配列の特徴: 特徴を表す記号: peptid 存在位置: 1..11 配列 Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 10

【００９８】配列番号: 3 配列の長さ: 10 配列の形: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: ペプチド配列の特徴: 特徴を表す記号: ペプチド存在位置: 1..10 配列 Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 10

【００９９】配列番号: 4 配列の長さ: 9 配列の形: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: ペプチド配列の特徴: 特徴を表す記号: ペプチド存在位置: 1..9 配列 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5

【０１００】配列番号: 5 配列の長さ: 22 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..22 配列 GGAGCAACCG CCTGCTGGGT GC 22

【０１０１】配列番号: 6 配列の長さ: 21 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..21 配列 CCTGTGTTGC CTGCTGGGAC G 21

【０１０２】配列番号: 7 配列の長さ: 21 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..21 配列 GGAGACTGAA GTTAGGCCAG C 21

【０１０３】配列番号: 8 配列の長さ: 76 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..76 配列 GCGGCACCAG GCCGCTGCTG TGATGATGAT GATGATGGCT GCTGCCCATG ACTGCGTAAT 60 GCGGTCATGA CGCTTT 76

【０１０４】配列番号: 9 配列の長さ: 75 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..75 配列 GAAGGGGGTG GGGGAGGCAA GGGTACATGA GAGCCATTAC GTCGTCTTCC TGAATCCCTT 60 TAGCCGCTTT GCTCG 75

【０１０５】配列番号: 10 配列の長さ: 22 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..22 配列 CCCTATGACG TCCCGGATTA CG 22

【０１０６】配列番号: 11 配列の長さ: 22 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..22 配列 GTGGAGTGGT GCCCGGCAAG GG 22

【０１０７】配列番号: 12 配列の長さ: 19 配列の形: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: ペプチド配列の特徴: 特徴を表す記号: ペプチド存在位置: 1..19 配列 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Cys

【０１０８】配列番号: 13 配列の長さ: 1310 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..1310 配列 CCATGGGCTA TCCCTATGAC GTCCCGGATT ACGCAGTCAT GGGCAGCAGC CATCATCATC 60 ATCATCACAG CAGCGGCCTG GTGCCGCGCG GCAGCCATAT GGATCAGAAC AACAGCCTGC 120 CACCTTACGC TCAGGGCTTG GCCTCCCCTC AGGGTGCCAT GACTCCCGGA ATCCCTATCT 180 TTAGTCCAAT GATGCCTTAT GGCACTGGAC TGACCCCACA GCCTATTCAG AACACCAATA 240 GTCTGTCTAT TTTGGAAGAG CAACAAAGGC AGCAGCAGCA ACAACAACAG CAGCAGCAGC 300 AGCAGCAGCA GCAGCAACAG CAACAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC 360 AGCAGCAGCA GCAGCAGCAA CAGGCAGTGG CAGCTGCAGC CGTTCAGCAG TCAACGTCCC 420 AGCAGGCAAC ACAGGGAACC TCAGGCCAGG CACCACAGCT CTTCCACTCA CAGACTCTCA 480 CAACTGCACC CTTGCCGGGC ACCACTCCAC TGTATCCCTC CCCCATGACT CCCATGACCC 540 CCATCACTCC TGCCACGCCA GCTTCGGAGA GTTCTGGGAT TGTACCGCAG CTGCAAAATA 600 TTGTATCCAC AGTGAATCTT GGTTGTAAAC TTGACCTAAA GACCATTGCA CTTCGTGCCC 660 GAAACGCCGA ATATAATCCC AAGCGGTTTG CTGCGGTAAT CATGAGGATA AGAGAGCCAC 720 GAACCACGGC ACTGATTTTC AGTTCTGGGA AAATGGTGTG CACAGGAGCC AAGAGTGAAG 780 AACAGTCCAG ACTGGCAGCA AGAAAATATG CTAGAGTTGT ACAGAAGTTG GGTTTTCCAG 840 CTAAGTTCTT GGACTTCAAG ATTCAGAACA TGGTGGGGAG CTGTGATGTG AAGTTTCCTA 900 TAAGGTTAGA AGGCCTTGTG CTCACCCACC AACAATTTAG TAGTTATGAG CCAGAGTTAT 960 TTCCTGGTTT AATCTACAGA ATGATCAAAC CCAGAATTGT TCTCCTTATT TTTGTTTCTG 1020 GAAAAGTTGT ATTAACAGGT GCTAAAGTCA GAGCAGAAAT TTATGAAGCA TTTGAAAACA 1080 TCTACCCTAT TCTAAAGGGA TTCAGGAAGA CGACGTAATG GCTCTCATGT ACCCTTGCCT 1140 CCCCCACCCC CTTCTTTTTT TTTTTTTAAA CAAATCAGTT TGTTTTGGTA CCTTTAAATG 1200 GTGGTGTTGT GAGAAGATGG ATGTTGAGTT GCAGGGTGTG GCACCAGGTG ATGCCCTTCT 1260 GTAAGTGCCC CTTCCGGCAT CCCGGAATTC CTGCAGCCCA ACGCGGCCGC 1310

