CZ160198A3 - Transgenní zvíře, transgen, způsob jejich přípravy a použití pro purifikaci transkripčních komplexů - Google Patents

Transgenní zvíře, transgen, způsob jejich přípravy a použití pro purifikaci transkripčních komplexů Download PDF

Info

Publication number
CZ160198A3
CZ160198A3 CZ981601A CZ160198A CZ160198A3 CZ 160198 A3 CZ160198 A3 CZ 160198A3 CZ 981601 A CZ981601 A CZ 981601A CZ 160198 A CZ160198 A CZ 160198A CZ 160198 A3 CZ160198 A3 CZ 160198A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
tbp
epitope
animal
transgenic
transgene
Prior art date
Application number
CZ981601A
Other languages
English (en)
Inventor
Bernd Dr. Kirschbaum
Erick Dr. Berglund
Michael Dr. Meisterernst
Greg Dr. Polites
Original Assignee
Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Aktiengesellschaft filed Critical Hoechst Aktiengesellschaft
Publication of CZ160198A3 publication Critical patent/CZ160198A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká transgenu, který obsahuje DNA kódující protein vázající box TATA (TBP) se značeným epitopem, vytvoření transgenních zvířat, která exprimují TBP se značeným epitopem a jeho použití pro afinitní purifikaci (nových) transkripčnich faktorů a transkripčnich komplexů z celé řady eukaryotických tkání a buněčných typů.
Dosavadní stav techniky
Postupná formace a aktivita pre-iniciačního komplexu je nejdůležitějším faktorem pro regulaci eukaryotické transkripce. Pre-iniciační komplex je rozsáhlý komplex s mnoha podjednotkami, který je nezbytný pro správné umístění a iniciaci enzymu RNA polymerázy II v místě počátku transkripce. V posledních letech bylo charakterizováno mnoho obecných transkripčnich faktorů (GTF) tohoto komplexu z eukaryotických jader, včetně TFIIA, TFIIB,
TFIID, TFIIE,
TFIIF a TFIIH (Zawel a
Reinberg,
1995, Ann. Rev. Biochem.,
64, 533-561,
Serizawa
1994, In: Transcription:
Mechanisms and regulation,
45-66, Raven press).
V promotorech obsahujících TATA (sekvenci) má TFIID specifickou afinitu pro sekvenci boxu TATA. Prostřednictvím rozpoznání této sekvence je způsobeno, že TFIID je první prvek, který se váže k promotoru v základní transkripci RNA polymerázou II, a tím tvoří nukleační komplex (Lewin, B., 1990, Cell, 61, 1161-1164). Další GTF se vážou postupně • ·
9· vymezeným způsobem, což vede ke vzniku kompletního preiniciačního komplexu. Tento velký komplex následně vyhledá a správně umístí RNA polymerázu II (Pol II) na místo počátku transkripce, aby inicioval bazální transkripci. Je jasné, že
TFIID, sám o sobě komplex s mnoha podjednotkami, hraje klíčovou úlohu v regulaci „aktivované transkripce, volně definované jako zvýšené hladiny produkce mRNA v přítomnosti transkripčních aktivátorů. Tyto aktivátory mohou být přirozeně se vyskytující determinanty vázající zesilovač, jako je box E vázající USF (Sawadogo a Roeder, 1985, Cell, 43, 165-175, Kirschbaum et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12, 5094-5100) nebo virové faktory jako je VP16 (Stringer et al., 1990, Nátuře, 345, 783-786).
TFIID je složen z proteinu vázajícího se na box TATA (TBP) a několika faktory sdruženými s TBP (TAFus) (v přihlášce termín „TAFus zahrnuje jakýkoliv druh transkripčního faktoru, transkripčního aktivátoru, transkripčniho inhibitoru). Do současnosti bylo charakterizováno až 20 odlišných TAF^s a byly pozorovány komplexy TFIID obsahující různé kombinace TAF^s (Zawel a
Reinberg, 1995, Ann. Rev. Biochem., 64, 533-561, Hoři, R., a Carey, M., 1994, Curr. Opinion Gen. Dev., 4, 236-244). Kromě toho různé kombinace TAF^s propůjčují komplexu TFIID rozdílné vlastnosti. Například u drozofil jsou proteiny tvořící vzor Hunchback (HB) a Bicoid (BCD) zcela odkázané na přítomnost TAFn60, TAFullO a ΤΑΕΣΙ250 v komplexu TFIID (Sauer, F., et al., 1995, Science, 270, 1783-1788). Tyto složky TFIID působí jako společné aktivátory pro protisměrné k zesilovači vázané proteiny HB a BCD. Bylo prokázáno, že neurogenní faktor NTF-1 vyžaduje pro aktivovanou transkripci minimální komplex TBP, TAFul50 (ke kterému se váže) a TAFn250, zatímco SPI vyžaduje pro svou aktivaci další faktor • · ········
TAFnllO (Chen, J-L., et al., 1994, Cell, 79, 93-105). Další studie identifikovala TAFn28, jehož přítomnost je nezbytná pro transkripční aktivaci estrogenových receptorů a jaderných receptorů pro vitamin D3 (May, M., et al., 1996, EMBO, 15, 3093-3104). Je pravděpodobné, že TAFuS působí jako transkripční adaptéry přenášející regulační informaci od aktivátorových/receptorových faktorů k jádru iniciačního komplexu prostřednictvím interakcí protein-protein.
Podle současného pohledu na regulovanou transkripci, exprese jednotlivých genů a/nebo malých skupin blízce příbuzných lokusů je regulována definovatelnými soubory podjednotek transkripčního komplexu. Ačkoliv některé z faktorů jsou všudypřítomné a přítomné ve většině transkripčních jevů, například GTFs, zvyšující se počet genově a buněčně regulované transkripce.
Existuje několik ověřených metod, pro identifikaci transkripčních faktorů, které vedly k objevu RNA Pol II a sedmi TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH a byl nyní specifických prvků popsán které byly použity Dřívější strategie, různých GTF (TFIIA, hlavně frakcionaci jaderných
TFIIJ), vyžadovaly buněčných linií na kolonách (Zawel a Reinberg, 1995, Serizawa et al., 1994, Roeder, R.G., 1996, TIBS, 21, 327-335). Tyto frakce poskytovaly částečně purifikované proteiny s různým množstvím transkripční schopnosti. Většina těchto frakcí se zdála být zcela nezbytná pro bazální transkripci. V této době bylo známo, že frakce TFIID byla zodpovědná za rozpoznávání boxu TATA. Avšak pokusy izolovat jeden protein se schopností vázat se na TATA nebyly úspěšné. Průlom nastal, když se ukázalo, že jedna složka z kvasinek je schopná nahradit TFIID v testech rekonstituované bazální transkripce, což vedlo k izolaci a klonování proteinu
vázajícího se na TATA (TBP) o velikosti 27 kD (Buratowski,
S., et al., 1988, Nátuře, 334, 37-42, Cavallini, B., et al.,
1988, Proč. Nati. Acad. Sci., 86, 9803-9809). Použití degenerovaných primerů vedlo k další identifikaci genů pro podjednotku TBP lidského (Kao, C.C., et al., 1990, Science, 248, 1646-1649, Hoffmann, A., et al., 1990, Nátuře, 346,
387-390, Peterson, M.G., et al., 1990, Science, 248, 16251630), drozofily (Hoey, T., et al., 1990, Cell, 61, 11791186, Muhich, M.L., et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci., 87, 9148-9152) a myšího TFIID (Tamura, T., et al., 1991, Nuc. Acids Res., 19, 3861-3865).
Dostupnost cDNA pro TBP z různých druhů umožnila široký rozvoj výzkumu včetně nadměrné exprese (over-expression) těchto proteinů v buněčné kultuře. Byly vytvořeny linie buněk HeLa, které konstitutivně exprimují protein TBP se značkou FLAG nebo s označením epitopu hemaglutininem (HA) viru chřipky, který je přidán k jeho amino konci (Zhou, Q., et al., 1993, Genes & Development, 7, 180-187, Chiang et al., 1993, EMBO, 12, 2749-2762). Značka FLAG je epitop skládající se ze syntetické sekvence osmi aminokyselin. Značka HA je přirozený epitop s aminokyselinovou sekvencí s identifikačním číslem 1 „MGYPYDVPDYAV (jednopísmenný kód) .
Pro expresi fúzního proteinu obsahujícího TBP v drozofilové buněčné linii byl také použit kratší peptid z přirozené značky HA (10 aminokyselin z hemaglutininu viru chřipky) (Colgan a Manley, 1992, Genes Dev., 6, 304-331,
Trivrdi et al., 1996, Mol. Cel. Biol., 16, 6909-6916).
Proteiny TBP se dvěma epitopy značenými na amino koncích, epitop FLAG a HA, byly exprimovány v bakteriích (Chiang et al., 1993, EMBO, 12, 2749-2762). Proteiny TBP značené FLAG byly také exprimovány za regulace ········
indukovatelným promotorem (Wu et al., 1996, BioTechniques, 21, 718-725). Byly použity monoklonální protilátky proti epitopu/epitopům, aby se purifikovaly komplexy sdružené s TBP z jaderných extraktů, šlo tedy o společnou purifikaci faktorů sdružených s TBP v komplexu TFIID (TAFuS) (Zhou, et al., 1993, Genes Dev., 7, 180-187).
V mnoha laboratořích pokračuje v tomto směru výzkum vedoucí k současné vlně nových TAF a faktorů interagujicich s TAF, které jsou identifikovány a charakterizovány z jaderných extraktů buněk HeLa a kvasinek (Hoři, a Carey,
1994, Curr. Op. Gen. Dev., 4, 236-244, Zawel a Reinberg,
1995, Ann. Rev. Biochem., 64, 533-561, Roeder, R.G., 1996, Trends Biochem. Sci, 21, 327-335).
Z lidských TAFs jsou známy TAFn68, TAFn55, TAFn30, TAFn28, TAFn20 a TAFnl8 (Mengus et al., 1995, EMBO, 14, 1520-1531, Bertolotti et al., 1996, EMBO, 15, 5022-5031, Wu a Chiang, 1996, Biotechniques, 21, 718-725) .
Je třeba zdůraznit, že ačkoliv byla těmito metodami nalezena hojnost faktorů, výzkum je omezen na transkripčni komplexy, TAFs a faktory interagujicí s TAF, které jsou specifické pro typ buněčné linie nebo kmen kvasinek, který je používán.
Podstata vynálezu
Vynález se týká „univerzálního systému, kde je TBP se značeným epitopem použit pro afinitní purifikaci nových transkripčních komplexů a transkripčnich faktorů, TAFs a faktorů interagujicich s TAF, v souvislosti s celým zvířetem, a tudíž z celé řady odlišných eukaryotických tkání a buněčných typů.
·· ·· • · · · •·· · · ·· • · · · · · • · · zvířete které je
Vynález se týká transgenního schopné exprimovat protein značeným epitopem. V dalším ohledu transgenního vázajici kromě se na se člověka, box
TATA použiti identifikaci a izolaci zvířete kromě člověka vynález výhodně týká pro transkripčních izolaci řádu vyššího sdružených transkripční faktory). V dalším zvířete kromě a pro identifikaci v transkripčním komplexu interagující s TAF, např.
ohledu se vynález týká přípravy transgenního člověka zavedením transgenu (gen jiný než přirozeně se vyskytující) do zárodečné linie a/nebo somatických buněk transgenního zvířete kromě člověka, výhodně v konkrétním stupni vývoje, být použit pro
Provedení
Vynález se dále týká transgenu, který může tvoření transgenních zvířat kromě člověka.
transgen, který vynálezu tedy poskytuje značeným epitopem. Transgen DNA, která kóduje jednu nebo výhodně obsahuje kóduje TBP se první sekvenci značek, a dále obsahuje druhou sekvenci DNA, která kóduje TBP. Transgen může obsahovat další sekvenci(e) DNA, která více epitopových kóduje epitopovou výhodně cDNA. DNA, značku(y). DNA, která kóduje TBP, je která kóduje TBP, může být jakákoliv přirozeně se vyskytující DNA, její derivát nebo část. DNA, výhodně cDNA, může být např. z eukaryot, včetně ptáků, obojživelníků, plazů, kvasinek, C. elegans, savců, apod. Může být použita například DNA kódující TBP z hlodavců, ovce, psa, krávy, prasete a primátů, člověka nebo jejich části. Výhodné je použití lidské cDNA pro TBP (hTBP). Vynález také zahrnuje použití jakékoliv DNA, která se nevyskytuje přirozeně, např. derivát TBP-cDNA. Derivát DNA může mít například změněnou sekvenci, např. mutovanou nebo modifikovanou sekvenci a/nebo může obsahovat modifikované
„GYPYDVPDYA (sekvence s identifikačním číslem 3), „YPYDVPDYA (sekvence s identifikačním číslem 4) nebo další peptidy pocházející z epitopu HA.
V jednom provedení vynálezu obsahuje transgen cDNA lidského TBP a dvě sekvence DNA, které kóduji epitopovou značku. Výhodně první sekvence DNA kóduje epitop HA, který může sloužit jako epitop pro imunoreakci např. s komerčně dostupnou monoklonální protilátkou (Kolodziej a Youna, 1991, Meth. Enzym., 194, 508-519) . Přímo na 3' konci k sekvenci, která kóduje značku HA, je lokalizována sekvence DNA, která kóduje úsek 6 histidinových zbytků (značka His). Značka His může tvořit nekovalentni reverzibilní komplex s ionty Ni2+. Například komerčně dostupný Ni2+ agarózový materiál pro afinitní kolony je rutinně používán k purifikaci proteinů značených His (Hochuli, E., et al., 1987, J. Chromatography, 411, 177-184, Janknecht, R., et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 4835). Ve speciálním provedeni vynálezu transgen obsahuje sekvenci DNA s identifikačním číslem 13. Sekvence s identifikačním číslem 13 poskytuje transgen, který kóduje fúzní protein skládající se z dvojitě značeného hTBP.
Ve výhodném provedení vynález poskytuje transgen, který kóduje TBP se značeným epitopem a který obsahuje promotor pro expresi fúzního proteinu. Transgen může obsahovat jednu nebo více genově regulačních sekvenci kromě DNA, která kóduje TBP (např. cDNA z TBP nebo její derivát) a sekvenci(e) DNA kódující epitopové značky. Tyto genově regulační sekvence jsou například přirozené nebo syntetické promotory nebo jejich části a/nebo cis působící prvky (např. zesilovač-enhancer, tlumič-silencer) . Pro tento účel mohou být použity savčí promotory, například promotor myšího transferinového genu, promotor genu enolázy specifické pro neurony (NSE) (Fors-Petter, S., et al., 1990, Neuron, 5,
187-197) nebo promotor thymidinkinázového genu. Mohou být také použity virové promotory, jako například promotory genů cytomegaloviru nebo časného genu SV40. Výhodně se použijí indukovatelné nebo konstitutivní promotory nebo jejich deriváty. Jako konstitutivní promotor může být použit například promotor genu lidského elongačního faktoru-1 alfa (EF) (Uetsuki, T., et al., 1989, J. Biol. Chem., 264, 57915798). Jako indukovatelný promotor může být použit například promotor metalothioninu (MT), který má několik cis prvků, které jsou responzivní na těžké kovy (Palmiter, R.D., 1987, Experimentia Supplementum, 52, 63-80, Birknáuser Verlag). Kromě toho může být pro tento účel použit promotor genu, který je exprimován např. specificky pro buněčný cyklus, specificky pro typ buňky nebo vývojově specificky.
