KR19980087337A - 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터의 고 전사 복합체의 정제방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 에피토프-택을 갖는(epitope-tagged) TATA-박스 결합 단백질(TBP)을 코딩하는 DNA를 포함하는 전이유전자(transgene), 에피토프-택을 갖는 TBP를 발현하는 형질전이된(transgenic) 동물의 생산, 및 다양한 진핵생물 조직 및 세포형으로부터의 (신규한) 전사 인자 및 전사 복합체의 친화성 정제에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 에피토프-택을 갖는 TATA-박스 결합 단백질(TBP)을 코딩하는 DNA를 포함하는 전이유전자, 에피토프-택을 갖는 TBP를 발현하는 형질전이된 동물의 생산 및 다양한 진핵동물 조직 및 세포형으로부터의 (신규한) 전사 인자 및 전사 복합체의 친화성 정제에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
진핵생물의 전사 조절의 핵심은 전사 개시전 복합체의 단계별 형성 및 활성이다. 이 전사 개시전 복합체는 큰 여러개의 서브유니트를 갖는 복합체이며, 이는 전사 출발 부위에서 RNA 폴리머레이즈(polymerase) II 효소의 정확한 위치 선정 및 개시에 필요하다. 이 복합체의 일반적인 전사 인자(GTF)중 대부분은 최근 몇년동안 진핵세포 핵에서 특성화되어왔고, TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF 및 TFIIH를 포함한다(자웰(Zawel) 및 레인버그(Reinberg)의 문헌[1995, Ann. Rev. Biochem. 64, 533-561], 세리자와(Serizawa) 등의 문헌[1994, Transcription: Mechanisms and regulation, 45-66, Raven Press]을 참조할 수 있다). TATA-함유 프로모터에서는, TFIID는 TATA-박스 서열에 대해 특이적인 친화성을 갖는다. 이 서열 인식에서 TFIID는 기본 RNA 폴리머레이즈 II 전사에서 프로모터에 결합하여 복합체 형성의 핵을 형성하는 제 1 요소이다(레윈(Lewin, B.)의 문헌[1990, Cell, 61: 1161-1164]을 참조할 수 있다). 다른 GTF들이 정해진 단계별 방식으로 결합하여 완전한 전사 개시전 복합체를 완성한다. 이어서, 이 큰 복합체는 RNA 폴리머레이즈 II(Pol II)를 소집하여 전사 출발 부위에 정확하게 위치시켜 기본 전사를 개시한다. 다중 서브유니트 복합체인 TFIID 그자체가 전사 활성화제의 존재하에서의 증가된 양의 mRNA 생성으로 막연하게 정의된 활성화된 전사의 조절에 중요한 역할을 하는 것은 명확해지고 있다. 이런 활성화제는 E-박스 결합 USF와 같은 자연적으로 발생하는 인핸서(enhancer) 결합 결정자(사와도고(Sawadogo) 및 로에더(Roeder)의 문헌[1985, Cell, 43: 165-175]; 키르스크바움(Kirschbaum) 등의 문헌[1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5094-5100]을 참조할 수 있다) 또는 VP16과 같은 바이러스 인자(스트링거(Stringer) 등의 문헌[1990, Nature 345: 783-786]을 참조할 수 있다)일 수 있다.
TFIID는 TATA-결합 단백질(TBP) 및 여러 TBP-결합 인자(TAFII)(본원에서 TAFII는 임의의 종류의 전사 인자, 전사 활성화제, 전사 억제제를 포함한다)로 구성된다. 20개 정도의 상이한 TAFII가 이제까지 특성화되어왔고, TAFII의 여러 조합을 함유한 TFIID 복합체가 관찰되어왔다(자웰 및 레인버그의 문헌[1995, Ann. Rev. Biochem. 64, 533-561]; 호리(Hori, R) 및 카레이(Carey, M)의 문헌[1994, Curr. Opinion Gen. Dev. 4: 236-244]을 참조할 수 있다). 또한, TAFII의 상이한 조합이 TFIID 복합체의 독특한 성질을 제공한다. 예를 들면 초파리에서는 패턴 형성 단백질인 헌치백(Hunchback)(HB) 및 비코이드(Bicoid)(BCD)는 TFIID 복합체에서 TAFII60, TAFII110 및 TAFII250의 존재에 절대적으로 의존한다(사우어(Sauer, F) 등의 문헌[1995, Science 270, 1783-1788]을 참조할 수 있다). 이들 TFIID 성분은 업스트림(upstream) 인핸서에 결합된 BH 및 BCD 단백질에 대한 조활성화제로서 작용한다. 신경성 인자인 NTF-1은 최소한의 TBP의 복합체를 필요로하는 것으로 나타났다. 전사를 활성화하기위해 TAFII150(여기에 결합한다) 및 TAFII250을 필요로하고, 반면 SP1은 활성화를 위해 추가 인자인 TAFII110을 필요로한다(첸(Chen, J.-L.) 등의 문헌[1994, Cell 79: 93-105]을 참조할 수 있다). 다른 연구는 TAFII28를 확인하였고, 이의 존재는 에스트로겐 및 비타민 D3의 핵 수용체에 의한 전사 활성화에 필요하다(메이(May, M.) 등의 문헌[EMBO 15: 3093-3104]을 참조할 수 있다). TAFII가 활성화제/리프레서(repressor)로부터의 조절 정보를 단백질-단백질 상호작용에 의해 코어 개시 복합체에 전달하는 전사 어댑터(adaptor)로서 작용하는 것 같다.
현재 조절 전사의 측면에서는, 개별적인 유전자 및/또는 매우 연관된 유전자좌의 작은 그룹의 발현은 한정된 세트의 전사 복합체 서브유니트에 의해 제어된다. 비록 일부 인자, 예를 들면 GTF가 매우 흔하고 대부분의 전사에 존재하지만, 제어되는 전사의 유전자- 및 세포-특이전 요소의 수의 증가가 현재 개시되고 있다. 전사 인자를 확인하기위해 여러 증명된 방법들이 사용되어왔다. RNA Pol II 및 7개의 GTF(TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF, TFIIH 및 TFIIJ)를 밝혀낸 초기 전략은 주로 세포주로부터의 핵 제조물의 칼럼 분획화를 포함한다(자웰 및 레인버그(1995); 세리자와 등(1994); 로에더(1996) TIBS 21:327-335). 이들 분획은 다양한 양의 전사능을 갖는 반-정제된 단백질을 생성하였다. 이들 분획의 대부분은 기본 전사에 절대적으로 필요한 것으로 보였다. 이 시점에서, TFIID 분획이 TATA-박스 인식을 담당하는 것으로 알려졌다. 그러나, TATA-결합능을 갖는 단일 단백질을 단리하고자 하는 시도는 성공하지못하였다. 이스트의 단일 성분이 재구축된 기본 전사 분석법에서 TFIID를 대체할 수 있는 것으로 나타났을 때 획기적으로 약진되었고, 이는 27kD의 TATA-결합 단백질(TBP)을 단리 및 클로닝하게하였다(부라토위스티(Buratowski, S.) 등의 문헌[1988, Nature, 334: 37-42]; 카발리니(Cavallini, B.) 등의 문헌[1988, Proc. Nat. Acad. Sci. 86: 9803-9809]을 참조할 수 있다). 디제러너러시(degeneracy)를 갖는 프라이머를 이용하여 인간(카오(Kao, C.C.) 등의 문헌[1990, Science 248: 1646-1649]; 호프만(Hoffmann, A.) 등의 문헌[1990, Nature 346: 387-390]; 피터슨(Peterson, M.G.) 등의 문헌[1990, Science, 248: 1625-1630]을 참조할 수 있다), 초파리(호에이(Hoey, T.) 등의 문헌[1990, Cell 61: 1179-1186]; 무히치(Muhich, M.L.) 등의 문헌[1990, Proc. Nat. Acad. Sci: 87, 9148-9152]을 참조할 수 있다) 및 쥐(타무라(Tamura, T) 등의 문헌[1991, Nuc. Acids Res. 19: 3861-3865]을 참조할 수 있다) TFIID의 TBP 서브유니트에 대한 유전자를 또한 확인하였다.
상이한 종으로부터 TBP에 대한 cDNA의 이용가능성은 세포 배양액에서의 이들 단백질의 과발현을 포함하는 다양한 연구를 가능하게 하였다. HeLa 세포주는 FLAG-택 또는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 에피토프-택이 아미노 말단에 추가된 TBP 단백질을 연속적으로 발현하게 제조되었다(조(Zhou, Q) 등의 문헌[1993, Genes Development 7, 180-187]; 치앙(Chiang) 등의 문헌[1993, EMBO, 12, 2749-2762]을 참조할 수 있다). FLAG-택은 8개의 아미노산의 합성 서열로 구성된 에피토프이다. HA-택은 서열 식별 번호 1의 MGYPYDVPDYAV(1문자 코드)의 아미노산 서열을 갖는 천연 에피토프이다.
또한 천연 HA 택(인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌으로부터의 10개의 아미노산)으로부터의 더 짧은 펩티드가 초파리 세포주에서 TBP를 함유하는 융합 단백질의 발현에 사용되어왔다(콜간(Colgan) 및 만리(Manley)의 문헌[1992, Genes Dev. 6, 304-331]; 트리브르디(Tribrdi) 등의 문헌[1996, Mol. Cel. Biol. 16, 6909-6916]을 참조할 수 있다).
아미노산 말단에 2개의 에피토프, 즉 FLAG- 및 HA-에피토프의 택을 갖는 TBP 단백질은 박테리아에서 발현되어왔다(치앙 등의 문헌[1993, EMBO 12, 2749-2762]을 참조할 수 있다). FLAG-택을 갖는 TBP 단백질은 또한 유도성 프로모터의 제어하에서 발현되어왔다(우(Wu) 등의 문헌[1996, BioTechniques 21: 718-725]을 참조할 수 있다). 그러나, 에피토프/에피토프들에 대한 단클론성 항체가 핵 추출물로부터 TBP-결합된 복합체를 정제하여 TFIID 복합체의 TBP-결합 인자(TAFII)의 공동 정제에 이용되었다(주 등의 문헌[1993, Genes Dev. 7: 180-187]을 참조할 수 있다).
여러 실험실에서 이들 세포주를 따라 연구가 계속되었고, 최근에는 HeLa 핵 추출물 및 이스트로부터 새로운 TAF 및 TAF-상호작용 인자들이 확인되고 특성화되었다(호리 및 카레이의 문헌[1994, Curr. Op. Gen. Dev. 4: 236-244; 자웰 및 레인버그의 문헌[1995, Ann. Rev. Biochem. 64: 533-561]; 로에더의 문헌[1996, Trends Biochem. Sci. 21, 327-335]을 참조할 수 있다).
인간으로부터의 TAF들, TAFII68, TAFII55, TAFII30, TAFII28, TAFII20 및 TAFII18이 공지되어있다(멘구스(Mengus) 등의 문헌[1995, EMBO, 14: 1520-1531]; 베르톨로티(Bertolotti) 등의 문헌[1996, EMBO 15: 5022-5031] 및 우 및 치앙의 문헌[1996, Biotechniques 21: 718-725]을 참조할 수 있다).
비록 많은 인자들이 이 방법으로 발견되어왔지만, 연구는 사용되는 세포주 형 또는 이스트 균주에 특정한 전사 복합체, TAF 및 TAF-상호작용 인자에 한정된다는 것은 명확하다.
본 발명은 다양한 진핵 생물 조직 및 세포형으로부터의 전사 인자 및 전사 복합체의 정제에 사용되는 에피토프-택을 갖는 TBP를 코딩하는 DNA를 포함하는 전이 유전자를 제공하고 에피토프-택을 갖는 TBP를 발현하는 형질전이된 동물을 생산하기 위한 것이다.