【０１０９】配列番号: 14 配列の長さ: 4286 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..4286 配列 GAATTCCCCT GCAGGTCACT TAGCGTTGGC CACATAGTAG GTTCTCAAAT ACTTGTTAAT 60 AAATAAGTTT GTTCGAGAAG CTGGGCAATG ATATTCTACA GCTGGAAGAA GAAACATAAT 120 GATCTAGTAA TTAGCTCAAT TAAAAATAAA CGTTCTTCTT TCCTCAGAGG AGCATTTCCC 180 AAGGCCTGCC TTGATAGCCA TCCAAAAAGG CCAAGCTCAT CCAATCTTGC CCTAGATTTA 240 TGCTAAAATG CAGTTACAAT CGATAGGATG ACAGAAAACG ACAGCACTTA TTTAAATATA 300 ATAGGCACTT ATTTAAATAG GAGAAGCTGT GACTTCATAG CAAGTGTTGG GGTTAGGAAA 360 CTGGGTGGAT AAACTTGCTG ATGCTGTAGA TCTTAGCCTC TACATGAGAT CATGTGGAAA 420 ATCTGAAAGC ATTTTAGGTT CCTTATGTTT GCAATCAAAT AACTGTACAC CTTTTAATTT 480 AAAAAGTACC ATGAGGCACA CACACACACT CGCAGGAACT TTTTGGCGTA ACAAAACTAG 540 AATTAGATCT AAAAGCTAAC TGTAGGACTG AGTCTATTCT AAACTGAAAG CCTGGACATC 600 TGGAGTACCA GGGGGAGATG ACGTGTTACG GGCTTCCATA AAAGCAGCTG GCTTTGAATG 660 GAAGGAGCCA AGAGGCCAGC ACAGGAGCGG ATTCGTCGCT TTCACGGCCA TCGAGCCGAA 720 CCTCTCGCAA GTCCGTGAGC CGTTAAGGAG GCCCCCAGTC CCGACCCTTC GCCCCAAGCC 780 CCTCGGGGTC CCCGGGCCTG GTACTCCTTG CCACACGGGA GGGGCGCGGA AGCCGGGGCG 840 GAGGAGGAGC CAACCCCGGG CTGGGCTGAG ACCCGCAGAG GAAGACGCTC TAGGGATTTG 900 TCCCGGACTA GCGAGATGGC AAGGCTGAGG ACGGGAGGCT GATTGAGAGG CGAAGGTACA 960 CCCTAATCTC AATACAACCT TTGGAGCTAA GCCAGCAATG GTAGAGGGAA GATTCTGCAC 1020 GTCCCTTCCA GGCGGCCTCC CCGTCACCAC CCCCCCCAAC CCGCCCCGAC CGGAGCTGAG 1080 AGTAATTCAT ACAAAAGGAC TCGCCCCTGC CTTGGGGAAT CCCAGGGACC GTCGTTAAAC 1140 TCCCACTAAC GTAGAACCCA GAGATCGCTG CGTTCCCGCC CCCTCACCCG CCCGCTCTCG 1200 TCATCACTGA GGTGGAGAAG AGCATGCGTG AGGCTCCGGT GCCCGTCAGT GGGCAGAGCG 1260 CACATCGCCC ACAGTCCCCG AGAAGTTGGG GGGAGGGGTC GGCAATTGAA CCGGTGCCTA 1320 GAGAAGGTGG CGCGGGGTAA ACTGGGAAAG TGATGTCGTG TACTGGCTCC GCCTTTTTCC 1380 CGAGGGTGGG GGAGAACCGT ATATAAGTGC AGTAGTCGCC GTGAACGTTC TTTTTCGCAA 1440 CGGGTTTGCC GCCAGAACAC AGGTAAGTGC CGTGTGTGGT TCCCGCGGGC CTGGCCTCTT 1500 TACGGGTTAT GGCCCTTGCG TGCCTTGAAT TACTTCCACG CCCCTGGCTG CAGTACGTGA 1560 TTCTTGATCC CGAGCTTCGG GTTGGAAGTG GGTGGGAGAG TTCGAGGCCT TGCGCTTAAG 1620 GAGCCCCTTC GCCTCGTGCT TGAGTTGAGG CCTGGCCTGG GCGCTGGGGC CGCCGCGTGC 1680 GAATCTGGTG GCACCTTCGC GCCTGTCTCG CTGCTTTCGA TAAGTCTCTA GCCATTTAAA 1740 ATTTTTGATG ACCTGCTGCG ACGCTTTTTT TCTGGCAAGA TAGTCTTGTA AATGCGGGCC 1800 AAGATCTGCA CACTGGTATT TCGGTTTTTG GGGCCGCGGG CGGCGACGGG GCCCGTGCGT 1860 CCCAGCGCAC ATGTTCGGCG AGGCGGGGCC TGCGAGCGCG GCCACCGAGA ATCGGACGGG 1920 GGTAGTCTCA AGCTGGCCGG CCTGCTCTGG TGCCTGGCCT CGCGCCGCCG TGTATCGCCC 1980 CGCCCTGGGC GGCAAGGCTG GCCCGGTCGG CACCAGTTGC GTGAGCGGAA AGATGGCCGC 2040 TTCCCGGCCC TGCTGCAGGG AGCTCAAAAT GGAGGACGCG GCGCTCGGGA GAGCGGGCGG 2100 GTGAGTCACC CACACAAAGG AAAAGGGCCT TTCCGTCCTC