Ve speciálním provedení vynálezu transgen obsahuje cDNA hTBP a sekvence DNA, které kódují epitop HA (např. 9 aminokyselin přirozeného epitopu HA) a epitop His (např. značka 6x his) a konstitutivní promotor. Například exprese TBP je regulována promotorem pro lidský elongační faktor-1
Chem., 264, 57915798). Promotor EF je promotor bez TATA, který byl použit k expresi transgenů u myší v mírných, ale konstantních hladinách (Hanaoka, K.,
1991, Differentiation, 183speciálním provedení vynálezu obsahuje transgen sekvenci DNA, která kóduje dvojitě značený (epitop HA a His) hTBP a sekvenci promotoru EF, transgen konkrétně má sekvenci DNA s identifikačním číslem 14.
V dalším speciálním provedení vynálezu transgen obsahuje DNA, která kóduje TBP, nejlépe cDNA z hTBP a sekvence DNA, které kódují epitop HA (např. 9 aminokyselin přirozeného epitopu HA) a epitop His (např. 6x his) a indukovatelný promotor. Indukovatelný promotor je nejlépe ·« ···· promotor metalothioninu (MT) . Například v případě, že zavedení přidatné sekvence kódující TBP do genomu zvířat a následná exprese TBP nebo fúzního proteinu TBP je toxická, toto provedení vynálezu umožní zvířeti donosit plod s transgenem kódujícím fúzní protein TBP, který zůstává umlčený, dokud není promotor uveden do činnosti. Promotor může být indukován například, když je zvíře plně dospělé nebo v jakémkoliv zkoumaném vývojovém stadiu, např. v případě promotoru MT intraperitoneální injekcí obsahující divalentní kationty jako Zn2+, Mg2+, Mn2+ nebo Cd2+. Jak bylo ukázáno na jiných modelech, gen řízený MT se poté exprimuje ve zvýšené míře (Palmiter, R.D., et al., 1982, Cell, 29, 701-710). V konkrétním provedení vynálezu transgen obsahuje sekvenci DNA, která kóduje dvojitě značený hTBP (epitop HA a HIS) a promotor MT, transgen konkrétně má sekvenci DNA s identifikačním číslem 15.
Vynález se dále připojením sekvence(i) týká způsobu vytvoření transgenu
DNA., která kóduje jednu nebo více epitopových značek, k sekvenci DNA, která kóduje protein
TBP.
Vynález se dále týká použití transgenu. Transgen může být například použit pro přípravu rekombinantního vektoru.
Vynález se také týká způsobu přípravy rekombinantního vektoru. Tento způsob zahrnuje integraci transgenu do příslušného vektoru, např. vektoru, který obsahuje regulační sekvence. Příklady vektorů jsou expresní vektory a retroviry nebo jejich deriváty.
Vynález se dále týká použití rekombinantních vektorů, které obsahují transgen. Vynález se konkrétně týká použití rekombinantního vektoru, který obsahuje transgen (který např. obsahuje cDNA z TBP nebo jeho derivátu, zejména hTBP, a sekvencí DNA kódujících epitopové značky, například • * · · · · • · sekvence DNA kódující epitop HA a His). Vynález se týká použití vektoru pro zavedení transgenu do eukaryotické buňky, zejména pro zavedení do savčí buňky. Vynález se dále týká použití vektoru obsahujícího tento transgen pro amplifikaci transgenní DNA v bakteriích nebo eukaryotických buňkách. Eukaryotická buňka, do které je zaveden vektor obsahující transgen, může být také použita pro heterologní/transgenní expresi transgenu. Eukaryotická buňka (hostitelská buňka) může být částí transgenního zvířete.
V hlavním provedení vynálezu je transgen použit pro přípravu transgenního zvířete kromě člověka. Transgen nebo rekombinantní vektor obsahující transgen je proto zaveden do hostitelské buňky a/nebo zvířete. V dalším ohledu se vynález týká transgenního zvířete kromě člověka, které vzniklo zavedením transgenu do zvířete nebo jeho buňky. Transgenní zvíře podle vynálezu má schopnost exprimovat nebo nadměrně exprimovat TBP nebo fúzní protein obsahující nebo se skládající z TBP s epitopovou značkou.
Pro přípravu transgenního zvířete je jako hostitelské zvíře použito zvíře kromě člověka. Toto zvíře kromě člověka zahrnuje obratlovce, jako jsou hlodavci, primáti kromě člověka, ovci, kozu, psa, krávu, prase, ptáky, obojživelníky, plazy apod. Preferovaná zvířata jsou vybrána ze savčích druhů zvířat kromě člověka, výhodně zvířat řádu hlodavců včetně krys a myší, nejvýhodněji myší.
Transgenní zvíře kromě člověka podle vynálezu zahrnuje každé zvíře, do jehož genomu byla zavedena jedna nebo více kopií transgenu(ů), který řídí expresi nebo který kóduje TBP nebo jeho derivát, jako fúzní protein sestávající z TBP a epitopových značek nebo je obsahující. Transgenní zvíře by mělo mít schopnost exprimovat protein TBP se značeným epitopem. Ve speciálním provedení vynálezu může transgenní
• · • · ···· • Φ 1*
• · * · • • 9 · • •
• · · • • · · • · • «
• · * · • • • · ·· • •
• · · • • • • •
·· • M • · * ·
zvíře mít transgenním způsobem přerušen nebo vyřazen endogenní gen(y) TBP („knock-out zvíře).
Transgenní zvíře podle vynálezu je zvíře, do kterého byl zaveden prostředky jinými než přirozenými (tj. lidskou manipulací) jeden nebo více genů TBP (transgenů podle vynálezu), které se u zvířete přirozeně nevyskytují, např. cizorodý gen TBP nebo jeho deriváty, jako genetickým inženýrstvím změněný endogenní nebo cizorodý TBP. Gen TBP jiný než přirozeně se vyskytující se nazývá transgen. Transgen může být z téhož nebo odlišného druhu, jako je zvíře, ale v každém případě transgen se přirozeně nenalézá u zvířete v konfiguraci a/nebo chromozómovém lokusu transgenem obsazeném.
Transgen (transgenová DNA) může obsahovat cizorodý gen kódující TBP, tj. sekvence, které nejsou normálně nalezeny v genomu hostitelského zvířete, jako gen TBP nebo cDNA získaná z odlišných zvířecích druhů. Jako alternativu nebo přídavek může transgen obsahovat endogenní gen kódující TBP, např. sekvence DNA, které jsou abnormální v tom, že byly jinak uspořádány nebo mutovány in vitro, aby se změnil normální in vivo model exprese genu TBP nebo aby se změnila či vyloučila biologická aktivita endogenního TBP. Vynález se také týká expresních vektorů, které obsahují transgen a které mohou být použity k přípravě transgenního zvířete.
Vynález se dále týká způsobu přípravy transgenního zvířete podle vynálezu. Transgenní zvíře podle vynálezu může být tvořeno zavedením transgenů a/nebo vektoru, např. expresního vektoru, který obsahuje transgen, do zárodečné linie nebo buňky zárodečné linie a/nebo do somatické buňky zvířete kromě člověka. Pro zavedení transgenů podle vynálezu mohou být například použity embryonální cílové buňky v různých vývojových stadiích. V závislosti na stavu vývoje
• · 44 • 4 ···· ··
• * • A 9 • • · • * • A·· • · • · A • A
A • 4 4 4 • » ··♦ 4 4
A 4 4 · • 4 • •
···· • 444 • A ·»· 4 A 4 4
embryonální cílové buňky(buněk) mohou být aplikovány různé metody. Některé příklady jsou:
1. Preferovanou metodou pro zavedení transgenu do genomu zvířat v praxi vynálezu je mikroinjekce zygot. Mikroinjekce vyžaduje izolaci embryí ve stadiu jedné buňky. Proto je preferovanou cílovou buňkou pro mikroinjekci transgenní DNA (DNA transgenu) zygota, oplodněné vajíčko, které neprodělalo fúzi pronukleů nebo následné buněčné dělení. Pronukleus myšího samce dosahuje velikosti přibližně 20 mikrometrů v průměru, což umožňuje reprodukovatelnou injekci 1-2 pl roztoku obsahujícího transgenní DNA. Použití zygoty pro zavedení transgenu má výhodu, že ve většině případů je injikovaná transgenní DNA zavedena do genomu hostitelského zvířete před prvním buněčným dělením (Brinster, et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82, 44384442). V důsledku toho všechny buňky výsledných transgenních zvířat (zakladatelských zvířat) trvale nesou zavedený transgen v konkrétním genetickém lokusu, který se nazývá transgenní alela. Transgenní alela vykazuje mendelovskou dědičnost: polovina potomků, kteří jsou výsledkem křížení transgenního zvířete s netransgenním zvířetem zdědí transgenní alelu, podle mendelovských pravidel náhodného výběru.
Všeobecně používané postupy pro manipulaci s embryem a pro mikroinjekce transgenní DNA jsou detailně popsány v „Transgenic Animal Technology - A Laboratory Handbook, editor Carl A. Pinkert, Academie Press, lne., 1994.
2. Pro zavedení transgenu podle vynálezu do zvířete může být také použita virová integrace. Vyvíjející se embrya jsou kultivována in vitro do vývojového stadia známého jako blastocysta. V tomto okamžiku mohou být blastomery infikovány vektory obsahujícími transgen (transgenní DNA/DNA ···· ···· • ·· · · • ·· • ·· • · · · · ·· ·· konstrukty), pro tento účel může být použit například příslušný virový nebo retrovirový vektor (Jaenich,
R. , 1976,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 73, 1260-1264). Transformace nebo infekce blastomer může být zvýšena enzymatickým odstraněním zóna pellucida (Hogan et al., 1986, Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Jestliže je do blastomer zaveden prostřednictvím virových vektorů transgen, jsou takové vektory typicky defektni co se týče replikace, ale zůstávají kompetentní pro integraci transgenních sekvenci DNA, které jsou spojeny s vektorovými sekvencemi, do genomu hostitelského zvířete (Jahner et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 6927-6931, Van der Putten et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 6148-6152). Transfekce se snadno a účinně dosáhne kultivací blastomer v jedné vrstvě buněk produkujících vektor obsahující transgen (Van der Putten et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82, 6148 — 6152, Stewart et al., 1987, EMBO, 6, 383-388).
Jako alternativa může být infekce provedena v pozdějším stadiu, jako je blastokéla (Jahner, D., et al., 1982, Nátuře, 298, 623-628). Většina transgenních zakladatelských zvířat tvořených retrovirovou nebo virovou integrací má transgen pouze v podskupině všech buněk, které tvoři transgenní zakladatelské zvíře. Kromě toho v jednom zakladatelském zvířeti mohou nastat mnohonásobné (retro)virové integrační jevy, dávající vznik násobným transgenním alelám, které se segregují v budoucích generacích potomků. Zavedení transgenu do zárodečných buněk tímto způsobem je možné, ale pravděpodobně nastane s nízkou frekvencí (Jahner, D., et al·., 1982, Nátuře, 298, 623-628). Avšak jakmile je jednou transgen touto metodou zaveden do zárodečných buněk, může být produkováno potomstvo, ve kterém je transgenní alela přítomná ve všech zvířecích buňkách, tj. jak v buňkách somatických, tak zárodečných.
3. Jako cílové buňky pro zavedení transgenu podle vynálezu do zvířat mohou také sloužit embryonální kmenové (ES) buňky. Buňky ES se získají z preimplantačních embryí, která mohou být pěstována in vitro (Evens, M.J., et al., 1981, Nátuře, 292, 154-156, Bradley, M.O., et al., 1984 ,
Nátuře, 309, 255-258, Gossler et al., 1986, Proč. Natí.
Acad. Sci. USA, 83, 9065-9069, Robertson et al., 1986,
Nátuře, 322, 455-448, Robertson, E.J., in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson,
IRL Press, Oxford, 1987, str. 71-112). Buňky ES, které jsou
St. Louis, komerčně dostupné (např. od Genome Systems, lne., být transformovány s jedním
MO) , mohou nebo více transgeny zavedenými metodami
R.H., in
Teratocarcinomas and
Embryonic
Stem
Cells: A
Practical
Approach, Robertson,
IRL
Press, Oxford, 1987, str. 153-182). Transformované buňky ES se zvířecí blastocystou, zatímco buňky mohou být kombinovány
ES kolonizují embryo a přispívají k zárodečné linii výsledného zvířete, které je chiméra (složené z buněk pocházejících ze dvou nebo více zvířat) (Jaenisch, R., 1988, Science, 240, 1468-1474, Bradley, A., in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, E.J., ed., IRL Press, Oxford, 1987, str. 113-151). Opět platí, že jakmile je jednou transgen zaveden do zárodečných buněk touto metodou, může být produkováno potomstvo, ve kterém je transgenní alela přítomná ve všech zvířecích buňkách, tj . jak v buňkách somatických, tak zárodečných.
Počáteční zavedení transgenu, ať nastane jakkoliv, není mendelovská událost. Ale transgen podle vynálezu může být trvale integrován do buněk zárodečné linie a přenášen na
• · potomstvo transgenniho zvířete jako mendelovský lokus. Zárodečná integrace je podstatná pro produkci transgenních zvířat, která mohou přenášet genetickou informaci na své potomstvo mendeiovským způsobem, a aby se využila tato transgenní zvířata jako stálé zvířecí modely.
Další transgenní techniky mají za následek mozaiková transgenní zvířata, ve kterých některé buňky nesou transgen a jiné buňky ne. V mozaikových transgenních zvířatech, ve kterých buňky zárodečné linie nenesou transgen, nenastává přenos transgenu na potomky. Nicméně mozaiková transgenní zvířata jsou schopna projevit fenotypy sdružené s transgenem a mohou být použita pro afinitní purifikaci konkrétních transkripčních komplexů, TAFs a faktorů interagujicích s TAF. Vynález se týká mozaikových transgenních zvířat, která obsahují popsaný transgen podle vynálezu.
Vynález se dále týká transgenně zavedených mutací, což zahrnuje nulové („knock-out) alely, ve kterých je sekvence DNA kódující druhově specifický TBP odstraněna (deletována) a/nebo substituována geneticky změněnou sekvencí TBP (např. transgen podle vynálezu) téhož nebo odlišného druhu a je regulována promotorem(y)/zesilovačem(i) dle výběru.