본 발명은 에피토프-택을 갖는 TBP가 전체 동물, 따라서, 다양한 진핵세포 및 세포형으로부터의 신규한 전사 복합체 및 전사 인자, TAF 및 TAF-상호작용 인자의 친화성 정제에 응용되는 보다 보편적인 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 에피토프-택을 갖는 TATA-박스 결합 단백질(TBP)를 발현하는 능력을 갖는 인간이 아닌 형질전이된 동물에 관한 것이다. 다른 측면에서는, 본 발명은 인간이 아닌 형질전이된 동물의 용도, 바람직하게는 고 전사 복합체의 확인 및 단리 및 고 전사 복합체에 결합된 단백질(TAF 및 TAF-상호작용 인자, 예를 들면 전사 인자)의 확인 및 단리를 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 다른 양태에서는, 본 발명은 전이유전자를 인간이 아닌 형질전이된 동물, 바람직하게는 특정한 발육 단계의 이들의 배선(germline) 및/또는 체세포에 주입함을 포함하는 인간이 아닌 형질전이된 동물의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간이 아닌 형질전이된 동물을 제조하는데 이용할 수 있는 전이유전자에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 양태는 에피토프-택을 갖는 TBP를 코딩하는 전이유전자를 제공한다. 바람직하게는, 전이유전자는 하나이상의 에피토프-택을 코딩하는 제 1 DNA 서열을 포함하고, TBP를 코딩하는 제 2 DNA 서열을 포함한다. 전이유전자는 에피토프-택(들)을 코딩하는 또다른 DNA-서열(들)을 포함할 수 있다. 바람직하게는 TBP를 코딩하는 DNA는 cDNA이다. TBP를 코딩하는 DNA는 임의의 천연 DNA, 이들의 유도체 또는 일부일 수 있다. DNA, 바람직하게는 cDNA는 새, 양서류, 파충류, 이스트, 씨. 엘레강스(C. elegans), 포유류 등을 포함하는 진핵류에서 유래할 수 있다. 예를 들면, 설치류, 양, 개, 소, 돼지 및 영장류, 인간 또는 이들의 일부로부터의 TBP를 코딩하는 DNA를 사용할 수 있다. 바람직하게는 인간 TBP(hTBP)-cDNA의 이용이다. 본 발명은 또한 임의의 비-천연 DNA, 예를 들면 TBP-cDNA 유도체의 이용을 포함한다. DNA의 유도체는 예를 들면 돌연변이 또는 변형된 서열과 같은 다른 서열을 가질 수 있고/있거나 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. DNA의 유도체는 또한, 염, 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
전이유전자는 1, 2, 3, 4 또는 5개이상의 에피토프-택을 코딩하는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 전이유전자는 2개의 에피토프-택을 코딩하는 DNA를 포함한다. 개별적인 에피토프-택을 코딩하는 DNA는 TBP를 코딩하는 DNA의 5'- 및/또는 3'- 말단 및/또는 TBP를 코딩하는 DNA서열 사이의 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있다. 개별적인 에피토프-택을 코딩하는 DNA는 나란히 또는 서로 직접적으로 인접하게 분리되고/되거나 배열될 수 있다.
에피토프-택으로서, 임의의 천연 또는 합성 펩티드를 사용할 수 있다. 각각의 에피토프-택은 TBP와의 융합 단백질로서 발현되고, 에피토프 택은 스페이서 펩티드에 의해 또는 직접적으로 TBP에 연결될 수 있다. 바람직하게는, 에피토프-택은 TBP 또는 융합 단백질을 친화성 정제할 수 있는 기회를 제공하고, TAF 및 TAF-상호작용 인자와 같은 TBP 또는 융합 단백질에 결합하는 단백질을 친화성 정제할 수 있는 기회를 제공한다. 또한, 에피토프-택은 TBP와의 융합 단백질로서 발현될 때 TBP의 작용 활성을 파괴하지않아야만한다. 이 목적을 위해서는 바람직하게는 짧은 펩티드가 에피토프-택으로서 사용된다. 이들은 약 1 내지 50개 또는 그 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 특히 5 내지 15개의 아미노산을 포함하는 펩티드를 사용한다. 에피토프-택으로서 사용할 수 있는 펩티드의 비한정 예는 FLAG-에피토프, HA-에피토프, 다중 히스티딘 잔기(6 내지 10개 또는 그이상의 히스티딘 잔기, 바람직하게는 6개의 히스티딘 잔기)(His 택), Myc 택(스톤(Stone) 등의 문헌[1996, Nature 384: 129-134]을 참조할 수 있다), 스트렙타비딘 택 및 기타이다. 또한 천연 에피토프의 더 짧은 펩티드를 이 목적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 HA-에피토프의 이용은 에피토프 MGYPYDVPDYA(서열 식별 번호 2), GYPYDVPDYA(서열 식별 번호 3), YPYDVPDYA(서열 식별 번호 4) 또는 HA-펩티드로부터 유래된 다른 펩티드의 이용을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 전이유전자는 인간 TBP의 cDNA 및 에피토프-택을 코딩하는 2개의 DNA 서열을 함유한다. 바람직하게는 제 1 DNA 서열은 HA 에피토프를 코딩하고, 이는 시판되는 단클론성 항체와의 면역반응에 대한 에피토프로서 사용할 수 있다(콜로지에즈(Kolodziej) 및 영(Young)의 문헌[1991, Meth. Enzym. 194: 508-519]를 참조할 수 있다). HA 택을 코딩하는 서열의 바로 3'에 연속적인 6개의 히스티딘 잔사(His 택)를 코딩하는 DNA 서열이 위치한다. 이 His 택은 Ni2+이온과 비-공유, 가역적인 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 시판되는 Ni2+아가로즈 친화성 칼럼 물질은 His-택을 갖는 단백질을 정제하기위해 일반적으로 사용된다(호출리(Hochuli, E) 등의 문헌[1987, J. Chromatography 411: 177-184]; 쟝네치(Janknecht, R) 등의 문헌[1991, Proc. Nat. Acad. Sci. 74: 4835]을 참조할 수 있다). 본 발명의 특정한 양태에서는, 전이유전자는 서열 식별 번호 13의 DNA 서열을 포함한다. 서열 식별 번호 13은 이중 택을 갖는 hTBP로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 전이유전자를 제공한다.
바람직한 양태에서는, 본 발명은 에피토프-택을 갖는 TBP를 코딩하고, 융합 단백질의 발현용 프로모터를 포함하는 전이유전자를 제공한다. 전이유전자는 TBP를 코딩하는 DNA(예를 들면 TBP의 cDNA 또는 이들의 유도체) 및 에피토프-택을 코딩하는 DNA-서열(들)에 추가하여 하나이상의 유전자 조절 서열을 포함할 수 있다. 이런 유전자 조절 서열은 예를 들면 천연 또는 합성 프로모터 또는 이들의 일부 및/또는 시스(cis) 작용 요소(예를 들면 인핸서, 사일런서(silencer))이다. 이 목적을 위해서, 포유동물 프로모터, 예를 들면 마우스의 트랜스페린(transferrin) 유전자의 프로모터, 뉴론-특이적 이놀레이즈(enolase)(NSE) 유전자(포르스-피터(Forss-Peter, S.) 등의 문헌[1990, Neuron 5: 187-197]) 또는 티미딘 키네이즈(kinase) 유전자의 프로모터를 사용할 수 있다. 또한 바이러스 프로모터, 예를 들면 사이토메갈로바이러스 유전자 또는 SV 40 초기 유전자의 프로모터를 사용할 수 있다. 바람직하게는 이들의 유도성 또는 구성 프로모터 또는 이들의 유도체를 사용한다. 구성 프로모터로서는 예를 들면 인간 연장 인자-1 알파 유전자(EF)(우에츠키(Uetsuki, T) 등의 문헌[1989, J. Biol. Chem. 264: 5791-5798]을 참조할 수 있다)를 사용할 수 있다. 유도성 프로모터로서 예를 들면 중금속에 반응하는 여러 시스-요소를 갖는 메탈로티오닌 프로모터(MT)(팔미터(Palmiter, R.D)의 문헌[1987, Experimentia Supplementum 52: 63-80, Birkhauser Verlag]을 참조할 수 있다)를 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면 세포 주기 특이적, 세포형 특이적 또는 발육 특이적으로 발현하는 유전자의 프로모터를 이 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 특정한 양태에서는, 전이유전자는 hTBP의 cDNA 및 HA 에피토프(예를 들면 천연 HA 에피토프의 9개의 아미노산) 및 His 에피토프(6x His 택)를 코딩하는 DNA 서열, 및 구성 프로모터를 포함한다. 예를 들면 TBP 발현은 인간 연장 인자-1알파(EF)의 프로모터에 의해 제어된다(우에츠키 등의 문헌[1989, J. Biol. Chem. 264: 5791-5798]을 참조할 수 있다). EF-프로모터는 중간정도이지만 일정한 수준으로 마우스에서 전이유전자를 발현하는데 사용되어온 TATA가 없는 프로모터이다(하나오카(Hanaoka, K) 등의 문헌[1991, Differentiation, 183-189]을 참조할 수 있다). 본 발명의 특정한 양태에서는, 전이유전자는 이중-택(HA 및 His 에피토프)을 갖는 hTBP 및 EF-프로모터의 서열을 코딩하는 DNA 서열을 포함하고, 특히 전이유전자는 서열 식별 번호 14의 DNA 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 특정한 양태에서는, 전이유전자는 TBP를 코딩하는 DNA, 바람직하게는 hTBP의 cDNA, 및 HA(예를 들면 천연 HA 에피토프의 9개의 아미노산) 및 His 에피토프(예를 들면 6개의 히스티딘)을 코딩하는 DNA-서열 및 유도성 프로모터를 포함한다. 바람직하게는 유도성 프로모터는 메탈로티오닌 프로모터(MT)이다. 예를 들면 추가의 TBP 코딩 서열을 동물 게놈에 도입하고 TBP 또는 TBP 융합 단백질을 각각 발현시키는 것은 유독하므로, 본 발명의 이 양태는 프로모터가 도입될 때까지 TBP 융합 단백질을 코딩하는 전이유전자가 침묵하도록 동물을 타협하게한다. 프로모터는 예를 들면, 완전히 성장하였거나 또는 관심이 있는 임의의 발육 단계에서 동물을 유도시킬 수 있고, 예를 들면 MT 프로모터는 Zn2+, Mg2+, Mn2+또는 Cd2+와 같은 2가 양이온을 함유하는 복강내 주사에 의해 유도될 수 있다. 다른 모델에서 도시된 바와 같이, MT 지향성 유전자는 상승된 양으로 발현된다(팔미터(Palmiter, R.D) 등의 문헌[1982, Cell 29: 701-710]을 참조할 수 있다). 본 발명의 특정한 양태에서는, 전이유전자는 이중 택(HA 및 HIS 에피토프)을 갖는 hTBP를 코딩하는 DNA 서열 및 MT 프로모터를 포함하고, 특히 전이유전자는 서열 식별 번호 15의 DNA 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 하나이상의 에피토프-택을 코딩하는 DNA 서열(들)을 TBP 단백질을 코딩하는 DNA서열에 연결함에 의한 전이유전자의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 전이유전자의 용도에 관한 것이다. 예를 들면 전이유전자는 재조합 벡터의 제조에 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 재조합 벡터의 제조 방법에 관한 것이다. 이 방법은 전이유전자의 적절한 벡터, 예를 들면 조절 서열을 함유하는 벡터에의 인티그레이션(integration)을 포함한다. 벡터의 예는 발현 벡터 및 리트로바이러스 또는 이들의 유도체이다.
본 발명은 또한 전이유전자를 포함하는 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다. 특히 본 발명은 전이유전자(즉, 예를 들면 TBP의 cDNA, 또는 이의 유도체, 특히 hTBP 및 에피토프-택, 예를 들면 HA 및 His 에피토프를 코딩하는 DNA 서열을 함유하는 전이유전자)을 포함하는 재조합 벡터의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 진핵 세포에 전이유전자를 도입하기위한, 특히 포유동물 세포에 도입하기위한 벡터의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 박테리아 또는 진핵 세포에서의 형질전이된 DNA의 증폭을 위한 이런 전이유전자를 포함하는 벡터의 용도에 관한 것이다. 전이유전자를 함유하는 벡터가 도입된 진핵 세포는 또한 전이유전자의 이종/전이유전자 발현에 사용될 수 있다. 진핵 세포(숙주 세포)는 형질전이된 동물의 일부일 수 있다.
본 발명의 주 양태에서는, 전이유전자는 인간이 아닌 형질전이된 동물의 제조에 사용된다. 따라서, 전이유전자 또는 전이유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주 세포 및/또는 동물로 도입한다. 다른 양태에서는, 본 발명은 전이유전자를 동물 또는 그의 세포로 도입하여 생성된 인간이 아닌 형질전이된 동물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전이된 동물은 TBP 또는 에피토프-택을 갖는 TBP를 포함하거나 또는 이로 구성된 융합 단백질을 과발현되게 발현시킬 수 있는 능력을 갖는다.
형질전이된 동물의 제조를 위해서, 인간이 아닌 동물을 숙주 동물로서 사용한다. 이런 인간이 아닌 동물은 설치류, 인간이 아닌 영장류, 양, 염소, 개, 소, 돼지, 새, 양서류, 파충류 등과 같은 척추동물을 포함한다. 바람직한 동물은 인간이 아닌 포유동물 종, 바람직하게는 래트 및 마우스를 포함하는 설치류과로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 마우스이다.