AGCCGTCGCT TCATGTGACT 2160 CCACGGAGTA CCGGGCGCCG TCCAGGCACC TCGATTAGTT CTCGAGCTTT TGGAGTACGT 2220 CGTCTTTAGG TTGGGGGGAG GGGTTTTATG CGATGGAGTT TCCCCACACT GAGTGGGTGG 2280 AGACTGAAGT TAGGCCAGCT TGGCACTTGA TGTAATTCTC CTTGGAATTT GCCCTTTTTG 2340 AGTTTGGATC TTGGTTCATT CTCAAGCCTC AGACAGTGGT TCAAAGTTTT TTTCTTCCAT 2400 TTCAGGTGTC GTGAGGAATT GCCCGGGGGA TCCATGGGCT ATCCCTATGA CGTCCCGGAT 2460 TACGCAGTCA TGGGCAGCAG CCATCATCAT CATCATCACA GCAGCGGCCT GGTGCCGCGC 2520 GGCAGCCATA TGGATCAGAA CAACAGCCTG CCACCTTACG CTCAGGGCTT GGCCTCCCCT 2580 CAGGGTGCCA TGACTCCCGG AATCCCTATC TTTAGTCCAA TGATGCCTTA TGGCACTGGA 2640 CTGACCCCAC AGCCTATTCA GAACACCAAT AGTCTGTCTA TTTTGGAAGA GCAACAAAGG 2700 CAGCAGCAGC AACAACAACA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAACA GCAACAGCAG 2760 CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGGCAGTG 2820 GCAGCTGCAG CCGTTCAGCA GTCAACGTCC CAGCAGGCAA CACAGGGAAC CTCAGGCCAG 2880 GCACCACAGC TCTTCCACTC ACAGACTCTC ACAACTGCAC CCTTGCCGGG CACCACTCCA 2940 CTGTATCCCT CCCCCATGAC TCCCATGACC CCCATCACTC CTGCCACGCC AGCTTCGGAG 3000 AGTTCTGGGA TTGTACCGCA GCTGCAAAAT ATTGTATCCA CAGTGAATCT TGGTTGTAAA 3060 CTTGACCTAA AGACCATTGC ACTTCGTGCC CGAAACGCCG AATATAATCC CAAGCGGTTT 3120 GCTGCGGTAA TCATGAGGAT AAGAGAGCCA CGAACCACGG CACTGATTTT CAGTTCTGGG 3180 AAAATGGTGT GCACAGGAGC CAAGAGTGAA GAACAGTCCA GACTGGCAGC AAGAAAATAT 3240 GCTAGAGTTG TACAGAAGTT GGGTTTTCCA GCTAAGTTCT TGGACTTCAA GATTCAGAAC 3300 ATGGTGGGGA GCTGTGATGT GAAGTTTCCT ATAAGGTTAG AAGGCCTTGT GCTCACCCAC 3360 CAACAATTTA GTAGTTATGA GCCAGAGTTA TTTCCTGGTT TAATCTACAG AATGATCAAA 3420 CCCAGAATTG TTCTCCTTAT TTTTGTTTCT GGAAAAGTTG TATTAACAGG TGCTAAAGTC 3480 AGAGCAGAAA TTTATGAAGC ATTTGAAAAC ATCTACCCTA TTCTAAAGGG ATTCAGGAAG 3540 ACGACGTAAT GGCTCTCATG TACCCTTGCC TCCCCCACCC CCTTCTTTTT TTTTTTTTAA 3600 ACAAATCAGT TTGTTTTGGT ACCTTTAAAT GGTGGTGTTG TGAGAAGATG GATGTTGAGT 3660 TGCAGGGTGT GGCACCAGGT GATGCCCTTC TGTAAGTGCC CCTTCCGGCA TCCCGGATAT 3720 CCTGCAGCCC AACACGGCCG CTCGAGCATG CATCTAGAGA ACGTCACGGC CGCGATCCCC 3780 CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGGTT GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC 3840 CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT 3900 CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT 3960 TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGGTAC CCAGGTGCTG 4020 AAGAATTGAC CCGGTTCCTC CTGGGCCAGA AAGAAGCAGG CACATCCCCT TCTCTGTGAC 4080 ACACCCTGTC CACGCCCCTG GTTCTTAGTT CCAGCCCCAC TCATAGGACA CTCAACTTGG 4140 AGCGGTCTCT CCCTCCCTCA TCAGCCCACC AAACCAAACC TAGCCTCCAA GAGTGGGAAG 4200 AAATTAAAGC AAGAAGGCTA TTAAGTGCAG AGGGAGAGAA AATGCCTCCA ACATGTGAGG 4260 AAGTAATGAT AGAAATCATA GAATTC 4286