Vynález se týká transgenních zvířat, do kterých byl zaveden transgen obsahující značkou, a je-li nezbytné,
DNA kódující TBP s epitopovou spojený s konstitutivním nebo indukovatelným promotorem. Vynález se zejména týká transgenních zvířat, do kterých byl zaveden transgen, který obsahuje DNA kódující hTBP s epitopovou značkou HA a His a sekvenci DNA promotoru EF. V dalším speciálním provedení se vynález týká transgenniho zvířete, do kterého byl zaveden transgen, který obsahuje DNA kódující hTBP s epitopovou značkou HA a His a sekvenci DNA promotoru MT. Ve speciálním provedení vynálezu transgenní zvíře obsahuje transgen se • · · · • · • · · · · · · · ··· • · · · · · · ···· · ·· ··· ··· ········ ·· · · · · · · · sekvenci s identifikačním číslem 13. Další transgenní zvíře vynálezu obsahuje transgen se sekvencí s identifikačním číslem 14. Další transgenní zvíře vynálezu obsahuje transgen se sekvencí s identifikačním číslem 15. Vynález se zejména týká transgenního zvířete, které má do svého genomu trvale zaveden transgen, například sekvenci DNA s identifikačním číslem 13, sekvenci s identifikačním číslem 14 a/nebo sekvenci s identifikačním číslem 15.
Potomek, který zdědil transgen, může být odlišen od sourozenců, kteří transgen nezdědili, analýzou genetického materiálu potomka na přítomnost biologických molekul, které obsahují sekvence jednoznačně odpovídající sekvencím transgenu, nebo jsou jím kódovány. Proto tedy mohou být imunologicky testovány na přítomnost polypeptidu kódovaného transgenem, např. TBP s epitopovou značkou, například biologické tekutiny, které obsahují polypeptidy (např. TBP s epitopovou značkou) jednoznačně kódované transgenem podle vynálezu. Jednodušší a spolehlivější prostředek pro identifikaci transgenního potomka zahrnuje získání vzorku tkáně např. z končetiny nebo ocasu zvířete, a analýzu vzorku na přítomnost sekvencí nukleové kyseliny odpovídajících sekvenci DNA jednoznačné části nebo částí transgenu podle vynálezu. Přítomnost takové sekvence nukleové kyseliny může být určena např. hybridizační (Southernovou, northernovou) analýzou se sekvencemi DNA odpovídajícími jednoznačně částem transgenu, analýzou produktů reakcí PCR za použití sekvencí DNA ve vzorku jako substrátu a oligonukleotidů odvozených ze sekvence DNA transgenu, atd.
Vynález se proto také týká testů, kdy může být testována případná první generace transgenních zvířat (Go), a také všechny další generace transgenních zvířat (Gi, G2, G3, G4 ...) nebo zvířat transgenních zvířecích linií, na ·· · · ···· • · · · přítomnost transgenu, např. standardními reakcemi PCR. Pro tento účel může být extrahována ze zvířecích tkání genomová DNA, například z tkáně ocasu, po ošetření s proteinázou K a RNázou. Pro tyto reakce PCR by měla sekvence primerů odpovídat částem sekvence transgenu, např. v promotorových oblastech, oblasti(těch) DNA kódující epitopovou značku(y) a/nebo oblastech DNA jednoznačných pro konkrétní konstrukt TBP. S takovými reakcemi PCR může být například u myší detekován v asi 25 % injikovaných vajíček odpovídající produkt reakce PCR, tj. asi 25 % myší produkují pozitivní potomstvo.
Další způsob, jak ověřit, zda zvířata nesou či nenesou transgen, se týká testu na přítomnost transgenní mRNA v případných transgenních zvířatech/transgenních zvířecích liniích. Počáteční testování může být například prováděno analýzou Sl, která je velmi citlivá na malá množství mRNA (Berk, A.J., a Sharp, P.A., 1977, Cell, 12, 721). Pro tento účel jsou hybridizovány značené „antisense oligonukleotidy (s orientací opačnou ke směru transkripce) s celkovou RNA, která byla izolována z tkáně zvířete. Následné ošetření nukleázou Sl štěpí všechny jednovláknové nukleové kyseliny, DNA a RNA. Dvoj vláknové DNA nebo hybridy DNA-RNA jsou ponechány neporušené. Jestliže je přítomná jakákoliv transgenní mRNA, hybridizuje s antisense oligonukleotidem, a tím je tedy chráněna před štěpením nukleázou Sl.
Vynález zahrnuje také detekci přítomnosti transgenní mRNA v tkáňových preparátech, např. v preparátech celkové jaterní mRNA prostřednictvím Sl protekčních testů. Mohou být syntetizovány antisense oligonukleotidy, které jsou komplementární k části transgenní mRNA (např. mRNA odpovídající sekvenci DNA TBP s epitopovou značkou). Oligonukleotidy jsou označeny, např. na 5' konci, a například • · · · • · · · • · · · • · · · · • · · • · · · radioaktivně se 32S, 33P, 35P, 3H nebo 14C nebo fluorescenčními markéry či jinými typy markérů, jako je biotin nebo digoxigenin. Značené oligonukleotidy jsou smíseny s mRNA z transgenní myši za selektivních hybridizačních podmínek podle standardních laboratorních protokolů (Sambrook et al.,
1989). Směs je poté ošetřena nukleázou Sl. Krátká oblast neodpovídající sekvence, např. na 3' konci oligonuklectidu, by měla být vždy naštěpena a skýtá vnitřní kontrolu, která ukáže, že nukleáza Sl vskutku štěpí všechny dostupné jednovláknové nukleové kyseliny. V přítomnosti transgenní mRNA by značený oligonukleotid měl být chráněn před štěpením a jeho přítomnost a velikost by měla být snadno určena např.
sekvenování (např. nenaštěpeného značeného detekována např. expozicí transgenní mRNA by denaturačnim gelu podobném s 8 M močovinou) .
gelu při
PAGE oligonukleotidu gelu na nevznikl žádný film.
pás, může
Přítomnost být poté
V nepřítomnosti neboť nechráněný nukleázou Sl. Vynález oligonukleotid by zahrnuje také to, různým buněčným typům byly připraveny na přítomnost transgenní mRNA.
Další provedeni vynálezu se týká a buňky odpovídající ze zvířat a testovány testováni transgenních zvířat northernovou analýzou. Nej výhodněji byla transgenní zvířata, která byla shledána pozitivními pro transgenní mRNA metodou PCR nebo mapováním nukleázou Sl, dále testována northernovou analýzou (McMaster, G.K. a Carmichael, 1977, Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 4835) . Pro tento účel může být izolována celková RNA z různých tkáni a/nebo buněčných typů a separována dle velikosti např. za denaturujících podmínek na agarózovém gelu. RNA může být poté navázána například na membránu nebo filtr za použiti např. kapilárního přenosu a vazba fixována UV světlem. Navázaná RNA může být testována
9 9 • · · · • · • · · · • ·
sondou za použiti obvyklých podmínek pro northernův přenos (blotování) se značenou sondou odpovídající kódující oblasti transgenu nebo jeho části, např. s DNA sondou odpovídající 5' konci transgenu podle sekvence s identifikačním číslem 13. Takové DNA sondy jsou výhodně dlouhé asi 20 až 1000 párů baží (bp). Nejvýhodněji jsou dlouhé asi 100, 200, 300, 400 a 500 bp. Je-li nutné, je přebytek značené sondy odmyt a membrána je exponována filmu. Sondy mohou být značeny, jak je popsáno výše pro oligonukleotidy. Pro tyto pokusy s northernovým přenosem mohou být někdy také použity oligonukleotidy.
Transgenní zvíře, výhodně takové transgenní zvíře, které bylo pozitivní v každém dalším molekulárně biologickém testu, je testováno na přítomnost transgenního proteinu TBP specifickou imunoreakcí např. westernovým přenosem nebo testem ELISA. Za tímto účelem mohou být izolována standardními postupy jádra z tkáně nebo konkrétních buněk zvířat, výhodně z jaterní tkáně nebo jakékoliv měkké tkáně, např. na sacharózovém gradientu při odstřeďování v ultracentrifuze. Z těchto jader může být soustředěn celkový jaderný protein, např. ošetřením jader vysokou koncentrací solí (např. 400 mM KC1) a neiontovým surfaktantem (např. NP-40). Poté může být jaderný protein separován dle velikosti, např. příslušnou elektroforézou v denaturačním gelu, výhodně SDS-PAGE. Tyto gely mohou být přeneseny, např. elektrickým přenosem, na pevný povrch, např. membrány nebo filtry, výhodně na nitrocelulózovou membránu. Membrány nebo filtry mohou být poté předem blokovány, a pak zkoušeny s vhodnými protilátkami podle standardních laboratorních protokolů (Sambrook et al., „Molecular Cloning”, druhé vydání, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
• · · ·
Pro tento účel mohou být použity polyklonálni a/nebo monoklonálni protilátky, které se tvoří např. v myši, králíkovi, kryse, ovci, koze, koni, ptácích apod. Detekce může být provedena přímo s protilátkami, které rozpoznávají fúzní protein TBP a které jsou spojeny s enzymem nebo markérem, např. alkalickou fosfatázou nebo fluorescenčním markérem nebo biotinem nebo digoxigeninem nebo označeny radioaktivně. Detekce se může také provádět nepřímo použitím druhé protilátky, která rozpoznává konzervativní oblast primární protilátky, například, když se první protilátka tvoří v myši, druhá protilátka musí být protimyší protilátka tvořící se například v ovci. Tato druhá protilátka může být pro detekci také spojena s enzymem nebo jinými markéry.
Vynález se dále týká použití transgenu nebo jeho části nebo kódovaného fúzního proteinu nebo jeho části pro tvorbu protilátek, které vážou TBP s epitopovou značkou kódovaný transgenem, např. k přípravě monoklonálních nebo polyklonálních protilátek.
Protilátky vztahující se k vynálezu jsou protilátky, které rozpoznávají jeden nebo více epitopů fúzniho proteinu TBP. Tyto protilátky mohou být namířeny proti jednotlivému epitopu(ům) patřícímu k TBP a/nebo mohou být namířeny proti epitopové značce(značkám). Jedno provedení vynálezu se týká protilátky, která rozpoznává amino-koncovou část fúzního proteinu TBP. Další provedení vynálezu se týká protilátky, která rozpoznává epitop sousedící s částí aminokyselinové sekvence, kde jsou TBP a epitopová značka(y) a/nebo dvě epitopové značky spojeny dohromady.
Jedno provedení vynálezu se týká protilátky, která rozpoznává epitop fúzního proteinu, který se skládá z hTBP a dvou epitopových značek. Protilátka konkrétně rozpoznává epitop fúzního proteinu skládajícího se ze značek His a HA
a hTBP. Protilátka nejvýhodněji rozpoznává epitop(y) na amino-koncové části TBP značeného HA a His. Speciální provedení vynálezu se týká protilátky, která rozpoznává aminokyselinovou sekvenci s identifikačním číslem 16 nebo epitop správně uspořádaného fúzniho proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci s identifikačním číslem 16 nebo jeho část. Vynález se týká protilátky (protilátek anti-TBP), která rozeznává aminokyselinovou sekvenci s identifikačním číslem 17 nebo její správně uspořádaný epitop, výhodně v souvislosti s fúzním proteinem TBP.
Protilátky vynálezu mohou být polyklonální nebo monoklonální.
Protilátka se může tvořit ve všech druzích zvířat kromě člověka, výhodně v myši, kryse, králíkovi, ovci, koze, koni, v jejich vejcích). Tato protilátka se může protokolů (Hurlow a tvořit podle standardních laboratorních
Lané, „Antibodies: A Laboratory Manual,
1988, Cold Spring Harbor Press). Protilátky mohou být, je-li to nezbytné, afinitně purifikovány za použití originálního imunizačního peptidu (epitopu). Speciální provedení vynálezu se týká polyklonálních protilátek tvořených v králíkovi, které jsou tvořeny imunizací králíka peptidem majícím sekvenci s identifikačním číslem 17 (např. spojeným s vhodným proteinovým nosičem). Polyklonální protilátka (protilátka anti-TBP) rozpoznává fúzní protein hTBP (značky HA a His).
Protilátka týkající se vynálezu může být použita pro analýzu westernovým přenosem, a také pro afinitní purifikaci fúzniho proteinu TBP a transkripčních komplexů vyššího řádu, které jsou sdružené s fúzním proteinem TBP. Komplexy vyššího řádu obsahují TAFs, které jsou sdruženy s fúzním proteinem TBP a faktory interagujícími s TAF.
• ·
Vynález se týká použiti transgenniho zvířete. Transgenní zvíře podle vynálezu může být použito pro společnou afinitní purifikaci transkripčních komplexů vyššího řádu, TAFs a faktorů interagujícimi s TAF z tkáně transgennich zvířat a/nebo kultivovaných buněk transgenniho zvířete. Tyto transkripční komplexy vyššího řádu mohou být izolovány a purifikovány z celé řady různých tkání a/nebo buněčných typů. Z takových tkání/buněčných typů se výhodně provádějí jaderné preparáty, nej výhodněji z homogenizovanýcn buněk podle standardních laboratorních protokolů (Dignam et al., 1983, Nuc. Acids Res., 11, 1575, Lichtenstein et al., 1987, Cell, 51, 963-973, Gorsky et al., 1986, Cell, 47, 767776). Je-li nezbytné, mohou být jaderné proteiny poté hromaděny standardními metodami. Proto se vynález také týká způsobů společné afinitní purifikace vyšších nebo transkripčních komplexů, TAFs a faktorů interagujícimi s TAF z transgennich zvířat.
Vynález se například týká afinitní purifikace transkripčních komplexů vyššího řádu, TAFs a faktorů interagujícimi s TAF za použití protilátek specifických pro epitop nebo materiálů, které nesou náboj (pozitivní nebo negativní). Pro tento účel mohou být použity například protilátky již detailně popsané. Jeden z nejvýhodnějšleh společně purifikujících způsobů pro transkripční komplexy vyššího řádu, které obsahují TBP s epitopem značeným HA a His, výhodně hTBP, zahrnuje afinitní purifikaci za použití Ni2+ a/nebo protilátek anti-HA (např. komerčně dostupných protilátek) a/nebo protilátek rozpoznávájících epitop podle sekvence s identifikačním číslem 17. Tyto protilátky nebo Ni2+ mohou být spojeny s vhodným materiálem na kolony tak, že afinitní purifikace se může provádět za použití např. Ni2+ φ φ • φ φ φ φ φ
kolon nebo kolon se specifickými protilátkami, např. s protilátkami anti-HA nebo protilátkami anti-TBP.
V dalším provedení se vynález týká fúzniho proteinu TBP, TBP s epitopovou značkou. Fúzni protein TBP je výhodně exprimován v transgennim zvířeti. Vynález se zejména týká fúzniho proteinu hTBP. Fúzni protein TBP může být izolován a purifikován z transgenního zvířete. Jedno provedení vynálezu je protein TBP značený HA. a His, konkrétně protein hTBP značený HA a His. Další provedení vynálezu je protein, který má aminokyselinovou sekvenci s identifikačním číslem 16. V dalším provedení vynálezu obsahuje fúzni protein TBP jedno nebo více štěpných míst pro proteinázu/peptidázu, např. štěpné místo pro trombin. Štěpná místa jsou výhodně lokalizována v aminokyselinové sekvenci fúzniho proteinu mezi epitopovou značkou(ami) a proteinem TBP.
Vynález se týká způsobu přípravy fúzniho proteinu TBP, kde je transgen podle vynálezu exprimován ve vhodné hostitelské buňce, která je výhodně částí transgenního zvířete.