본 발명에 따른 인간이 아닌 형질전이된 동물은 TBP, 또는 TBP 및 에피토프-택을 포함하거나 이로 구성된 융합 단백질과 같은 TBP의 유도체를 코딩하고 발현하게하는 하나이상의 전이유전자(들)의 카피가 게놈에 도입된 임의의 동물을 포함한다. 형질전이된 동물은 에피토프-택을 갖는 TBP 단백질을 발현시키는 능력을 가져야만한다. 본 발명의 특정한 양태에서는, 형질전이된 동물은 내생 TBP 유전자(들)의 형질전이된 방해 또는 변화(파괴된 동물)를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 형질전이된 동물은 비천연 수단(즉, 인간의 조작에 의한)에 의해 동물에서 천연적으로 발생하지않는 하나이상의 TBP 유전자(본 발명에 따른 전이유전자), 예를 들면 외부 TBP 유전자 또는 이들의 유도체 등의 유전적으로 조작된 내생 또는 외부 TBP 유전자가 도입된 동물이다. 천연적으로 발생하지않은 TBP 유전자는 전이유전자로 언급된다. 전이유전자는 동물의 동일하거나 상이한 종에서 유래될 수 있지만, 어느 경우든 전이유전자는 이들에 의해 부여되는 크로모좀 유전자좌 및/외형으로 동물에서 천연적으로 발생하지않는다.
전이유전자(형질전이된 DNA)은 TBP를 코딩하는 외부 유전자, 즉 다른 동물 종으로부터 수득된 TBP 유전자 또는 cDNA등과 같은 숙주 동물의 게놈에서 통상적으로 발견되지않는 서열을 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 전이유전자는 TBP 유전자의 통상적인 생체내 발현 패턴을 변화시키거나 내생 TBP의 생물학적 활성을 변화 또는 제거시키기위해 생체외에서 재배열되거나 돌연변이된 정상이 아닌 DNA서열과 같은 TBP를 코딩하는 내생 유전자을 포함한다. 본 발명은 또한 전이유전자를 포함하고 형질전이된 동물을 제조하는데 이용될 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 형질전이된 동물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전이된 동물은 전이유전자 및/또는 벡터, 예를 들면 전이유전자를 포함하는 발현 벡터를 인간이 아닌 동물의 배선 또는 배선 세포 및/또는 체세포에 각각 도입함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면 다양한 발육 단계의 배아 목적 세포가 본 발명의 전이유전자의 도입에 이용될 수 있다. 다양한 방법을 배아 목표 세포(들)의 발육 단계에 의존해서 사용할 수 있다. 일부 예는 하기와 같다:
1. 접합자의 미세주입은 본 발명의 실시에서 전이유전자를 동물 게놈에 도입하기위한 바람직한 방법이다. 미세주입은 단일 세포 단계에서의 배아의 단리를 포함한다. 따라서, 생식핵 융합 또는 후속적인 세포 분할을 격지않은 접합자, 수정된 난자가 형질전이된 DNA(전이유전자의 DNA)의 미세주입에 적합한 목표 세포이다. 설치류 수컷의 생식핵은 직경이 약 20㎛에 이르게되고, 이는 형질전이된 DNA를 함유한 용액 1 내지 2피코리터를 재현성있게 주입할 수 있게 하는 특징이다. 전이유전자의 도입을 위한 접합자의 이용은 대부분의 경우에, 주입된 전이유전자 DNA가 제 1 세포 분열 전에 숙주 동물의 게놈에 도입될 것이라는 점에서 장점을 갖는다(브린스터(Brinster) 등의 문헌[1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 4438-4442]을 참조할 수 있다). 결과적으로, 생성된 형질전이된 동물(기원 동물)의 모든 세포는 특정한 유전적 유전자좌에서 도입된 전이유전자(형질전이된 대립인자로 언급된다)을 안정적으로 유지한다. 형질전이된 대립인자는 멘델 유전을 나타낸다: 형질전이된 동물과 비-형질전이된 동물의 교배에 의한 자손의 절반은 멘델의 무작위 분류에 따라 형질전이된 대립인자를 유전받을 것이다.
배아의 조작 및 형질전이된 DNA의 미세주입에 대한 방법으로 통상적으로 사용되는 것은 문헌[Transgenic Animal Technology - A Laboratory Handbook, 핀커트(Carl A. Pinkert) 편집, Academic Press, Inc.(1994)]에 개시되어있다.
2. 바이러스 인티그레이션은 또한 동물에 본 발명에 따른 전이유전자를 도입하기위해 사용될 수 있다. 발육되는 배아는 포배로서 공지된 발육 단계로 생체외 배양된다. 이 시점에서 할구들은 전이유전자를 함유한 벡터(형질전이된 DNA/DNA 구축물)로 감염될 수 있고, 예를 들면 적절한 바이러스 또는 리트로바이러스 벡터를 이 목적으로 사용할 수 있다(자에니흐(Jaenich, R.)의 문헌[1976, Proc. Natl. Sci. (USA) 73: 1260-1264]을 참조할 수 있다). 할구들의 형질전환 또는 감염은 투명대를 효소로 제거함으로써 증대될 수 있다(호간(Hogan) 등의 문헌[1986, Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]를 참조할 수 있다). 바이러스 벡터를 통해 전이유전자를 할구로 도입한다면, 이런 벡터는 전형적으로 복사할수 없지만 벡터 서열에 연결된 형질전이된 DNA 서열을 숙주 동물 게놈으로 인티그레이션하기에 적합한 상태로 남아있는다(자너(Jahner) 등의 문헌[1985, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 6927-6931]; 반 더 푸텐(Van der Putten) 등의 문헌[1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152]를 참조할 수 있다). 형질감염은 전이유전자-함유 벡터를 생산하는 세포의 단층상에 할구들을 배양함으로써 쉽고 효율적으로 수득된다(반 더 푸텐 등의 문헌[1985, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 6148-6152]; 스튜와트(Stewart) 등의 문헌[1987, EMBO 6: 383-388]을 참조할 수 있다).
다르게는, 감염은 분할강(자너 등의 문헌[1982, Nature 298: 623-628]을 참조할 수 있다)과 같은 더 후기 상태에서 수행될 수 있다. 어떤 경우든, 대부분의 형질전이된 기원 동물은 형질전이된 기원 동물을 형성하는 모든 세포의 오직 아군에 리트로바이러스 또는 바이러스 인티그레이션되어 생성된다. 더욱이, 다중 (리트로)바이러스 인티그레이션이 단일 기원 동물에서 발생하여 미래의 자손의 세대에서는 분리될 다중 형질전이된 대립인자를 생성할 수 있다. 이 방법에 의한 배선 세포에의 전이유전자의 도입이 가능하지만 낮은 빈도로 발생할 것이다(자너 등의 문헌[1982, Nature 298: 623-628]을 참조할 수 있다). 그러나, 일단 전이유전자가 이 방법에 의해 배선 세포에 도입되면, 형질전이된 대립인자가 모든 동물 세포, 즉 체세포 및 배선 세포 둘모두에 존재하는 자손이 생성될 수 있다.
3. 배아간(ES) 세포는 또한 동물에게 본 발명에 따른 전이유전자를 도입하기위한 목표 세포로서 사용될 수 있다. ES 세포는 생체외에서 배양될 수 있는 이식전 배아로부터 수득된다(에븐스(Evens, M.J.) 등의 문헌[1981, Nature, 292: 154-156]; 브래들리(Bradley, M.O.) 등의 문헌[1984, Nature, 309: 255-258]; 고슬러(Gossler) 등의 문헌[1986, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 83: 9065-9069]; 로버트슨(Robertson) 등의 문헌[1986, Nature 322: 455-448]; 로버트슨(Robertson, E. J)의 문헌[Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 로버트슨 편집, IRL Press, Oxford(1987) p. 71-112]를 참조할 수 있다). 시판되는 ES 세포(예를 들면 미주리주 세인트 루이스 소재의 게놈 시스템스 인코포레이티드(Genome Systems, Inc.)로부터)는 확립된 방법(로벨-배지(Lovell-Badge, R.H.)의 문헌[Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 로버트슨 편집, IRL Press, Oxford(1987), p. 153-182]를 참조할 수 있다)에 의해 하나이상의 전이유전자로 형질전환될 수 있다. 형질전환된 ES 세포는 동물 포배와 혼합된후 ES 세포는 배아를 군집시키고 생성된 동물의 배선에 기여하고, 이는 키메라(2가지 이상의 동물로부터 유래된 세포로 구성됨)이다(자에니치(Jaenisch, R.)의 문헌[1988, Science 240: 1468-1474]; 브래들리(Bradley, A)의 문헌[Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, 로버트슨 편집, IRL Press, Oxford(1987), p113-151]을 참조할 수 있다). 또한, 일단 전이유전자가 이 방법에 의해 배선 세포에 도입되면, 형질전이된 대립인자가 동물의 모든 세포, 즉 체세포 및 배선 세포 둘모두에 존재하는 자손이 생성될 것이다.
그러나, 이가 발생하더라도, 전이유전자의 초기 도입은 멘델 법칙을 따르지않는다. 그러나, 본 발명의 전이유전자는 배선 세포에 안정하게 인티그레이션되고 멘델 유전자좌로서 형질전이된 동물의 자손에게 전달될 수 있다. 배선 인티그레이션은 멘델 방식으로 자손에게 유전 정보를 전달할 수 있는 형질전이된 동물의 생산 및 영구적인 동물 모델로서 이들 형질전이된 동물을 이용하기위해서 필수적이다.
다른 형질전이된 기술은 일부 세포는 전이유전자를 갖고, 다른 세포는 갖지않는 모자이크 형질전이된 동물을 생성한다. 배선 세포가 전이유전자를 갖지않는 모자이크 전이유전자 동물에서는 전이유전자가 자손으로 전달되지않는다. 그럼에도불구하고, 모자이크 형질전이된 동물은 전이유전자와 연관된 표현형을 나타낼수 있고, 특정한 전사 복합체, TAF 및 TAF 상호작용 인자의 친화 정제에 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 개시된 전이유전자를 함유하는 모자이크 형질전이된 동물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 종특이적 TBP를 코딩하는 DNA 서열이 선택된 프로모터(들)/인핸서(들)의 제어하의 삭제되고/되거나, 동일하거나 상이한 종의 유전적으로 변형된 TBP 서열(예를 들면, 본 발명에 따른 전이유전자)로 치환된 널(null)(파괴) 대립인자를 포함하는 형질전이된적으로 도입된 돌연변이에 관한 것이다.
본 발명은 구성 또는 유도성 프로모터의 측면에서 경우에 따라 에피토프-택을 갖는 TBP를 코딩하는 DNA를 포함하는 전이유전자를 도입한 형질전이된 동물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 HA 및 His 에피토프-택을 갖는 hTBP를 코딩하는 DNA 및 EF 프로모터의 DNA 서열을 포함하는 전이유전자가 도입된 형질전이된 동물에 관한 것이다. 다른 특정한 양태에서는, 본 발명은 HA 및 His 에피토프-택을 갖는 hTBP를 코딩하는 DNA 및 MT 프로모터의 DNA 서열을 포함하는 전이유전자가 도입된 형질전이된 동물에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 양태에서는, 형질전이된 동물은 서열 식별 번호 13의 전이유전자를 함유한다. 본 발명의 다른 형질전이된 동물은 서열 식별 번호 14의 전이유전자를 함유한다. 본 발명의 다른 형질전이된 동물은 서열 식별 번호 15의 전이유전자를 함유한다. 특히 본 발명은 예를 들면 DNA 서열 식별 번호 13, 서열 식별 번호 14 및/또는 서열 식별 번호 15인 전이유전자를 그의 게놈에 안정하게 인티그레이션시킨 형질전이된 동물에 관한 것이다.