【０１１０】配列番号: 15 配列の長さ: 3263 配列の形: 核酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: cDNA 配列の特徴: 特徴を表す記号: exon 存在位置: 1..3263 配列 ATCGATAAGC TGAGATCCGG CTAGAAACTG CTGAGGGCTG GACCGCATCT GGGGACCATC 60 TGTTCTTGGC CCTGAGCGGG GCAGGAACTG CTTACCGCAG ATATCCTGTT TGCCCCAATT 120 CAGCTGTTCC ATCTGTTCTT GGCCCTGAGC GGGGCAGGAA CTGCTTACCA CAGATATCCT 180 GTTTGGCCCA TATTCAGCTG TCTCTCTGTT CCTGACCTTG ATCTGAACTT CTCTATTCTC 240 AGTTATGTAT TTTTCCCATG CCTTGCAAAA TGGCGTTACT TAAGCTAGCT TGCCAAACCT 300 ACGGCTGGGG TCTTTCACGT TTATATCTAT GAGGGGAAGG ACCCAGAGTG GGGAAGCTGG 360 GATCTTGGGA ACACGCTTCT CTACATGGCA TTGTCTGCAC GGTGGAGTCC GGATCTGAGC 420 TTGGCTTGGT TTTTAAAACC AGCCTGGAGT AGAGCAGATG GGTTAAGGTG AGTGACCCCT 480 CAGCCCTGGA CATTCTTAGA TGAGCCCCCT CAGGAGTAGA GAATAATGTT GAGATGAGTT 540 CTGTTGGCTA AAATAATCAA GGCTAGTCTT TATAAAACTG TCTCCTCTTC TCCTAGCTTC 600 GATCCAGAGA GAGACCTGGG CGGAGCTGGT CGCTGCTCAG GAACTCCAGG AAAGGAGAAG 660 CTGAGGTTAC CACGCTGCGA ATGGGTTTAC GGAGATAGCT GGCTTTCCGG GGTGAGTTCT 720 CGTAAACTCC AGAGCAGCGA TAGGCCGTAA TATCGGGGAA AGCACTATAG GGACATGATG 780 TTCCACACGT CACATGGGTC GTCCTATCCG AGCCAGTCGT GCCAAAGGGG CGGTCCCGCT 840 GTGCACACTG GCGCTCCAGG GAGCTCTGCA CTCCGCCCGA AAAGTGCGCT CGGCTCTGCC 900 AGGACGCGGG GCGCGTGACT ATGCGTGGGC TGGAGCAACC GCCTGCTGGG TGCAAACCCT 960 TTGCGCCCGG ACTCGTCCAA CGACTATAAA GAGGGCAGGC TGTCCTCTAA GCGTCACCAC 1020 GACTTCAACG TCCTGAGTAC CTTCTCCTCA CTTACTCCGT AGCTCCAGCT TCACCAGATC 1080 CTCGAGAACG TCTCCCATGG GCTATCCCTA TGACGTCCCG GATTACGCAG TCATGGGCAG 1140 CAGCCATCAT CATCATCATC ACAGCAGCGG CCTGGTGCCG CGCGGCAGCC ATATGGATCA 1200 GAACAACAGC CTGCCACCTT ACGCTCAGGG CTTGGCCTCC CCTCAGGGTG CCATGACTCC 1260 CGGAATCCCT ATCTTTAGTC CAATGATGCC TTATGGCACT GGACTGACCC CACAGCCTAT 1320 TCAGAACACC AATAGTCTGT CTATTTTGGA AGAGCAACAA AGGCAGCAGC AGCAACAACA 1380 ACAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGCAACAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA 1440 GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGGCA GTGGCAGCTG CAGCCGTTCA 1500 GCAGTCAACG TCCCAGCAGG CAACACAGGG AACCTCAGGC CAGGCACCAC AGCTCTTCCA 1560 CTCACAGACT