Transgenní mRNA a/nebo fúzni protein TBP kódovaný transgenem a/nebo transkripční komplexy vyššího řádu sdružené s fúzním proteinem TBP mohou být izolovány z různých typů tkání a/nebo buněčných typů, které se nalézají v transgennim zvířeti, např. mozek, srdce, ledviny, játra, plíce, nervový systém, sval, žlázy, kostní dřeň, buňky patřící k imunitnímu systému, kůže atd.
Vynález se týká použití fúzniho proteinu TBP, konkrétně pro izolaci transkripčních zvířete, a pro komplexů vyššího komplexů vyššího řádu charakterizaci z transgenního transkripčních druhů, z různých tkání a/nebo různých buněčných typů.
řádu získaných izolovaných od různých
Fúzni protein TBP a transgenní zvíře podle vynálezu mohou být tedy • · • · ·♦· · použity pro izolaci a charakterizaci jednotlivých proteinů, jako jsou TAFs a faktory interagujici s TAF, které jsou sdruženy v různé komplexy vyššího řádu. Například proteiny spojené v konkrétním transkripčním komplexu vyššího řádu mohou být disociovány a separovány tak, že mohou být identifikovány jednotlivé TAFs a faktory sdružené s TAF. Složení TAFs a faktorů interagu j i cl ch s TAF se v různých komplexech vyššího řádu do alespoň určité míry liší v závislosti na typu tkáně a/nebo buňky a/nebo vývojovém stadiu a/nebo transgenu, který je exprimován.
TAFs a faktory interagujici s TAF, zejména tkáňově charakterizovány a pro mohou být rychle stupeň asociace specifické faktory, které již byly které již existují protilátky, identifikovány a může u nich být s transkripčními komplexy. Příkladem toho I/OCA-B, určen je faktor Bobaktivátor který je považován za zodpovědný za aktivaci
M., et al.
1996, EMBO, specifický koomezenou na B buňky 15, 2781-2790). Ačkoliv tkáňově bez vnitřní kapacity všudypřítomné faktory vázající DNxA
Oct, tkáňově a požadavku pro téměř omezený výskyt tohoto faktoru propůjčuje B buňce specifickou transkripční aktivaci prostřednictvím mechanismu protein-protein.
Dále, nové TAFs a faktory TAFs a faktory interagujici specifické a/nebo specifické interagujici s s TAF, které pro buněčný
TAF, j sou typ zejména tkáňově a/nebo specifické pro vývojové stadium a/nebo specifické pro buněčný komplexu cyklus, mohou být identifikovány vyššího řádu. Jak je zmíněno v transkripčním výše, existuje hoj nost dat, která silně svědčí pro to, že mnoho tkáňově specifických faktorů vázajících zesilovač je schopno projevit vliv, a tudíž tkáňovou specifitu, na transkripční aktivitu genu. Mohou být proto identifikovány „jedinečné • <t ···· faktory, které jsou tkáňově specifické, specifické pro buněčný typ, specifické pro buněčný cyklus, specifické pro vývojové stadium, které regulují specifickou expresi genů.
Tento „univerzální transgenní systém dále skýtá výkonný nástroj pro zkoumáni stupně, do kterého se takové TAFs a faktory interagující s TAF (např. ko-aktivátory) spojují s TBP a/nebo TAFs a transkripčním komplexem v řadě tkání a buněčných typů.
Vynález se také týká způsobu identifikace a charakterizace různých transkripčních komplexů vyššího řádu, kdy je z transgenního zvířete izolován TBP s epitopovou značkou, k němuž jsou připojeny transkripčni komplexy vyššího řádu. Způsob charakterizace složeni různých transkripčních komplexů vyššího řádu může například obsahovat a) zavedení transgenu podle vynálezu do zvířete kromě člověka, b) izolaci TBP s epitopovou značkou z různých zvířecích tkání a/nebo různých buněčných typů zvířete, volitelně v odlišných vývojových stadiích zvířete a c) určení složení transkripčních komplexů vyššího řádu.
Jeden způsob izolace transkripčního komplexu vyššího řádu z transgenního zvířete kromě člověka obsahuje afinitni purifikaci za použití alespoň jedné epitopové značky připojené k TBP. Výhodně jsou transkripčni komplex vyššího řádu a TAFs a faktory interagující s TAF sdružené v tomto komplexu purifikovány společně, když je izolován TBP s epitopovou značkou. Například transkripčni komplex vyššího řádu může být izolován, když je purifikován TBP s epitopovou značkou navázáním jednoho z jeho epitopů, výhodně epitopové značky, k látce, ke které se epitop váže specificky. Tato látka může být například Ni2+ kolona (ke které se váže epitop His) nebo protilátky, např. protilátky anti-HA (vážou epitop HA) nebo protilátky, které se vážou k epitopu TBP
·· » · • • 4 • · • ·· • · • · ·«·· * ··· A · • · ·· • • ·
• • • · · • • ··· • •
• • • · • • • •
···· ···· ·· ··* *0 • ·
s epitopovou značkou, se sekvenci s identifikačním číslem 17 nebo její částí (např. epitop sekvence s identifikačním číslem 17).
Vynález se také týká způsobu identifikace nového a/nebo specifického TAF a/nebo faktoru interagujičího s TAF. Transkripční komplex vyššího řádu je výhodně izolován z transgenního zvířete podle vynálezu. Tento způsob může například zahrnovat a) zavedení transgenu podle vynálezu do zvířete kromě člověka, b) izolaci TBP s epitopovou značkou z určité zvířecí tkáně a/nebo určitého buněčného typu zvířete, volitelně v určitém vývojovém stadiu zvířete a c) disociace a separace TAF a/nebo faktoru interagujicího s TAF sdruženého s TBP s epitopovou značkou v transkripční komplex vyššího řádu a d) a je-li to nezbytné, také určení aminokyselinové sekvence TAF a/nebo faktoru interagujicího s TAF.
Kromě potvrzení již známých mechanismů má transgenní model výhodu proti současným systémům buněčných kultur v tom, že vede k nalézání a charakterizaci nových faktorů sdružených s TAF.
Jak je zmíněno výše, proteiny
TAFs, které byly do současnosti afinitně společně purifikovány, pocházej i ze studií na HeLa buňkách a kvasinkách.
Byly také nalezeny cDNA pro TAF dalších organismů, ale metodami testování interakčních knihoven, což je časově náročné. Fakt, že transgenní model zahrnuje „celý organismus, činí tento univerzální transgenní systém obzvláště vhodný k rozpoznání nových tkáňově specifických aktivačních prvků také proto, že zůstává velmi „blízko ke skutečnému procesu transkripce in vivo.
Je jasné, že takové transgenní zvíře exprimující značený TBP, např. myš, by bylo schopné přispět k oblasti vývoje léků. Značný farmaceutický zájem může být přisouzen • · · ···· · ··· • · ·· · · · ···· · • · · · · ··· ········ ·· ··· ·♦ ·· jakýmkoliv „jedinečným faktorům tkáňově specifickým, specifickým pro buněčný typ, specifickým pro buněčný cyklus, specifickým pro vývojové stadium (TAFs, faktory interagujíci s TAF), určitých genových transkripčních komplexů, obzvláště jestliže se jedná o gen mající vztah k nemoci. Identifikace a charakterizace „klíčových TAFs a faktorů interagujících s TAF, které jsou zapojeny v transkripčni kontrole jednoho nebo několika genů majících vztah k nemoci, je platná strategie pro vyvinutí léčivých sloučenin, které zmirňují takové genetické nemoci. Jakmile byl jednou takový TAF nebo faktor interagujíci s TAF charakterizován a klonován, může být podniknut jakýkoliv počet testovacích postupů, aby se identifikovaly molekulární druhy/látky, které specificky interaguj! s TAF nebo faktorem sdruženým s TAF. Farmaceuticky použitelný druh molekuly nebo látka by byla ta, která zesiluje nebo potlačuje přirozenou aktivitu TAF nebo faktoru interagujícího s TAF in vitro a/nebo in vivo, a tím umožní léčebně ovlivnit příslušný gen.
Identifikované TAFs a faktory interagujíci s TAF mohou být poté také použity jako nástroje v biochemii a v molekulární biologii, například takové proteiny z transgenních zvířat kromě člověka mohou být použity jako sondy pro izolaci odpovídajících lidských TAFs a faktorů interagujících s TAF nebo jejich cDNA. Lidské TAFs a faktory interagujíci s TAF mohou být poté také použity pro testování vysoce specifických nových léků.
Předkládaný vynález je dále detailněji popsán v následujících neomezujících příkladech.
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
Vytvoření transgenních zvířat
Možné zdroje zvířat:
Zvířata vhodná pro transgenní pokusy byla získána ze standardních komerčních zdrojů, Charles River (Wilmington, MA) . Taconic (Germantown, NY), a The Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine). Myši B6SJL/F1 byly použity pro výběr embrya a přenos. Samci B6SJL/F1 mohou být použity pro páření a vazektomovaní chovní samci „Swiss použiti pro stimulaci pseudogravidity.
Transgenní myši:
U samic myší starých šest superovulace injekcí týdnů je vyvolána cm3, intraperitoneálně) gonadotropinu ze séra březí klisny (PMSG, např. Sigma, Saint
Louis, Missouri, později injekcí
USA), která 5 IU (0,1 cm3, je choriového gonadotropinu (hCG, umístěny k samcům okamžitě po injekci hCG. Dvacet jedna hodin po podání hCG v C02 nebo dislokací se získají embrya, jsou spářené samice usmrceny krční páteře a z vyříznutých která se umístí do živného zadušením vej covodů média M2 (např. Sigma). Buňky obklopující ovariálni vyklenutí se odstraní hyaluronidázou (1 mg/ml). Pronukleární embrya jsou poté omyta a umístěna v živném médiu M16 (např. Sigma) a poté vložena do inkubátoru s teplotou 37 °C se zvlhčovanou atmosférou v 5% CO2, O2 a 90% N2 až do doby injekce.
€· ···
Přiklad 2
Příprava konstruktů pro transfekce a mikroinjekce
DNA klony pro mikroinjekce byly štěpeny příslušnými enzymy, DNA klony obsahující transgen MT-hTBP (dvojitě značený, podle sekvence v tabulce 3) s Clal a BamHI nebo transgen EF-hTBP (dvojitě značený, podle sekvence v tabulce 2) s EcoRI/EcoRI a fragmenty DNA o příslušné velikosti byly elektroforeticky rozděleny na 1% agarózových gelech v pufru ΤΒΞ (Sambrook et al·., 1989). Pásy DNA se vizualizovaly obarvením ethidiumbromidem, vyřízly a umístily do dialyzačních váčků obsahujících 0,3 M octan sodný, pH 7,0. DNA se elektricky eluovala v dialyzačních váčcích, extrahovala směsí fenolu a chloroformu (1:1) a precipitovala dvěma objemy etanolu. DNA se opět rozpustila v pufru TE (10 mM Tris, pH 7,4, a 1 mM EDTA) a purifikovala na koloně DEAE sephacel (např. Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Kolona je nejdříve naplněna 0,5 ml pufru s vysokým obsahem soli (1,5 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4, a 1 mM EDTA), pak následuje promytí se 3 ml pufru s nízkým obsahem soli (0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, a 1 mM EDTA) . Roztoky DNA jsou solí upraveny na koncentraci 0,15 M NaCl, a poté se nechají protékat kolonou, přičemž se DNA naváže na matrix kolony. Po třech promytích se 3 ml pufru s nízkým obsahem soli je DNA eluována poměrnými částmi 4x 0,3 ml pufru s vysokým obsahem soli a precipitována dvěma objemy etanolu. Frakce byly sloučeny rozpuštěním ve 200 μΐ TE, jednou extrahovány směsí fenol-chloroform, dvakrát chloroformem, a poté byla DNA precipitována přes noc etanolem. DNA se resuspendovala v pufru TE pro mikroinjekce (10 mM Tris, pH 7,4, 0,1 mM EDTA) a koncentrace DNA se upravila na 2 ng/μΐ a vizualizovala proti známým standardům
DNA elektroforetickým rozdělením na agarózovém gelu.
Transgenní DNA (MT-hTBP nebo EF-hTBP) purifikovaná v pufru pro
Mikrojehly a držící byla rozpuštěna v koncentraci 2 ng/μΐ. nasazeny na mikropipetový tahač Flaming Brown, pomocí DEAE mikroinj ekce pipety byly např. Model
P87 (Sutter Inst. Co.). Držící pipety byly poté zlomeny a konce zataveny ohněm v mikrovýhni typu deFonbrune (např. Technical Product Inst. Inc) . Pipety byly poté připevněny na mikromanipulátory (např. Leitz), které byly připojeny k mikroskopu Zeiss Axiovert® 135. Injekční pipeta naplněná vzduchem (např. Medical Systém Corp.) byla naplněna špičkou roztokem DNA. Embrya ve skupinách po 40-50 byla umístěna ve 200 μΐ média M2 pod silikonový olej pro mikromanipulaci. Embryo bylo nastaveno a drženo držící pipetou, a poté byla vložena injekční pipeta do pronukleu, který byl injekční pipetě nejblíže. Injekce se sledovala zduřením pronukleu. Po injekci byla skupina embryí umístěna v médiu M16 až do přenosu do přijímajících samic.
Příklad 3
Přenos embrya mikroinjekcí
Náhodně ovulující dospělé samice myší jsou spárovány s vazektomovanými samci. Pro tento účel může být použit kmen Swiss Webster nebo jiný srovnatelný kmen. Přijímající samice jsou spářeny v tutéž dobu jako dárcovské samice. V čase přenosu embrya jsou přijímající samice podrobeny anestezii intraperitoneální injekcí 0,015 ml 2,5% avertinu na 1 g «# · · · · · · · · ·· · · ···· ··· ···· • · · · · · · · · · · • · · · · · · ···· · • · ♦ · · · · · ···· ···· ·· ··♦ ·* *· tělesné hmotnosti. Vejcovody jsou odkryty jednou incizi v dorzálni střední čáře. Poté je provedena incize přes tělní stěnu přímo nad vejcovodem. Pak je protržen ovariální váček hodinářskou pinzetou. Embrya, která mají být přenesena, jsou umístěna v médiu M16 a poté ve špičce přenášející pipety (asi 10-12 embryí). špička pipety je vložena do infundibula a embrya jsou přenesena. Po přenosu je incize uzavřena dvěma stehy a kůže sesvorkována. Příjemkyně se zotavovala tři hodiny na vyhřívané podložce a pak byla umístěna do kolonie do doby porodu.
Celkem bylo mikroinjikováno 469 pronukleárních embryí pro MT-hTBP a narodilo se 170 mláďat a celkem 407 pronukleárních embryí pro EF-hTBP poskytlo 76 mláďat.