전이유전자를 유전받은 자손은 전이유전자의 서열에 상응하는 독특한 서열을 포함하거나 또는 전이유전자에 의해 코딩되는 생분자의 존재에 대해 자손의 유전 물질을 분석함으로써 전이유전자를 유전받지않은 같은 배의 새끼들과 구별될 수 있다. 따라서, 예를 들면 본 발명에 따른 전이유전자에 의해 독특하게 코딩되는 폴리펩티드(예를 들면 에피토프-택을 갖는 TBP)를 함유하는 생물학적 유체는 전이유전자, 예를 들면 에피토프-택을 갖는 TBP에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 존재에 의해 면역분석될 수 있다. 형질전이된 자손을 확인하는 보다 단순하고 믿을수 있는 수단은 동물의 말단, 예를 들면 꼬리에서 조직 시료를 수득하고 본 발명의 전이유전자의 독특한 일부 또는 일부들의 DNA 서열에 상응하는 핵산 서열의 존재에 대해 시료를 분석함을 포함한다. 이런 핵산 서열의 존재는 예를 들면 전이유전자의 독특한 일부에 상응하는 DNA 서열과의 하이브리드형성(써던(Southern), 노던(Northern)) 분석, 기재로서 시료중의 DNA 서열을 이용한 PCR 반응 생성물의 분석 및 전이유전자의 DNA 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 등에 의해 결정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 가능한 제 1 형질전이된 동물(G0) 및 이후 세대의 형질전이된 동물(G1, G2, G3, G4…) 또는 형질전이된 동물주의 동물을 예를 들면 표준 PCR 반응을 이용하여 전이유전자의 존재에 대해 시험할 수 있는 시험 방법에 관한 것이다. 이 목적을 위해서 게놈 DNA는 예를 들면 꼬리 조직으로부터 프로테이네이즈(Proteinase) K 및 알엔에이즈(RNAse) 처리후에 동물 조직으로부터 추출될 수 있다. 이런 PCR 반응을 위해서는, 프라이머의 서열은 전이유전자의 서열의 일부들, 예를 들면 프로모터 영역, 에피토프-택(들)을 코딩하는 DNA 영역 및/또는 특정한 TBP 구축물에 독특한 DNA 영역에 상응해야만 한다. 마우스에서 이런 PCR 반응을 이용하여, 주입된 난의 예를 들면 약 25%에서 상응하는 PCR 생성물이 탐지될 수 있다면, 즉 약 25%의 마우스가 양성 자손을 생성한다.
동물이 전이유전자를 갖는지의 여부를 증명하는 다른 방법은 가능한 형질전이된 동물/형질전이된 동물주에서 형질전이된 mRNA의 존재에 대한 시험이다. 초기 시험은 예를 들면 매우 소량의 mRNA에 매우 민감한 S1 분석을 이용하여 수행될 수 있다(베크(Berk, A.J.) 및 샤프(Sharp, P.A.)의 문헌[1977, Cell 12, 721]을 참조할 수 있다). 이 목적을 위해서는 표지된 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드는 동물의 조직으로부터 단리된 총 RNA와 하이브리드를 형성한다. S1 뉴클리에이즈(nuclease)를 이용한 후속적인 처리는 모든 단선 핵산, DNA 및 RNA를 분해시킨다. 이중-나선 DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드는 그대로 남아있는다. 임의의 전이유전자 mRNA가 존재한다면, 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 하이브리드를 형성하여 이를 S1 뉴클리에이즈 분해로부터 보호한다.
본 발명은 예를 들면 S1 보호 분석법에 의한 총 간 mRNA의 제조물와 같은 조직 제조물에서 검출되는 형질전이된 mRNA의 존재를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 형질전이된 mRNA(예를 들면 에피토프-택을 갖는 TBP의 DNA 서열에 상응하는 mRNA)의 일부에 상보적이도록 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들면32S,33P,35P,3H 또는14C로 방사활성 또는 형광 마커 또는 바이오틴 또는 디곡시게닌(digoxygenin)과 같은 다른 유형의 마커로 5'말단 표지로 표지된다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 표준 프로토콜(샴브룩 등의 문헌(1989)을 참조할 수 있다)에 따른 선택적인 하이브리드 형성 조건하에서 형질전이된 마우스로부터의 mRNA와 혼합된다. 그런다음, 혼합물을 S1 뉴클리에이즈로 처리한다. 올리고뉴클레오티드의 3'말단에서와 같은 비-정합 서열의 짧은 영역은 항상 분해되어야만하고, S1 뉴클리에이즈가 실제로 모든 사용가능한 단선 핵산을 분해시키는 것을 보여주는 내부 조절을 제공한다. 형질전이된 mRNA의 존재하에서는, 표지된 올리고뉴클레오티드는 분해로부터 보호되어야만하고 그의 존재 및 크기는 서열화 스타일 변성 젤 전기영동(예를 들면 8M 우레아 PAGE)에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 그런 다음, 분해되지않은 표지된 올리고뉴클레오티드를 젤을 필름에 노출시킴으로써 검출할 수 있다. 보호되지않은 올리고뉴클레오티드는 S1 뉴클리에이즈에 의해 분해되므로 형질전이된 mRNA가 없으면 밴드가 나타나지 않는다. 본 발명은 동물로부터 제조되고 형질전이된 mRNA의 존재에 대해 시험된 상이한 조직 및 다양한 세포형에 관한 상이한 조직 및 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 노던 분석법을 이용한 형질전이된 동물의 시험에 관한 것이다. 가장 바람직하게는, PCR 또는 S1 뉴클리에이즈 매핑(mapping)에 의해 형질전이된 mRNA에 대해 양성인 것으로 밝혀진 형질전이된 동물을 노던 분석법으로 더욱 시험하였다(맥마스터(McMaster, G.K) 및 카미카엘(Carmichael)의 문헌[1977, Proc. Nat. Acad. Sci. 74: 4835]을 참조할 수 있다). 이 목적을 위해서는 예를 들면 아가로즈 젤 상에서의 변성 조건하에서 상이한 조직 및/또는 세포형으로부터의 총 RNA가 단리되고 크기가 분리된다. 그런 다음 RNA는 예를 들면 모세관 이동 및 UV 가교결합을 이용하여 멤브레인 또는 필터상에 결합될 수 있다. 결합된 RNA는 전이유전자의 코딩 영역 또는 이들의 일부에 상응하는 표지된 프로브, 예를 들면 서열 식별 번호 13에 따른 전이유전자의 5'말단에 상응하는 DNA-프로브를 이용하여 종래의 노던 블롯 조건을 이용하여 프로브(probe)할 수 있다. 이런 DNA-프로브는 바람직하게는 약 20 내지 1000개의 염기쌍(bp)의 길이를 갖는다. 가장 바람직하게는 이들은 약 100, 200, 300, 400 및 500bp의 길이를 갖는다. 경우에 따라, 표지된 프로브의 과량은 세정되고 멤브레인은 필름에 노출된다. 프로브를 상기 개시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드에 대해 표지화할수 있다. 올리고뉴클레오티드는 종종 이들 노던 블롯 실험에 사용될 수 있다.
형질전이된 동물, 바람직하게는 임의의 다른 분자 생물학 시험에서 양성인 이런 형질전이된 동물을 웨스턴 블롯 또는 ELISA와 같은 특정 면역반응으로 형질전이된 TBP 단백질의 존재에 대해 시험한다. 따라서, 동물의 조직 또는 특정한 세포로부터, 바람직하게는 간 조직 또는 임의의 다른 연 조직으로부터 핵을 표준 방법, 예를 들면 초원심분리된 당 농도구배상에서 단리할 수 있다. 이런 핵으로부터 총 핵 단백질을 예를 들면 핵을 고염 조건(예를 들면 400mM KCl) 및 비이온성 계면활성제(예를 들면 NP-40)으로 처리하여 수집할 수 있다. 이후에 핵 단백질을 예를 들면 적절한 변성 젤 전기영동, 바람직하게는 SDS-PAGE로서 크기를 분리할 수 있다. 이런 젤을 멤브레인 또는 필터, 바람직하게는 니트로셀룰로즈 멤브레인과 같은 고형 표면상에 전기-이동하여 이동시킬 수 있다. 그런 다음, 멤브레인 또는 필터를 예비차단시키고 표준 프로토콜에 따른 적합한 항체로 프로브화한다(샴브룩 등의 문헌[Molecular Cloning 2판(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press]를 참조할 수 있다).
이런 목적으로 다클론성 및/또는 단클론성 항체를 사용할 수 있고, 예를 들면 마우스, 토끼, 래트, 양, 염소, 말, 새 등에서 발생시킬 수 있다. TBP 융합 단백질을 인식하고 효소 또는 마커, 예를 들면 알칼리 포스파테이즈(alkaline phosphatase) 또는 형광 마커 또는 바이오틴 또는 디곡시게닌 또는 방사능표지에 커플링된 항체로 직접적으로 검출할 수 있다. 검출은 또한 제 1 항체의 보존 영역을 인식하는 제 2 항체를 이용하여 간접적으로 수행될 수 있고, 예를 들면, 제 1 항체가 마우스에서 발생될 때 제 2 항체는 양등에서 생성된 항-마우스 항체이어야한다. 이런 제 2 항체는 또한 검출을 위해서 효소 또는 다른 마커에 커플링될 수 있다.
본 발명은 또한 전이유전자에 의해 코딩되는 에피토프-택을 갖는 TBP에 결합하는 항체를 생산하기위한 전이유전자 또는 그의 일부 또는 코딩된 융합 단백질 또는 그의 일부, 예를 들면 단클론성 또는 다클론성 항체의 제조물의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 대한 항체는 TBP 융합 단백질의 하나이상의 에피토프(들)를 인식하는 항체이다. 이런 항체는 TBP에 속하는 개별적인 에피토프(들)에 대한 것일 수 있고. 있거나 에피토프-택(들)에 대한 것일 수 있다. 본 발명의 한 양태는 TBP 융합 단백질의 아미노-말단 영역을 인식하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 TBP 융합 단백질의 카복시 말단 영역을 인식하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 TBP 및 에피토프-택(들) 및/또는 2개의 에피토프-택이 서로 연결된 아미노산의 일부에 인접한 에피토프를 인식하는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태는 hTBP 및 2개의 에피토프-택으로 구성된 융합 단백질의 에피토프를 인식하는 항체에 관한 것이다. 특히, 항체는 His- 및 HA-택 및 hTBP로 구성된 융합 단백질의 에피토프를 인식한다. 가장 바람직하게는 항체는 HA- 및 His-택을 갖는 TBP의 아미노말단에서 에피토프(들)를 인식한다. 본 발명의 특정한 양태는 서열 식별 번호 16의 아미노산 서열, 또는 서열 식별 번호 16의 아미노산 서열 또는 그의 일부를 갖는 정확하게 절첩된 융합 단백질의 에피토프를 인식하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 서열 식별 번호 17의 아미노산 서열, 또는 TBP 융합 단백질이라는 측면에서 이들의 정확하게 절첩된 에피토프를 인식하는 항체(항-TBP 항체)에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있다. 항체는 인간이 아닌 모든 종의 동물, 바람직하게는 마우스, 래트, 토끼, 양, 염소, 말, 새(예를 들면 알에서)로부터 제조될 수 있다. 이런 항체는 표준 프로토콜(휴로우(Hurlow) 및 레인(Lane)의 문헌[Antibodies A Laboratory Manual(1988), Cold Spring Harbor Press]를 참조할 수 있다)을 따라서 제조될 수 있다. 항체는, 경우에 따라, 원래의 면역화 펩티드(에피토프)를 이용하여 친화성 정제될 수 있다. 본 발명의 특정한 양태는 서열 식별 번호 17의 서열을 갖는 펩티드(예를 들면 적합한 담체 단백질에 커플링시켜)로 토끼를 면역시켜 생성되는 토끼에서 생성되는 다클론성 항체에 관한 것이다. 다클론성 항체(항-TBP 항체)는 hTBP 융합 단백질(HA- 및 His-택)을 인식한다.
본 발명의 항체는 웨스턴 블롯 분석법 및 TBP 융합 단백질 및 TBP 융합 단백질에 결합된 고 전사 복합체의 친화성 정제에 사용될 수 있다. 고 복합체는 TBP 융합 단백질 및 TAF-상호작용 인자에 결합된 TAF를 포함한다.
본 발명은 형질전이된 동물의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전이된 동물은 형질전이된 동물 조직 및/또는 형질전이된 동물의 배양된 세포로부터의 고 전사 복합체, TAF 및 TAF-상호작용 인자의 친화성 공동 정제에 이용될 수 있다. 이런 고 전사 복합체는 상이한 다른 조직 및/또는 세포형으로부터 단리 및 정제될 수 있다. 바람직하게는, 이런 조직/세포형으로부터의 핵 제조물은 가장 바람직하게는 표준 프로토콜(디그남(Dignam) 등의 문헌[1983, Nuc. Acids Res. 11: 1575]; 리체튼스타인(Lichtenstein) 등의 문헌[1987, Cell 51: 963-973]; 고스키(Gorsky) 등의 문헌[1986, Cell 47: 767-776]을 참조할 수 있다)에 따라 균질화시킨 세포로부터 준비된다. 경우에 따라, 핵 단백질을 표준 방법으로 축적할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 형질전이된 동물의 고 전사 복합체, TAF 및 TAF-상호작용 인자를 친화성 공동 정제하기위한 방법에 관한 것이다.