CTCACAACTG CACCCTTGCC GGGCACCACT CCACTGTATC CCTCCCCCAT 1620 GACTCCCATG ACCCCCATCA CTCCTGCCAC GCCAGCTTCG GAGAGTTCTG GGATTGTACC 1680 GCAGCTGCAA AATATTGTAT CCACAGTGAA TCTTGGTTGT AAACTTGACC TAAAGACCAT 1740 TGCACTTCGT GCCCGAAACG CCGAATATAA TCCCAAGCGG TTTGCTGCGG TAATCATGAG 1800 GATAAGAGAG CCACGAACCA CGGCACTGAT TTTCAGTTCT GGGAAAATGG TGTGCACAGG 1860 AGCCAAGAGT GAAGAACAGT CCAGACTGGC AGCAAGAAAA TATGCTAGAG TTGTACAGAA 1920 GTTGGGTTTT CCAGCTAAGT TCTTGGACTT CAAGATTCAG AACATGGTGG GGAGCTGTGA 1980 TGTGAAGTTT CCTATAAGGT TAGAAGGCCT TGTGCTCACC CACCAACAAT TTAGTAGTTA 2040 TGAGCCAGAG TTATTTCCTG GTTTAATCTA CAGAATGATC AAACCCAGAA TTGTTCTCCT 2100 TATTTTTGTT TCTGGAAAAG TTGTATTAAC AGGTGCTAAA GTCAGAGCAG AAATTTATGA 2160 AGCATTTGAA AACATCTACC CTATTCTAAA GGGATTCAGG AAGACGACGT AATGGCTCTC 2220 ATGTACCCTT GCCTCCCCCA CCCCCTTCTT TTTTTTTTTT TAAACAAATC AGTTTGTTTT 2280 GGTACCTTTA AATGGTGGTG TTGTGAGAAG ATGGATGTTG AGTTGCAGGG TGTGGCACCA 2340 GGTGATGCCC TTCTGTAAGT GCCCCTTCCG GCATCCCGGA ATTCCTGCAG CCCAACGCGG 2400 CCGCTTCGAG GGATCTTTGT GAAGGAACCT TACTTCTGTG GTGTGACATA ATTGGACAAA 2460 CTACCTACAG AGATTTAAAG CTCTAAGGTA AATATAAAAT TTTTAAGTGT ATAATGTGTT 2520 AAACTACTGA TTCTAATTGT TTGTGTATTT TAGATTCCAA CCTATGGAAC TGATGAATGG 2580 GAGCAGTGGT GGAATGCCTT TAATGAGGAA AACCTGTTTT GCTCAGAAGA AATGCCATCT 2640 AGTGATGATG AGGCTACTGC TGACTCTCAA CATTCTACTC CTCCAAAAAA GAAGAGAAAG 2700 GTAGAAGACC CCAAGGACTT TCCTTCAGAA TTGCTAAGTT TTTTGAGTCA TGCTGTGTTT 2760 AGTAATAGAA CTCTTGCTTG CTTTGCTATT TACACCACAA AGGAAAAAGC TGCACTGCTA 2820 TACAAGAAAA TTATGGAAAA ATATTCTGTA ACCTTTATAA GTAGGCATAA CAGTTATAAT 2880 CATAACATAC TGTTTTTTCT TACTCCACAC AGGCATAGAG TGTCTGCTAT TAATAACTAT 2940 GCTCAAAAAT TGTGTACCTT TAGCTTTTTA ATTTGTAAAG GGGTTAATAA GGAATATTTG 3000 ATGTATAGTG CCTTGACTAG AGATCATAAT CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT 3060 TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT GAACCTGAAA CATAAAATGA ATGCAATTGT 3120 TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA 3180 TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA 3240 TGTATCTTAT CATGTCTGGA TCC 3263