Příklad 4
Detekce transgenní DNA v zakladatelských myších (tj.
transgenních myších první generace)
4a) Extrakce DNA:
Genomová DNA případných zakladatelských myší byla extrahována z malého kousku ocasní tkáně (přibližně 1 cm) odříznuté potomku starému 2-4 týdny. Ocasní řezy se inkubovaly přes noc na třepačce v 500-750 μΐ pufru pro ocasní řezy (pufr pro ocasní řezy: 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% SDS, 30 μρ/πιΐ Proteinase K) . Ke každému vzorku ocasu byl následně přidán stejný objem směsi fenol/chloroform/ isoamylalkohol (25:24:1). Vzorky se jemně protřepaly ručně nebo automaticky míchadlem Vortex s nízkými obrátkami. Všechny vzorky se stočily 10 minut ve stolní centrifuze. Vodná fáze se přenesla do 5ml polypropylénové zkumavky (např. zkumavky Falcon®). Do zkumavky se pomalu přidával (po kapkách) stejný objem etanolu, aby umožnil DNA postupně precipitovat. Druhý objem etanolu se přidal prudce, aby promíchal obsah zkumavky. Zkumavky byly poté několikrát převráceny pro zajištění promíchání. DNA se poté namotala na neostrou pipetovou špičku (špičku pro sekvenační gel) a přenesla se do samostatné jamky na mikrotitrační destičce. Poté se DNA nechala schnout na vzduchu po 4 hodiny. Pak se přidalo 200 μΐ Ix TE do každé jamky (Ix TE: 10 mM Tris, pH 7,4, 1 mM EDTA) . Genomová DNA se poté ponechala rozpouštět po dobu 15-30 minut při teplotě místnosti, pak se jemně promíchala opatrným pipetováním. Před testováním metodou PCR (polymerázová řetězová reakce) byly mikrotitrační destičky často skladovány v -20 °C. Před testováním se odebralo 10 μΐ a naštěpilo s EcoRI (např. 10 μΐ genomové DNA, 2 μΐ lOx pufr pro EcoRI, 7 μΐ H2O, 1 μΐ EcoRI, enzym a pufr od Boehringer Mannheim, Mannheim, Německo).
4b) Reakce PCR:
Naštěpená genomová DNA byla naředěna vodou v poměru 1:3. Vzorky byly poté zahřívány ve 100 °C v tepelném bloku po dobu 10 minut. Pak se použily 2 μΐ pro reakce PCR. Reakce se prováděly v objemu 50 μΐ, který se skládal z 2 μΐ genomové DNA, lx reakčního pufru, 1,5 mM MgCl2, 0,8 μΜ oligonukleotidového předního („forward) primeru, 0,8 μΜ oligonukleotidového zpětného („reverse”) primeru, 8 μΐ směsi nukleotidů obsahující každý nukleotid v 0,2 mM koncentraci (dATP, dCTP, dTTP a dGTP) a 2,5 jednotky Taq polymerázy. PCR se prováděla za použití např. enzymu a pufru AmpliTaq® od firmy Perkin Elmer (Perkin Elmer Norwalk, Connecticut, USA).
Detekce transgenu MT-hTBP se prováděla za použití oligonukleotidového předního primeru („sense primer) 5' GGA GCA ACC GCC TGC TGG GTG C 3' (sekvence s identifikačním
···· ····
nukleotidy. Derivát DNA může být také sůl, výhodně fyziologická tolerovatelná sůl.
Transgen obsahuje jednu nebo více sekvenci DNA, které kóduji jeden, dva, tři, čtyři, pět nebo více epitopových značek. Transgen výhodně obsahuje DNA, která kóduje dvě epitopové značky. DNA kódující jednotlivé epitopové značky může být lokalizována na 5' a/nebo 3' konci DNA, která kóduje TBP, a/nebo v jakékoliv vhodné pozici uprostřed sekvence DNA, která kóduje TBP. DNA kódující jednotlivé epitopové značky může být oddělena a/nebo seřazena za sebou nebo může být přímo sousedící.
Jako epitopová značka může být použit jakýkoliv přirozený nebo syntetický peptid. Každá epitopová značka je exprimována jako fúzní protein s TBP, epitopová značka může být např. spojena s TBP přímo nebo vmezeřeným peptidem. Epitopová značka by měla výhodně nabízet možnost pro afinitní purifikaci TBP nebo fúzniho proteinu a pro afinitní purifikaci proteinů, které jsou sdruženy s TBP nebo fúzním proteinem, jako TAFs a faktory interagující s TAF. Kromě toho by epitopová značka neměla zničit funkční aktivitu TBP, když je exprimována jako fúzní protein s TBP. Pro tento účel jsou výhodně použity jako epitopové značky krátké peptidy. Mohou obsahovat asi 1 až 50 nebo více aminokyselin, jsou používány zejména peptidy, které obsahují 5 až 15 aminokyselin. Neomezující příklady peptidů, které mohou být použity jako epitopové značky, jsou epitop-FLAG, epitop-HA, násobné histidinové zbytky (6 až 10 nebo více histidinových zbytků) (značka His), značka Myc (Stone et al., 1996, Nátuře, 384, 129-134), streptavidinové značky a další. Pro tento účel mohou být použity také kratší peptidy přirozených epitopů. Například použití epitopu HA zahrnuje použití epitopů „MGYPYDVPDYA” (sekvence s identifikačním číslem 2), číslem 5) a oligonukleotidového zpětného primeru („antisense primer) 5' CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG 3' (sekvence s identifikačním číslem 6).
Detekce transgenů EF-hTBP se prováděla za použití oligonukleotidového předního primeru 5' GGA GAC TGA AGT TAG GCC AGC 3' (sekvence s identifikačním číslem 7). Byl použit stejný zpětný primer, jako pro detekci MT-hTBP (5' CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG 3') .
Teplotní cyklování se provádělo za použití
automatického tepelného cyklovače (např. od firmy
Stratagene, La Jolla, CA, USA).
Teploty v j ednotlivých cyklech byly:
cyklus 1: 94 °C, 5 min - 60 °C, 3 min - 72 °c, 2 min
cyklus 2-25: 94 °C, 1 min - 60 °C, 2 min - 72 °c, 3 min
cyklus 26: 94 °C, 1 min - 60 °C, 2 min - 72 °c, 5 min
nebo
cyklus 1-40: 95 °C, 2 min - 55 °C, 1 min - 72 °c, 1 min
Výskyt amplifikovaných produktů se zjišťoval provedením
standardní elektroforézy v agarózovém gelu (např. 1,2-1,5% agaróza) a obarvením gelu ethidiumbromidem pro vizualizaci DNA v UV světle.
Pozitivní vzorky MT-hTBP byly rozeznány podle výskytu amplifikovaného produktu DNA o velikosti asi 580 bp. Pozitivní vzorky EF-hTBP tvořily amplifikovaný fragment DNA o velikosti asi 500 bp.
Analýza DNA ze 170 mláďat na MT-hTBP reakcí PCR ukázala, že 35 vzorků genomové DNA bylo pozitivní na výskyt transgenů. Analýza genomové DNA ze 76 EF-hTBP mláďat analýzou PCR ukázala, že transgen EF-hTBP byl obsažen v 9 myších.
4d) Rozvoj transgenního modelu:
Zakladatelé Go s pozitivní DNA byli kříženi s netransgenními protějšky kmene B6SJL a výsledné vrhy byly genotypizovány pomocí PCR. Potomci Gi byli použiti pro kontinuální křížení a udržováni jednotlivých linií a pro další analýzy mRNA a exprese proteinů.
Příklad 5
Detekce transgenní mRNA „protékáním testem pomocí SI nukleázy:
5a) Charakteristika:
Byly vytvořeny oligonukleotidy komplementární k 5' konci a 3' konci transgenního transkriptu:
Sekvence 5' oligonukleotidu („sense primer) (sekvence s identifikačním číslem 8): 5'GCGGCACCAGGCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCCCATGA CTGCGTAATGCGGTCATGACGCTTT3'
Sekvence 3' oligonukleotidu („antisense primer) (sekvence s identifikačním číslem 9): 5'GAAGGGGGTGGGGGAGGCAAGGGTACATGAGAGCCATTACGTCGTCTTCCT GAATCCCTTTAGCCGCTTTGCTCG3'
Podtržené oblasti jsou nehybridizuj ici sekvence. 40 ng oligonukleotidu bylo značeno na 5' konci s (32P gama)ATP (5000 cpm/mM) za použití T4 polynukleotidkinázy a pufru např. od firmy Boehringer Mannheim (Mannheim). Reakce se prováděla v 50 μΐ reakčního objemu ve 30 °C po 1 hodinu. Označený oligonukleotid byl oddělen od nezačleněného (32P gama)ATP za použití vylučovací chromatografie (např. Push-Columns®, Stratagene, La Jolla, CA, USA).
• ·
5b) Indukce promotoru:
Před analýzou RNA bylo nezbytné indukovat myši MT-hTBP, protože promotor je aktivován v přítomnosti Zn2+. Každé myši MT-hTBP byly podány dvě intraperitoneálni injekce ZnSO4 v H2O 18 hodin a opět 4 hodiny před odstraněním jater (dávka byla 0,1 mg ZnSO4/10 g hmotnosti myši).
5b) Extrakce RNA:
Celková RNA se extrahovala z 1-5 g tkáně za použití komerčně dostupné reagencie Trizol (např. Gibco-BRL, Paisly, UK) . Tkáň se homogenizovala pomocí Ultra-Turrax v 5 ml roztoku Trizol ve 12ml propylénové zkumavce (např. zkumavce Falcon®). Přidal se 1 ml chloroformu a zkumavky se uzavřely víčkem a důkladně ručně protřepaly po dobu 15 s. Roztoky se inkubovaly při teplotě místnosti po 3 min, a poté se stočily ve 12 000 x g po 15 minut ve 4 °C v rotoru Sorvall SS-34. Supernatant se přenesl do nové zkumavky, přidalo se 2,5 ml izopropanolu a promísilo. Následovala inkubace po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Vzorky se stočily ve 12 000 x g po 10 minut ve 4 °C. Supernatant se odstranil a peleta RNA se omyla 5 ml 75% etanolu. Vzorky se promíchaly a stočily v 7 500 x g po 10 minut. Pelety RNA se resuspendovaly ve vodě bez RNázy a následně kvantifikovaly měřením absorbance ve 260 nm.
5d) „Protekční test pomocí S1 nukleázy:
Stejná množství RNA (10-20 ,ug) byla doplněna na 100 μΐ vodou bez RNázy. Bylo přidáno 50 000-150 000 cpm značeného
oligonukleotidu (0,1-1 ng, v závislosti na účinnosti
značení). Směs RNA/oligonukleotid se precipitovala 0,3 M
octanem sodným a etanolem. Peleta RNA/oligonukleotid se
opláchla a usušila na vzduchu. Přidalo se 23 μΐ hybridizačního roztoku (80% formamid, 10 mM PIPES, pH 6,4 (Sambrook et al., 1989), 1 mM EDTA, 0,05% SDS). Reakční směs se promíchala a denaturovala 20 minut v 65 °C, a poté se ke každému vzorku přidaly 2 μΐ 5 M NaCl v 65 °C. Vzorky se inkubovaly 1 další hodinu v 65 °C ve vodní lázni, a poté byla teplota lázně nastavena na 37 °C. Postupné sníženi teploty z 65 °C na 37 °C (přes noc) usnadnilo specifickou hybridizaci oligonukleotid-mRNA. Příští den se ke každému vzorku přidalo 300 μΐ pufru Sl (pufr Sl: 167 U/ml Sl nukleázy (např. Gibco BRL, Paisly, UK), 0,3 M NaCl, 30 mM NaOAc (pH 4,5), 3 mM ZnSO4) · Vzorky se inkubovaly 1 hodinu při teplotě místnosti, poté se přidal 1 ml etanolu (studeného), aby se precipitovala všechna nukleová kyselina. Peleta se poté stočila a omyla a krátce osušila ve vakuu se peleta resuspendovala ve formamid, 0,01 % bromfenolová xylencyanol, lx dobu minut
TBE). Vzorky se zahřívaly před tím, než se nanesly a separovaly denaturačním dle velikosti močovina) za použití elektroforézy s tenkým polyakrylamidovým gelem.
Autoradiografie suchého gelu usnadnila detekci chráněných nenaštěpených pásů.
Ze 35 zakladatelských zvířat pro MT-hTBP vykazovalo 7 zakladatelských zvířat detekovatelné hladiny mRNA při analýze Sl protekčním testem. Pro EF-hTBP ukazovala 3 zakladatelská zvířata při analýze Sl detekovatelnou mRNA.
Přiklad 6
Detekce transgenni mRNA northernovým přenosem
6a) Syntéza hybridizační sondy ampiifikací PCR z TBP a značeni sondy TBP:
Byly navrženy a syntetizovány oligonukleotidy/primery vymezující fragment o velikosti 498 bp z dvojitě značeného konstruktu hTBP.
Přední oligonukleotid začínal 10 baží po směru transkripce („downstream) od startovacího místa „AUG (místo ATG v tabulce 1). Sekvence tohoto „sense primeru byla: sekvence s identifikačním číslem 10: 5'CCCTATGACGTCCCGGATTACG3'.
Zpětný primer končil 507 bp po směru transkripce od startovacího místa „AUG (místo ATG v tabulce 1) . Sekvence tohoto „antisense primeru byla: sekvence s identifikačním číslem 11: 5'GTGGAGTGGTGCCCGGCAAGGG3'.
Reakce PCR se prováděly s 0,2 μα pAG-17, 0,5 mM MgCl2, 0,8 μΜ každého primeru, lx pufr PCR (Perkin-Elmer), 0,2 mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP a 2,5 U enzymu AmpliTaq® (Perkin Elmer Norwalk, Connecticut, USA).
Program teplotního cyklovače: cykly 1-35: 94 °C, 2 min - 55 °C, 1 min - 72 °C, 1 min, poté 10 minut v 72 °C, pak uskladnění ve 4 °C. Amplifikované pásy byly purifikovány z 0,7% agarózového gelu.
Sonda TBP-DNA byla značena pomocí náhodných primeru a enzymu Klenowova fragmentu ze značící soupravy Megaprime® (Amersham, UK) . 25-50 ng DNA sondy se smísilo s 5 μΐ náhodných hexamerových primeru (např. Amersham) a 20 μΐ H2O.
• · · · • ·
DNA se denaturovala ve 100 °C po dobu 5 minut. Značící směs byla doplněna do konečného objemu 50 μΐ lx reakčním pufrem, Ix dATP, lx dTTP, lx dGTP, 4 μΐ 3000 Ci/mmol alfa-32P dCTP (např. Amersham) a 2 U Klenowova enzymu. Reakce se ponechala při teplotě místnosti po 1 hodinu. Značená DNA se oddělila od nezačleněných nukleotidů použitím vylučovací chromatografie (např. Push-Columns®).
6b) Gelová elektroforéza a přenos
10-20 μα celkové RNA bylo precipitováno etanolem, peleta byla denaturována 10 minut v 65 °C v RNA nanášecim pufru (65% formamid, 20% formaldehyd (37% roztok), lx pufr MOPS (Sambrook et al., 1989), 5% glycerol, 0,01% bromfer.olová modř, 0,01% xylencyanol, 0,1 mg/ml ethidiumbromid). RNA byla rozdělena dle velikosti na 1% agarózovém gelu obsahujícím 18% formaldehyd (37% roztok) a lx MOPS jako pufr pro elektroforézu (40 mM MOPS, pH 7,0, 10 mM octan sodný, 1 mM EDTA). Gely se nechaly běžet pomalu přes noc při 1 V/cm v lx MOPS jako pufru pro elektroforézu obsahujícím 18% formaldehyd (37% roztok). Gely se poté ošetřily v 0,05 M NaOH/1,5 M NaCl po dobu 30 minut, následováno 20 minutami v 0,5 M Tris (pH 7,4)/1,5 M NaCl. RNA se přenesla na nylonovou membránu (např. Hybond-N+, Amersham, UK) za použití techniky kapilárního přenosu. RNA navázaná na membránu byla fixována např. UV světlem za
použití přístroje Stratalinker® USA) . (Stratagene, La Jolla, CA,
6c) Hybridizace a odmývání
Prehybridizace se prováděla například v pufru „Rapid-
Hyb (Amersham, UK) v rotační hybridizační pícce (např.