예를 들면, 본 발명은 에피토프-특이적 항체 또는 하전된(양 또는 음전하로 하전된) 물질을 이용한 고 전사 복합체, TAF 및 TAF-상호작용 인자의 친화-정제에 관한 것이다. 예를 들면, 이미 자세히 개시된 항체를 이런 목적으로 사용할 수 있다. HA 및 His 에피토프-택을 갖는 TBP, 바람직하게는 hTBP를 포함하는 고 전사 복합체를 공동 정제하기에 가장 바람직한 방법중 하나는 Ni2+및/또는 항-HA-항체(예를 들면 시판되는 항체) 및/또는 서열 식별 번호 17에 상응하는 에피토프를 인식하는 항체를 이용한 친화성 정제를 포함한다. 이런 항체 또는 Ni2+는 적합한 칼럼 물질에 커플링되어 친화성 정제는 예를 들면 Ni2+-칼럼 또는 항-HA 항체 또는 항-TBP 항체와 같은 특정한 항체가 있는 칼럼을 이용하여 수행될 수 있다.
다른 양태에서는 본 발명은 TBP 융합 단백질, 에피토프-택을 갖는 TBP에 관한 것이다. 바람직하게는, TBP 융합 단백질은 형질전이된 동물에서 발현된다. 특히 본 발명은 hTBP 융합 단백질에 관한 것이다. TBP 융합 단백질은 형질전이된 동물로부터 단리 및 정제될 수 있다. 본 발명의 한 양태는 HA 및 His 택을 갖는 TBP 단백질, 특히 HA 및 His 택을 갖는 hTBP 단백질이다. 본 발명의 다른 양태는 서열 식별 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. 본 발명의 다른 양태에서는 TBP 융합 단백질은 프로테이네이즈/펩티데이즈를 위한 하나이상의 분해 부위(들), 예를 들면 트롬빈 분해 부위를 포함한다. 바람직하게는, 융합 단백질의 아미노산 서열내의 분해 부위는 에피토프-택(들)과 TBP-단백질사이에 위치한다.
본 발명은 본 발명에 따른 전이유전자가 바람직하게는 형질전이된 동물의 일부인 적합한 숙주 세포에서 발현되는 TBP 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
형질전이된 mRNA 및/또는 전이유전자에 의해 코딩되는 TBP 융합 단백질 및/또는 TBP 융합 단백질과 결합되는 고 전사 복합체는 형질전이된 동물에서 발견되는 상이한 유형의 조직 및/또는 세포형, 예를 들면 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 신경계, 근육, 샘, 골수, 면역계에 속한 세포, 피부등에서 단리될 수 있다.
본 발명은 TBP 융합 단백질의 용도, 특히 형질전이된 동물로부터 고 전사 복합체를 단리하기위한 TBP 융합 단백질의 용도 및 상이한 종, 상이한 조직 및/또는 상이한 세포형으로부터 수득된 단리된 고 전사 복합체의 특성에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 TBP 융합 단백질 및 형질전이된 동물은 상이한 고 복합체에 결합된 TAF 및 TAF-상호작용 인자와 같은 개별적인 단백질의 단리 및 특성화에 이용될 수 있다. 예를 들면, 특정한 고 전사 복합체에 결합된 단백질은 해리되고 분리되어 개별적인 TAF 및 TAF-연관 인자가 확인될 수 있다. TAF 및 TAF-상호작용 인자의 조성은 조직형 및/또는 세포형 및/또는 발육 단계 및/또는 발현된 전이유전자에 따라 상이한 고 복합체에서 적어도 어느 정도 상이하다.
TAF 및 TAF-상호작용 인자, 특히 특성화되고 항체가 이미 존재하는 조직 특이적 인자는 빨리 확인될 수 있고 전사 복합체와의 결합 정도를 평가할 수 있다. 이의 예는 Bob-I/OCA-B 인자인데, 이는 B-세포 한정 활성화를 담당하는 조직 특이적 보조 활성화제로서 생각된다(그스타이거(Gstaiger, M.) 등의 문헌[1996, EMBO 15, 2781-2790]을 참조할 수 있다). 비록 내인성 DNA-결합능 및 거의 도처에 편재하는 Oct 인자에 대한 필요성이 없지만, 이 인자가 조직에 한정적으로 나타나는 것은 단백질-단백질 기작을 통한 B-세포 특이 전사 활성화를 가능하게한다.
또한 신규한 TAF 및 TAF-상호작용 인자, 특히 조직- 및/또는 세포형-특이적 및/또는 발육 (단계) 특이적 및/또는 세포 주기 특이적 TAF 및 TAF-상호작용 인자는 고 전사 복합체에서 확인될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 많은 인핸서-결합 조직 특이적 인자가 유전자의 전사 활성에 영향을 미쳐서 조직 특이성을 나타낼 수 있음을 강하게 제시하는 많은 자료가 있다. 따라서, 독특한 조직-특이적, 세포형 특이적, 세포 주기 특이적, 발육 단계 특이적 인자를 확인할 수 있고, 이는 유전자의 특이 발현을 조절한다.
이 보편적인 형질전이된 시스템은 또한 상이한 조직 및 세포형의 TBP 및/또는 TAF 및 전사 복합체와 이런 TAF 및 TAF-상호작용 인자(예를 들면 조활성화제)가 결합하는 정도를 조사할 수 있는 강력한 수단을 제공한다.
본 발명은 또한 고 전사 복합체가 결합되는 에피토프-택을 갖는 TBP를 형질전이된 동물로부터 단리시키는, 상이한 고 전사 복합체의 확인 및 특성화를 위한 방법에 관한 것이다. 상이한 고 전사 복합체의 조성의 특성화 방법은 예를 들면 a) 본 발명에 따른 전이유전자를 인간이 아닌 동물에게 도입하는 단계, b) 동물의 상이한 동물 조직 및/또는 상이한 세포형, 선택적으로 동물의 상이한 발육 단계로부터 에피토프-택을 갖는 TBP를 단리시키는 단계 및 c) 고 전사 복합체의 조성을 결정하는 단계를 포함한다.
인간이 아닌 형질전이된 동물로부터 고 전사 복합체를 단리시키는 한 방법은 TBP의 택인 에피토프중 적어도 하나를 이용한 친화성 정제를 포함한다. 바람직하게는 고 전사 복합체 및 이 복합체에 결합된 TAF 및 TAF-상호작용 인자는 에피토프-택을 갖는 TBP가 단리될 때 함께 정제된다. 예를 들면, 에피토프중 하나를, 바람직하게는 에피토프-택을 에피토프가 특이적으로 결합하는 물질에 결합시켜 에피토프-택을 갖는 TBP를 정제할 때, 고 전사 복합체를 단리할 수 있다. 이 물질은 예를 들면 Ni2+-컬럼(여기에 His-에피토프가 결합한다) 또는 항체, 예를 들면 항-HA 항체(HA 에피토프에 결합한다) 또는 서열 식별 번호 17의 서열 또는 그의 일부을 갖는 에피토프-택을 갖는 TBP의 에피토프(예를 들면 서열 식별 번호 17의 에피토프)에 결합되는 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 새롭고/새롭거나 특이적 TAF 및/또는 TAF-상호작용 인자를 확인하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 고 전사 복합체는 본 발명에 따른 형질전이된 동물로부터 단리된다. 이런 방법은 예를 들면 a) 본 발명에 따른 전이유전자를 인간이 아닌 동물에 도입하는 단계, b) 특정한 동물 조직 및/또는 특정한 동물의 세포형, 선택적으로 동물의 특정한 발육 단계로부터 에피토프-택을 갖는 TBP를 단리하는 단계 및 c) 고 전사 복합체에서 에피토프-택을 갖는 TBP와 결합된 TAF 및/또는 TAF-상호작용 인자를 해리 및 분리시키는 단계 및 d) 경우에 따라 TAF 및/또는 TAF-상호작용 인자의 아미노산 서열을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 이미 공지된 기작을 확인할 때, 형질전이된 모델은 새로운 TAF 또는 TAF-상호작용 인자를 발견하고 특성화하는데 있어서 현재의 세포 배양 시스템보다 장점을 갖는다. 상기 언급된 바와 같이, 이제까지 친화성 공동 정제된 TAF 단백질은 HeLa 및 이스트에서 연구되어왔다. 다른 미생물에 대한 TAF cDNA도 또한 발견되었지만, 시간을 소비하는 상호작용 라이브러리 스크리닝 방법에 의해서였다. 형질전이된 모델이 전체 미생물이므로 이 보편적인 형질전이된 시스템이 전사의 진정한 생체내 과정에 매우 밀접하면서도 신규한 조직-특이적 활성 요소의 인식에 특히 반응하게한다.
이런 택을 갖는 TBP를 발현하는 형질전이된 동물, 예를 들면 마우스가 약물 개발 분야에 기여할 수 있을 것이란 것은 명확하다. 주어진 유전자(특히 질병에 관련된 유전자인 경우)의 전사 복합체의 임의의 '독특한' 조직-특이적, 세포형 특이적, 세포주기 특이적, 발육 단계 특이적 인자(TAF, TAF-상호작용 인자)에 대한 약학적 관심이 상당하다. 하나 또는 몇 개의 질병에 연관된 유전자의 전사적 제어에 포함되는 주요 TAF 및 TAF-상호작용 인자의 확인 및 특성화는 이런 유전 질병을 경감시키는 치료 화합물을 개발하기위한 좋은 전략이다. 일단 이런 TAF 또는 TAF-상호작용 인자가 특성화되고 클로닝되면, 임의의 다수의 스크리닝 방법이 TAF 또는 TAF 결합 인자와 특정하게 상호작용하는 분자 종/물질을 확인하기위해 착수될 수 있다. 약학적으로 유용한 종/물질은 생체외 및/또는 생체내에서 TAF 또는 TAF-상호작용 인자의 천연 활성을 증가시키거나 억제시켜서, 연관된 유전자의 치료 조작을 가능하게 하는 것일 것이다.
그런 다음 확인된 TAF 및 TAF-상호작용 인자를 생화학 및 분자 생물학에서 도구로서 사용할 수 있고, 예를 들면 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터의 이런 단백질을 상응하는 인간 TAF 및 TAF-상호작용 인자 또는 이들의 cDNA를 단리시키기위한 프로브로서 사용할 수 있다. 그런 다음 인간 TAF 및 TAF-상호작용 인자를 매우 특이적인 신약을 스크리닝하기위해서 사용할 수 있다.
본 발명은 하기 비한정적인 실시예에서 보다 자세히 설명된다.
실시예
실시예 1: 형질전이된 동물의 구축
가능한 동물 공급원:
형질전이된 실험에 적합한 동물은 표준 상업적 공급원인, 챨스 리버(Charlse River, 매사추세츠주 윌밍톤 소재), 타코닉(Taconic, 뉴욕주 저만타운 소재) 및 더 잭슨 레보레이토리(The Jackson Laboratory, 메인주 바 하버 소재)에서 수득하였다. B6SJL/F1 마우스를 배아 회수 및 이동에 이용하였다. B6SJL/F1 수컷을 교배에 이용하였고 정관절제된 스위스 웹스터 종축을 가임신을 흉내내기위해 사용하였다.
형질전이된 마우스:
6주령된 암컷 마우스를 임신한 말의 혈청 고나도트로핀(PMSG; 예를 들면 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마에서 판매)을 5 IU 주사(0.1cc, 복강내)한후 48시간후에 인간의 융모막 고나도트로핀(hCG; 예를 들면 시그마에서 판매)을 5IU 주사(0.1cc, 복강내)하여 과잉배란을 유도시킨다. 암컷을 hCG 주사후 곧 수컷과 함께 둔다. hCG 주사 21시간후에, 교배한 암컷을 CO2질식 또는 경부 탈구시켜 죽여서 배아를 절개된 나팔관에서 회수하여 M2 배지(예를 들면 시그마)에 둔다. 주위의 더미 세포를 하이알루로니데이즈(hyaluronidase)(1㎎/㎖)로 제거한다. 그런 다음 생식핵 배아를 세척하고 M16 배지(예를 들면 시그마)에 놓은 후 주입할 때까지 5% CO2, O2및 90% N2의 가습 대기의 37℃ 항온배양기에 둔다.