【０１１１】配列番号: 16 配列の長さ: 371 配列の形: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: プロテイン配列の特徴: 特徴を表す記号: プロテイン存在位置: 1..371 配列 Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val Met Gly Ser Ser 1 5 10 15 His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His 20 25 30 Met Asp Gln Asn Asn Ser Leu Pro Pro Tyr Ala Gln Gly Leu Ala Ser 35 40 45 Pro Gln Gly Ala Met Thr Pro Gly Ile Pro Ile Phe Ser Pro Met Met 50 55 60 Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Thr Pro Gln Pro Ile Gln Asn Thr Asn Ser 65 70 75 80 Leu Ser Ile Leu Glu Glu Gln Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 85 90 95 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 100 105 110 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala 115 120 125 Val Ala Ala Ala Ala Val Gln Gln Ser Thr Ser Gln Gln Ala Thr Gln 130 135 140 Gly Thr Ser Gly Gln Ala Pro Gln Leu Phe His Ser Gln Thr Leu Thr 145 150 155 160 Thr Ala Pro Leu Pro Gly Thr Thr Pro Leu Tyr Pro Ser Pro Met Thr 165 170 175 Pro Met Thr Pro Ile Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ser Glu Ser Ser Gly 180 185 190 Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Gly Cys 195 200 205 Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala Glu Tyr 210 215 220 Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Arg 225 230 235 240 Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly Ala 245 250 255 Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala Arg Val 260 265 270 Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys Ile Gln 275 280 285 Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly 290 295 300 Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe 305 310 315 320 Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu Leu Ile 325 330 335 Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg Ala Glu 340 345 350 Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly Phe Arg 355 360 365 Lys Thr Thr 370