Hybaid) v 65 °C po dobu 1-2 hodin. Hybridizace se prováděla ·· ·· 99 9999 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 · 9 · ·· · ··· • · 9 9 9 9 9 99 9 9 9
9 · 9 9 9 9 9
999 9999 99 999 ·· ·· například v 6-10 ml pufru „Rapid-Hyb obsahujícím 10s-10xl06 cpm denaturované sondy v 65 °C po dobu 2-3 hodiny. Membrána se odmyla dvakrát při teplotě místnosti (10 minut/odmytí) v 2x SSC/0,1% SDS (lx SSC: 150 mM NaCl, 15 mM citrát sodný, pH 7,0). Membrána se dále odmyla 2x v 65 °C (15 minut/odmytí) v lx SSC/0,1% SDS. Další dvě odmytí se prováděla v 65 °C po dobu 15 minut v 0,5x SSC/0,1% SDS, následováno 1 nebo 2 konečnými odmytími (bylo-li nutné) po dobu 15 minut/odmytí v 65 °C 0,2x SSC/0,1% SDS. Provedla se autoradiografie odmyté membrány.
Příklad 7:
Tvorba polyklonální protilátky specifické pro značený hTBP
Všeobecná strategie:
Mezi myším a lidským TBP existuje významná sekvenční homologie. Proto bude většina komerčně dostupných protilátek zkříženě reagovat a tudíž detekovat jak endogenní, tak transgenní TBP. Aby se rozlišilo mezi těmito dvěma, vytvořila se polyklonální protilátka proti značené oblasti transgenního TBP (odpovídající štěpnému místu trombinu a značce His značeného hTBP): sekvence s identifikačním číslem 12: H2N--MGSSHHHHHHSSGLVPRGC—COOH.
Tento peptid byl připojen k proteinovému nosiči a injikován do králíků za použití standardních laboratorních protokolů. V pravidelných intervalech se odebíralo sérum a testovalo se na titr protilátek anti-hTBP za použití testů
ELISA.
·· ···♦
Přiklad 8
Detekce transgenniho proteinu westernovým přenosem:
8a) Příprava jaderných extraktů z jater:
páteře a játra byla podrobeny 2 intraperitoneálním Myši byly usmrceny odstraněna. Játra dislokací krční byla okamžitě homogenizována ml homogenizačního puf ru sacharóza, mM
HEPES, pH 7,4 (Sambrook et al·., mM KC1, glycerol, 0,15 mM spermin,
0,5 mM spermidin, na 25
Po homogenizaci byl objem
Homogenát byl opatrně navrstven na doplněn ml ml tímtéž pufrem. homogenizačního pufru do centrifugačních zkumavek, např.
do zkumavek Ultra-Clear SW-28® (Beckman, Palo Alto,
CA, USA) . Vzorky byly stočeny v rotoru SW-28 1 hodinu v 25 000 rpm (4 °C) . Supernatant byl opatrně odstraněn a peletovaná jádra byla resuspendována ve 200 μΐ pufru NEXB (20 mM HEPES, pH 7,9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, mM DTT, 1 mM PMSF, 10% glycerol, 2 μς/πιΐ aprotininu, μα/ml leupeptinu, 2 μς/ιηΐ pepstatinu-A) . Resuspendovaná jádra se inkubovala na ledu po 15-30 minut s častým mícháním pomocí pipetování. Vzorky byly podrobeny 5 cyklům zmrazení/rozmrazení v lázni suchý led/etanol a vodní lázni 37 °C. Poté se vzorky stočily 30 s ve vysokých otáčkách a v supernatantu se měřil obsah proteinů, např. s reagencií proteinového testu (např. Bio-Rad, Hercules, CA, USA) .
8b) Elektroforéza a přenos:
20-75 μρ extraktu bylo separováno dle velikosti denaturační gelovou elektroforézou. Analytický gel: 10% akrylamid (poměr akrylamid:bis-akrylamid je 1:37), 0,1% SDS, ·· ··· · ·· ·· ···· · · · ♦ · · · • · · · · ·· · · · · • · · · · · · ···* · • · ·· · · · · ········ ·· ··· 99 99
375 mM Tris, pH 8,8. Srovnávací gel: 5% akrylamid, 0,1% SDS, 125 mM Tris, pH 8,3. Pufr pro elektroforézu: 25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycin, 0,1% SDS. Protein byl přenesen na čistě nitrocelulózovou membránu (např. Bio-Rad) přístrojem pro polosuchý přenos (např. Hoefer, San Francisco, CA, USA) za použití modifikovaného přenosového pufru dle Bjerruma (48 mM Tris, 39 mM glycin, 10% metanol, 0,0375% SDS, pH 9,2). Přenos se ponechal běžet při 0,8 mA/cm po 2-4 hodiny.
8c) Imunodetekce:
Membrány byly blokovány 1-2 hodiny při teplotě místnosti v lx TBS (20 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl) s 3% želatinou (např. Bio-Rad) na laboratorní kývací plošině. Membrány se odmývaly 10 minut v lx TTBS (lx TBS s 0,05% Tween-20) při teplotě místnosti. Hybridizace s primární protilátkou v 1% želatině/1 x TTBS se prováděla 4 hodiny až přes noc na kývací plošině při teplotě místnosti. Membrány se odmývaly 2-3krát (5 minut/odmytí) s lx TTBS. Hybridizace se sekundární protilátkou spojenou s alkalickou fosfatázou (AP) v 1% želatině/1 x TTBS se prováděla po 2-3 hodiny. Membrány se opět odmývaly 2-3krát (5 minut/odmytí) s lx TTBS při teplotě místnosti, následováno 5 minutovým odmytím v pufru lx TBS. Poté byly membrány inkubovány v lx vyvolávacím pufru (např. Bio-Rad) obsahujícím reagencie NBT/BCIP při teplotě místnosti, dokud se dostatečně neobjevily pásy. Reakce AP byla zastavena odmytím H2O.
·· ·· ·· φφφφ ·· ·· • · · · φφφ ΦΦΦ· • φ · ···· · · ·· • φ · φ φ φφφφ··· e · «·· φφφ
ΦΦΦΦ φφφφ ·· ··· ·· ··
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1...12 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Val 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1...11 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
5 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1...10 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 15 10 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 9 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1...9 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GGAGCAACCG CCTGCTGGGT GC 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE-.SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
CCTGTGTTGC CTGCTGGGAC G 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE-.SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
GGAGACTGAA GTTAGGCCAG C 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 76 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární • · • · ··· · (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...76 (xi) POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
GCGGCACCAG GCCGCTGCTG TGATGATGAT GATGATGGCT GCTGCCCATG 50 ACTGCGTAAT GCGGTCATGA CGCTTT 76 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 75 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...75 (xi) POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
GAAGGGGGTG GGGGAGGCAA GGGTACATGA GAGCCATTAC GTCGTCTTCC 50
TGAATCCCTT TAGCCGCTTT GCTCG 75 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi)POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
CCCTATGACG TCCCGGATTA CG
O '-'i • · · · · · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY': cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi)POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:
GTGGAGTGGT GCCCGGCAAG GG 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1...19 (xi)POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val 15 10 15
Pro Arg Gly Cys (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1310 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární
• · ·« 99 ·· ··
• • · • • • • · • •
9 • • • ··· • · • ·
• • « · • • ··· • «1
• • • • • • •
·· 9 · · ·· • ·
(ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...1310 (xi)POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM
13:
CCATGGGCTA TCCCTATGAC GTCCCGGATT ACGCAGTCAT GGGCAGCAGC CATCATCATC 60
ATCATCACAG CAGCGGCCTG GTGCCGCGCG GCAGCCATAT GGATCAGAAC AACAGCCTGC 120
CACCTTACGC TCAGGGCTTG GCCTCCCCTC AGGGTGCCAT GACTCCCGGA ATCCCTATCT 180
TTAGTCCAAT GATGCCTTAT GGCACTGGAC TGACCCCACA GCCTATTCAG AACACCAATA 240
GTCTGTCTAT TTTGGAAGAG CAACAAAGGC AGCAGCAGCA ACAACAACAG CAGCAGCAGC 300
AGCAGCAGCA GCAGCAACAG CAACAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC 360
AGCAGCAGCA GCAGCAGCAA CAGGCAGTGG CAGCTGCAGC CGTTCAGCAG TCAACGTCCC 420
AGCAGGCAAC ACAGGGAACC TCAGGCCAGG CACCACAGCT CTTCCACTCA CAGACTCTCA 480
CAACTGCACC CTTGCCGGGC ACCACTCCAC TGTATCCCTC CCCCATGACT CCCATGACCC 540
CCATCACTCC TGCCACGCCA GCTTCGGAGA GTTCTGGGAT TGTACCGCAG CTGCAAAATA 600
TTGTATCCAC AGTGAATCTT GGTTGTAAAC TTGACCTAAA GACCATTGCA CTTCGTGCCC 660
GAAACGCCGA ATATAATCCC AAGCGGTTTG CTGCGGTAAT CATGAGGATA AGAGAGCCAC 720
GAACCACGGC ACTGATTTTC AGTTCTGGGA AAATGGTGTG CACAGGAGCC AAGAGTGAAG 780
AACAGTCCAG ACTGGCAGCA AGAAAATATG CTAGAGTTGT ACAGAAGTTG GGTTTTCCAG 840
CTAAGTTCTT GGACTTCAAG ATTCAGAACA TGGTGGGGAG CTGTGATGTG AAGTTTCCTA 900
TAAGGTTAGA AGGCCTTGTG CTCACCCACC AACAATTTAG TAGTTATGAG CCAGAGTTAT 960
TTCCTGGTTT AATCTACAGA ATGATCAAAC CCAGAATTGT TCTCCTTATT TTTGTTTCTG 1020
GAAAAGTTGT ATTAACAGGT GCTAAAGTCA GAGCAGAAAT TTATGAAGCA TTTGAAAACA 1080
TCTACCCTAT TCTAAAGGGA TTCAGGAAGA CGACGTAATG GCTCTCATGT ACCCTTGCCT 1140
CCCCCACCCC CTTCTTTTTT TTTTTTTAAA CAAATCAGTT TGTTTTGGTA CCTTTAAATG 1200
GTGGTGTTGT GAGAAGATGG ATGTTGAGTT GCAGGGTGTG GCACCAGGTG ATGCCCTTCT 1260
GTAAGTGCCC CTTCCGGCAT CCCGGAATTC CTGCAGCCCA ACGCGGCCGC
1310
44 ·· ·· ···» • 4 • 4
« · • · • • • 4 4 • 4
• • • • ··· 4 4 44
• • • · • • 4 • 44 4 4
• • • • • 4 4 4
4··· ···· ·· ··· ·· IP
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 4286 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...4286 (xi)POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:
GAATTCCCCT GCAGGTCACT TAGCGTTGGC CACATAGTAG GTTCTCAAAT ACTTGTTAAT 60
AAATAAGTTT GTTCGAGAAG CTGGGCAATG ATATTCTACA GCTGGAAGAA GAAACATAAT 120
GATCTAGTAA TTAGCTCAAT TAAAAATAAA CGTTCTTCTT TCCTCAGAGG AGCATTTCCC 180
AAGGCCTGCC TTGATAGCCA TCCAAAAAGG CCAAGCTCAT CCAATCTTGC CCTAGATTTA 240
TGCTAAAATG CAGTTACAAT CGATAGGATG ACAGAAAACG ACAGCACTTA TTTAAATATA 300
ATAGGCACTT ATTTAAATAG GAGAAGCTGT GACTTCATAG CAAGTGTTGG GGTTAGGAAA 360
CTGGGTGGAT AAACTTGCTG ATGCTGTAGA TCTTAGCCTC TACATGAGAT CATGTGGAAA 420
ATCTGAAAGC ATTTTAGGTT CCTTATGTTT GCAATCAAAT AACTGTACAC CTTTTAATTT 480
AAAAAGTACC ATGAGGCACA CACACACACT CGCAGGAACT TTTTGGCGTA ACAAAACTAG 540
AATTAGATCT AAAAGCTAAC TGTAGGACTG AGTCTATTCT AAACTGAAAG CCTGGACATC 600
TGGAGTACCA GGGGGAGATG ACGTGTTACG GGCTTCCATA AAAGCAGCTG GCTTTGAATG 660
GAAGGAGCCA AGAGGCCAGC ACAGGAGCGG ATTCGTCGCT TTCACGGCCA TCGAGCCGAA 720
CCTCTCGCAA GTCCGTGAGC CGTTAAGGAG GCCCCCAGTC CCGACCCTTC GCCCCAAGCC 780
CCTCGGGGTC CCCGGGCCTG GTACTCCTTG CCACACGGGA GGGGCGCGGA AGCCGGGGCG 840
GAGGAGGAGC CAACCCCGGG CTGGGCTGAG ACCCGCAGAG GAAGACGCTC TAGGGATTTG 900
TCCCGGACTA GCGAGATGGC AAGGCTGAGG ACGGGAGGCT GATTGAGAGG CGAAGGTACA 960
CCCTAATCTC AATACAACCT TTGGAGCTAA GCCAGCAATG GTAGAGGGAA GATTCTGCAC 1020
GTCCCTTCCA GGCGGCCTCC CCGTCACCAC CCCCCCCAAC CCGCCCCGAC CGGAGCTGAG 1080
• · ···· ··· ···· • · · ···· · · · · • · ·· · ·· ···· · • · ·· · ♦ · · ···· ···· ·· ··· ·· ·♦
AGTAATTCAT ACAAAAGGAC TCGCCCCTGC CTTGGGGAAT CCCAGGGACC GTCGTTAAAC 1140
TCCCACTAAC GTAGAACCCA GAGATCGCTG CGTTCCCGCC CCCTCACCCG CCCGCTCTCG 1200
TCATCACTGA GGTGGAGAAG AGCATGCGTG AGGCTCCGGT GCCCGTCAGT GGGCAGAGCG 1260