실시예 2: 형질감염 및 미세주입을 위한 구축물의 제조
미세주입용 DNA 클론을 적절한 효소로 분해하며, 예를 들면 MT-hTBP 전이유전자(이중-택, 표 3의 서열을 갖는다)을 포함하는 DNA 클론을 Cla I 및 BamHI으로 분해하거나, EF-hTBP 전이유전자(이중-택, 표 2의 서열을 갖는다)을 포함하는 DNA 클론을 EcoRI/EcoRI으로 분해하여 적절한 크기의 DNA 단편을 TBE 완충용액중의 1% 아가로즈 젤상에서 전기영동시킨다(샴브룩 등의 문헌(1989)을 참조할 수 있다). DNA 밴드를 에티디움 브로마이드를 이용한 염색으로 가시화시키고 절개하여 0.3M 아세트산 나트륨, pH 7.0을 함유하는 투석용 백에 넣는다. DNA를 투석용 백에 전기용출시키고 페놀-클로로포름(1:1)으로 추출하고, 2배의 에탄올로 침전시킨다. DNA를 TE 완충용액(10mM 트리스, pH 7.4 및 1mM EDTA)에 재용해시키고 DEAE 세파셀(sephacel)(예를 들면 스웨덴 웁살라 소재의 파마시아) 칼럼 상에서 정제하였다. 칼럼을 먼저 0.5㎖의 고염 완충용액(1.5M NaCl, 10mM Tris pH 7.4 및 1mM EDTA)로 먼저 하도시킨후 3㎖의 저염 완충용액(0.15M NaCl, 10mM 트리스 pH 8.0 및 1mM EDTA) 3㎖로 세척하였다. DNA 용액을 0.15M NaCl로 염 조절한후 칼럼을 통과시켜 DNA가 칼럼 매트릭스에 결합되게한다. 3㎖의 저염 완충용액으로 3회 세척한후에 DNA를 4x0.3㎖의 고염 완충용액으로 용출시키고 2배의 에탄올로 침전시킨다. 분획을 수집하여 200㎕의 TE에 용해시키고, 페놀:클로로포름으로 1회 추출하고, 클로로포름으로 2회 추출한후 DNA를 에탄올로 하룻밤 침전시켰다. DNA를 미세주입용 완충용액 TE(10mM 트리스 pH 7.4, 0.1mM EDTA)에 현탁시키고 DNA 농도를 2ng/㎕로 조졸하고 아가로즈 젤상에서의 전기영동에 의해 공지된 DNA 표준물을 가시화시킨다.
미세주입:
DEAE 정제된 전이유전자 DNA(MT-hTBP 또는 EF-hTBP)를 2ng/㎕에서 미세주입용 완충용액에 용해시켰다. 미세바늘 및 지지용 피펫을 플래밍 브라운 마이크로피펫 풀러(Flaming Brown micropipette puller), 예를 들면 모델 P87(수터 인스트 캄파니(Sutter Inst. Co.))에 끼운다. 그런 다음 유지 피펫을 깨서 드폰브룬(deFonbrune) 형 미세용광로(예를 들면 테크니칼 프로덕트 인스트. 인코포레이티드(Technical Product Inst. Inc.)상에서 불로 다듬는다. 피펫을 자이스 액시오버트(Zeiss Axiovert, 등록상표) 135 현미경에 결합된 미세조작기(예를 들면 레츠(Leitz)상에)에 탑재시켰다. 공기 충진된 주입용 피펫(예를 들면 메디칼 시스템 코포레이션(Medical System Corp.)을 팁을 통해서 DNA 용액으로 충진시켰다. 40 내지 50개의 그룹으로 배아를 미세조작용 실리콘 오일하의 200㎕의 M2 배지에 넣었다. 배아를 유지 피펫으로 배향하게하고 유지시킨후 주입 피펫을 주입 피펫에 가장 가까운 생식핵에 삽입하였다. 삽입은 생식핵의 팽윤에 의해 모니터링되었다. 주입 후에, 일군을 배아를 수용자인 암컷에게 이동시킬 때까지 M16 배지에 두었다.
실시예 3: 미세주입에 의한 배아 이동
무작위 주기의 성숙한 암컷 마우스를 정관절제한 수컷과 짝지었다. 스위스 웹스터 또는 다른 상응하는 주를 이 목적으로 사용할 수 있다. 수용자 암컷을 제공자 암컷과 동시에 교배시켰다. 배아의 이전시, 수용자 암컷을 체중 g 당 2.5% 아버틴 0.015㎖을 복강내 주사하여 마취시킨다. 나팔관을 단일 중앙선 배 절개에 의해 노출시켰다. 그런 다음 나팔관 상에서 직접적으로 체벽을 통해 절개한다. 난소낭을 시계제조용 핀셋으로 뜯었다. 이동될 배아를 M16 및 이어서 이동용 피펫의 팁에 놓았다(약 10 내지 12개의 배아). 피펫 팁을 누두로 삽입시키고 배아를 이동시킨다. 이동후에 절개부를 2개의 봉합재로 봉합하고 피부를 스태플러로 봉합한다. 따뜻한 접시에서 3시간동안 회복된 수용자를 이동을 위해서 콜로니에 두었다.
총 469개의 생식핵 배아를 MT-hTBP를 위해 미세주입하였고 EF-hTBP에 대해 170마리의 새끼가 태어났고 총 407개의 생식핵 배아로 76마리의 새끼를 수득했다.
실시예 4: 기원 마우스에서의 형질전이된 DNA의 검출
4a) DNA 추출
가능한 기원 마우스의 게놈 DNA를 2 내지 4주령된 자손의 꼬리 조직(약 1㎝)의 작은 조각에서부터 추출하였다. 500 내지 750㎕의 꼬리 완충용액(꼬리 완충용액: 10mM 트리스 pH 7.5, 100mM NaCl, 10mM EDTA, 0.5% SDS, 30㎍/㎖ 프로테이네이즈 K)중의 꼬리 절단물을 54℃ 교반기에서 하룻밤 항온처리하였다. 이어서 각각의 꼬리 시료에 같은 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜(25:24:1)을 첨가하였다. 시료를 손으로 또는 낮게 세팅된 보텍스 마이서(Vortex micer)에서 자동으로 부드럽게 진탕하였다. 시료를 모두 10분동안 탁상용 원심분리기에서 원심분리하였다. 수상을 5㎖ 폴리프로필렌 튜브(예를 들면 팔콘(Falcon, 등록상표) 튜브)로 옮겼다. 같은 부피의 에탄올을 튜브에 서서히 적가하여 DNA가 점진적으로 침전되게하였다. 제 2 부피의 에탄올을 힘차게 첨가하여 튜브의 내용물을 혼합시켰다. 그런 다음 튜브를 여러번 뒤집어서 확실히 혼합되게하였다. 그런다음 게놈 DNA를 평평한 피펫 팁(서열화 젤 팁) 주위에 감아서 마이크로타이터 디쉬의 개별적인 웰로 이동시켰다. 그런다음 DNA를 디쉬에서 4시간동안 공기건조시켰다. 그런 다음 200㎕의 1 x TE(1 x TE: 10mM 트리스, pH 7.4, 1mM EDTA)를 각각의 웰에 첨가하였다. 그런 다음 게놈 DNA를 실온에서 15 내지 30분동안 용해시킨후 조심스럽게 피펫팅해서 혼합하였다. 마이크로타이터 플레이트를 종종 PCR 시험전에 -20℃에서 저장하였다. 시험하기전에, 10㎕를 덜어서 EcoRI(예를 들면 10㎕의 게놈 DNA, 2㎕의 10xEcoRI 완충용액, 7㎕의 H2O, 1㎕의 EcoRI; 효소 및 완충용액은 독일 만하임 소재의 뵈링거-만하임(Boehringer-Mannheim)에서 구입)으로 분해시켰다.
4b) PCR 반응
분해된 게놈 DNA를 물로 1:3 희석시켰다. 그런 다음, 시료를 가열 블록에서 10분동안 100℃로 가열시켰다. 그런다음 2㎕를 PCR 반응을 위해 사용하였다. 반응을 2㎕의 게놈 DNA, 1 x의 반응 완충용액, 1.5mM의 MgCl, 0.8μM의 진행 방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 0.8μM의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 각각의 뉴클레오티드(dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP)를 0.2mM 함유한 8㎕의 뉴클레오티드 혼합물 및 2.5유니트의 Taq 폴리머레이즈로 구성된 50㎕ 부피에서 수행하였다. PCR을 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)(미국 코넥티컷주 노워크 소재의 퍼킨 엘머)의 앰플리택(AmpliTaq, 등록상표) 효소 및 완충용액을 이용하여 수행하였다.
MT-hTBP 전이유전자의 검출을 진행방향 프라이머 올리고뉴클레오티드(센스 프라이머) 5' GGAGCA ACC GCC TGC TGG GTG C 3'(서열 식별 번호 5) 및 역방향 프라이머 올리고뉴클레오티드(안티센스 프라이머) 5' CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG 3'(서열 식별 번호 6)을 이용하여 수행하였다.
EF-hTBP 전이유전자의 검출은 진행 방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 5' GGA GAC TGA AGT TAG GCC AGC 3'(서열 식별 번호 7)을 이용하여 수행하였다. MT-hTBP 검출에서와 동일한 역방향 프라이머(5' CCT GTG TTG CCT GCT GGG ACG 3')를 사용하였다.
자동 온도 사이클러(예를 들면 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진)를 이용하여 온도 주기를 수행하였다.
온도 주기는 하기와 같다:
주기 1: 94℃에서 5분 60℃에서 3분 72℃에서 2분;
주기 2-25: 94℃에서 1분 60℃에서 2분 72℃에서 3분;
주기 26: 94℃에서 1분 60℃에서 2분 72℃에서 5분; 또는
주기 1-40: 95℃에서 2분 55℃에서 1분 72℃에서 1분.
증폭된 생성물의 존재는 진행 표준 아가로즈 젤 전기영동(예를 들면 1.2 내지 1.5% 아가로즈)을 시행하고 UV 광으로 DNA를 가시화하기위해 에티디움 브로마이드를 이용하여 젤을 염색시켜 검출된다.
양성 MT-hTBP 시료는 약 580bp의 증폭된 DNA 생성물의 존재를 특징으로하였다. 양성 EF-hTBP 시료는 약 500bp의 증폭 DNA 단편을 생성하였다.
PCR-반응에 의한 MT-hTBP용의 170마리의 새끼로부터의 DNA-분석은 35개의 게놈 DNA 시료가 전이유전자에 대해 양성임을 나타내었다. PCR 분석에 의한 76 마리의 EF-hTBP 새끼들의 게놈 DNA의 분석은 EF-hTBP 전이유전자가 9개의 마우스에 포함되어있음을 나타내었다.
4d) 형질전이된 모델 확장:
DNA 양성인 G0기원 생물을 비-형질전이된 B6SJL과 교배시키고 생성된 새끼들은 PCR 유전형이었다. G1자손들을 계속 교배시키고 개별적인 주를 유지시키고 더 이상의 mRNA 및 단백질 발현 분석을 위해 사용하였다.
실시예 5: S1 뉴클리에이즈 보호 분석법에 의한 형질전이된 mRNA의 검출
5a) 특징
형질전이된 전사물의 5' 말단 및 3' 말단에 상보적인 올리고뉴클레오티드(올리고)를 제조하였다:
5' 올리고(센스 프라이머)의 서열(서열 식별 번호 8):
3' 올리고(안티센스 프라이머)의 서열(서열 식별 번호 9)
줄친 영역은 하이브리드를 형성하지않는 서열이다. 40ng의 올리고를 예를 들면 뵈링거-만하임(만하임 소재)의 T4 폴리뉴클레오티드 카이네이즈 및 완충용액을 이용하여 (32P 감마)ATP(5000cpm/mM)로 5'-표지화하였다. 1시간동안 30℃에서 50㎕의 반응 부피에서 반응시켰다. 표지된 올리고를 크기 배타적 크로마토그래피(예를 들면 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene)의 푸쉬-칼럼(Push-Column, 등록상표))를 이용하여 도입되지않은 (32P 감마)ATP로부터 단리하였다.
5b) 프로모터 유도:
프로모터가 Zn2+의 존재하에서 활성화되기 때문에 RNA 분석전에 MT-hTBP 마우스를 유도하는 것이 필요하였다. 각각의 MT-hTBP 마우스에서, H2O중의 ZnSO4를 간을 제거하기 18시간전 및 4시간전에 2회 복강내 주사하였다(투여량은 마우스 중량 10g 당 0.1㎎ ZnSO4이었다).