【０１１２】配列番号: 17 配列の長さ: 18 配列の形: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列の種類: プロテイン配列の特徴: 特徴を表す記号: プロテイン存在位置: 1..18 配列 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ミヒャエル、マイスターエルンストドイツ連邦共和国アイヘナウ、ヤーンシュトラーセ、11 (72)発明者グレグ、ポリッツアメリカ合衆国ニュージャージー州、ブリッジウォーター、ルート、202−206、ブールバード、エヌ3218

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エピトープ標識されたＴＡＴＡボックス結
合タンパク質（ＴＢＰ）を発現しうる能力を有する、ト
ランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】ＴＢＰが二つのエピトープ‐標識を有した
融合タンパク質として発現される、請求項１に記載のト
ランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】融合タンパク質がヒトＴＢＰ（ｈＴＢＰ）
を含んでなる、請求項１または２に記載のトランスジェ
ニック非ヒト動物。
【請求項４】融合タンパク質がＨＡ‐およびＨｉｓ‐エ
ピトープを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に
記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】融合タンパク質が配列番号１６の配列を有
する、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト動
物。
【請求項６】トランスジェニック動物がマウスである、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のトランスジェニッ
ク非ヒト動物。
【請求項７】非ヒト動物の生殖系および／または体細胞
中にトランスジーンを導入することを含んでなる、請求
項１〜６のいずれか一項に記載のトランスジェニック非
ヒト動物の作製方法。
【請求項８】非ヒト動物接合体中にトランスジェニック
ＤＮＡをマイクロインジェクトすることを含んでなる、
請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック動物の作製
方法。
【請求項９】トランスジーンを含んでなるベクターで胚
盤胞をトランスフェクトすることを含んでなる、請求項
７に記載の非ヒトトランスジェニック動物の作製方法。
【請求項１０】胚幹細胞中にトランスジーンを導入する
ことを含んでなる、請求項７に記載の非ヒトトランスジ
ェニック動物の作製方法。
【請求項１１】エピトープ標識されたＴＢＰをコードし
ており、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトランス
ジェニック非ヒト動物を作製するために使用される、ト
ランスジーン。
【請求項１２】ＴＢＰをコードする第一ＤＮＡ配列と、
一以上のエピトープ‐標識をコードする第二ＤＮＡ配列
とを含んでなる、請求項１１に記載のトランスジーン。
【請求項１３】ＴＢＰをコードするＤＮＡ配列がｃＤＮ
Ａである、請求項１１または１２に記載のトランスジー
ン。
【請求項１４】ＤＮＡ配列がヒトＴＢＰ（ｈＴＢＰ）の
ｃＤＮＡである、請求項１３に記載のトランスジーン。
【請求項１５】第二ＤＮＡ配列が二つのエピトープ‐標
識をコードしているものである、請求項１１〜１４のい
ずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項１６】エピトープ‐標識がＨＡ‐エピトープお
よびＨｉｓ‐エピトープである、請求項１５に記載のト
ランスジーン。
【請求項１７】ＨＡ‐エピトープが、配列番号１、配列
番号２、配列番号３、または配列番号４の配列のいずれ
か一つを有してなるものである、請求項１５または１６
に記載のトランスジーン。
【請求項１８】配列番号１３の配列を含んでなる、請求
項１１〜１７のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項１９】誘導性または構成性プロモーターのＤＮ
Ａを含んでなる、請求項１１〜１８のいずれか一項に記
載のトランスジーン。
【請求項２０】プロモーターがＥＦ遺伝子のプロモータ
ーである、請求項１９に記載のトランスジーン。
【請求項２１】プロモーターがＭＴ遺伝子のプロモータ
ーである、請求項１９に記載のトランスジーン。
【請求項２２】トランスジーンが配列番号１４または配
列番号１５の配列を有してなるものである、請求項１１
〜２２のいずれか一項に記載のトランスジーン。
【請求項２３】非ヒトトランスジェニック動物を作製す
るための、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のト
ランスジーンの使用。
【請求項２４】一以上のエピトープ‐標識をコードする
ＤＮＡ配列を、ＴＢＰタンパク質をコードするＤＮＡ配
列に連結することを含んでなる、請求項１１〜２２のい
ずれか一項に記載のトランスジーンの作製方法。
【請求項２５】エピトープ標識されたＴＢＰを作製する