CACATCGCCC ACAGTCCCCG AGAAGTTGGG GGGAGGGGTC GGCAATTGAA CCGGTGCCTA 1320
GAGAAGGTGG CGCGGGGTAA ACTGGGAAAG TGATGTCGTG TACTGGCTCC GCCTTTTTCC 1380
CGAGGGTGGG GGAGAACCGT ATATAAGTGC AGTAGTCGCC GTGAACGTTC TTTTTCGCAA 1440
CGGGTTTGCC GCCAGAACAC AGGTAAGTGC CGTGTGTGGT TCCCGCGGGC CTGGCCTCTT 1500
TACGGGTTAT GGCCCTTGCG TGCCTTGAAT TACTTCCACG CCCCTGGCTG CAGTACGTGA 1560
TTCTTGATCC CGAGCTTCGG GTTGGAAGTG GGTGGGAGAG TTCGAGGCCT TGCGCTTAAG 1620
GAGCCCCTTC GCCTCGTGCT TGAGTTGAGG CCTGGCCTGG GCGCTGGGGC CGCCGCGTGC 1680
GAATCTGGTG GCACCTTCGC GCCTGTCTCG CTGCTTTCGA TAAGTCTCTA GCCATTTAAA 1740
ATTTTTGATG ACCTGCTGCG ACGCTTTTTT TCTGGCAAGA TAGTCTTGTA AATGCGGGCC 1800
AAGATCTGCA CACTGGTATT TCGGTTTTTG GGGCCGCGGG CGGCGACGGG GCCCGTGCGT 1860
CCCAGCGCAC ATGTTCGGCG AGGCGGGGCC TGCGAGCGCG GCCACCGAGA ATCGGACGGG 1920
GGTAGTCTCA AGCTGGCCGG CCTGCTCTGG TGCCTGGCCT CGCGCCGCCG TGTATCGCCC 1980
CGCCCTGGGC GGCAAGGCTG GCCCGGTCGG CACCAGTTGC GTGAGCGGAA AGATGGCCGC 2040
TTCCCGGCCC TGCTGCAGGG AGCTCAAAAT GGAGGACGCG GCGCTCGGGA GAGCGGGCGG 2100
GTGAGTCACC CACACAAAGG AAAAGGGCCT TTCCGTCCTC AGCCGTCGCT TCATGTGACT 2160
CCACGGAGTA CCGGGCGCCG TCCAGGCACC TCGATTAGTT CTCGAGCTTT TGGAGTACGT 2220
CGTCTTTAGG TTGGGGGGAG GGGTTTTATG CGATGGAGTT TCCCCACACT GAGTGGGTGG 2280
AGACTGAAGT TAGGCCAGCT TGGCACTTGA TGTAATTCTC CTTGGAATTT GCCCTTTTTG 2340
AGTTTGGATC TTGGTTCATT CTCAAGCCTC AGACAGTGGT TCAAAGTTTT TTTCTTCCAT 2400
TTCAGGTGTC GTGAGGAATT GCCCGGGGGA TCCATGGGCT ATCCCTATGA CGTCCCGGAT 2460
TACGCAGTCA TGGGCAGCAG CCATCATCAT CATCATCACA GCAGCGGCCT GGTGCCGCGC 2520
GGCAGCCATA TGGATCAGAA CAACAGCCTG CCACCTTACG CTCAGGGCTT GGCCTCCCCT 2580
CAGGGTGCCA TGACTCCCGG AATCCCTATC TTTAGTCCAA TGATGCCTTA TGGCACTGGA 2640
CTGACCCCAC AGCCTATTCA GAACACCAAT AGTCTGTCTA TTTTGGAAGA GCAACAAAGG 2700
CAGCAGCAGC AACAACAACA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAACA GCAACAGCAG 2760
CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGGCAGTG 2820
GCAGCTGCAG CCGTTCAGCA GTCAACGTCC CAGCAGGCAA CACAGGGAAC CTCAGGCCAG 2880
GCACCACAGC TCTTCCACTC ACAGACTCTC ACAACTGCAC CCTTGCCGGG CACCACTCCA 2940
CTGTATCCCT CCCCCATGAC TCCCATGACC CCCATCACTC CTGCCACGCC AGCTTCGGAG 3000
AGTTCTGGGA TTGTACCGCA GCTGCAAAAT ATTGTATCCA CAGTGAATCT TGGTTGTAAA 3060
CTTGACCTAA AGACCATTGC ACTTCGTGCC CGAAACGCCG AATATAATCC CAAGCGGTTT 3120
GCTGCGGTAA TCATGAGGAT AAGAGAGCCA CGAACCACGG CACTGATTTT CAGTTCTGGG 3180
AAAATGGTGT GCACAGGAGC CAAGAGTGAA GAACAGTCCA GACTGGCAGC AAGAAAATAT 3240
GCTAGAGTTG TACAGAAGTT GGGTTTTCCA GCTAAGTTCT TGGACTTCAA GATTCAGAAC 3300
ATGGTGGGGA GCTGTGATGT GAAGTTTCCT ATAAGGTTAG AAGGCCTTGT GCTCACCCAC 3360
CAACAATTTA GTAGTTATGA GCCAGAGTTA TTTCCTGGTT TAATCTACAG AATGATCAAA 3420
CCCAGAATTG TTCTCCTTAT TTTTGTTTCT GGAAAAGTTG TATTAACAGG TGCTAAAGTC 3480
AGAGCAGAAA TTTATGAAGC ATTTGAAAAC ATCTACCCTA TTCTAAAGGG ATTCAGGAAG 3540
ACGACGTAAT GGCTCTCATG TACCCTTGCC TCCCCCACCC CCTTCTTTTT TTTTTTTTAA 3600
ACAAATCAGT TTGTTTTGGT ACCTTTAAAT GGTGGTGTTG TGAGAAGATG GATGTTGAGT 3660
TGCAGGGTGT GGCACCAGGT GATGCCCTTC TGTAAGTGCC CCTTCCGGCA TCCCGGATAT 3720
CCTGCAGCCC AACACGGCCG CTCGAGCATG CATCTAGAGA ACGTCACGGC CGCGATCCCC 3780
CTGTGCCTTC TAGTTGCCAG CCATCTGGTT GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACC 3840
CTGGAAGGTG CCACTCCCAC TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGT 3900
CTGAGTAGGT GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGAT 3960
TGGGAAGACA ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGGTAC CCAGGTGCTG 4020
AAGAATTGAC CCGGTTCCTC CTGGGCCAGA AAGAAGCAGG CACATCCCCT TCTCTGTGAC 4080
ACACCCTGTC CACGCCCCTG GTTCTTAGTT CCAGCCCCAC TCATAGGACA CTCAACTTGG 4140
AGCGGTCTCT CCCTCCCTCA TCAGCCCACC AAACCAAACC TAGCCTCCAA GAGTGGGAAG 4200
AAATTAAAGC AAGAAGGCTA TTAAGTGCAG AGGGAGAGAA AATGCCTCCA ACATGTGAGG 4260
AAGTAATGAT AGAAATCATA GAATTC
4286 • · • · (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3263 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...3263 (xi)POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:
ATCGATAAGC TGAGATCCGG CTAGAAACTG CTGAGGGCTG GACCGCATCT GGGGACCATC 60
TGTTCTTGGC CCTGAGCGGG GCAGGAACTG CTTACCGCAG ATATCCTGTT TGCCCCAATT 120
CAGCTGTTCC ATCTGTTCTT GGCCCTGAGC GGGGCAGGAA CTGCTTACCA CAGATATCCT 180
GTTTGGCCCA TATTCAGCTG TCTCTCTGTT CCTGACCTTG ATCTGAACTT CTCTATTCTC 240
AGTTATGTAT TTTTCCCATG CCTTGCAAAA TGGCGTTACT TAAGCTAGCT TGCCAAACCT 300
ACGGCTGGGG TCTTTCACGT TTATATCTAT GAGGGGAAGG ACCCAGAGTG GGGAAGCTGG 360
GATCTTGGGA ACACGCTTCT CTACATGGCA TTGTCTGCAC GGTGGAGTCC GGATCTGAGC 420
TTGGCTTGGT TTTTAAAACC AGCCTGGAGT AGAGCAGATG GGTTAAGGTG AGTGACCCCT 480
CAGCCCTGGA CATTCTTAGA TGAGCCCCCT CAGGAGTAGA GAATAATGTT GAGATGAGTT 540
CTGTTGGCTA AAATAATCAA GGCTAGTCTT TATAAAACTG TCTCCTCTTC TCCTAGCTTC 600
GATCCAGAGA GAGACCTGGG CGGAGCTGGT CGCTGCTCAG GAACTCCAGG AAAGGAGAAG 660
CTGAGGTTAC CACGCTGCGA ATGGGTTTAC GGAGATAGCT GGCTTTCCGG GGTGAGTTCT 720
CGTAAACTCC AGAGCAGCGA TAGGCCGTAA TATCGGGGAA AGCACTATAG GGACATGATG 780
TTCCACACGT CACATGGGTC GTCCTATCCG AGCCAGTCGT GCCAAAGGGG CGGTCCCGCT 840
GTGCACACTG GCGCTCCAGG GAGCTCTGCA CTCCGCCCGA AAAGTGCGCT CGGCTCTGCC 900
AGGACGCGGG GCGCGTGACT ATGCGTGGGC TGGAGCAACC GCCTGCTGGG TGCAAACCCT 960
• · · · ··· · · · · • · · · · · · · · · · • · ·· · ·· · · · · · • · · · · · · · ···· ···· ·· ··· ·· ··
TTGCGCCCGG ACTCGTCCAA CGACTATAAA GAGGGCAGGC TGTCCTCTAA GCGTCACCAC 1020
GACTTCAACG TCCTGAGTAC CTTCTCCTCA CTTACTCCGT AGCTCCAGCT TCACCAGATC 1080
CTCGAGAACG TCTCCCATGG GCTATCCCTA TGACGTCCCG GATTACGCAG TCATGGGCAG 1140
CAGCCATCAT CATCATCATC ACAGCAGCGG CCTGGTGCCG CGCGGCAGCC ATATGGATCA 1200
GAACAACAGC CTGCCACCTT ACGCTCAGGG CTTGGCCTCC CCTCAGGGTG CCATGACTCC 1260
CGGAATCCCT ATCTTTAGTC CAATGATGCC TTATGGCACT GGACTGACCC CACAGCCTAT 1320
TCAGAACACC AATAGTCTGT CTATTTTGGA AGAGCAACAA AGGCAGCAGC AGCAACAACA 1380
ACAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA ACAGCAACAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA 1440
GCAGCAGCAG CAGCAGCAGC AGCAGCAGCA GCAACAGGCA GTGGCAGCTG CAGCCGTTCA 1500
GCAGTCAACG TCCCAGCAGG CAACACAGGG AACCTCAGGC CAGGCACCAC AGCTCTTCCA 1560
CTCACAGACT CTCACAACTG CACCCTTGCC GGGCACCACT CCACTGTATC CCTCCCCCAT 1620
GACTCCCATG ACCCCCATCA CTCCTGCCAC GCCAGCTTCG GAGAGTTCTG GGATTGTACC 1680
GCAGCTGCAA AATATTGTAT CCACAGTGAA TCTTGGTTGT AAACTTGACC TAAAGACCAT 1740
TGCACTTCGT GCCCGAAACG CCGAATATAA TCCCAAGCGG TTTGCTGCGG TAATCATGAG 1800
GATAAGAGAG CCACGAACCA CGGCACTGAT TTTCAGTTCT GGGAAAATGG TGTGCACAGG 1860
AGCCAAGAGT GAAGAACAGT CCAGACTGGC AGCAAGAAAA TATGCTAGAG TTGTACAGAA 1920
GTTGGGTTTT CCAGCTAAGT TCTTGGACTT CAAGATTCAG AACATGGTGG GGAGCTGTGA 1980
TGTGAAGTTT CCTATAAGGT TAGAAGGCCT TGTGCTCACC CACCAACAAT TTAGTAGTTA 2040
TGAGCCAGAG TTATTTCCTG GTTTAATCTA CAGAATGATC AAACCCAGAA TTGTTCTCCT 2100
TATTTTTGTT TCTGGAAAAG TTGTATTAAC AGGTGCTAAA GTCAGAGCAG AAATTTATGA 2160
AGCATTTGAA AACATCTACC CTATTCTAAA GGGATTCAGG AAGACGACGT AATGGCTCTC 2220
ATGTACCCTT GCCTCCCCCA CCCCCTTCTT TAAACAAATC AGTTTGTTTT 2280
GGTACCTTTA AATGGTGGTG TTGTGAGAAG ATGGATGTTG AGTTGCAGGG TGTGGCACCA 2340
GGTGATGCCC TTCTGTAAGT GCCCCTTCCG GCATCCCGGA ATTCCTGCAG CCCAACGCGG 2400
CCGCTTCGAG GGATCTTTGT GAAGGAACCT TACTTCTGTG GTGTGACATA ATTGGACAAA 2460
CTACCTACAG AGATTTAAAG CTCTAAGGTA AATATAAAAT TTTTAAGTGT ATAATGTGTT 2520
AAACTACTGA TTCTAATTGT TTGTGTATTT TAGATTCCAA CCTATGGAAC TGATGAATGG 2580
GAGCAGTGGT GGAATGCCTT TAATGAGGAA AACCTGTTTT GCTCAGAAGA AATGCCATCT 2640
AGTGATGATG AGGCTACTGC TGACTCTCAA CATTCTACTC CTCCAAAAAA GAAGAGAAAG 2700
GTAGAAGACC CCAAGGACTT TCCTTCAGAA TTGCTAAGTT TTTTGAGTCA TGCTGTGTTT 2760
AGTAATAGAA CTCTTGCTTG CTTTGCTATT TACACCACAA AGGAAAAAGC TGCACTGCTA 2820
TACAAGAAAA TTATGGAAAA ATATTCTGTA ACCTTTATAA GTAGGCATAA CAGTTATAAT 2880
CATAACATAC TGTTTTTTCT TACTCCACAC AGGCATAGAG TGTCTGCTAT TAATAACTAT 2940
GCTCAAAAAT TGTGTACCTT TAGCTTTTTA ATTTGTAAAG GGGTTAATAA GGAATATTTG 3000
ATGTATAGTG CCTTGACTAG AGATCATAAT CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT 3060
TGCTTTAAAA AACCTCCCAC ACCTCCCCCT GAACCTGAAA CATAAAATGA ATGCAATTGT 3120
TGTTGTTAAC TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA 3180
TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA AACTCATCAA 3240
TGTATCTTAT CATGTCTGGA TCO 3263 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 371 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...371 xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:
Met 1 Gly Tyr Pro Tyr 5 Asp Val Pro Asp Tyr Ala 10 Val Met Gly Ser 15 Ser
His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser His
20 25 30
Met Asp Gin Asn Asn Ser Leu Pro Pro Tyr Ala Gin Gly Leu Ala Ser
35 40 45
Pro Gin Gly Ala Met Thr Pro Gly Ile Pro Ile Phe Ser Pro Met Met
50 55 60
Pro Tyr Gly Thr Gly Leu Thr Pro Gin Pro Ile Gin Asn Thr Asn Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ile Leu Glu Glu Gin Gin Arg Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin
85 90 95
Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin
100 105 110
Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Gin Ala
115 120 125
Val Ala Ala Ala Ala Val Gin Gin Ser Thr Ser Gin Gin Ala Thr Gin
130 135 140
Gly Thr Ser Gly Gin Ala Pro Gin Leu Phe His Ser Gin Thr Leu Thr
145 150 155 160
Thr Ala Pro Leu Pro Gly Thr Thr Pro Leu Tyr Pro Ser Pro Met Thr
165 170 175
Pro Met Thr Pro Ile Thr Pro Ala Thr Pro Ala Ser Glu Ser Ser Gly
180 185 190
Ile Val Pro Gin Leu Gin Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Gly Cys
195 200 205
Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala Glu Tyr
210 215 220
Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Arg
225 230 235 240
Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly Ala
245 250 255
• · · · ···· ··· ···· • · · ···· · ··· • · · · · · · · · · · · • · ·· · ··· ········ ·· · · · ·· · ·
Lys Ser Glu Glu 260 Gin Ser Arg Leu Ala 265 Ala Arg Lys Tyr Ala 270 Arg Val
Val Gin Lys 275 Leu Gly Phe Pro Ala Lys 280 Phe Leu Asp Phe 285 Lys Ile Gin
Asn Met 290 Val Gly Ser Cys Asp 295 Val Lys Phe Pro Ile 300 Arg Leu Glu Gly
Leu 305 Val Leu Thr His Gin 310 Gin Phe Ser Ser Tyr 315 Glu Pro Glu Leu Phe 320
Pro Gly Leu Ile Tyr 325 Arg Met Ile Lys Pro 330 Arg Ile Val Leu Leu 335 Ile
Phe Val Ser Gly 340 Lys Val Val Leu Thr 345 Gly Ala Lys Val Arg 350 Ala Glu
Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly Phe Arg
355 360 365
Lys Thr Thr
370 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...18 (xi)POPIS SEKVENCE:SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:
Met Gly Ser Ser His His His
5
Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg
His His His

Claims (11)

1. Transgenní zvíře kromě které má schopnost exprimovat protein vázající se na box TATA (TBP) opatřený epitopovou značkou.