5c) RNA 추출
시판되는 트리졸(Trizol) 시약(예를 들면 영국 페이슬리 소재의 깁코-BRL)을 이용하여 1 내지 5g의 조직으로부터 총 RNA를 추출하였다. 조직을 12㎖ 폴리프로필렌 튜브(예를 들면 팔콘 튜브)중의 5㎖의 트리졸 용액중의 울트라-투락스(Ultra-Turrax)로 균질화시켰다. 1㎖의 클로로포름을 첨가하고, 튜브의 뚜껑을 닫고 손으로 격렬하게 15초동안 진탕시켰다. 용액을 실온에서 3분동안 항온처리한후 소발(Sorvall) SS-34 로터를 이용하여 4℃, 12000xg에서 15분동안 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고; 2.5㎖의 이소프로판올을 첨가하고 혼합하였다. RT에서 10분간 항온처리하였다. 시료를 4℃, 12,000xg에서 10분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 RNA 펠렛을 5㎖의 75% 에탄올로 세척하였다. 시료를 혼합하고 7,500xg에서 10분간 원심분리하였다. RNA 펠렛을 알엔에이즈가 없는 물에 재현탁시킨후 260nm에서의 흡광도를 측정하여 정량하였다.
5d) S1 뉴클리에이즈 보호:
일정한 양의 RNA(10 내지 20㎍)를 100㎕의 알엔에이즈가 없는 물에 용해시켰다. 50,000 내지 150,000dpm의 표지된 올리고를 첨가하였다(0.1 내지 1ng, 표지 효율에 따라 상이함). RNA/올리고 혼합물을 0.3M 나트륨 아세테이트 및 에탄올로 침전시켰다. RNA/올리고 펠렛을 세척하고 공기 건조시켰다. 23㎕의 하이브리드 형성 용액을 첨가하였다(80% 포름아미드, 10mM PIPES pH 6.4(샴브룩 등의 문헌(1989)을 참조할 수 있다), 1mM EDTA, 0.05% SDS). 반응물을 혼합시키고 65℃에서 20분동안 변성시킨후 2㎕의 5M NaCl을 65℃에서 각각의 시료에 첨가하였다. 시료를 H2O 욕에서 65℃에서 추가로 1시간동안 항온처리한 후 욕의 온도를 37℃로 고정시켰다. 65℃에서 37℃로 점진적으로 온도를 감소시켜(하룻밤동안) 특이적 올리고-mRNA 하이브리드 형성을 촉진시켰다. 다음날, 300㎕의 S1 완충용액을 각각의 시료에 첨가하였다(S1 완충 용액: 167U/㎖ S1 뉴클리에이즈(예를 들면 영국 페슬리 소재의 깁코 비알엘(Gibco BRL), 0.3M NaCl, 30mM NaOAc(pH 4.5), 3mM ZnSO4). 시료를 실온에서 1시간동안 항온처리한 후 1㎖의 (찬) 에탄올을 첨가하여 모든 핵산을 침전시켰다. 펠렛을 원심분리하고 세척하고 스피드-백(Speed-Vac)에서 짧게 건조시켰다. 그런 다음, 펠렛을 12㎕ S1 부하용 완충용액(85% 포름아미드, 0.01% 브로모페놀 블루, 0.01% 크실렌 시아놀, 1xTBE)에 재현탁시켰다. 시료를 70℃로 5분동안 가열하고 부하하고 변성(6M 우레아) 얇은 폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 이용하여 크기 분리시켰다. 건조된 젤의 방사선사진은 보호되고 비분해된 밴드의 검출을 용이하게한다.
MT-hTBP에 대한 35마리의 기원 생물에서 7마리의 기원 생물이 S1 보호 분석법에 의해 분석시 검출가능한 mRNA 수준을 보였다. EF-hTBP의 경우, 3마리의 기원 생물이 S1 보호 분석법에서 검출될 만한 mRNA를 나타냈다.
실시예 6: 형질전이된 mRNA의 노던 블롯 검출
6a) TBP의 PCR 증폭 및 TBP 프로브의 표지화에 의한 하이브리드 프로브의 합성
이중-택을 갖는 hTBP 구축물의 498bp를 일괄한 올리고뉴클레오티드/프라이머를 고안하고 합성하였다.
진행 방향 올리고는 AUG 출발 부위(표 1의 ATH 부위)로부터 10개 염기 다운스트림에서 시작한다. 센스 프라이머의 서열은 하기와 같다:
서열 식별 번호 10:
역방향 프라이머는 AUG 출발 부위(표 1의 ATH 부위)로부터 507개 염기쌍 다운스트림에서 종결된다. 안티센스 프라이머의 서열은 하기와 같다:
서열 식별 번호 11:
PCR 반응은 0.2㎍ pAG-17, 0.5mM MgCl2, 0.8μM의 각각의 프라이머, 1x PCR 완충용액(퍼킨 엘머), 0.2mM dATP, dTTP, dCTP, dGTP 및 2.5U의 앰플리택(등록상표) 효소(미국 코넥티컷 노르워크 소재의 퍼킨 엘머)를 이용하여 수행되었다.
써모사이클러(thermocycler) 프로그램:
주기 1 내지 35: 94℃에서 1분 55℃에서 1분 72℃에서 1분;
그런 다음 72℃에서 10분후 4℃에서 저장한다. 증폭된 밴드는 0.7% 아가로즈 젤에서 정제하였다.
TBP-DNA 프로브를 메가프라임 표지 키트(Megaprime labeling kit, 등록상표)(영국 아머샴(Amersham))의 무작위 프라이머 및 클레노우(Klenow) 단편 효소를 이용하여 표지화시켰다. 25 내지 50ng의 프로브 DNA를 5㎕의 무작위 헥사머 프라이머(예를 들면 아머샴) 및 20㎕의 H2O와 혼합하였다. DNA를 100℃에서 5분동안 변성시켰다. 표지 혼합물을 1x 반응 완충용액, 1x dATP, 1x dTTP, 1x dGTP, 4㎕ 3000Ci/mmol의 알파-32P dCTP(예를 들면 아머샴) 및 2U 클레노우 효소와 함께 50㎕의 최종 부피에 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 표지된 DNA를 크기 배타 크로마토그래피(예를 들면 푸쉬 칼럼)을 이용하여 도입되지않은 뉴클레오티드로부터 단리했다.
6b) 젤 전기영동 및 이동
10 내지 20㎍의 총 RNA를 에탄올 침전시키고, 펠렛을 RNA 부하 완충용액(65% 포름아미드, 20% 포름알데히드(37% 용액), 1x MOPS 완충용액(샴브룩 등의 문헌(1989)을 참조할 수 있다), 5% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 블루, 0.01%의 크실렌 시아놀, 0.1㎎/㎖의 에티디움 브로마이드)중에서 65℃에서 10분동안 변성시켰다. RNA를 18% 포름알데하이드(37% 용액) 및 1x MOPS 시행 완충용액(40mM MOPS pH 7.0, 10mM 나트륨 아세테이트, 1mM EDTA)를 함유한 1% 아가로즈 젤상에서 크기 분획화하였다. 젤을 18% 포름알데하이드(37% 용액)을 함유한 1xMOPS 시행 완충용액에서 1V/㎝에서 하룻밤동안 서서히 시행하였다. 그런 다음 젤을 0.05M NaOH/1.5M NaCl에서 30분동안 처리한후 0.5M 트리스(pH 7.4)/1.5M NaCl중에서 20분간 처리하였다. RNA를 모세관 기술을 이용하여 나일론 멤브레인(예를 들면 영국 아머샴의 하이본드(Hybond)-N+)으로 이동시켰다. 멤브레인-결합된 RNA는 예를 들면 스트라타링커(Stratalinker, 등록상표, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진)를 이용하여 가교결합하였다.
6c) 하이브리드 형성 및 세척:
예를 들면 65℃에서 1 내지 2시간동안 회전 하이브리드 오븐(예를 들면 하이바이드(Hybaid))에서 래피드-하이브(Rapid-Hyb) 완충용액(영국 아머샴)중에서 예비 하이브리드 형성을 수행하였다. 65℃에서 2 내지 3시간동안 106내지 10x106cpm의 변성된 프로브를 함유하는 6 내지 10㎖의 래피드-하이브 완충용액중에서 하이브리드 형성을 수행하였다. 멤브레인을 2x SSC/0.1% SDS(1xSSC: 150mM NaCl, 15mM Na3시트레이트, pH 7.0)에서 실온(10분/세척)에서 2회 세척하였다. 멤브레인을 1xSSC/0.1% SDS중에서 65℃에서 2회(15분/세척) 더 세척하였다. 다음 2회 세척은 0.5xSSC/0.1% SDS중에서 65℃에서 15분 및 0.2xSSC/0.1% SDS중에서 65℃에서의 15분/세척의 1 또는 2회의 최종 세척(경우에 따라)으로 수행되었다. 세척된 멤브레인의 방사선 사진을 찍었다.
실시예 7: 택을 갖는 hTBP에 대한 다클론성 항체의 생성
일반적인 전략:
마우스와 인간의 TBP사이에는 상당량의 서열 상동성이 존재한다. 따라서, 대부분의 시판되는 항체는 서로 반응하고 내생성 및 형질전이된 TBP 둘 모두를 검출할 것이다. 이들 둘 사이를 구별하기위해서 다클론성 항체를 형질전이된 TBP의 택 영역(택을 갖는 hTBP의 트롬빈 분해 부위 및 His 택에 상응한다): 서열 식별 번호 12:에 대해 발생시켰다.
이 펩티드를 담체 단백질에 커플링시켜 표준 프로토콜을 이용하여 토끼에 주사하였다. 혈청을 일정한 간격으로 수집하고 ELISA 분석법을 이용하여 항-hTBP 역치에 대해 시험하였다.
실시예 8: 형질전이된 단백질의 웨스턴 블롯 검출
8a) 간의 핵 추출물의 제조
MT-hTBP 마우스에 ZnSO4(5b를 참조할 수 있다)를 2회 복강내 주사하였다. 쥐를 경부 이탈시켜 죽이고 간을 회수하였다. 간을 10㎖ 균질화 완충용액(1.8M 슈크로즈, 10mM HEPES pH 7.4(샴브룩 등의 문헌(1989)을 참조할 수 있다), 25mM KCl, 1mM EDTA, 5% 글리세롤, 0.15mM 스퍼민, 0.5mM 스퍼미딘, 0.4mM PMSF)에서 즉시 균질화한다. 균질화후에, 부피를 동일한 완충용액으로 25㎖로 증가시켰다. 균질화물을 원심분리 튜브, 예를 들면 울트라-클리어(Ultra-Clear) SW-28 튜브(미국 캘리포니아주 팔로 알토 벡크만(Beckman))에서 7㎖의 균질화 완충용액상에 조심스럽게 층을 형성시켰다. 시료를 25,000rpm(4℃)에서 1시간동안 SW-28 로터에서 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠렛화된 핵을 200㎕의 NEXB 완충용액(20mM HEPES pH 7.9, 400mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 10% 글리세롤, 2㎍/㎖ 아프로티닌, 2㎍/㎖ 루펩틴, 2㎍/㎖ 펩스타틴-A)에 재현탁시켰다. 재현탁된 핵을 가끔 혼합시키고 피펫팅하면서 15 내지 30분동안 얼음에서 항온처리하였다. 시료를 드라이 아이스/에탄올 욕 및 37℃ H2O 욕에서 5회 냉동/해동 주기를 반복하였다. 시료를 고속으로 30초동안 원심분리하고 상층액을 예를 들면 단백질 분석 시약(예를 들면 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오-래드(Bio-Rad))을 이용하여 단백질 함량에 대해 측정하였다.
8b) 전기영동 및 이동
20 내지 75㎍의 추출물을 변성 젤 전기영동에 의해 크기 구별하였다. 분해 젤: 10% 아크릴아미드(1:37 비율의 아크릴아미드:비스-아크릴아미드), 0.1% SDS, 375mM 트리스, pH 8.8. 적층 젤: 5% 아크릴아미드, 0.1% SDS, 125mM 트리스 pH 8.3. 시행 완충용액: 25mM 트리스 pH 8.3, 192mM 글리신, 0.1% SDS. 변형된 베럼(Bjerrum) 이동 완충용액(48mM 트리스, 39mM 글리신, 10% 메탄올, 0.0375% SDS, pH 9.2)를 이용하여 반-건조 블롯터(blotter)(예를 들면 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재의 호에퍼(Hoefer))로 단백질을 순수한 니트로셀룰로즈 멤브레인(예를 들면 바이오-래드)로 이동시켰다. 이동은 0.8mA/㎝에서 2 내지 4시간동안 시행되었다.
8c) 면역검출
멤브레인을 3% 젤라틴(예를 들면 바이오-래드)을 이용하여 1x TBS(20mM 트리스 pH 7.5, 500mM NaCl)중의 흔들리는 표면에 실온에서 1 내지 2시간동안 차단하였다. 멤브레인을 실온에서 1x TTBS(0.05% 트윈-20이 있는 1xTBS)중에서 10분동안 세척하였다. 1% 젤라틴/1xTTBS중의 1차 항체와의 하이브리드 형성은 실온에서 흔들리는 표면상에서 4시간내지 하룻밤동안 수행되었다. 멤브레인은 2 내지 3회(5분/세척) 1xTTBS로 세척되었다. 1% 젤라틴/1xTTBS중의 알칼리 포스파테이즈(AP)와 커플링된 2차 항체와의 하이브리드 형성은 2 내지 3시간동안 수행되었다. 멤브레인을 1xTTBS에서 2 내지 3회(5분/세척) 실온에서 세척한후 1xTBS 완충용액에서 5분동안 세척하였다. 그런다음, 밴드가 충분히 보일 때까지 멤브레인을 NBT/BCIP 시약을 함유한 1x 전개 완충용액(예를 들면 바이오래드)중에서 실온에서 항온처리하였다. AP 반응은 H2O로 세척함으로써 중단되었다.
본 발명에 의하면 에피토프-택을 갖는 TATA-박스 결합 단백질을 코딩하는 DNA가 제공되고, 에피토프-택을 갖는 TBP를 발현하는 형질전이된 동물을 생산할 수 있고, 이들을 이용하여 다양한 진핵생물 조직 및 세포형으로부터 전사 인자 및 전사 복합체를 친화성 정제할 수 있다.
서열 목록
(1) 일반적인 정보
(i) 출원인:
(A) 이름: 훽스트 아크티엔게젤샤프트
(B) 스트리트:
(C) 시: 푸랑크푸르트
(D) 주:
(E) 국가: 독일
(F) 우편 번호: 65926
(G) 전화: 069-305-7072
(H) 텔레팩스: 069-35-7175
(I) 텔렉스:
(ii) 발명의 명칭: 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터의 고 전사 복합체의 정제 방법
(iii) 서열의 수: 17개
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 패튼트인 릴리즈(PatentIn Release) #1.0, 버전 #1.25(EPO)
(2) 서열 식별 번호 1에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 12 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 펩티드
(B) 위치: 1..12
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 1
(2) 서열 식별 번호 2에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 11 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 펩티드
(B) 위치: 1..11
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 2
(2) 서열 식별 번호 3에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 10 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 펩티드
(B) 위치: 1..10
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 3
(2) 서열 식별 번호 4에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 9 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 펩티드
(B) 위치: 1..9
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 4
(2) 서열 식별 번호 5에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..22
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 5
(2) 서열 식별 번호 6에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..21
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 6
(2) 서열 식별 번호 7에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..21
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 7
(2) 서열 식별 번호 8에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 76 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..76
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 8
(2) 서열 식별 번호 9에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 75 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..75
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 9
(2) 서열 식별 번호 10에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..22
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 10
(2) 서열 식별 번호 11에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..22
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 11
(2) 서열 식별 번호 12에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 19 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 펩티드
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 펩티드
(B) 위치: 1..19
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 12
(2) 서열 식별 번호 13에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1310 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..1310
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 13
(2) 서열 식별 번호 14에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 4286 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..4286
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 14
(2) 서열 식별 번호 15에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 3263 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: cDNA
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 엑손
(B) 위치: 1..3263
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 15
(2) 서열 식별 번호 16에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 371 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 단백질
(B) 위치: 1..371
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 16
(2) 서열 식별 번호 17에 관한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 18 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자의 타입: 단백질
(ix) 특징
(A) 특징을 나타내는 기호: 단백질
(B) 위치: 1..18
(ix) 서열 개시: 서열 식별 번호: 17
Claims (47)
- 에피토프-택을 갖는(epitope-tagged) TATA-박스 결합 단백질(TBP)을 발현시킬 수 있는 능력을 갖는, 인간이 아닌 형질전이된(transgenic) 동물.
- 제 1 항에 있어서, TBP가 2개의 에피토프-택과의 융합 단백질로서 발현되는 인간이 아닌 형질전이된 동물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 융합 단백질이 인간 TBP(hTBP)를 포함하는 인간이 아닌 형질전이된 동물.
- 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 HA(헤마글루티닌)- 및 His-에피토프를 포함하는 인간이 아닌 형질전이된 동물.
- 제 4 항에 있어서, 융합 단백질이 서열 식별 번호 16의 서열을 갖는 인간이 아닌 형질전이된 동물.
- 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 형질전이된 동물이 마우스인 인간이 아닌 형질전이된 동물.
- 인간이 아닌 동물의 배선(germline) 및/또는 체세포에 전이유전자(transgene)를 도입시킴을 포함하는 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항의 인간이 아닌 형질전이된 동물의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서, 형질전이된 DNA를 인간이 아닌 동물의 접합자에 미세주입함을 포함하는 인간이 아닌 형질전이된 동물의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서, 전이유전자를 함유하는 벡터로 포배를 형질감염시킴을 포함하는 인간이 아닌 형질전이된 동물의 제조 방법.
- 제 7 항에 있어서, 전이유전자를 배아간 세포에 도입시킴을 포함하는 인간이 아닌 형질전이된 동물의 제조 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한항의 인간이 아닌 형질전이된 동물을 제조하는데 사용될 수 있는 에피토프-택을 갖는 TBP를 코딩하는 전이유전자.
- 제 11 항에 있어서, 제 1 DNA 서열이 TBP를 코딩하고 제 2 DNA 서열이 하나이상의 에피토프-택을 코딩하는 전이유전자.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, TBP를 코딩하는 DNA 서열이 cDNA인 전이유전자.
- 제 13 항에 있어서, DNA 서열이 인간 TBP(hTBP)의 cDNA인 전이유전자.
- 제 11 항 내지 제 14 항중 어느 한 항에 있어서, 제 2 DNA 서열이 2개의 에피토프-택을 코딩하는 전이유전자.
- 제 15 항에 있어서, 에피토프-택이 HA-에피토프 및 His-에피토프인 전이유전자.
- 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, HA-에피토프가 서열 식별 번호 1, 서열 식별 번호 2, 서열 식별 번호 3 또는 서열 식별 번호 4의 서열중 하나를 갖는 전이유전자.
- 제 11 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서, 서열 식별 번호 13의 서열을 포함하는 전이유전자.
- 제 11 항 내지 제 18 항중 어느 한 항에 있어서, 유도성 또는 구성 프로모터의 DNA를 포함하는 전이유전자.
- 제 19 항에 있어서, 프로모터가 EF 유전자의 프로모터인 전이유전자.
- 제 19 항에 있어서, 프로모터가 MT 유전자의 프로모터인 전이유전자.
- 제 11 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 서열 식별 번호 14 또는 서열 식별 번호 15의 서열을 갖는 전이유전자.
- 인간이 아닌 형질전이된 동물을 제조하기위한 제 11 항 내지 제 22 항중 어느 한 항의 전이유전자의 용도.
- 하나이상의 에피토프-택을 코딩하는 DNA 서열(들)을 TBP 단백질을 코딩하는 DNA 서열에 연결시킴을 포함하는 제 11 항 내지 제 22 항중 어느 한 항의 전이유전자의 제조 방법.
- 에피토프-택을 갖는 TBP를 제조하기위한 제 11 항 내지 제 22 항중 어느 한 항의 전이유전자의 용도.
- 에피토프-택을 갖는 TBP를 제조하기위한 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항의 형질전이된 동물의 용도.
- 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항의 형질전이된 동물에서 발현되는 에피토프-택을 갖는 TBP.
- 제 27 항에 있어서, 2개의 에피토프를 포함하는 에피토프-택을 갖는 TBP.
- 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, TBP가 hTBP인 에피토프-택을 갖는 TBP.
- 제 27 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 있어서, TBP가 HA-에피토프 및 His-에피토프에 연결된 에피토프-택을 갖는 TBP.
- 제 27 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서, HA 에피토프가 서열 식별 번호 1, 서열 식별 번호 2, 서열 식별 번호 3 및 서열 식별 번호 4의 서열중 하나를 갖는 에피토프-택을 갖는 TBP.
- 제 27 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서, 서열 식별 번호 16의 서열을 갖는 에피토프-택을 갖는 TBP.
- 제 11 항 내지 제 22 항중 어느 한항의 전이유전자를 동물의 배선 및/또는 체세포에 도입시킴을 포함하는 제 27 항 내지 제 32 항중 어느 한 항의 에피토프-택을 갖는 TBP의 제조 방법.
- 제 33 항에 있어서, 구성 프로모터를 포함하는 전이유전자를 인간이 아닌 동물에게 도입시키고, 이때 에피토프-택을 갖는 TBP를 동물의 특정한 세포형 및/또는 조직으로부터, 선택적으로 동물의 특정한 발육 단계에서 발현시키는, 에피토프-택을 갖는 TBP의 제조 방법.
- 제 33 항에 있어서, 유도성 프로모터를 포함하는 전이유전자를 인간이 아닌 동물에 도입시키고, 프로모터 유도시 에피토프-택을 갖는 TBP를 발현시키는, 에피토프-택을 갖는 TBP의 제조 방법.
- 형질전이된 동물로부터 고 전사 복합체 단리, 및 TAF 및 TAF-상호작용 인자 확인을 위한, 에피토프-택을 갖는 TBP의 용도.
- 에피토프-택을 갖는 TBP를 발현시키기위한 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항의 인간이 아닌 형질전이된 동물의 용도.
- 동물의 상이한 조직 및/또는 세포형으로부터, 선택적으로 상이한 발육 단계에서 고 전사 복합체를 단리하기위한 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항의 인간이 아닌 형질전이된 동물의 용도.
- 새롭고/새롭거나 특정한 TAF 및/또는 TAF-상호작용 인자를 확인하기위한 인간이 아닌 형질전이된 동물의 용도.
- 고 전사 복합체가 결합되는 에피토프-택을 갖는 TBP를 형질전이된 동물로부터 단리시킴을 포함하는 다양한 고 전사 복합체의 확인 및 특성화 방법.
- a) 제 11 항 내지 제 22 항중 어느 한항의 전이유전자를 인간이 아닌 동물에게 도입하는 단계,b) 에피토프-택을 갖는 TBP를 동물의 다양한 조직 및/또는 세포형으로부터, 선택적으로 동물의 상이한 발육 단계에서 단리하는 단계, 및c) 고 전사 복합체의 조성을 결정하는 단계를 포함하는,상이한 고 전사 복합체 조성의 특성화 방법.
- a) 제 11 항 내지 제 22 항중 어느 한항의 전이유전자를 인간이 아닌 동물에게 도입하는 단계,b) 에피토프-택을 갖는 TBP를 특정한 동물 조직 및/또는 동물의 특정한 세포형으로부터, 선택적으로는 특정한 발육 단계에서 단리하는 단계,c) 고 전사 복합체에서 에피토프-택을 갖는 TBP와 결합한 TAF 및/또는 TAF-상호작용 인자를 해리시키고 분리시키는 단계, 및d) 선택적으로 TAF 및/또는 TAF-상호작용 인자의 아미노산 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 새롭고/새롭거나 특정한 TAF 및/또는 TAF-상호작용 인자의 확인 방법.
- TBP의 택인 하나이상의 에피토프를 이용하여 에피토프-택을 갖는 TBP를 친화성에 의해 정제할 때 에피토프-택을 갖는 TBP에 결합된 고 전사 복합체를 친화성에 의해 함께 정제하는, 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한항의 인간이 아닌 형질전이된 동물로부터 다양한 고 전사 복합체를 단리하는 방법.
- 제 43 항에 있어서,에피토프-택을 갖는 TBP를 그의 His 에피토프를 Ni2+-칼럼에 결합시킴으로써 정제하는 고 전사 복합체를 단리하는 방법.
- 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,에피토프-택을 갖는 TBP를, 그의 HA 에피토프를 항-HA 항체에 결합시킴으로써 정제하는, 고 전사 복합체를 단리하는 방법.
- 제 43 항 내지 제 45 항중 어느 한 항에 있어서, 서열 식별 번호 17의 서열을 갖고 에피토프-택을 갖는 TBP의 에피토프를 인식하는 항체가 있는 친화성 칼럼을 이용하여 고 전사 복합체를 단리시키는, 고 전사 복합체의 단리 방법.
- 서열 식별 번호 17의 서열을 갖는 에피토프-택을 갖는 TBP의 에피토프를 인식하는 항체.
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