ための、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のトラ
ンスジーンの使用。
【請求項２６】エピトープ標識されたＴＢＰを発現させ
るための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトラン
スジェニック動物の使用。
【請求項２７】請求項１〜６のいずれか一項に記載のト
ランスジェニック動物で発現される、エピトープ標識さ
れたＴＢＰ。
【請求項２８】二つのエピトープを有している、請求項
２７に記載のエピトープ標識されたＴＢＰ。
【請求項２９】ＴＢＰがｈＴＢＰである、請求項２７ま
たは２８に記載のエピトープ標識されたＴＢＰ。
【請求項３０】ＴＢＰがＨＡ‐エピトープおよびＨｉｓ
‐エピトープに連結されてなる、請求項２７〜２９のい
ずれか一項に記載のエピトープ標識されたＴＢＰ。
【請求項３１】ＨＡ‐エピトープが、配列番号１、配列
番号２、配列番号３、または配列番号４の配列のいずれ
か一つを有してなるものである、請求項２７〜３０のい
ずれか一項に記載のエピトープ標識されたＴＢＰ。
【請求項３２】配列番号１６の配列を含んでなる、請求
項２７〜３１のいずれか一項に記載のエピトープ標識さ
れたＴＢＰ。
【請求項３３】動物の生殖系および／または体細胞中に
請求項１１〜２２のいずれか一項に記載のトランスジー
ンを導入することを含んでなる、請求項２７〜３２のい
ずれか一項に記載のエピトープ標識ＴＢＰの作製方法。
【請求項３４】構成性プロモーターを含んでなるトラン
スジーンを非ヒト動物に導入することにより、エピトー
プ標識されたＴＢＰが、場合により動物の特定成長段階
で、動物の特定細胞型および／または組織で発現され
る、請求項３３に記載されたエピトープ標識ＴＢＰの作
製方法。
【請求項３５】誘導性プロモーターを含んでなるトラン
スジーンを非ヒト動物に導入し、そのプロモーターの誘
導によりエピトープ標識されたＴＢＰを発現させる、請
求項３３に記載されたエピトープ標識ＴＢＰの作製方
法。
【請求項３６】トランスジェニック動物からの高次転写
複合体の単離と、ＴＡＦおよびＴＡＦ相互作用因子の同
定のための、エピトープ標識されたＴＢＰの使用。
【請求項３７】エピトープ標識されたＴＢＰを発現させ
るための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトラン
スジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項３８】場合により動物の異なる成長段階におけ
る、異なる組織および／または細胞型から高次転写複合
体の単離のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載
のトランスジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項３９】新規および／または特異的ＴＡＦおよび
／またはＴＡＦ相互作用因子を同定するための、トラン
スジェニック非ヒト動物の使用。
【請求項４０】高次転写複合体が合体されたエピトープ
標識ＴＢＰがトランスジェニック動物から単離される、
異なる高次転写複合体の同定および特徴付けのための方
法。
【請求項４１】ａ）請求項１１〜２２のいずれか一項に
記載されたトランスジーンを非ヒト動物中に導入し、
ｂ）エピトープ標識されたＴＢＰを、場合により動物の
異なる成長段階で、異なる動物組織および／または動物
の異なる細胞型から単離し、そしてｃ）高次転写複合体
の組成を決定することを含んでなる、異なる高次転写複
合体の組成を特徴付ける方法。
【請求項４２】ａ）請求項１１〜２２のいずれか一項に
記載されたトランスジーンを非ヒト動物中に導入し、
ｂ）エピトープ標識されたＴＢＰを、場合により特定の
成長段階で、特定の動物組織および／または動物の特定
細胞型から単離し、ｃ）高次転写複合体でエピトープ標
識ＴＢＰと合体されたＴＡＦおよび／またはＴＡＦ相互
作用因子を解離および分離し、そしてｄ）場合により、
ＴＡＦおよび／またはＴＡＦ相互作用因子のアミノ酸配
列を決定することを含んでなる、新規および／または特
異的ＴＡＦおよび／またはＴＡＦ相互作用因子の同定方
法。
【請求項４３】ＴＢＰに標識された少くとも一つのエピ
トープを用いることによりエピトープ標識ＴＢＰがアフ
ィニティ精製されたときに、エピトープ標識ＴＢＰと合
体された高次転写複合体がアフィニティ共精製される、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のトランスジェニッ
ク非ヒト動物から異なる高次転写複合体を単離する方
法。
【請求項４４】エピトープ標識ＴＢＰがＮｉ^２＋カラム
へのそのＨｉｓエピトープの結合により精製される、請
求項４３に記載の高次転写複合体の単離方法。
【請求項４５】エピトープ標識ＴＢＰが抗ＨＡ抗体への
そのＨＡエピトープの結合により精製される、請求項４
３または４４に記載の高次転写複合体の単離方法。
【請求項４６】高次転写複合体が、配列番号１７の配列
を有する、エピトープ標識ＴＢＰのエピトープを認識す
る抗体とのアフィニティカラムを用いることにより単離
される、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の高次
転写複合体の単離方法。
【請求項４７】配列番号１７の配列を有する、エピトー
プ標識ＴＢＰのエピトープを認識する抗体。