2. Transgenní zvíře kromě člověka podle nároku 1, kde TBP je exprimován jako fúzní protein se dvěma epitopovými značkami.
3 Transgenní zvíře kromě člověka podle kteréhokoliv z ( nároků 1 a hTBP). 2, kde fúzní protein obsahuj e lidský TBP 4 Transgenní zvíře kromě člověka podle kteréhokoliv
z nároků 1 až 3, kde fúzní protein obsahuje epitcp HA a His.
5. Transgenní zvíře kromě člověka podle nároku 4, kde fúzní protein má sekvenci s identifikačním číslem 16.
6. Transgenní zvíře kromě člověka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde transgenní zvíře je myš.
7. Způsob vytvořeni transgenního zvířete kromě člověka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 vyznačující se t i m, že se transgen zavede do zárodečné linie a/nebo do somatických buněk zvířete kromě člověka.
8. Způsob vytvoření transgenního zvířete kromě člověka podle nároku 7vyznačující se tím, že se do zygoty zvířat kromě člověka zavede transgenní DNA mikroinjekcí.
• · · · • · ·· · ··· ···· ···· ·· ··· ·· ··
9. Způsob vytvořeni transgenního zvířete kromě člověka podle nároku 7 vyznačující se tím, že se blastocysta transfekuje vektorem, který obsahuje transgen.
10. Způsob vytvoření transgenního zvířete kromě člověka podle nároku 7 vyznačující se tím, že se transgen zavede do embryonální kmenové buňky.
*
11. Transgen, který kóduje TBP s epitopovou značkou a který může být použit pro vytvoření transgenního zvířete kromě člověka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
12. Transgen podle nároku 11, který obsahuje první sekvenci DNA, která kóduje TBP a druhou sekvenci DNA, která kóduje jednu nebo více epitopových značek.
13. Transgen sekvence DNA, podle která kteréhokoliv kóduje TBP, je z nároků li ; cDNA. I a 12, kde 14. Transgen podle nároku 13, kde sekvence DNA je CDNA lidského TBP (hTBP). 15. Transgen podle kteréhokoliv z nároků 11 až 14, kde druhá sekvence DNA kóduje dvě epitopové značky. 16. Transgen podle nároku 15, kde epitopové značky j sou
epitop HA a epitop His.
17. Transgen podle kteréhokoliv z nároků 15 a 16, kde epitop
HA má jednu ze sekvencí s identifikačním číslem 1, 2, 3 nebo 4.
18. Transgen podle kteréhokoliv z nároků 11 až 17, který obsahuje sekvenci s identifikačním číslem 13. 19. Transgen podle kteréhokoliv z nároků 11 až 18, který obsahuje DNA indukovatelného nebo konstitutivního promotoru.
4 20. Transgen podle nároku 19, kde promotor je promotor genu EF. 4 21. Transgen podle nároku 19, kde promotor je promotor genu MT. 22. Transgen podle kteréhokoliv z nároků 11 až 22, kde transgen má se kvenci s identifikačním číslem 14 nebo 15.
23. Použiti transgenu podle kteréhokoliv z nároků 11 až 22 pro vytvoření transgenního zvířete kromě člověka.
24. Způsob tvorby transgenu podle kteréhokoliv z nároků 11 až 22 vyznačující se tím, že se připojí sekvence DNA, která(é) kóduje(i) jednu nebo více epitopových značek, k sekvenci DNA, která kóduje protein TBP.
25. Použití transgenu podle kteréhokoliv z nároků 11 až 22 pro vytvoření TBP s epitopovou značkou.
26. Použití transgenního zvířete podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro expresi TBP s epitopovou značkou.
27. TBP s epitopovou značkou exprimovaný v transgenním zvířeti podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6.
28. TBP s epitopovou značkou podle nároku 27, který obsahuje dva epitopy.
29. TBP s epitopovou značkou podle kteréhokoliv z nároků 27 a 28, kde TBP je hTBP.
30. TBP s epitopovou značkou podle kteréhokoliv z nároků 27 až 29, kde TBP je spojen s epitopem HA a epitopem His.
31. TBP s epitopovou značkou podle kteréhokoliv z nároků 27 až 30, kde epitop HA má jednu ze sekvencí s identifikačním číslem 1, 2, 3 nebo 4.
32. TBP se značeným epitopem podle kteréhokoliv z nároků 27 až 31, který má sekvenci s identifikačním číslem 16.
33. Způsob přípravy TBP s epitopovou značkou podle kteréhokoliv z nároků 27 až 32 vyznačující se tím, že se zavede transgen podle kteréhokoliv z nároků 11 až 22 do zárodečné linie a/nebo somatických buněk zvířete.
34. Způsob přípravy TBP s epitopovou značkou podle nároku 33 vyznačující se tím, že se zavede transgen, který obsahuje konstitutivní promotor, do zvířete kromě člověka, načež TBP s epitopovou značkou je exprimován v určitých buněčných typech a/nebo tkáních zvířete, volitelně v určitém vývojovém stadiu zvířete.
35. Způsob přípravy TBP s epitopovou značkou podle nároku 33 vyznačující se tím, že se zavede transgen, který obsahuje indukovatelný promotor, do zvířete kromě φ φ ΦΦΦΦ člověka, a po indukci promotoru se exprimuje TBP s epitopovou značkou.
36. Použití TBP s epitopovou značkou pro izolaci transkripčních komplexů vyššího řádu z transgenního zvířete a pro identifikaci TAFs a faktorů interagujícich s TAF.
37. Použití transgenního zvířete kromě člověka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro expresi TBP s epitopovou značkou.
38. Použiti transgenního zvířete kromě člověka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro izolaci transkripčních komplexů vyššího řádu z různých tkání a/nebo buněčných typů, volitelně v různých vývojových stadiích zvířete.
39. Použití transgenního zvířete kromě člověka pro identifikaci nových a/nebo specifických TAFs a/nebo faktorů interagujícich s TAF.
40. Způsob identifikace a charakterizace různých transkripčních komplexů vyššího řádu vyznačuj ící se tím, že TBP s epitopovou značkou, se kterým jsou transkripční komplexy vyššího řádu sdruženy, je izolován z transgenního zvířete.
41. Způsob charakterizace složení různých transkripčních komplexů vyššího řádu vyznačující se tím, že a) je zaveden transgen podle kteréhokoliv z nároků 11 až 22 do zvířete kromě člověka, b) je izolován TBP s epitopovou značkou z různých zvířecích tkáni a/nebo různých buněčných typů zvířete, volitelně v různých vývojových stadiích • · • · · · f · zvířete a c) je určeno složeni transkripčních komplexů vyššího řádu.
42. Způsob identifikace nového a/nebo specifického TAF a/nebo faktoru interagujícího s TAF vyznačující se t i m, že a) je zaveden transgen podle kteréhokoliv z nároků 11 až 22 do zvířete kromě člověka, b) je izolován TBP s epitopovou značkou z určité zvířecí tkáně a/nebo určitého buněčného typu zvířete, volitelně v určitém vývojovém stadiu zvířete a c) jsou disociovány a separovány TAF a/nebo faktor interagující s TAF sdružený s TBP s epitopovou značkou v transkripčním komplexu vyššího řádu a d) volitelně je určena aminokyselinová sekvence TAF a/nebo faktoru interagujícího s TAF.
43. Způsob izolace různých řádu z transgenniho z nároků 1 zvířete transkripčních komplexů vyššího kromě člověka až 6 jící podle kteréhokoliv se tím, že transkripční komplex značkou je řádu vyššího společně je TBP s epitopovou značkou afinitně s epitopovou afinitně
TBP když sdružený s purifikován, purifikován pomocí alespoň jedné epitopové značky použité k označení TBP.
44. Způsob izolace transkripčního komplexu vyššího řádu podle nároku 43 vyznačující se tím, že TBP s epitopovou značkou je purifikován navázáním svého epitopu His na kolonu s Ni2+.
45. Způsob izolace transkripčního komplexu vyššího řádu podle kteréhokoliv z nároků 43 a 44 vyznačující se t i m, že TBP s epitopovou značkou je purifikován navázáním svého epitopu HA k protilátkám anti-HA.
φφ ·· φφ ΦΦΦ· φφ ·· • · · · φφφ ···· • φ · · · · · · φφφ • φ · · · Φ· · · φ φ φ • φ · φ φ φφφ
Φ»Φ·ΦΙΦΦ Λ· ΦΦΦ «Φ φφ
46. Způsob izolace transkripčního komplexu vyššího řádu podle kteréhokoliv z nároků 43 až 45 vyznačující se t i m, že transkripční komplex vyššího řádu je izolován pomocí afinitní kolony s protilátkami, které rozpoznávají epitop z TBP s epitopovou značkou, která má sekvenci s identifikačním číslem 17.
47. Protilátka, která rozpoznává epitop z TBP s epitopovou značkou, která má sekvenci s identifikačním číslem 17.
CZ981601A 1997-05-26 1998-05-22 Transgenní zvíře, transgen, způsob jejich přípravy a použití pro purifikaci transkripčních komplexů CZ160198A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97108433 1997-05-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ160198A3 true CZ160198A3 (cs) 1998-12-16

Family

ID=8226829

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ981601A CZ160198A3 (cs) 1997-05-26 1998-05-22 Transgenní zvíře, transgen, způsob jejich přípravy a použití pro purifikaci transkripčních komplexů

Country Status (15)

Country Link
US (2) US20020157127A1 (cs)
JP (1) JPH114638A (cs)
KR (1) KR100607527B1 (cs)
CN (1) CN1200235A (cs)
AR (1) AR012743A1 (cs)
AT (1) ATE443132T1 (cs)
AU (1) AU748461B2 (cs)
BR (1) BR9801703A (cs)
CA (1) CA2232806A1 (cs)
CZ (1) CZ160198A3 (cs)
DE (1) DE69841149D1 (cs)
HU (1) HUP9801188A3 (cs)
ID (1) ID20397A (cs)
PL (1) PL197770B1 (cs)
TR (1) TR199800920A2 (cs)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4850047A (en) * 1986-08-29 1989-07-18 Fujitsu Limited Optical bus communication system utilizing frame format signals
WO2004095029A1 (ja) * 2003-04-23 2004-11-04 Olympus Corporation 一分子蛍光分析により核酸と核酸結合タンパク質との結合を検出する方法
WO2007086382A1 (ja) * 2006-01-24 2007-08-02 Nagoya City University ヒト関節リウマチの病態を再現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物
CN101864420B (zh) * 2009-05-06 2012-05-23 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种用于hek293细胞高效表达外源基因的表达载体

Also Published As

Publication number Publication date
ID20397A (id) 1998-12-03
HUP9801188A2 (hu) 1999-03-29
US20050268350A1 (en) 2005-12-01
HUP9801188A3 (en) 2005-05-30
PL326482A1 (en) 1998-12-07
PL197770B1 (pl) 2008-04-30
DE69841149D1 (de) 2009-10-29
BR9801703A (pt) 2000-01-11
HU9801188D0 (en) 1998-09-28
AR012743A1 (es) 2000-11-08
CA2232806A1 (en) 1998-11-26
KR19980087337A (ko) 1998-12-05
TR199800920A2 (xx) 1998-12-21
CN1200235A (zh) 1998-12-02
AU748461B2 (en) 2002-06-06
KR100607527B1 (ko) 2006-09-22
JPH114638A (ja) 1999-01-12
US20020157127A1 (en) 2002-10-24
AU6806898A (en) 1998-11-26
ATE443132T1 (de) 2009-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100558288B1 (ko) 연골의 퇴행성 질환용 트랜스제닉 동물 모델
US5843652A (en) Isolation and characterization of Agouti: a diabetes/obesity related gene
EP0710250A1 (en) Human mhc class ii double transgene and uses
Mikkelsen et al. Tissue-specific expression in the salivary glands of transgenic mice
US20050268350A1 (en) Identification and purification of higher order transcription complexes from transgenic non-human animals
JPH11509408A (ja) 新規なヒト第１６染色体遺伝子、組成物、それらの製造および使用方法
US6734336B1 (en) Gene-targeted non-human mammal with human fad presenilin mutation and generational offspring
EP1148779B1 (en) Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals
AU700224B2 (en) Alpha-lactalbumin gene constructs
AU712016B2 (en) Ikaros transgenic cells and animals
US20100107265A1 (en) Double-muscling in mammals
EP0881288B1 (en) Purification of higher order transcription complexes from transgenic non-human animals
MXPA98004115A (en) Purification of more elevated order transcription compositions from transgenic animals no huma
JP2005500835A (ja) Ｐｅｒｖスクリーニング法およびその使用
JP5046413B2 (ja) ヒトｆａｄプレセニリン突然変異をもつ標的遺伝子組換え非ヒト哺乳動物および生殖による子孫
US6410723B1 (en) VDUP1 promoter and methods of use thereof
US6888047B1 (en) Transgenic animals as urinary bioreactors for the production of polypeptide in the urine, recombinant DNA construct for kidney-specific expression, and method of using same
AU2006281607B2 (en) Isolation of the t-complex distorters and applications thereof
CA2260020A1 (en) The butyrophilin gene promoter and uses thereof
EP1135518A1 (en) Transgenic animals as urinary bioreactors for the production of protein in the urine, recombinant dna construct for kidney-specific expression, and method of using same
WO2005037994A2 (en) Transgenic rodents selectively expressing human b1 bradykinin receptor protein
WO1998045465A1 (en) Transgenic, non-human animal with protein deficiency, cells derived therefrom, use of said animal and cells, and method of producing said transgenic animal
JP2005512568A (ja) 精嚢組織特異的プロモーター及びその利用
JPH11318468A (ja) 脳神経組織細胞の分化に関わる新規なタンパク質
JPH11196709A (ja) Ｄｏｃ２α遺伝子が欠損したトランスジェニック・マウス

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic